CN114152742A - 包含磁性发光微球的光激化学发光免疫检测的试剂盒及其应用 - Google Patents

包含磁性发光微球的光激化学发光免疫检测的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于光激化学发光免疫检测的试剂盒，其包括磁性发光微球，所述磁性发光微球标记有第一抗体；第二抗体，所述第二抗体由第一结合部分标记，并且与所述第一抗体针对相同抗原的不同表位；无磁性感光微球，所述无磁性感光微球由第二结合部分标记，并且所述第二结合部分能够与所述第一结合部分结合。本发明还涉及所述试剂盒用于实现目标物检测的应用。

Description

包含磁性发光微球的光激化学发光免疫检测的试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及光激化学发光免疫检测领域，具体地涉及一种包含磁性发光微球的光激化学发光免疫检测的试剂盒及其应用。
背景技术
光激化学发光免疫检测是一种典型的均相免疫分析方法。它以“双球”即“发光微球”和“感光微球”为基本特征，基于这两种微球表面包被的抗原或抗体，在液相中与目标物偶联形成免疫复合物而将这两种微球拉近。在激发光作用下，具有感光功能的“感光微球”能够将周围环境中的氧分子转化为单线态氧，并传递至具有发光功能的“发光微球”，进而诱导了发光微球上组分的化学发光反应，产生高能级的红光。通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为目标物浓度。而当待测样本不含目标物时，这两种微球则无法形成免疫复合物，其间距会超出单线态氧传播范围，则无高能级红光信号产生。
通常来说，这种均相免疫分析方法在测定过程中将待测样本与反应体系中的相关试剂混合反应后直接测定，而无需多余的分离或清洗的步骤，由此具有快速、免分离和清洗、高灵敏度和操作简单的特点。但是，由于缺少了样品分离的过程，在某些样品中，由于样品基质的干扰较大，在部分情况下会对抗原抗体的识别造成较大的影响。此外，在某些灵敏度要求高的检测中，由于目标物浓度过低造成的微球复合物(或称为微簇)浓度过低，这种均相免疫分析方法的灵敏度可能无法达到要求。
因此，本领域需要一种改进的光激化学发光免疫检测方法，使其能够在需要时解决因缺乏对样品进行分离和清洗而带来的基质干扰问题以及因微球复合物过低导致的灵敏度低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的光激化学发光免疫检测方法。具体地，本发明提供一种包含磁性发光微球的试剂盒及其用于光激化学发光免疫检测的应用。
本申请的发明人发现，在光激化学发光免疫检测的双球中的“发光微球”上加入磁性核心，使得发光微球具有磁性，在反应过程中则可以利用磁性操控发光微球的移动，由此能够在发光微球和感光微球形成微球复合物之前将捕获了目标物的发光微球与反应体系进行分离并清洗，进而降低后续检测中的背景干扰，提高发光信号，提升检测的灵活性和可调性，能够实现方法学上的多种可能性。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种用于通过光激化学发光免疫检测目标物的试剂盒，其包括：
-磁性发光微球，所述磁性发光微球标记有第一抗体；
-第二抗体，所述第二抗体由第一结合部分标记，并且特异性针对与所述第一抗体针对相同抗原的不同表位；
-无磁性感光微球，所述无磁性感光微球由第二结合部分标记，并且所述第二结合部分能够与所述第一结合部分结合。
在第二方面，提供了一种通过光激化学发光免疫检测目标物的方法，其使用第一方面所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
a)将磁性发光微球与待测样本在第一反应体系中混合并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
b)磁性分离孵育后的所述磁性发光微球；
c)将经分离的磁性发光微球、以及第二抗体加入第二反应体系，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
d)向所述第二反应体系中加入所述无磁性感光微球，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
e)检测所述磁性发光微球的发光强度。
在第三方面，提供了一种通过光激化学发光免疫检测目标物的方法，其使用根据第一方面所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
