JPH06109734A - 抗原の測定方法 - Google Patents
抗原の測定方法Info
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- JPH06109734A JPH06109734A JP28350092A JP28350092A JPH06109734A JP H06109734 A JPH06109734 A JP H06109734A JP 28350092 A JP28350092 A JP 28350092A JP 28350092 A JP28350092 A JP 28350092A JP H06109734 A JPH06109734 A JP H06109734A
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- JP
- Japan
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- measured
- antibody
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- reaction
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 測定すべき抗原に対する抗体を固相化し該固
相のブロッキングを行った後、測定すべき抗原を含む被
検試料を反応させ、測定すべき抗原に対するペルオキシ
ダーゼ標識第２抗体を反応させた後、過酸化水素の存在
下にビオチニルチラミドを反応させ、更にアルカリフォ
スファターゼ標識アビジンを反応させて、該アルカリフ
ォスファターゼの活性を測定する 【効果】 ビオチニルチラミド反応に基づく増感反応と
アルカリフォスファターゼを用いる活性測定法とを組合
せることにより、ＥＩＡによる抗原の高感度測定が可能
となる。
相のブロッキングを行った後、測定すべき抗原を含む被
検試料を反応させ、測定すべき抗原に対するペルオキシ
ダーゼ標識第２抗体を反応させた後、過酸化水素の存在
下にビオチニルチラミドを反応させ、更にアルカリフォ
スファターゼ標識アビジンを反応させて、該アルカリフ
ォスファターゼの活性を測定する 【効果】 ビオチニルチラミド反応に基づく増感反応と
アルカリフォスファターゼを用いる活性測定法とを組合
せることにより、ＥＩＡによる抗原の高感度測定が可能
となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗原の高感度測定方法に
関し、より詳しくはビオチニルチラミドとアルカリフォ
スファターゼを用いる活性測定との組合せにより測定感
度を著しく向上させた抗原の測定方法に関する。
関し、より詳しくはビオチニルチラミドとアルカリフォ
スファターゼを用いる活性測定との組合せにより測定感
度を著しく向上させた抗原の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原（「抗体と特異的に結合する物質」
をいう）の測定方法としては種々の方法が知られている
が、測定対象によっては、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）で
高感度測定ができない場合があった。例えば、抗原の一
種である神経組織関連蛋白質（Ｓ−１００等）のＥＩＡ
測定においては、ヒト髄液中のレベルを直接にモニター
できる程度の検出限界（例えば０．０２ｎｇ／ｍｌ程
度）を有する高感度な測定方法は未だ確立されていな
い。
をいう）の測定方法としては種々の方法が知られている
が、測定対象によっては、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）で
高感度測定ができない場合があった。例えば、抗原の一
種である神経組織関連蛋白質（Ｓ−１００等）のＥＩＡ
測定においては、ヒト髄液中のレベルを直接にモニター
できる程度の検出限界（例えば０．０２ｎｇ／ｍｌ程
度）を有する高感度な測定方法は未だ確立されていな
い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
検体中に微量に存在する抗原のレベルを直接にモニター
可能な感度を有する抗原のＥＩＡ測定方法を提供するこ
とにある。
検体中に微量に存在する抗原のレベルを直接にモニター
可能な感度を有する抗原のＥＩＡ測定方法を提供するこ
とにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ビオチニルチラミドの反応に基づく増感反応とア
ルカリフォスファターゼを用いる活性測定とを組合せる
ことにより、ＥＩＡによる抗原の高感度測定が可能なこ
とを見出した。
結果、ビオチニルチラミドの反応に基づく増感反応とア
ルカリフォスファターゼを用いる活性測定とを組合せる
ことにより、ＥＩＡによる抗原の高感度測定が可能なこ
とを見出した。
【０００５】本発明の抗原の測定方法は、上記知見に基
くものであり、より詳しくは、測定すべき抗原に対する
抗体を固相化し該固相のブロッキングを行った後、測定
すべき抗原を含む被検試料を反応させ、測定すべき抗原
に対するペルオキシダーゼ標識第２抗体を反応させた
後、過酸化水素の存在下にビオチニルチラミドを反応さ
せ、更にアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応
させて、該アルカリフォスファターゼの活性を測定する
ことを特徴とするものである。
くものであり、より詳しくは、測定すべき抗原に対する
抗体を固相化し該固相のブロッキングを行った後、測定
すべき抗原を含む被検試料を反応させ、測定すべき抗原
に対するペルオキシダーゼ標識第２抗体を反応させた
後、過酸化水素の存在下にビオチニルチラミドを反応さ
せ、更にアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応
させて、該アルカリフォスファターゼの活性を測定する
ことを特徴とするものである。
【０００６】本発明によれば、更に、測定すべき抗原に
対する抗体を磁性粒子からなる固相に固相化し該固相の
ブロッキングを行った後、測定すべき抗原を含む被検試
料および測定すべき抗原に対するペルオキシダーゼ標識
第２抗体を反応させ、過酸化水素の存在下にビオチニル
チラミドを反応させ、更にアルカリフォスファターゼ標
識アビジンを反応させて、該アルカリフォスファターゼ
の活性を測定することを特徴とする抗原の測定方法が提
供される。
対する抗体を磁性粒子からなる固相に固相化し該固相の
ブロッキングを行った後、測定すべき抗原を含む被検試
料および測定すべき抗原に対するペルオキシダーゼ標識
第２抗体を反応させ、過酸化水素の存在下にビオチニル
チラミドを反応させ、更にアルカリフォスファターゼ標
識アビジンを反応させて、該アルカリフォスファターゼ
の活性を測定することを特徴とする抗原の測定方法が提
供される。
