KR100381462B1 - 전기화학발광을이용한생체분자반응속도측정방법 - Google Patents

전기화학발광을이용한생체분자반응속도측정방법 Download PDF

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로렛 내캐멀리
조나단 케이. 레랜드
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Abstract

효소 반응 또는 친화성 결합 반응과 같은 생체분자 반응은 생체분자 반응 속도를 측정하기 위하여, 반응물, 반응 파트너 또는 반응 파트너의 반응 산물의 농도를 전기화학발광 강도와 관련시키는 발광단을 포함하는 시약을 포함하는 시약 혼합물을 사용하여 전기화학 셀 중에서 수행된다. 반응 파트너는 반응물과 반응하고 자체 또는 이의 반응 산물이 발광단과 참여하여 ECL 방출을 초래하는 시약이다. ECL 강도는 시약 혼합물에 설정된 간격의 시간과 지속기간 동안 설정된 전위로 인가되는 일련의 전기 펄스로 조정된다. 강도는 값(P)의 타이밍된 시리즈를 제공하기 위하여 이들 간격 동안에 측정된다. 동일 실험을 2회 반복하는 데 한번은 반응이 완료된 후에 조정하여 값(C)의 타이밍된 시리즈를 수득하고, 마지막에는 반응 파트너의 부재하에서 반응을 수행하여 값(B)의 타이밍된 시리즈를 수득한다. 결과를 수학식 1을 사용하여 표준화하여(N) 반응의 시간 경과를 수득하기 위하여 플로팅되는 값(N)의 시리즈를 수득한다.
[수학식 1]

Description

전기화학발광을 이용한 생체분자 반응속도 측정 방법
생체분자 반응의 과정을 측정하기 위한 다양한 공지된 방법이 있고 본 방법은 이러한 반응의 속도를 모니터하기 위한 신규한 방법을 제공한다. 예를 들면, 효소 반응의 과정은 분광광도법 및 형광에 의해 모니터되어 왔다. 이러한 방법 및 다른 방법은 현대적 실험실에서 사용되고 있고 본 발명의 신규한 분석 기술의 발달을 위한 참고 데이타를 수득하기 위해 출원인에 의해 사용되었다.
항원-항체 반응 속도는 생체분자 상호작용을 검출하기 위한 표면 플라스몬 공명을 사용한 실시간 바이오특이 상호작용 분석으로 불리는 기술을 사용하여 측정될 수있다. 본 방법은“Label-Free Biosensor Technology Visualizes Biomolecular Interactions in Real Time”, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 8, No. 2, Products and Innovations, pp. ?-ⅹⅳ의 제목의 논설에 연구의 통상적 방법에 대한 가치있는 보충으로 보고되었다. 표면 플라스몬 공명의 사용은 또한“Integrated Fluid Handling System for Biomolecular Interaction Analysis”, Analytical Chemistry 1991, Vol. 63, pp. 2338-2345내에 Sjolander, S.와 Urbaniczky에 의해 설명되어 있다. 본 방법에 따라서, 항원과 항체 사이의 생체분자 상호작용을 위한 속도가 표지화없이 직접 수행될 수 있다. 본 방법은 직접 낮은 농도의 고분자량을 가진 생화학적으로 활성인 분자를 검출하는데 유용하다.
용액내 항원-항체 평형의 해리 상수(KD)의 측정을 위한 일반적 방법이“Mesurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complexes by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, Journal of Immunological Method 1985, Vol. 77, pp. 305-319에서 Friguet, B., et al에 의해 보고되었다. 본 방법은 고전적 간접 ELISA를 사용하고 매우 작은 농도의 항체의 측정 및 10-9M 정도의 KD값의 측정을 허용하는 것으로 보고되었다.
