JP2000508075A - 発光特異的結合アッセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
全血中の検体を検出するための発光特異的結合アッセイ。このアッセイは第1の結合試薬がルミネセンス発光タンパクで標識され、そして固定化された第2の結合試薬が捕獲試薬として作用する、不均質サンドイッチまたは競合アッセイである。ルミネセンス発光タンパクは、活性化によりルミネセンス検出器によって検出できる光を放射する。このアッセイは速くそして感受性であり、小さいサンプル体積に対して実施することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
発光特異的結合アッセイ本発明の背景
1.本発明の分野
本発明は特異的結合アッセイを実施するための方法およびキットに関する。さ
らに詳しくは、本発明は、発光性物質、好ましくは発光タンパク、エクオリンが
標識として採用される特異的結合アッセイに関する。
2.背景技術の説明
特異的結合アッセイ方法は、ここでは“検体”と一般に呼称する広範囲の物質
の定性的および定量的測定のために使用される。これら物質はタンパク、ウイル
ス、ウイルス抗原、バクテリア細胞、細胞表面受容体、酵素、ホルモン、ポリサ
ッカライド、グリコタンパク、リポタンパクなどのような大きな複合体分子か、
またはペプチド、ある種のホルモン、治療用薬物、乱用薬物などの小さいハプテ
ン分子であり得る。
これらのアッセイは生物学的分子間で発生する特異的結合反応の利益を享受す
る。最も普通に使用される特異的結合反応は、抗体と抗原の間で発生する反応で
ある。この場合は、特異的結合反応はイムノアッセイと呼称される。他の結合ペ
ア間の反応も採用し得る。例えば、酵素と基質間、ホルモンと受容体、および核
酸の相補ストランド間の相互作用がこの目的のために使用されている。アビジン
とビオチン間および免疫グロブリンと免疫グロブリン結合タンパク
(例えばタンパクAおよびタンパクG)間の反応のような他の結合反応も特異的
結合反応に有利に使用されている。
特異的結合アッセイは種々のフォーマットに組むことができる。例えば、その
ようなアッセイは競合またはサンドイッチアッセイでよい。それらは均質または
不均質アッセイでよく、そしてそれらは逐次的または同時でよい。特異的結合ア
ッセイの大部分において、特異的結合アッセイに参加する結合ペアのメンバーの
少なくとも一方は標識される。標識は反応生成物を検出しそして定量化するため
の手段を提供する。ラジオイムノアッセイは放射性同位元素を含有する結合ペア
メンバー(例えば抗原)を採用する。酵素イムノアッセイにおいては、結合ペア
メンバーの一方は酵素で標識される。酵素は色変化のような検出し得る信号を発
生する基質と反応する。
発光特異的結合アッセイは、化学発光または生物発光標識の種類のどれかを利
用する。そのようなアッセイの一つは標識として、エクオリンとして知られる発
光タンパクを利用する。エクオリンは、クラゲ、Aequorea victo
riaの生物ルミネセンスに責任ある高アフィニティーカルシウムイオン結合タ
ンパクである。天然エクオリンは、強く結合した腔腸動物ルシフェリンおよび酸
素各1モルを含んでいる、MW21,000ダルトンの単一ポリペプチド鎖より
なる発光タンパクである。この複合体はカルシウムイオンの不存在下安定であり
、そして発光はエクオリン1モルあたり3モルのカルシウムイオンが結合した時
開始される。カルシウムイオンの存在下において、エクオリンはルシフェリンの
オキシルシフェリンへの酸化を触媒し、同時に約10秒持続する青色光(λma
x=469nm)のフラッシュを伴う。stults, et al
.,Biochemistry,31:1433−42(1992)およびそれ
に引用されている参考文献を見よ。
エクオリンはAequorea組織から単離することができる。加えて、それ
は組換えDNA技術によって製造することができる。Cormier,M.J.
