基于免疫比浊和余辉发光的均相联合检测试剂和检测方法
发明领域
本发明涉及免疫检测技术领域,尤其涉及一种基于免疫比浊和余辉发光的均相联合检测试剂组合物、试剂盒和相应的检测方法。
发明背景
体外诊断是现今用于诊断各种疾病的主要途径。除疾病诊断之外,体外诊断试剂更被用于个人健康水平的检测及预警。体外诊断试剂的涉及范围极广,包括了肝肾功能、心梗检测和炎症诊断等一系列项目。体外诊断多使用血液、尿液、唾液作为检测样本,以求达到快速、便捷、精准的诊断目的。
在体外诊断领域,免疫检测技术是重要的组成部分。免疫检测技术是一种利用抗原与抗体特异性反应而建立的检测方法。在临床诊断方面,免疫检测技术主要包括免疫比浊法、化学发光法、电化学发光法、时间分辨免疫荧光法和免疫层析法等。化学发光法和电化学发光法在操作上较为复杂,需要多步洗涤,因此出首诊报告的时间通常需要长达1-2小时。时间分辨免疫荧光法因涉及到溶解解离过程,也需要多步操作和洗涤,出首诊报告的时间也需要1-2小时。因此,化学发光法、电化学发光法、时间分辨免疫荧光法这3种方法都不是均相免洗体系,都需要多步操作,无法实现快速诊断。免疫层析法具有使用便捷、快速,适合用于口岸等床旁的即时检测,但免疫层析法需要使用试纸条作为载体,属于干式检测方法,其精准度较差,基质影响较大,检测通量难以提高。
免疫比浊法是最为普遍应用的检测方法之一,其优势在于均相反应,检测用时短、效率高,生产试剂成本较低,技术平台较为成熟等。同时,免疫比浊法的劣势也较为明显,主要体现在检测灵敏度不够,很多高灵敏项目的检测无法实现。均相免疫比浊法主要针对待测物含量在μg/mL以上级别的检测项目。
目前,对于待测物含量较低时,可选择例如均相发光免疫检测的方法,这是一类具有较高灵敏度的均相免疫检测方法。均相发光免疫检测法是一种基于微球与微球、粒子与粒子、或分子与分子之间靠近的效应,并用于待测样本中目标分析物检测的方法,例如均相FRET、均相化学发光等。通过对光信号的强度检测,来判断实际检测样本中有无待测目标分析物或进一步得到目标分析物的浓度信息。
随着科技的进一步发展,体外检测如今呈现套餐化,希望通过一次取样检测多个免疫指标能够更加精准对疾病做出判断。因此,多个项目联检大大提高了检测效率。但是,由于不同待测物在样本中的含量不同,不同项目的检验灵敏度和线性范围技术要求也不同。因此,一次采取样本进行多项目联检是个挑战。
已经有报道可以将光激化学发光法用于多项目联检,其通过调节不同能量供受体的组合以产生不同波长的发光信号,从而同时检测样本中多个待测物含量。但是,这种基于均相化学发光的均相发光免疫检测方法是在波长维度上对发光信号进行区分,由于被检测的两个发光波长可能存在着光谱重叠的现象,导致两个检测项目的发光信号存在互相干扰,所以可能导致假阳性和假阴性的结果,严重影响检测的准确性。
另外,在检测中经常涉及到多种待测物指标。由于这些待测物在体内的浓度含量存在巨大差异,难以使用一种方法同时对它们进行准确的检测。例如在炎症的诊断和鉴别中,C反应蛋白(CRP)是mg级含量水平的物质,降钙素原(PCT)是pg级含量水平的物质,如此明显的浓度差异会导致所对应检测信号强度的巨大差异,弱信号会被强信号掩盖或被严重干扰。因此,单次取样难以完成这两种项目的准确检测。
总之,现有技术的检测方法仍有不足,期望能够进一步提高诊断的效率,提高临床检测准确度和灵敏度以及缩短出首诊报告的时间。同时,还希望开发出一种能够实现通过一次取样而检测多个免疫指标的均相检测方法,尤其是针对那些在体内浓度差异巨大而难以同时准确检出的待测物。
发明内容
针对现有技术的上述这些缺陷,本发明提供了一种基于免疫比浊和余辉发光的均相联合检测试剂组合物、试剂盒和相应的检测方法。该方法利用余辉发光材料的特性,使得可以在不同的时间维度上读取光照射后的光学信号,并且将其与免疫比浊法相结合,从而得到一种联合均相免疫检测试剂组合物、试剂盒及均相免疫检测方法。
通过本发明,将余辉发光和比浊法联合,产生的余辉发光信号和浊度信号间没有交叉干扰。浊度不会造成余辉发光的淬灭,而余辉发光的微球的聚集也可以增强浊度的变化灵敏度,从而提高检测灵敏度,获得稳定性高、重复性好及灵敏度高的均相同步检测结果。此外,可以例如在一个反应管内实现两个生物分子(比浊生物标志物和余辉生物标志物)以及多个生物分子(一个比浊生物标志物和多个余辉生物标志物)的同步均相检测,即使不同待测物的浓度水平差异巨大。
因此,本发明的第一个方面涉及一种均相联合检测试剂组合物,其包括浊度试剂I和发光试剂II,其中
所述浊度试剂I包含连接有能与比浊生物标志物特异性结合的对应物的载体微球,所述浊度试剂I与比浊生物标志物发生免疫反应而使浊度增加;
所述发光试剂II包含:
供体组分II-1,其包含连接有能与余辉生物标志物特异性结合的对应物的供体微球,所述供体微球在光激发下产生单线态氧,和
受体组分II-2,其包含连接有能与余辉生物标志物特异性结合的对应物的受体微球,所述受体微球与单线态氧反应产生余辉发光信号。
在根据本发明的检测过程中,由于浊度试剂组分会与比浊生物标志物发生免疫反应而发光试剂的两种组分也会与余辉生物标志物发生特异性免疫反应,所以用激发光源照射后形成第一复合物和第二复合物。第一检测器将比浊复合物(第一复合物)产生的光信号转化成电信号从而收集浊度OD值。与此同时,余辉复合物(即第二复合物)已被激发光激发。然后,可以关闭激发光源,用第二检测器将第二复合物产生的将光信号转换成电信号从而收集余辉发光值。第一和第二检测器可以是不同的设备也可以集成在单一设备中。
本发明的发明人发现,比浊信号对余辉信号的测定基本不存在影响。一方面,由于比浊光信号和余辉发光信号不同,并且两种信号由两种不同光学检测器分别收集并且信号收集时间不同(余辉信号是在关闭激发光后收集发光信号),从而避免了交叉干扰。另一方面,由于比浊微球修饰的对应物和余辉微球(能量供体微球和能量受体微球)修饰的对应物本身存在特异性,其与各自特定待测物的免疫反应的亲和力远大于微球间的物理吸附力,所以比浊微球和余辉微球倾向于各自形成复合物而较少相互干扰,同时在低浓度微球修饰下形成的比浊复合物不会引起余辉发光的淬灭。
另外,发明人还发现,虽然余辉发光试剂对比浊测定有一定影响(这是因为第一检测器收集的是第一复合物和第二复合物的总的浊度值),但是这样的影响可以很容易地通过校准操作而消除。
本发明采用一步法检测模式,即可以一次取样后将样本一次加入预先混好的包含上述三种微球的混合液中,随后放入检测仪中由仪器自动检测显示结果。
在本发明的方法中,样品和检测试剂都是连续加入,不需分两次。一般认为几种微球同时加入会由于微粒体积比待测物如抗体及蛋白分子大,使得运动较慢影响反应速度。但发明人发现,在均相环境中生物分子可以很快运动,微球对它的位阻效应小。微球预混,不会减少样品中自由的生物分子和对应物碰撞的机会,因此不会影响检测时的反应时间。这种方法大大降低了检测人员的劳动强度,节约了时间。
此外,利用本发明的均相联合检测试剂组合物和检测方法可以直接检测全血样本,将微量的全血样本直接加入到包含如上所述的几种微球的检测试剂混合液中进行测试。这种方法省去了常规的均相反应样本前处理的流程,大大降低了整个检测流程的时间。
最后,本发明的优点还在于解决了对单一样本中的含量差别较大(如含量相差大于100倍)的多种抗原或抗体实现联检的问题。例如对于CRP、SAA、PCT、IL-6的检测,CRP、SAA是mg级水平的物质,而PCT、IL-6则是pg级水平的物质。对于CRP、SAA这类物质更适合使用免疫比浊法进行检测,而对于高灵敏的PCT、IL-6项目则更适合使用均相发光检测。本发明由于结合了这两种检测方法的优点并且不会产生相互干扰,因此能够利用时间维度和抗原浓度差异实现联检技术的有机整合,通过一次测试能完成所有项目的检测。此外,该检测不仅局限于炎症标志物,也能应用于肝肾功能和心梗指标等方面的标志物。
以下将对本发明做进一步详细的阐述。
定义
在本发明范畴内适用如下定义。
“生物标志物”一般是指可供客观测定和评价的一个生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标,其可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变。生物标志物应当具有一定的特异性和具有足够的灵敏度,特别是在比浊检测和发光检测过程中。本领域技术人员知道如何选取合适的生物标志物作为“比浊生物标志物”和“余辉生物标志物”。例如,可以根据体内各自不同的浓度以及相应合适的检测方式而选择将某种生物标志物作为比浊生物标志物或余辉生物标志物。适合本发明的生物标志物的例子包括C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、降钙素原(PCT)、白介素-6(IL-6)和病毒如HIV病毒等。
“与(比浊/余辉)生物标志物特异性结合的对应物”指的是能够与生物标志物发生特异性反应从而与之结合或偶联的物质。这样的物质还能够通过偶联的方式修饰在载体微球、能量供体微球和能量受体微球上。这样的物质的例子包括单克隆抗体和/或多克隆抗体等。在例如生物标志物是CRP的情况下,可以与CRP特异性结合的对应物可选自CRP单克隆抗体或CRP多克隆抗体,优选为CRP多克隆抗体。
本申请中,所述“浊度信号值(OD)”表征了由微量不溶性物质(如微球)造成的溶液的混浊程度。现有技术中可以采用多种不同的浊度计来测量浊度信号值,这是本领域技术人员已知的测量技术。所述“余辉信号值”特别指的是余辉材料在激发光照射关闭之后的发光强度值。同样的,余辉的强度值的测量同样可以采用多种不同的测量仪来进行。在本申请中,余辉信号值与浊度信号值都直接与各自生物标志物的浓度相关,因此对浊度值和余辉强度值的测量方式本身并没有特别的限定。
