JP3290193B2 - 被分析物質の測定方法 - Google Patents

被分析物質の測定方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は液体・固相間の標識物質
分配を測定する分析方法に関する。アッセイには微粒状
あるいはモノリスの例えばコーティングされたチューブ
であってよい固相試薬が包含される。このタイプのアッ
セイは自体当業者に知られ、そしてイムノアッセイおよ
びイムノメトリックアッセイを含有する。
【０００２】
【従来の技術】多くの場合において、試薬をインキュベ
ートした後には、液相からの固相分離が伴う（いわゆる
不均一または固相イムノメトリック測定）。微粒状固相
は沈降、遠心分離、濾過または磁場により液相から除く
ことができる。
【０００３】かかるイムノアッセイに用いる固相も同じ
く当業者に知られており、また文献に知られている。例
えば、VOLLER, A. et al.,Bull. World Health Org. 5
3, 55〜65 (1976）を参照されたい。
【０００４】懸濁され得るが液相には不溶である磁化可
能な粒子には磁場において液相から速かに取り出せると
いう利点がある。
【０００５】磁性粒子を用いた被分析物質（analyte）
の測定方法は例えば米国特許第4,554,088号、同第3,93
3,997号、および欧州特許出願EP 0 136 126に記載され
ている。ラジオアイソトープで標識された物質がこれら
の方法で被分析物質を測定するために用いられている。
【０００６】これら前述の方法には、潜在的な害が知ら
れ、従って取扱いおよび廃棄物処理が困難なラジオアイ
ソトープの使用に限られるという重大な欠点がある。
【０００７】ラジオアイソトープを標識として用いる代
わりに今では酵素、従って酵素イムノアッセイが広く用
いられている。この方法では、標識されるべき試薬は酵
素に連結され、そして固相レセプター／被分析物質複合
体または固相レセプター／被分析物質／レセプター複合
体の形成後、その酵素の基質とインキュベートされる。
その段階で酵素反応により、有色の、発光性のまたは蛍
光性の基質誘導体が生成する。反応完了後に、放射活性
の代わりに測定されるのは吸収、発光または蛍光であ
る。
【０００８】磁気的に除去自在の適切な粒子は例えば酸
化鉄粒子を含んでいる故に固有の色を有している。それ
らは、それらのサイズおよびそれらのマグネタイト含量
の関数として光を吸収する。この粒子による固有の吸収
は吸収、発光または蛍光の測定における信号を非特異的
に減少させてしまう。吸光度は、就中、磁性粒子の使用
量に依存する。
【０００９】さらに、もちろんのことではあるが、前述
の依存性は、程度の差はあるが、磁力による引力を受け
ない粒子にもあてはまる。
【００１０】特許出願EP 0 177 191は、固相としての磁
性粒子、酵素／被分析物質接合体および信号発出試薬と
しての発色原性基質を用いた不均一酵素イムノアッセイ
を記載している。吸収を測定する前に磁性粒子を除去し
なければならない。この方法の欠点は信号を発生させる
ために通常２０〜６０分というさらなるインキュベーシ
ョン段階を付加的に踏む必要がある点である。すなわち
この方法は、ラジオアイソトープを用いる相当する方法
よりも時間および労力の消費が相当に大きくならざるを
得ない。もう一つの欠点は、この方法が直接の化学発光
または蛍光標識を用いる不均一イムノアッセイには使用
できない点である。
【００１１】このことは、文献に開示されそして例えば
特許出願EP 0 149 565に用いられているような酵素−強
化発光系においては不可能である。その場合にはレミノ
ール型の基質を刺激して発光させるのにペルオキシダー
ゼが用いられる。この方法においてレセプターと酵素の
複合体を担持する粒子を除去することは、化学発光発生
がもはや可能でなくなる、つまり信号も全く測定できな