の米国特許No.5,162,227およびZenno,S.et al.,米
国特許No.5,288,623を見よ。増強された生物発光性を有するアポエ
クオリンの修飾形も組換えDNA操作によって製造された。Prasher,D
.米国特許No.5,360,728を見よ。ここで使用する術語“エクオリン
”は、この発光タンパクの天然および組換え形のみならず、前述したPrash
er特許に記載されたその修飾形をも含む。
特異的結合アッセイに標識として使用することができる他の発光タンパクが知
られている。そのような発光タンパクはobeln,mnemiopsin,b
erovin,pholasin,ルシフェラーゼおよびPelagia,Cy
pridinaおよびoctracodから単離される発光タンパクを含む。
大部分の特異的結合アッセイは、生物学的に意義ある検体について血液および
尿のような生物学的流体の分析のために仕組まれている。ある特異的結合アッセ
イの目標が全血中のある物質の存在を決定することである時、典型的にはサンプ
ルはアッセイを妨害し得る細胞成分およびヘモグロビンを除去するように前処理
されなければならない。特異的結合アッセイは通常全血の血清成分について実施
される。代わりに、全血アッセイは細胞成分およびヘモグロビンからの妨害を最
小にするため、特異的結合アッセイに先立って濾過ま
たは吸収を提供するように設計されている。例えば、Chen,F.M.の米国
特許No.5,096,809を見よ。ここで用語“血液”および“全血”は互
換的に使用され、そして実質上血球、血漿、血清およびフィブリンを含むその成
分の分離を達成するように処理されていない、体内の心脈管チャンネルを通って
循環する均質な液体を意味すると定義される。
しばしば、特異的結合アッセイを全血に対して直接実施することが高度に望ま
しいであろう。前処理ステップから生ずるサンプルのロスが避けられるので、全
血に対して直接実施されるアッセイには低いサンプル体積が必要である。さらに
、もし前処理ステップが省かれるならば、実施すべきアッセイのための時間を最
小にすることができる。救急室または手術室環境においては、特に小児患者の場
合、これら要因は決定的に重要になり得る。本発明の概要
本発明によれば、発光特異的アッセイ法は、(a)検体を含有もしくは含有す
る疑いある全血のサンプルを得るステップ、(b)サンプルを、検体へ結合する
ことができ、かつ発光分子で標識された第1の結合試験と合併するステップ、(
c)サンプルを、検体へ結合することができそして検体もしくは第1の試薬へ結
合した検体と複合体を形成することができ、かつ固体支持体へ固定化された第2
の結合試薬と接触させるステップ、(d)第1の結合試薬と検体と第2の結合試
薬の複合体をサンプルから除去するために固体支持体をサンプルから分離するス
テップ、(e)固体支持体を含まないサンプル中の発光標識、または固体支持体
へ結合した発光標識を活性化するステップ、および(f)活性化した発光標識か
ら発する光を
検出することによってサンプル中の検体の存在を測定するステップを含んでいる
。
特異的結合アッセイ方法の代替具体例は、第1の結合試薬が使用されない競合
アッセイフォーマットを使用する。この具体例においては、全血サンプルは発光
標識で標識した標識検体の既知量と合併される。標識したおよび未標識検体は固
定化した第2の結合試薬に対して競合し、第2の結合試薬によって捕獲された標
識検体の量はサンプル中に存在する未標識検体の量に反比例する。
特定の具体例においては、本発明の特異的結合アッセイは発光標識としてエク
オリンを使用し、そして固体支持体として磁性粒子を使用する。
他の具体例において、本発明はここに記載したアッセイ方法において使用され
る試薬を含む発光アッセイキットに関する。図面の簡単な説明
図1は、本発明によるアッセイ方法から得られた較正曲線を図示し、全血不含
標準液と全血の存在下の両方におけるTSH濃度の関数としての発光を示してい
る。本発明の詳細な説明
