CN113884672B - 一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析方法及系统，属于免疫分析的技术领域。激发光源照射免疫层析试纸条，测定荧光信号强度，当检测线处最大荧光强度值小于免疫分析仪器的阈值时，将荧光发光强度与预存的待测目标物浓度‑荧光发光强度标准曲线拟合，得到待测目标物浓度；大于或等于阈值时，关闭光源并收集长余辉信号强度，与预存的待测目标物浓度‑长余辉发光强度标准曲线拟合，得到待测目标物浓度。本发明检测方法最大程度地拓宽了检测区间，有效增大荧光免疫层析的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析的技术领域，特别涉及一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析方法及系统。
背景技术
传统荧光免疫试纸条的检测范围仅为2～3个数量级。因检测范围有限，当面对待检测物质的含量变化范围极大时，市售的荧光免疫层析试纸条并不能完成准确的测试。另外，目前现有荧光免疫检测方法中适用的仪器检测器阈值有限，例如基于拍照式成像的免疫层析分析仪、时间分辨免疫层析分析仪，可准确检测的信号下限至阈值上限也只有2～3个数量级(～100至～60000)，相关检测仪器在测试含量水平跨度更宽的待检物时，所检测到信号的线性范围受限，常常不能满足测试需要。
例如，在孕期持续跟踪中HCG的含量会发生显著的变化，最高水平的HCG含量相比于孕初期会有5个数量级的增加，传统的试纸条在远低于最高水平时已经趋于饱和，其高浓度区的定量准确性变得非常差。甚至，当样本中HCG浓度过高时，还会出现假阴性的结果。
因此，现有的免疫层析方法和系统难以同时兼顾高的灵敏度和宽的检测区间，限制了基于发光信号进行定量检测的应用范围。
发明内容
本发明提供一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析方法及系统，解决现有的免疫层析方法和系统难以同时兼顾高的灵敏度和宽的检测区间的问题。
为了解决上述问题，本发明提供如下方案：
S1、准备试纸条：
试纸条结合垫上标记有长余辉纳米微球偶联的生物标志物Ⅰ，检测线上标记生物标志物Ⅱ，质控线上标记活性检测物；
所述生物标志物Ⅰ、生物标志物II分别用于与待测目标物特异性结合；
所述活性检测物用于指示结合垫上标记物的有效性；
S2、上样：
于步骤S1准备的试纸条上滴加含有待测目标物的待测样品，至反应完成；
S3、使用荧光免疫分析仪器进行检测：
光源照射经步骤S2上样后的试纸条，测定检测线与质控线处的荧光信号强度，分别获得检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT，质控线处最大峰值对应的最大荧光强度值HC；
S4、比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT；
当HT小于阈值DT时，将荧光发光强度与预存的待测目标物浓度-荧光发光强度标准曲线拟合，得到待测目标物浓度；
当HT大于或等于阈值DT时，关闭光源，测定检测线与质控线处的长余辉信号强度；将长余辉发光强度与预存的待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线拟合，得到待测目标物浓度。
荧光与长余辉均属于长余辉纳米微球在光源激发作用下的发射光，其中荧光是光源开启时的即时发光，长余辉是光源关闭后的延时发光，对采集荧光信号或长余辉信号所需的探测器可以是相同的。检测线处最大峰值指示着长余辉纳米微球中发光剂量的多少，对应着指示长余辉纳米微球量的多少，进一步地可指示长余辉纳米微球上偶联物的量，检测线处长余辉纳米微球偶联物的量即对应待测目标物的量。
在仪器阈值固定时，低浓度待测物使用荧光获得高灵敏度，高浓度荧光信号超过仪器阈值DT时，对应的标准曲线超出了线性区间，在超出阈值范围内如果再使用荧光对应的标准曲线计算待测目标物的浓度，将造成测试数据不准确。在超出阈值部分，收集光源关闭后长余辉纳米微球的长余辉发光，因收集得到的长余辉发光强度远低于荧光发光强度，能够保证长余辉的发光强度小于仪器阈值DT，故而使得待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线还在线性区间内，从而使得计算得到数据的准确性。
作为优选地，步骤S4中，比较HT大于或等于阈值DT后，关闭光源前还包括步骤：调低光源功率，重复步骤S3。重复步骤时，新测得的数据将前一次测得的数据覆盖。
荧光材料的荧光强度正比于激发光强度，不同激发光源照射下，高功率光源对应高光强，高光强光照射下得到激发光的激发光强度也大。本发明于步骤S4比较HT大于或等于阈值DT后，关闭光源前，调低激发光源功率，重复步骤S3，即通过降低激发光强度对应降低荧光强度，进而扩宽检测区间。
