JPH07146293A - 免疫測定法 - Google Patents
免疫測定法Info
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- JPH07146293A JPH07146293A JP29546793A JP29546793A JPH07146293A JP H07146293 A JPH07146293 A JP H07146293A JP 29546793 A JP29546793 A JP 29546793A JP 29546793 A JP29546793 A JP 29546793A JP H07146293 A JPH07146293 A JP H07146293A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】遊離型のサイロキシン量を測定する競合法の酵
素免疫測定法において、測定対象の遊離型のサイロキシ
ンを、あらかじめ結合させておいた抗サイロキシン抗体
を利用して、磁性化されたミクロビーズに固定化する。
残存している固定化抗体量を、標識化サイロキシンを用
いて化学発光法で測定する事により測定対象の遊離型の
サイロキシン量を算出する。 【効果】抗サイロキシン抗体を結合した磁性化ミクロビ
ーズを用いる事により検体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 と
の競合反応時間を短縮し、さらに免疫反応で形成された
酵素標識Ｔ4 を化学発光法で測定する事により酵素反応
時間を短縮することによって、迅速に血中のＦＴ4 量を
酵素免疫法で測定する。
素免疫測定法において、測定対象の遊離型のサイロキシ
ンを、あらかじめ結合させておいた抗サイロキシン抗体
を利用して、磁性化されたミクロビーズに固定化する。
残存している固定化抗体量を、標識化サイロキシンを用
いて化学発光法で測定する事により測定対象の遊離型の
サイロキシン量を算出する。 【効果】抗サイロキシン抗体を結合した磁性化ミクロビ
ーズを用いる事により検体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 と
の競合反応時間を短縮し、さらに免疫反応で形成された
酵素標識Ｔ4 を化学発光法で測定する事により酵素反応
時間を短縮することによって、迅速に血中のＦＴ4 量を
酵素免疫法で測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法に関する。
さらに詳しくは、遊離型のサイロキシン量を測定する競
合法の酵素免疫測定法において、まず測定対象の遊離型
のサイロキシンを、あらかじめ結合させておいた抗サイ
ロキシン抗体を利用して、磁性化されたミクロビーズに
固定化する。そして残存している固定化抗体量を、標識
化サイロキシンを用いて化学発光法で測定する事により
測定対象の遊離型のサイロキシン量を算出する方法に関
する。
さらに詳しくは、遊離型のサイロキシン量を測定する競
合法の酵素免疫測定法において、まず測定対象の遊離型
のサイロキシンを、あらかじめ結合させておいた抗サイ
ロキシン抗体を利用して、磁性化されたミクロビーズに
固定化する。そして残存している固定化抗体量を、標識
化サイロキシンを用いて化学発光法で測定する事により
測定対象の遊離型のサイロキシン量を算出する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】Ｔ4 （サイロキシン）はＴ3 （トリヨー
ドサイロニン）とともに、甲状腺から分泌される甲状腺
ホルモンで、生体の種々の代謝調節に関与している。甲
状腺ホルモンの分泌は、下垂体からのＴＳＨ（甲状腺刺
激ホルモン）の刺激によりコントロールされているが甲
状腺ホルモンも、視床下部および下垂体に働いて、ネガ
ティブ・フィードバックによりＴＳＨ量を調節してい
る。血中において、Ｔ4 はその９９．９％以上が血中の
他の輸送蛋白質と結合した状態で存在しており、生理活
性をもつのは残りの極微量の遊離型のサイロキシン、Ｆ
Ｔ4 であることが分かっている。
ドサイロニン）とともに、甲状腺から分泌される甲状腺
ホルモンで、生体の種々の代謝調節に関与している。甲
状腺ホルモンの分泌は、下垂体からのＴＳＨ（甲状腺刺
激ホルモン）の刺激によりコントロールされているが甲