いことを意味している。
【００１２】米国特許第4,576,912号は蛍光団を担体分
子を介して特異結合パートナーに結合させる方法を開示
している。その蛍光団は未結合接合体を除去した後に担
体分子の化学的または酵素的加水分解によって遊離さ
れ、またこの加水分解は典型的には６０分間かかる。化
学発光標識はこの特許では考慮されていない。
【００１３】EP 0 149 565に記載の方法は、技術水準を
代表している。この特許出願は懸濁磁性粒子の存在下の
化学発光および蛍光の測定を記載している。光の吸収に
かかわらずアッセイの実施が可能な磁性粒子の狭い濃度
範囲がそこに示されている（図１も参照）。しかしなが
ら、本発明が示すように、これだからといって表面積が
大きく拡散行程（diffusion pathway）が短いといった
磁性粒子技術の利点が消尽しているわけではない。
【００１４】
【課題を解決するための手段】今般、驚くべきことに、
適切な物質を添加することにより標識試薬の信号を、該
標識を脱着させそして固相の除去後に干渉なく測定でき
ることを見出した。測定された信号は被分析物質の使用
濃度に対し厳密な関係を示す。
【００１５】本発明による方法により、EP 0 149 565に
記載の方法よりも著しく大きい信号収率(signal yield)
および信号ダイナミクスの向上が達成される(図２も参
照)。
【００１６】これによって特定の作用機構を明記したい
わけではないが、本発明による物質は固相との標識担持
複合体をスプリットさせ、そして標識を適切な形で遊離
させるものと推定される。
【００１７】今般、本発明により固相を高濃度で用いる
ことができる。さらに表面積が増大するために、被分析
物質に比べ大過剰で固相レセプターを用いることができ
る。さらにまた、拡散行程が相当短くなる。それら二つ
の作用は平衡の位置およびアッセイの反応速度に有益な
影響を与える。
【００１８】
【詳細な記述】本発明は、方法中に以下の段階を含む液
体媒質中の被分析物質を測定するための不均一免疫化学
的方法に関する： −被分析物質含有検体を、磁気的に引きつけ自在の固相
試薬と、及び発光団（luminophore）または蛍光団（flu
orophore）で標識された試薬と反応容器内でインキュベ
ートして標識された試薬を被分析物質濃度の関数として
液相と磁気的に引きつけ自在の粒子との間に分配させ
る。 −固相粒子から液相を除去する。 −粒子を試薬Ａに再懸濁し、該粒子を除去する。 −上清中の発光（luminescence）または蛍光反応を生起
させそして測定する。（ここで試薬Ａは標識を固相から
脱着させるのに適している。）
【００１９】適切な場合には、洗浄段階を個々の段階の
間にはさむこともできる。
【００２０】この方法は、原則として、例えば酵素活性
または放射活性をマーカーとして測定する系に対しても
適しているが、蛍光または化学発光標識に関連して用い
るのが特に有利であり、そして化学発光標識が好まし
い。
【００２１】文献には様々な化学発光系が記載されてい
るが、これらのうち、ルミノール、イソルミノールおよ
びアクリジニウム誘導体が主として重要なものとなって
いる。ルミノールおよびイソルミノール誘導体はH.R. S
chroeder et al. “Methodsin Enzymology" Academic P
ress Inc, New York, VolLVII 424 et seq.に記載され
ている。標識付与物質としてのアクリジニウム誘導体の
使用はWeeks et al.(Clin. Chem 29/8, 1983, 1474〜14
79）に記載されている。アクリジニウム誘導体の化学発
光はアルカリ性Ｈ2Ｏ2の添加により開始させることがで
き、また数秒以内に測定できる。
【００２２】これら化合物には、酵素強化発光系とは対
照的に、信号を誘出するために更なるインキュベーショ