a)将磁性发光微球、待测样本以及第二抗体在第一反应体系中混合，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
b)磁性分离孵育后的所述磁性发光微球；
c)将所述经分离的磁性发光微球加入至第二反应体系，并向所述第二反应体系中加入所述无磁性感光微球，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
d)检测所述磁性发光微球的发光强度。
本发明的有益效果如下：利用磁性使抗体上捕获了目标物的发光微球(发光微球-目标物复合物)可以从反应体系中分离，利用清洗过程对复合物进行纯化，从而降低后续检测中的背景干扰；在需要高灵敏度的检测中，可以利用磁性将复合物转移到体积更小的反应体系，从而提高复合物的浓度，进而使得单线态氧在感光微球和发光微球之间的传递能够更加高效，从而提升检测信号；利用磁性使复合物能够在不同反应体系中转移，从而实现在不同体系中进行结合、检测等过程，提升了检测的灵活性和可调性。
附图说明
得益于以下具体实施方式以及参考附图，本发明的技术方案和益处对本领域技术人员会变得显而易见。
图1示出了根据本发明的一个实施方案制备的磁性发光微球的粒径分布。
图2示出了采用无磁性发光微球得到的胃泌素释放肽前体在0pg/ml至150pg/ml的低浓度范围与发光量的线性相关度曲线。
图3示出了采用无磁性发光微球得到的胃泌素释放肽前体在0pg/ml至8000pg/ml的全浓度范围与发光量的线性相关度曲线。
图4示出了采用根据本发明的磁性发光微球得到的胃泌素释放肽前体在0pg/ml至150pg/ml的低浓度范围与发光量的线性相关度曲线。
图5示出了采用根据本发明的磁性发光微球得到的胃泌素释放肽前体在0pg/ml至8000pg/ml的全浓度范围与发光量的线性相关度曲线。
图6示出了采用无磁性发光微球得到的降钙素原浓度在0ng/ml至30ng/ml的浓度范围与发光量的线性相关度曲线。
图7示出了采用磁性发光微球得到的降钙素原浓度在0ng/ml至30ng/ml的浓度范围与发光量的线性相关度曲线。
具体实施方式
下面对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明技术方案进行修改。
在第一方面，本申请提供了一种用于通过光激化学发光免疫检测目标物的试剂盒，其包括：
-磁性发光微球，所述磁性发光微球标记有第一抗体；
-第二抗体，所述第二抗体由第一结合部分标记，并且特异性针对与所述第一抗体针对相同抗原的不同表位；
-无磁性感光微球，所述无磁性感光微球由第二结合部分标记，并且所述第二结合部分能够与所述第一结合部分结合。
在一个进一步具体的实施方案中，所述第一结合部分和所述第二结合部分选自一对能够相互特异性结合的物质，例如配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素。
在一个优选的实施方案中，所述第一结合部分为亲和素和生物素中的一种，所述第二结合部分为亲和素和生物素中的另一种。作为示例，所述亲和素可以为例如卵白亲和素、卵黄亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、或类亲和素，但不限于此。
在一个更优选的实施方案中，所述第一结合部分为链霉亲和素和生物素中的一种，所述第二结合部分为链霉亲和素和生物素中的另一种。在一个具体实施方案中，所述第一结合部分为生物素，所述第二结合部分为链霉亲和素。
本领域技术人员根据本发明的内容能够清楚地知道，第一结合部分和第二结合部分之间的结合能够使第二抗体和无磁性感光微球结合，而第二抗体能够与磁性发光微球上结合目标物的第一抗体形成双抗体夹心结构，由此拉近了磁性发光微球和无磁性感光微球之间的距离，使得化学发光反应能够在光激发的情况下发生。由此，本领域技术人员也能够根据需要选择合适的第一结合部分和第二结合部分以分别标记第二抗体和无磁性感光微球。
如本文所用的，术语“结合”在本发明的上下文中具有本领域技术人员所理解的广泛的含义，具体地指由于例如共价偶联、配位、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
在又一个具体的实施方案中，所述目标物可以是疾病相关标志物，例如，肿瘤标志物，如胃泌素释放肽前体、甲胎蛋白、糖类抗原等；炎性疾病标志物，如降钙素原、白细胞介素、C反应蛋白等；病毒相关抗原，所述病毒可以为例如非洲猪瘟、牛口蹄疫、牛病毒性腹泻病毒等。
在又一个具体的实施方案中，所述目标物还可以是药物及其代谢物，例如用于人体或动物的抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗肿瘤试剂、类固醇、激素等及其代谢物。
在又一个具体的实施方案中，所述磁性发光微球通过以下方法制备：