状腺ホルモンも、視床下部および下垂体に働いて、ネガ
ティブ・フィードバックによりＴＳＨ量を調節してい
る。血中において、Ｔ4 はその９９．９％以上が血中の
他の輸送蛋白質と結合した状態で存在しており、生理活
性をもつのは残りの極微量の遊離型のサイロキシン、Ｆ
Ｔ4 であることが分かっている。
【０００３】一方、生体成分の微量測定法として、免疫
測定法は複雑な組成の混合物の中から免疫反応で特異的
に選別できることから、通常の定量法に必要な対象物を
試料から分離する前処理が不要であり、しかも高感度・
高精度に定量できる特徴を持つ。また免疫測定法のう
ち、酵素標識を特徴とする酵素免疫測定法は、放射性同
位元素を用いる放射免疫測定法に比べて廉価で危険な廃
棄物を伴わず、測定の感度と精度の面で遜色ない事から
汎用されている。
測定法は複雑な組成の混合物の中から免疫反応で特異的
に選別できることから、通常の定量法に必要な対象物を
試料から分離する前処理が不要であり、しかも高感度・
高精度に定量できる特徴を持つ。また免疫測定法のう
ち、酵素標識を特徴とする酵素免疫測定法は、放射性同
位元素を用いる放射免疫測定法に比べて廉価で危険な廃
棄物を伴わず、測定の感度と精度の面で遜色ない事から
汎用されている。
【０００４】この酵素免疫測定法でＦＴ4 量を測定する
場合、競合法による各種の方法が開発され利用されてい
る。競合法とは、一般に、抗体を固相化した反応器中で
試料中の測定対象物と標識した測定対象物とを競合反応
させて、形成された固相上の免疫反応物の標識量を測る
ことにより測定対象物量を算出する方法である。
場合、競合法による各種の方法が開発され利用されてい
る。競合法とは、一般に、抗体を固相化した反応器中で
試料中の測定対象物と標識した測定対象物とを競合反応
させて、形成された固相上の免疫反応物の標識量を測る
ことにより測定対象物量を算出する方法である。
【０００５】典型的な実際例を示すと、まず第１抗体を
特異的に認識できる第２抗体を固相化した反応槽内で、
ＦＴ4 を特異的に認識する第１抗体に、検体中のＦＴ4
と酵素標識Ｔ4 とを一定時間競合反応させる。反応後
に、未反応成分を洗浄除去する。検体中のＦＴ4 が多け
れば第１抗体に結合できる酵素標識Ｔ4 量は減少し、反
応槽への結合量も減少する。次いで反応槽に結合した酵
素標識Ｔ4 に対し、基質として発色剤を加える。基質は
酵素によって発色反応を触媒され、一定時間後に酵素反
応を停止させる。酵素反応によって生成した物質の吸光
度の変化は検体中のＦＴ4 量に逆比例する。
特異的に認識できる第２抗体を固相化した反応槽内で、
ＦＴ4 を特異的に認識する第１抗体に、検体中のＦＴ4
と酵素標識Ｔ4 とを一定時間競合反応させる。反応後
に、未反応成分を洗浄除去する。検体中のＦＴ4 が多け
れば第１抗体に結合できる酵素標識Ｔ4 量は減少し、反
応槽への結合量も減少する。次いで反応槽に結合した酵
素標識Ｔ4 に対し、基質として発色剤を加える。基質は
酵素によって発色反応を触媒され、一定時間後に酵素反
応を停止させる。酵素反応によって生成した物質の吸光
度の変化は検体中のＦＴ4 量に逆比例する。
【０００６】血中のＦＴ4 量は極微量であるために、検
体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 との競合反応は一般に１時
間以上を有し、また酵素反応に基づく発色物質の蓄積に
も３０分を要することから、血中のＦＴ4 量を酵素免疫
法で測定するためには、従来、数時間以上が必要とされ
ていた。
体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 との競合反応は一般に１時
間以上を有し、また酵素反応に基づく発色物質の蓄積に
も３０分を要することから、血中のＦＴ4 量を酵素免疫
法で測定するためには、従来、数時間以上が必要とされ
ていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫測定法
に関する。さらに詳しくは、遊離型のサイロキシン量を
測定する競合法の酵素免疫測定法において、抗サイロキ
シン抗体を結合した磁性化ミクロビーズを用いる事によ
り検体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 との競合反応時間を短
縮し、さらに免疫反応で形成された酵素標識Ｔ4 を化学
