KR101545529B1

KR101545529B1 - 전기화학발광 면역분석 방법

Info

Publication number: KR101545529B1
Application number: KR1020137027041A
Authority: KR
Inventors: 준 친
Original assignee: 베이징 유니디악 테크놀러지 아이엔씨
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-13
Publication date: 2015-08-19
Also published as: WO2012122929A1; JP2014509735A; JP5753282B2; US20140072963A1; CN102680456A; US10024861B2; KR20130126741A; CN102680456B

Abstract

본 발명은 Ru(bpy) 표지된 단백질-일차 항체, 실험되는 바이오틴화된(biotinylated) 단백질-이차 항체, 및 실험되는 샘플의 완전한 반응; 항원, 항체, 및 마그네틱(magnetic) 입자를 포함하는 복합체를 형성하기 위한 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 마그네틱 입자의 첨가; 상기 마그네틱 입자에 의해 전극 표면에 흡착; 디부틸 에탄올아민(dibutyl ethanolamine) 용액의 첨가를 이용한; 전기화학 방법의 수단에 의해 실험하는, 전기화학발광 면역분석(electrochemiluminescence immimmunoassay) 방법을 밝힌다. 또한 이에 상응하는 전기화학발광 면역분석 검출 키트를 밝힌다.

Description

전기화학발광 면역분석 방법{electrochemiluminescence immunoassay method}

본 출원은 "전지화학발광 면역분석 방법(ELECTROCHEMILUMINESCENCE IMMUNOASSAY METHOD)"이라는 제목으로, 2011년 3월 16일에 중국 특허청에 출원된, 중국 특허 출원 번호 201110063893.0에 대한 우선권을 주장하며, 내용들은 본 명세서에 참조로서 통합된다.

기술분야

본 발명은 면역학(immunology), 특히 전기화학발광(electrochemiluminescence) 면역분석(immunoassay) 방법에 관한 것이다.

화학발광 면역분석(Chemiluminescence immunoassay)은 트레이서(tracer) 신호로서 표지 발광체(labeling illuminant)를 사용함에 의해 수립된 비방사성(non-radioactive) 면역분석으로, 이는 고감도(high sensitivity), 광범위한 선형 영역(linear range), 빠른 분석 속도, 단순 작동(operation), 및 자동화(automation)를 위한 준비가 장점이다.

현재, 일반적으로 임상 실험에 사용되는 화학발광 면역시약들(immunoreagents)은 하기와 같다:

1. 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 루미놀(luminol)를 포함한 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)의 반응 시스템. 상기 반응 시스템의 주요한 단점은 알카라인 포스파타아제 및 호스라디시 퍼옥시다아제의 활성들(aactivities)이 온도 변화(variation)에 의해 크게 영향을 받고, 그리고 실험 결과들이 환경 변화에 의해 크게 영향을 받는다는 것이다.

2. 아크리디늄에스터(acridinium ester) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)를 포함한 이의 유도체의 알카라인 용액에서 발광(Luminescence) 반응. 상기 반응의 주요한 단점은 이것이 짧은 발광 시간을 가지는 플래시(flash) 발광이고, 이는 유일하게 완전히 자동화된 장치(automated instrument)에서 검출될 수 있다는 것이다. 결과들의 계산을 위한 방식(mode)은 복잡하고, 그리고 실험 결과들이 안정하지 않다.

3. 루테늄 피리딘(ruthenium pyridine) 및 트리프로필아민(tripropylamine)의 전기-화학발광(Electro-chemiluminescence) 시스템.

전기-화학발광(ECL) 반응은 전극(electorde)의 표면에서 전기화학(electrochemistry)에 의해 유인되는 특이적 화학발광 반응이다. 항원-항체(antigen-antibody) 복합체 및 루테늄 피리딘의 접합체(conjugate)는 트리프로필아민의 존재 하에 전기화학에 의해 여기(excited)되고, 산화환원반응(redox reaction)이 광자(photons)를 방출하기 위해 발생하고, 이는 광전자증배관(photomultiplier tube)에 의해 수집될 수 있다. 이 과정은 많은 광자를 생산하기 위해 반복적으로 수행되고, 이는 광학 신호(optical signal)을 증폭한다. 일반적으로 전기화학발광 분석에 사용되는 표지들(labels)은 표지된 항체 또는 항원을 생산하기 위한, 다른 화학 구조를 가진 항체 또는 항원 분자에 결합할 수 있는 표지들이다.

루테늄 피리딘은 수용성(water-soluble)이고 매우 안정하며, 이는 효율적이고 안정된 전자화학발광 반응을 확실하게 하고 배경 노이즈(background noise)로부터 간섭을 피한다. 루테늄 피리딘의 면역글로블린(immunoglobulin)에 대한 결합의 몰비(molecular ratio)가 20을 넘을 때, 항체의 용해도(solubility) 및 면역 활성(immunological activity)이 여전히 영향을 받지 않고, 그리고 분자량(molecular weight)이 낮고, 입체 장애(steric hindrance)가 낮고, 그리고 작은 분자 핵산도 또한 표지될 수 있다.

현재 사용 가능한 전기화학발광 방법은 주로 반응물(reactant)로서 트리프로필아민 TPA를 이용한다. 트리프로필아민의 단점은 반응이 느리고, 농도가 높고, 전극 물질에 의해 크게 영향을 받고, 발광 효율(efficiency)이 제한되고, 그리고 비용 최소화될 수 없다.