本発明の発光結合アッセイは、全血中の検体を前処理ステップなしで測定する
ために使用される。このアッセイは感受性であり、そしてサンプル体積が小さい
時でさえ速いそして正確な結果を提供することができる。
この発光特異的結合アッセイは、サンドイッチもしくは競合フォーマットにお
いて実施することができる不均質アッセイである。サンドイッチフォーマットに
おいては、発光物質で標識された第1の
結合試薬例えば抗体と、そして捕獲試薬として役立つ第2の結合試薬を採用する
。サンドイッチフォーマットにおいては、第1および第2の結合試薬は関心ある
検体へ同時に結合することができる。第2の結合試薬は固定支持体上に固定化さ
れる。固定化は第2の結合試薬と固体支持体とを直接、または固体支持体上に固
定化された第3の結合試薬を介して結合することによって達成することができる
。後者の具体例が使用される時は、第1および第2の結合試薬の検体との反応は
固体支持体をサンプルへ導入する前に発生することができ、この場合はそれらの
反応は溶液反応動力学に実質上従って挙動する。代わって、成分のすべてを同時
に加えることができ、この場合は結合反応は同時に発生する。
第1および第2の結合試薬の検体との反応によって生成した複合体は、固体支
持体をサンプル混合物から分離することによって未結合標識結合試薬から分離さ
れる。本発明の好ましい具体例においては、第2の結合試薬は磁性粒子上へ直接
、または固定化された第3の結合試薬を介して間接的に固定化される。分離ステ
ップはサンプルからの粒子の除去、またはルミネセンス発光の検出を許容するよ
うにサンプル内の粒子の局在化を含むことができる。
固定化した複合体の分離もしくは単離後、発光標識は光を放出させるため活性
化される。光の放出はサンプルから、または固体支持体へ固定化された複合体か
ら、または両方から検出することができる。
標識した第1の結合試薬は、発光標識を結合試薬へ接合することによって調製
される。結合試薬は、例えばポリクローナル、モノクローナルもしくは相補決定
領域グラフト抗体、またはそれらの結合
フラグメント、例えばFab,Fab’もうくはF(ab’)2,または合成1
本鎖抗体でよい。代わって、結合試薬は核酸(RNAまたはDNA)または特異
的結合反応に関与する他の分子、例えばホルモン、受容体、酵素、葉酸結合タン
パクもしくは内因子のような結合タンパク、基質、タンパクAもしくはタンパク
Gのような免疫グロブリン結合タンパク等でもよい。第1の結合試薬は関心ある
検体に対し結合親和力を有する。
競合アッセイフォーマットにおいては、第1の試薬は使用されない。関心ある
検体と結合し得る固定化した第2の結合試薬は、サンプルもしくは較正標準液お
よび発光分子で標識された検体の固定量と合併される。サンプルもしくは標準液
中の検体は固定した方の結合試薬に対して標識した検体と競合する。固定化した
第2の結合試薬へ結合した標識した検体の量はサンプルもしくは標準液中の検体
の量に反比例する。サンドイッチフォーマットと同様に、第2の結合試薬は固体
支持体へ直接結合するか、または前に記載したように固体支持体上に固定化され
た第3の結合試薬へ結合することができる。
第1の結合試薬(または競合アッセイフォーマットの場合は検体)へ接合され
る発光標識は、結合試薬へ接合する時光を放射するその能力を保持する任意の発
光化合物でよい。好ましい発光標識はエクオリンである。カルシウムイオンを暴
露する時、エクオリンは全血の吸光度が比較的低い波長において高い量子収率を
もって青い光を放射する。発光標識としてエクオリンの使用は感受性全血アッセ
イの設計を許容する。
本発明に使用されるエクオリンはクラゲ組織から単離された天然
エクオリンか、または組換え(合成)エクオリンでよい。加えて、それは増強さ
れた生物発光性を有する修飾エクオリンでよい。
エクオリンは、この化合物のルミネセンス特性を実質上妨害することなく抗体
、核酸、種々の検体および他の結合試薬へ接合することができる。エクオリンお
よび関連する発光タンパクの結合試薬への接合操作は、Stults,M.L.
