CN110736739A - 一种均相化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种均相化学发光检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括:供体试剂,其包括供体微球,所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧,且所述供体微球表面包被有标记物;和,受体试剂,其包括受体微球,所述受体微球能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号,且所述受体微球表面包被有生物分子,所述生物分子能够与待测目标分子特异性结合;其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。试剂盒中的供体微球的粒径等于受体微球的粒径,提高了该试剂盒的精密性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于化学发光技术领域,具体涉及一种均相化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
迄今为止,生物体内微量生物活性物质的测定方法已经历了由放射免疫、分析(RIA)、荧光免疫分析(FIA)、酶联免疫分析(EIA)以及化学发光分析等诸阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性需求的不断提高而决定的。
化学发光分析法是一种利用化学发光物质发射的光波进行检测的方法。化学发光物质作为标记应用于核酸检测与免疫检测中。例如,可通过多种途径将特异结合对中的某一分子与发光物质结合形成发光复合物。该复合物可与样品中被检测物(特异结合对中的另一分子)反应,分配于固相与液相中,且分配比例与检测物的量相关。通过测定固相或液相中发光量,即可得出样品中检测物的相应浓度。
化学发光分析中供体微球和受体微球的发光效率决定了化学发光分析法的检测灵敏度。为了提高供体微球和/或受体微球的发光效率,本领域一般采用提高供体微球中染料的感光效率和/或受体微球中发光化合物的接受光的效率和发光效率的方法。
虽然采用本领域所述方法可在一定程度上提高化学发光检测法的检测灵敏度,但是检测量程或线性范围却较窄。因此,目前需要开发一种能在现有技术基础上进一步提高发光效率的试剂盒,不仅具有较高的灵敏度,而且检测量程又较宽。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供一种用于均相化学发光检测的试剂盒,将该试剂盒用于均相化学发光检测时不仅具有较高的灵敏度,而且具有较宽的检测量程。
为此,本发明第一方面提供了一种均相化学发光检测试剂盒,其包括:
供体试剂,其包括供体微球,所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧,且所述供体微球表面包被有标记物;和,
受体试剂,其包括受体微球,所述受体微球能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号,且所述受体微球表面包被有生物分子,所述生物分子能够与待测目标分子特异性结合;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的一些具体实施方式中,所述供体微球与受体微球的平均粒径均为20nm-350nm,优选为50nm-300nm,更优选为100nm-250nm,最优选为180nm-220nm。
在本发明的一些实施方式中,所述供体微球包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面化学键合标记物。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合标记物。
在本发明的一些实施方式中,所述标记物为亲和素。
在本发明的另一些实施方式中,所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素,优选选自中性亲和素或链霉亲和素。
在本发明的一些实施方式中,所述亲和素通过氨基与所述第一载体表面的醛基反应形成席夫碱的方式化学键合在所述第一载体的表面。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的表面带有键合官能团,所述键合官能团用于将标记物化学键合在所述第一载体的表面。
在本发明的一些实施方式中,所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体表面的键合官能团的含量为100~500nmol/mg,优选为200~400nmol/mg。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的表面包被有亲水性的醛基葡聚糖,所述醛基葡聚糖的醛基化学键合标记物。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟碄和酞菁中的一种。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球包括第二载体,所述第二载体的内部填充有发光组合物,所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层,所述多糖层的表面连接有生物分子。
在本发明的一些实施方式中,所述第二载体的表面包被有亲水性的羧基葡聚糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述发光组合物包括铕配合物;进一步优选地,所述铕配合物为MTTA-EU3+。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体和/或第二载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯;优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体微球在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%;和/或,
所述受体微球在所述受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
在本发明的一些实施方式中,所述活性氧为单线态氧。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗原结合的受体微球,所述第一抗原的抗原表位能够与待测目标抗体的抗原表位第一结合位点特异性结合;所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗原,所述第二抗原能够与待测目标抗体的抗原表位第二结合位点特异性结合,且待测目标抗体的抗原表位第一结合位点和抗原表位第二结合位点不相重叠;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球;所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的另一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗体结合的受体微球,所述第一抗体能够与待测目标抗原的抗原决定簇特异性结合;所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗体,所述第二抗体能够与待测目标抗原的抗原决定簇特异性结合;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球;所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与抗原结合的受体微球,所述抗原能够与目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗体,所述第二抗体能够与所述抗原特异性结合;和
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的另一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
第一试剂,其包含与生物素结合的第一抗原,所述第一抗原能够与目标抗体的抗原表位结合位点特异性结合;
受体试剂,其包含与抗免疫复合物抗体结合的受体微球,所述抗免疫复合物抗体能够与第一抗原和目标抗体形成的免疫复合物中目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗原结合的受体微球,所述第一抗原能够与目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的抗免疫复合物抗体,所述抗免疫复合物抗体能够与第一抗原和目标抗体形成的免疫复合物中目标抗体特异性结合;