【０００７】以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発
明を詳細に説明する。
明を詳細に説明する。
【０００８】（固相）後述する抗体の固定化（主に物理
吸着による）が可能なものであれば、固相の材質又は形
状は特に制限されないが、多数の被検試料（検体）を同
時に測定可能な点からは、複数のウエル（穴）を有する
マイクロプレート（例えば、９６ウエル−マイクロプレ
ート）を用いることが好ましい。酵素活性を発光反応を
用いて測定する場合には、隣り合うウエルからの光の干
渉防止の点からは、上記マイクロプレートは不透明なも
のであることが好ましい。
吸着による）が可能なものであれば、固相の材質又は形
状は特に制限されないが、多数の被検試料（検体）を同
時に測定可能な点からは、複数のウエル（穴）を有する
マイクロプレート（例えば、９６ウエル−マイクロプレ
ート）を用いることが好ましい。酵素活性を発光反応を
用いて測定する場合には、隣り合うウエルからの光の干
渉防止の点からは、上記マイクロプレートは不透明なも
のであることが好ましい。
【０００９】本発明においては磁性粒子（磁性体を被覆
した樹脂粒子をいう）をも上記固相として好ましく使用
可能である。このような磁性粒子を用いた場合、固相と
しての表面積が大きいため、反応速度を大きくでき、ま
た磁石等の利用により洗浄操作が容易という利点があ
る。このような磁性粒子としては、粒径０．２〜１μｍ
（更には０．２〜０．５μｍ）程度のものが好ましく用
いられる。上記磁性体としては鉄酸化物等の公知の磁性
体（マグネタイト、フェライト等）を用いることができ
る。また、磁性粒子中の磁性体の含有量は３０〜７０％
（更には４０〜６０％）程度であることが好ましい。樹
脂粒子としては、スチレン−アクリル共重合体等の公知
のポリマー粒子が使用可能である。
した樹脂粒子をいう）をも上記固相として好ましく使用
可能である。このような磁性粒子を用いた場合、固相と
しての表面積が大きいため、反応速度を大きくでき、ま
た磁石等の利用により洗浄操作が容易という利点があ
る。このような磁性粒子としては、粒径０．２〜１μｍ
（更には０．２〜０．５μｍ）程度のものが好ましく用
いられる。上記磁性体としては鉄酸化物等の公知の磁性
体（マグネタイト、フェライト等）を用いることができ
る。また、磁性粒子中の磁性体の含有量は３０〜７０％
（更には４０〜６０％）程度であることが好ましい。樹
脂粒子としては、スチレン−アクリル共重合体等の公知
のポリマー粒子が使用可能である。
【００１０】本発明においては、上記磁性粒子として市
販品（例えば商品名：フェリスフィア、日本ペイント社
製；バイオ・マグ、アドバンス・マグネティック社製；
等）をそのまま用いることが可能である。
販品（例えば商品名：フェリスフィア、日本ペイント社
製；バイオ・マグ、アドバンス・マグネティック社製；
等）をそのまま用いることが可能である。
【００１１】（ブロッキング）本発明においては、抗体
を固相化した後、該固相をブロッキング剤によりブロッ
キングして用いる。本発明において用いるブロッキング
剤としては、公知のものを特に制限なく用いることがで
きる。より具体的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、カゼイン、スキムミルク等が好ましく用いられ
る。また市販のブロッキング剤（例えば商品名：ブロッ
クエース、雪印乳業製）を用いてもよい。
を固相化した後、該固相をブロッキング剤によりブロッ
キングして用いる。本発明において用いるブロッキング
剤としては、公知のものを特に制限なく用いることがで
きる。より具体的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、カゼイン、スキムミルク等が好ましく用いられ
る。また市販のブロッキング剤（例えば商品名：ブロッ
クエース、雪印乳業製）を用いてもよい。
【００１２】（抗原）本発明において測定可能な抗原は
特に制限されないが、本発明は、特に従来、酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）ではヒト血中および髄液中レベルでの測
定が困難であったような抗原（調節因子、ホルモン、神
経伝達物質等）、より具体的には、例えばＳ−１００等
の神経組織関連蛋白質等の測定に好ましく適用できる。
特に制限されないが、本発明は、特に従来、酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）ではヒト血中および髄液中レベルでの測
定が困難であったような抗原（調節因子、ホルモン、神
経伝達物質等）、より具体的には、例えばＳ−１００等
の神経組織関連蛋白質等の測定に好ましく適用できる。
【００１３】（被検試料）測定すべき抗原を含有すると
考えられる血清、血漿、髄液、培養上清等が用いられ
る。必要に応じて、被検試料は、緩衝液等で希釈（例え
ば５〜１００倍程度に希釈）して用いてもよい。
考えられる血清、血漿、髄液、培養上清等が用いられ
る。必要に応じて、被検試料は、緩衝液等で希釈（例え
ば５〜１００倍程度に希釈）して用いてもよい。
【００１４】（固相化抗体）固相化すべき抗体として
は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のい
ずれも使用可能である。
は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のい
ずれも使用可能である。
【００１５】（第２抗体）固相化した抗体とともに、抗
原をはさむ（サンドイッチ）べき第２抗体としては、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも
使用可能である。この第２抗体を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼで標識する方法
としては、公知の方法が特に制限なく用いられる。
原をはさむ（サンドイッチ）べき第２抗体としては、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも
使用可能である。この第２抗体を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼで標識する方法
としては、公知の方法が特に制限なく用いられる。
【００１６】（ビオチニルチラミド反応）本発明におい
て、ビオチニル・チラミド(Biotinyl tyramide) は、過
酸化水素（Ｈ2Ｏ2）とペルオキシダーゼの存在下にラジ
カルとなり、ペルオキシダーゼ近傍のブロッキング剤
（蛋白質）に選択的に結合するため、後述するアビジン
−ビオチン反応との組合せによる増感が可能となる。こ
のビオチニルチラミド反応の詳細については文献(J. Im
munol. Methods１２５，２７９−２８５（１９８９））
を参照することができる。
て、ビオチニル・チラミド(Biotinyl tyramide) は、過