-制备Fe3O4磁珠；
-用聚合物作为载体包被所述Fe3O4磁珠，得到磁性高分子微球；
-用发光组合物涡旋包覆所述磁性高分子微球，得到磁性发光微球，其中所述发光组合物包含烯烃化合物和金属螯合物；
-连接针对目标物的第一抗体。
在一个进一步具体的实施方案中，由氯化铁或其水合物来制备Fe3O4磁珠。
所述磁性发光微球以Fe3O4磁珠为内核，表面包被有带有活性基团如羧基、氨基、醛基、环氧基、偶氮基、烯烃、炔烃的聚合物，如聚苯乙烯、聚己内酯、琼脂糖、二氧化硅等。这种活性基团能够用于偶联抗体。
在一个进一步具体的实施方案中，所述发光组合物包含烯烃化合物和金属螯合物。所述烯烃化合物可以为2-苯基氧硫杂环己烯及其衍生物。在一个更进一步具体的实施方案中，所述金属螯合物的金属可以是荧光稀土金属，优选地选自钇、铕、钆、镧、铈、铽、镱、钐等，更优选为铕。例如，所述金属螯合物为铕(Eu)配合物，例如为(1,10-菲咯啉)三[4,4,4-三氟-1-(2-噻吩基)-1,3-丁二酮]铕(III)。
在又一个具体的实施方案中，所述磁性发光微球的粒径为40nm至800nm。在进一步优选的实施方案中，所述磁性发光微球的粒径为100nm至300nm。
在又一个具体的实施方案中，所述无磁性感光微球的粒径可以为40nm至800nm。在一个优选的实施方案中，所述无磁性感光微球的粒径为100nm至300nm。无磁性感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。感光化合物可以是例如酞菁染料、卟啉衍生物或其它可以接收光并产生活性氧的化合物等。所述无磁性感光微粒可以是商购获得，例如购自珀金埃尔默股份有限公司。本领域技术人员能够根据实际需要选择适用于本发明的无磁性感光微粒。在用于本发明之前，本领域技术人员可以采用本领域常规手段对商购的无磁性感光微球标记第二结合部分。
在第二方面，提供了一种通过光激化学发光免疫检测目标物的方法，其使用根据第一方面所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
a)将磁性发光微球与待测样本在第一反应体系中混合，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
b)磁性分离孵育后的所述磁性发光微球；
c)将经分离的磁性发光微球、以及第二抗体加入第二反应体系，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
d)向所述第二反应体系中加入所述无磁性感光微球，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
e)检测所述磁性发光微球的发光强度。
如本文所用的，术语“待测样本”是指待测的含有或疑似含有待测目标物的样本。可以用于本发明的待测样本包括体液，例如人或动物血清、血浆、尿液、痰液、乳汁、唾液；溶剂；食品样品如蔬菜瓜果；环境样本如土或水样；植物材料；细胞；细菌；病毒；真菌等等。
在一个具体的实施方案中，所述磁性发光微球在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL；所述第二抗体在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL；以及所述无磁性感光微球在所述第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL。
在一个优选的实施方案中，所述磁性发光微球在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.04mg/mL至0.4mg/mL；所述第二抗体在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.04mg/mL至0.4mg/mL；以及所述无磁性感光微球在所述第二反应体系中的浓度为0.04mg/mL至0.4mg/mL。
在一个优选的实施方案中，步骤a)包括在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至20分钟，例如在37℃孵育15分钟。
在一个具体的实施方案中，步骤b)中的磁性分离可以包括利用吸磁棒、吸磁板等本领域熟知工具，并无特殊限制。
在又一个具体的实施方案中，在进行步骤c)之前，将所述经分离的磁性发光微球转移至清洗液中进行清洗。本领域技术人员能够根据检测体系的实际需要选择清洗液，例如HEPES缓冲液、PBS缓冲液、TRIS-HCl等。清洗可以使得磁性发光微球上第一抗体捕获的目标物从第一反应体系中分离，并利用清洗过程对磁性发光微球-目标物复合物进行纯化，降低背景干扰。