발명의 요약

본 발명에 의해 해결되기 위한 기술적 문제는 고발광 효율(high luminescence efficiency), 빠른 반응, 및 광범위하게 적용할 수 있는 전기화학발광(electrochemiluminescence) 면역분석(immunoassay)을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 기술적 해결방안들을 제공한다:

하기 단계를 포함하는, 전기화학발광 면역분석 방법:

단계 1: 단백질에 대한 루테늄 피리딘(ruthenium pyridine)-표지된 일차 항체가 실험되고 그리고 단백질에 대한 바이오틴화된(biotinylated) 이차 항체가 실험되는 샘플에 효율적으로 반응하는 것이 실험되는 것을 가능하게 하거나, 또는 단백질에 대한 루테늄 피리딘-표지된 항체가 실험되고 그리고 바이오틴화된 항체가 실험되는 샘플에 효율적으로 반응하는 것이 실험되는 것을 가능하게 하는 단계;

단계 2: 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된(coated) 마그네틱 입자들 (magnetic particles)을 첨가하고, 항원, 항체 및 마그네틱 입자를 포함하는 복합체를 형성하기 위한 반응을 가능하게 하고, 유동셀(flow cell)에서 항체, 항원 및 마그네틱 입자를 포함하는 복합체가 마그네틱 입자를 통해 전극(electrode)의 표면으로 흡착되는, 상기 유동셀(flow cell)로 반응액을 흡수하는 단계;

단계 3: 디부틸 에탄올아민(dibutyl ethanolamine) 용액을 첨가하고, 전압을 인가함으로써 ECL 반응을 시작하고, 그리고 광학검출기(optical detector)로 스캔된(scanned) 광학 신호들을 수집하는 단계;

단계 4: 농도 구배로 표준 용액을 제제화하고, 발광강도(luminescence intensity)의 값에 있어서 변화에 대한 대수(logarithm) 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응(dose-response) 곡선을 그리고, 그리고 계산에 의해 실험된 샘플에서 실험된 단백질의 농도를 구하는 단계.

ECL의 기본 원리는 산화되기 위해, 반응에서 발광 기질 및 조성물이 전극의 표면에서 전자(electrons)를 잃는 것이다. 전자 공여체(electron donor) 는 여기상태(excited state)로 발광 기질을 환원하는, 강한 환원제(reducing agent)가 되기 위해 H⁺를 잃고, 그 후 상기 발광 기질은 기저상태(ground state)로 돌아가기 위해 광자(photons)를 방출한다. 이 과정은 전극의 표면에서 반복적으로 수행되고, 그리고 광자는 일반적으로 기질 농도를 일정하게 유지하기 위해 계속적으로 방출된다.

트리프로필아민(tripropylamine, TPA)의 단점은 반응이 느리고, 농도가 높고, 그리고 전극 물질에 의해 크게 영향을 받는다는 것이다. 디부틸 에탄올아민의 발광 효율(efficiency)이 명확히 TPA의 발광 효율보다 낫고, 그리고 백금(platinum) 전극에서 그리고 금 전극에서 이의 발광 강도들을 비교한 도식(diagram)을 도 5에 나타낸다. 디부틸 에탄올아민 DBAE는 공반응물(co-reatant) 안드루테늄 피리딘(andruthenium pyridine)이 항원 또는 항체, 또는 면역반응(immunoreaction) 또는 ECL 반응에 의해 전기화학발광 면역분석을 위한 핵산을 표지하기 위해 본 발명에서 표지(label)로서 사용되는 것과 같이 선택되었다.

본 발명에 따른 라테늄 피리딘의 구조는 하기와 같다:

디부틸 에탄올아민의 구조는 하기와 같다:

본 발명에서, 항원 또는 항체를 표지하기 위하여, 루테늄 피리딘이 표지로서 사용되고, 그리고 면역반응 및 ECL 반응에 의한 전기화학발광 면역분석을 수행한다. 본 발명에 따른 방법은 두 부분, 화학 반응 및 전기화학 반응으로 나뉘어진다. 본 발명의 몇몇 특정 실시예에서, 화학 반응의 부분은 시험관(test tube)에서 수행되고, 그리고 전기화학 반응의 부분은 유동셀에서 수행된다.

전극의 표면에서 전기화학에 의해 유인되는 특이적 화학발광 반응을 위하여, 항체(Ab)는 전기화학발광 시약인 루테늄 피리딘에 의해 표지되고, 고상 담체(solid phase carrier)는 샘플에서 상응하는 항원 또는 항체를 가지고 면역 반응의 특정 방식에 의해 복합체를 형성하는 항원 또는 항체로 코팅된다. 표지가 접합된 복합체는 분리 기술에 의해 자유 표지들(free labels)로부터 분리된다. 실험되는 항원(Ag) 또는 항체(Ab)는 전극에서 루테늄 피리딘의 발광 강도에 따라 정량적으로/정성적으로 측정된다.

본 발명에서, 마그네틱 입자(magnetic particles)는 고상 담체로서 선택된다. 고상 담체의 자성(magnetism) 때문에, 결합된 표지로부터 자유 표지를 분리할 때, 자석(magnet)으로 끌어당기는 것이 오직 요구되고, 이는 사용하기 편리하고 빠르다. 본 발명의 특정 실시예에서, 고상 담체는 2.8 μm의 직경을 가지는 자석을 포함한 폴리스틸렌(polystyrene) 입자이다.

예로서 혈청(serum) 샘플들에서 TSH를 실험하기 위하여, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 활성화된(activated) 루테늄 피리딘이 접합된 TSH에 대한 항체 및 바이오틴(biotin)이 접합된 TSH 항체는 배양되고 그리고 실험되는 혈청과 반응하고, 그후 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 마그네틱 입자가 첨가되고, 그 결과 마그네틱 입자, 실험되는 항체, 및 TSH 항체는 "샌드위치(sandwich)"를 형성하기 위하여, 바이오틴의 아비딘(avidin)과의 접합에 의해 서로 연결된다.

특정 실시예에서, 형성된 대로 스트렙타비딘으로 코팅된 루테늄 피리딘-항체-항원-바이오틴화된 항체-마그네틱 입자의 복합체는 연동펌프(peristaltic pump)에 의해 유동 측정 셀(flow measuring cell)로 빨아들여진다. 루테늄 피리딘이 접합된 자유 바이오틴화된 항체 및 자유 TSH 항체를 포함한, 자유 TSH 항체들은 측정 셀 밖으로 빨아들여지는 반면, 상기 복합체들은 마그네틱 입자를 통해 작동 전극(working electrode) 아래 위치된 자석에 의해 전극의 표면으로 흡착된다.

디부틸 에탄올아민 DBAE는 연동펌프에 의해 첨가되고, 그리고 전압은 ECL 반응을 시작하기 위해 인가된다. 이 과정은 많은 광자를 생산하기 위해, 전극의 표면에서 반복적으로 수행된다. 광 강도(light intensity)는 광전자증배관을 사용함으로써 측정되고, 그리고 이의 광 강도는 루테늄 피리딘의 농도와 선형 관계(linear relationship)를 가진다. 상기에 근거하여, 실험되는 샘플에서 TSH의 함유량(content)이 측정된다.