発光法で測定する事により酵素反応時間を短縮すること
によって、迅速に血中のＦＴ4 量を酵素免疫法で測定す
る方法を提供する。
に関する。さらに詳しくは、遊離型のサイロキシン量を
測定する競合法の酵素免疫測定法において、抗サイロキ
シン抗体を結合した磁性化ミクロビーズを用いる事によ
り検体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 との競合反応時間を短
縮し、さらに免疫反応で形成された酵素標識Ｔ4 を化学
発光法で測定する事により酵素反応時間を短縮すること
によって、迅速に血中のＦＴ4 量を酵素免疫法で測定す
る方法を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題は、以下の本発
明によって解決できる。すなわち本発明は、固体担体と
して直径０．１〜１００μｍの磁性ミクロビーズを用い
ることを特徴とするサイロキシンの免疫測定法およびそ
の測定用キットに関するものであり、より好ましくは ａ）測定対象を含む試料と、測定対象と特異的に反応し
得る抗体を固体担体に固定させた固定化抗体とを反応さ
せる過程、 ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗体−測定対象結合物の残
存固定化抗体を、固定化抗体と特異的に反応する標識化
抗原と反応させる過程および、 ｃ）固定化担体に固定された結合物を、結合物中に含ま
れる標識を利用して検出する過程とを含む免疫測定法に
おいて、 固定化抗体としてサイロキシンと特異的に結合する抗体
を用い、固体担体として直径０．１〜１００μｍの磁性
ミクロビーズを用いることを特徴とする免疫測定法に関
するものである。
明によって解決できる。すなわち本発明は、固体担体と
して直径０．１〜１００μｍの磁性ミクロビーズを用い
ることを特徴とするサイロキシンの免疫測定法およびそ
の測定用キットに関するものであり、より好ましくは ａ）測定対象を含む試料と、測定対象と特異的に反応し
得る抗体を固体担体に固定させた固定化抗体とを反応さ
せる過程、 ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗体−測定対象結合物の残
存固定化抗体を、固定化抗体と特異的に反応する標識化
抗原と反応させる過程および、 ｃ）固定化担体に固定された結合物を、結合物中に含ま
れる標識を利用して検出する過程とを含む免疫測定法に
おいて、 固定化抗体としてサイロキシンと特異的に結合する抗体
を用い、固体担体として直径０．１〜１００μｍの磁性
ミクロビーズを用いることを特徴とする免疫測定法に関
するものである。
【０００９】サイロキシンと特異的に反応する固定化抗
体として使用される抗体は、あらかじめヒト・マウス・
ウサギ・ラット・ヤギ・ヒツジなどにサイロキシンを免
疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体などが適宜選択さ
れ利用できるが、好適には、血中のＦＴ4 量は極微量で
あることから、検体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 との競合
反応時間の短縮を目的として、親和性の優れた抗体を選
択して利用する事ができる。
体として使用される抗体は、あらかじめヒト・マウス・
ウサギ・ラット・ヤギ・ヒツジなどにサイロキシンを免
疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体などが適宜選択さ
れ利用できるが、好適には、血中のＦＴ4 量は極微量で
あることから、検体中のＦＴ4 と酵素標識Ｔ4 との競合
反応時間の短縮を目的として、親和性の優れた抗体を選
択して利用する事ができる。
【００１０】本発明において使用する固定化担体として
は、競合反応時間の短縮を目的とし、特開昭６０−１５
９６５１号，特開平３−１１５８６２号，ＷＯ８９／０
４３７３に示されている磁性化したミクロビーズが好適
に利用できる。また磁性化ミクロビ−ズの直径は０．１
〜１００μｍより好ましくは０．５〜１０μｍである。
は、競合反応時間の短縮を目的とし、特開昭６０−１５
９６５１号，特開平３−１１５８６２号，ＷＯ８９／０
４３７３に示されている磁性化したミクロビーズが好適
に利用できる。また磁性化ミクロビ−ズの直径は０．１