具体地，在光源功率的可调范围内，以高光源功率对应的高荧光强度提高检测灵敏度，拓宽测量待测目标物浓度范围的低值；当HT大于或等于阈值，调低激发光源功率可调低最大荧光强度值HT，再继续步骤S4比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值；经步骤S3-S4-S3的闭环调节，以光源可调功率的最低值激发荧光并收集荧光信号，再以长余辉发光强度拓宽目标物浓度检测范围高值，即能够获得较宽的线性范围区间；本发明方法相较于现有使用荧光材料测试目标物浓度的系统，可有效可调地将检测范围提高最大达4个数量级。
作为优选地，调低光源功率为将光源功率调低2-30倍；进一步优选地，调低5-10倍。
作为优选地，所述荧光免疫分析仪器的阈值由仪器硬件指数决定或是人为设定。通常情况下，仪器硬件中所配备的各元件都可能会影响到检测阈值。例如CMOS摄影头模块包括摄像头与处理芯片，此模块的荧光强度检测阈值不但受到摄像头像素的影响，还受到处理芯片处理能力的影响。
作为优选地，待测目标物为核酸、抗原蛋白或抗体。
作为进一步优选地，所述待测目标物为特异性的核酸链段；所述生物标志物Ⅰ为核酸适配体；所述生物标志物Ⅱ为与待检测目标物部分互补的核酸链段。
作为进一步优选地，所述待测目标物为抗原蛋白；所述生物标志物Ⅰ为待测目标物抗体Ⅰ；所述生物标志物Ⅱ为待测目标物抗体Ⅱ；所述活性检测物为二抗。
作为进一步优选地，所述待测目标物为抗体；所述生物标志物Ⅰ为待测目标物抗原Ⅰ；所述生物标志物Ⅱ为待测目标物抗原Ⅱ；结合垫上还包括长余辉纳米微球偶联的鸡IgY，所述活性检测物为羊抗鸡IgY。
作为优选地，所述的长余辉纳米微球与抗体、抗原或适配体通过功能性反应基团如羧基、氨基、醛基进行生物偶联。例如，可以羧基-氨基反应形成偶联或醛基-氨基反应形成偶联。通常，根据纳米微球表面功能基团的情况选择对应的偶联方法。
作为优选地，所述长余辉纳米微球包括载体微球和包埋于载体微球内部的长余辉发光材料。
作为进一步优选地，所述长余辉发光材料占长余辉纳米微球重量的0.1％～30％；再优选0.2％～25％；更优选0.5％～20％；最优选1％～15％。
作为进一步优选地，所述长余辉发光材料包括吸光剂、缓存剂与发光剂；
吸光剂用于吸收激发光的能量后产生单线态氧；
缓存剂被单线态氧氧化生成不稳定中间体，不稳定中间体断键重组并释放能量；
发光剂吸收不稳定中间体断键重组释放的能量，并释放长余辉。
发光剂具有较高的发光量子效率，其本身可以作为荧光染料而发挥相应的功能；当受到激发光源照射时，发光剂立即会跃迁至激发态而产生即时发光，发射光经探测器收集得到荧光强度。
吸光剂在光源照射时也跃迁至激发态，经过一系列能量代谢途径而产生长余辉发光，当光源关闭后，即可收集得到不被荧光干扰的长余辉发光信号。因相同激发光源激发下，荧光的发光强度会远远大于长余辉发光强度。吸光剂吸收光能，经缓存剂传递至发光剂，从而释放能量发射出长余辉；此特征使得荧光材料(这里指发光剂，荧光泛指短寿命的即时发光，其发光寿命通常远小于10ms，对应着发光剂在光源照射激发下所发出的荧光或磷光)标记的生物标志物的响应灵敏度要大于长余辉标记的生物标志物，荧光发光强度也远大于长余辉的发光强度，因此，长余辉发光不会对荧光检测造成影响。
本发明长余辉纳米微球的组分配制灵活，可以根据实际需求来设计材料的组成与性质，并可获得灵活多样的纳米结构，且具有可剪裁的发光性能。充能的激发光波长与长余辉发光的波长可以分别地进行调节，方便对吸光剂和发光剂的组合方案进行调整更换，以此高效地实现色彩丰富的长余辉发光。
作为进一步优选地，长余辉纳米微球的粒径为5nm–1000nm，更优选为50nm–800nm，最优选纳米粒径为100nm–500nm。纳米微球所有的颗粒的形貌和粒径可以通过电子显微镜拍摄图像表征，并且将多次测量得到的纳米微球的平均直径记录为粒径。这样的纳米微球的表征方法是技术人员已知的并且可以采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等仪器测得。
在相同的测试条件下，本发明的长余辉发光聚苯乙烯纳米微球的发光强度可以远超过纳米尺度的商业化无机长余辉材料SrAl2O4:Eu2+,Dy3+的水平。特别的，本发明基于吸光剂、缓存剂与发光剂形成长余辉发光材料制备长余辉纳米微球，在激发光关闭之后还能持续发光，且长余辉发光时间100ms–3600s，优选地在500ms–1200s，更优选地在1s–600s，最优选2s–60s。长余辉发光材料的长余辉发光亮度0.1mcd m-2–10000mcd m-2，优选地在0.32mcdm-2–8000mcd m-2，更优选地在1mcd m-2–5000mcd m-2。基于上述性质，本发明的长余辉纳米微球能够为免疫层析检测技术提供完备的材料基础。