본 발명의 방법 및 시스템은 화학적 잔기의 정량 및 정성 분석을 위한 분석 방법에서 앞서 사용된 전기화학발광을 사용한다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,310,687 호에서 하나 이상의 전기화학발광 유기금속 화합물에 부착된 화학, 생화학 또는 생물학적 물질을 포함하는 화학적 잔기가 기재되어 있다. 화학발광, 전기화학발광 및 광-발광 수단을 사용한 화학적 잔기의 낮은 농도 검출을 위한 방법이 기술되어 있다. 루테늄-함유 및 오스뮴-함유 표지 또는 기타 전기화학발광 표지과 관련된 표지 물질을 위해 유용한 화합물이 기재되어 있다. 표지된 물질은 결합 분석 및 비교 결합 분석의 검출 및 분석물 정량을 위한 방법에서 유용하다.
임상적 사용, 연구 실험실등의 진단 키트에서 사용될 수 있는 생체분자 반응 및 방법의 과정을 모니터하기 위한 전기화학발광을 사용하는 방법 및 시스템이 발견되었다. 본 발명은 시판되는 장비를 사용하고 효소 활성 또는 농도의 진단 측정을 위한 매우 정확한 수단을 제공한다. 본 방법은 또한 항체-항원 결합 속도 측정하기 위한 수단을 제공하고 고결합 속도 항체를 위한 스크리닝에 유용하다. 하나의 양태에서, 한 방법은 암종 배의 항원에 결합된 항체의 속도 측정을 위해 고안되었다. 다른 양태에서, 한 방법은 임상적 적용을 위한 락테이트 데하이드로게나제 측정을 위해 고안되었다.
본 발명은 생체분자 반응의 속도 측정을 위한 분석 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체분자 반응의 과정을 실시간으로 모니터하기 위한 전기화학발광(“ECL”)에 관한 것이다. 본 방법은 친화도 결합 반응의 과정을 모니터하기 위해 사용될 수 있고, 그 자체로 다른 것 중에서 항체-항원 결합 속도 측정에 또한 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백하게될 바와 같이 효소 활성 또는 농도의 진단 측정 및 다른 속도 측정을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서 모니터되는 생체분자 반응은 반응물의 농도 또는 ECL 세기에 대한 반응의 생성물과 관련된 반응 조건하에서 발광단을 사용하여 수행되야 한다. 따라서, 반응에 사용된 시약은 반응물과 반응하는 반응 파트너를 포함하고 발광단과 함께 ECL의 방출을 일으킨다. 임의의 양태에서, 시약은 발광단과 함께 ECL의 방출을 일으키는 반응 파트너의 반응 생성물이다. 본 발명의 방법은 또한 생체분자 반응의 ECL 세기의 변조 및 측정과 세기 측정의 탈변조를 요구한다.
생체분자 반응은 전기화학적 셀에서 수행되고 전기적 펄스의 시리즈는 ECL출력을 조절하기 위해 예비선택된 전위와 예비선택된 시간 간격의 상수 및 지속 상수에서 적용된다. 생성된 발광의 세기는 방법(P)에서 반응으로 불리는 값의 시간 시리즈를 제공하기 위한 동일한 간격에서 측정된다. ECL 세기가 반응 완결(C)으로 불리는 값의 시간 시리즈를 제공하기 위한 동일한 조건하에서 펄싱 및 발광 측정에 의해 측정되기 전에 완성으로 가는 것을 허용하는 것을 제외하고는 동일한 실험을 반복한다. 동일한 실험을 반응 파트너없이 3번 반복하고 ECL 세기를 블랭크(백그라운드)(B)로 불리는 값의 시간 시리즈를 제공하기 위해 동일한 간격에서 3번 측정한다.
반응 과정, 반응의 농도 대 시간은 세기 측정 탈조절에 의해 측정된다. 이것은 방법(P)에서 반응으로부터 블랭크(B)를 제하고 블랭크(B)보다 반응 완결(C)의 차이에 의해 나뉨으로써 수행된다. 따라서, 효소 반응(P)은 수학식 1에 의하여 표준화(N)된다.
[수학식 1]
Figure pct00001
시간 과정을 시간에 걸쳐 농도를 측정하기 위해 공지된 표준과 비교하고 반응 속도는 농도 대 시간 곡선상에서 제 1 유도체(탄젠트 기울기)을 취함으로써 시간내 임의의 시점에서 결정될 수 있다.