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧。
根据本发明,所述抗免疫复合物抗体不与游离的或未与第一抗原结合的目标抗体结合。
本发明第二方面提供了一种均相化学发光检测方法,其利用如本发明第一方面所述的试剂盒检测待测样本中的待测目标分子。
本发明第三方面提供了一种均相化学发光检测装置,其利用如本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第二发明所述的方法检测待测样本中的待测目标分子。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述装置为POCT即时检测装置。
本发明的有益效果为:本发明所述试剂盒通过控制受体微球和供体微球的基质粒径,使得将所述试剂盒用于化学发光检测时,提高了检测的发光效率,具有很好的检测灵敏度。另外,本发明中受体微球表面包被有亲水性的羧基葡聚糖,供体微球表面包被有亲水性的醛基葡聚糖,大大降低了非特异性吸附,减少体系外其他环境因素如pH值及电解质等的影响,进而可以提高检测的准确性。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1为实施例7中制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布图。
图2为实施例7中制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Nicomp分布图。
图3为实施例7中制备的供体微球的Gaussian分布图。
图4为实施例8制备的包被葡聚糖的微球的Gaussian分布图
图5为实施例8制备的供体微球的Gaussian分布图。
图6为实施例9制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布曲线图。
图7为实施例9制备的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布曲线图。
图8为实施例9制备的包被葡聚糖的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布图。
图9为实施例9制备的平均粒径在250nm左右的受体微球的Gaussian分布图。
具体实施方式
为使本发明容易理解,下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前,应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解,本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式,而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下,应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中,并且也涵盖在本发明内,服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下,排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义,本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可在本发明的实施或测试中使用,但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”,其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离即可进行检测。
在本发明中,所述“供体微球”可以是通过功能基团被包被在载体上形成填充有光敏剂的高分子微粒,在光激发下能够产生活性氧(如,单线态氧),此时供体微球也可以称为感光微球或感光微粒。所述供体微球内部填充有光敏剂。所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂,优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物,其非限定性的例子包括亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、和酞菁等化合物,以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物,所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。所述供体微球还可以填充其他敏化剂,其非限定性的例子是某些化合物,它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些供体的例子包括:1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等,加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。
所述“受体微球”可以是通过功能基团被包被在载体上形成填充有发光化合物的高分子微粒,此时可以称为发光微球或发光微粒。所述发光微球受体微球表面有亲水性的羧基葡聚糖,内部填充有能够与活性氧(如,单线态氧)发生反应的发光组合物。在本发明的一些具体实施例中,所述发光组合物,其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体,所述亚稳态中间体可以分解,同时或随后发光。在本发明的一些优选实施例中,所述发光组合物包括铕配合物;进一步优选地,所述铕配合物为MTTA-EU3+。
本发明所述“载体”选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠子、粒子和微球,其可以是本领域技术人员所公知的微球或微粒,其可以是任何尺寸的,其可以是有机的或是无机的,其可以是可膨胀或不可膨胀的,其可以是多孔的或非多孔的,其可以是磁性或非磁性的,其具有任何密度,但优选具有和水接近的密度,优选能漂浮于水中,且由透明、部分透明或不透明的材料构成。
本发明所述用语“待测样本”是指可能含有待测目标分子的一种混合物,待测目标分子包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样本包括体液,如全血、血清、血浆、唾液和尿等。待测样本可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如,为了避免HOOK效应,可以在上机检测前使用稀释液对待测样本进行稀释后再在检测仪器上进行检测。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用,包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”,是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应,从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下,特异性结合反应的检测方法包括但不限于:双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用,包括任何同种型的抗体,保留对抗原的特异性结合的抗体片段,包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。所述抗体能够与待测抗原特异性结合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合,发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中,其分子上有两个环状结构,分别为咪唑酮环和噻吩环,其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶联,包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等;而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质,分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成,其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子,从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下,本发明中所用任何试剂,包括抗原、抗体、受氧微球或供氧微球,可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