选取作为吸光剂的化合物具有较大的摩尔吸光系数，例如光敏剂或能量给体染料；发光剂具有更高的发光量子效率，例如发光染料。另外，吸光剂的吸收峰与发光剂的发射峰重叠少，避免长余辉发光被吸收剂吸收而减弱的不利影响。
作为进一步优选地，所述吸光剂选自卟啉类染料、酞菁类染料、过渡金属配合物、量子点QDs，以及其衍生物或共聚物中的至少一种；
所述发光剂选自铱配合物、稀土配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物(BODIPY)、以及其衍生物和共聚物中的至少一种；
所述缓存剂选自如结构式(I)的化合物中的至少一种：
其中，G和T分别选自O，S，Se和N中的一种；
R1′、R2′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′各自独立地选自H、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基，具有1-50个、优选1-24个、更优选2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、芳基、芳烷基，或具有N、O或S的杂芳基或杂芳烷基；
其中所述芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基分别具有一个或多个取代基L；
L选自羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基，具有1-50个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氨基，或者其组合；
R3′为吸电子基团或包含吸电子基团的芳基，所述吸电子基团选自硝基、卤素、卤代烷基、磺酸基、氰基、酰基、羧基或者其组合。
作为进一步优选地，吸光剂与发光剂的摩尔比在1:2到1:10000，优选1:10到1:8000或1:50到1:6000，更优选1:100到1:4000或1:200到1:2000。缓存剂在长余辉发光材料三种原料中的重量百分位比为0.1％到80％，优选0.3％到60％，更优选0.5％到40％，最优选1％到20％。
当吸光剂比例过高时，会产生长余辉发光被吸光剂吸收而减弱的不利影响；当吸光剂比例过低时，吸收的激发光能量比较有限，也会导致长余辉发光较弱。另外，当缓存剂过少时，能量缓存能力较弱，导致长余辉发光的性能受到不利影响，例如影响到长余辉发光的稳定性和发光亮度等；当体系中添加的缓存剂过多时，会阻碍各组分之间的碰撞传能，缓存的能量无法有效地传输出去而被耗散掉，使得长余辉发光性能降低。
作为进一步优选地，吸光剂优选自卟啉类配合物、酞菁类配合物、量子点(QDs)、及其衍生物。例如以下示例性的一种或多种化合物：
以及石墨烯量子点、CdSe量子点和PbS量子点等量子点材料。
作为优选地，发光剂选自铱配合物、稀土配合物、氟硼二吡咯类化合物(BODIPY)、苝及其衍生物。例如以下示例性的一种或多种化合物：
优选地，缓存剂选自如下化合物：
一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析系统，包括试纸条和荧光免疫分析仪器；
试纸条的结合垫上标记有长余辉纳米微球偶联的生物标志物Ⅰ，检测线上标记生物标志物Ⅱ，质控线上标记活性检测物；
生物标志物Ⅰ、生物标志物II分别用于与待测目标物特异性结合；
活性检测物用于指示结合垫上标记物的有效性；
荧光免疫分析仪器包括光源、探测器、信息处理单元；
光源用于为长余辉纳米微球的长余辉激发及发光剂的荧光(或磷光)激发提供激发光；
探测器用于采集试纸条上的荧光信号和长余辉信号；
信号处理单元用于储存设定程序、标准曲线，发送程序指令，接收探测器采集的信号，并进行数据比对、分析、储存。
作为进一步优选地，试纸条包括底板、样品垫、结合垫、NC膜(硝酸纤维素膜)与吸水纸；NC膜设于底板的中部，结合垫与吸水纸分别搭接于NC膜的两侧，样品垫搭接于结合垫远离NC膜一侧。整体上样品垫、结合垫、NC膜与吸水纸顺次搭接于底板顶部。NC膜上设有检测线与质控线。
免疫层析试纸条免疫层析技术主要有双抗夹心法和竞争法。双抗夹心法主要用于检测蛋白等大分子类物质，如肿瘤标志物、病毒和炎性因子等。这些检测方法本身是已知的。例如，使用一对针对抗原不同表位的配对抗体，将捕获抗体固定在NC膜的检测线上，检测抗体偶联修饰的长余辉纳米微球则固定于结合垫上，羊抗鼠(或驴抗鼠、羊抗兔、兔抗鼠等)二抗作为质控线固定在NC膜上；检测过程中，将样品滴加在样品垫上，通过毛细作用泳动，依次通过结合垫，检测线和质控线发生特异性免疫反应。竞争法主要用于小分子物质检测。例如可以将全抗原固定在NC膜上形成检测线，抗体偶联修饰的长余辉纳米微球则固定于结合垫上，羊抗鼠(或驴抗鼠、羊抗兔、兔抗鼠等)二抗作为质控线；检测过程中，样品滴加在样品垫上，通过毛细作用依次通过结合垫，检测线和质控线，固定在检测线的抗原会和样本中游离的抗原与抗体发生竞争性结合。