在一个优选的实施方案中，步骤c)包括在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至15分钟，例如在37℃孵育15分钟。
在又一个优选的实施方案中，步骤d)包括在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至15分钟，例如在37℃孵育15分钟。
如果待测样本中包含目标物，则在步骤a)的孵育后，标记有第一抗体的磁性发光微球会通过第一抗体与所述目标物偶联；在步骤c)的孵育后，第二抗体与所述目标物偶联；在步骤d)的孵育后，第二抗体与无磁性感光微球通过所述第一结合部分和第二结合部分而结合；并且，第一抗体与第二抗体在所述目标物上的不同结合位点与所述目标物偶联。
在进一步具体的实施方案中，所述第一反应体系与所述第二反应体系是相同或不同的。利用磁性分离之后的微球复合物可以被转移到与第一反应体系不同的体系中，从而实现微球、目标物和抗体之间的结合与检测过程在不同体系中进行，进而提升检测的灵活性和可调性。例如，所述第二反应体系可以具有与所述第一反应体系不同的溶剂、酸碱度、表活浓度等，使得能够促进第二抗体或感光微球与微球复合物的结合，以及降低检测的背景干扰等。
在又一个具体的实施方案中，所述第一反应体系的溶液体积和所述第二反应体系的溶液体积可以是相同或不同的。
在需要高灵敏度的检测中，利用磁性分离之后的微球复合物可以转移到体积更小的第二反应体系中，从而提高微球复合物的浓度，使得微球复合物彼此更加紧密，进而使得活性氧在感光微球和发光微球之间的传递更加高效，从而提升检测信号。因此，在一个优选的实施方案中，所述第二反应体系的溶液体积小于所述第一反应体系的溶液体积。
在一个进一步具体的实施方案中，步骤e)中检测发光强度可以采用本领域熟知的方法，例如，首先采用激光光照，如利用600nm至700nm的光激发无磁性感光微粒，可以将空气中的氧分子转化成单线态氧，在无磁性感光微粒与磁性发光微粒距离足够近的情况下，单线态氧能够传递到磁性发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，并激发其中金属螯合物中的金属，最终产生例如520nm至620nm的短波光子。然后，可以使用商用的酶标仪检测磁性发光微球的发光强度。检测得到的发光强度决定了待测样本中是否包括目标物以及目标物的含量。
在第三方面，提供了一种通过光激化学发光免疫检测目标物的方法，其使用根据第一方面所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
a)将磁性发光微球、待测样本以及第二抗体在第一反应体系中混合，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
b)磁性分离孵育后的所述磁性发光微球；
c)将所述经分离的磁性发光微球加入至第二反应体系，并向所述第二反应体系中加入所述无磁性感光微球，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟；
d)检测所述磁性发光微球的发光强度。
在一个具体的实施方案中，所述磁性发光微球在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL；所述第二抗体在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL；以及所述无磁性感光微球在所述第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL。
在一个优选的实施方案中，所述磁性发光微球在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.04mg/mL至0.4mg/mL；所述第二抗体在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.04mg/mL至0.4mg/mL，以及所述无磁性感光微球在所述第二反应体系中的浓度为0.04mg/mL至0.4mg/mL。
在一个优选的实施方案中，步骤a)包括在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至20分钟，例如在37℃孵育15分钟。
在又一个具体的实施方案中，步骤b)中的磁性分离可以包括利用吸磁棒、吸磁板等本领域公知工具，并无特殊限制。