〜１００μｍより好ましくは０．５〜１０μｍである。
【００１１】標識化サイロキシンの標識として使用され
る酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
ウレアーゼ、各種のルシフェラーゼなどが挙げられる。
標識の酵素活性を検出する手段としては、測定機器の特
性によって適宜選択され、比色法・蛍光法・発光法など
が利用できる。標識化抗体の標識としては、酵素以外に
も発光物質・発光蛋白質や蛍光物質を利用する事が可能
である。
る酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
ウレアーゼ、各種のルシフェラーゼなどが挙げられる。
標識の酵素活性を検出する手段としては、測定機器の特
性によって適宜選択され、比色法・蛍光法・発光法など
が利用できる。標識化抗体の標識としては、酵素以外に
も発光物質・発光蛋白質や蛍光物質を利用する事が可能
である。
【００１２】酵素標識を用い検出を行なった場合、下記
に示されるような酵素反応時間の短縮を目的とし、同程
度以上の感度で酵素活性を短時間で検出できる発光法が
好適に利用できる。標識酵素としてペルオキシダーゼを
用いた場合、ＷＯ９０／１３６６５に開示された2-フェ
ニル，6-ヒドロキシ ベンゾオキサゾール、ＷＯ８３／
３１０４に記載された２−シアノ，６−ヒドロキシベン
ゾチアゾール等のエンハンサーを用いることにより、ル
ミノール発光反応を増強して感度を上昇させる事ができ
る。
に示されるような酵素反応時間の短縮を目的とし、同程
度以上の感度で酵素活性を短時間で検出できる発光法が
好適に利用できる。標識酵素としてペルオキシダーゼを
用いた場合、ＷＯ９０／１３６６５に開示された2-フェ
ニル，6-ヒドロキシ ベンゾオキサゾール、ＷＯ８３／
３１０４に記載された２−シアノ，６−ヒドロキシベン
ゾチアゾール等のエンハンサーを用いることにより、ル
ミノール発光反応を増強して感度を上昇させる事ができ
る。
【００１３】固定化抗体と特異的に反応する標識化抗原
として酵素標識されたサイロキシンを作製するために
は、酵素表面上の各種の官能基と、サイロキシンのアミ
ノ基とを結合させることによって達成できる。例えばグ
ルタルアルデヒド処理された酵素とサイロキシンを結合
させる方法、アミノ基と反応性を持つ二価性の反応試薬
で酵素とサイロキシンを架橋する方法、チオール基と特
異的に反応するマレイミド基を導入したサイロキシンを
酵素表面上のチオール基と反応させる方法、チオール基
を導入したチオール化サイロキシンと、マレイミド基を
導入した酵素とを結合する方法などが開発されている。
として酵素標識されたサイロキシンを作製するために
は、酵素表面上の各種の官能基と、サイロキシンのアミ
ノ基とを結合させることによって達成できる。例えばグ
ルタルアルデヒド処理された酵素とサイロキシンを結合
させる方法、アミノ基と反応性を持つ二価性の反応試薬
で酵素とサイロキシンを架橋する方法、チオール基と特
異的に反応するマレイミド基を導入したサイロキシンを
酵素表面上のチオール基と反応させる方法、チオール基
を導入したチオール化サイロキシンと、マレイミド基を
導入した酵素とを結合する方法などが開発されている。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【００１５】実施例１ １．抗体固相化磁性ビーズの作製 米・スクリップス社製抗Ｔ4 モノクローナル抗体を0.5
Ｍ ホウ酸溶液（pH9.5)に150 μｇ蛋白質／mlの濃度に
溶解した。
Ｍ ホウ酸溶液（pH9.5)に150 μｇ蛋白質／mlの濃度に
溶解した。
【００１６】ノルウェー・ダイナル社製磁性ビーズTosy
l-activated ビーズ（直径２．８μｍ，３０mg/ml)を同
じ容量加え、室温下で一昼夜反応させた。低速遠心（30
00ｒｐｍ、３分）でビーズを集め、上清を捨てた後、0.
01Ｍ生理的食塩水、 0.1％（W/V)牛血清アルブミンで１
０分づつ３回、３０分間１回、４℃で一晩洗浄して、同
緩衝液中に30mgビーズ/ml になるように懸濁して４℃で
保存した。
l-activated ビーズ（直径２．８μｍ，３０mg/ml)を同
じ容量加え、室温下で一昼夜反応させた。低速遠心（30
00ｒｐｍ、３分）でビーズを集め、上清を捨てた後、0.