の米国特許No.5,486,455に記載されており、その開示をここに参照
として取り入れる。当業者に既知の他の結合操作も使用し得る。
エクオリンに加え、本発明の発光特異的結合アッセイに使用し得る発光標識は
、obeln,mnemiopsin,berovin,phalasin,ル
シフエラーゼ、およびPelagia,Cypridinaおよびostrac
odから単離された発光タンパクのような他の発光タンパク、および2,3−ジ
ヒドロ−1,4−フタラインジオン、アクリジニウムエステル、アクリジニウム
スルホナルアミド、ルシフェリン、ルミノール、1,2−ジオキセタン、環状ヒ
ドラジド、ユウロピウムキレートおよびフェノール誘導体のような非タンパク発
光化合物を含む。
前に論じたように、サンドイッチまたは競合フォーマットのどちらにおいても
、第2の結合試薬は、直接結合により、または固定化した第3の試薬に対する親
和性を介して固体支持体上に固定化することができる。後者の具体例においては
、第3の結合試薬に対する第2の結合試薬の親和性は種々の形を取ることができ
る。例えば、もし第2の結合試薬が免疫グロブリンであれば、固定化した第3の
結合試薬はタンパクAもしくはタンパクGもしくは抗免疫グロブリン抗体でよい
。代わって、第2の結合試薬は抗原またはハプテンに
対する抗体でよい。例えば第2の結合試薬をビオチニル化することができ、その
場合第3の結合試薬はアビジンまたはストレプトアビジンである。反対に、第2
の結合試薬をアビジンまたはストレプトアビジンへ結合することができ、その場
合固定化された第3の結合試薬はビオチンである。ビオチンはアビジンまたはス
トレプトアビジンと強い非共有結合を形成する。抗体、タンパクおよび核酸のビ
オチニル化操作はこの分野において良く知られている。例えば、Huber E
.et al.,米国特許No.5,521,319およびCarrico,R
.J.米国特許No.5,200,313を見よ。これらの開示をここに参照と
して取り入れる。
第2の結合試薬がその上に固定化される固体支持体は不均質イムノアッセイに
使用するため既知の広範囲の固体支持体のどれでもよい。マイクロ粒子は、それ
らの高い表面積が捕獲ステップの効率および動力学を改善する故固体支持体とし
て使用するのに好ましい。Craig,et al.,米国特許No.4,40
1,765に開示されたタイプのラテックス粒子、およびBangs Labo
ratories,Inc.Fishers,IN,46038−2886,U
SAから入手し得るような磁性粒子が好ましい。Cortex Biochem
,San Leandro CAから入手し得るCortex粒子を代替具体例
において使用することができる。ここに参照として取り入れる1987年4月2
8日発行の米国特許No.4,661,408に記載されている安定化二酸化ク
ロム粒子も使用することができる。これらの粒子およびそれらのイムノアッセイ
における使用は、ここに参照として取り入れるObzansky,D.M.米国
特許No.5,369,006に記載さ
れている。Obzansky特許は二酸化クロム粒子の表面にストレプトアビジ
ンのような結合試薬を固定化するための操作を記載する。
磁性粒子は、混合および分離ステップが強い磁場の適用によって便利にそして
速やかに達成できるので本発明の実施のために好ましい。例えば、このアッセイ
は、容器の反対側へ磁場を交替に適用することにより、磁性粒子を反応容器を横
切って往復水泳させる時特に良好に機能することが判明した。溶液から複合体の
分離に続いて、発光標識が活性化され、そして光の放射が検出される。固体支持
体へ固定化された発光標識の、または固定支持体が分離された溶液の発光を測定
することができる。サンプル中の検体の量は、放射された光のレベルを標準較正
曲線と比較することによって定量化される。
本発明の特異的結合アッセイは広範囲の異なる態様に組むことができるが、好
ましい具体例においては、第1の結合試薬は検体へ結合することができる、エク
オリン標識モノクローナル抗体である。第2の結合試薬は、検体へ結合すること
ができるビオチニル化モノクローナル抗体である。固体支持体は、Bangs
Laboratories,Inc.,Fishers,IN,46038−2
886,USAからストックNo.C0008200RNとして入手し得るよう