在又一个具体的实施方案中，在进行步骤c)之前，将所述经分离的磁性发光微球转移至清洗液中进行清洗。本领域技术人员能够根据检测体系的实际需要选择清洗液，例如HEPES缓冲液、PBS缓冲液、TRIS-HCl等。清洗可以使得磁性发光微球上第一抗体捕获的目标物从第一反应体系中分离，并利用清洗过程对磁性发光微球-目标物复合物进行纯化，降低背景干扰。
在一个具体的实施方案中，步骤c)包括在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至15分钟，例如在37℃孵育15分钟。
如果待测样本中包含目标物，则在步骤a)的孵育后，标记有第一抗体的磁性发光微球会通过第一抗体与所述目标物偶联，且第二抗体也会与所述目标物偶联；并且，第一抗体与第二抗体在所述目标物上的不同结合位点与所述目标物偶联；在步骤c)的孵育后，第二抗体与无磁性感光微球通过所述第一结合部分和第二结合部分而结合。
本申请的发明人发现，无论是在与第二抗体偶联前将感光微球-目标物复合物从体系分离然后再偶联第二抗体，还是在将第二抗体偶联于感光微球-目标物复合物形成微球复合物之后在从体系分离，都能够实现降低背景干扰、提高检测信号、提升检测的灵活性和可调性的技术效果。在一个优选的实施方案中，在将第二抗体偶联于感光微球-目标物复合物形成微球复合物之后进行分离，对于实现降低背景干扰、提高检测信号、提升检测的灵活性和可调性的效果更佳。
在一个进一步具体的实施方案中，所述第一反应体系与所述第二反应体系是相同或不同的。利用磁性分离之后的微球复合物可以被转移到与第一反应体系不同的体系中，从而实现微球、目标物和抗体之间的结合与检测过程在不同体系中进行，进而提升检测的灵活性和可调性。例如，所述第二反应体系可以具有与所述第一反应体系不同的溶剂、酸碱度、表活浓度等，使得能够促进第二抗体或感光微球与微球复合物的结合，以及降低检测的背景干扰等。
在又一个具体的实施方案中，所述第一反应体系的溶液体积和所述第二反应体系的溶液体积可以是相同或不同的。
实施例
下文中，结合实施例及附图更详细地描述本发明。然而，本文公开的具体实施例仅出于示例的目的，而不应该被认为旨在解释本发明的范围。
化学试剂均可以通过商购获得，例如购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，感光微球购自珀金埃尔默股份有限公司。
实施例1.无抗体标记的磁性发光微球的制备
Fe3O4磁核的制备：在1000ml三口瓶中加入16.2g六水氯化铁、500ml聚乙二醇和1g乙酸钠，抽真空通氮气，300rpm磁力搅拌，200℃回流48小时，超纯水洗涤三次，得到磁核。
磁性高分子微球的制备：取上述得到的磁核1g加入30ml无水乙醇，加入0.5ml甲基丙烯酸，0.25mL聚苯乙烯(平均分子量26000)，导入到含有250ml 75乙醇且带有450rpm机械搅拌的三口瓶中，加入5ml乙醇0.1mM偶氮二异丁腈，通氮气除氧，加热至75℃，搅拌过夜，得到磁性高分子微球。
磁性发光微球的制备：取上述磁性高分子微球60mg，定容至30mL，涡旋包覆制备发光微球，加入2.85mL二氯乙烷，加入Eu配合物(1,10-菲咯啉)三[4,4,4-三氟-1-(2-噻吩基)-1,3-丁二酮]铕(III)20mg,1-苯二甲胺基，2-苯基氧硫杂环己烯10mg，涡旋2小时后，旋转蒸发仪40℃旋蒸30分钟，随后无水乙醇洗涤3次，得到磁性发光微球。
实施例2.无抗体标记的磁性发光微球的表征
粒径表征：取实施例1制备的磁性发光微球10μL，将其分散于超纯水中，浓度控制为0.1-1mg/mL的范围,利用激光粒度仪进行测试，结果如图1所示。由此可知，根据本发明实施例1所制备的磁性发光微球的平均粒径为182nm，PDI为0.044。
羧基含量表征：取实施例1制备的磁性发光微球100mg，分散于100mL超纯水中，用0.1M氢氧化钠溶液，结合电位滴定仪进行滴定，计算得出羧基含量为86μmol/g。就实验的可操作性来看，通常选择羧基含量在60μmol/g至200μmol/g范围的磁性发光微球。
实施例3：用第一抗体标记磁性发光微球
用胃泌素释放肽前体的抗体(抗ProGRP抗体)标记磁性发光微球的步骤如下：
活化：取100μL的10mg/mL浓度磁性发光微球(即1mg)，用10000rpm离心15分钟，去上清，加入200μL pH7.0 100mM HEPES缓冲液，超声重悬。
现称取一定量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，用pH7.0 100mM HEPES缓冲液溶解，分别配制为50mg/ml EDC和50mg/mlNHS。往上述含磁性发光微球的体系中先加入NHS 10μL，再加入EDC 5μL，随后37℃活化90min。
偶联：活化步骤结束后，往体系中加入100μL HEPES缓冲液，并再次在10000rpm、37℃离心15分钟，去上清，先加入HEPES缓冲液，超声重悬，随后加入抗体(抗ProGRP抗体)，37℃偶联过夜。