本发明所述用语“粒径”是指微球的平均粒径,它是用常规粒径仪测定的。
本发明所述“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中,粒径在Gaussian分布中的变异系数。变异系数的计算公式为:C.V值=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%。
本发明所述用语“Nicomp分布”是指美国PSS纳米粒度仪NICOMP中的一种算法分布。相对于Gaussian单峰算法,Nicomp多峰算法对于多组分、粒径分布不均匀液态分散体系的分析以及胶体体系的稳定性分析具有独特优势。
Ⅱ.具体实施方案
下面将更详细地说明本发明。
本发明第一方面所涉及的均相化学发光检测试剂盒,其包括:
供体试剂,其包括供体微球,所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧,且所述供体微球表面包被有标记物;和,
受体试剂,其包括受体微球,所述受体微球能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号,且所述受体微球表面包被有生物分子,所述生物分子能够与待测目标分子特异性结合;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
本发明中,所述供体微球与受体微球的粒径相同的优点如下:
1.供体微球与受体微球的粒径相同时可以使用同一批次聚苯乙烯微球填充染料,可以保证微球表面羧基或者醛基官能团密度相同。
2.化学反应碰撞理论指出反应物分子间必须相互碰撞才有可能发生反应,而包被有生物分子的受体微球与包被有标记物的供体微球在检测中的碰撞是由布朗运动产生的随机碰撞。布朗运动与颗粒大小有关,粒径相同的微球碰撞几率相同。
3.本发明的检测发光信号原理为供体微球中的光敏剂受到680nm激光照射释放出单线态氧,单线态氧存在时间为微秒级别,传播距离也仅为200nm,所以较小粒径微球发光效率高。
在本发明的一些实施方式中,所述供体微球与受体微球的平均粒径均为20nm-350nm,优选为50nm-300nm,更优选为100nm-250nm,最优选为180nm-220nm。如,在本发明的一些具体实施例中,所述供体微球与受体微球的平均粒径均为20nm、50nm、70nm、90nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、220nm、240nm和250nm。
在本发明的一些具体优选的实施方式中,所述供体微球与受体微球的平均粒径均为200nm,此时检测的发光信号值最优,检测的灵敏度最好。
在本发明的一些实施方式中,所述供体微球包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面化学键合标记物。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合标记物。
在本发明的一些实施方式中,所述标记物为亲和素。
在本发明的另一些实施方式中,所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素,优选选自中性亲和素或链霉亲和素。
在本发明的一些实施方式中,所述亲和素通过氨基与所述第一载体表面的醛基反应形成席夫碱的方式化学键合在所述第一载体的表面。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的表面带有键合官能团,所述键合官能团用于将标记物化学键合在所述第一载体的表面。
在本发明的一些实施方式中,所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体表面的键合官能团的含量为100~500nmol/mg,优选为200~400nmol/mg。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的表面包被有亲水性的醛基葡聚糖,所述醛基葡聚糖的醛基化学键合标记物。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟碄和酞菁中的一种。所述光敏剂的载带量无特别的限制,它可以是本领域常用的量。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球包括第二载体,所述第二载体的内部填充有发光组合物,所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层,所述多糖层的表面连接有生物分子。
在本发明的一些实施方式中,所述第二载体的表面包被有亲水性的羧基葡聚糖。
采用含上述载体的微球进行检测时,可以大大降低非特异性吸附,减少体系外其他环境因素如pH值及电解质等的影响,从而提高检测的准确性。
在本发明的另一些实施方式中,所述发光组合物包括铕配合物;进一步优选地,所述铕配合物为MTTA-EU3+。填充在聚苯乙烯微球中的铕配合物与聚苯乙烯微球相互作用,进一步提高其发光效率。在本发明进一步优选的实施方式中,所述铕配合物为MTTA-EU3+,此配合物可以直接捕获感光微球内酞菁染料产生的单线态氧后发出铕离子特征波长614-615nm的红光。
MTTA:[4’-(10-甲基-9-蒽基)-2,2’:6’2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺]四乙酸,其结构式如式Ⅰ所示,合成参考CN200510130851.9。
铕配合物MTTA-EU3+(铕(Ⅲ)配合物)的合成如下:
(1)取500mL三口烧瓶,将732mg MTTA(1mmoL)和366mg EuCl3·6H2O(1mmoL),溶于100mL甲醇中,搅拌下70℃回流2小时。
(2)减压蒸馏除去溶剂。
(3)生成物中加入50mL乙醚,过滤收集滤饼,并用丙酮洗涤三次。
(4)真空干燥后得到830mg MTTA-EU3+。
在本发明的一些具体的实施方式中,所述供体微球和受体微球均为聚苯乙烯微球。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体和/或第二载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯;优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。
在本发明的一些实施方式中,所述生物分子选自蛋白质分子、核酸分子、多糖分子和脂类分子;优选为蛋白质分子。当然,生物大分子不局限于蛋白质分子、核酸分子、多糖分子和脂类分子,只要在本发明的公开的技术思想下,结合现有技术,任意能够被设计为满足上述条件的物质都能够作为本发明中的生物分子,在此就不再赘述。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述蛋白质分子为抗原和/或抗体;其中,所述抗原是指具有免疫原性的物质;所述抗体是指机体产生的能识别特定外来物的免疫球蛋白。
在本发明的另一些实施方式中,所述活性氧为单线态氧。
另外,本领域技术人员通常认为,微球的粒径尺寸越均一,利用该微球进行的均相化学发光检测的性能就越好。因此目前针对均相化学发光中采用的微球的研究趋于获得更均一粒径的微球。本申请的发明人通过研究后发现,采用粒径尺寸均一的微球进行均相化学发光检测时,检测结果的灵敏度和检测量程难以同时保障。但是通过采用粒径尺寸均一性合适的微球(如微球粒径分布的变异系数>5%),反而既能保障光激化学发光检测的灵敏度,又能拓宽检测量程。
因此,在本发明的一些实施方式中,所述供体微球在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体微球在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8%;优选地,所述供体微球在所述供试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10%。
在本发明的一些实施方式中,所述供体微球在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40%;更进一步优选地,所述供体微球在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20%。
在本发明的一些具体实施方式中,所述供体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值可以为5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、25%、30%、35%或40%等。
