CN113419059B - 用于化学发光免疫分析方法的封闭剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于化学发光免疫分析方法的封闭剂,属于免疫检测技术领域。本发明公开了封闭化学发光物质的封闭剂,其由Lys与Tris、Gly、Arg中的一种或多种物质组成。与现有的封闭剂相比,本发明的封闭剂可以有效避免封闭不完全的问题,降低非特异性干扰,提高检测试剂的灵敏度和特异性。本发明还公开了包括前述封闭剂的封闭液,以及化学发光物质封闭液与固相载体封闭液的组合物,二者组合使用的封闭效果更佳。本发明公开的封闭剂以及封闭液可以用于制备高特异性的化学发光免疫分析试剂,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域,具体涉及用于化学发光免疫分析方法的封闭剂。
背景技术
免疫检测技术是根据抗体与抗原反应的原理,定量定性分析待测物的一种检测方法。由于免疫检测技术具有简便、灵敏度高及特异性强等优点,最近几年已在现代生命科学、食品科学、临床医学以及生态学等领域广泛应用。目前应用较广泛的免疫检测技术主要包括:免疫荧光技术,免疫层析技术,酶联免疫吸附试验,免疫传感器,分子印迹技术等。这些免疫检测技术存在多方面优点,但在检测准确度和灵敏度方面仍然有待进一步提高。
化学发光免疫分析方法(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将高灵敏的化学发光检测与高特异性的免疫反应相结合,用于检测各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物的分析技术,是继放射免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。化学发光免疫分析主要具有以下特点:(1)高度敏感,极限达10-17~10-19mol/L,远高于放射性免疫分析和酶联免疫分析;(2)特异性强,重复性好;(3)测试范围宽,可达7个数量级;(4)试剂制备成本低,比时间分辨荧光免疫分析试剂便宜;(5)试剂稳定性好。
磁微粒化学发光免疫分析方法是一种以磁微粒为固相载体的化学发光免疫分析技术,它充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性、化学发光技术的高灵敏度,以及免疫分析技术的特异性,在生物分析领域展现了不可替代的作用。在磁微粒化学发光免疫分析方法中,常用的化学发光物质包括酶类标记物(例如辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶(ALP)),直接发光物:吖啶酯类化合物、钌等。其中,吖啶酯类化合物的发光过程只需要在碱性条件下,经过氧化氢氧化就可以直接发光,不需要其它发光催化剂;它的化学发光为闪光型,在加入启动剂0.4s后发射光强度就达到最大,半衰期为0.9s,2s内发光基本结束,可以实现快速检测。链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质,它能与生物素或其衍生物发生特异性结合,它们之间的结合力是目前已知的最强的非共价键结合力。链霉亲和素以同源四聚体的形式存在,每摩尔的四聚体分子可结合四摩尔的生物素分子,所以在免疫检测领域具有信号放大作用。由于这一特性,链霉亲和素磁珠成为了磁微粒化学发光免疫分析方法中最常用的固相载体之一。
研究发现,免疫检测技术中存在的干扰会影响试剂检测的特异性、准确性、灵敏度。引起免疫检测干扰的原因主要包括试剂组分(例如固相载体、化学发光物质等)引起的干扰,待测样本成分引起的干扰和检测方法导致的干扰等。在磁微粒化学发光免疫分析方法中,试剂组分引起的干扰主要是链霉亲和素包被的固相载体与待检测样品中的某些蛋白或疏水分析物之间产生非特异性相结合,或者化学发光标记物与待检测样品中的某些成分产生非特异性结合引起的,这些干扰容易导致试剂本底高、非特异性结合、变异系数(CV)高、信噪比低、假阳性、假阴性等不良后果。因此,为了提高检测方法的准确度、灵敏度和特异性,需要利用封闭剂对与特定的免疫分析物抗体/抗原结合后的链霉亲和素包被的固相载体上的未结合位点进行封闭,或者在化学发光标记物对特定的免疫分析物抗体/抗原进行标记后对化学发光标记物上的未结合位点进行封闭。