封闭：偶联步骤结束后，加入100μL封闭剂，随后37℃封闭过夜；过夜后置换至HEPES溶液。
实施例4：目标物浓度与发光强度的线性相关度
于酶标板中加入标记有胃泌素释放肽前体的抗体I的25μL磁性发光微球、10μL的胃泌素释放肽前体浓度为0pg至8000pg范围的不同浓度的待测血清样本、25μl生物素化抗体II，在37℃孵育15分钟；随后，用磁棒将其取出，并放置于pH6.5 100mM HEPES溶液中分散搅动30秒，再分散于60μL含1％BSA、0.05％吐温80、2％蔗糖的pH6.5 100mM HEPES溶液中，再向其中加入75μL标记有链霉亲和素的感光微球37℃孵育15分钟，随后测试发光强度。
使用无磁性发光微球作为对照，于酶标板中加入标记有胃泌素释放肽前体的抗体I的25μL无磁性发光微球、10μL的胃泌素释放肽前体浓度为0pg至8000pg范围的不同浓度的待测血清样本、25μL生物素化抗体II，在37℃孵育15分钟；再向其中加入75μL标记有链霉亲和素的感光微球37℃孵育15分钟，随后测试发光强度。
将待测血清样本中胃泌素释放肽前体的浓度与检测得到的相应的发光强度结果与罗氏化学发光测试的值进行比对，并做出低浓度范围(0pg/mL至150pg/mL)和全浓度范围(0pg/mL至8000pg/mL)的线性相关度曲线，结果如图2-图5所示。
结果发现，在全浓度范围，特别是高浓度(高于150pg/mL)时，磁性发光微球和无磁性发光微球的结果非常接近，线性度都达到了0.99，如图3和图5所示。这说明在高浓度情况下，对目标物进行分离的步骤对于浓度的线性相关度影响不大。而在目标物的浓度低于150pg/mL时，磁性发光微球的线性相关度要明显更好，达到0.95，如图4所示，而无磁性发光微球的线性相关度较差，仅为0.867，如图2所示。这说明对于低浓度的目标物，磁性的加入或者说分离步骤的引入对线性相关度的提升有明显影响。可以理解，低浓度一般是杂质影响最多的区间，通过磁性发光微球对目标物进行分离的步骤，使得浓度与发光强度的线性相关度得到明显的提升。
实施例5：磁性发光微球粒径与发光强度的测试
于酶标板中加入标记有胃泌素释放肽前体的抗体I的25μL磁性发光微球(五个不同粒径：278nm、205nm、173nm、127nm和97nm)(于pH6.8 100mM HEPES溶液中)、50μL的含胃泌素释放肽前体的待测血清样本(三个不同浓度0.2ng/mL、0.067ng/mL和0.022ng/mL)、以及25μL生物素化抗体II，在37℃孵育15分钟；随后，向其中加入75μL标记有链霉亲和素的感光微球37℃孵育15分钟，随后测试发光强度，结果如下表1所示。
表1：不同浓度(ng/mL)的样本在不同粒径(nm)的磁性发光微球下的发光强度
Figure BDA0003383956810000141
由表1可知，粒径大于100nm的磁性发光微球的发光强度远远高于粒径略低于100nm的磁性发光微球的发光强度。
实施例6：降钙素原的检测
于酶标板中加入25μL标记有降钙素原抗体I的磁性发光微球、25μL的不同降钙素原浓度的待测血清样本、25μL生物素化的降钙素原抗体II，在37℃孵育15分钟；随后，用磁棒将其取出，并放置于pH6.5 100mM HEPES溶液中分散搅动30秒，再分散于75μL含1％BSA、0.05％吐温80、2％蔗糖的pH6.5 100mM HEPES溶液中，再向其中加入140μL标记有链霉亲和素的感光微球，在37℃孵育15分钟，随后测试发光强度。
于酶标板中加入标记有降钙素原抗体I的25μL无磁性发光微球、25μL的不同降钙素原浓度的待测血清样本、25μL生物素化的降钙素原抗体II，在37℃孵育15分钟；随后，向其中加入140μL标记有链霉亲和素的感光微球，在37℃孵育15分钟，随后测试发光强度。
将待测血清样本中降钙素原的浓度与其分别通过磁性发光微球和无磁性发光微球得到的发光结果进行比对，结果示于图6-7和下表2。
由图6和图7可知，尽管从线性相关度的角度来看，通过磁性发光微球和无磁性发光微球的检测都得到了不错的结果，但是，从斜率的角度来看，磁性发光微球得到的斜率是无磁性发光微球的2倍，这说明磁性发光微球能够更好地区分低浓度的样本。