值得注意的是,本发明所述的供体微球粒径分布变异系数C.V值指的是供体微球包被上所需的物质后的粒径分布变异系数C.V值。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8%;优选地,所述受体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10%。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40%;更进一步优选地,所述受体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20%。
在本发明的一些具体实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值可以为5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、25%、30%、35%或40%等。
值得注意的是,本发明所述的受体微球粒径分布变异系数C.V值指的是受体微球包被上所需的物质后的粒径分布变异系数C.V值。
在本发明的一些具体实施方式中,所述粒径分布变异系数C.V值是通过Gaussian分布计算得到。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括第一试剂。需要说明的是,本发明中所述的第一试剂,不特指某一类试剂,所述第一试剂是为了保证某些基于特异性反应的检测方法的顺利或优化进行而添加的试剂。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗原结合的受体微球,所述第一抗原的抗原表位能够与待测目标抗体的抗原表位第一结合位点特异性结合;所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗原,所述第二抗原能够与待测目标抗体的抗原表位第二结合位点特异性结合,且待测目标抗体的抗原表位第一结合位点和抗原表位第二结合位点不相重叠;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球;所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的另一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗体结合的受体微球,所述第一抗体能够与待测目标抗原的抗原决定簇特异性结合;所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗体,所述第二抗体能够与待测目标抗原的抗原决定簇特异性结合;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球;所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与抗原结合的受体微球,所述抗原能够与目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗体,所述第二抗体能够与所述抗原特异性结合;和
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的另一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
第一试剂,其包含与生物素结合的第一抗原,所述第一抗原能够与目标抗体的抗原表位结合位点特异性结合;
受体试剂,其包含与抗免疫复合物抗体结合的受体微球,所述抗免疫复合物抗体能够与第一抗原和目标抗体形成的免疫复合物中目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗原结合的受体微球,所述第一抗原能够与目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的抗免疫复合物抗体,所述抗免疫复合物抗体能够与第一抗原和目标抗体形成的免疫复合物中目标抗体特异性结合;
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧。
根据本发明,所述抗免疫复合物抗体不与游离的或未与第一抗原结合的目标抗体结合。
本发明第二方面涉及一种均相化学发光检测方法,其利用如本发明第一方面所述的试剂盒检测待测样本中的待测目标分子。
在本发明的一些实施方式中,所述方法包括以下步骤:
S1,将待测样本与受体试剂和第一试剂混合后,再与和供体试剂混合,从而得到待测混合物;
S2,对步骤S1中得到的待测混合物进行激光照射,激发供体产生单线态氧;
S3,通过检测待测混合物中的受体微球与单线态氧反应产生的化学发光信号强度来分析判断待测样本中是否包含待测目标分子和/或待测目标分子的浓度。
在本发明的一些优选的实施方式中,在步骤S1中,先将所述待测样本利用稀释液稀释后,再与所述受体试剂及供体试剂混合形成待测混合物。所述稀释液包括缓冲液、蛋白、稳定剂、防腐剂等。所述稀释液具有稀释和缓冲的作用,提高了最终检测结果的准确性和待测样本的稳定性。
在本发明的另一些实施方式中,步骤S2中,利用600~700nm的红色激发进行激光照射。
本发明第三方面涉及一种均相化学发光检测装置,其利用如本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第二发明所述的方法检测待测样本中的待测目标分子。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述装置为POCT即时检测装置。
在本发明的一些实施方式中,所述装置包括:
a.试剂杯条,其上设有若干盛装试剂的孔位,所述孔位至少包括:
待测样本孔位,其用于盛装包含待测目标分子的待测样本;
第一试剂孔位,其用于盛装包含供体微球的供体试剂,所述供体微球能够在激发状态下产生活性氧;
第二试剂孔位,其用于盛装包含受体微球的受体试剂,所述受体微球能够与活性氧反应产生化学发光信号,且所述供体微球的粒径等于受体微球的粒径;
b.加样机构,其用于将所述孔位中盛装的试剂在各孔位之间相互移动;所述加样机构每次转移的物质为1-500μL;
c.检测机构,其与所述加样机构电连接,用于检测受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号。
在本发明的另一些实施方式中,所述待测样本孔位、所述供体试剂孔位和所述受体试剂孔位均覆膜封闭孔口,以保证其中物质的不被污染。所述覆膜可以是一次性封膜也可以是反复使用的封膜。
为方便识别和读取待测样本的信息,优选的技术方案是,所述试剂杯条沿宽度方向的侧面设有条形码区,所述条形码区包含所述试剂杯条的信息。所述条形码可以为一维或二维码。
对应的,所述POCT装置还包括条码扫描模块,所述条码扫描模块用于识别读取条形码中的信息。
所述条码扫描模块支持IC卡扫描、印刷条形码介质(纸张或试剂卡)扫描,信息读入采用接触式扫描或者是非接触式扫描,其方式可以是红外或射频等方式;所述信息包括但不限于检测分析项目名称、标准曲线、试剂组分、批号、效期、生产商信息。
为提高最终检测结果的准确性和待测样本的稳定性,在本发明的一些实施方式中,所述试剂杯条上还开设有稀释液孔位,所述稀释液孔位用来盛装稀释液。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂杯条上还开设有附加试剂孔位,所述附加试剂孔位用来盛装附加试剂(第一试剂),所述附加试剂孔位覆膜封闭孔口。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述加样机构包括:
移液组件,用于抽吸或者排放液体;
竖直移动组件,所述移液组件设置在所述竖直移动组件上,所述竖直移动组件用于带动所述移液组件竖直移动;
水平移动组件,所述竖直移动组件设置在所述水平移动组件上,所述水平移动组件用于带动所述移液组件水平移动。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述检测机构包括:
底座,用于承载所述试剂杯条;
驱动组件,用于驱动所述底座绕其中心转动,并带动所述试剂杯条进行转动;
检测组件,用于检测所述试剂杯条中的受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号。
在本发明的一些具体的实施方式中,所述检测组件包括激发器,所述激发器能够发射600~700nm的红色激发光。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号的检测波长为450-650nm。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述移液组件包括从上至下依次设置的活塞机构、连接件和移液管,所述活塞机构连接所述连接件,所述移液管设置在所述底座的端面边缘处;在需要进行液体转移时,所述连接件下降并连接所述移液管,所述活塞机构能够上下移动以带动所述移液管抽吸或排放液体。
在本发明的一些实施方式中,所述装置还包括温育模块,所述温育模块用于为化学发光反应提供合适的环境温度。在检测时,所述温育模块采用金属浴、水浴或油浴等方式,使所述试剂杯条及试剂杯条内物质的温度为温度为20-50℃。