ン段階が不要であるという標識付与試薬としての利点が
ある。さらにまたアクリジニウム化合物は本発明に使用
される諸試薬に対して安定である。
【００２３】好ましい化学発光標識はEP 0 257 541およ
びEP 0 330 050に記載のアクリジニウム化合物である。
【００２４】本発明に用いる磁気的に引きつけ自在の粒
子の厳密な構成は自体、当業者に知られていて本発明に
ついては実質的に重要ではないが、有利には複合粒子ま
たは純マグネタイト粒子として設計できる超常磁性粒子
が好ましい。さらに原則として磁化できない粒子を用い
ることもできるが、その場合にはその分離方法は、例え
ば遠心分離またはクロマトグラフィーなど特定の粒子に
適切なものでなければならない。かかる微粒状固相も、
例えば有色または無色のいずれでもよいラテックス粒子
など、当業者に知られている。
【００２５】前記粒子は好ましくは、０.１〜５.０μｍ
のサイズを有し、また０.２〜２.５μｍの範囲が特に好
ましく、０.２〜１.０μｍが格別に好ましい。
【００２６】粒子全質量が同じ場合に全体として数も表
面積も多い小粒子をアッセイに用いるのが有利である。
粒子数が多いということは、所与の容量における粒子間
距離が極めて小さいことを意味し、その結果、溶存非分
析物質の、および標識物質の粒子表面積への拡散行程が
極めて小さいものとなる。従って、固相に結合したレセ
プター複合体の形成に導く反応の速度が増加する。さら
に、固相の総表面積が大きいためにレセプター濃度を増
加させることができるようになる。レセプター濃度が高
いと被分析物質の結合が広範囲となり、また同じく反応
速度も増加する。
【００２７】しかしながら、磁気的に除去自在の複合小
粒子は、実用的な時間内に反応溶液から除去できるよう
にするには、大きな割合の磁化可能な材料を必要とす
る。粒子懸濁液による光の吸収は、特に、その性質、サ
イズ、磁性材料の含量および粒子使用濃度に依存する。
従来の技術に記載されているように、懸濁粒子の存在下
に信号を測定すると、例えば血清中のＴＳＨを測定する
ためのアッセイにおける測定可能信号は、混合物あたり
の粒子数の増加に伴い最大値を通過する。これらの条件
下において至適である粒子量を超えると、光の吸収量の
増加が標識試薬結合の増加により得られる付加的化学発
光を超えてしまう（図１）。
【００２８】従って、本発明による方法によってのみ、
磁気的に除去自在の粒子を十分に広い濃度範囲で用いる
ことができるようになる。
【００２９】本発明に用いられる脱着試薬は次の要件を
満たす： −水素結合およびイオン性、疎水性およびファン・デル
・ワールス相互作用より本質的に成る少くとも一つの分
子間結合を除去する。 −光の吸収による化学発光反応の障害がない。 −発光団の励起状態のクエンテングがない。 −アルカリ性Ｈ2Ｏ2溶液と反応しない。 −磁性粒子の磁気による除去自在性が障害されない。 −磁性粒子を溶解したり凝集したりしない。
【００３０】これらの条件に満たす試薬には、例えば、
カオトロピック試薬、イオン性洗剤、一部の有機溶媒、
およびpHを１.５〜３の範囲に調節するのに適した緩衝
物質が包含される。下記において例示として挙げられる
試薬のほか、前述の要件を満たす極めて多くの他の試薬
およびそれらの組合せが考えられる。それらの一部は実
施例に用いられている。
【００３１】
【表１】
【００３２】これらの試薬は単独であるいは組合せとし
て用いることができる。
【００３３】基本的に当業者は各種濃度を用いたいくつ
かの実験によって特定の物質または物質の組合せについ
ての至適条件を容易に確立することができる。
【００３４】実施例に示された具体例は特に好ましい。
【００３５】本発明は原則として標識試薬の液相・固相
間分配を測定する方法に用いることができる。
【００３６】この方法の過程において、固相、被分析物
質および標識試薬は同時にまたは逐次的に適当な時間イ