01Ｍ生理的食塩水、 0.1％（W/V)牛血清アルブミンで１
０分づつ３回、３０分間１回、４℃で一晩洗浄して、同
緩衝液中に30mgビーズ/ml になるように懸濁して４℃で
保存した。
【００１７】２．標識化サイロキシンの作製 石川らの方法（J. Clin. Lab. Anal.;４ : 208(1990)）
により、米シグマ社製サイロキシンをドイツ・ベーリン
ガーマンハイム社製西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
化して、Ferruaらの方法（J. Immunol. Methods ;87: 1
37(1986)）で精製して用いた。
により、米シグマ社製サイロキシンをドイツ・ベーリン
ガーマンハイム社製西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
化して、Ferruaらの方法（J. Immunol. Methods ;87: 1
37(1986)）で精製して用いた。
【００１８】３．ＦＴ4 標準血清の作製 米バインディングサイト社より購入したヒトプール血清
を、２％(W/V) の活性炭で処理後、0.22μｍ径のミリポ
ア社製膜フィルターで濾過して血清中のサイロキシンを
除去して使用した。活性炭処理血清に過剰量のサイロキ
シンを添加して、血清中に遊離した ＦＴ4 量をアマシ
ャム社製アマレックス粒子法で決定して用いた。
を、２％(W/V) の活性炭で処理後、0.22μｍ径のミリポ
ア社製膜フィルターで濾過して血清中のサイロキシンを
除去して使用した。活性炭処理血清に過剰量のサイロキ
シンを添加して、血清中に遊離した ＦＴ4 量をアマシ
ャム社製アマレックス粒子法で決定して用いた。
【００１９】４．ＦＴ４ 量の測定 50μｌの０〜5.5ng/dlのＦＴ4 濃度を有する標準血清
と、 100μｌの0.25％（W/V)の牛血清アルブミンを含む
0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) に懸濁した３ｍ
ｇビーズ／ｍｌの抗体固相化磁性ビーズを混合し、37℃
で10分間保温した。磁性ビーズを磁気分離後、0.02％
（V/V) Tween20を含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(p
H7.4) で洗浄してから、0.25％（W/V)の牛血清アルブミ
ンを含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) に溶解
した 150μｌの10ｎｇ／mlの標識化サイロキシンを添加
して、37℃で15分間保温した。磁性ビーズを磁気分離し
ながら、0.02％（V/V) Tween20を含む0.01Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.4) で３回洗浄してから、ＷＯ９０／
１３６６５に開示された2-フェニル，6-ヒドロキシ ベ
ンゾオキサゾールをエンハンサーとして用いたルミノー
ル化学発光法により過酸化水素添加後37℃で５分間保温
した後に、発光量を測定した。相対発光強度は、10秒間
の発光量をアロカ社製ＢＬＲ−２０１ルミネッセンスリ
ーダーで積算した値で示した。表１に結果を示した。こ
のとき本発明によるＦＴ4 測定に要した全操作時間は30
分であり、下記の比較例の90分と比較して、健康者の正
常範囲（0.9〜2.1ng/dl）を含む検出領域が、より短時
間に測定できた。
と、 100μｌの0.25％（W/V)の牛血清アルブミンを含む
0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) に懸濁した３ｍ
ｇビーズ／ｍｌの抗体固相化磁性ビーズを混合し、37℃
で10分間保温した。磁性ビーズを磁気分離後、0.02％
（V/V) Tween20を含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(p
H7.4) で洗浄してから、0.25％（W/V)の牛血清アルブミ
ンを含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) に溶解
した 150μｌの10ｎｇ／mlの標識化サイロキシンを添加
して、37℃で15分間保温した。磁性ビーズを磁気分離し
ながら、0.02％（V/V) Tween20を含む0.01Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.4) で３回洗浄してから、ＷＯ９０／
１３６６５に開示された2-フェニル，6-ヒドロキシ ベ
ンゾオキサゾールをエンハンサーとして用いたルミノー
ル化学発光法により過酸化水素添加後37℃で５分間保温
した後に、発光量を測定した。相対発光強度は、10秒間
の発光量をアロカ社製ＢＬＲ−２０１ルミネッセンスリ
ーダーで積算した値で示した。表１に結果を示した。こ
のとき本発明によるＦＴ4 測定に要した全操作時間は30
分であり、下記の比較例の90分と比較して、健康者の正
常範囲（0.9〜2.1ng/dl）を含む検出領域が、より短時
間に測定できた。
【００２０】
【表１】 比較例１ １．抗体固相化チューブの作製 米・スクリップス社製抗Ｔ4 モノクローナル抗体を0.5
Ｍ ホウ酸溶液（pH9.5)に150 μｇ蛋白質／mlの濃度に
溶解した。５００μｌの抗体溶液を米・ヌンク社製ポリ
スチレンチューブに加え、４℃下で一昼夜反応させた。
抗体溶液を捨てた後、0.01Ｍ生理的食塩水、 0.1％（W/
V)牛血清アルブミンで１０分づつ３回、３０分間１回、
４℃で一晩洗浄して、同緩衝液中に４℃で保存した。
Ｍ ホウ酸溶液（pH9.5)に150 μｇ蛋白質／mlの濃度に
溶解した。５００μｌの抗体溶液を米・ヌンク社製ポリ
スチレンチューブに加え、４℃下で一昼夜反応させた。
抗体溶液を捨てた後、0.01Ｍ生理的食塩水、 0.1％（W/
V)牛血清アルブミンで１０分づつ３回、３０分間１回、
４℃で一晩洗浄して、同緩衝液中に４℃で保存した。
【００２１】２．ＦＴ４ 量の測定 20μｌの０〜5.5ng/dlのＦＴ4 濃度を有する標準血清と
500μｌの0.25％（W/V)牛血清アルブミンを含む0.01Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) を、抗体固相化ポリス
チレンチューブに添加し、室温化で30分間静置した。0.