在本发明的另一些实施方式中,所述待测样本孔位、所述供体试剂孔位以及所述受体试剂孔位的横截面的形状互不相同。
所述装置的使用流程为:在所述待测样本孔位、供体试剂孔位以及所述受体试剂孔位分别盛装待测样本、供体试剂和受体试剂后,将所述试剂卡置于所述POCT分析仪中,利用加样机构取相应体积待测样本,加入第一试剂孔位,经过一定时间反应后,继续取一定体积混合后液体加入第二试剂孔位,所述检测组件中的激发器用于发射激光向第二试剂孔位照射,经过一定时间反应,所述检测机构检测受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号,计算出待测样本中的降钙素原的浓度。
Ⅲ.实施例
为使本发明更加容易理解,下面将结合实施例来进一步详细说明本发明,这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1:均相化学发光检测试剂盒的制备
一、受体微球的制备
1、准备25mL的圆底烧瓶,加入0.1g铕(Ⅲ)配合物,10mL95%乙醇,磁力搅拌,水浴升温至70℃,获得铕(Ⅲ)配合物溶液。
2、准备100mL的三口烧瓶,加入10mL 95%乙醇、10mL水和10mL浓度为10%、粒径200nm的包被有羧基葡聚糖水凝胶的聚苯乙烯微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃。
3、将步骤1中的铕(Ⅲ)配合物溶液缓慢滴加至步骤2中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却,得到乳液。
4、将上述乳液离心1小时,30000g,离心后弃去上清液,然后用50%乙醇重新悬浮。重复离心清洗3次后用PH值=10的50mM CB缓冲液重新悬浮,使其终浓度为20mg/mL,获得粒径为200nm的受体微球溶液。
5、用同样的方法制得粒径分别为100nm、150nm、250nm、300nm和350nm的受体微球溶液。
二、受体微球偶联抗体
1.按制备量量取10mg的包被有羧基葡聚糖水凝胶的受体微球于离心管中,10000rpm,离心60min。
2.弃上清,向沉淀中加入2mg的Anti-PCT抗体Ⅰ(可以是任何其他分析项目对应的抗体实施例(anti-cTnI抗体Ⅰ和anti-PCT抗体Ⅰ)),50μL的Tween-20(50mg/mL),再补加一定体积的0.05M MES pH=6.0,使受体微球终浓度为10mg/mL。
3.超声迅速混匀。
4.向离心管加入50μL的NaBH3CN(50mg/mL,0.05M MES pH=6.0配制)混匀,37℃置于旋转混合仪反应36-48h。
5.封闭:加入1mL的BSA(50mg/mL,0.05M MES pH=6.0配制),37℃置于旋转混合仪反应12-16h。
6.清洗:用0.05M MES缓冲液清洗3次。
7.取样测定清洗完毕的包被抗体的受体微球的浓度、粒径、信号值。
三、供体微球的制备
1、准备25mL的圆底烧瓶,加入0.1g酞菁铜(Ⅱ)、10mL DMF,磁力搅拌,水浴升温至70℃,获得酞菁铜(Ⅱ)溶液。
2、准备100mL的三口烧瓶,加入10mL 95%乙醇、10mL水和10mL浓度为10%、粒径200nm的包被有醛基葡聚糖水凝胶的聚苯乙烯微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃。
3、将步骤1中的酞菁铜(Ⅱ)溶液缓慢滴加至步骤2中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却,得到乳液。
4、将上述乳液离心1小时,30000g,离心后弃去上清液,用50%乙醇重新悬浮。重复离心清洗3次后用PH值=10的50mM CB缓冲液重新悬浮,使其终浓度为20mg/mL,获得粒径为200nm的供体微球溶液。
5、用同样的方法制得粒径分别为80nm、100nm、150nm、250nm、300nm和350nm的供体微球溶液。
四、供体微球偶联亲和素
1.供体微球混悬液处理:吸取一定量的供体微球于高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量MES缓冲液,超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮,加入MES缓冲液调节供体微球浓度至100mg/mL。
2.亲和素溶液配制:称量一定量亲和素(也可以是链霉亲和素或中和亲和素),加MES缓冲液溶解至8mg/mL。
3.混合:将处理好的供体微球混悬液、8mg/mL的亲和素以及MES缓冲液,以2:5:1的体积比进行混合,迅速混匀,得到反应液。
4.反应:MES缓冲液配制25mg/mL的NaBH3CN溶液,按照与反应液1:25的体积比加入,迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
5.封闭:MES缓冲液配制75mg/mL的Gly溶液以及25mg/mL的NaBH3CN溶液,按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中,混匀,37℃旋转反应2小时。再加入200mg/mL的BSA溶液(MES缓冲液),其与反应液体积比为5:8,迅速混匀,37℃旋转反应16小时。
6.清洗:向反应好的溶液中加入MES缓冲液,高速冷冻离心机离心,弃上清,加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮,再次离心,如此清洗3次,最后用少量的缓冲液进行悬浮,测定固含量,用缓冲液调节浓度至10mg/mL。
五、生物素标记抗体(第一试剂)的制备
1.抗体处理:将Anti-PCT抗体Ⅱ(可以是任何其他分析项目对应的抗体实施例(anti-cTnI抗体Ⅱ和anti-PCT抗体Ⅱ))透析于0.1M NaHCO3溶液,测定抗体浓度并调节至1mg/mL。
2.用DMSO配制16.17mg/mL的生物素溶液。
3.标记:取处理好的1mg/mL Anti-PCT抗体Ⅱ(可以是任何其他分析项目对应的抗体实施例(anti-cTnI抗体Ⅱ和anti-PCT抗体Ⅱ))与配制好的生物素溶液,二者按照10000:54的体积比进行混合,迅速混匀。2-8℃静置反应12-16小时。
4.透析:将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(pH=8.00)。
5.将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中,取样测定抗体浓度。将质检合格的生物素标记抗体浓度调节至0.5mg/mL。
六、组装
将上述制备的试剂进行组装,获得化学发光均相检测试剂盒。
实施例2:均相化学发光检测方法
在试剂杯条的待测样本孔位、附加试剂孔位、第一试剂孔位、第二试剂孔位分别加入25μL待检样本、25μL生物素标记的抗体、175μL供体试剂、25μL受体试剂后,将所述试剂杯条置于由博阳生物科技(上海)有限公司开发的POCT分析仪中,加样机构取相应体积待测样本,加入到附加试剂孔位,振动,37℃温育10分钟;取附加试剂孔位内温育后的液体加入到第一试剂孔位后振动,37℃温育10分钟,形成混合液体;继续将混合液体加入到第二试剂孔位,振动,37℃温育10分钟,形成待测混合物。利用检测组件中的激发器发射的激光照射第二试剂孔位,经过一定时间反应,采用检测机构检测受体微球与活性氧反应所产生的化学发光信号,计算出待测样本中的待测目标分子的浓度。
实施例3:发光信号量的检测
采用实施例2所述方法及实施例1所述试剂盒(以包含包被Anti-PCT抗体Ⅰ的受体微球、生物素标记Anti-PCT抗体Ⅱ的试剂盒为例)检测待测样本中的待测PCT,检测结果如表1所示。
表1
从表1可知,在供体微球粒径固定的条件下,随着受体微球粒径的增大,所检测的发光信号值逐渐下降,当受体微球粒径与供体微球的粒径相等时,检测的发光信号值最大。且当供体微球粒径与受体微球的粒径均为200nm时,检测的发光信号值最优,检测的灵敏度最好。
实施例4:质控品与校准品的制备
1.质控品的制备
以新生牛血清为稀释液,将抗原纯品分别稀释为2个不同浓度的工作液,该工作液即为质控品Q1、Q2。取待检测的质控品Q1、Q2在本公司仪器系统上进行三次重复标定。每次测定10孔,并计算总体均值与SD,均值±3SD即为质控品浓度测定许可范围。
2.校准品的制备
抗原纯品用小牛血清(含防腐剂)稀释成系列浓度,用免疫测定用国家标准品校准后,冷冻保存备用。-20℃保存时,有效期2年。
校准品与相应浓度的国家标准品同时进行分析测定,用4参数或其它模型拟合,要求校准品剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900;同时两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验);以国家标准品为标准,校准品的实测效价与标定效价的比应在0.90-1.10之间。
实施例5:均相化学发光检测试剂盒批间精密度的检测
待测样本:实施例4中制备的质控品Q1;
