CN113671001B - 纸基电化学发光核酸即时检测芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片及其制备方法与应用,该检测芯片包括自上而下分布的第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层;所述纸通道层包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述检测区固定有电化学发光试剂,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;所述电极层包括三电极,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层对应加样区设置有加样孔。本发明实施例的核酸检测芯片是一种免标记、简单、普适性纸基即时检测芯片,可广泛应用于医学检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域,尤其涉及一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片及其制备方法与应用。
背景技术
世界卫生组织针对中低收入国家在传染性疾病床旁诊断所面临的复杂状况、多样性需求和各种障碍,提出了床旁诊断POCT(Point of Care Testing,POCT)ASSURED原则,即可支付(Affordable)、特异(Sensitive)、敏感(Specific)、用户友好(User friendly,最少培训几步内简单完成)、检测迅速可靠(Rapid and Robust,试剂室温储存30min内可出结果)、无需设备或者设备简单(Equipment free or minimal equipment)、直接交付(deliverable to end-users)。目前整个核酸即时检测领域正处于市场发展的早期,国内外即时分子检测产品正在蓬勃发展,国外分子诊断巨头通过收购正在加强布局,国内目前开发产品较少,开发相关技术平台具有重要社会意义和经济价值。
传统的核酸检测方法主要应用荧光PCR(聚合酶链式反应)技术,但受仪器设备、电力、空间以及操作技术人员等诸多因素的限制,不能有效实现床边诊断。发展新型核酸即时检测技术,在当前我国在大力倡导进行分级诊疗和促进医患相互理解配合的情形下意义重大。
发明内容
有鉴于此,本发明实施例的目的是提供一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片及其制备方法与应用,该核酸检测芯片是一种免标记、简单、普适性纸基即时检测芯片。
第一方面,本发明实施例提供了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片,该芯片包括自上而下分布的第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层;所述纸通道层包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述检测区固定有电化学发光试剂,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;所述电极层包括三电极,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层对应加样区设置有加样孔。
可选地,所述三电极设置有导电纳米材料。
可选地,所述导电纳米材料包括石墨烯、多壁碳纳米管或金属纳米颗粒材料中的任一种。
可选地,所述加样区预固定有恒温扩增试剂。
可选地,所述检测区为圆形。
第二方面,本发明实施例提供了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的制备方法,包括步骤:
在纸基底材料上制备包含三电极的电极层,并在电极层上制备隔离层;
在滤纸上使用喷蜡打印技术印制包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道,以制备纸通道层;所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;并在所述检测区固定电化学发光试剂;
采用热压技术制备自上而下包含第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层的纸基电化学发光核酸即时检测芯片;所述第一密封膜层在加样区设置有加样孔。
可选地:制备方法还包括步骤:在所述三电极上制备导电纳米材料。
可选地,制备方法还包括步骤:在所述加样区预固定恒温扩增试剂。
可选地,所述在滤纸上使用喷蜡打印技术印制包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道,具体包括:
使用Adobe Illustrator软件设计由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道的版型,然后以Whatman 1号滤纸为基底材料,使用喷蜡打印技术印制倒“山”型微通道。
第三方面,本发明实施例提供了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的检测方法,包括步骤:
将提纯的待检测核酸样品加入纸基电化学发光核酸即时检测芯片的加样孔;所述纸基电化学发光核酸即时检测芯片包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述检测区固定有电化学发光试剂,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;所述电极层包括三电极,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层对应加样区设置有加样孔;