な、ストレプトアビジン被覆超常磁性マイクロスフエアである。反応は試験管ま
たはマイクロタイターウエルのような容器中で実施することができる。反応は、
全血もしくは較正液を、適当なバッファー溶液中の第1の結合試薬および第2の
結合試薬の適量と合併することによって開始される。サンプルは免疫反応の生起
を許容するのに十分に長い時間インキュベートされる。次にストレプトアビジン
被覆磁性粒子がサンプルへ添加され、そして混合物は攪拌され、免疫複合体の磁
性粒子への結合を許容するようにインキュベートされる。粒子は磁場の適用によ
って分離され、洗浄および再懸濁される。発光エクオリン標識による光を放出さ
せるため十分なカルシウムイオンが添加される。放出される光がルミネセンス検
出器によって検出され、そして較正曲線との比較によって読みが検体の濃度に相
関される。
当業者には、本発明の特異的結合アッセイは人力により実施することができ、
または自動機器へ容易に適用化することができることが認められるであろう。試
薬の添加順序は、種々の結合反応が、記載した定性的または定量的測定を得るこ
とができる点へ進行することが許容される限り、重要ではない。
本発明は、限定を意図しない以下の実施例によってさらに例証される。
実施例1TSHのための生物発光アッセイ
塩化ナトリウム10mM,塩化カリウム2.7mM,リン酸ナトリウム10m
M,pH7.4を有し、塩化マグネシウム10mM,EGTA 10mM,アジ
化ナトリウム0.1%およびウシ血清アルブミン(BSA)5%を添加したリン
酸塩緩衝化食塩水(PBS)よりなるバッファーで、スチレンマイクロライター
プレートウエルを一夜室温で前浸漬した。マイクロタイタープレートウエルを使
用前水切りし、空気乾燥した。マイクロタイターウエルへかきまぜながら以下を
加えた。TSH 21mIU/Lを含有するTSH較
正液0.1mL,TSHに対するビオチニル化マウスモノクローナル抗体(Bo
ehringer Mannheim,Indeannapolis,IN,U
SA,カタログNo.1367978(クローンA8TSH)50ナノグラム、
およびTSHに対するエクオリン標識モノクローナル抗体9ナノグラム(Sea
Lite Science,Inc.Norcross,GA,USAから得
たロットNo.46−145,バッファー(塩化カリウム1M,トリス10mM
,pH7.5,塩化マグネシウム10mM,EGTA 10mMアジ化ナトリウ
ム0.1%,およびBSA0.1%を含む)20μl中、OEM Concep
ts Inc.Toms Riven,NJから得たクローン057−1100
3から調製したTSHに対するマウスモノクローナル抗体へ接合することにより
調製した)。溶液を37℃で15分間インキュベートした。0.1% BSAお
よび0.1% Triton X−100を添加したPBS中のストレプトアビ
ジン被覆超常磁性マイクロフエア(Bangs Laboratories,I
nc.Fishers,IN,USA,ストックコードC0008200RN)
20マイクロリットル(22.5マイクログラム)をかきまぜながら溶液へ添加
した。混合物を37℃で5分間インキュベートした。次に粒子を四極磁場の適用
により分離した。粒子を、塩化マグネシウム10mM,EGTA 10mM,ア
ジ化ナトリウム0.1%,Tween200.05%を含むPBS,pH7.4
の100μLで4回洗浄し、同じバッファー100μL中に再懸濁した。0.1
M CaCl2の100μLをかきまぜながら粒子中へ注入した。Dynate
ch ML 3000ミネセンス検出器を用いて光放射を10秒間
測定した。
上の操作を追加の較正溶液、全血サンプルおよび1.5および21mIU/L
の濃度でTSHをスパイクしたスパイク全血サンプルについて繰り返した。ルミ
ネセンス検知器からの読みをTSH濃度に対してプロットし、そして応答は試験
した範囲を通じて直線状であることが見られた。データを下の表1に示し、そし
て得られる較正曲線はエクオリン応答が全血および較正液中のTSH濃度の関数
として提供される図1に示されている。較正液とスパイクした全血値間の差は、
全血サンプル中の正常内因性TSH1.3mIU/Lによるものである。
実施例2クレアチンキナーゼ、MBアイソザイム(CKMB)のための生物発光アッセイ
実施例1に類似したやり方で、塩化ナトリウム120mM,塩化カリウム2.