02％（V/V) Tween20を含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.4) で洗浄してから、0.25％（W/V)の牛血清アル
ブミンを含む 0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)
に溶解した 500μｌの10ｎｇ／mlの標識化サイロキシン
を添加して、室温化で30分間静置した。0.02％（V/V) T
ween20を含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) で
３回洗浄してから、0.9mg/mlのO-フェニレンジアミン、
0.14％（w/w)の過酸化水素を含む１ｍｌの 100ｍＭリン
酸クエン酸ナトリウム緩衝液（pH4.4)を添加して、室温
化で30分間静置した。１ｍｌの３Ｎ硫酸を加えて酵素反
応を停止させ、 492ｎｍの吸光度を測定した。表２に結
果を示した。
500μｌの0.25％（W/V)牛血清アルブミンを含む0.01Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) を、抗体固相化ポリス
チレンチューブに添加し、室温化で30分間静置した。0.
02％（V/V) Tween20を含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.4) で洗浄してから、0.25％（W/V)の牛血清アル
ブミンを含む 0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)
に溶解した 500μｌの10ｎｇ／mlの標識化サイロキシン
を添加して、室温化で30分間静置した。0.02％（V/V) T
ween20を含む0.01Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) で
３回洗浄してから、0.9mg/mlのO-フェニレンジアミン、
0.14％（w/w)の過酸化水素を含む１ｍｌの 100ｍＭリン
酸クエン酸ナトリウム緩衝液（pH4.4)を添加して、室温
化で30分間静置した。１ｍｌの３Ｎ硫酸を加えて酵素反
応を停止させ、 492ｎｍの吸光度を測定した。表２に結
果を示した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【発明の効果】本発明によって、血中の遊離型サイロキ
シン量を測定する競合法の酵素免疫測定法において、迅
速に検出する方法が提供された。
シン量を測定する競合法の酵素免疫測定法において、迅
速に検出する方法が提供された。
Claims (4)
- 【請求項１】固体担体として直径０．１〜１００μｍの
磁性ミクロビーズを用いることを特徴とするサイロキシ
ンの免疫測定法。 - 【請求項２】ａ）測定対象を含む試料と、測定対象と特
異的に反応し得る抗体を固体担体に固定させた固定化抗
体とを反応させる過程、 ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗体−測定対象結合物の残
存固定化抗体を、固定化抗体と特異的に反応する標識化
抗原と反応させる過程および、 ｃ）固定化担体に固定された結合物を、結合物中に含ま
れる標識を利用して検出する過程とを含む免疫測定法に
おいて、固定化抗体としてサイロキシンと特異的に結合
する抗体を用い、固体担体として直径０．１〜１００μ
ｍの磁性ミクロビーズを用いることを特徴とする免疫測
定法。 - 【請求項３】標識としてペルオキシダーゼを用い、検出
に際しエンハンサーとして２−フェニル，６−ヒドロキ
シ ベンゾオキサゾールを用いた化学発光法であるるこ
とを特徴とする請求項１または２記載の免疫測定法。 - 【請求項４】固定化抗体として直径０．１〜１００μｍ
の磁性ミクロビーズに固定化したサイロキシンと特異的
に結合する抗体、標識としてペルオキシダーゼおよびエ
ンハンサーとして２−フェニル，６−ヒドロキシ ベン
ゾオキサゾールを用いることを特徴とするサイロキシン
酵素免疫測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29546793A JPH07146293A (ja) | 1993-11-25 | 1993-11-25 | 免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29546793A JPH07146293A (ja) | 1993-11-25 | 1993-11-25 | 免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07146293A true JPH07146293A (ja) | 1995-06-06 |
Family
ID=17820978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29546793A Pending JPH07146293A (ja) | 1993-11-25 | 1993-11-25 | 免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07146293A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2573561A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-03-27 | Fujifilm Corporation | Thyroxine immunoassay using fluorescent particles |
-
1993
- 1993-11-25 JP JP29546793A patent/JPH07146293A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2573561A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-03-27 | Fujifilm Corporation | Thyroxine immunoassay using fluorescent particles |
| US8912010B2 (en) | 2011-09-26 | 2014-12-16 | Fujifilm Corporation | Thyroxine immunoassay using fluorescent particles |
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