申请号为CN201510240537.X的中国专利申请公开了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法,该方法主要包括以下步骤:(1)以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体,将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面;(2)用封闭液封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点;(3)用吖啶酯对HE4标记抗体进行标记;(4)将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合吖啶酯标记的HE4抗体加入封闭后的包被有HE4抗体的金磁微粒中进行反应,形成双抗体夹心复合物;(5)清洗;(6)化学发光检测。该方法在用吖啶酯对HE4标记抗体进行标记后,使用赖氨酸盐溶液进行封闭,在一定程度上减少了非特异性反应的产生。但是,使用赖氨酸盐溶液作为封闭液的封闭效果有限,仍然存在因未完全封闭而导致的非特异性干扰。
因此,需要开发出一种封闭效果更好优的封闭剂,提高化学发光免疫分析方法的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在化学发光免疫分析过程中有效避免非特异性干扰,提高检测试剂灵敏度和特异性的封闭剂和封闭方法。
本发明提供了一种在化学发光免疫分析方法中用于封闭化学发光物质的封闭剂,所述封闭剂由如下2种组分组成:组分1:Lys;组分2:Tris、Gly、Arg中的一种或多种。
进一步地,所述封闭剂由组分1:Lys和组分2:Tris组成。
进一步地,所述组分1和组分2的质量比为1:(0.1~10)。
进一步地,所述组分1和组分2的质量比可以为1:0.1,1:0.5,1:0.8,1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9或1:10。
进一步地,所述组分1和组分2的质量比为1:10。。
进一步地,所述化学发光物质为吖啶类化合物,优选为吖啶酯。
本发明封闭剂可以用于封闭化学发光免疫分析方法中任意连接了发光物质的试剂,进而提高化学发光免疫分析方法的特异性和灵敏度。
本发明还提供了一种在化学发光免疫分析方法中用于封闭化学发光物质的封闭液,所述封闭液包含上述的封闭剂和溶剂。
进一步地,所述封闭液还包含缓冲液、糖类物质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。
进一步地,所述封闭液中,组分1的浓度为10~100g/L,组分2的浓度为10~100g/L,缓冲液的浓度为10~140mmol/L,糖类物质的浓度为10~50g/L,稳定剂的浓度为5~15g/L,表面活性剂的浓度为0.05~2.0mL/L,防腐剂的浓度为0.4~1.2g/L;优选地,组分1的浓度为10g/L,组分2的浓度为100g/L。
进一步地,所述封闭液中,缓冲液的浓度为75mmol/L,糖类物质的浓度为30g/L,稳定剂的浓度为10g/L,表面活性剂的浓度为1.0mL/L,防腐剂的浓度为0.8g/L。
进一步地,所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或多种;
或,所述糖类物质为葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、海藻糖、果糖、蔗糖中的一种或多种;