将纸基电化学发光核酸即时检测芯片置于电化学发光检测仪中进行检测,得到检测曲线,并根据所述检测曲线确定待检测核酸样品的浓度。
实施本发明实施例包括以下有益效果:本发明实施例通过纸基上倒“山”型微通道反应池有效控制流体方向,减少非特异性吸附,以提高分析效率;在微通道的检测区固定有电化学发光试剂,微通道加样区的待检测核酸样品到达检测区发生电化学发光反应,从而实现核酸即时检测,该检测芯片免标记、结构简单且具有普适性,可广泛推广应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的结构示意图;
图2是本发明实施例提供的一种倒“山”型微通道的结构示意图;
图3是本发明实施例提供的一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的制备方法的步骤流程示意图;
图4是本发明实施例提供的另一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的结构示意图;
图5是本发明实施例提供的一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的检测方法的步骤流程示意图;
图6是本发明实施例提供的一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的液体流向示意图;
图7是本发明实施例提供的一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。对于以下实施例中的步骤编号,其仅为了便于阐述说明而设置,对步骤之间的顺序不做任何限定,实施例中的各步骤的执行顺序均可根据本领域技术人员的理解来进行适应性调整。
纸基微流控装置(简称纸芯片)具有较小的检测区域和较高的比表面积,各种基于捕捉和扩散的反应过程会被加速,具有改进现有临床诊断技术的巨大潜力;电化学发光传感器加工比微光学器件和微质谱器件容易许多,并且其数据信号处理系统等外围设备也相对简单,易微型化。因此,将电化学发光与纸芯片结合,可以较好的满足世界卫生组织提出的ASSUED原则,是极有前途的新一代核酸即时检测发展方向。
如图1所示,本发明实施例提供了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片,该芯片包括自上而下分布的第一密封膜层1、纸通道层2、电极层3及第二密封膜层4;所述纸通道层2包括由第一通道C及第二通道B组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道C的第一端为加样区,所述第一通道C上设置有检测区,所述检测区固定有电化学发光试剂,所述第一通道C的第二端连接所述第二通道B;所述电极层包括三电极D,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层1对应加样区设置有加样孔A。
需要说明的是,第一通道C为直线段,检测区可以设置在直线段的中间位置,第二通道B为折线段。
需要说明的是,为了防止样品/试剂蒸发、污染,使用压膜机对纸芯片进行压膜封装。
需要说明的是,本申请的电化学发光试剂可以为ssDNA-Ru@介孔硅球,封闭介孔的ssDNA可以根据不同的检测对象订制。
具体地,微通道用于含蓄实验溶液、进行基因扩增及连接电极,利用微通道可以代替电极的支持设备并能够控制用于进行电化学发光反应的区域面积。实验首先设计倒“山”型微通道反应池,采用蜡印获得高深宽比微通道,通过改变纸表面化学,有效控制流体方向,减少非特异性吸附,提高分析效率的目的。根据影响应用的参数,如表面特性、表面积、毛细管流速、孔径、孔隙率和厚度,选择不同品牌和型号的滤纸/层析纸做基底。样品混合液通过微通道时既不能太慢,影响分析时间;也不能太快,影响分离效果。本实施例选择Whatman 1号层析纸、双圈102定性滤纸能满足要求。
可选地,所述三电极设置有导电纳米材料。
可选地,所述导电纳米材料包括石墨烯、多壁碳纳米管或金属纳米颗粒材料中的任一种。
需要说明的是,纳米金颗粒、纳米银颗粒等金属纳米粒子,由于其良好的导电性,也可与纳米碳复合用于信号放大,提高ECL(增强化学发光法)强度,以提高检测的灵敏度和稳定性。
具体地,微电极是反应发生场所,直接决定电化学发光效率。由于碳三电极丝印电极(工作电极及对电极为碳,参比电极为Ag)价格相对便宜,本申请以其为基础,进行表面增敏。既可以在商品化碳三电极丝印电极表面通过电化学沉积等手段修饰上如石墨烯、多壁碳纳米管、金纳米颗粒等纳米材料;也可以自制印刷电极,自制导电碳浆中添加石墨烯、多壁碳纳米管、金属纳米颗粒等纳米材料,根据成品率、实际成本以及电极的循环伏安实验、阻抗实验,挑选合适的电极。
可选地,所述检测区为圆形。
具体地,如图2所示,作为一个具体的实施例,本申请的倒“山”型微通道的具体设计如下,纸通道层是长为505mm,宽为12.7mm的矩形,第一通道和第二通道的宽为3mm,圆形检测区的直径为6mm。
可选地,所述加样区预固定有恒温扩增试剂。
需要说明的是,通过恒温扩增试剂对靶核酸进行扩增,加快反应时间,利于核酸实时检测。
具体地,恒温扩增试剂的扩增原理:重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列;一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。