载体微球
在本发明上下文中,“载体微球”指的是球状或粒状的载体基质,其上可以负载具有不同功能的不同种类的物质,如发光剂、吸光剂、与待测物特异性反应的对应物和缓存剂等。适用于免疫检测技术的常见的载体微球的例子包括水凝胶微球、苯乙烯聚合物微球、蛋白质微球、硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球或者两种或更多种的混合物。这样的混合物包括例如以上述一种微球材料包裹另一微球的包裹形式,例如苯乙烯聚合物包覆的SiO2微球、水凝胶包覆的SiO2微球、水凝胶包覆的苯乙烯聚合物乳胶微粒、水凝胶包覆的交联的苯乙烯聚合物乳胶微粒等。
硅微球是指二氧化硅微球。苯乙烯聚合物微球则包括苯乙烯的均聚物或者其与其他可共聚单体形成的共聚物。硅微球和苯乙烯聚合物微球是领域内已知并商业化的微球种类,可以由已知的方法合成大批量且粒径均匀的微球。适于本发明的蛋白质微球理论上没有限制,但优选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、丝素蛋白、酪蛋白的一种或多种,更优选牛血清白蛋白。由这些蛋白形成微球的方法也是本领域已知的。此外,可以优选使得这些载体微球表面含有氨基、羧基、和/或醛基等基团,从而本发明的微球表面可以利用这些基团而偶联上对应物或适配体。
此外,优选的,根据本发明的载体微球的粒径的变异系数小于10%、优选小于5%和更优选小于3%。变异系数(CV)表示数据标准偏差与平均值的比值,它是对数据点在一系列数据中围绕平均值的离散度的统计度量。在本发明范畴内,载体微球,如苯乙烯聚合物微球粒径的变异系数越小越有利于在实际应用中获得稳定可重复的检测效果。本领域技术人员熟悉变异系数的测量方法及所需的测量仪器。
在本发明中,“(能量)受体微球”在发光试剂中是接收激发光能量的部分,产生单线态氧。“(能量)供体微球”则在发光试剂中接收能量供体微球产生的单线态氧,进而发射出光子信号。这两种微球都是基于载体微球的并且由负载于载体微球上的功能物质而实现其各自的功能。
从均相联合检测技术的角度来看,所述浊度试剂和发光试剂中所用的载体微球优选是基于苯乙烯聚合物的微球。所述的“苯乙烯聚合物”指的是苯乙烯的均聚物或其与其他可共聚单体形成的高分子共聚物。这样的可共聚单体的例子包括烯烃、炔烃、烯属不饱和羧酸或其酸酐或酰胺或酯等、以及它们的具有一个或多个取代基的衍生物形式,如丁二烯、马来酸酐、(甲基)丙烯酸或(甲基)丙烯酰胺等。在此,所述的“烯烃”或“炔烃”指的是直链、支化或环状的具有一个或多个C-C双键或三键的不饱和脂族烃,优选具有2-50、更优选2-24、如4-18个碳原子。所述的“不饱和羧酸”尤其指的是脂族的烯属不饱和羧酸,即具有式Y-COOH,其中Y是具有一个或多个C-C双键取代C-C单键的C2-C18、如C3-C8的直链、支化或环状的脂族烷基,更优选(甲基)丙烯酸。所述“取代基”包括卤素、氨基、酰胺基、醛基和/或羧基等。
优选的,苯乙烯聚合物微球表面可以含有选自氨基、酰胺基、羧基、和/或醛基的偶联基团,从而可以利用这些基团而更好地在微球表面上偶联(如通过偶联剂如EDC(碳二亚胺))能与余辉生物标志物特异性结合的对应物如抗体。特别优选的,所述苯乙烯聚合物微球是醛基或羧基化的苯乙烯聚合物微球。因此,优选的,共聚单体可以具有一个或多个选自氨基、酰胺基、羧基和/或醛基的基团,如(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酰胺或氨基取代的烯烃等。
根据本发明的一个有利的实施方式,形成所述微球的苯乙烯聚合物中包含按所有单体总重量计的1%-15%,更优选2%-10%的上述共聚单体。优选的,根据本发明的苯乙烯聚合物或其微球含有基于聚合物总重量计0.05%-5%,更优选为0.1%-2%的如上所述的偶联基团。这样的优选的苯乙烯聚合物易于获得并且特别适合于免疫检测应用。
在一个更优选的实施方式中,所述苯乙烯聚合物是由苯乙烯、(甲基)丙烯酸或其酯或(甲基)丙烯酰胺以及任选的其他共聚单体形成的共聚物。
本发明范畴内,可以直接采用本身以微球形式合成得到的载体微球如苯乙烯聚合物。取决于不同的聚合和处理工艺,可以包括如下的微球结构:核壳结构、水包油结构、油包水结构、介孔结构、中空结构、可溶胀结构等。优选地,载体微球的结构选自中空结构、介孔结构和核壳结构。不同结构可根据负载量进行选择,例如选择中空结构的微球可以吸附更多的发光剂、吸光剂和缓存剂。一般而言,随着载体微球的粒径增大,单个微球中含有的发光剂、吸光剂和缓存剂的数量或质量增多,由此单个微球的余辉发光增强对测试信号的高效检出是有利的;但是粒径太大则不利于微球在溶液中的扩散,从而影响免疫结合反应。因此为了获得理想的余辉检测效果,本发明的载体微球有利地具有30nm–1000nm,更优选50nm–800nm,最优选100nm–500nm范围内的粒径。
浊度试剂I
在根据本发明的均相联合检测试剂组合物中包含浊度试剂I,其包含连接有能与比浊生物标志物特异性结合的对应物的载体微球,所述对应物与比浊生物标志物发生免疫反应从而产生不溶解的第一复合物,该复合物会使得浊度增加,从而被第一检测器检测。
在浊度试剂I中,与比浊生物标志物特异性结合的对应物通过偶联的方式修饰在载体微球。在一个优选的实施方式中,该对应物在浊度试剂I中的质量百分比含量为0.5-20%,优选1-10%,以浊度试剂I总重计。
发光试剂II
在根据本发明的均相联合检测试剂组合物中还包含发光试剂II,其包含:
供体组分II-1,其包含连接有能与余辉生物标志物特异性结合的对应物的供体微球,所述供体微球在光激发下产生单线态氧,和
受体组分II-2,其包含连接有能与余辉生物标志物特异性结合的对应物的受体微球,所述受体微球与单线态氧反应产生余辉发光信号。
在所述发光试剂II的供体组分II-1和受体组分II-2中均包含连接在供体或受体微球上的能与余辉生物标志物特异性结合的对应物。这些对应物在供体组分II-1和受体组分II-2中的质量百分比含量均可以为0.0006%~0.1%,优选0.001%~0.05%,基于各自组分II-1或II-2的总重计。所述物质与余辉生物标志物发生免疫反应从而产生第二复合物。
根据本发明,所述供体微球包括载体微球和吸光剂或者由它们组成,而所述受体微球包括载体微球、光化学缓存剂和发光剂或者由它们组成。在本发明的方法中,通过供体组分和受体组分的光能量传递而实现发光,特别是余辉发光的功能。所述光化学缓存剂可在所述发光剂和所述吸光剂之间构建能量交换和储存的桥梁,使输入的激发光能量以发光的形式释放出来并保持一定时间,从而实现余辉发光。
吸光剂和发光剂
在本申请中,吸光剂和发光剂本身是现有技术已知的。吸光剂通常指能吸收并捕获来自于自然光源或人工光源的光能的物质。吸光剂的选取范围包括传统的光敏试剂和其他能量供体材料等。而发光剂通常指能够将能量最终以光能的形式发射出来的物质。发光剂可以是能够产生荧光或磷光等的发光物质。有关的发光分子基团本身是已知的,并且可参考例如Jeff W.Lichtman等人的综述性论文Nature Methods,2005,2,910-919。
为了利用余辉材料的有益效果,特别是例如改善余辉强度和时间,在本发明的组合物中对发光剂和吸光剂两个组分做了明确区分,使其各自分别承担吸收光能和释放光能的作用,从而在与经过特定筛选的光化学缓存剂组合之后实现能量输入、能量缓存和能量输出的能量利用路径。这也意味着,在有利的实施方式中,在结构上既具有吸光基团也具有发光基团从而可以以同一分子发挥两种功能的化合物不是根据本发明的发光剂或吸光剂,并且也不会得到本发明的优异技术效果。一方面,这样的化合物等同于把吸光剂与发光剂连同它们的性质一起打包绑定,就无法分别地对余辉发光试剂的激发和发光性能进行调节,例如当其根据实际的激发充能的需要选取了一个化合物后,试剂的发光性质也同时固定了,反之亦然;另一方面,这样的化合物等同于把吸光剂与发光剂的比例固定为例如1:1,无法同时调节吸光程度的强弱和发光水平的高低;而且,同时具备高效吸光功能与高效发光功能的材料相对较少。
在根据本发明的发光试剂中,吸光剂与发光剂的选取具有一定的规则标准。一般而言,将具有较大的摩尔吸光系数的化合物选取作为吸光剂,例如光敏剂或能量供体染料;而将具有更高发光量子效率的化合物选取作为发光剂,例如发光染料。另外,吸光剂的吸收峰应该与发光剂的发射峰尽可能少的重叠,避免余辉发光被吸收剂吸收而减弱的不利影响。
本申请的发明人发现,从提高发光亮度或发光信号强度的角度考虑,所述吸光剂和发光剂应当有利地分别是选自如下的不同分子式或不同结构的至少一种化合物:卟啉和酞菁类染料、金属配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物(BODIPY)、量子点(QDs)、石墨烯类,以及这些化合物的衍生物或共聚物。有利的,在本发明中所用的发光剂是单体的非聚合的化合物且其分子量小于10000g mol-1。在本申请上下文中,所述分子量指的是化合物的重均分子量,其可以通过质谱、气相色谱、液相色谱的方法测得。可供选用的仪器可以是例如质谱分析仪、或者液相-质谱联用仪。在此,所述非聚合的化合物指的是该化合物结构中不包含通过聚合或低聚反应得到的超过2个的重复单元。
更有利地,用于本发明的发光试剂中的吸光剂和发光剂分别选自如下这些。
(1)吸光剂
优选的,所述吸光剂可选自卟啉类和酞菁类染料、过渡金属配合物、量子点(QDs),以及这些化合物的衍生物或共聚物。这些化合物本身是本领域技术人员已知的,以下提及吸光剂的一些非限制性的实例。