특정 실시예에서, 본 발명에서 이용되는 고상 담체들은 2.8 μm의 직경을 가지는 마그네틱 폴리스틸렌 입자들이고, 이는 플레이트 타입(plate type)과 비교하여, 반응 부위가 20 내지 30 배 확대되고 흡착 효율(adsorption efficiency )이 높고; 그리고 균질현탁(homogeneous suspension)이 액상(liquid phase)과 유사한 방법으로 반응에 관여하기 위해 액체에서 형성되고, 이는 반응속도(reaction rate)를 크게 가속한다.

스트렙타비딘 및 바이오틴은 검출의 효과를 증폭하기 위해 사용된다. 한 분자(molecule)의 스트렙타비딘은 4 분자의 바이오틴과 결합할 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 스트렙타비딘은 바이오틴에 결합할 수 있는 일반적 고체 담체를 형성하기 위하여, 균질하게 그리고 견고하게 마그네틱 입자들에 코팅된다. 스트렙타비딘-코팅된 마그네틱 입자가 바이오틴화된 항원 또는 항체와 접촉할 때, 상기 항원 또는 항체는 즉시 마그네틱 입자에 코팅된다. 접합상태(conjugated state)에 있는 항원들 및 항체들은 전자기장(electromagnetic field)을 사용하여 자성에 의해 자유상태(free state)에 있는 항원들 및 항체들로부터 분리된다. 이것은 편리하고 빠르며, 그리고 완전한 자동화는 정확히 달성되고, 그리고 한편 표지들의 재활용(recycling)이 달성된다. 뿐만 아니라, 발광 시간이 더 길고, 강도가 더 높고, 그리고 발광이 쉽게 측정된다.

단백질 및 폴리펩티드(polypeptide) 항원을 검출하기 위한 방법은 주로 이중 항체 샌드위치(double antibody sandwich) 방법 및 경쟁(competition) 방법이다. 이중 항체 샌드위치 방법은 일반적으로 단백질 거대분자 항원(macromolecular antigen)의 측정에 사용된다. 그러나, 오직 단일 항원결정기(epitope)을 가지는, 작은 분자 호르몬(molecular hormone), 약물, 또는 이와 같은 것은, 이들이 오직 하나의 항원결정기를 가지거나, 또는 분자가 너무 작거나, 그리고 하나의 항체에 결합 후, 입체 장애(steric hindrance) 때문에 이들이 또다른 항체에 결합할 수 없기 때문에, 이중 항체 샌드위치 방법을 이용한 측정에 적합하지 않다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 경쟁적 억제(competitive inhibition) 방법은 바람직하게 자유 트리요오드티로닌(free triiodothyronine) FT3와 같은 작은 분자 항원들을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 경쟁적 억제 방법의 원리는 샘플에 있는 항원들이 고체상 항체와 결합하는 다량의 표지된 항원과 경쟁하는 것이다. 샘플에 있는 항원의 함유량이 더 높을 때, 고체상에 접합되는 표지된 항원의 함유량은 더 적다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 루테늄 피리딘으로 표지된 항원-항체 복합체, 스트렙타비딘 및 바이오틴의 시스템, 및 디-엔-부틸 에탄올아민(di-n-butyl ethanolamine)이 사용되고, 그리고 면역반응 및 전기화학 반응은 단백질 함유량의 검출을 수행하기 위해 적용되며, 이는 고감도, 고발광 효율이 특징이고, 그리고 중요한 비방사성(non-radioactive) 면역분석 방법이며, 종양 마커(tumor marker) 단백질 및 호르몬과 같은 다양한 단백질들을 검출하기 위해 적합하다.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 하기 아이템들(items)을 검출하기 위해 사용될 수 있다: T3 트리요오드티로닌(triiodothyronine), ASA 항-정자(anti-sperm) 항체, 트로포닌 I(troponin I), T4 티록신(thyroxine), ACA 항카티오리핀(anticardiolipin) 항체, CKMB, TSH, AEA 항-자궁내막(anti-endometrium) 항체, FT3 자유 트리요오드티로닌(free triiodothyronine), AOA 항-난소(anti-ovarian) 항체, FT4 자유 티록신(free thyroxine), ATB 항-영양막(anti-trophoblast) 항체, 항-TM 갑상샘마이크로좀(thyroid microsomal) 항체, ZP 항-투명대(anti-zona pellucida) 항체, 항-TG 항-티로글로블린(anti-thyroglobulin) 항체, 항-HCG 항체, 인간 태반 락토진(human placental lactogen) , 항-TPO 갑상선 과산화효소(thyroid peroxidase) 항체, HCG, TOX 톡소플라즈마(toxoplasma) 항체, FSH, AFP 알파페토단백질(alpha-fetoprotein), CEA 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen), PSA 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen), FPSA 자유 전립선 특이 항원(free prostate-specific antigen), CMV 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 항체, LH 황체형성호르몬(luteinizing hormone), HSV-1 단순포진바이러스(herpes simplex virus) 항체, PRL 프로락틴(prolactin), HSV-2 단순포진바이러스 항체, TES 테스토스테론(testosterone), RV 풍진바이러스(rubella virus) 항체, PRO 프로게스테론(progesterone), 페리틴(Ferritin), TOX-Ag 톡소플라즘 순환 항원(toxoplasm circulating antigen), E2 에스트라디올(estradiol), CA125, E3 에스트리올(estriol), CA153, CA199, HBsAg, NSE 뉴런특이에놀라아제(neuron-specific enolase), HBsAb, CA50, HBeAg, β2 마이크로글로블린(microglobulin), HBeAb, 콕삭키바이러스(Coxsackie virus) 항체, HBcAb, BGP 골 Gla 단백질(bone Gla protein), D-Pyr 데옥시피리디놀린( deoxypyridinoline), 비타민 D(vitamin D), 인슐린(insulin), PCIII III형 프로콜라겐(type III procollagen), C-펩타이드(C-peptide), IV 형 콜라겐(type IV collagen), 인슐린 항체, LN 라미닌(laminin), 글루카곤(glucagon), HA 히알루론산(hyaluronic acid), GAD-AB 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase) 항체, Fn 피브로넥틴(fibronectin), 인플루엔자 바이러스 B(influenza virus B), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), EB 바이러스, 홍역 바이러스(measles virus), 미코플라즈마 뉴모니아((Mycoplasma pneumoniae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 멈프스 바이러스(mumps virus), HCV 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 아데노바이러스(adenovirus), RSV 호흡기세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 에코바이러스(Echovirus), 및 프로-가스트린-유리 펩타이드(pro-gastrin-releasing peptide), CYFRA21-1, AFP, APT, CA242, CA724, CA50, f-PSA, t-PSA, 자유 β-hCG(Free β-hCG), 및 SCCA.