作为优选地，数据比对包括比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT；
分析包括HT小于阈值DT时，利用荧光发光强度分析待测目标物浓度；HT大于或等于阈值DT时，利用长余辉发光强度分析待测目标物浓度。
作为优选地，为适应不同的激发功率，光源功率可调；光源为复合光，进而能够同时激发吸光剂和发光剂。
作为进一步优选地，光源的波长区间覆盖紫外光到近红外光的全部波段，配合滤光片或光栅可以调节获得在所述区间内特定波长范围的激发光。
作为进一步优选地，光源的波长区间同时包含至少两种单色光的波段，其中一种单色光为紫外光，波长范围为300nm-400nm。
作为进一步优选地，光源在结构上呈对称排列以形成环形光源，使出射的光束在照射到目标检测NC膜面时呈均匀分布。
进一步地，本发明方法及系统可应用于食品安全检测等领域，例如：在测试样品中细菌相关目标物的含量时，若细菌感染处于初期，需要试纸条具有高的灵敏度以对较低水平的目标物进行定量检测，即检测限低值较低；随着细菌的指数式繁殖增长，特异性目标物的含量也会发生巨大的变化，出现远高于检测限低值的高值，如目标物的浓度增长倍数可能高达6个数量级，对应地荧光信号强度的变化区间也将显著增大。在这种情况下，待检测目标物的变化情况已经远超过常规荧光免疫层析系统的可检测范围，常规的荧光免疫层析方法和系统根本无法对其进行定量检测，即可使用本发明方法及系统以保证检测灵敏度以及较宽的检测范围。
另外，如果同时对两种目标物进行检测，而两种目标物浓度范围差别巨大，常规的荧光免疫层析试纸条及检测仪器也会面临以上问题，无法实现有效的全范围定量检测；此时亦可利用本发明方法及系统，通过不同激发光激发荧光及长余辉发光，进而实现高浓度目标物与低浓度目标物的同时检测。
有益效果：
本发明提供了一种荧光和长余辉联合检测的免疫层析方法及系统，通过长余辉和荧光两种功能的组合可实现超大浓度范围的目标物检测，所述荧光功能部分对低值进行检测，所述长余辉功能部分对高值进行检测。
原理上，本发明的长余辉和荧光联用具有非常巧妙的设计：
一、荧光功能部分属于直接在激发光源照射的同时收集发光信号，而长余辉是在关闭激发光源一段时间后(≥100ms)采集发光信号，所以在时间维度上具有可程序化的先后顺序，方便检测流程的稳定进行。
二、荧光材料的发光寿命很短(<10ms，包括荧光或磷光)，在开始收集长余辉发光信号时荧光信号早已消失，所以荧光对长余辉信号的采集过程不受影响。
三、本发明的长余辉功能部分也具有荧光的功能，但是由于长余辉信号收集时已经过了至少100ms的衰减，而且长余辉信号发射过程较漫长(在秒级甚至分钟级，相当于光子在如此长的时间内慢慢地发出，远远比不上荧光在远小于10ms内即完全放出那么快速剧烈)，所以相同的微球量长余辉发光可以比荧光弱高达两个数量级。荧光和长余辉都属于对发光信号进行检测，在测得信号后其它原理一致。发光强度越高越利于对目标物低值进行检测，所以荧光可检测低值区间范围。长余辉发光强度较弱，在低值区间基本无信号，出现可检测信号的目标物浓度已经很高，例如高出荧光两个数量级，所以长余辉适合检测高值区间范围。利用这种独特的性质和设计，在不改变荧光免疫分析仪器的情况下，荧光适合低值检测，长余辉适合高值检测，自然就能够拓宽同一目标物检测范围或对两种浓度差异大的不同目标物进行定量检测。
综上所述，本发明以新型长余辉纳米微球作为实现手段，以可调光源作为辅助手段，最大程度地拓宽了检测范围，实现现有宽跨度待检物的准确测量，整个方法有效、可调、方便快捷，且测得数据准确、适用范围宽。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种荧光和长余辉联合检测的免疫层析方法及系统的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1所示为长余辉纳米微球偶联生物标志物Ⅰ的结构示意图。
图2所示为长余辉纳米微球的余辉发光机制示意图。
图3所示为试纸条结构示意图；
附图标号说明：1-底板；2-样品垫；3-结合垫；4-NC膜；5-吸水纸/吸水垫；6-检测线；7-质控线。
图4所示为选取沿试纸条上与质控线和检测线垂直的轴线方向为目标，绘制的信号强度分布图。
图5所示为HCG检测项目相关的荧光与长余辉检测线信号与浓度的关系。
图6所示为HCG检测项目中荧光与长余辉分别对应的T/C值与浓度的关系。
图7所示为待测目标物HCG浓度-荧光发光强度标准曲线段与待测目标物HCG浓度-长余辉发光强度标准曲线段。