作为卟啉类染料及其配合物可以提及例如以下这些化合物:
作为酞菁类染料及其配合物可以提及例如以下这些:
在以上所示的这些吸光剂化合物的结构式中,
X表示卤素如F,Cl,Br,I;和
M=金属元素,如Al,Pd,Pt,Zn,Ga,Ge,Cu,Fe,Co,Ru,Re,Os等。
各个取代基R如R1-24表示H、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、醛基、硝基、磺酸基、卤素,或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、芳基、具有N、O或S的杂芳基、烷氧基、烷氨基,或者它们的组合。优选地,上述基团R如R1-24各自独立地选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、苯基或者它们的组合。
可以用作吸光剂的过渡金属配合物本身是已知的,并且优选是如上所示的那些卟啉类和酞菁类染料的配合物。
合适的量子点材料包括例如石墨烯量子点、碳量子点和重金属量子点。
重金属量子点包括例如Ag2S、CdS、CdSe、PbS、CuInS、CuInSe、CuInGaS、CuInGaSe、InP量子点。其外可以包裹壳层,形成核壳结构,壳层可以为Ag2S、CdS、CdSe、PbS、CuInS、CuInSe、CuInGaS、CuInGaSe中的一种或几种,也可以为ZnS层。
优选地,采用表面配体对量子点进行修饰,所述表面配体可以是例如油酸、油胺、十八烯、十八胺、正十二硫醇及其组合等。在一些更有利的情况下,量子点表面的配体通过配体交换策略部分更换为含有三线态的分子结构,例如羧基蒽,羧基并四苯、羧基并五苯、氨基蒽、氨基并四苯、氨基并五苯、巯基蒽、巯基并四苯、巯基并五苯等。
在一个更优选的实施方式中,所述吸光剂优选自卟啉和酞菁类的配合物、量子点(QDs)、以及这些化合物的衍生物。例如以下这些示例性的一种或多种化合物:
以及还有石墨烯量子点、CdSe量子点和PbS量子点等量子点材料。
(2)发光剂
优选的,所述发光剂可选自铱配合物、稀土配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物(BODIPY)、以及这些化合物的衍生物和共聚物。
作为氟硼二吡咯类化合物(BODIPY),可以提及例如以下这些化合物:
作为并苯类化合物,可以提及例如以下这些化合物:
在以上所示的这些发光剂化合物的结构式中,
n=大于等于0的整数,例如0、1、2和3;
各个取代基R如R1-16表示H、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、醛基、硝基、磺酸基、卤素,或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、芳基、具有N、O或S的杂芳基、烷氧基、烷氨基,或者它们的组合。优选地基团R如R1-16选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、苯基;或者它们的组合。
适合作为发光剂试剂的铱配合物中,配体的组成可以是一种或多种不同配体的组合,其结构示意及部分C-N,N-N,O-O和O-N配体的种类例示性展示如下(其中所示的C-N,N-N,O-O和O-N配体为其简略结构示意图且分别突出表示以配体中的C与N原子、两个N原子、两个O原子和O与N原子为配位点与铱原子Ir进行配位作用,这样的表示方法是本领域技术人员熟悉和理解的):
其中C-N配体可以具有例如以下结构:
O-N配体可以具有例如以下结构:
N-N配体可以具有例如以下结构:
作为发光剂的稀土配合物可以例如是这样的结构,其中中心原子为镧系元素,配体以O或N与中心原子配位,一般中心原子为Eu、Tb、Sm、Yb、Nd、Dy、Er、Ho、Pr等。这些稀土配合物的配位数大约在3到12,优选6到10。在实际的稀土配合物中,配体种类、每个配体的个数和总的配位数可以发生变化。稀土配合物及其配体可参考例如Jean-Claude G.Bünzli的综述性论文Coord.Chem.Rev.,2015,293-294,19-47。
在一个更优选的实施方式中,所述发光剂选自铱配合物、稀土配合物、氟硼二吡咯类化合物(BODIPY)、苝以及这些化合物的衍生物。例如以下这些示例性的一种或多种化合物:
光化学缓存剂
光化学缓存剂的功能主要是光化学能量的转化,与主要功能为发光的发光剂不同,缓存剂分子本身不发光或发光很弱,其分子结构中一般不包含直接能发光的基团或共轭结构。特别的,根据本发明的光化学缓存剂在种类上区别于发光剂或吸光剂,尤其是本发明所列的那些发光剂或吸光剂物质。在光化学反应中经过加成、重排或断键的反应步骤,激活在能级间跃迁的能量提取过程。
根据本发明的光化学缓存剂优选为非聚合物的小分子化合物,分子量优选小于2000g mol-1,更优选小于1000g mol-1。所述不是聚合物的化合物是指化合物不是通过常规的聚合反应得到,优选该化合物中不包含或包含不超过2个的重复单元。
特别的,本发明人发现,有一些特定的缓存剂化合物特别适合于制备稳定且余辉发光性能良好的发光试剂。特别适用于本发明的缓存剂选自如下的结构式(I):
其中,
G和T为选自O,S,Se和N的杂原子;
R1’和R2’以及R4’到R8’各自独立地选自H、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基,或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、芳基、芳烷基、具有N、O或S的杂芳基或杂芳烷基,或者它们的组合,其中所述芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基任选具有一个或多个取代基L;和
L选自羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基,或具有1-50、优选1-24、如2-14个或6-12个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基和烷氨基,或者它们的组合;和
R3’为吸电子基团或包含吸电子基团的芳基。
在本申请上下文中,“芳基”表示与脂族化合物相区别的芳香族化合物形成的基团或环,它们通过一个或多个单键而直接与另一结构基团相连接或者与另一环结构稠合,因此区分于通过亚烷基或酯基等间隔基与另一结构基团相连的基团例如“芳烷基”或“芳氧基”或“芳酯基”。类似的,也适用于“杂芳基”,它们可以看做是用杂原子N、S、Se或O代替芳基上的环碳原子或用所述杂原子代替脂族环如环烯烃上的碳原子而形成的基团。此外,如无相反指示,则所述“芳基”或“杂芳基”还包括用芳基、杂芳基取代或稠合的芳基或杂芳基,如联苯基、苯基噻吩基或苯并噻唑基。另外,所述“芳基”或“杂芳基”还可以包括具有例如醚基或羰基的官能基团的芳族或杂芳族化合物形成的基团,如蒽酮、二苯醚或噻唑酮等。有利的,根据本发明的“芳基”或“杂芳基”具有4-30个、更优选5-24、例如6-14或6-10个碳原子。术语“稠合”则表示两个芳环具有公共的边。
在本申请上下文中,术语“烷基”、“烷氧基”或“烷硫基”指的是直链、支化或环状的饱和的脂族烃基,其通过单键、氧基或硫基与其他基团相连接,其优选具有1-50、更优选1-24、如1-18个碳原子。术语“烯基”或“炔基”指的是直链、支化或环状的具有一个或多个C-C双键或三键的不饱和的脂族烃基,优选具有2-50、更优选2-24、如4-18个碳原子。
在本申请上下文中,术语“烷氨基”指的是一个或多个烷基取代的氨基,包括单烷氨基或二烷基氨基,如甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、二丁基氨基等。
在本申请上下文中,术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
在本申请上下文中,术语“吸电子基团”理解为当该基团取代了芳族或杂芳族环上的氢后会使得环上电子云密度降低的基团。这样的基团在化学领域中是广泛公知的。优选的,在本发明中,所述吸电子基团选自硝基、卤素、卤代烷基、磺酸基、氰基、酰基、羧基和/或它们的组合。
此外,在本申请上下文中,所列举的各个取代基定义中的选择基团可以相互组合而形成符合价键原则的新取代基,这意味着例如由烷基、酯基与乙烯基相互组合形成的例如C1-C6烷基酯基乙烯基(C1-6烷基-O-C(=O)-C=C-)也在相关取代基的定义中。
在一个优选的实施方式中,R1’和R2’以及R4’到R8’各自独立地选自具有1-18、优选1-12、更优选1-16个碳原子的烷基、烷氧基、烷氨基或芳基或者它们的组合,其中所述芳基可以被一个或多个基团L取代或未取代并且优选是被一个或多个L取代或未取代的苯基。
优选地,L选自羟基,磺酸基、卤素、硝基、具有1-12个、更优选1-6个碳原子的直链或支化的烷基、烷氧基、烷氨基、氨基,或者它们的组合。
更优选地,基团R1’和R2’以及R4’到R8’选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、二丁氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基,或者它们的组合。
更优选地,基团R3’选自吸电子基团或包含吸电子基团的芳基,所述吸电子基团优选自硝基、氰基、卤素、卤代烷基和/或它们的组合。相应的,包含吸电子基团的芳基优选包括环上具有一个或多个选自硝基、氰基、卤素和/或卤代烷基的取代基的芳基,优选苯基,如氟代苯基或全氟苯基。