상기에서, AFP, APT는 간암(hepatocellular carcinoma) 및 생식세포 종양(germ cell tumor)를 위한 마커들이고, 이들은 또한 배아세포 암(embryonic cell cancer), 난소성 기형종(ovarian teratoma), 위암(gastric cancer), 담도암(biliary tract carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer) 등과 같은 다른 관련된 종양에서 발견된다.

CEA는 소화관 종양(digestive tract tumors)을 위한 광범위-스펙트럼(broad-spectrum) 마커이고, 그리고 또한 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 갑상선 비수질종양(medullary thyroid carcinoma) 등과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

CA242는 췌장암, 위암, 대장암(colon cancer)을 위한 마커이고, 그리고 또한 다른 관련된 종양: 간암(liver cancer), 식도암(esophageal cancer), 및 폐암에서 발견된다.

CA125는 난소암(ovarian cancer)을 위한 마커이고, 그리고 폐암, 췌장암, 유방암, 간암, 위장관암(gastrointestinal malignancy), 자궁암(uterine cancer)과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

CA199는 췌장암, 쓸개관암(bile duct cancer), 대장암(colorectal cancer)을 위한 마커이고, 그리고 또한 간암, 담낭암(gallbladder carcinoma), 쓸개관암 등과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

CA153는 유방암을 위한 바람직한 마커이고, 그리고 폐암, 난소암, 폐암, 대장암 등과 같은 다른 관련된 종양들에서 증가할 수 있다.

CA724는 위암을 위한 가장 바람직한 종양 마커들 중 하나이고, 그리고 다양한 검출율(detection rates)을 가지는 위장관암, 유방암, 폐암, 난소암 등과 같은 다른 관련된 종양들에서 검출될 수 있다.

CA50는 췌장암 및 대장암을 위한 마커이고, 그리고 또한 위암, 담낭암, 간암, 폐암, 및 유방암과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

NSE 및 프로-게스트린-유리 펩타이드에 대한 주요한 관련된 종양은 작은 세포 폐암(small cell lung cancer)이고, 그리고 이들은 또한 다른 관련된 종양들: 폐선암종(lung adenocarcinoma) 및 큰 세포 폐암에서 발견된다.

CYFRA21-1에 대한 주요한 관련된 종양들은 폐편평세포암종(lung squamous cell carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 식도암이고, 그리고 이것은 또한 방광암(bladder cancer), 비인두암(nasopharyngeal carcinoma), 난소암, 및 위장관암과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

f-PSA 및 t-PSA에 대한 주요한 관련된 종양은 전립선암(prostate cancer)이고, 그리고 이들은 또한 특정 부인과 종양들(gynecologic tumors) 및 유방암과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

자유 β-hCG에 대한 주요한 관련된 종양들은 부인과 종양들 및 비정원고환암(non-spermatogonial testicular cancer)이고, 그리고 이는 또한 유방 종양(breast tumor), 정원고환암(spermatogonial testicular cancer), 폐암, 간암 등과 같은 다른 관련된 종양에서 발견된다.

SCCA에 대한 주요한 관련된 종양은 자궁경부편평세포암종(cervical squamous cell carcinoma)이고, 그리고 이는 또한 폐편평세포암종(lung squamous cell carcinoma), 두경부편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma), 식도암, 및 생식기편평세포암종(genital squamous cell carcinoma)과 같은 다른 관련된 종양들에서 발견된다.

β2-MG는 악성종양(malignancy)에 대한 보조 마커(auxiliary marker)이고, 그리고 특히 만성 림프종 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 림프 육종(lymphosarcoma), 다발성 골수종(multiple myeloma) 등에서 명확하고, 그리고 또한 폐암, 유방암, 위장관암 및 자궁경부암에서 증가되는 것이 발견된다.

본 발명은 추가적으로 하기 조성물을 포함하는, 전기화학발광 면역분석을 위한 키트를 제공한다: 실험되는 단백질에 대한 루테늄 피리딘-표지된 일차 항체, 실험되는 단백질에 대한 바이오틴화된 이차 항체, 스트렙타비딘-코팅된 마그네틱 입자, 및 디-엔-부틸 에탄올아민 용액.

바람직하게, 본 발명에 따른 키트는 추가적으로 세척 용액을 포함한다.

더욱 바람직하게, 상기 세척 용액은 0.05 mol/L 인산 완충용액(phosphate buffer) (pH 7.4)에 있는 0.05% 트윈-20(Tween-20)이다. pH값이 높을 때, 광화학 반응(photochemical reaction)의 발광 효율이 높고, 반면 pH값이 낮을 때, 검출 결과가 안정된다. 본 발명의 발명자는, 세척 용액의 pH값이 7.4일 때, 발광이 효율적이고 안정화되며, 이는 임상 샘플들의 측정을 위한 요구를 만족함을 발견하였다.

본 발명에 따른 키트는 항원 및 항체의 양을 매우 절약할 수 있다. 디부틸 에탄올아민과 루테늄 피리딘 간 광화학 반응의 발광 강도는 트리프로필아민을 사용함으로써 얻어지는 것의 6 배이고, 그리고 따라서 더 많은 광자가 광전자증배관에 의해 수집되며, 그 결과 키트의 감도가 더 높다. 값은 심지어 상당히 작은 양의 항원 및 항체를 사용하여도 검출될 수 있고, 따라서 항체의 양은 효율적으로 줄어들 수 있고, 그리고 키트의 가격은 10% 내지 30% 줄어든다.

당업계에 알려진 기술과 비교하여, 본 발명에 따른 전기화학발광 면역분석 방법 및 키트는 하기의 장점을 가지고 있다:

1. 스트렙타비딘 및 바이오틴의 적용이 감도를 매우 증가시키고, 이는 pg/ml 또는 pmol의 수준까지 도달할 수 있다.

2. 강한 특이성(specificity), 좋은 재현성(reproducibility), CV<5%.

3. 넓은 검출 범위, 이는 10의 7 자리수(7 orders of magnitude)에 도달할 수 있다.