过程:重复检测20次,得到光强度值(RLU)
离群点的判定标准:≥3SD
检测时采用的试剂盒包含以下试剂:
(1)受体试剂,其包含受体微球(受体微球的粒径为200nm,且分别与anti-cTnI抗体Ⅰ和anti-PCT抗体Ⅰ连接);
(2)第一试剂(生物素标记抗体,抗体分别为anti-cTnI抗体Ⅱ、和anti-PCT抗体Ⅱ));
(3)供体试剂,其包含供体微球(包被亲和素的不同粒径(80nm、200nm)的供体微球)。
将试剂(1)-(3)进行搭配,组成如表2所示的试剂组1和试剂组2,分别检测cTnI和PCT抗原(稀释到合适浓度后,试剂组1和2同时检测相同的样本),重复检测20孔,检测过程如实施例2所述,检测结果如表3所示。
表2:
试剂分组 | 试剂组1 | 试剂组2 |
受体微球粒径/nm | 200nm | 200nm |
供体微球粒径/nm | 80nm | 200nm |
表3:
从表3可知,相较于试剂组1,试剂组2的光强度增高,即受体微球的粒径等于供体微球的粒径时,所述试剂盒检测的光强度增高。同时相较于试剂组1,试剂组2的变异系数(CV)更小,即受体微球的粒径等于供体微球的粒径时,精密性更高。
实施例6:均相化学发光检测试剂盒分析灵敏度的检测
待测样本:零值校准品;
过程:重复检测20次,得到光强度值(RLU)
灵敏度:RLU代入校准曲线
检测时采用的试剂及检测过程同实施例5,检测结果如表4所示。
表4:
从表4可知,相较于试剂组1,试剂组2检测出的灵敏度更好,即受体微球的粒径等于供体微球的粒径时,有利于提高试剂盒的灵敏度。
对比例1:对比试剂盒的制备
一、受体微球包被抗体
1、将anti-PCT抗体Ⅰ透析至PH值=10的50mM CB缓冲液,测得浓度为1mg/mL。
2、在2mL离心管中加入0.5mL实施例1制备的受体微球,0.5mL anti-PCT抗体Ⅰ,混匀后加入100μL 10mg/mL NaBH4溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应4小时。
3、反应完毕后加入0.5mL 100mg/mLBSA溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应2小时。
4、反应完毕后离心45min,30000g,离心后弃去上清液,然后用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗4次,并稀释至终浓度为100μg/mL,获得粒径分别为100nm、150nm、200nm、250nm和350nm的包被anti-PCT抗体Ⅰ的受体微球。
二、供体微球包被抗体
1、将anti-PCT抗体Ⅱ透析至PH值=10的50mM CB缓冲液,测得浓度为1mg/mL。
2、在2mL离心管中加入0.5mL感光微球,0.5mL配对抗体Ⅱ,混匀后加入100μL10mg/mL NaBH4溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应4小时。
3、反应完毕后加入0.5mL 100mg/mL BSA溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应2小时。
4、反应完毕后离心45min,30000g,离心后弃去上清液,用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗4次,并稀释至终浓度为100μg/mL。获得粒径分别为100nm、150nm、200nm、250nm和350nm的包被anti-PCT抗体Ⅱ的供体微球。
对比例2:对比试剂盒发光信号量的检测
检测过程同实施例3,仅将使用的微球组合物替换为对比例1制备的对试剂盒,检测结果如表5所示。
表5
从表5可知,对比试剂盒的发光信号量显著降低,检测灵敏度显著下降。且对比试剂盒中当供体微球不小于受体微球粒径的粒径时,检测的发光信号值也不较优。
实施例7:平均粒径为250nm的表面不包被或连接有多糖的供体微球及供体试剂的制备
(一)醛基聚苯乙烯乳胶微球的制备
a)准备100ml的三口烧瓶,加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水,搅拌10min后通N2 30min。
b)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠,溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤a)的反应体系中,继续通N2 30min。
c)将反应体系升温至70℃,反应15小时。
d)将反应完成后的乳液冷却至室温,用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗,直至离心初的上清液的电导率接近去离子水,然后用水稀释,以乳液形式保存。
e)由纳米粒度仪测得该乳胶微球粒径的高斯分布平均粒径为201.3nm,变异系数(C.V.)=8.0%,Gaussian分布图如图1所示,Nicomp分布为多峰(如图2所示)。由电导滴定法测得该乳胶微球醛基含量为260nmol/mg。
(二)敏化剂的填充
a)准备25ml的圆底烧瓶,加入0.11g酞菁铜,10ml N,N-二甲基甲酰胺,磁力搅拌,水浴升温至75℃,获得光敏剂溶液。
b)准备100ml的三口烧瓶,加入10ml 95%乙醇、10ml水和10ml浓度为10%、(一)中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃。
c)将步骤a)中的溶液缓慢滴加至步骤b)中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却,获得乳液。
d)将上述乳液离心1小时,30000G,离心后弃去上清液,用50%乙醇重新悬浮。重复离心清洗三次后用pH值=10的50mM CB缓冲液重新悬浮,使其终浓度为20mg/ml。
(三)微球表面修饰亲和素,制备供体试剂
a)微球混悬液处理:吸取一定量步骤(二)制备的微球于高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量MES缓冲液,超声细胞破碎仪上超声至微球重新悬浮,加入MES缓冲液调节微球浓度至100mg/ml。
b)亲和素溶液配制:称量一定量链霉亲和素,加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
c)混合:将处理好的微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES缓冲液,以2:5:1的体积比进行混合,迅速混匀,得到反应液。
d)反应:MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液1:25的体积比加入,迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
e)封闭:MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中,混匀,37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液),其与反应液体积比为5:8,迅速混匀,37℃旋转反应16小时。
f)清洗:向反应好的溶液中加入MES缓冲液,高速冷冻离心机离心,弃上清,加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮,再次离心,如此清洗3次,最后用少量的供体微球缓冲液进行悬浮,测定固含量,并用供体微球缓冲液调节浓度至150μg/ml,获得包含供体微球的供体试剂。
由纳米粒度仪测得供体微球的高斯分布平均粒径为227.7nm,变异系数(C.V.)=6.5%,具体如图3所示。
实施例8:平均粒径为250nm的包被有多糖的供体微球及供体试剂的制备
醛基聚苯乙烯乳胶微球的制备以及敏化剂的填充过程同实施例7中(一)和(二)的制备步骤。
(一)氨基葡聚糖的制备
a)将500mL四口烧瓶置于油浴锅中,装好冷凝管,通氮气。
b)依次加入10g平均分子量分布为500000KDa的葡聚糖、100ml去离子水、2g NaOH、10g N-(2,3-环氧丙基)邻苯二甲酰亚胺,机械搅拌。
c)90℃油浴2小时后关闭加热,维持搅拌自然冷却。
d)反应混合液在2L甲醇中析出主要混合物,收集固体,烘干。
e)将200mL四口烧瓶置于油浴锅中,装好冷凝管,通氮气。
f)依次加入烘干后的固体、100mL去离子水,1.8g乙酸钠、5mL 50%水合肼后调pH至4,机械搅拌。
g)85℃油浴1小时后关闭加热,维持搅拌自然冷却。
h)反应液pH调至中性后过滤,收集滤液。
i)滤液置于透析袋中,去离子水4℃透析2天,每天换水3-4次。
j)透析完成后冷冻干燥,得氨基葡聚糖固体9.0g。
k)用TNBSA法测得氨基含量为0.83mmol/g。
(二)醛基葡聚糖的制备