在一个尤其优选的实施方式中,光化学缓存剂选自例如如下这些化合物:
在一个有利的实施方式中,吸光剂与发光剂的摩尔比在1:2到1:10000,优选1:10到1:8000或1:50到1:6000,更优选1:100到1:4000或1:200到1:2000。在一个有利的实施方式中,光化学缓存剂以吸光剂、发光剂和光化学缓存剂总质量计,其含量可以为0.1%到80%,优选0.3%到60%,更优选0.5%到40%,最优选1%到20%。
当吸光剂比例过高时,会产生余辉发光被吸光剂吸收而减弱的不利影响。当吸光剂比例过低时,吸收的激发光能量比较有限,也会导致余辉发光较弱。另外,当光化学缓存剂过少时,能量缓存能力较弱,导致长余辉发光的性能受到不利影响,例如影响到长余辉发光的稳定性和发光亮度等。当体系中添加的缓存剂过多时,会阻碍各组分之间的碰撞传能,缓存的能量无法有效地传输出去而被耗散掉,使得长余辉发光性能降低。
其他成分
除了如上所述的那些必要和优选的成分和组分之外,在根据本发明的均相联合检测试剂组合物中或者在该组合物中的浊度试剂I、发光试剂II中还可以包含免疫反应中常用的其他添加剂成分以例如保持体系的稳定。
这样的其他成分包括例如盐、稳定剂、信号放大组分、表面活性剂、水、防腐剂、核酸、多肽,pH值调节剂。可选地,这样的成分还可包括稀释液,例如缓冲液PB、PBS、PBST、BBS、MES、Tris、TES、HEPES中的至少一种,它们能对全血样本进行溶血和稀释,并控制反应体系的pH、盐浓度等。
在将试剂组合物制成试剂盒的形式时,这些其他成分可以任选地分别与如上所述的浊度试剂I和发光试剂II组合,从而配制和分装成试剂盒中的不同试剂包装。
在根据本发明的试剂组合物中,从优化检测效果以及减少信号干扰的角度来看,浊度试剂I与发光试剂II的用量很大程度上与微球的数量比例相关。有利的,浊度试剂I与发光试剂II(即组分II-1和II-2的总和)中所包含的微球数量的比例在1:10到1000:1的范围,优选1:2到300:1的范围,最优选1:1到200:1的范围。
本申请的第二方面涉及一种基于免疫比浊和余辉发光的均相联合检测方法,包括以下步骤:
S1、提供如上所述的均相联合检测试剂组合物和取样的待测样本,将组合物的各组分与待测样本混合,形成检测混合物,
S2、用激发光照射所述检测混合物,
S3、收集浊度(OD)信号值Z和收集余辉信号值F,和
S4、根据所收集的浊度信号值Z和余辉信号值F得到待测样本中比浊生物标志物和余辉生物标志物的信息。
如上所述,本申请的方法基于免疫比浊和余辉发光技术的结合,并且只需要通过对样本单次取样,就能联合检测得到多个标志物的信息。在一个可行的具体实施方案中,所述待测样本包括例如全血、尿液、末梢血、血清、血浆和/或脑脊液等。这样的信息包括生物标志物的种类和浓度等。
在步骤S1中,通常在得到了试剂组合物与待测样本的混合物之后进行充分的搅拌以得到均匀的体系,在该过程中所述生物标志物会与能与它们特异性结合的对应物发生免疫反应。因此,通常选择孵育时间1-10min。在孵育一段时间后,比浊生物标志物与能与之特异性结合的对应物形成第一复合物,而余辉生物标志物与能与之特异性结合的对应物形成第二复合物。
在步骤S2中,有利的,用于照射的激发光波长选自365-1532nm的范围。更优选地,激发光的波长为1064nm、980nm、915nm、808nm、785nm、830nm、808nm、785nm、730nm、680nm、630nm、532nm、488nm、450nm、405nm、365nm。
在步骤S3中,浊度信号值Z和余辉信号值F的收集不分先后。但是,从操作便利性上显然优选首先收集浊度信号值Z然后关闭激发光之后收集余辉信号值F。优选的,可以在0.1ms~5s的照射时间后关闭激发光。由于在本发明的检测试剂组合物中的发光试剂II包含余辉发光材料,因此其可以在关闭光源之后的一段时间内持续发出余辉信号。
根据本发明的方法中,余辉发光时间可以达到秒级甚至分钟级,例如100ms–3600s或500ms–1200s。此外,余辉发光亮度可以达到0.1mcd m-2–10000mcd m-2,例如在0.32mcd m-2–8000mcd m-2范围内。因此,从快速检测角度出发,优选可以在例如0.1-5100ms的范围内检测余辉信号。有利的,在该步骤中,在激发光照射下产生余辉发光,余辉发光的中心波长为X,所述X选自400-800nm,更优选地X选自615nm、540nm或450nm。
在具体的检测实施过程中,激发光源可以采用具有相应波长(如上述优选波长范围)的激光器。可以采用相同或不同的检测器来同时或分别检测浊度信号值和余辉信号值,只要它们具有能实现上述的两个信号收集的功能。例如,在采用不同的检测器的情况下,第一检测器可以为硅光电池检测器,用于收集浊度信号;第二检测器可以为光电倍增管检测器,用于收集余辉发光信号。特别的,对于第二检测器还可以通过在其前面增加滤光片的方法收集标记不同的受体和供体微球所产生的不同波长的发光信号,从而实现在同一个检测中联合检测更多的项目。
在测得相应的浊度信号值Z和余辉信号值F之后,可以依据预先或另外建立的比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线,获得精确的检测信息。因此,在本发明检测方法的一个优选的实施方式中,另外包含步骤S’1:建立比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线,以将浊度信号值和余辉信号值分别与各自生物标志物的信息如浓度关联。该步骤可以在步骤S1-S4之前进行也可以独立于S1-S4的检测程序而进行。该步骤中,比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线可以同时或者也可以在分开的时间和空间内分别建立。
可以例如在测试开始前基于若干个已知不同浓度的测试样本在根据步骤S1-S3的操作程序中(但其中分别将样本与发光试剂或浊度试剂相混合)所显示出来的若干个浊度信号值和若干个余辉信号值数据进行拟合,从而分别建立比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线。
在一个更优选的实施方式中,可以基于下文所述的余辉信号值-浊度信号值校正曲线来进一步校正如上所述建立的比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线。
如上所述,由于余辉发光试剂可能对浊度信号值Z产生一定影响,因此如果要求更为精确的生物标志物检测信息,则有必要有利地通过校准而消除这种影响。例如,在第一检测器收集完成第二复合物余辉发光值后,可通过将第二复合物的余辉发光信号代入余辉信号值-浊度信号值校正曲线,计算得到第二复合物对应的浊度。从第一检测器测定的总浊度信号中减去第二复合物产生的浊度值,很容易得到更加准确的第一复合物的浊度值,从而保证比浊测定的准确性。
因此,在本发明检测方法的一个优选的实施方式中,另外包含步骤S’2:建立余辉信号值-浊度信号值校正曲线。该步骤同样可以在步骤S1-S4之前进行也可以独立于S1-S4的检测程序以及步骤S’1而进行。
同样的,可以例如在测试开始前基于若干个已知不同浓度的测试样本在根据步骤S1-S3的操作程序中所显示出来的若干个浊度信号值和若干个余辉信号值数据进行拟合,从而建立余辉信号值-浊度信号值校正曲线,以校正发光试剂对浊度试剂检测的可能的影响。
在一个有利的例示性实施方式中,可以如此来实施步骤S’2:
S’201、将余辉生物标志物配制为浓度依次递增的M份余辉生物标志物溶液;
S’202、将制得的M份余辉生物标志物溶液之一、任选的稀释液、浊度试剂I、发光试剂II混合制备成免疫反应体系;
S’203、用激发光照射,收集浊度(OD)信号值Zm1;
S’204、关闭激发光,收集余辉信号值Fm1;
S’205、依次重复步骤S’202、S’203和S’204,分别得到M个浊度OD值Zm1、Zm2、Zm3、…、ZmM和M个余辉光信号值Fm1、Fm2、Fm3、…、FmM;
S’206、根据所得M个浊度信号值和M个余辉信号值拟合得到余辉信号值-浊度信号值校正曲线。
同样的,在步骤S’202中通常可以选择孵育时间1-10min。在孵育一段时间后,余辉生物标志物与能与之特异性结合的对应物形成第二复合物。在步骤S’204中,优选的,可以在0.1ms~5s的照射时间后关闭激发光。
在例如如上所述那样建立了余辉信号值-浊度信号值校正曲线之后,就有可能获得更为精确的检测信息。例如,在一个有利的例示性实施方式中,可以如此来实施步骤S’1以建立更为精确的、经校正的比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线:
S’101、将余辉生物标志物和比浊生物标志物分别配制为浓度依次递增的N份待测溶液;
S’102、分别将得到的N份余辉生物标志物溶液和比浊生物标志物溶液之一与任选的稀释液、浊度试剂I和发光试剂II混合制备成免疫反应体系,其中形成第一复合物和第二复合物;
S’103、用激发光照射;
S’104、收集第一复合物和第二复合物的总浊度值Zn1,和收集第二复合物的余辉信号值Ff1;
S’105、依次重复步骤S’102、S’103和S’104,分别得到N个浊度值Zn1、Zn2、Zn3、…、ZnN和N个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、FnN;