图8所示为实施例4中，选取沿试纸条上与质控线和检测线垂直的轴线方向为目标，绘制的信号强度分布图，其中HT小于阈值DT。
图9所示为实施例5中，选取沿试纸条上与质控线和检测线垂直的轴线方向为目标，绘制的信号强度分布图，其中HT大于阈值DT。
图10所示为实施例6中，选取沿试纸条上与质控线和检测线垂直的轴线方向为目标，绘制的信号强度分布图，其中HT大于阈值DT。
图11所示为实施例6中，高功率下的待测目标物CRP浓度-荧光发光强度标准曲线。
图12所示为实施例6中，调低10倍后低功率下的待测目标物CRP浓度-荧光发光强度标准曲线。
图13、14所示为实施例8中一种荧光和长余辉联合检测的拍照式免疫层析系统；
附图标号说明：11-支撑架；12-底座；13-避光外壳；14-数字摄像头；15-滤波片；16-光源；17-试纸条；18-温育单元；181-温度探测器；182-加热片；183-制冷片。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。
实施例1
长余辉纳米微球的制备，将吸光剂(PdOEP)、发光剂(Eu-1)和缓存剂/>(CA-1)加入到5mL的苯甲醇-乙二醇-水(v:v:v，1:8:1)溶液中，其中PdOEP浓度为200μmol L-1，CA-1浓度为3mmol L-1，Eu-1浓度为50mmol L-1。各组分超声分散后，加入50mg 200nm表面带有羧基的聚苯乙烯纳米微球(载体微球)，在110℃加热30min。然后，冷却至室温，使用乙醇和水离心清洗3次，最后将纳米粒子分散到水中保存。
图1为长余辉纳米微球偶联抗体或适配体的结构示意图；图2为长余辉发光纳米材料的发光机制示意图。材料是支撑功能的基础，本发明使用的长余辉材料能有效的实现稳定、长时间的长余辉发光。
为了使材料实现免疫层析检测的功能，一般采用生物偶联的方式进行功能修饰，具体举例如下：
长余辉纳米微球偶联人绒毛膜促性腺激素(HCG)抗体HCG-Ab1制备：
1)取粒径为200nm的长余辉纳米微球100mg离心，去除上清，将沉淀复溶到18mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，充分超声使其分散均匀；
2)向其中分别加入10mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2.5mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHSS)，室温下反应2小时；
3)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，向其中加入10mg的HCG-Ab1型单克隆抗体，室温下反应4小时；
4)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，向其中加入100mg的BSA，室温下反应2小时；
5)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，4℃保存备用。
长余辉纳米微球偶联前列腺特异抗原(PSA)适配体制备：
1)取10mg长余辉纳米微球(粒径为200nm)离心，复溶到1.8mL的BBS缓冲液中(pH7.4)，充分超声使其分散均匀；
2)向其中分别加入1mg的EDC和0.25mg的NHSS，室温下震荡反应2小时；
3)反应结束后，离心洗涤，复溶到2mL的BBS缓冲液中，并向其中加入20μL含有2μmol mL-1的PSA适配体aptamer，其序列为NH2-ATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTGC，室温下反应4小时；
4)反应结束后，离心洗涤，复溶到2mL BBS缓冲液中，向其中加入10mg的BSA，室温下反应2小时；
5)反应结束后，离心清洗2遍，复溶到4mL BBS缓冲液中(pH 7.4)，4℃保存备用。
长余辉纳米微球偶联C反应蛋白(CRP)CRP-Ab1制备：
1)长余辉纳米微球100mg离心，复溶到18mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，充分超声使其分散均匀；
2)向其中分别加入10mg的EDC和2.5mg的NHSS，室温下反应2小时；
3)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，向其中加入10mg的CRP-Ab1型单克隆抗体，室温下反应4小时；
4)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，向其中加入100mg的BSA，室温下反应2小时；
5)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，4℃保存备用。