实施本发明实施例包括以下有益效果:本发明实施例通过纸基上倒“山”型微通道反应池有效控制流体方向,减少非特异性吸附,以提高分析效率;在微通道的检测区固定有电化学发光试剂,微通道加样区的待检测核酸样品到达检测区发生电化学发光反应,从而实现核酸即时检测。该检测芯片制作简单、成本低廉;集样品输送、检测于一体,只需更换介孔微球上的靶基因特异互补链,即可实现多种检测对象的测定,普适性强。另外,通过核酸杂交反应、常温扩增技术,建立灵活的核酸信号放大技术,为便携式电化学发光检测装置的研究奠定理论和技术基础。
如图3所示,本发明实施例提供了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的制备方法,包括步骤:
S1、在纸基底材料上制备包含三电极的电极层,并在电极层上制备隔离层;
S2、在滤纸上使用喷蜡打印技术印制包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道,以制备纸通道层;所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;并在所述检测区固定电化学发光试剂;
S3、采用热压技术制备自上而下包含第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层的纸基电化学发光核酸即时检测芯片;所述第一密封膜层在加样区设置有加样孔。
具体地,如图4所示,纸基电化学发光核酸即时检测芯片的制备方法按如下步骤进行:准备纸基底材料b;丝网印刷导电油墨制备导电轨道c;丝网印刷银伪参比电极丝网d;丝网印刷掺有纳米颗粒的导电碳浆工作电极e;丝网印刷导电碳浆作为对电极f;丝网印刷一薄层绝缘油墨作为隔离层g;喷蜡打印且加热后的疏水通道h;将检测区与三电极区域对准,加盖透明密封材料i和a。对制备完成的纸基电化学发光核酸即时检测芯片沿1-1方向和2-2方向进行剖视,A1为导电轨道,D2为工作电极,D1为对电极,E为进样口。
可选地,所述在滤纸上使用喷蜡打印技术印制包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道,具体包括:
使用Adobe Illustrator软件设计由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道的版型,然后以Whatman 1号滤纸为基底材料,使用喷蜡打印技术印制倒“山”型微通道。
具体地,Adobe Illustrator软件设计通道蜡印版型,使用喷蜡打印技术印制纸基通道,蜡印后,蜡附着在滤纸/层析纸表面,需要加热处理,将蜡渗透到滤纸/层析纸背面,形成疏水区域,以达到控制流体方向的目的。考察不同通道设计尺寸、蜡块颜色以及加热条件对通道分辨率的影响,实验发现,由于蜡印通道为批量印制,加热装置各区域温度的均一性以及加热时间直接决定了蜡印通道的质量。以蜡质完全渗透纸纤维为标准,蜡印量和加热时间并非越多(长)越好,经过反复实验和验证,使用灰蜡(C=M=Y=0,K=50,其中,C、M、Y及K分别表示青、品红、黄及黑色),100℃加热2min可以获得较高的通道分辨率。
具体地,本申请检测区固定电化学发光试剂的步骤如下,将电化学发光试剂Ru(bpy)3 2+(三联吡啶钌或钌联吡啶)包埋进羧基化介孔硅球(硅球直径约为100nm,介孔直径约为5nm)中,并用氨基化修饰的ssDNA封闭;将洗涤干燥制得的ssDNA-Ru@介孔硅球用共反应物N-丁基二乙醇胺(BDEA)溶解固定于电极上方的圆形检测区上,冻干备用。
可选地:制备方法还包括步骤:在所述三电极上制备导电纳米材料。
具体地,自制电极制备导电纳米材料方法如下:(1)准备纸基底材料;(2)丝网印刷导电油墨(导电碳浆或导电银浆)制备导电轨道;(3)丝网印刷添加了纳米材料的导电碳浆(如掺杂石墨烯的Acehson ED 423SS导电碳浆)制备工作电极;(4)丝网印刷导电碳浆(如Acehson ED 423SS导电碳浆)制备对电极;(5)丝网印刷导电银浆(如上海玖银737H导电银浆)制备伪参比电极;(6):丝网印刷一薄层绝缘油墨(如Acehson 452SS油)作为隔离层。
商品化碳三电极制备导电纳米材料方法如下:将商品化印刷三电极在磷酸缓冲溶液中在0.2V~2.0V下,以50mV/s的扫描速度先循环伏安扫描10个循环,对电极进行活化预处理;再以10mM硝酸钾为电解质、100μM硝酸银为纳米银颗粒前体,在-1.0V~+1.0V通过循环伏安法下,以50mV/s的扫描速度先循环伏安扫描20个循环,进行纳米银颗粒还原沉积;最后,用乙醇和超纯水对电极进行冲洗,用氮气吹干备用。
可选地,制备方法还包括步骤:在所述加样区预固定恒温扩增试剂。
具体地,恒温扩增试剂的制备方法如下:1、配置反应体系:A buffer:20μL,上游引物:2μL,下游引物:2μL,ddH2O:20μL,总体积:44μL;2、将混匀好的反应体系加入装有酶粉的反应管中并旋涡混合均匀;3、加入2μL 280mmol/L醋酸镁混匀;4、将上46μL混合液滴加到加样区,真空冷冻干燥。
实施本发明实施例包括以下有益效果:本发明实施例通过纸基上倒“山”型微通道反应池有效控制流体方向,减少非特异性吸附,以提高分析效率;在微通道的检测区固定有电化学发光试剂,微通道加样区的待检测核酸样品到达检测区发生电化学发光反应,从而实现核酸即时检测。该检测结构简单、成本低,且集样品输送、检测于一体,只需更换介孔微球上的靶基因特异互补链,即可实现多种检测对象的测定,普适性强。
如图5所示,本发明实施例提供了一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的检测方法,包括步骤:
S100、将提纯的待检测核酸样品加入纸基电化学发光核酸即时检测芯片的加样孔;所述纸基电化学发光核酸即时检测芯片包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述检测区固定有电化学发光试剂,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;所述电极层包括三电极,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层对应加样区设置有加样孔;