7mM,リン酸ナトリウム10mM,pH7.4を有し、塩化マグネシウム10
mM,EGTA10mM,アジ化ナトリウム0.1%およびウシ血清アルブミン
(BSA)5%を添加したリン酸塩緩衝化食塩水(PBS)よりなるバッファー
でスチレンマイクロタイタープレートウエルを一夜室温で前浸漬した。マイクロ
タイタープレートウエルは使用前水切りし、空気乾燥した。マイクロタイターウ
エルへかきまぜながら以下を加えた。CKMB 329ng/mLを含むCKM
B較正液25μL,CKMBに対するビオチニル化マウスモノクローナル抗体1
00ng(Dade Chemistry Systems,Inc.部品No
.735322.312)およびCKMBに対するモノクローナル抗体のエクオ
リン標識F(ab’)2フラグメント20ng(Dade Chemistry
Systems,Inc.部品No.735322.305)(塩化マグネシ
ウム10mM,EGTA 10mMおよび0.05%Tween20を添加した
、塩化カリウム1M,トリス10mM,pH7.5,塩化マグネシウム10mM
,EGTA 10mM,アジ化ナトリウム0.1%およびPBS 80mLのバ
ッファー20μL中)この溶液を37℃で5分間インキュベートした。0.1%
BSAおよび0.05%TritonX100を添加したPBS中のストレプト
アビジン被覆超常磁性マイクロスフエア(Bangs Laboratorie
s,Inc.Fisher
s,IN,USA,ストックコードC0009000RN)の20μL(22.
5μg)をかきまぜながら溶液へ加えた。混合物を37℃で5分間インキュベー
トした。次に四極磁場の適用によって粒子を分離した。PBS pH7.4,塩
化マグネシウム10mM,EGTA 10mM,0.1%アジ化ナトリウム、お
よび0.05%Tween20を含有する洗浄バッファーの100μLで粒子を
4回洗った。粒子を次に同じバッファーの100μLに再懸濁した。塩化カルシ
ウム0.1Mの100μLを粒子懸濁液へかきまぜながら注入した。Dynat
ech ML 3000ルミネセンス検出器を用いて光放射を10秒間測定した
。上の操作を全血(EDTA含有真空採取チューブ中)25μLを加えて繰り返
した。この操作を再び上の全血添加有り無しのCKMB 0ng/mLを含有す
る追加の較正液について繰り返した。データを以下の表2に示す。
表 2
MCKMBng/mL 0 329
ルミネセンスカウント
較正液 263 133514
321 132782
836 117215
平均 473 127837
標準偏差 315 9206
%CV 66.6 7.2
全血 591 126315
475 120287
298 107301
平均 591 126315
標準偏差 147 9716
%CV 32.5 8.2
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.全血中の不均質発光特異的結合アッセイ方法であって、 (a)検体を含有もしくは含有する疑いある全血のサンプルを得るステップ、 (b)サンプルを、検体へ結合することができ、かつ活性化により光を放射す るルミネセンス発光タンパクで標識された第1の結合試薬と合併するステップ、 (c)サンプルを、検体へ結合することができ、かつ固体支持体へ固定化され た第2の結合試薬と接触させるステップ、 (d)複合体を生成する条件下で、前記第1および第2の結合試薬がサンプル 中に存在する検体と反応することを許容するステップ、 (e)サンプルから固体支持体を分離することによってサンプルから複合体を 分離するステップ、 (f)固体支持体不含サンプル中のまたは固体支持体へ結合した複合体のルミ ネセンス発光タンパクを活性化するステップ、および (g)活性化したルミネセンス発光タンパク標識から放射される光を検出する ことによってサンプル中の検体の存在を測定するステップ、 を含む前記方法。 2.