酸化水素（Ｈ2Ｏ2）とペルオキシダーゼの存在下にラジ
カルとなり、ペルオキシダーゼ近傍のブロッキング剤
（蛋白質）に選択的に結合するため、後述するアビジン
−ビオチン反応との組合せによる増感が可能となる。こ
のビオチニルチラミド反応の詳細については文献(J. Im
munol. Methods１２５，２７９−２８５（１９８９））
を参照することができる。
【００１７】（アビジン−ビオチン反応）本発明におい
ては、アルカリフォスファターゼ標識アビジン（ストレ
プトアビジンを包含する趣旨で用いる）を上記ビオチニ
ルチラミド反応の生成物と更に反応させている。このア
ルカリフォスファターゼ標識アビジンは、上記ビオチン
と選択的に結合するため、結果的に第２抗体に結合した
ペルオキシダーゼの近傍に所定量のアルカリフォスファ
ターゼが存在することとなり、増感が可能となる。
ては、アルカリフォスファターゼ標識アビジン（ストレ
プトアビジンを包含する趣旨で用いる）を上記ビオチニ
ルチラミド反応の生成物と更に反応させている。このア
ルカリフォスファターゼ標識アビジンは、上記ビオチン
と選択的に結合するため、結果的に第２抗体に結合した
ペルオキシダーゼの近傍に所定量のアルカリフォスファ
ターゼが存在することとなり、増感が可能となる。
【００１８】（基質）本発明において利用可能な基質
は、アルカリフォスファターゼ活性の定量が可能である
限り、特に制限されないが、感度を向上させる点から
は、発光反応を利用することが好ましい。発光反応を利
用して酵素活性を測定する場合、基質としては、ジオキ
セタン誘導体を用いることが好ましい。上記ジオキセタ
ン誘導体としては、下記一般式（化１）に示すものが好
ましく用いられる。
は、アルカリフォスファターゼ活性の定量が可能である
限り、特に制限されないが、感度を向上させる点から
は、発光反応を利用することが好ましい。発光反応を利
用して酵素活性を測定する場合、基質としては、ジオキ
セタン誘導体を用いることが好ましい。上記ジオキセタ
ン誘導体としては、下記一般式（化１）に示すものが好
ましく用いられる。
【００１９】
【化１】
【００２０】（式中、Ａｄはスピロ結合を通してジオキ
セタンへ結合しているアダマンチリデン基を示し、Ｒは
低級アルキル基を示し、Ａｒは芳香族基を示す）。
セタンへ結合しているアダマンチリデン基を示し、Ｒは
低級アルキル基を示し、Ａｒは芳香族基を示す）。
【００２１】前記式（化１）に示すようなジオキセタン
誘導体は、例えばヨーロッパ特許公開公報２５４０５１
号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８８００６９５号、ないしTe
trahedron Lett.,２８，１１５５−１１５８（１９８
７）に記載の方法と同様にして製造することができる。
誘導体は、例えばヨーロッパ特許公開公報２５４０５１
号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８８００６９５号、ないしTe
trahedron Lett.,２８，１１５５−１１５８（１９８
７）に記載の方法と同様にして製造することができる。
【００２２】前記一般式（化１）中のＲとしては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキ
ル基を、Ａｒとしては、フェニレン基、ナフチル基、ア
ントラニル基等の芳香族基を例示することができる。
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキ
ル基を、Ａｒとしては、フェニレン基、ナフチル基、ア
ントラニル基等の芳香族基を例示することができる。
【００２３】尚、前記一般式（化１）で表されるジオキ
セタン誘導体の陽イオンとしてはナトリウム、カリウム
等のアルカリ金属、アンモニウム、Ｎ (Ｒ2)4 + （式
中、Ｒ2 は、メチル、エチル等のアルキル基、ベンジル
等のアラルキル基を表わす。）で表される四級アンモニ
ウムを例示することができる。
セタン誘導体の陽イオンとしてはナトリウム、カリウム
等のアルカリ金属、アンモニウム、Ｎ (Ｒ2)4 + （式
中、Ｒ2 は、メチル、エチル等のアルキル基、ベンジル
等のアラルキル基を表わす。）で表される四級アンモニ
ウムを例示することができる。
【００２４】（増感剤）本発明においては、増感剤とし
て、アルカリフォスファターゼと基質との反応に基づく
発光を増進する物質が広く使用可能であるが、特に、ポ
リアルキル４級アミン、および／又はケイ光剤が好まし
く用いられる。
て、アルカリフォスファターゼと基質との反応に基づく
発光を増進する物質が広く使用可能であるが、特に、ポ
リアルキル４級アミン、および／又はケイ光剤が好まし
く用いられる。
【００２５】ポリアルキル４級アミンとしては、例え
ば、ポリジアリールジメチルアンモニウムクロライド、
ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウ
ム、クロライド）〕（以下ＢＤＭＱと記す）等が好まし
く使用される。更に、ケイ光剤としては、例えば、フル
オレセイン誘導体、ローダミン誘導体等が好ましく使用
できる。
ば、ポリジアリールジメチルアンモニウムクロライド、
ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウ
ム、クロライド）〕（以下ＢＤＭＱと記す）等が好まし
く使用される。更に、ケイ光剤としては、例えば、フル
オレセイン誘導体、ローダミン誘導体等が好ましく使用
できる。
【００２６】（測定方法）本発明の抗原測定方法の概要
は、以下の通りである。まず固相（例えば、９６ウエル
−マイクロタイタープレート：発光用）に抗体を固定化
する。この固相化は、例えば、測定すべき抗原に対する
抗体（好ましくは濃度２〜２０μｇ／ｍＬ程度）を緩衝
液（炭酸緩衝液等）とともに、固相上に好ましくは５０
〜２００μＬ／ウエルずつ分注し、例えば４℃で一晩放
置することにより行えばよい。
は、以下の通りである。まず固相（例えば、９６ウエル
−マイクロタイタープレート：発光用）に抗体を固定化
する。この固相化は、例えば、測定すべき抗原に対する
抗体（好ましくは濃度２〜２０μｇ／ｍＬ程度）を緩衝
液（炭酸緩衝液等）とともに、固相上に好ましくは５０
〜２００μＬ／ウエルずつ分注し、例えば４℃で一晩放
置することにより行えばよい。
【００２７】次に、上記固相のブロッキングを行う。例
えばＢＳＡ（好ましくは濃度０．５〜３％程度、更には
１〜２％程度）を緩衝液（例えばリン酸緩衝液；ＰＢ
Ｓ）とともに各ウエルに５０〜２５０μＬ程度（更には
１００〜２００μＬ程度）分注し、例えば室温（２５
℃）で３０分〜３時間程度（更には１〜２時間程度）放
置して固相のブロッキングを行うことができる。
えばＢＳＡ（好ましくは濃度０．５〜３％程度、更には
１〜２％程度）を緩衝液（例えばリン酸緩衝液；ＰＢ
Ｓ）とともに各ウエルに５０〜２５０μＬ程度（更には
１００〜２００μＬ程度）分注し、例えば室温（２５
℃）で３０分〜３時間程度（更には１〜２時間程度）放