实施例2
试纸条的制备：如图3所示，试纸条包括底板1、样品垫2、结合垫3、NC膜4与吸水纸5；NC膜4设于底板1的中部，结合垫3与吸水纸5分别搭接于NC膜4的两侧，样品垫1搭接于结合垫2远离NC膜3一侧。整体上，样品垫2、结合垫3、NC膜4与吸水纸5顺次搭接粘附固定于底板1上面。NC膜4上平行划有检测线6和质控线7，待测目标物为抗原蛋白、抗体或核酸序列。
具体地，对于CRP检测试纸条，在白色PVC底板上依次相互交错2mm地贴上样品垫2，标记了CRP-Ab1型单克隆抗体偶联长余辉纳米微球的玻璃纤维(结合垫3)，划有CRP-Ab2型单克隆抗体的检测线6和驴抗鼠IgG的质控线7的NC膜4，最后贴上吸水纸5。接着将组装好的层析板通过高速斩切机切割成3.0mm宽的试纸条，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条。
对于HCG检测试纸条，在白色PVC底板上依次相互交错1-2mm地贴上样品垫2，标记了HCG-Ab1抗体偶联长余辉纳米微球与鸡IgY偶联长余辉纳米微球的玻璃纤维(结合垫3)，划有HCG-Ab2抗体的检测线6和羊抗鸡IgY的质控线7的NC膜4，最后贴上吸水纸5。接着将组装好的层析板通过高速斩切机切割成3.9mm宽的试纸条，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条。加样孔加入待测目标物HCG相关的样本。
准备荧光免疫分析仪器，包括光源、探测器和信息处理单元；
光源用于提供同时激发吸光剂和发光剂的复合光；
探测器用于采集试纸条上的荧光信号和长余辉信号；
信号处理单元用于储存设定程序、标准曲线，发送程序指令，接收探测器采集的信号，并进行数据比对、分析、储存。
实施例3
样本中HCG浓度-长余辉发光强度标准曲线的建立如下所示，HCG浓度-荧光发光强度标准曲线同理制得：
1)利用不含HCG的全血样品将HCG抗原储备液稀释为不同浓度的全血HCG抗原溶液，浓度分别为0mIU mL-1、10mIU mL-1、100mIU mL-1、500mIU mL-1、1000mIU mL-1、5000mIUmL-1、10000mIU mL-1、20000mIU mL-1、50000mIU mL-1和100000mIU mL-1。
2)分别取2μL不同浓度的全血HCG抗原溶液加入到98μL的BBS缓冲液中(含有1％的BSA、2％的NaCl、0.1％的吐温和1％的蔗糖)，并充分混合。
3)将混合均匀的100μL混合液加入到实施例2制备的HCG检测试纸条样品垫上，液体会通过毛细作用依次通过结合垫、NC膜、吸水纸。检测样本中含有抗原溶液时，抗原首先与结合垫上HCG-Ab1抗体偶联的长余辉纳米微球结合形成免疫复合物，然后随着液体泳动到检测线与HCG-Ab2形成三明治夹心免疫复合物，另一部分鸡IgY偶联的长余辉纳米微球则泳动到质控线与羊抗鸡IgY结合。
4)反应进行10分钟后，使用荧光免疫分析仪器进行检测，利用光源照射试纸条，探测器(数字摄像头)采集检测线(T线)和质控线(C线)的荧光发光强度，再计算检测线和质控线荧光强度的比值，基于比值与HCG抗原浓度建立标准曲线。关闭光源，探测器(数字摄像头)采集检测线和质控线的长余辉发光强度，再计算检测线和质控线长余辉发光强度的比值，基于比值与HCG抗原浓度建立标准曲线。
选取沿试纸条上与质控线和检测线垂直的轴线方向为目标，绘制信号强度分布图，如图4所示。
如图5所示，在HCG标准曲线绘制过程中，当使用荧光信号时，HCG浓度在10000mIU/mL时，检测线信号接近系统检测阈值上限(55000)。当HCG浓度超过10000mIU/mL后，检测线信号超过阈值上限，这时检测信号是不准确的，难以维持标准曲线的线性。而当使用长余辉信号时，HCG浓度即使是再增加10倍到100000mIU/mL时，检测线信号只有系统检测阈值上限的五分之一以内，对于更大浓度的HCG检测还有较大的剩余空间。
通过待测目标物浓度-荧光发光强度标准曲线与待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线的对比，不难发现荧光在低浓度时就有较好的响应，即其线性区间下限较小，反映了较高的检测灵敏度。随着浓度的增高，曲线开始逐渐走平。但此时的待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线则响应良好，远没到检测阈值上限，即其线性区间上限较大，反映了较宽的检测范围。
进一步地，计算T比C值(T/C值)如图6所示。在荧光信号模式中，线性只能勉强维持到10000mIU/mL，随后开始平缓走低；反观长余辉信号模式，从10000mIU/mL到100000mIU/mL的高浓度下，线性依然保持良好。
实施例4