4. 독성(toxicity) 없는 안정된 시약들

5. 반응 시간이 짧고, 그리고 분석이 20 분 이내에 완료될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 전기화학발광(electrochemiluminescence) 면역분석(immunoassay) 방법의 원리의 계통도(schematic diagram)이다;
도 2는 본 발명에 따른 전기화학발광 면역분석 방법에 의해 수행된 전기화학(electorchemical) 검출의 계통도이다;
도 3은 샌드위치 방법(sandwich method)에 대한 용량-반응(dose-response) 곡선이다;
도 4는 경쟁 방법(competition method)에 대한 용량-반응 곡선이다.
도 5는 백금 전극(platinum electrode) 및 금 전극(gold electrode)에서 디부틸 에탄올아민(dibutyl ethanolamine) 및 트리프로필아민(tripropylamine)의 발광 강도(luminescence intensities)를 비교한 도식(diagram)이다.

본 발명은 전기화학발광(electrochemiluminescence) 면역분석(immunoassay) 방법을 밝힌다. 당업계에 숙련된 기술자는 본 명세서에서 내용들을 참조로서 사용할 수 있고, 그리고 기술적 요소(paramerers)를 적절하게 개선함으로써 달성할 수 있다. 특히, 모든 유사한 치환 및 변형이 당업계에 숙력된 기술자들에게 명확하고, 그리고 이들은 모두 본 발명 내에 포함되는 것으로 여기어 진다. 본 발명의 방법 및 적용은 바람직한 실시예를 통해 설명되고, 그리고 본 명세서에서 설명된 방법 및 적용은 본 발명의 내용들, 의도 및 범위에 벗어남 없이 본 발명의 기술을 달성하고 그리고 적용하기 위하여 관련된 당업자에 의해 변형될 수 있고 또는 적절하게 변화될 수 있고 또는 결합될 수 있다.

당업계의 숙련된 기술자에 의해 본 발명의 기술적 해결책의 더 나은 이해를 위하여, 본 발명을 하기 구체적인 실시예에 의하여 추가적으로 설명한다.

실시예 1: 본 발명에 따른 키트의 조성물

본 발명에 따른 키트는 하기 조성물을 포함한다:

시약(reagent) A. 전기화학발광제(electrochemiluminescence agent) 루테늄 피리딘(ruthenium pyridine)에 의해 표지된, 실험되는 단백질에 대한 일차 항체

시약 B. 실험되는 단백질에 대한 바이오틴화된(biotinylated) 이차 항체

시약 C. 마그네틱 입자((magnetic particles)가 2.8 μm의 직경을 가지는 폴리스틸렌 입자(polystyrene particles)인, 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 마그네틱 입자들

시약 D. 디부틸 에탄올아민(Dibutyl ethanolamine) 용액

바람직하게, 세척 용액, 더 바람직하게 0.05 mol/L 인산 완충용액(phosphate buffer)(pH 7.4) 및 0.05% 트윈-20(TWEEN-20)이, 또한 포함될 수 있다. 상기 세척용액은 또한 당해 업계에 숙련된 기술자들에 의해 도움 없이 제제화 될 수 있다.

사용할 때, 본 발명에 따른 키트에 있는 루테늄 피리딘이 접합된 항체 및 바이오틴이 접합된 항체는 배양되었고 그리고 실험되는 샘플들과 반응되었다. 그후, 스트렙타비딘이 코팅된 마그네틱 입자들이 첨가되었다. 실험되는 마그네틱 입자들, 항원 및 항체는 "샌드위치(sandwich)" 복합체를 형성하기 위해, 바이오틴의 스트렙타비딘으로의 결합을 통해 서로 연결되었다.

복합체는 마그네틱 입자들을 통해 작동 전극(working electrode) 아래에 위치된 자석에 의해 전극의 표면으로 유인되었다. 표지-접합된 복합체들은 산화철(iron oxide)의 자성(magnetism)의 도움으로 전자기장(electromagnetic field) 분리를 이용하여 자유 표지(free labels)로부터 분리되었다. 그후, 디부틸 에탄올아민 DBAE가 첨가되고, 그리고 ECL 반응을 시작하기 위해 전압이 인가되었다. 산화되기 위하여, 반응 조성물로서 발광 기질 루테늄 피리딘 및 디부틸 에탄올아민은 전극의 표면에서 전자를 잃었다. 전자 공여체로서 디부틸 에탄올아민은 강한 환원제가 되기 위해 하나의 H⁺를 잃었고, 이는 산화된 형태인 3가 루테늄을 여기된 2가 루테늄으로 환원하고, 그 후 광자를 잃고 바닥상태의 발광 기질로 돌아간다. 이 과정은 많은 광자를 생산하기 위해, 전극의 표면에서 반복적으로 수행되었다. 광 강도(light intensity)는 광전자증배관(photomultiplier tube)을 사용하여 검출되었다. 이의 광 강도는 루테늄 피리딘의 농도와 선형 관계를 가진다. 전극에서 루테늄 피리딘에 의해 방출되는 광 강도에 근거하여, 실험되는 항원(Ag) 또는 항체(Ab)가 정량적으로/정성적으로 측정되었다. 상기 반응 원리의 계통도(schematic diagram)는 도 1에서 나타낸다.

실시예 2: 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수행되는 인간 갑상성 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone) TSH의 검출

키트는 하기 조성물을 포함한다:

시약 A. 루테늄 피리딘에 의해 표지된 TSH 항체

시약 B. TSH에 대한 바이오틴화된 이차 항체

시약 C. 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 입자들

시약 D. 디부틸 에탄올아민 용액

시약 E. 세척 용액

검출을 위한 단계:

(1) 시약 A 및 B, 및 실험되는 샘플 혈청이 시험관(test tube)에 첨가되었고, 그리고 37℃에서 8 분 동안 액체상 상태 하에 반응되었다.

(2) 시약 C가 상기 반응 액체에 첨가되고, 그리고 37℃에서 8 분 동안 액체상에 가까운 상태 하에 반응되었다.

(3) 두 단계 반응의 완료 후 시험관에 있는 반응 액체가 유동셀(flow cell)에 유입되었다.