置して固相のブロッキングを行うことができる。
【００２８】必要に応じて、洗浄用緩衝液（例えば０．
０５％程度の Tween２０含有ＰＢＳ）で洗浄した後、一
次反応、すなわち固相化した抗体と、被検試料中の抗原
との反応を行なう、被検試料（血清、血漿、髄液等）
は、必要に応じて希釈用緩衝液（例えば０．５％ＢＳ
Ａ、０．０５％ Tween２０含有のＰＢＳ）で２〜２００
倍程度（更には２〜２０倍程度）に希釈して５０〜２０
０μＬ／ウエル（更には１００〜１５０μＬ／ウエル）
程度分注する。反応は、例えば３７℃で１時間〜２時間
程度行えばよい。
０５％程度の Tween２０含有ＰＢＳ）で洗浄した後、一
次反応、すなわち固相化した抗体と、被検試料中の抗原
との反応を行なう、被検試料（血清、血漿、髄液等）
は、必要に応じて希釈用緩衝液（例えば０．５％ＢＳ
Ａ、０．０５％ Tween２０含有のＰＢＳ）で２〜２００
倍程度（更には２〜２０倍程度）に希釈して５０〜２０
０μＬ／ウエル（更には１００〜１５０μＬ／ウエル）
程度分注する。反応は、例えば３７℃で１時間〜２時間
程度行えばよい。
【００２９】必要に応じて上記と同様に洗浄を行った
後、二次反応、すなわち第２抗体と抗原との反応を行
う。
後、二次反応、すなわち第２抗体と抗原との反応を行
う。
【００３０】例えば希釈用緩衝液で１０，０００〜１０
０，０００倍程度に希釈したペルオキシダーゼ標識第２
抗体を、５０〜２００μＬ／ウエル程度分注して、例え
ば室温で１〜４時間程度反応させればよい。
０，０００倍程度に希釈したペルオキシダーゼ標識第２
抗体を、５０〜２００μＬ／ウエル程度分注して、例え
ば室温で１〜４時間程度反応させればよい。
【００３１】必要に応じて上記と同様に洗浄を行った
後、ビオチニルチラミド反応を行う。例えば、ビオチニ
ルチラミドを緩衝液で１００〜５００倍程度に希釈し
て、Ｈ2 Ｏ2 存在下５０〜２００μＬ／ウエル程度分注
し、例えば室温で１５〜６０分程度反応させればよい。
後、ビオチニルチラミド反応を行う。例えば、ビオチニ
ルチラミドを緩衝液で１００〜５００倍程度に希釈し
て、Ｈ2 Ｏ2 存在下５０〜２００μＬ／ウエル程度分注
し、例えば室温で１５〜６０分程度反応させればよい。
【００３２】必要に応じて上記と同様に洗浄を行った
後、更にアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応
させる。例えばアルカリフォスファターゼ標識アビジン
を緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ Tween２０含有
Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）等）で１０，０００〜１０
０，０００倍程度に希釈して５０〜２００μＬ／ウエル
程度分注し、例えば室温で３０〜６０分程度反応させれ
ばよい。
後、更にアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応
させる。例えばアルカリフォスファターゼ標識アビジン
を緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ Tween２０含有
Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）等）で１０，０００〜１０
０，０００倍程度に希釈して５０〜２００μＬ／ウエル
程度分注し、例えば室温で３０〜６０分程度反応させれ
ばよい。
【００３３】必要に応じて洗浄を行った後、アルカリフ
ォスファターゼに反応する基質（例えばジオキセタン誘
導体たるＡＭＰＰＤ：３−（２′−スピロアダマンタ
ン）−４−メトキシ−４−（３′−フォスフォリロキ
シ）−フェニル−１，２−ジオキセタン）を、好ましく
は濃度０．１〜０．５ｍＭ程度をアルカリ条件下（例え
ば１ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有１００ｍＭジエタノールアミ
ン（ＤＥＡ）溶液ｐＨ１０．０等）に加える。本発明に
おいては、この際に、好ましくは１０〜２０倍程度に希
釈した増感剤（ＢＤＭＱ等）を共存させることが好まし
い。このような（基質＋増感剤）は、好ましくは５０〜
２００μＬ／ウエル程度分注した後、例えば室温で１０
〜８０分程度（更には２０〜６０分程度）反応させれば
よい。
ォスファターゼに反応する基質（例えばジオキセタン誘
導体たるＡＭＰＰＤ：３−（２′−スピロアダマンタ
ン）−４−メトキシ−４−（３′−フォスフォリロキ
シ）−フェニル−１，２−ジオキセタン）を、好ましく
は濃度０．１〜０．５ｍＭ程度をアルカリ条件下（例え
ば１ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有１００ｍＭジエタノールアミ
ン（ＤＥＡ）溶液ｐＨ１０．０等）に加える。本発明に
おいては、この際に、好ましくは１０〜２０倍程度に希
釈した増感剤（ＢＤＭＱ等）を共存させることが好まし
い。このような（基質＋増感剤）は、好ましくは５０〜
２００μＬ／ウエル程度分注した後、例えば室温で１０
〜８０分程度（更には２０〜６０分程度）反応させれば
よい。
【００３４】上述した反応によって発生する発光を発光
測定機（例えば、マイクロプレートルミノメーター）等
を用いて、相対発光強度（ＲＬＵ）として測定すればよ
い。
測定機（例えば、マイクロプレートルミノメーター）等
を用いて、相対発光強度（ＲＬＵ）として測定すればよ
い。
【００３５】なお、上記固相として前述したような磁性
粒子を用いた場合、抗体を固相化した磁性粒子に被検試
料と第２抗体を同時に加えることにより、抗原−固相化
抗体の反応と抗原−第２抗体の反応の中間の洗浄操作が
省略可能となり、操作の簡便化、短縮化の点で好まし
い。
粒子を用いた場合、抗体を固相化した磁性粒子に被検試
料と第２抗体を同時に加えることにより、抗原−固相化
抗体の反応と抗原−第２抗体の反応の中間の洗浄操作が
省略可能となり、操作の簡便化、短縮化の点で好まし
い。
【００３６】以下、実施例により本発明を更に具体的に
説明する。実施例１ 固相たる９６穴マイクロタイタープレート（発光用）に
０．０５Ｍ炭酸緩衝液で希釈した抗Ｓ−１００抗体（２
０μｇ／ｍＬ；シグマ社製）を１００μＬ／ウエルずつ
分注し、４℃で１晩（１５〜１８時間）放置して、抗Ｓ
−１００抗体を固相化した。
説明する。実施例１ 固相たる９６穴マイクロタイタープレート（発光用）に
０．０５Ｍ炭酸緩衝液で希釈した抗Ｓ−１００抗体（２
０μｇ／ｍＬ；シグマ社製）を１００μＬ／ウエルずつ
分注し、４℃で１晩（１５〜１８時間）放置して、抗Ｓ
−１００抗体を固相化した。
【００３７】洗浄緩衝液（０．０５％ Tween２０含有Ｐ
ＢＳ）で３回固相を洗浄した後、ＢＳＡ（アーマー社）
の２％溶液（ＰＢＳ中）を２００μＬ／ウエルずつ分注
し、室温で２時間放置して固相のブロッキングを行っ
た。次いで、洗浄緩衝液で４回固相を洗浄した。