본 발명의 효소 측정 방법은 ECL 활성 물질을 생산하거나 소비하는 효소 반응을 요구한다. 반응이 진행됨에 따라 ECL 세기가 ECL 활성 물질의 농도에 따라변화된다. 발광단과 ECL 활성 물질(또는 ECL 활성 물질을 생산하는 물질)을 다른 반응물과 혼합한다. 효소를 마지막으로 첨가하고 반응은 전기화학적 셀에서 진행하도록 한다. 상기 설명한 바와 같이, 전기적 펄스의 시리즈를 적용하고, ECL 세기를 측정하고 반응의 시간 과정을 수득하기 위해 탈조절한다. 결합 반응 속도, 예를 들면, 항체-항원 결합 속도의 측정에서 2개 시약이 결합 전에 제조된다. Ru(2,2-비피리딘)3 2+(본원에서“Ru(bpy)3 2+”로 약칭하기도 하고 비피리딘 리간드 자체는“bby”로 약칭된다) 같은 발광단은 결합 속도가 결정된 항체에 부착되고, 항원(반응 파트너)은 마그네틱 비드에 부착된다. Igen, Inc., 1530 East Jefferson Street, Rockville, MD 20852, U.S.A.로부터 시판되는 ORIGEN?분석기가 마그네틱 비드를 함유한 샘플을 제거하고 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 샘플을 분석기의 전기화학적 유동 셀로부터 취하고 마그네틱 비드로 코팅된 항원을 자기를 직접 아래에 위치시킴으로써 유동 스트림으로부터 작동 전극상에 균일하게 침착된다. 결합이 개시되고 분석기의 전기화학적 유동 셀을 통해 연속적으로 표지된 항체를 빼냄으로써 진행된다. 결합이 진행됨에 따라 ECL 활성 표지가 마그네틱 비드에 결합한다. 전기적 펄스의 시리즈가 상기와 같이 적용된다. ECL내 융기가 결합이 진행됨에 따라 발생하고 반응 과정을 나타낸다. ECL 세기는 반응의 시간 과정을 수득하기 위해 탈조절된다.
본 발명에 따라 사용된 전기화학발광성 표지는 민감하고, 유해하지 않으며 저렴하여, 광범위한 적용에서 사용될 수 있다.
[바람직한 양태의 설명]
생체분자 반응의 시간 과정은 반응물을 함유한 제 1 시약 혼합물, 발광단 및 반응 파트너를 형성함으로써 본 발명에 따라 측정된다. 반응물은 반응 파트너와 반응하고 발광단은 반응 파트너와 함께 시약 혼합물이 전기적 에너지에 노출시 전기화학발광을 방출한다. 본 발명의 양태에서, 반응 파트너 자체보다 반응 파트너의 반응 생성물이 발광체와 함께 전기화학발광을 방출한다. 전기적 펄스의 시리즈는 예비선택된 전위와 예비선택된 시간 및 지속의 간격에서 제 1 시약혼합물에 적용시키고 전기화학발광은 각 간격의 값을 수득하기 위해 동일한 간격에서 측정한다.
제 2 시약 혼합물은 제 1 시약 혼합물과 동일하게 형성된다. 제 2 시약 혼합물의 시약은 반응이 완결될 때까지 반응하도록 하고 혼합물은 제 1 시약 혼합물과 같이 동일한 전위, 시간 및 지속의 간격에서 전기적 펄스의 시리즈에 노출된다. 전기화학발광은 또한 각 간격의 값을 수득하기 위해 제 1 시약 혼합물과 같이 동일한 간격에서 측정한다.
제 3 시약 혼합물을 형성시키고 이것은 반응 파트너를 함유하지 않는 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일하다. 전기적 펄스의 시리즈를 제 1 시약 혼합물과 동일한 전위, 시간 및 지속의 간격에서 제 3 시약 혼합물에 적용시킨다. 전기화학발광은 각 간격의 값을 수득하기 위해 제 1 시약 혼합물과 같이 동일한 간격에서 측정한다.