或,所述稳定剂为甘露醇、丙三醇中的一种或多种;
或,所述表面活性剂为Tween系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、EMULGEN系列表面活性剂、月桂酸聚乙二醇甘油酯、阴离子烷基多苷、十二烷基二甲基甜菜碱、3ARAMT1、SHO62C和AM PHITOL中的一种或多种;
或,所述防腐剂为叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、PC300、PC950种的一种或多种。
本发明还提供了一种用于化学发光免疫分析的封闭液组合物,所述封闭液组合物包含以下两种封闭液:
封闭液I:上述的封闭液;
封闭液II:用于封闭连接有链霉亲和素的固相载体的封闭液。
进一步地,封闭液II中含有封闭剂,所述封闭剂由大分子类封闭物质和小分子类封闭物质组成,其中,大分子类封闭物质为生物素化BSA、生物素化酪蛋白或生物素化多聚PEG,小分子类封闭物质为生物素酯或维生素H。
进一步地,封闭液II中,所述大分子类封闭物质为生物素化多聚PEG,小分子类封闭物质为维生素H;所述生物素化多聚PEG与维生素H的质量比为1:(0.1~10)。
进一步地,所述生物素化多聚PEG与维生素H的质量比可以为1:0.1,1:0.5,1:0.8,1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9或1:10。
进一步地,所述生物素化多聚PEG与维生素H的质量比为1:10。
进一步地,封闭液II中包含溶剂,还包含缓冲液、糖类物质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。
进一步地,封闭液II中,生物素化多聚PEG的浓度为1~10g/L,维生素H的浓度为1~10g/L,缓冲液的浓度为10~140mmol/L,糖类物质的浓度为10~50g/L,稳定剂的浓度为5~15g/L,表面活性剂的浓度为0.05~2.0mL/L,防腐剂的浓度为0.4~1.2g/L;优选地,封闭液II中,生物素化多聚PEG的浓度为1g/L,维生素H的浓度为10g/L。
进一步地,封闭液II中,缓冲液的浓度为75mmol/L,糖类物质的浓度为30g/L,稳定剂的浓度为10g/L,表面活性剂的浓度为1.0mL/L,防腐剂的浓度为0.8g/L。
进一步地,封闭液II中,所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或多种;所述糖类物质为葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、海藻糖、果糖、蔗糖中多的一种或多种;
或,所述稳定剂为甘露醇、丙三醇中的一种或多种;
或,所述表面活性剂为Tween系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、EMULGEN系列表面活性剂、月桂酸聚乙二醇甘油酯、阴离子烷基多苷、十二烷基二甲基甜菜碱、3ARAMT1、SHO62C和AM PHITOL中的一种或多种;
或,所述防腐剂为叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、PC300、PC950种的一种或多种。
进一步地,所述的固相载体为磁珠。
本发明还提供了上述封闭剂、上述封闭液或上述封闭液组合物在制备化学发光免疫分析用检测试剂中的用途。
采用本发明封闭剂、封闭液或者封闭液组合物对待封闭物质进行封闭,可以有效降低未能完全封闭导致的非特异性干扰,制备高灵敏度、特异性地检测试剂,是一种高效的封闭方法。
基于此,本发明还提供了一种用于化学发光免疫分析方法的检测试剂,所述检测试剂是采用上述封闭剂、上述封闭液封闭处理后得到的连接有化学发光物质的抗体或者抗原。
进一步地,所述化学发光物质为吖啶类化合物,优选为吖啶酯;和/或,所述化学发光物质上还连接有组分1和/或组分2中的物质。