根据实施例3的结果，HCG检测的标准曲线由荧光标准曲线段和长余辉标准曲线段组成，分别覆盖HCG低值和HCG高值部分，如图7所示。
基于此，一种荧光和长余辉联合检测的免疫层析方法，包括以下步骤：
S1、准备实施例2中的HCG检测试纸条；
S2、于试纸条结合垫上滴加含全血HCG抗原溶液样品，至其层析过程完成；
S3、光源照射经步骤S2上样后的试纸条，荧光免疫分析仪器的探测器测定检测线与质控线处的荧光信号强度，分别测得检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT(33800)、质控线处最大峰值对应的最大荧光强度值HC(6200)；
S4、比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT(55000)；
如图8所示，HT小于阈值DT，将荧光发光强度与预存的待测目标物浓度-荧光发光强度标准曲线拟合(图7中的荧光标准曲线段)，得到待测目标物浓度：HCG浓度为5760mIU/mL。
实施例5
根据实施例3的结果，HCG检测的标准曲线由荧光标准曲线段和长余辉标准曲线段组成，分别覆盖HCG低值和HCG高值部分，如图7所示。
基于此，一种荧光和长余辉联合检测的免疫层析方法，包括以下步骤：
S1、准备实施例2中的HCG检测试纸条；
S2、于试纸条上滴加含全血HCG抗原溶液样品，至其层析过程完成；
S3、光源照射经步骤S2上样后的试纸条，荧光免疫分析仪器的探测器测定检测线与质控线处的荧光信号强度，分别测得检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT(58000)、质控线处最大峰值对应的最大荧光强度值HC；
S4、比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT(55000)。如图9所示，HT大于阈值DT，关闭光源，探测器收集检测线与质控线处的长余辉信号强度；
S5、测得检测线处最大峰值对应的最大长余辉强度值HT(2600)，质控线处最大峰值对应的最大长余辉强度值HC，将长余辉发光强度与预存的待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线拟合(图7中的长余辉标准曲线段)，得到待测目标物浓度：HCG浓度为44000mIU/mL。
实施例6
扩大荧光免疫分析仪器检测范围的方法，包括以下步骤：
S1、准备实施例2中的CRP检测试纸条；
S2、于试纸条上滴加含全血CRP抗原溶液样品，至其层析过程完成；
S3、光源照射经步骤S2上样后的试纸条，荧光免疫分析仪器的探测器测定检测线与质控线处的荧光信号强度，分别测得检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT(56000)，质控线处最大峰值对应的最大荧光强度值HC(15000)；
S4、比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT(55000)；如图10所示，HT大于阈值DT。如果按照高功率下的待测目标物浓度-荧光发光强度标准曲线(图11)，无法获得准确的CRP浓度值。故调低光源功率，重复步骤S3。
S5、将光源功率调低10倍，新测得的HT为14000，新测得的HC为1550，经过比较确定新测得的HT小于阈值DT，将荧光发光强度与预存的低功率下待测目标物浓度-荧光发光强度标准曲线拟合(图12)，得到待测目标物浓度：CRP浓度为250μg/mL。
实施例7
根据实施例3的结果，HCG检测的标准曲线由荧光标准曲线段和长余辉标准曲线段组成，分别覆盖HCG低值和HCG高值部分(图7)。
基于此，一种荧光和长余辉联合检测的免疫层析方法，包括以下步骤：
S1、准备实施例2中的HCG检测试纸条；
S2、于试纸条上滴加含全血HCG抗原溶液样品，至其层析过程完成；
S3、光源照射经步骤S2上样后的试纸条，荧光免疫分析仪器的探测器测定检测线与质控线处的荧光信号强度，分别测得检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT(59000)，质控线处最大峰值对应的最大荧光强度值HC；
S4、比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值(55000)；HT大于阈值上限DT，准备下一步调低光源功率5倍，重复步骤S3与阈值比较。
S5、将光源功率调低5倍后，新测得的HT为56800，经过比较确定新测得的HT仍大于阈值，关闭光源，探测器收集检测线与质控线处的长余辉信号强度；测得检测线处最大峰值对应的最大长余辉强度值HT(3200)，质控线处最大峰值对应的最大长余辉强度值HC，将长余辉发光强度与预存的待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线拟合，得到待测目标物浓度：HCG浓度为53000mIU/mL。