S’106、将N个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、FnN代入步骤S’2中建立的余辉信号值-浊度信号值校正曲线,得到N个第二复合物的对应的浊度信号值Zz1、Zz2、Zz3、…、ZzN,然后进一步得到第一复合物的浊度信号值为Zn1-Zz1、Zn2-Zz2、Zn3-Zz3、…、ZnN-ZzN;
S’107、基于N个余辉信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、FnN和N份待测溶液中余辉生物标志物的浓度,拟合得出余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线;
S’108、基于N个浊度值Zn1-Zz1、Zn2-Zz2、Zn3-Zz3、…、ZnN-ZzN以及N份待测溶液中比浊生物标志物的浓度,拟合得出比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线。
显然的,如果参与余辉反应的微球量极少,使得其不会影响浊度信号,那么则可以无需建立校正曲线并用其修正浊度信号值。在此情况下,例如,建立比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线的实施步骤S’1可以无需包括上述的步骤S’106,即其可以包括或由如下步骤组成:
S’101、将余辉生物标志物和比浊生物标志物分别配制为浓度依次递增的N份待测溶液;
S’102、分别将得到的N份余辉生物标志物溶液和比浊生物标志物溶液之一与任选的稀释液、浊度试剂I和发光试剂II混合制备成免疫反应体系,其中形成第一复合物和第二复合物;
S’103、用激发光照射;
S’104、收集第一复合物的浊度值Zn1,和收集第二复合物的余辉信号值Ff1;
S’105、依次重复步骤S’102、S’103和S’104,分别得到N个浊度值Zn1、Zn2、Zn3、…、ZnN和N个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、FnN;
S’107、基于N个余辉信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、FnN和N份待测溶液中余辉生物标志物的浓度,拟合得出余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线;
S’108、基于N个浊度值Zn1、Zn2、Zn3、…、ZnN以及N份待测溶液中比浊生物标志物的浓度,拟合得出比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线。
在根据本发明的均相联合检测方法中,步骤S’1和S’2可以独立于步骤S1到S4实施。特别的,可以有利地将步骤S’1和S’2的生物标志物-余辉信号值/浊度信号值曲线以及余辉信号值-浊度信号值校正曲线设定和集成在用于实施根据本发明的检测方法的检测仪器内,从而便利于使用者的使用。
根据本发明的检测方法可以仅一次取样获得待测样品而联合检测获得多个检测项目的信息。特别有利的,根据本发明的方法无需在检测过程中进行一个或多个洗涤操作。利用本发明的方法,可以将获取检测结果的首诊时间大大缩短,例如缩短到5-30min、优选5-10min。
本申请的再一个方面涉及一种试剂盒,其包含如上所述的均相联合检测试剂组合物。
在一个有利的实施方式中,所述试剂盒还可以进一步包含适用于均相免洗联合检测的那些标准品和缓冲液等。优选地,试剂盒可以包含微球保护剂,选自葡萄糖、甘露醇、BSA和Proclin-300等,例如包含10-50μL 20%(w/v)的葡萄糖,10-50μL 10%(w/v)的甘露醇,10-50μL 0.5%(w/v)的BSA和10-50uL 0.01(v/v)的Proclin-300。
在试剂盒的一个有利的实施方式中,通常将如上所述的浊度试剂I和发光试剂II分别与适量的添加剂,特别是缓冲液一起配制成溶液并分装成试剂盒中的不同试剂包装。浊度试剂I与发光试剂II(即组分II-1和II-2的总和)的包装量的比例以试剂溶液的体积计,在1:10到10:1的范围,优选1:5到3:1的范围,最优选为1:3到1:1的范围。其中,浊度试剂I的包装中载体微球的质量以浊度试剂溶液总质量计,在0.01%到10%的范围;发光试剂II的包装中能量供体和能量受体微球的质量总和以发光试剂溶液总质量计,在0.001%到1%的范围。微球含量太低会导致检测信号较弱,微球含量太高则在微球间易发生自聚集等近距离的相互作用。本领域技术人员熟悉这样的配制和分装过程。
因此,具体而言,本申请包括如下方面:
1.一种均相联合检测试剂组合物,其包括浊度试剂I和发光试剂II,其中
所述浊度试剂I包含连接有能与比浊生物标志物特异性结合的对应物的载体微球,所述浊度试剂I与比浊生物标志物发生免疫反应而使浊度增加;
所述发光试剂II包含:
供体组分II-1,其包含连接有能与余辉生物标志物特异性结合的对应物的供体微球,所述供体微球在光激发下产生单线态氧,和
受体组分II-2,其包含连接有能与余辉生物标志物特异性结合的对应物的受体微球,所述受体微球与单线态氧反应产生余辉发光信号。
2.根据方面1所述的试剂组合物,其特征在于,所述载体微球选自水凝胶微球、苯乙烯聚合物微球、蛋白质微球、硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球或者两种或更多种的混合物,更优选自苯乙烯聚合物微球,尤其选自表面含有氨基、羧基、酰胺基和/或醛基的苯乙烯聚合物微球。
3.根据方面1或2所述的试剂组合物,其特征在于,所述供体微球包括载体微球和吸光剂或者由它们组成,而所述受体微球包括载体微球、光化学缓存剂和发光剂或者由它们组成。
4.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述光化学缓存剂选自如下的结构式(I):
其中,
G和T为选自O,S,Se和N的杂原子;
R1’和R2’以及R4’到R8’各自独立地选自H、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基,或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、芳基、芳烷基、具有N、O或S的杂芳基或杂芳烷基,或者它们的组合,其中所述芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基任选具有一个或多个取代基L;和
L选自羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基,或具有1-50、优选1-24、如2-14个或6-12个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基和烷氨基,或者它们的组合;和
R3’为吸电子基团或包含吸电子基团的芳基。
5.根据方面4所述的试剂组合物,其特征在于,环部分
选自
6.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,R1’和R2’以及R4’到R8’各自独立地选自具有1-18、优选1-12、更优选1-16个碳原子的烷基、烷氧基、烷氨基或芳基或者它们的组合,其中所述芳基可以被一个或多个基团L取代或未取代并且优选是被一个或多个L取代或未取代的苯基。
7.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,L选自羟基,磺酸基、卤素、硝基、具有1-12个、更优选1-6个碳原子的直链或支化的烷基、烷氧基、烷氨基、氨基,或者它们的组合。
8.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,基团R1’和R2’以及R4’到R8’选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、二丁氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基,或者它们的组合。
9.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述光化学缓存剂选自以下的一种或多种:
10.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述吸光剂选自卟啉类和酞菁类染料、过渡金属配合物、量子点(QDs),以及这些化合物的衍生物或共聚物。
11.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述发光剂选自铱配合物、稀土配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物(BODIPY)、以及这些化合物的衍生物和共聚物。
12.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述组合物中还包括选自以下的一种或多种:盐、稳定剂、信号放大组分、表面活性剂、水、防腐剂、核酸、多肽、pH值调节剂、稀释液,例如缓冲液PB、PBS、PBST、BBS、MES、Tris、TES、HEPES中的至少一种;优选PB、PBS、BBS缓冲液。
13.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述载体微球的变异系数小于10%、优选小于5%和更优选小于3%。
14.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述载体微球有利地具有30nm–1000nm,更优选50nm–800nm,最优选100nm–500nm范围内的粒径。