本发明还提供了上述检测试剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)将化学发光物质与抗体或者抗原混合,反应;
(2)步骤(1)反应完成后,加入所述封闭剂或封闭液,反应,反应完成后即得。
本发明还提供了用于化学发光免疫分析方法的检测试剂盒,所述检测试剂盒包括如下两种试剂:
试剂1:上述检测试剂;
试剂2:上述的封闭液II封闭的连接有链霉亲和素的固相载体。
本发明还提供了制备上述检测试剂盒的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(a)按照上述方法制备得到试剂1;
(b)制备试剂2,制备法包括以下步骤:(i)将连接有链霉亲和素的固相载体与抗体或者抗原混合,反应;(ii)步骤(i)反应完成后,加入所述封闭液II,反应,反应完成后得到试剂2。
本发明的检测试剂盒可以不仅包含上述试剂1和/或试剂2,本领域技术人员可以根据需要,将前述涉及的试剂与其他常用试剂,比如缓冲液,任意组合制备成为试剂盒售卖并使用。
采用前述试剂盒,可以配合检测仪器进行检测,检测步骤如下:
1、取待测样本;
2、在待测样本中加入试剂1和试剂2,混合,充分反应;
3、将反应后的体系在化学发光免疫检测仪上测试发光信号值,发光信号值与样本中的抗体或抗原的含量呈正比关系。
关于本发明的使用术语的定义:除非另有说明,本文中术语提供的初始定义适用于整篇说明书的术语;对于本文没有具体定义的术语,应该根据公开内容和上下文,给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
本发明中,封闭剂是指能够与待封闭物质发生非特异性反应,以避免待封闭物质与抗体或抗原发生非特异性反应的一种物质;
固相载体,是指在免疫检测技术中用于结合抗体或抗原的固态载体,它可以将抗体或抗原牢固地固定在其表面,经长期保存和多次洗涤也不易脱落,它不会影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性,比如磁珠;
磁珠,是指具有细小粒径的超顺磁微球,它是化学发光免疫分析方法中常用的一种固相载体;
链霉亲和素磁珠,是指由超顺磁性微球与高纯度链霉亲和素共价结合而成的物质;
生物素酯是指NHS-LC-Biotin;
Lys是指赖氨酸;
Tris是指三羟甲基氨基甲烷;
Gly是指甘氨酸;
Arg是指精氨酸;
维生素H,又称生物素。
“吖啶类化合物”包括吖啶酯及其衍生物、吖啶磺酰胺化学发光物质和光泽精,其适用于化学发光免疫分析系统。在碱性H2O2溶液中,分子受到过氧化氢离子进攻时,生成不稳定的二氧乙烷,此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮,当其回到基态时发出光子。
吖啶酯及其衍生物在化学发光免疫分析领域中是众所周知的,例如中国专利201510090045.7中记载了用于化学发光免疫分析的吖啶酯衍生物(式I)及其制备方法;Law等(Novelpoly-substitutedaryl acridiniumestersandtheirusei nimmunoassay,JBiolumin Chemilumin.1989Jul;4(1):88-98)合成了一系列可用于免疫分析的吖啶酯类似物。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:与传统封闭剂相比,本发明的封闭剂,采用赖氨酸与Tris、Gly、Arg中的一种或多种物质的组合形成的特别组合物,可以有效避免化学发光物质标记后由于分子间空间位阻导致的封闭不完全的问题,降低非特异性干扰,有效降低试剂本底,提高试剂抗非特异性吸附的能力,从而提高试剂的灵敏度和特异性。