ＢＳ）で３回固相を洗浄した後、ＢＳＡ（アーマー社）
の２％溶液（ＰＢＳ中）を２００μＬ／ウエルずつ分注
し、室温で２時間放置して固相のブロッキングを行っ
た。次いで、洗浄緩衝液で４回固相を洗浄した。
【００３８】次に、抗原として検量線作成のためのスタ
ンダード（標準サンプル）たるＳ−１００ Ｂ（シグマ
社製）を（反応用アッセイ）バッファー（１）で希釈し
て０．００２、０．０５、０．１５、０．５、１、１．
５、３、５、１０および２０ｎｇ／ｍＬの濃度となるよ
うにした（図１参照）。一方、サンプル（被検試料）
は、バッファー（２）（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ T
ween２０含有ＰＢＳ）で２倍に希釈して用いた。ここで
上記バッファー（１）とは、吸収ＣＳＦ（Ｓ−１００を
吸収により除去した脊髄液（ＣＳＦ））５０％と、上記
バッファー（２）５０％とからなるバッファーである。
ンダード（標準サンプル）たるＳ−１００ Ｂ（シグマ
社製）を（反応用アッセイ）バッファー（１）で希釈し
て０．００２、０．０５、０．１５、０．５、１、１．
５、３、５、１０および２０ｎｇ／ｍＬの濃度となるよ
うにした（図１参照）。一方、サンプル（被検試料）
は、バッファー（２）（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ T
ween２０含有ＰＢＳ）で２倍に希釈して用いた。ここで
上記バッファー（１）とは、吸収ＣＳＦ（Ｓ−１００を
吸収により除去した脊髄液（ＣＳＦ））５０％と、上記
バッファー（２）５０％とからなるバッファーである。
【００３９】上記したスタンダード（又はサンプル）
を、上記固相の１ウエルあたり１００μＬずつ３ウエル
に分注（３重測定）し、３７℃で２時間反応させた（第
１反応）。
を、上記固相の１ウエルあたり１００μＬずつ３ウエル
に分注（３重測定）し、３７℃で２時間反応させた（第
１反応）。
【００４０】洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した後、第２
抗体たる自家調製の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）標識Ｓ−１００抗体をバッファー（２）で２０，０
００倍に希釈して１００μＬ／ウエルずつ加え、室温で
１時間反応させた。次いで、洗浄緩衝液で３回固相を洗
浄した後、ビオチニルチラミド（デュポン社、ＥＬＡＳ
Ｔキット）をＨ2 Ｏ2 含有緩衝液（ＥＬＡＳＴキット付
属）で１００倍に希釈して１００μＬ／ウエルずつ加
え、室温で１５分反応させてビオチニルチラミド反応を
行った。
抗体たる自家調製の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）標識Ｓ−１００抗体をバッファー（２）で２０，０
００倍に希釈して１００μＬ／ウエルずつ加え、室温で
１時間反応させた。次いで、洗浄緩衝液で３回固相を洗
浄した後、ビオチニルチラミド（デュポン社、ＥＬＡＳ
Ｔキット）をＨ2 Ｏ2 含有緩衝液（ＥＬＡＳＴキット付
属）で１００倍に希釈して１００μＬ／ウエルずつ加
え、室温で１５分反応させてビオチニルチラミド反応を
行った。
【００４１】洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した後、アル
カリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＴＡＧ
Ｏ社製）を緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ Tween
２０含有０．５Ｍ Tris −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１
５，０００倍に希釈して１００μＬ／ウエルずつ加え、
室温で３０分反応させてアビジン−ビオチン反応を行っ
た。
カリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＴＡＧ
Ｏ社製）を緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ Tween
２０含有０．５Ｍ Tris −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１
５，０００倍に希釈して１００μＬ／ウエルずつ加え、
室温で３０分反応させてアビジン−ビオチン反応を行っ
た。
【００４２】洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した後、０．
４ｍＭのＡＭＰＰＤ溶液（１ｍＭＭｇＣｌ2 含有の１０
０ｍＭジエタノールアミン溶液（ｐＨ１０．０）中）を
１００μＬ／ウエルずつ加えて遮光下室温で２０分反応
させた。このＡＭＰＰＤ溶液には、１０倍に希釈した増
感剤（ＢＤＭＱ＋フルオレセイン・イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）：商品名Emerald 、トロピックス社製）を
共存させた。
４ｍＭのＡＭＰＰＤ溶液（１ｍＭＭｇＣｌ2 含有の１０
０ｍＭジエタノールアミン溶液（ｐＨ１０．０）中）を
１００μＬ／ウエルずつ加えて遮光下室温で２０分反応
させた。このＡＭＰＰＤ溶液には、１０倍に希釈した増
感剤（ＢＤＭＱ＋フルオレセイン・イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）：商品名Emerald 、トロピックス社製）を
共存させた。
【００４３】上記反応に基づく発光強度は、マイクロプ
レートルミノメーター（ダイナテック社製）を用いて測
定した。測定結果を図１に示す。上述したようにスタン
ダードとして牛脳由来Ｓ−１００を用いた本実施例の測
定系の検出範囲は０．０２〜５ｎｇ／ｍＬであり、検出
限界は０．０２ｎｇ／ｍＬであった。
レートルミノメーター（ダイナテック社製）を用いて測
定した。測定結果を図１に示す。上述したようにスタン
ダードとして牛脳由来Ｓ−１００を用いた本実施例の測
定系の検出範囲は０．０２〜５ｎｇ／ｍＬであり、検出
限界は０．０２ｎｇ／ｍＬであった。
【００４４】上述した本実施例の測定系により各種疾患
の髄液中のＳ−１００を測定したところ、図２に示すデ
ータが得られた。
の髄液中のＳ−１００を測定したところ、図２に示すデ
ータが得られた。
【００４５】比較例１ （比色法）固相たる９６穴マイクロタイタープレート
（比色用）にＰＢＳで希釈した抗Ｓ−１００抗体（５μ
ｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルずつ分注し、４℃で１
晩（１５〜１８時間）放置して抗Ｓ−１００抗体を固相
した。洗浄緩衝液（０．０５％ Tween２０含有ＰＢＳ）
で３回固相を洗浄した後、蒸留水で４倍に希釈したブロ
ッキング剤（ブロックエース、雪印乳業製）を２００μ
Ｌ／ウエルずつ分注し、室温で２時間放置して固相のブ