ンキュベートされる。インキュベーションの後、固相を
除去し、次いで脱着試薬に懸濁しそして短時間インキュ
ベートする。粒子を再び除去し、そして上清を測定す
る。多数の検体を同時に検査するときのステップ順序は
典型的には次のとおりである：
【００３７】Ａ． 懸濁された磁気的に引きつけ自在の
粒子、検体、標準および標識試薬をピペットで反応容器
に移す。 Ｂ． 反応混合物を含む容器を所要の温度で規定時間イ
ンキュベートする。 Ｃ． 使用容器に適したマグネット装置を用いて磁性粒
子を除去する。 Ｄ． 適切なピペット、ポンプまたは真空で吸引するこ
とにより上清を除去する。 Ｅ． 洗浄用緩衝液の添加および吸引除去を反復する。 Ｆ． 磁化可能な粒子の除去に用いた磁場を除去または
スイッチ・オフし、そして磁性粒子を脱着試薬に再懸濁
する。 Ｇ． マグネット系を用いて粒子を除去し、その上清を
適当な容器に移しそして標識を測定する。
【００３８】特許請求の範囲も開示の一部を形成する。
【００３９】以下の実施例は本発明の例示に役立つもの
であるが、それをいささかも限定するものではない。特
に断りのない限り、ローヌ・プーラン（Rhone Poulen
c）社により供給されたEstaporR 粒子（０.３５μｍ）
が磁気的に除去自在の粒子として用いられる。
【００４０】実施例１ 従来技術によるヒト甲状腺刺激ホルモンの測定 （懸濁液中の測定）以下の試薬をポリスチレンチューブ
中で共にインキュベートした： −モノクローナル抗−ｈＴＳＨ抗体でコーティングされ
た磁気的に除去自在の粒子、０.００６mg、０.０１３m
g、０.０１９mg、０.０２５mg、０.０５０mg、０.０７
５mg、０.１mgおよび０.１２５mg。 −ヒト血清中の５０μＩＵ／ml ｈＴＳＨ溶液１００μ
ｌ。 −アクリジニウム誘導体に接合されたモノクローナル抗
体の溶液４０μｌ。 −粒子を懸濁させる。 −その懸濁液を３７℃で１５分間インキュベートする。 −Gene-Trak社により供給される分離系を用いて粒子を
除去し、そして上清を吸引により除去する。 −３００μｌの洗浄用緩衝液を除去された粒子に４回添
加しその都度再び吸引除去する。 −次いで粒子を１００μｌの洗浄用緩衝液に再懸濁させ
る。 −そしてポリプロピレンチューブ（１ml）に移す。これ
らチューブをポリスチレンチューブ（５ml）に入れる。
３００μｌの０.１Ｎ硝酸および０.５％Ｈ2Ｏ2および３
００μｌの０.２５Ｎ水酸化ナトリウム溶液の添加によ
り化学発光を生起させそしてBerthold社により供給され
る発光測定装置（型式LB 952 T）で測定する（図１参
照）。
【００４１】実施例２ ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）の測定 以下の試薬をポリスチレンチューブ中で共にインキュベ
ートした： −モノクローナル抗−ｈＴＳＨ抗体でコーティングされ
た磁気的に除去自在の粒子０.０２５mg、０.１２５mgお
よび０.２５０mg。 −ヒト血清中の５０μＩＵ／ml溶液１００μｌ。 −アクリジニウム誘導体に接合されたモノクローナル抗
体の溶液４０μｌ。 −粒子を懸濁させる。 −その懸濁液を３７℃で１５分間インキュベートする。 −Gene-Trak社により供給された分離系により粒子を除
去し、そしてその上清を吸引により除去する。 −除去された粒子に３００μｌの洗浄用緩衝液を４回添
加しそしてその都度吸引により除去する。 −次にそれら粒子を１００μｌの除去試薬に再懸濁し、
そして次に、 ａ） その懸濁液を測定に用いる、 ｂ） 脱着させた磁性粒子を除去しそしてその上清を測
定に用いる、 ｃ） ｂ）で除去された磁性粒子を１００μｌの洗浄用
緩衝液に再懸濁しそしてこの懸濁液を測定に用いる。 −測定に用いられる検体をポリプロピレンチューブ（１
ml）に移す。それらチューブをポリスチレンチューブ
（５ml）に入れる。３００μｌの０.１Ｎ硝酸および０.