实验结果表明,在吖啶酯标记完成后,形成标记物,按照标记物与封闭液体积比为10:1的比例加入10g/L Lys+100g/L Tris组封闭液1封闭,可降低制得的检测试剂本底,提高检测试剂的灵敏度和特异性;在磁珠与抗原/抗体连接完成后,按照10ug维生素H每mg磁珠+1ug生物素化多聚PEG每mg磁珠的比例用封闭液2封闭反应,也可降低制得的检测试剂本底,提高检测试剂的灵敏度和特异性;将前述两种封闭液搭配使用时封闭效果最佳。
本发明提供的封闭液能够有效降低检测试剂本底、提高试剂灵敏度和特异性,在化学发光免疫分析中具有良好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
其中,Lys为赖氨酸,Tris为三羟甲基氨基甲烷,Gly为甘氨酸,Arg为精氨酸;生物素酯为NHS-LC-Biotin。
生物素化多聚PEG可购自四川安可瑞新材料技术有限公司,是连接了多个PEG的生物素酯;生物素化BSA(即生物素化牛血清白蛋白)可购自四川安可瑞新材料技术有限公司。
实施例1:本发明用于吖啶酯标记过程中的封闭液1的制备
本发明用于吖啶酯标记过程中的封闭液1由表1中的原料混合而成,各原料的浓度如表1所示:
表1用于吖啶酯标记过程中的封闭液1的组成成分
实施例2:本发明用于磁微粒包被过程中的封闭液2的制备
表2用于磁微粒包被过程中的封闭液2的组成成分
实施例3:本发明用于化学发光免疫分析方法的检测试剂的制备
本发明用于化学发光免疫分析方法的检测试剂的制备方法如下:
1、按照实施例1的方法制备封闭液1;
2、将吖啶酯与抗原/抗体(比如,重组人类免疫缺陷病毒-1抗原)混合,使其充分反应,反应完成后得到吖啶酯标记的抗原/抗体,即标记物;
3、步骤2反应完成后,按照标记物与封闭液体积比10:1加入封闭液1,充分反应,反应完成后得到封闭液封闭的连接有吖啶酯的抗原/抗体;
4、按照试剂盒配置标准规程配置成成品检测试剂。
实施例4:本发明用于化学发光免疫分析方法的检测试剂盒的制备
本发明用于化学发光免疫分析方法的检测试剂盒的制备方法如下:
1、制备封闭液封闭的连接有吖啶酯的抗原/抗体:
1.1按照实施例1的方法制备封闭液1;
1.2将吖啶酯与抗原/抗体(比如,重组人类免疫缺陷病毒-1抗原)混合,使其充分反应,反应完成后得到吖啶酯标记的抗原/抗体,即标记物;
1.3步骤1.2反应完成后,按照标记物与封闭液体积比10:1加入封闭液1,充分反应,反应完成后得到封闭液封闭的连接有吖啶酯的抗原/抗体;
2、制备封闭液封闭的连接有链霉亲和素磁珠的抗原/抗体:
2.1按照实施例2的方法制备封闭液2;
2.2将链霉亲和素磁珠与抗原/抗体(比如,重组人类免疫缺陷病毒-1抗原)混合,使其充分反应,反应完成后得到连接有链霉亲和素磁珠的抗原/抗体;
2.3步骤2.2反应完成后,按照10ug维生素H每mg磁珠+1ug生物素化多聚PEG每mg磁珠的比例加入封闭液2,充分反应,得到封闭液封闭的连接有链霉亲和素磁珠的抗原/抗体;
3、按照试剂盒配置标准规程配置成成品检测试剂盒。
实施例5:利用本发明的检测试剂进行磁微粒化学发光免疫分析的方法
1、取待测样本;
2、在待测样本中加本发明实施例3或实施例4所得检测试剂,混合,充分反应;
3、将反应后的体系在全自动化学发光免疫检测仪I3000(迈克生物股份有限公司)上测试发光信号值,发光信号值与样本中的抗体或抗原的含量呈正比关系。
以下通过试验例证明本发明的有益效果。
试验例1:用于吖啶酯标记过程中的封闭液的筛选实验
用人类免疫缺陷病毒抗原抗体检测试剂盒(直接化学发光法)作为测试该封闭方法的试剂,人类免疫缺陷病毒抗原抗体检测试剂盒中含以下组分:组分1:包被了重组人类免疫缺陷病毒-1抗原的链霉亲和素磁珠;组分2:20mmol/L缓冲液;组分3:标记了吖啶酯的重组人类免疫缺陷病毒-1抗原。