a)称取10g平均分子量分布为500000KDa的葡聚糖置于250烧杯中,加入100mL0.1M/pH=6.0的磷酸盐缓冲液,室温搅拌溶解。
b)称取1.8g偏高碘酸钠置于50mL烧杯中,加入10毫升0.1M/pH=6.0的磷酸盐缓冲液,室温搅拌溶解。
c)将偏高碘酸钠溶液缓慢滴加至葡聚糖溶液中,反应至无气泡产生后继续搅拌1小时。
d)将反应混合液置于透析袋中,去离子水4℃透析2天,每天换水3-4次。
e)透析完成后冷冻干燥,得醛基葡聚糖固体9.6g。
f)用BCA Kit测得醛基含量为0.94mmol/g。
(三)微球包被葡聚糖
a)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解。
b)取100mg供体微球,加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2小时。
c)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜。
d)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/ml。
e)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解。
f)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2小时。
g)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜。
h)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/ml。
i)由纳米粒度仪测得该微球的高斯分布平均粒径为235.6nm,变异系数(C.V.)=8.1%,具体如图4所示。
(四)微球表面修饰亲和素,制备供体试剂
g)微球混悬液处理:吸取一定量步骤(三)制备的微球高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量MES缓冲液,超声细胞破碎仪上超声至微球重新悬浮,加入MES缓冲液调节供体微球浓度至100mg/ml。
h)亲和素溶液配制:称量一定量中性亲和素,加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
i)混合:将处理好的微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES缓冲液,以2:5:1的体积比进行混合,迅速混匀,得到反应液。
j)反应:MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液1:25的体积比加入,迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
k)封闭:MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中,混匀,37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液),其与反应液体积比为5:8,迅速混匀,37℃旋转反应16小时。
l)清洗:向反应好的溶液中加入MES缓冲液,高速冷冻离心机离心,弃上清,加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮,再次离心,如此清洗3次,最后用少量的供体微球缓冲液进行悬浮,测定固含量,用供体微球缓冲液调节浓度至150μg/ml,获得包含供体微球的供体试剂。
由纳米粒度仪测得供体微球的高斯分布平均粒径为249.9nm,变异系数(C.V.)=11.6%,具体如图5所示。
实施例9:平均粒径为250nm的受体微球的制备
1.醛基聚苯乙烯乳胶微球的制备及表征过程
1)准备100ml的三口烧瓶,加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水,搅拌10min后通N2 30min;
2)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠,溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤1的反应体系中,继续通N2 30min;
3)将反应体系升温至70℃,反应15小时;
4)将反应完成后的乳液冷却至室温,用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗,直至离心初的上清液的电导率接近去离子水,然后用水稀释,以乳液形式保存;
5)由纳米粒度仪测得此时乳胶微球粒径的Gaussian分布平均粒径为202.2nm,变异系数(C.V.)=4.60%,Gaussian分布曲线如图6所示。由电导滴定法测得该乳胶微球醛基含量为280nmol/mg。
2.在微球内部填埋发光组合物的过程及表征
1)准备25ml的圆底烧瓶,加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU3+),10ml 95%乙醇,磁力搅拌,水浴升温至70℃,获得配合物溶液;
2)准备100ml的三口烧瓶,加入10ml 95%乙醇、10ml水和10ml浓度为10%、步骤1中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃;
3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却;
4)将上述乳液离心1小时,30000G,离心后弃去上清液,得到填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球。
5)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为204.9nm,变异系数(C.V.)=5.00%(如图7所示)
3.在微球表面包被多糖涂层的过程及表征
1)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
2)取100mg步骤2中已制备好的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球,加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2小时;
3)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜;
4)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/ml;
5)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
6)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2小时;
7)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜;
8)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/ml。
9)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.6nm,变异系数(C.V.)=12.90%(如图8所示)。
4.PCT抗体的偶联过程
1)将配对PCT抗体透析至PH值=10的50mM CB缓冲液,测得浓度为1mg/ml。
2)在2ml离心管中加入0.5ml步骤3中获得的微球以及0.5ml步骤1)获得的配对抗体Ⅰ,混匀后加入100μl 10mg/ml NaBH4溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应4小时。
3)反应完毕后加入0.5ml 100mg/ml BSA溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应2小时。
4)反应完毕后将离心45min,30000G,离心后弃去上清液,用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗四次,并用缓冲溶液稀释至终浓度为50μg/ml,获得偶联PCT抗体的受体微球溶液。
由纳米粒度仪测得此时受体微球的粒径的Gaussian分布平均粒径值为253.5nm,变异系数(C.V值)=9.60%(如图9所示)。
实施例10:上机检测结果及分析(检测物质:PCT抗原)
本实例所用的PCT均相化学发光检测试剂盒(光激化学发光法)由包含第一抗PCT抗体包被的受体微球的试剂1(R1’)、包含生物素标记的第二抗PCT抗体的试剂2(R2’)组成,另外包括含有供体微球的通用液(R3’)。其中,R1’是利用实施例9中受体微球(粒径分布变异系数C.V值=9.6%)制备得到的受体试剂;R3’是利用实施例7和实施例8中供体微球制备得到的供体试剂。