从表2中的数据也可以得到相同的结论：当采用无磁性发光微球检测血清样本中的降钙素原时，无法明显区分0ng/mL和0.04ng/mL这两个浓度，说明采用无磁性发光微球检测的检出限至少大于0.04ng/mL。而采用磁性发光微球时，可以明显区分0ng/mL和0.008ng/mL这两个浓度，说明采用磁性发光微球检测的检出限至少为0.008ng/mL。由于采用了血清样本，血清基质对于发光强度的检测会有一定干扰。这种基质的干扰在低浓度样本的检测中尤其明显，例如，浓度为0时的信号差异就可能是血清基质的影响，来源于基质中的非特异性的吸附。由表2可知，这种基质效应使得无磁性发光微球根本无法区分0ng/mL、0.008ng/mL和0.04ng/mL这三个浓度，而磁性发光微球则由于增强的发光强度，避免了基质效应的影响。可见，采用磁性发光微球的检测降低了检出限。同时，从发光强度看，采用磁性发光微球的发光强度数值是采用无磁性发光微球的发光强度数值的至少2倍以上，明显更利于浓度的区分。也就是说，采用磁性发光微球的检测利于浓度的区分，具有降低的检出限和提高的准确度。
表2：采用磁性和无磁性发光微球检测得到的发光强度
Figure BDA0003383956810000161
实施例7：胃泌素释放肽前体的检测
于酶标板中加入标记有胃泌素释放肽前体抗体I的25μL磁性发光微球、25μL的不同胃泌素释放肽前体浓度的待测样本、25μL生物素化的抗体II，在37℃孵育15分钟；随后，用磁棒将其取出，并放置于pH6.5 100mM HEPES溶液中分散搅动30秒，再分散于75μL含1％BSA、0.05％吐温80、2％蔗糖的pH6.5 100mM HEPES溶液中，再向其中加入140μL标记有链霉亲和素的感光微球，在37℃孵育15分钟，随后测试发光强度。
于酶标板中加入标记有胃泌素释放肽前体抗体I的25μL磁性发光微球、25μL的不同胃泌素释放肽前体浓度的待测血清样本、25μL生物素化的抗体II，在37℃孵育15分钟；随后，再向其中加入140μL标记有链霉亲和素的感光微球，在37℃孵育15分钟，随后测试发光强度。
将待测血清样本中胃泌素释放肽前体的浓度与其分别通过磁性发光微球和无磁性发光微球得到的发光结果进行比对，结果如下表3所示。由表中的数据可知，尽管采用无磁性发光微球和采用磁性发光微球都能够明显区分0ng/mL和0.0016ng/mL这两个浓度，但是对比发光强度的差值可知，采用磁性发光微粒检测0.0016ng/mL浓度得到的发光强度是0ng/mL的3倍，而采用无磁性发光微粒的比值检测0.0016ng/mL浓度得到的发光强度是检测0ng/mL浓度的不到2倍。这从侧面说明了采用磁性发光微粒进行检测的检出限明显更低，更利于浓度的区分和提高检测的准确度。
表3：采用磁性和无磁性发光微球检测得到的发光强度
Figure BDA0003383956810000171
同样，由于待测样本采用了标准溶液，并无杂质，采用磁性发光微粒无法体现出去除杂质的优势，因此检出限的提升可以归因于提高了微簇浓度。
实施例8：更换反应体系的检测
将标记了非洲猪瘟抗体I的浓度为1mg/mL的磁性发光微球25μL、100mM Tris-HClpH6.0 25μL与25μL猪血清样本(呈VP72蛋白阳性)混合，37度孵育15分钟，随后用吸磁棒将其转移到含0.1％吐温80的100mM的pH7.0 PBS缓冲液中清洗一次，释放到75μL的含0.1％的吐温80的100mM的pH7.0 PBS缓冲液中，再加入25μL生物素化的非洲猪瘟抗体II，37度孵育15分钟。加入市售的15μL标记了链霉亲和素的感光微球1mg/mL，在37度孵育15分钟，随后测试磁性发光微球的发光强度，结果如下表4所示。
表4：不同反应体系中磁性发光微球的发光强度
Figure BDA0003383956810000172
Figure BDA0003383956810000181
由表4中的数据可知，将磁性发光微球从反应体系Tris-HCl pH6.0转移至含0.1％吐温80的100mM的pH7.0 PBS缓冲液，发光强度出现了数量级的增长，这显然更利于浓度的区分和提高检测的准确度。

Claims (10)

1.一种用于通过光激化学发光免疫检测目标物的试剂盒，其包括：
-磁性发光微球，所述磁性发光微球标记有第一抗体；
-第二抗体，所述第二抗体由第一结合部分标记，并且特异性针对与所述第一抗体针对相同抗原的不同表位；
-无磁性感光微球，所述无磁性感光微球由第二结合部分标记，并且所述第二结合部分能够与所述第一结合部分结合，例如通过共价偶联、配位、静电、疏水、离子、和/或氢键相互作用结合。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一结合部分和所述第二结合部分选自一对能够相互特异性结合的物质，例如配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素；优选地，所述第一结合部分为亲和素和生物素中的一种，所述第二结合部分为亲和素和生物素中的另一种；所述亲和素为例如卵白亲和素、卵黄亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、或类亲和素，优选为链霉亲和素。