在完成吖啶酯与抗原/抗体的连接后得到标记物,按照标记物与封闭液体积比10:1加入下述不同组成的各封闭液进行封闭;在完成磁微粒(连接有链霉亲和素)与抗原/抗体的连接后,加入酪氨酸进行封闭。进行内部控制品(阳性)和随机样本(本底)、假阳样本(特异性)发光信号值(RLU)测定,发光信号值与样本中的抗体含量呈正比关系,以此对比不同封闭液的封闭效果。其中,内部控制品1为阴性、内部控制品2为阳性,由缓冲液配制;随机样本是阴性的血清样本;假阳样本是有干扰物的血清样本。
检测装置:全自动化学发光免疫检测仪I3000(迈克生物股份有限公司)。
1、用于吖啶酯标记过程的封闭液的组成的筛选实验
(1)封闭液选择
在完成吖啶酯与抗原/抗体的连接后加入的各封闭液中除了包含与表1相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含表3所示不同的大分子和/或小分子;其中,对照组封闭液除了包含与表1相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含10g/L Lys。
(2)实验结果
表3用于吖啶酯标记过程的封闭液的组成的筛选实验结果
结果如表3所示。结果显示与对照组封闭液、小分子+大分子组封闭液、大分子+大分子组封闭液相比,小分子+小分子(10g/L Lys+10g/L Tris)组封闭液的封闭效果明显更优,试剂本底更低且灵敏度更高。
2、用于吖啶酯标记过程的封闭液中的小分子+小分子组成的筛选实验
(1)实验方法
在完成吖啶酯与抗原/抗体的连接后加入的各封闭液中除了包含与表1相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含表4所示不同的小分子+小分子。
(2)实验结果
表4用于吖啶酯标记过程的封闭液的小分子+小分子组成的筛选实验结果
结果如表4所示。结果显示在小分子+小分子封闭液组中,10g/L Lys+10g/LTris组的封闭效果更优。
3、用于吖啶酯标记过程的封闭液中的小分子+小分子比例的筛选实验
(1)实验方法
在完成吖啶酯与抗原/抗体的连接后加入的各封闭液中除了包含与表1相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含表5所示不同的小分子+小分子。
(2)实验结果
表5用于吖啶酯标记过程的封闭液的小分子+小分子比例的筛选实验结果
结果如表5所示。结果显示在Lys+Tris封闭液组合中,10g/L Lys+100g/L Tris组更能降低试剂本底和提高灵敏度。也就是说,在Lys+Tris封闭液组合中,当Lys与Tris的浓度比为1:10时,更有利于降低试剂本底和提高灵敏度。
将此处的10g/L Lys+100g/L Tris组封闭液作为用于吖啶酯标记过程的最优组封闭液。
4、用于吖啶酯标记过程的封闭液的灵敏度和特异性对比
(1)封闭液选择
对照组(10g/L Lys组)封闭液,上述最优组(10g/L Lys+100g/L Tris组)封闭液。
(2)实验结果
表6灵敏度和特异性结果
表6中,“S/CO”中的S代表标本sample的OD值,CO即cutoff,若S/CO值≥1判为阳性,若S/CO值<1判为阴性。
结果如表6所示。结果显示在吖啶酯标记完成后,用10g/L Lys+100g/L Tris组(Lys与Tris的质量比是1:10,下同)封闭液封闭反应,可明显提高试剂灵敏度和特异性,降低本底。
试验例2:用于磁微粒包被过程中的封闭液的筛选实验
参照试验例1的实验方法,用人类免疫缺陷病毒抗原抗体检测试剂盒(直接化学发光法)作为测试该封闭方法的试剂,在完成吖啶酯与抗原/抗体的连接后得到标记物,加入赖氨酸进行封闭;在完成磁微粒(连接有链霉亲和素)与抗原/抗体的连接后,按照具体封闭剂与磁珠的质量比,加入下述不同组成的各封闭液进行封闭。进行内部控制品(阳性)和随机样本(本底)、假阳样本(特异性)发光信号值(RLU)测定,对比不同封闭液的封闭效果。
1、用于磁微粒包被过程的封闭液的组成的筛选实验
(1)封闭液选择