전기화학발광의 과정 동안 유동셀은 모든 상기 전기화학발광 반응을 위한 위치(location)이다. 하나의 여기 전극(exciting electrode)은 유동셀 아래 위치되고, 두개의 검출 전극(detecting electrodes)는 상기 여기 전극의 양측에 설치되며, 그리고 광 신호들(light signals)의 수집 및 분석을 촉진하기 위하여 광전자증배관에 대한 수집 포트(collecting port)가 있다. 이동가능한 자석은 마그네틱 입자들의 유인을 위해 유동셀 아래 설치된다. 반응 액체는 연동 펌프(peristaltic pump)에 의해 유동셀에 펌프로 퍼올려진다. 자유 표지된-항체를 접합된 표지된-항체들로부터 분리를 달성하기 위하여, 마그네틱 입자들은 자석의 유인 때문에 전극으로 유도되고, 그리고 다른 반응물들은 유동셀에서 흘러나온다.

(4) 시약 D(디부틸 에탄올아민 용액)은 유동셀로 유입되었고, 그리고 상기 유동셀에 차게 되었다.

(5) 자석이 제거되었고, 그리고 전극에 전기가 통하게 되었다.

루테늄 피리딘 및 디부틸 에탄올아민 간의 전기화학 반응이 발생하고, 그리고 방출된 광은 광전자증배관에 의해 수집되었고, 따라서 광 강도가 측정되었다.

유동셀에서 반응의 계통도는 도 2에서 나타낸다.

(6) 농도 구배로 표준 용액들은 제제화 되었고, 그리고 도 3에 나타낸 바와 같이, 발광 강도(luminescence intensity)의 값에 있어서 변화에 대한 대(logarithm)수 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응(dose-response) 곡선이 그려지고, 그리고 실험된 샘플에서 실험된 단백질의 농도가 계산에 의해 얻어졌다.

(7) 전압이 종결되고, 그리고 마그네틱 입자들이 제거되었다. 시약 E(세척 용액)은 유동측정쳄버(flow measuring chamber)를 씻어내기 위해 첨가되었고, 그후 다음 샘플이 측정될 수 있다.

발광 강도의 값에 있어서 변화에 대한 대수 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응 곡선이 그려지고, 그리고 이들이 좋은 선형 관계에 있음이 발견되었다. 샘플에서 TSH의 농도는 용량-반응 곡선에 따라 추론되었다.

실시예 3: 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 수행된 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein)의 검출

인간 혈청, 아비딘(avidin)이 접합된 마그네틱 입자들, 바이오틴이 접합된 항체 1, 및 루테늄 피리딘이 접합된 항체 2가 반응 용기(reaction vessel)에 첨가되었다. 상기 용기는 37℃에서 9 내지 17 분 동안 배양되었다. 마그네틱 분리가 수행되었고, 즉, 비접합된(unconjugated) 물질들이 세척되고, 그리고 마그네틱 입자들을 포함한 항원-항체 복합체를 포함하는 상기 언급된 잔류 액체가 유동셀로 유입되었다. 디프로필 에탄올아민(Dipropyl ethanolamine)이 첨가되었고, 그리고 전극의 존재 하에서 산화환원 반응(redox reaction)이 발생하였다. 이 과정 동안, 광이 방출되었다. 광자들은 광전자증배관에 의해 획득되고, 분석되고 컴퓨터에 의해 증폭되었다. 농도 구배에 따른 표준 용액은 제제화되고, 그리고 발광 강도의 값에 있어서 변화에 대한 대수 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응 곡선이 그려졌다. 결과가 계산되었다. 따라서, 실험되는 혈청에서 알파-페토단백질의 함유량이 측정되었다.

실시예 4: 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 수행된 암종태아(carcinoembryonic) 항원의 검출

키트는 하기 조성물을 포함한다:

시약 A. 암종태아 항원에 대한 루테늄 피리딘-표지된 항체들

시약 B. 암종태아 항원에 대한 바이오틴화된 이차 항체

시약 C. SA로 코팅된 마그네틱 입자들

시약 D. 디부틸 에탄올아민 용액

시약 E. 세척 용액: 0.05 M 인산 완충용액(pH 7.4) 및 0.05% 트윈-20

검출을 위한 단계:

(1) 시약 A 및 B, 및 실험되는 샘플 혈청이 시험관에 첨가되었고, 그리고 37 ℃에서 8 분 동안 액체상 상태 하에 반응되었다.

(3) 두 단계 반응의 완료 후 시험관에 있는 반응 액체들이 유동셀로 유입되었다.

(4) 디부틸 에탄올아민 용액은 유동셀로 유입되었고, 그리고 상기 유동셀에 차게 되었다.

(5) 자석이 제거되었고, 그리고 전극에 전기가 통하게 되었다. 루테늄 피리딘 및 디부틸 에탄올아민 간의 전기화학 반응이 발생하고, 그리고 방출된 광은 광전자증배관에 의해 수집되었고, 따라서 광 강도가 측정되었다.

(6) 농도 구배에 따른 표준 용액들은 제제화 되었고, 그리고 발광 강도의 값에 있어서 변화에 대한 대수 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응 곡선이 그려지고, 그리고 실험된 샘플에서 실험된 항원의 농도가 계산에 의해 얻어졌다.

(7) 세척 용액은 반응물을 철저하게 씻어내기 위하여 유동셀에 유입되었고, 그후 다음 샘플이 측정될 수 있다.

실시예 5: 경쟁 방법(competition method)을 사용하여 자유 트리요오드티로닌 (free triiodothyronine) FT3의 검출

검출 단백질(detecting protein) 및 폴리펩티드(polypeptide) 항원들을 위한 방법은 주로 이중 항체 샌드위치 방법(double antibody sandwich method) 및 경쟁 방법이다. 이중 항체 샌드위치 방법은 일반적으로 단백질 거대분자 항원의 측정을 위해 사용된다. 그러나, 오직 단일 항원결정기(epitope)를 가진, 작은 분자 호르몬, 약물, 또는 이와 같은 것은 오직 하나의 항원결정기를 가지며, 또는 분자가 매우 작고, 그리고 하나의 항체에 결합한 후, 이들이 입체 장애(steric hindrance) 때문에 또다른 항체에 결합할 수 없기 때문에, 이중 항체 샌드위치 방법을 사용하여 측정하는 것이 적합하지 않다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 경쟁 억제 방법(competitive inhibition method)는 자유 트리요오드티로닌 FT3와 같은 작은 분자 항원들을 검출하기 위하여 이용되었다. 상기 경쟁 억제 방법의 원리는 샘플에서 항원들이 고체상 항체에 결합하기 위한 다량의 표지된 항원과 경쟁한다. 샘플에 있는 항원의 함유량이 더 높을 때, 고체상에 접합된 표지된 항원의 함유량이 더 적다.