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述目标物是疾病相关标志物或药物及其代谢物，例如，肿瘤标志物(如胃泌素释放肽前体、甲胎蛋白、糖类抗原)，炎症疾病标志物(如降钙素原、白细胞介素、C反应蛋白)，病毒(如非洲猪瘟、牛口蹄疫、牛病毒性腹泻病毒)相关抗原，抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗肿瘤试剂、类固醇、激素及其代谢物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中，所述磁性发光微球通过以下方法制备：
-制备Fe3O4磁珠；
-用聚合物如聚苯乙烯作为载体包被所述Fe3O4磁珠，得到磁性高分子微球；
-用发光组合物涡旋包覆所述磁性高分子微球，得到磁性发光微球，其中所述发光组合物包含烯烃化合物和金属螯合物；
-连接针对目标物的第一抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其中，所述磁性发光微球的粒径为40nm至800nm，优选为100nm至300nm；并且
其中，所述无磁性感光微球的粒径为40nm至800nm，优选为100nm至300nm。
6.一种通过光激化学发光免疫检测目标物的方法，其使用根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
a)将磁性发光微球与待测样本在第一反应体系中混合，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟，优选在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至20分钟；
b)磁性分离孵育后的所述磁性发光微球；
c)将经分离的磁性发光微球、以及第二抗体加入第二反应体系，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟，优选在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至15分钟；
d)向所述第二反应体系中加入所述无磁性感光微球，并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟，优选在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至15分钟；
e)检测所述磁性发光微球的发光强度。
7.一种通过光激化学发光免疫检测目标物的方法，其使用根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
a)将磁性发光微球、待测样本以及第二抗体在第一反应体系中混合并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟，优选在35℃至40℃的温度范围孵育10分钟至20分钟；
b)磁性分离孵育后的所述磁性发光微球；
c)将所述经分离的磁性发光微球加入至第二反应体系，并向所述第二反应体系中加入所述无磁性感光微球并在30℃至42℃的温度范围孵育3分钟至30分钟，优选在35℃至40℃的温度范围孵育5分钟至15分钟；
d)检测所述磁性发光微球的发光强度。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述磁性发光微球在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL，优选为0.04mg/mL至0.4mg/mL；所述第二抗体在所述第一反应体系或第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL，优选为0.04-0.4mg/mL；以及所述无磁性感光微球在所述第二反应体系中的浓度为0.001mg/mL至5mg/mL，优选为0.04mg/mL至0.4mg/mL。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述第一反应体系与所述第二反应体系是相同或不同的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一反应体系的溶液体积和所述第二反应体系的溶液体积是相同或不同的；优选地，所述第二反应体系的溶液体积小于所述第一反应体系的溶液体积。
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