在完成磁微粒与抗原/抗体的连接后,加入的各封闭液中除了包含与表2相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含表7所示不同的大分子和/或小分子;其中,对照组封闭液除了包含与表2相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含10g/L生物素酯。
(2)实验结果
表7用于磁微粒包被过程的封闭液的组成筛选实验结果
结果显示,与对照组封闭液、小分子+小分子组封闭液、大分子+大分子组封闭液相比,采用小分子+大分子(2ug/mg生物素酯+2ug/mg生物素化BSA)组封闭液为封闭液的特异性更优。
2、用于磁微粒包被过程的封闭液中的小分子+大分子组成的筛选实验
(1)封闭液选择
在完成磁微粒与抗原/抗体的连接后加入的各封闭液中除了包含与表1相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含表8所示不同的小分子+大分子。
(2)实验结果
表8用于磁微粒包被过程的封闭液的小分子+大分子组成的筛选实验结果
结果显示,在小分子+大分子封闭液组合中,2ug/mg维生素H+2ug/mg生物素化多聚PEG组的封闭效果更好,该组合特异性更好。
3、用于磁微粒包被过程的封闭液中的小分子+大分子比例的筛选实验
(1)封闭液选择
在完成磁微粒与抗原/抗体的连接后加入的各封闭液中除了包含与表1相同的缓冲液、糖类、稳定剂、表面活性剂和防腐剂外,还包含表9所示不同的小分子+大分子比例。
(2)实验结果
表9用于磁微粒包被过程的封闭液的小分子+大分子比例的筛选实验结果
结果显示,在维生素H+生物素化多聚PEG封闭液组合中,小分子和大分子之间最优的比例为10g/L维生素H+1g/L生物素化多聚PEG(此时维生素H:生物素化多聚PEG=10:1),该组合对消除试剂假阳,提高试剂特异性有明显效果。
将此处的10g/L维生素H+1g/L生物素化多聚PEG组封闭液作为用于磁微粒包被过程的最优组封闭液。
4、用于磁微粒包被过程的封闭液的灵敏度和特异性对比
(1)封闭液选择
对照组(10g/L生物素酯组,按照10ug生物素酯每mg磁珠的比例加入)封闭液,上述最优组(10g/L维生素H+1g/L生物素化多聚PEG组,按照10ug维生素H每mg磁珠+1ug生物素化多聚PEG每mg磁珠的比例加入)封闭液。
(2)实验结果
表10灵敏度和特异性检测结果
结果显示,磁珠与抗原/抗体连接完成后,用10g/L维生素H+1g/L生物素化多聚PEG组封闭液封闭反应,可有效提高试剂特异性。
试验例3:用于吖啶酯标记过程和用于磁微粒包被过程的两种封闭液搭配使用的效果
(1)实验方法
参照试验例1的实验方法,用人类免疫缺陷病毒抗原抗体检测试剂盒(直接化学发光法)作为测试该封闭方法的试剂,在完成吖啶酯与抗原/抗体的连接后得到标记物,按照标记物与封闭液体积比10:1加入用于吖啶酯标记过程的对照组(10g/L Lys组)封闭液或最优组(10g/L Lys+100g/L Tris组)封闭液进行封闭;在完成磁微粒(连接有链霉亲和素)与抗原/抗体的连接后,加入用于磁微粒包被过程的对照组(10g/L生物素酯组,按照10ug生物素酯每mg磁珠的比例)封闭液或最优组(10g/L维生素H+1g/L生物素化多聚PEG组,按照10ug维生素H每mg磁珠+1ug生物素化多聚PEG每mg磁珠的比例)封闭液进行封闭。进行内部控制品(阳性)和随机样本(本底)、假阳样本(特异性)发光信号值(RLU)测定,对比不同封闭液搭配使用下的封闭效果。
(2)实验结果
表11两种封闭液搭配使用的效果
结果显示,在吖啶酯标记完成后,用10g/L Lys+100g/L Tris组封闭液封闭反应可降低试剂本底、提高试剂灵敏度和特异性;在磁珠与抗原/抗体连接完成后,用10g/L维生素H+1g/L生物素化多聚PEG组封闭液封闭反应,也可降低试剂本底、提高试剂灵敏度和特异性;将前述两种封闭液搭配使用时封闭效果最佳。