全血中の不均質特異的結合アッセイ方法であって、 (a)検体を含有もしくは含有する疑いある全血のサンプルけを得るステップ 、 (b)サンプルを、活性化により光を放射するルミネセンス発光タンパクで標 識した既知量のサンプルと合併するステップ、 (c)サンプルを、検体と結合することができ、かつ固体支持体へ固定化され た第2の結合試薬と接触させるステップ、 (d)複合体を生成するように前記第2の結合試薬が標識したおよび標識しな い検体と反応することを許容するステップ、 (f)固体支持体不含サンプル中の、または固体支持体へ結合した複合体中の ルミネセンス発光タンパク標識を活性化するステップ、および (g)サンプルからの光放射をサンプル中の検体の存在に相関させるステップ 、 を含む前記方法。 3.第2の結合試薬は固体支持体へ直接結合している請求項1または2の方法 。 4.第2の結合試薬は検体と、そして固体支持体上に固定化された第3の結合 試薬の両方へ結合することができ、このアッセイ方法は第3の結合試薬を固定化 した固体支持体とサンプルを接触させることをさらに含んでいる請求項1または 2の方法。 5.ルミネセンス発光タンパクはエクオリンである請求項1または2の方法。 6.光タンパクはエクオリンである請求項4の方法。 7.エクオリン標識は活性化量のカルシウムイオンの添加によって光を放射す るように活性化される請求項6の方法。 8.固体支持体は磁性マイクロ粒子よりなる請求項6の方法。 9.ステップ(e)において規定した分離は磁場の適用によって 得られ、そして分離された磁性粒子は溶液中に再懸濁され、粒子懸濁液中の発光 標識が活性化され、そして光放射が検出される請求項8の方法。 10.第1および第2の結合試薬の各自は抗体またはその免疫反応性フラグメ ントである請求項6の方法。 11.第1および第2の結合試薬の各自はモノクローナル抗体である請求項6 の方法。 12.第1および第2の結合試薬の各自は核酸である請求項6の方法。 13.第2の結合試薬はビオチニル化され、そして第3の結合試薬はアビジン またはストレプトアビジンである請求項6の方法。 14.第2の結合試薬はビオチニル化され、そして第3の結合試薬はアビジン またはストレプトアビジンである請求項10の方法。 15.第2の結合試薬はビオチニル化され、そして第3の結合試薬はアビジン またはストレプトアビジンである請求項12の方法。 16.全血中の検体のための特異的結合アッセイを実施するためのキットであ って、 (a)検体へ特異的に結合する能力を有し、かつ発光タンパク、エクオリンで 標識された第1の結合試薬、 (b)検体へ特異的に結合する能力を有し、かつ固体支持体上に固定化された 第3の結合試薬へ結合する能力を有する第2の結合試薬、 (c)第2の結合試薬へ結合することができる第3の結合試薬を その上に固定化した固体粒子、 を含んでいる前記キット。 17.全血中の検体のための特異的結合アッセイを実施するためのキットであ って、 (a)ルミネセンス発光タンパク、エクオリンで標識された標識した検体、 (b)検体へ特異的に結合する能力を有し、かつ固体支持体上に固定化された 第3の結合試薬へ結合する能力を有する第2の結合試薬、 (c)第2の結合試薬へ結合することができる第3の結合試薬をその上に固定 化した固体粒子、 を含んでいる前記キット。 18.第1および第2の結合試薬の各自は抗体またはその免疫反応性フラグメ ントである請求項16または17のキット。 19.抗体の少なくとも一方はモノクローナル抗体である請求項18のキット 。 20.第1および第2の結合試薬は核酸である請求項16または17のキット 。 21.第2の結合試薬はビオチニル化され、そして第3の結合試薬はアビジン またはストレプトアビジンである請求項16または17のキット。 22.固体粒子は磁性粒子である請求項16または17のキット。 23.固体粒子は磁性粒子である請求項21のキット。
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