S200、将纸基电化学发光核酸即时检测芯片置于电化学发光检测仪中进行检测,得到检测曲线,并根据所述检测曲线确定待检测核酸样品的浓度。
具体地,如图6所示,将提纯的待测核酸样品加入加样孔后,液流通过毛细作用在倒“山”型微通道反应池内流动,首先与固定在加样区的恒温扩增试剂结合,生成扩增产物,产生的扩增产物继续通过毛细作用运输到圆形检测区(电极上方),与包埋着发光试剂的介孔硅球上的ssDNA进行碱基互补配对,成功配对的核酸链从硅球上脱离,释放出介孔材料中的电化学发光试剂(Ru(bpy)3 2+),并与共反应物(BDEA)在电极上发生电化学发光反应,从而达到检测目的。如图7所示,加样区预固定恒温扩增试剂的ECL信号明显增强。
实施本发明实施例包括以下有益效果:本发明实施例通过纸基上倒“山”型微通道反应池有效控制流体方向,减少非特异性吸附,以提高分析效率;在微通道的检测区固定有电化学发光试剂,微通道加样区的待检测核酸样品到达检测区发生电化学发光反应,从而实现核酸即时检测。该检测结构简单、成本低,且集样品输送、检测于一体,只需更换介孔微球上的靶基因特异互补链,即可实现多种检测对象的测定,普适性强。
以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做作出种种的等同变形或替换,这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片,其特征在于,包括自上而下分布的第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层;所述纸通道层包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述检测区固定电化学发光试剂;所述加样区预固定有恒温扩增试剂;
检测区固定电化学发光试剂的步骤如下:将电化学发光试剂三联吡啶钌包埋进羧基化介孔硅球中,并用氨基化修饰的ssDNA封闭;将洗涤干燥制得的ssDNA-Ru@介孔硅球用共反应物N-丁基二乙醇胺溶解固定于电极上方的检测区上;
所述第一通道的第二端连接所述第二通道;所述电极层包括三电极,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层对应加样区设置有加样孔。
2.根据权利要求1所述的纸基电化学发光核酸即时检测芯片,其特征在于,所述三电极设置有导电纳米材料。
3.根据权利要求2所述的纸基电化学发光核酸即时检测芯片,其特征在于,所述导电纳米材料包括石墨烯、多壁碳纳米管或金属纳米颗粒材料中的任一种。
4.根据权利要求1所述的纸基电化学发光核酸即时检测芯片,其特征在于,所述检测区为圆形。
5.一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的制备方法,其特征在于,包括步骤:
在纸基底材料上制备包含三电极的电极层,并在电极层上制备隔离层;
在滤纸上使用喷蜡打印技术印制包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道,以制备纸通道层;所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述第一通道的第二端连接所述第二通道;并将电化学发光试剂三联吡啶钌包埋进羧基化介孔硅球中,并用氨基化修饰的ssDNA封闭;将洗涤干燥制得的ssDNA-Ru@介孔硅球用共反应物N-丁基二乙醇胺溶解固定于电极上方的检测区上;在所述加样区预固定恒温扩增试剂;
采用热压技术制备自上而下包含第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层的纸基电化学发光核酸即时检测芯片;所述第一密封膜层在加样区设置有加样孔。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,还包括步骤:在所述三电极上制备导电纳米材料。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述在滤纸上使用喷蜡打印技术印制包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道,具体包括:
使用Adobe Illustrator软件设计由第一通道及第二通道组成的倒“山”型微通道的版型,然后以Whatman 1号滤纸为基底材料,使用喷蜡打印技术印制倒“山”型微通道。
8.一种纸基电化学发光核酸即时检测芯片的检测方法,其特征在于,包括步骤:
将提纯的待检测核酸样品加入纸基电化学发光核酸即时检测芯片的加样孔;所述纸基电化学发光核酸即时检测芯片包括自上而下分布的第一密封膜层、纸通道层、电极层及第二密封膜层;所述纸通道层包括由第一通道及第二通道组成的倒“山”型蜡印纸基微通道,所述第一通道的第一端为加样区,所述第一通道上设置有检测区,所述检测区固定有电化学发光试剂;所述加样区预固定有恒温扩增试剂;所述第一通道的第二端连接所述第二通道;所述电极层包括三电极,所述三电极区与所述检测区位置对应;所述第一密封膜层对应加样区设置有加样孔;
检测区固定电化学发光试剂的步骤如下:将电化学发光试剂三联吡啶钌包埋进羧基化介孔硅球中,并用氨基化修饰的ssDNA封闭;将洗涤干燥制得的ssDNA-Ru@介孔硅球用共反应物N-丁基二乙醇胺溶解固定于电极上方的检测区上;
将纸基电化学发光核酸即时检测芯片置于电化学发光检测仪中进行检测,得到检测曲线,并根据所述检测曲线确定待检测核酸样品的浓度。
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