综上,本发明提供了一种能够在化学发光免疫分析过程中有效避免非特异性干扰,提高检测试剂的灵敏度和特异性的封闭剂和封闭方法。与现有的封闭剂相比,本发明的封闭剂可以有效避免封闭不完全的问题,降低非特异性干扰,提高检测试剂的灵敏度和特异性。本发明还提供了包括前述封闭剂的封闭液,以及化学发光物质封闭剂与固相载体封闭剂的组合物,二者组合使用的封闭效果更佳。本发明提供的封闭剂以及封闭液可以用于制备高特异性的化学发光免疫分析试剂,具有良好的应用前景。
Claims (15)
1.一种在化学发光免疫分析方法中用于封闭化学发光物质的封闭剂,其特征在于:所述封闭剂由如下2种组分组成:组分1:Lys;组分2:Tris、Gly、Arg中的一种或多种;所述化学发光物质为吖啶类化合物。
2.根据权利要求1所述的封闭剂,其特征在于:所述封闭剂由组分1:Lys和组分2:Tris组成。
3.根据权利要求1或2所述的封闭剂,其特征在于:所述组分1和组分2的质量比为1:(0.1~10);
所述化学发光物质为吖啶酯。
4.根据权利要求3所述的封闭剂,其特征在于:所述组分1和组分2的质量比为1:10。
5.一种在化学发光免疫分析方法中用于封闭化学发光物质的封闭液,其特征在于:所述封闭液包含权利要求1~4任一项所述的封闭剂和溶剂。
6.根据权利要求5所述的封闭液,其特征在于:所述封闭液还包含缓冲液、糖类物质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的封闭液,其特征在于:所述封闭液中,组分1的浓度为10~100g/L,组分2的浓度为10~100g/L,缓冲液的浓度为10~140mmol/L,糖类物质的浓度为10~50g/L,稳定剂的浓度为5~15g/L,表面活性剂的浓度为0.05~2.0mL/L,防腐剂的浓度为0.4~1.2g/L。
8.根据权利要求7所述的封闭液,其特征在于:所述组分1的浓度为10g/L,组分2的浓度为100g/L。
9.一种用于化学发光免疫分析的封闭液组合物,其特征在于:所述封闭液组合物包含以下两种封闭液:
封闭液I:权利要求5~8任一项所述的封闭液;
封闭液II:用于封闭连接有链霉亲和素的固相载体的封闭液。
10.根据权利要求9所述的封闭液组合物,其特征在于:封闭液II中含有封闭剂,所述封闭剂由大分子类封闭物质和小分子类封闭物质组成,其中,大分子类封闭物质为生物素化BSA、生物素化酪蛋白或生物素化多聚PEG,小分子类封闭物质为NHS-LC-Biotin或维生素H。
11.根据权利要求10所述的封闭液组合物,其特征在于:封闭液II中,所述大分子类封闭物质为生物素化多聚PEG,小分子类封闭物质为维生素H;所述生物素化多聚PEG与维生素H的质量比为1:(0.1~10);
封闭液II中包含溶剂,还包含缓冲液、糖类物质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种;
所述的固相载体为磁珠。
12.根据权利要求11所述的封闭液组合物,其特征在于:所述生物素化多聚PEG与维生素H的质量比为1:10;
封闭液II中,生物素化多聚PEG的浓度为1~10g/L,维生素H的浓度为1~10g/L,缓冲液的浓度为10~140mmol/L,糖类物质的浓度为10~50g/L,稳定剂的浓度为5~15g/L,表面活性剂的浓度为0.05~2.0mL/L,防腐剂的浓度为0.4~1.2g/L。
13.根据权利要求12所述的封闭液组合物,其特征在于:封闭液II中,生物素化多聚PEG的浓度为1g/L,维生素H的浓度为10g/L。
14.权利要求1~4任一项所述封闭剂、权利要求5~8任一项所述封闭液或权利要求9~13任一项所述的封闭液组合物在制备化学发光免疫分析用检测试剂中的用途。
15.用于化学发光免疫分析方法的检测试剂,其特征在于:所述检测试剂是采用权利要求1~4任一项所述封闭剂或权利要求5~8任一项所述封闭液封闭处理后得到的连接有化学发光物质的抗体或者抗原。
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