ロッキングを行った。洗浄緩衝液で４回固相を洗浄し
た。
（比色用）にＰＢＳで希釈した抗Ｓ−１００抗体（５μ
ｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルずつ分注し、４℃で１
晩（１５〜１８時間）放置して抗Ｓ−１００抗体を固相
した。洗浄緩衝液（０．０５％ Tween２０含有ＰＢＳ）
で３回固相を洗浄した後、蒸留水で４倍に希釈したブロ
ッキング剤（ブロックエース、雪印乳業製）を２００μ
Ｌ／ウエルずつ分注し、室温で２時間放置して固相のブ
ロッキングを行った。洗浄緩衝液で４回固相を洗浄し
た。
【００４６】次に、抗原として検量線作成のためのスタ
ンダード（標準サンプル）たるＳ−１００ Ｂ（シグマ
社製）を（反応用アッセイ）バッファー（１）で希釈し
て０、０．０５、０．１５、０．５、１、１．５、３、
５、１０、１５、３０、５０および１００ｎｇ／ｍＬの
濃度となるようにした（図３参照）。一方、サンプル
（被検試料）は、バッファー（２）（０．５％ＢＳＡ、
０．０５％ Tween２０含有ＰＢＳ）で２倍に希釈して用
いた。
ンダード（標準サンプル）たるＳ−１００ Ｂ（シグマ
社製）を（反応用アッセイ）バッファー（１）で希釈し
て０、０．０５、０．１５、０．５、１、１．５、３、
５、１０、１５、３０、５０および１００ｎｇ／ｍＬの
濃度となるようにした（図３参照）。一方、サンプル
（被検試料）は、バッファー（２）（０．５％ＢＳＡ、
０．０５％ Tween２０含有ＰＢＳ）で２倍に希釈して用
いた。
【００４７】上記したスタンダード（又はサンプル）
を、上記固相の１ウエルあたり１００μＬずつ３ウエル
に分注（３重測定）し、室温で２時間反応させた（第１
反応）。
を、上記固相の１ウエルあたり１００μＬずつ３ウエル
に分注（３重測定）し、室温で２時間反応させた（第１
反応）。
【００４８】洗浄緩衝液で３回洗浄した後、第２抗体た
る自家調製の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識Ｓ−１００抗体を希釈用緩衝液で２０，０００倍に希
釈して１００μＬ／ウエルずつ加え、室温で１時間反応
させた。
る自家調製の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識Ｓ−１００抗体を希釈用緩衝液で２０，０００倍に希
釈して１００μＬ／ウエルずつ加え、室温で１時間反応
させた。
【００４９】次いで、洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した
後、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ、シグマ社）の
基質溶液を（３ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルずつ
加え、室温で遮光下２０分間反応させて、上記ＯＰＤを
発色させた。この発色反応を２Ｎ−Ｈ2 ＳＯ4 を１００
μＬ／ウエルずつ加えて停止させた後、吸光度（ＯＤ）
をイムノリーダー（ダイナテック社製）を用いて波長４
９０ｎｍで測定した。得られたデータを図３に示す。こ
の図３から明らかなように、比色法を用いた場合のＳ−
１００の検出限界は０．２ｎｇ／ｍＬであった。
後、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ、シグマ社）の
基質溶液を（３ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルずつ
加え、室温で遮光下２０分間反応させて、上記ＯＰＤを
発色させた。この発色反応を２Ｎ−Ｈ2 ＳＯ4 を１００
μＬ／ウエルずつ加えて停止させた後、吸光度（ＯＤ）
をイムノリーダー（ダイナテック社製）を用いて波長４
９０ｎｍで測定した。得られたデータを図３に示す。こ
の図３から明らかなように、比色法を用いた場合のＳ−
１００の検出限界は０．２ｎｇ／ｍＬであった。
【００５０】実施例２ （希釈試験）反応用のアッセイバッファー（バッファー
（１））で実施例１で用いたＳ−１００抗原を希釈して
異なる３濃度（１．０、１．３および２．３ｎｇ／ｍ
Ｌ）を調製し、更にこれらの溶液を反応用のアッセイバ
ッファーで１／２倍、１／４倍、１／８倍、１／１６倍
の濃度となるように倍々希釈を重ね、これをサンプルと
した以外は、実施例１と同様に測定を行い、実施例１で
得られた検量線からＳ−１００濃度（ｎｇ／ｍＬ）を求
めた。結果を図４に示す。
（１））で実施例１で用いたＳ−１００抗原を希釈して
異なる３濃度（１．０、１．３および２．３ｎｇ／ｍ
Ｌ）を調製し、更にこれらの溶液を反応用のアッセイバ
ッファーで１／２倍、１／４倍、１／８倍、１／１６倍
の濃度となるように倍々希釈を重ね、これをサンプルと
した以外は、実施例１と同様に測定を行い、実施例１で
得られた検量線からＳ−１００濃度（ｎｇ／ｍＬ）を求
めた。結果を図４に示す。
【００５１】図４から明らかなように本実施例の希釈試
験においては、それぞれ原点付近を通る直線が得られ
た。
験においては、それぞれ原点付近を通る直線が得られ
た。
【００５２】実施例３ （添加回収試験）反応用のアッセイバッファー（バッフ
ァー（１））でＳ−１００Ｂ抗原（標準品、シグマ社
製）を希釈して異なる４濃度（０．１、０．２、０．５
および１．０ｎｇ／ｍＬ）のサンプル（サンプルＡ）を
調製した。次いで、このサンプルＡの調製と同様にして
異なる４濃度のサンプル（サンプルＢ）を調製した。濃
度測定用のサンプルとして、上記したサンプルＡ４種類
およびサンプルＢ４種類の組合せで合計１６種類の等量
混和液を調製した。
ァー（１））でＳ−１００Ｂ抗原（標準品、シグマ社
製）を希釈して異なる４濃度（０．１、０．２、０．５
および１．０ｎｇ／ｍＬ）のサンプル（サンプルＡ）を
調製した。次いで、このサンプルＡの調製と同様にして
異なる４濃度のサンプル（サンプルＢ）を調製した。濃
度測定用のサンプルとして、上記したサンプルＡ４種類
およびサンプルＢ４種類の組合せで合計１６種類の等量
混和液を調製した。
【００５３】上記した濃度測定用の１６サンプルを用い
た以外は、実施例１と同様に測定を行い、実施例１で得
られた検量線からＳ−１００濃度（ｎｇ／ｍＬ）を求め
た。結果を図５に示す。
た以外は、実施例１と同様に測定を行い、実施例１で得
られた検量線からＳ−１００濃度（ｎｇ／ｍＬ）を求め
た。結果を図５に示す。
【００５４】図５から明らかなように本実施例の添加回
収試験においては、各ポイントの測定値と理論値との比
である回収率として、１０３．０〜１０７．２％の良好
な結果が得られた。
収試験においては、各ポイントの測定値と理論値との比
である回収率として、１０３．０〜１０７．２％の良好
な結果が得られた。
【００５５】実施例４ （磁性粒子を用いるＥＩＡ）ポリプロピレンチューブに
最終濃度１％となるように磁性粒子（フェリスフィア１
００Ａ、日本ペイント社製）を加え、蒸留水で洗浄し