15.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,所述比浊生物标志物和余辉生物标志物选自C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、降钙素原(PCT)、白介素-6(IL-6)和病毒如HIV病毒。
16.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,能与所述生物标志物特异性结合的对应物选自单克隆抗体和/或多克隆抗体。
17.根据前述方面任一项所述的试剂组合物,其特征在于,浊度试剂I与发光试剂II(即组分II-1和II-2的总和)中所包含的微球数量的比例在1:10到1000:1的范围,优选1:2到300:1的范围,最优选1:1到200:1的范围。
18.一种基于免疫比浊和余辉发光的均相联合检测方法,包括以下步骤:
S1、提供如方面1至17任一项所述的均相联合检测试剂组合物和取样的待测样本,将组合物与待测样本混合,形成检测混合物,
S2、用激发光照射所述检测混合物,
S3、收集浊度(OD)信号值Z和收集余辉信号值F,和
S4、根据所收集的浊度信号值Z和余辉信号值F得到待测样本中比浊生物标志物和余辉生物标志物的信息,如种类和浓度。
19.根据方面18的方法,其特征在于,另外包含步骤S’1:建立比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线。
20.根据方面18或19的方法,其特征在于,另外包含步骤S’2:建立余辉信号值-浊度信号值校正曲线。
21.根据方面20的方法,其特征在于,基于步骤S’2中建立的余辉信号值-浊度信号值校正曲线来校正步骤S’1中所建立的比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线和余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线。
22.根据方面18至21任一项的方法,其特征在于,将步骤S’1和S’2中的生物标志物-余辉信号值和浊度信号值曲线以及余辉信号值-浊度信号值校正曲线设定和集成在检测仪器内。
23.根据方面18至22任一项的方法,其特征在于,仅取样一次获得待测样本,所述样本优选为全血、尿液、末梢血、血清、血浆和/或脑脊液等。
24.根据方面18至23任一项的方法,其特征在于,在5-30min、优选5-10min的首诊时间内获取包含生物标志物信息的检测结果。
25.一种检测试剂盒,其包含如方面1至17任一项所述的均相联合检测试剂组合物,其中将所述的浊度试剂I和发光试剂II分别与添加剂,特别是缓冲液一起配制成溶液并分装成不同的试剂包装。
26.根据方面25的试剂盒,其还进一步包含适用于均相免洗联合检测的标准品。
27.根据方面25或26的试剂盒,其特征在于,所述浊度试剂I的包装中载体微球的质量以浊度试剂溶液总质量计在0.01%到10%的范围,和发光试剂II的包装中能量供体和能量受体微球的质量总和以发光试剂溶液总质量计在0.001%到1%的范围。
附图说明
图1为根据本发明的试剂组合物中发光试剂的结构及其产生余辉信号的原理的示意图;
图2为根据本发明的试剂组合物中浊度试剂的结构及其产生浊度信号的原理的示意图;
图3为实施本发明的联合检测方法的简要示意图;
图4为本发明实施例1中同步联检的CRP-浊度信号值标准曲线;
图5为本发明实施例1中同步联检的SAA-余辉发光值标准曲线;
图6为本发明实施例1中同步联检的SAA余辉-浊度信号值校正曲线;
图7为本发明实施例1的同步联检检测CRP与日立生化分析仪检测CRP临床比对相关性;
图8为本发明实施例1的同步联检检测SAA与日立生化分析仪检测SAA临床比对相关性。
附图标记列表:
1、能量供体微球;11、第二对应物;2、能量受体微球;21、第三对应物;3、余辉生物标志物;4、载体微球;41、第一对应物;5、比浊生物标志物。
实施例
实施例1
采用本发明的均相免洗联合检测方法同步检测全血样本中的SAA和CRP
1.1所用物质介绍
待测样本:一次取样50例随机样本,包括正常人全血样本以及炎症患者全血样本;
吸光剂:酞菁染料,激发波长730nm;
发光剂:铕配合物,发光波长615nm;
光化学缓存剂:
与生物标志物特异性结合的对应物:SAA-Ab1单克隆抗体、SAA-Ab2单克隆抗体、CRP多克隆抗体
载体微球:羧基聚苯乙烯球
1.2、浊度试剂I的制备
将粒径130nm固含量为5%的羧基聚苯乙烯球5mL溶到100mL超纯水中,超声形成分散相。在24000转每分钟下搅拌并高速离心。用BBS的缓冲液清洗3次,最终定容到1%的固含量,再充分超声使其分散均匀形成胶乳微球。取上述胶乳微球500μL,加入500μL MES和10mgEDC中,使其在室温下反应2小时。
反应结束后,离心洗涤,分别复溶到500μL的PBS缓冲液中,向其中加入0.1mg CRP多克隆抗体,室温下反应8小时。
反应结束后,离心洗涤,复溶到500μL BBS缓冲液(pH7.0~pH7.6),向其中加入500mg BSA,室温下反应8小时。
反应结束后,离心洗涤,得到包被CRP多克隆抗体的胶乳微球,称重为10mg。将其复溶到1mL BBS缓冲液中,得到浊度试剂I。
1.3、发光试剂II的供体组分II-1的制备
1.3.1、能量供体微球的制备
将0.1g粒径为100nm的羧基聚苯乙烯球溶到100mL超纯水中,超声形成分散相。接着向该分散液中加入2wt%的十二烷基苯磺酸钠和1wt%乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚各0.5~5mL,搅拌;
将吸光剂分散于10mL四氢呋喃溶液中,溶液配制完成后将有机相迅速加入上述水相中,然后逐渐升温到50℃,持续搅拌10h。将反应完成的羧基聚苯乙烯球离心,再用超纯水和乙醇清洗两次,并保存于超纯水中,制成能量供体微球,并于避光放于常温下备用。
1.3.2、偶联与余辉生物标志物特异性结合的对应物
取1.3.1中制得的能量供体微球高速离心,用BBS的缓冲液清洗3次,最终定容到0.5%的固含量,超声使其分散均匀;
将500μL上述分散液加入500μL MES和10mg EDC中,室温下反应2小时。反应结束后,离心洗涤,分别将其复溶到500μL PBS缓冲液中,向其中分别加入0.05mg SAA-Ab1单克隆抗体,在室温下反应8小时。反应结束后,以35000转/min搅拌混合物,离心洗涤,复溶到500μL PBS缓冲液中。向其中加入10mg BSA,室温下反应8小时。反应结束后,离心洗涤,得到包被SAA-Ab1抗体的能量供体微球,称重为5mg。将其分别复溶到1.0mL BBS缓冲液中,制成发光试剂II的供体组分II-1,并于4℃保存备用。
1.4、发光试剂II的受体组分II-2的制备
1.4.1、能量受体微球的制备
如1.3.1的能量供体微球的制备所述那样制得受体微球,其中代替吸光剂而将发光剂和光化学缓存剂分散于10mL的四氢呋喃溶液中。
1.4.2、偶联与余辉生物标志物特异性结合的对应物
如1.3.2所述在能量受体微球上偶联SAA-Ab2单克隆抗体,制得最终的受体组分II-2。
1.5、包含浊度试剂I、发光试剂II的供体组分II-1和发光试剂II的受体组分II-2的试剂盒的制备
配制微球保护剂,其组成为:20μL 20%(w/v)葡萄糖,20μL10%(w/v)甘露醇,20μL0.5%(w/v)BSA和20uL 0.01(v/v)Proclin-300)。使用以上微球保护剂将供体组分II-1、受体组分II-2稀释到微球固含量为0.01%。使用微球保护剂将浊度试剂I稀释到微球固含量为1%。将稀释后的三种组分I,II-1,II-2分别再按1:1体积比与用纯化水配制的100mM BBS缓冲液(含有0.5%PEG、0.1%SDS、0.9%NaCl、0.1%KCl、0.5%BSA,pH7.0~pH7.6)进行混合后分装入试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3中,得到成品试剂盒。成品试剂盒放置于2-8℃避光保存。
1.6、检测方法:
该检测方法意在同步检测全血样本中余辉生物标志物和浊度生物标志物,其中余辉生物标志物为SAA,浊度生物标志物为CRP。
(1)S’2、建立余辉信号值-浊度信号值校正曲线:
S’201、用抗原稀释液(50mM PBS缓冲液,含有1%BSA,250mM氯化钠,0.1%防腐剂)将余辉生物标志物(SAA抗原)SAA抗原稀释为浓度依次递增的9份SAA抗原稀释液,浓度分别为0mg/mL、0.5mg/L、2mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L;
S’202、将2μL步骤S’201中的SAA抗原稀释液之一、150μL浊度试剂I、150μL发光试剂供体组分II-1、150μL发光试剂受体组分II-2依次加入同一反应杯中,搅拌均匀制备成免疫反应体系,孵育5min;
S’203、用730nm激发光照射,收集第二复合物的浊度信号值Zm1;
S’204、关闭激发光,在10ms后,收集该第二复合物的余辉光信号值Fm1,;
S’205、依次重复步骤S’202、S’203和S’204,分别得到9个浊度信号值Zm1、Zm2、Zm3、…、Zm9,9个余辉光信号值Fm1、Fm2、Fm3、…、Fm9;
S’206、根据9个浊度信号值和9个余辉信号值拟合得出余辉信号值-浊度信号值校正曲线,如图6所示。