키트는 하기 조성물을 포함한다:

시약 A. 루테늄 피리딘에 의해 표지된 FT3 항원

시약 B. FT3 항원에 대한 바이오틴화된 항체

시약 C. SA로 코팅된 마그네틱 입자들

시약 D. 디부틸 에탄올아민 용액

시약 E. 세척 용액: 0.05 M 인산 완충용액(pH 7.4) 및 0.05% 트윈-20

검출을 위한 단계:

(1) 시약 A 및 B, 및 실험되는 샘플 혈청이 시험관에 첨가되었고, 그리고 37℃에서 8 분 동안 액체상 상태 하에 반응되었다.

(6) 농도 구배에 따른 표준 용액들은 제제화 되었고, 그리고 도 4에 나타낸 바와 같이, 발광 강도의 값에 있어서 변화에 대한 대수 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응 곡선이 그려지고 그리고 실험된 샘플에서 실험된 항원의 농도가 계산에 의해 얻어졌다.

실시예 6: 본 발명에 따른 방법의 감도 및 검출 한계의 측정

UDECL 전기화학발광 분석기가 사용되었다. 광전자증배관의 고접압은 900 v로 설정되고, 스캐닝(scanning) 전압이 0.2 내기 1.6 v였고, 스캐닝 속도는 150 mV/s였고, 그리고 사용된 작동 전극은 Pt 전극이었다. 완충용액은 0.05 M 인산 완충용액(pH 7.4) 및 0.05% 트윈-20이었다. 본 방법에 따른 방법의 검출 한계(detection limit)를 측정하기 위하여, 용액의 발광 신호가 탐색되었다.

농도 구배에 따른 표준 용액들은 제제화 되었고, 그리고 발광 강도의 값에 있어서 변화에 대한 대수 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응 곡선이 그려졌고, 그리고 이들이 좋은 선형 관계에 있었음이 발견되었다.

알카라인 포스파타아제(alkaline phosphates) 및 루미놀(luminol)을 포함한 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)의 반응 시스템과 같은, 화학발광 면역분석의 효소 검출 방법(enzymic detection method)의 감도는 일반적으로 0.12 mIU/L였고; 종래의 전기화학 방법들의 감도의 검출 범위는 0.005 내지 100 μIU/ml이고, 그리고 본 발명에 따른 방법의 검출 범위는 0.001 내지 100 μIU/ml이다. 전기화학발광 방법의 전기화학발광 면역분석의 검출 범위는 ELISA의 검출 범위보다 더 넓다.

본 발명에 의해 제안되는 전기화학발광 면역분석 방법은 실시예에 의해 설명되고, 그리고 본 발명에서 밝힌 기술들을 달성하기 위하여, 본 발명의 내용들, 의도 및 범위에 벗어남 없이, 변형 또는 적절한 변경 및 조이 당업계에 숙련된 기술자들에 의해 본 발명에 따른 전기화학발광 면역분석 방법에서 일어날 수 있음이 명확하다. 특히, 모든 유사한 치환 및 변형이 당업계에 숙련된 기술자들에게 명확하고, 그리고 이들은 모두 본 발명의 의도, 범위 및 내용들 내에 있다고 여기어 지는 것이 지적되어야 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 전기화학발광(electrochemiluminescence) 면역분석(immunoassay) 방법:
단계 1: 단백질에 대한 루테늄 피리딘(ruthenium pyridine)-표지된 일차 항체가 실험되고 그리고 단백질에 대한 바이오틴화된(biotinylated) 이차 항체가 실험되는 샘플에 효율적으로 반응하는 것이 실험되는 것을 가능하게 하거나, 또는 단백질에 대한 루테늄 피리딘-표지된 항체가 실험되고 그리고 바이오틴화된 항체가 실험되는 샘플에 효율적으로 반응하는 것이 실험되는 것을 가능하게 하고, 여기서 상기 루테늄 피리딘의 구조는 하기와 같은 단계:

;
단계 2: 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된(coated) 마그네틱 입자들 (magnetic particles)을 첨가하고, 항원, 항체 및 마그네틱 입자를 포함하는 복합체를 형성하기 위한 반응을 가능하게 하고, 유동셀(flow cell)에서 상기 항체, 항원 및 마그네틱 입자를 포함하는 복합체가 마그네틱 입자를 통해 전극(electrode)의 표면으로 흡착되는, 상기 유동셀에 반응액을 빨아들이는(sucking) 단계;
단계 3: 디부틸 에탄올아민(dibutyl ethanolamine) 용액을 첨가하고, 전압을 인가함으로써 ECL 반응을 시작하고, 그리고 광학검출기(optical detector)로 스캔된(scanned) 광학 신호들을 수집하는 단계;
단계 4: 농도 구배로 표준 용액을 제제화하고, 발광 강도(luminescence intensity)의 값에 있어서 변화에 대한 대수(logarithm) 및 농도에 대한 대수에 따라 용량-반응(dose-response) 곡선을 그리고, 그리고 계산에 의해 실험된 샘플에서 실험된 단백질의 농도를 구하는 단계;
여기서 상기 마그네틱 입자는 2.8 μm의 직경을 가지는 폴리스티렌 (polystyrene) 입자이며;
단계 1에서 반응 조건은 37℃에서 8 분 동안 액체상 상태 하에 반응시키는 것이며;
단계 2에서 반응 조건은 37℃에서 8 분 동안 액체상 상태 하에 반응시키는 것이며;
실험될 샘플은 혈청(serum), 소변(urine), 또는 조직액(tissue fluid)이며;
실험될 단백질은 T3 트리요오드티로닌(triiodothyronine), ASA 항-정자(anti-sperm) 항체, 트로포닌 I(troponin I), T4 티록신(thyroxine), ACA 항카티오리핀(anticardiolipin) 항체, CKMB, TSH, AEA 항-자궁내막(anti-endometrium) 항체, FT3 자유 트리요오드티로닌(free triiodothyronine), AOA 항-난소(anti-ovarian) 항체, FT4 자유 티록신(free thyroxine), ATB 항-영양막(anti-trophoblast) 항체, 항-TM 갑상샘마이크로좀(thyroid microsomal) 항체, ZP 항-투명대(anti-zona pellucida) 항체, 항-TG 항-티로글로블린(anti-thyroglobulin) 항체, 항-HCG 항체, 인간 태반 락토진(human placental lactogen) , 항-TPO 갑상선 과산화효소(thyroid peroxidase) 항체, HCG, TOX 톡소플라즈마(toxoplasma) 항체, FSH, AFP 알파페토단백질(alpha-fetoprotein), CEA 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen), PSA 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen), FPSA 자유 전립선 특이 항원(free prostate-specific antigen), CMV 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 항체, LH 황체형성호르몬(luteinizing hormone), HSV-1 단순포진바이러스(herpes simplex virus) 항체, PRL 프로락틴(prolactin), HSV-2 단순포진바이러스 항체, TES 테스토스테론(testosterone), RV 풍진바이러스(rubella virus) 항체, PRO 프로게스테론(progesterone), 페리틴(Ferritin), TOX-Ag 톡소플라즘 순환 항원(toxoplasm circulating antigen), E2 에스트라디올(estradiol), CA125, E3 에스트리올(estriol), CA153, CA199, HBsAg, NSE 뉴런특이에놀라아제(neuron-specific enolase), HBsAb, CA50, HBeAg, β2 마이크로글로블린(microglobulin), HBeAb, 콕삭키바이러스(Coxsackie virus) 항체, HBcAb, BGP 골 Gla 단백질(bone Gla protein), D-Pyr 데옥시피리디놀린( deoxypyridinoline), 비타민 D(vitamin D), 인슐린(insulin), PCIII III형 프로콜라겐(type III procollagen), C-펩타이드(C-peptide), IV 형 콜라겐(type IV collagen), 인슐린 항체, LN 라미닌(laminin), 글루카곤(glucagon), HA 히알루론산(hyaluronic acid), GAD-AB 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase) 항체, Fn 피브로넥틴(fibronectin), 인플루엔자 바이러스 B(influenza virus B), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), EB 바이러스, 홍역 바이러스(measles virus), 미코플라즈마 뉴모니아((Mycoplasma pneumoniae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 멈프스 바이러스(mumps virus), HCV 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 아데노바이러스(adenovirus), RSV 호흡기세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 에코바이러스(Echovirus), 및 프로-가스트린-유리 펩타이드(pro-gastrin-releasing peptide), CYFRA21-1, AFP, APT, CA242, CA724, CA50, f-PSA, t-PSA, 자유 β-hCG(Free β-hCG), 또는 SCCA를 포함.
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하기 조성물을 포함하는, 전기화학발광 면역분석을 위한 키트: 실험될 단백질에 대한 루테늄 피리딘-표지된 일차 항체, 실험될 단백질에 대한 바이오틴화된 이차 항체, 스트렙타비딘-코팅된 마그네틱 입자, 및 디-엔-부틸 에탄올아민(di-n-butyl ethanolamine) 용액;
여기서 상기 루테늄 피리딘의 구조는 하기와 같으며,

;
실험될 단백질은 T3 트리요오드티로닌(triiodothyronine), ASA 항-정자(anti-sperm) 항체, 트로포닌 I(troponin I), T4 티록신(thyroxine), ACA 항카티오리핀(anticardiolipin) 항체, CKMB, TSH, AEA 항-자궁내막(anti-endometrium) 항체, FT3 자유 트리요오드티로닌(free triiodothyronine), AOA 항-난소(anti-ovarian) 항체, FT4 자유 티록신(free thyroxine), ATB 항-영양막(anti-trophoblast) 항체, 항-TM 갑상샘마이크로좀(thyroid microsomal) 항체, ZP 항-투명대(anti-zona pellucida) 항체, 항-TG 항-티로글로블린(anti-thyroglobulin) 항체, 항-HCG 항체, 인간 태반 락토진(human placental lactogen) , 항-TPO 갑상선 과산화효소(thyroid peroxidase) 항체, HCG, TOX 톡소플라즈마(toxoplasma) 항체, FSH, AFP 알파페토단백질(alpha-fetoprotein), CEA 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen), PSA 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen), FPSA 자유 전립선 특이 항원(free prostate-specific antigen), CMV 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 항체, LH 황체형성호르몬(luteinizing hormone), HSV-1 단순포진바이러스(herpes simplex virus) 항체, PRL 프로락틴(prolactin), HSV-2 단순포진바이러스 항체, TES 테스토스테론(testosterone), RV 풍진바이러스(rubella virus) 항체, PRO 프로게스테론(progesterone), 페리틴(Ferritin), TOX-Ag 톡소플라즘 순환 항원(toxoplasm circulating antigen), E2 에스트라디올(estradiol), CA125, E3 에스트리올(estriol), CA153, CA199, HBsAg, NSE 뉴런특이에놀라아제(neuron-specific enolase), HBsAb, CA50, HBeAg, β2 마이크로글로블린(microglobulin), HBeAb, 콕삭키바이러스(Coxsackie virus) 항체, HBcAb, BGP 골 Gla 단백질(bone Gla protein), D-Pyr 데옥시피리디놀린( deoxypyridinoline), 비타민 D(vitamin D), 인슐린(insulin), PCIII III형 프로콜라겐(type III procollagen), C-펩타이드(C-peptide), IV 형 콜라겐(type IV collagen), 인슐린 항체, LN 라미닌(laminin), 글루카곤(glucagon), HA 히알루론산(hyaluronic acid), GAD-AB 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase) 항체, Fn 피브로넥틴(fibronectin), 인플루엔자 바이러스 B(influenza virus B), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), EB 바이러스, 홍역 바이러스(measles virus), 미코플라즈마 뉴모니아((Mycoplasma pneumoniae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 멈프스 바이러스(mumps virus), HCV 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 아데노바이러스(adenovirus), RSV 호흡기세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 에코바이러스(Echovirus), 및 프로-가스트린-유리 펩타이드(pro-gastrin-releasing peptide), CYFRA21-1, AFP, APT, CA242, CA724, CA50, f-PSA, t-PSA, 자유 β-hCG(Free β-hCG), 또는 SCCA를 포함.
제 5항에 있어서, 상기 키트는 추가적으로 세척 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6항에 있어서, 상기 세척 용액은 0.05% 트윈-20(Tween-20)을 포함한 0.05 mol/L 인산 완충용액(phosphate buffer)(pH 7.4)인 것을 특징으로 하는 키트.