实施例8
一种荧光和长余辉联合检测的拍照式免疫层析系统，如图13、14所示，包括支撑架11、底座12、避光外壳13；
支撑架内由上至下分别设置探测器(数字摄像头14)、滤波片15、光源16(复合光)；
底座12设置于支撑架11底部，底座12上设置试纸条安装位和温育单元；
试纸条安装位可设置为单个试纸条17的安装位，也可设置为容纳多个试纸条并排检测的安装位；
温育单元18包括温度探测器181、加热片182、制冷片183，用于为试纸条提供温育环境；
避光外壳13罩设于支撑架11和底座12外。
还包括信息处理单元(单片机21)，与数字摄像头14、光源16、温育单元18连接，用于储存设定程序、标准曲线，接收数字摄像头的信号以及温度探测器获取的温度信息，发送拍照、开光光源、开关加热制冷等程序指令，并进行数据比对、分析、储存。
数据比对包括比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT；
分析包括HT小于阈值DT时，利用荧光发光强度分析待测目标物浓度；HT大于或等于阈值DT时，利用长余辉发光强度分析待测目标物浓度。
实施例9
根据实施例3的结果，HCG检测的标准曲线由荧光标准曲线段和长余辉标准曲线段组成，分别覆盖HCG低值和HCG高值部分(图7)。
基于此，一种荧光和长余辉联合检测的免疫层析方法，包括以下步骤：
S1、准备实施例2中的HCG检测试纸条两个；
S2、于两个试纸条上分别同时滴加含全血HCG抗原的两个样本溶液，至其层析过程完成；
S3、使用实施例8荧光免疫分析仪器对这两个试纸条同时进行测试，光源照射经步骤S2上样后的两个试纸条，数字摄像头成像并经过单片机进行的数据处理，分别测定检测线与质控线处的荧光信号强度，测得第一个试纸条检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT1(23000)，第二个试纸条检测线处最大峰值对应的最大荧光强度值HT2(57600)；
S4、比较检测线处最大荧光强度值HT1与荧光免疫分析仪器的阈值DT(55000)，HT1小于阈值上限DT，将荧光发光强度与预存的待测目标物浓度-荧光发光强度标准曲线拟合(图7荧光标准曲线段)，得到待测目标物浓度：样本1中HCG浓度为390mIU/mL；HT2大于阈值上限DT，进一步仪器系统转变为测试长余辉模式。
S5、关闭光源，数字摄像头收集检测线与质控线处的长余辉信号强度，测得第二个试纸条检测线处最大峰值对应的最大长余辉强度值HT(2500)，将长余辉发光强度与预存的待测目标物浓度-长余辉发光强度标准曲线拟合(图7长余辉标准曲线段)，得到待测目标物浓度：样本2中HCG浓度为41000mIU/mL。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析系统，其特征在于，包括试纸条和荧光免疫分析仪器；
所述试纸条包括：
长余辉纳米微球，包括载体微球和包埋于载体微球内部的长余辉发光材料；
吸光剂：吸收激发光的能量后产生单线态氧；
缓存剂：被所述单线态氧氧化生成不稳定中间体，所述不稳定中间体断键释放能量；
发光剂：吸收所述不稳定中间体断键释放的能量，并释放长余辉；
所述吸光剂选自卟啉类染料、酞菁类染料、过渡金属配合物、量子点QDs中的至少一种；
所述发光剂选自铱配合物、稀土配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物BODIPY中的至少一种；
所述缓存剂选自如下化合物：
所述试纸条的结合垫上标记有长余辉纳米微球偶联的生物标志物I，检测线上标记生物标志物Ⅱ，质控线上标记活性检测物；
所述生物标志物Ⅰ、生物标志物II分别用于与待测目标物特异性结合；
所述活性检测物用于指示结合垫上标记物的有效性；
所述荧光免疫分析仪器包括光源、探测器、信息处理单元；
所述光源用于提供激发光；
所述探测器用于采集试纸条上的荧光信号和长余辉信号；
所述信号处理单元用于储存设定程序、标准曲线，发送程序指令，接收所述探测器采集的信号，并进行数据比对、分析、储存；
所述数据比对包括比较检测线处最大荧光强度值HT与荧光免疫分析仪器的阈值DT；
所述分析包括HT小于阈值DT时，利用荧光发光强度分析待测目标物浓度；HT大于或等于阈值DT时，利用长余辉发光强度分析待测目标物浓度；
所述光源功率可调；
所述光源为复合光；
光源用于提供同时激发吸光剂和发光剂的复合光。
2.如权利要求1所述的一种荧光与长余辉联合检测的免疫层析系统，其特征在于，包括以下步骤：
所述待测目标物为核酸、抗原蛋白或抗体。
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