(2)S’1、建立余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线和比浊生物标志物-浊度信号
值标准曲线:
S’101、用抗原稀释液(50mM PBS缓冲液,含有1%BSA,250mM氯化钠,0.1%防腐剂)将CRP抗原和SAA抗原稀释为浓度依次递增的8份抗原溶液,浓度分别为0.5mg/L、2mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L,使用抗原稀释液作为0mg/L。
S’102、将2μL的步骤S’101中的抗原溶液之一、浊度试剂I、发光试剂供体组分II-1、发光试剂受体组分II-2依次加入同一反应杯中,搅拌均匀制备成免疫反应体系,孵育5min;
S’103、用730nm激发光照射反应杯,收集第一复合物和第二复合物的总浊度信号值Zn1。
S’104、关闭激发光,在10ms后,收集第二复合物的余辉光信号值Ff1;
S’105、依次重复步骤S’102、S’103和S’104,分别得到9个浊度信号值Zn1、Zn2、Zn3、…、Zn9,9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9;
S’106、将9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9代入步骤S’2中得到的余辉信号值-浊度信号值校正曲线,可得到9个第二复合物的浊度信号值Zz1、Zz2、Zz3、…、Zz9;并计算9个第一复合物的浊度信号值为Zn1-Zz1、Zn2-Zz2、Zn3-Zz3、…、Zn9-Zz9;
S’107、将9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9,结合9份余辉生物标志物的浓度,拟合得出余辉生物标志物-余辉光信号值标准曲线;
S’108、将9个浊度OD值Zn1-Zz1、Zn2-Zz2、Zn3-Zz3、…、Zn9-Zz9,结合9份待测溶液溶液中比浊生物标志物的浓度,拟合得出比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线。
(3)检测待测样本(全血)中的生物标志物:
S1、将2μL待测全血样本、稀释液(PBS缓冲液)、如上制得的检测试剂盒依次加入同一反应杯中,搅拌均匀制备成免疫反应体系,孵育5min;
S2、用730nm激发光照射反应杯,收集第一复合物和第二复合物的总浊度信号值Z;
S3、关闭激发光,在10ms后,收集第二复合物的余辉信号值F1;
S4、将F1代入步骤S’2中得到的校正曲线中,得出第二复合物的浊度信号值为Z1,计算第一复合物产生的浊度信号值Z2=Z-Z1;
将余辉光信号值F1和浊度信号值Z2代入(1)中得到的相应标准曲线中,得到待测样本中余辉生物标志物的浓度和比浊生物标志物的浓度。
1.7、对比
针对50例随机样本,采用本发明的均相免洗联合检测方法如上所述同步检测全血样本中SAA和CRP的浓度。将如上所述测得的各标志物的浓度列于下表1中。
另外采用日立全自动生化分析仪(对比试剂采用的是上海捷门生物技术有限公司生产的检测SAA及CRP的检测试剂)检测相同的50例样本(此为上述全血样本经过处理后的血清样本)进行临床比对实验,然后将两者的样本测定值进行相关性分析,如图7和图8所示。两种检测方法所得CRP临床测值的相关性为0.9950,SAA临床测值的相关性为0.9939。
由上述可见,通过对均相联检结果与对比试剂样本测定值进行相关性分析,两者有良好的相关性(r>0.99),两组数据差异不显著,说明均相联检的方法与已上市全自动生化分析仪在0.5mg/L-320mg/L的检测范围内,测定结果相当。
表1.CRP及SAA项目临床样本测值比对表
1.8试剂盒的最低检测限
用5%牛血清白蛋白(BSA)作为空白样本,测试本实施例中的试剂盒,重复测定20次,按公式(空白限=平均值+2SD)计算空白限,结果如表2,联检试剂盒中CRP检测空白限为0.26mg/L,SAA检测空白限为0.29mg/L。目前CRP和SAA试剂的最低检测限一般不大于0.5mg/L。分别对5个定值接近0.5mg/L的样本进行测试,所有样本的测值都高于对应项目的检测空白限。由此得到,试剂的检出限符合标准。
表2.试剂盒的最低检测限测定
实施例2
采用本发明的均相免洗联合检测方法同步检测全血样本中的CRP和PCT
2.1所用物质介绍
待测样本:一次取样50例随机样本,包括正常人全血样本以及炎症患者全血样本;
吸光剂:酞菁类染料,激发680nm;
发光剂:BODIPY,发光波长540nm;
光化学缓存剂:
与生物标志物特异性结合的对应物:PCT-Ab1单克隆抗体、PCT-Ab2单克隆抗体、CRP多克隆抗体
载体微球:醛基化聚苯乙烯球
2.2、浊度试剂I的制备
重复实施例1中的1.2步骤的程序制备浊度试剂I,其中采用粒径130nm固含量为5%的醛基化聚苯乙烯球5ml代替羧基聚苯乙烯球。
2.3、发光试剂II的供体组分II-1的制备
2.3.1、能量供体微球的制备
重复实施例1中的1.3.1步骤的程序制备供体微球,其中采用0.1g粒径为120nm的醛基聚苯乙烯球代替羧基聚苯乙烯球并采用2.1中所述的吸光剂。
2.3.2、偶联与余辉生物标志物特异性结合的对应物
取2.3.1中制得的能量供体微球高速离心,用BBS的缓冲液清洗3次,最终定容到0.5%的固含量,超声使其分散均匀;
将50 0μL上述分散液加入500μL MES和10mg EDC中,室温下反应2小时。反应结束后,离心洗涤,分别将其复溶到500μL PBS缓冲液中,向其中分别加入0.01mg PCT-Ab1单克隆抗体,在室温下反应24小时。反应结束后,以16000转/min搅拌混合物,离心洗涤,复溶到500μL PBS缓冲液中。向其中加入10mg BSA,室温下反应8小时。反应结束后,离心洗涤,得到包被PCT-Ab1抗体的能量供体微球,称重为1mg。将其分别复溶到3.0mL BBS缓冲液中,制成发光试剂II的供体组分II-1,并于4℃保存备用。
2.4、发光试剂II的受体组分II-2的制备
2.4.1、能量受体微球的制备
如2.3.1的能量供体微球的制备所述那样制得受体微球,其中代替吸光剂而将2.1中所述的发光剂和光化学缓存剂分散于10mL的四氢呋喃溶液中。
2.4.2、偶联与余辉生物标志物特异性结合的对应物
如2.3.2所述在能量受体微球上偶联PCT-Ab2单克隆抗体,制得最终的受体组分II-2。
2.5、包含浊度试剂I、发光试剂II的供体组分II-1和发光试剂II的受体组分II-2的试剂盒的制备
如1.5步骤中所述制备成品试剂盒。成品试剂盒放置于2-8℃避光保存。
2.6、检测方法:
该检测方法意在同步检测全血样本中余辉生物标志物和浊度生物标志物,其中余辉生物标志物为PCT,浊度生物标志物为CRP。
(1)建立余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线和比浊生物标志物-浊度信号值标
准曲线:
S’101、用抗原稀释液(50mM PBS缓冲液,含有1%BSA,250mM氯化钠,0.1%防腐剂)将CRP抗原稀释为以下浓度:0.5mg/mL、2mg/mL、10mg/mL、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L,使用稀释液作为0mg/L;另外,使用相同的抗原稀释液将PCT抗原稀释为以下浓度:0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL,使用稀释液作为0ng/mL。
S’102、将5μL步骤S’101中的抗原溶液之一、150μL浊度试剂组分I、100μL发光试剂供体组分II-1、100μL发光试剂受体组分II-2依次加入同一反应杯中,搅拌均匀制备成免疫反应体系,孵育5min。
S’103、用680nm激发光照射反应杯,收集第一复合物的浊度信号值Zn1。
S’104、关闭激发光,在100ms后,收集第二复合物的余辉光信号值Ff1。
S’105、依次重复步骤S’102、S’103和S’104,分别得到9个浊度OD值Zn1、Zn2、Zn3、…、Zn9,9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9。
S’107、将9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9,结合9份余辉生物标志物的浓度,拟合得出余辉生物标志物-余辉光信号值标准曲线。
S’108、将9个浊度信号值Zn1、Zn2、Zn3、…、Zn9,结合9份待测溶液溶液中比浊生物标志物的浓度,拟合得出比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线。
(2)检测待测样本(全血)中的生物标志物:
S1、将5μL待测全血样本、稀释液(PBS缓冲液)、如上制得的检测试剂盒依次加入同一反应杯中,搅拌均匀制备成免疫反应体系,孵育5min;
S2、用680nm激发光照射反应杯,收集第一复合物的浊度信号值Z;
S3、关闭激发光,在100ms后,收集第二复合物的余辉信号值F;
S4、将余辉光信号值F和浊度信号值Z代入(1)中得到的相应标准曲线中,可得到待测样本中余辉生物标志物的浓度和比浊生物标志物的浓度。
本实施例中,由于参与余辉反应的微球量极少,总量是同一反应中比浊微球量的1/100,余辉发光反应所产生的浊度值对于检测CRP含量的比浊信号影响基本不存在,因此无需在比浊信号值中扣除,即无需建立校正曲线。以检测接近CRP检出限定值为0.5mg/L的样本为例,在反应中添加50ng/mL的PCT校准品对于最终的浊度值无明显影响,由此可得,基于发光试剂供体组分II-1和受体组分II-2反应所得的第二复合物在反应混合物中的固含量极低,发光反应部分所产生的浊度对于第一复合物的浊度OD无影响。