５％Ｈ2Ｏ2および３００μｌの０.２５Ｎ水酸化ナトリ
ウム溶液の添加により化学発光を生起させそして測定す
る。
【００４２】
【表２】
【００４３】脱着試薬： 1) グアニジウムＨＣｌ ３mol/リットル、pH４ 2) 尿素 ５mol／リットル、pH４ 3) ＳＤＳ １ｇ／100mlの10mmol／リットル リン酸
ナトリウム緩衝液、pH６ 4) ＤＭＦ ６０％（w／v） これらのデータは図２にグラフとして示されている。
【００４４】実施例３ ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）の測定 以下の試薬をFlowチューブ内で共にインキュベートし
た： −モノクローナル抗−ｈＴＳＨ抗体でコーティングされ
た磁気的に除去自在の粒子、０.１２５mg。 −ヒト血清中のｈＴＳＨの標準溶液１００μｌ。 −アクリジニウム誘導体に接合されたモノクローナル抗
体の溶液４０μｌ。 −粒子を懸濁させる。 −その懸濁液を３７℃で１５分間インキュベートする。 −Gene-Trak社により供給された分離系を用いて粒子を
除去し、そして上清を吸引により除去する。 −除去された粒子に３００μｌの洗浄用緩衝液を４回添
加した。 −次にそれら粒子を１００μｌの除去試薬に再懸濁し、
次いで前記分離系に２分間置いた。 −その上清を除去しそしてFlowチューブに移す。それら
FlowチューブをSarstedtチューブに入れる。３００μｌ
の０.１Ｎ硝酸および0.5％Ｈ2Ｏ2および３００μｌの
０.２５水酸化ナトリウム溶液の添加により化学発光を
生起させそして発光測定装置で測定する。
【００４５】
【表３】 これらのデータは図３にグラフとして示されている。
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＴＳＨアッセイに用いた粒子量と信号との相
関例（従来技術）を示す図である。
【図２】ｈＴＳＨアッセイにおける信号検出前の磁性粒
子分離例を示す図である。
【図３】ｈＴＳＨアッセイにおける信号検出前の磁性粒
子分離例（標準曲線）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/543 G01N 33/553

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）被分析物質含有検体を、第１の特
    異結合パートナーを固定した微粒状固相と、そして液相
    中で蛍光または化学発光を生起する第２の特異結合パー
    トナーとをインキュベートし、第２の特異結合パートナ
    ーを被分析物質濃度の関数として液相と固相との間に分
    配させる、 （ｂ）固相から液相を除去する、 （ｃ）液体試薬Ａ中に固相を再懸濁する、ここで試薬Ａ
    は、水素結合、イオン性、疎水性およびファン・デル・
    ワールス相互作用より成る少なくとも一つの分子間結合
    を除去することにより、固相から標識を脱着させるのに
    適するものであり、さらに −光の吸収により化学発光反応の光収率を減じない −発光団の励起状態を減じない −アルカリ性Ｈ2Ｏ2と反応しない −磁性粒子の磁気による除去能を減じない、および −磁性粒子を溶解または凝集させないものである、 （ｄ）液相から固相を除去する、次いで （ｅ）検体中の被検物質量の測定として、固相から脱着
    した液相中の標識の量を測定する、 段階からなる、液体媒質中の被分析物質を測定するため
    の不均一免疫化学的方法。
  2. 【請求項２】 微粒状固相が磁気的に吸引可能であり、
    固相が液相から磁力により除去される請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 第２の特異結合パートナーが化学発光標
    識を生起するものである請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 試薬Ａが化学発光の生起に必要な試薬の
    一部分である請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 試薬Ａが水性溶液中に以下の試薬群： −カオトロピック試薬 −イオン性洗剤 −有機溶媒 −pH域１.５〜３の緩衝剤 の一物質、または少なくとも二物質の組合せを含有する
    請求項１または２記載の方法。
  6. 【請求項６】 試薬Ａが水性溶液中に以下の試薬群： −ＫＳＣＮ −塩酸グアニジニウム −ＣａＣｌ2 −ＮａＣｌＯ4 −テトラ−Ｎ−ブチル−アンモニウムクロライド −テトラメチルアンモニウムクロライド −尿素 −ＳＤＳ −プロピオン酸 −エチレングリコール −ＤＭＦ −pH域１.５〜５のグリシン の一物質、または少なくとも二物質の組合せを含有する
    請求項１記載の方法。
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