检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统(LiCA HT)上完成并输出检测结果,具体检测结果如下表6所示。
表6
从表6的结果可知,利用本申请所述试剂盒进行检测的灵敏度和检测上限均较为优异,且利用包含实施例7中的供体试剂的试剂盒进行检测的灵敏度和检测上限均优于包含实施例8中的供体试剂的试剂盒。可见,采用表面不包被多糖的供体微球的性能更加优异。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (26)
1.一种均相化学发光检测试剂盒,其包括:
供体试剂,其包括供体微球,所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧,且所述供体微球表面包被有标记物;和,
受体试剂,其包括受体微球,所述受体微球能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号,且所述受体微球表面包被有生物分子,所述生物分子能够与待测目标分子特异性结合;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述供体微球与受体微球的平均粒径均为20nm-350nm,优选为50nm-300nm,更优选为100nm-250nm,最优选为180nm-220nm。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,所述供体微球包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面化学键合标记物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合标记物。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒,其特征在于,所述标记物为亲和素;优选地,所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素,进一步优选选自中性亲和素或链霉亲和素。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述亲和素通过氨基与所述第一载体表面的醛基反应形成席夫碱的方式化学键合在所述第一载体的表面。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述第一载体的表面带有键合官能团,所述键合官能团用于将标记物化学键合在所述第一载体的表面。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基;优选选自醛基和/或羧基。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒,其特征在于,所述第一载体表面的键合官能团的含量为100~500nmol/mg,优选为200~400nmol/mg。
10.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述第一载体的表面包被有亲水性的醛基葡聚糖,所述醛基葡聚糖的醛基化学键合标记物。
11.根据权利要求3-10中任意一项所述试剂盒,其特征在于,所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟碄和酞菁中的一种。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述受体微球包括第二载体,所述第二载体的内部填充有发光组合物,所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层,所述多糖层的表面连接有生物分子。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述第二载体的表面包被有亲水性的羧基葡聚糖。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒,其特征在于,所述发光组合物包括铕配合物;进一步优选地,所述铕配合物为MTTA-EU3+。
15.根据权利要求3-14中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述第一载体和/或第二载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯;优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。
16.根据权利要求1-15中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述供体微球在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%;和/或,
所述受体微球在所述受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述活性氧为单线态氧。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗原结合的受体微球,所述第一抗原的抗原表位能够与待测目标抗体的抗原表位第一结合位点特异性结合;所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗原,所述第二抗原能够与待测目标抗体的抗原表位第二结合位点特异性结合,且待测目标抗体的抗原表位第一结合位点和抗原表位第二结合位点不相重叠;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球;所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
19.根据权利要求1-17中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗体结合的受体微球,所述第一抗体能够与待测目标抗原的抗原决定簇特异性结合;所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗体,所述第二抗体能够与待测目标抗原的抗原决定簇特异性结合;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球;所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
20.根据权利要求1-17中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与抗原结合的受体微球,所述抗原能够与目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的第二抗体,所述第二抗体能够与所述抗原特异性结合;和
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
21.根据权利要求1-17中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
第一试剂,其包含与生物素结合的第一抗原,所述第一抗原能够与目标抗体的抗原表位结合位点特异性结合;
受体试剂,其包含与抗免疫复合物抗体结合的受体微球,所述抗免疫复合物抗体能够与第一抗原和目标抗体形成的免疫复合物中目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;和,
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧;
其中,所述受体微球的粒径等于供体微球的粒径。
22.根据权利要求1-17中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
受体试剂,其包含与第一抗原结合的受体微球,所述第一抗原能够与目标抗体特异性结合,所述受体微球能够与单线态氧反应产生可检测的化学发光信号;
第一试剂,其包含与生物素结合的抗免疫复合物抗体,所述抗免疫复合物抗体能够与第一抗原和目标抗体形成的免疫复合物中目标抗体特异性结合;
供体试剂,其包含与亲和素结合的供体微球,所述所述供体微球能够在激发状态下生成单线态氧。
23.根据权利要求21或22所述的试剂盒,其特特征在于,所述抗免疫复合物抗体不与游离的或未与第一抗原结合的目标抗体结合。
24.一种均相化学发光检测方法,其利用如权利要求1-23中任意一项所述的试剂盒检测待测样本中的待测目标分子。
25.一种均相化学发光检测装置,其利用如权利要求1-23中任意一项所述试剂盒或权利要求19所述的方法检测待测样本中的待测目标分子。
26.根据权利要求25所述的装置,其特征在于,所述装置为POCT即时检测装置。
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