た。次いで最終濃度０．５％となるように蒸留水中でカ
ルボジイミド誘導体ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロ
ライド）を加え室温で５分間振とうした後、蒸留水で３
回洗浄した。
最終濃度１％となるように磁性粒子（フェリスフィア１
００Ａ、日本ペイント社製）を加え、蒸留水で洗浄し
た。次いで最終濃度０．５％となるように蒸留水中でカ
ルボジイミド誘導体ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロ
ライド）を加え室温で５分間振とうした後、蒸留水で３
回洗浄した。
【００５６】最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌの抗Ｓ−１００
抗体および最終濃度０．５％のＥＤＣ（蒸留水中）を上
記磁性粒子に加え、４℃で１晩振とうした後、上清を除
去した。次いで２％ＢＳＡ（蒸留水中）を加え、室温で
２時間振とうした後、上清を除去した。０．１％ＢＳ
Ａ、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3および１０ｍ
Ｍ
抗体および最終濃度０．５％のＥＤＣ（蒸留水中）を上
記磁性粒子に加え、４℃で１晩振とうした後、上清を除
去した。次いで２％ＢＳＡ（蒸留水中）を加え、室温で
２時間振とうした後、上清を除去した。０．１％ＢＳ
Ａ、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3および１０ｍ
Ｍ
【００５７】ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭ Tris −ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、同じ緩衝液で１
％けんだく液となるように分散させて固相化抗体とした
（この固相化抗体は、４℃で保存可能であった）。
ｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、同じ緩衝液で１
％けんだく液となるように分散させて固相化抗体とした
（この固相化抗体は、４℃で保存可能であった）。
【００５８】アッセイプレート（ＧＵＰＰ Durapore、
ミリポア社）に２％（比色法には０．５％）ブロッキン
グ剤（ブロックエース、雪印乳業製）を２００μＬ／ウ
エルずつ注入し、室温で１時間撹はんして上記プレート
のブロッキングを行った。
ミリポア社）に２％（比色法には０．５％）ブロッキン
グ剤（ブロックエース、雪印乳業製）を２００μＬ／ウ
エルずつ注入し、室温で１時間撹はんして上記プレート
のブロッキングを行った。
【００５９】洗浄緩衝液（０．９％ＮａＣｌ、含有５０
ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））または蒸留水で３
回プレートを洗浄した後、各種濃度のスタンダード（図
６参照）を含む試料（０．５％ＢＳＡ、０．００５％ T
ween２０含有５０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ８．０中）を１０
０μＬ／ウエル分注し、次いで最終濃度で２０，０００
倍希釈としたＨＲＰ標識抗Ｓ−１００抗体（第２抗
体）、および最終濃度で２５０倍希釈とした抗体固定化
磁性粒子（上記で得たもの）の混合液を１００μＬ／ウ
エルずつ加え、合計２００μＬ／ウエルの液を室温で１
時間撹はんして固相化抗体−抗原および抗原−第２抗体
の反応を行った。
ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））または蒸留水で３
回プレートを洗浄した後、各種濃度のスタンダード（図
６参照）を含む試料（０．５％ＢＳＡ、０．００５％ T
ween２０含有５０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ８．０中）を１０
０μＬ／ウエル分注し、次いで最終濃度で２０，０００
倍希釈としたＨＲＰ標識抗Ｓ−１００抗体（第２抗
体）、および最終濃度で２５０倍希釈とした抗体固定化
磁性粒子（上記で得たもの）の混合液を１００μＬ／ウ
エルずつ加え、合計２００μＬ／ウエルの液を室温で１
時間撹はんして固相化抗体−抗原および抗原−第２抗体
の反応を行った。
【００６０】洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した後、ビオ
チニル・チラミド（ＥＬＡＳＴキット・デュポン社）を
該キット中の緩衝液（Ｈ2Ｏ2含有）で１００倍に希釈し
て１００μＬ／ウエルずつ分注し、室温で３０分撹はん
してビオチニルチラミド反応を行った。
チニル・チラミド（ＥＬＡＳＴキット・デュポン社）を
該キット中の緩衝液（Ｈ2Ｏ2含有）で１００倍に希釈し
て１００μＬ／ウエルずつ分注し、室温で３０分撹はん
してビオチニルチラミド反応を行った。
【００６１】洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した後、アッ
セイバッファー（０．９％ＮａＣｌ、含有５０ｍＭ Tr
is−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で１５，０００倍に希釈し
たアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを
１００μＬ／ウエルずつ分注し、室温で３０分撹はんし
てアビジン−ビオチン反応を行った。
セイバッファー（０．９％ＮａＣｌ、含有５０ｍＭ Tr
is−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で１５，０００倍に希釈し
たアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを
１００μＬ／ウエルずつ分注し、室温で３０分撹はんし
てアビジン−ビオチン反応を行った。
【００６２】洗浄緩衝液で３回固相を洗浄した後、０．
４ｍＭのＡＭＰＰＤ溶液（１ｍＭＭｇＣｌ2 含有の１０
０ｍＭジエタノールアミン溶液（ｐＨ１０．０）中）を
１００μＬ／ウエルずつ加えて室温で２０分反応させ
た。このＡＭＰＰＤ溶液には、１０倍に希釈した増感剤
（ＢＤＭＱ＋フルオレセイン・イソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）；商品名Emerald 、トロピクス社製) を共存さ
せた。
４ｍＭのＡＭＰＰＤ溶液（１ｍＭＭｇＣｌ2 含有の１０
０ｍＭジエタノールアミン溶液（ｐＨ１０．０）中）を
１００μＬ／ウエルずつ加えて室温で２０分反応させ
た。このＡＭＰＰＤ溶液には、１０倍に希釈した増感剤
（ＢＤＭＱ＋フルオレセイン・イソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）；商品名Emerald 、トロピクス社製) を共存さ
せた。