2.7、对比
针对50例随机样本,采用本发明的均相免洗联合检测方法如上所述同步检测全血样本中PCT和CRP的浓度。将如上所述测得的各标志物的浓度列于下表3中。
此外,对于样本中CRP浓度还采用日立全自动生化分析仪(对比试剂采用的是上海捷门生物技术有限公司生产的检测CRP的检测试剂)检测相同的50例样本(此为上述全血样本经过处理后的血清样本)进行临床比对实验。而针对样本中的PCT浓度则另外与用罗氏化学发光法所测得的测值进行临床对比。根据两组样本测定值进行相关性分析,两种检测方法所得CRP临床测值的相关性为0.994,PCT临床测值的相关性为0.993。
由上述可见,通过对均相联检结果与对比试剂样本测定值进行相关性分析,两者有良好的相关性(r>0.99),两组数据差异不显著,说明根据本发明的均相联检中的CRP比浊检测法与已上市全自动生化分析仪上所得测值在0.5mg/L-320mg/L的检测范围内,测定结果相当。此外,均相联检中的针对PCT检测的发光法与化学发光检测所得测值在0.05ng/ml-50ng/ml的检测范围内,测值相关性佳。
表3.CRP及PCT项目临床样本测值比对表
2.8上述试剂盒的最低检测限
用5%牛血清白蛋白(BSA)作为空白样本,测试本实施例中的试剂盒,重复测定20次,按公式(空白限=测试平均值+2SD)计算CRP检测空白限为0.25mg/L,PCT检测空白限为0.05ng/ml。目前CRP试剂的最低检测限一般不大于0.5mg/L,PCT试剂的检出限不大于0.1ng/ml。分别使用试剂检测5个接近CRP和PCT最低检出限的样本,所得测值都高于对应项目的空白限,由此可得试剂盒的最低检测限符合要求。
表4.试剂盒的最低检测限测定
实施例3
采用本发明的均相免洗联合检测方法同步检测全血样本中的CRP和IL-6
IL-6和CRP与PCT一起是主要的炎症标志物之一,同时也是脓毒症的主要生物标志物之一。IL-6在临床应用上主要配合CRP和PCT监测病人的术后并发炎症,病患的用药效果及治愈情况。此外,IL-6也可用于判断类风湿关节炎发生和损害程度。IL-6的参考值在50-150pg/ml,对检测方法的灵敏度要求极高。但是,采用根据本发明的方法能够实现IL-6与CRP的联检,其中高灵敏的IL-6浓度可以由余晖发光信号值体现,而CRP浓度则由比浊信号值体现。
3.1所用物质介绍
待测样本:一次取样50例随机样本,包括正常人全血样本以及炎症患者全血样本;
吸光剂:苯并卟啉类染料,激发635nm;
发光剂:苝类染料,发光波长450nm;
光化学缓存剂:
与生物标志物特异性结合的对应物:IL-6-Ab1单克隆抗体、IL-6-Ab2单克隆抗体、CRP多克隆抗体
3.2、浊度试剂I的制备
重复实施例2中的2.2步骤的程序制备浊度试剂I。
3.3、发光试剂II的供体组分II-1的制备
3.3.1、能量供体微球的制备
重复实施例2中的2.3.1步骤的程序制备供体微球,其中采用3.1中所述的吸光剂。
3.3.2、偶联与余辉生物标志物特异性结合的对应物
取3.3.1中制得的能量供体微球高速离心,用BBS的缓冲液清洗3次,最终定容到0.1%的固含量,超声使其分散均匀;
将500μL上述分散液加入500μL MES和10mg EDC中,室温下反应2小时。反应结束后,离心洗涤,分别将其复溶到500μL PBS缓冲液中,向其中分别加入0.01mg IL-6-Ab1单克隆抗体,在室温下反应24小时。反应结束后,以16000转/min搅拌混合物,离心洗涤,复溶到500μL PBS缓冲液中。向其中加入10mg BSA,室温下反应8小时。反应结束后,离心洗涤,得到包被IL-6-Ab1抗体的能量供体微球,称重为1mg。将其分别复溶到2.0mL BBS缓冲液中,制成发光试剂II的供体组分II-1,并于4℃保存备用。
3.4、发光试剂II的受体组分II-2的制备
3.4.1、能量受体微球的制备
如3.3.1的能量供体微球的制备所述那样制得受体微球,其中采用0.1g的粒径100nm的醛基聚苯乙烯球并且代替吸光剂而将3.1中所述的发光剂和光化学缓存剂分散于10mL的四氢呋喃溶液中。
3.4.2、偶联与余辉生物标志物特异性结合的对应物
如3.3.2所述在能量受体微球上偶联IL-6-Ab2单克隆抗体并在室温下反应8小时,反应结束后以35000转/min搅拌混合物,其他条件相同。制得最终的受体组分II-2。
3.5、包含浊度试剂I、发光试剂II的供体组分II-1和发光试剂II的受体组分II-2的试剂盒的制备
如1.5步骤中所述制备成品试剂盒,除了使用微球保护剂将供体组分II-1和受体组分II-2稀释到微球固含量为0.005%。成品试剂盒放置于2-8℃避光保存。
3.6、检测方法:
该检测方法意在同步检测全血样本中余辉生物标志物和浊度生物标志物,其中余辉生物标志物为IL-6,浊度生物标志物为CRP。
(1)建立余辉生物标志物-余辉信号值标准曲线和比浊生物标志物-浊度信号值标
准曲线:
S’101、用抗原稀释液(50mM PBS缓冲液,含有1%BSA,250mM氯化钠,0.1%防腐剂)将CRP抗原稀释为以下浓度:0.5mg/mL、2mg/mL、10mg/mL、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L,使用稀释液作为0mg/L,并且使用相同的抗原稀释液将IL-6抗原稀释为以下浓度:25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、400pg/mL、800pg/mL、1200pg/mL、2000pg/mL,使用稀释液作为0ng/mL。
S’102、将5μL的步骤S’101中的抗原溶液之一、150μL的浊度试剂组分I、100μL的发光试剂供体组分II-1、300μL发光试剂受体组分II-2依次加入同一反应杯中,将其搅拌均匀制备成免疫反应体系。孵育5min。
S’103、用635nm激发光照射反应杯,收集第一复合物的浊度信号值Zn1。
S’104、关闭激发光,在500ms后,收集第二复合物的余辉信号值Ff1。
S’105、依次重复步骤S’102、S’103和S’104,分别得到9个浊度信号值Zn1、Zn2、Zn3、…、Zn9,9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9;
S’107、将9个余辉光信号值Fn1、Fn2、Fn3、…、Fn9,结合9份余辉生物标志物的浓度,拟合得出余辉生物标志物-余辉光信号值标准曲线。
S’108、将9个浊度信号值Zn1、Zn2、Zn3、…、Zn9,结合9份待测溶液溶液中比浊生物标志物的浓度,拟合得出比浊生物标志物-浊度信号值标准曲线。
(2)检测待测样本(全血)中的生物标志物:
S1、将5μL待测全血样本、稀释液(PBS缓冲液)、如上制得的检测试剂盒依次加入同一反应杯中,搅拌均匀制备成免疫反应体系,孵育5min;
S2、用635nm激发光照射反应杯,收集第一复合物的浊度信号值Z;
S3、关闭激发光,在500ms后,收集第二复合物的余辉信号值F;
S4、将余辉光信号值F和浊度信号值Z代入(1)中得到的相应标准曲线中,可得到待测样本中余辉生物标志物的浓度和比浊生物标志物的浓度。
本实施例中,由于参与余辉反应的微球数目极少,相较CRP比浊反应的微球数少100倍,余辉发光反应所产生的浊度值对于检测CRP浓度的比浊信号的影响基本不存在,因此无需在比浊信号值中扣除,即无需确立校正曲线。以检测接近CRP检出限定值为0.5mg/L的样本为例,在反应中添加1000pg/mL的IL-6校准品对于最终的浊度值无明显影响。由此可知,第二复合物在反应混合物中的固含量极低,发光反应部分所产生的浊度对于第一复合物的浊度信号值无影响。
3.7、对比
针对50例随机样本,采用本发明的均相免洗联合检测方法如上所述同步检测全血样本中IL-6和CRP的浓度。将如上所述测得的各标志物的浓度列于下表5中。
此外,对于样本中CRP浓度还采用日立全自动生化分析仪(对比试剂采用的是上海捷门生物技术有限公司生产的检测CRP的检测试剂)检测相同的50例样本(此为上述全血样本经过处理后的血清样本)进行临床比对实验。而针对IL-6浓度还与用西门子化学发光法所测得的值进行临床对比。根据两组样本测定值进行相关性分析,两种检测方法所得CRP临床测值的相关性为0.991,IL-6临床测值的相关性为0.993。
由上述可见,通过对均相联检结果与对比试剂样本测定值进行相关性分析,两者有良好的相关性(r>0.99),两组数据差异不显著,说明根据本发明的均相联检中的CRP比浊检测法与已上市全自动生化分析仪上所得测值在0.5mg/L-320mg/L的检测范围内,测定结果相当。此外,均相联检中的针对IL-6检测的发光法与化学发光检测所得测值在0.20pg/ml-1000pg/ml的检测范围内,测值相关性佳。
表5.CRP及IL-6项目临床样本测值比对表
3.8上述试剂盒的最低检测限
用5%牛血清白蛋白(BSA)作为空白样本,测试本实施例中的试剂盒,重复测定20次,按公式(空白限=测试平均值+2SD)计算最低检测限均相联检试剂的最低检测限不大于0.05mg/L。目前CRP试剂的最低检测限一般不大于0.5mg/L,IL-6试剂的检出限不大于10pg/ml。分别使用试剂检测5个接近CRP和IL-6最低检出限的样本,所得测值都高于对应项目的空白限,由此可得试剂盒的最低检测限符合要求。
表6.试剂盒的最低检测限测定