【００６３】バキュームマニホールド（ミリポア社製）
を用いて、上記反応液を測定用（発光用）プレートに移
した。上記反応に基づく発光強度は、マイクロプレート
ルミノメーター（ダイナテック社製）を用いて測定し
た。
を用いて、上記反応液を測定用（発光用）プレートに移
した。上記反応に基づく発光強度は、マイクロプレート
ルミノメーター（ダイナテック社製）を用いて測定し
た。
【００６４】測定結果を図６に示す。上述したようにス
タンダードとして牛脳由来Ｓ−１００を用いた本実施例
の測定系の検出範囲は０．０６〜１００ｎｇ／ｍＬであ
り、検出限界は０．０６ｎｇ／ｍＬであった。
タンダードとして牛脳由来Ｓ−１００を用いた本実施例
の測定系の検出範囲は０．０６〜１００ｎｇ／ｍＬであ
り、検出限界は０．０６ｎｇ／ｍＬであった。
【００６５】比較例２ （比色法）第２抗体たるＨＲＰ標識抗Ｓ−１００抗体を
１０，０００倍の希釈とし、固相化抗体−抗原および抗
原−第２抗体の反応時間を３０分とした以外は実施例４
と同様に第２抗体の反応までを行った。
１０，０００倍の希釈とし、固相化抗体−抗原および抗
原−第２抗体の反応時間を３０分とした以外は実施例４
と同様に第２抗体の反応までを行った。
【００６６】次いで、洗浄用緩衝液で４回固相を洗浄し
た後、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）の基質溶液
を（０．６ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルずつ加
え、室温で１５分間撹はんして反応させて、上記ＯＰＤ
を発色させた。この発色反応を４Ｎ−Ｈ2 ＳＯ4 を１０
０μＬ／ウエルずつ加えて停止させた後、反応液をバキ
ュームマニホールドで測定用プレート（比色用）に移
し、吸光度（ＯＤ）を波長４９０ｎｍで測定した。得ら
れたデータを図６に示す。
た後、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）の基質溶液
を（０．６ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルずつ加
え、室温で１５分間撹はんして反応させて、上記ＯＰＤ
を発色させた。この発色反応を４Ｎ−Ｈ2 ＳＯ4 を１０
０μＬ／ウエルずつ加えて停止させた後、反応液をバキ
ュームマニホールドで測定用プレート（比色用）に移
し、吸光度（ＯＤ）を波長４９０ｎｍで測定した。得ら
れたデータを図６に示す。
【００６７】
【発明の効果】上述したように本発明によれば、ビオチ
ニルチラミド反応に基づく増感反応とアルカリフォスフ
ァターゼを用いる活性測定法とを組合せることにより、
ＥＩＡによる抗原の高感度測定が可能となる。
ニルチラミド反応に基づく増感反応とアルカリフォスフ
ァターゼを用いる活性測定法とを組合せることにより、
ＥＩＡによる抗原の高感度測定が可能となる。
【図１】本発明の測定法によるＳ−１００蛋白質の検量
線を示すグラフである。
線を示すグラフである。
【図２】本発明の測定法により各種疾患の患者由来の髄
液中のＳ−１００濃度を測定した結果を示すプロットで
ある。
液中のＳ−１００濃度を測定した結果を示すプロットで
ある。
【図３】従来の比色によるＳ−１００測定の検量線を示
すグラフである。
すグラフである。
【図４】本発明の測定系における希釈試験の結果を示す
グラフである。
グラフである。
【図５】本発明の測定系における添加回収試験の結果を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図６】磁性粒子を用いた場合の本発明の測定法におけ
る検量線および比色法における検量線を示すグラフであ
る。
る検量線および比色法における検量線を示すグラフであ
る。
フロントページの続き (72)発明者 久保田 隆廣 東京都八王子市小宮町51 エスアールエル 八王子ラボラトリー内
Claims (5)
- 【請求項１】 測定すべき抗原に対する抗体を固相化し
該固相のブロッキングを行った後、測定すべき抗原を含
む被検試料を反応させ、測定すべき抗原に対するペルオ
キシダーゼ標識第２抗体を反応させた後、過酸化水素の
存在下にビオチニルチラミドを反応させ、更にアルカリ
フォスファターゼ標識アビジンを反応させて、該アルカ
リフォスファターゼの活性を測定することを特徴とする
抗原の測定方法。 - 【請求項２】 測定すべき抗原に対する抗体を磁性粒子
からなる固相に固相化し該固相のブロッキングを行った
後、測定すべき抗原を含む被検試料および測定すべき抗
原に対するペルオキシダーゼ標識第２抗体を反応させ、
過酸化水素の存在下にビオチニルチラミドを反応させ、
更にアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応させ
て、該アルカリフォスファターゼの活性を測定すること
を特徴とする抗原の測定方法。 - 【請求項３】 増感剤の存在下に前記アルカリフォスフ
ァターゼの活性を測定する請求項１又は２に記載の抗原
の測定方法。 - 【請求項４】 前記アルカリフォスファターゼの活性を
ジオキセタン誘導体を基質として用いて測定する請求項
１ないし３のいずれかに記載の抗原の測定方法。 - 【請求項５】 前記増感剤がポリアルキル４級アミンか
らなる請求項３に記載の抗原の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28350092A JPH06109734A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 抗原の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28350092A JPH06109734A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 抗原の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06109734A true JPH06109734A (ja) | 1994-04-22 |
Family
ID=17666354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28350092A Pending JPH06109734A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 抗原の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06109734A (ja) |
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- 1992-09-30 JP JP28350092A patent/JPH06109734A/ja active Pending
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