제 3 시약 혼합물을 위한 제 1 간격용 수득된 값은 제 1 차이점을 얻기위해제 1 시약 혼합물을 위한 제 1 간격용 수득된 값으로부터 빼낸다. 제 3 시약 혼합물을 위한 제 1 간격용 수득된 값은 또한 제 2 차이점을 얻기 위해 제 2 시약 혼합물을 위한 제 1 간격용 값으로부터 빼낸다. 제 1 차이점은 제 1 간격을 위한 표준화된 값을 수득하기 위해 제 2 차이점에 의해 분할된다. 표준화된 값은 시간 과정(농도 대 시간)을 예시하기 위해 구성될 수 있는 표준화된 값의 시리즈를 얻기 위해 각 연속적 간격용 동일한 방법으로 계산된다. 다른 수학적 작동은 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백할 것과 같이 데이타에서 수행될 수 있다.
본 발명의 시스템은 반응물, 발광단 및 반응 파트너를 함유한 제 1 시약 혼합물을 포함한다. 반응물은 반응 파트너와 반응하고, 발광단은 반응 파트너, 또는 반응 파트너의 반응 생성물과 함께 시약 혼합물의 전기적 에너지에 대한 노출시 전기화학발광을 방출하기 위해 관계한다. 시스템은 반응물이 반응하도록 허락된 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 2 시약 혼합물을 추가로 포함하고 반응된 시약을 포함한다. 반응 파트너를 함유하지 않는다는 점만을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 3 시약 혼합물이 또한 시스템과 함께 제공된다. 최종적으로, 시스템은 예비선택된 전위 및 예비선택된 시간과 지속의 간격에서 전기적 펄스의 시리즈에 대한 제 1, 제 2 및 제 3 시약 혼합물의 각각 분리된 노출을 위한 수단 및 동일한 간격에서 전기화학발광을 측정하기 위한 수단이 제공된다.
본 발명의 방법은 전기화학 셀 같은 전극으로 제공된 장치에서 수행된다. 본 발명에 따라 모니터된 생체분자 반응은 반응물의 농도, 반응 파트너 또는 ECL 세기에 대한 반응 파트너의 반응 생성물에 관계된 반응 조건하에서 발광단을 사용한 장치에서 수행되고, 반응 파트너는 반응물과 반응하는 시약이고 발광단(또는 이의 반응 생성물)과 함께 ECL의 방출을 일으킨다.
생체분자 반응의 ECL 세기는 전극에 적용된 입력 전위의 수단에 의해 조절된다. 입력 전위는 측정가능한 ECL 출력을 방출하기 위해 대기 온도에서 약 200 nanometers(“nm”) 내지 900 nm 파장에서 발광하는 발광단의 여기 상태를 만듬으로써 발광단을 유도한다. 입력 전위는 시간(예를 들면, RAMP 방법)에 대해 증가하고, ECL 출력은 전압 변화에 대한 반응으로서 검출된다. ECL 피크는 입력 전위에 의해 유도된 전기화학적 반응(피크 전위)의 전위에서 일어난다.
ECL 발생의 다른 방법은 입력 전압 또는 피크 전위보다 높은 곳에서 단계적인 것이다. ECL은 시간에 따라 쇠하는 샤프한 피크로서 관찰된다.
본 발명의 방법에 따라 짧은 펄스의 시리즈가 또한 피크 전위보다 약간 높은 전압에서 전극에 적용된다. 결과는 각각의 전압 펄스에 상응하는 ECL 피크의 시리즈이다. 이 방법에서, ECL 신호의“샘플링”은 시간 및 시간이 따라갈 수 있는 반응의 과정에서 일정한 간격에서 수득된다. 이 조절된 ECL 신호의 세기는 각 시간 간격에서 측정될 수 있고 측정은 반응의 시간 과정을 수득하기 위해 탈조절된다.
ECL 반응은 좁은 전압 펄스를 사용한 본 발명의 방법에 의해 느려지고 생체분자 반응에 기인하는 쇠퇴율은 ECL 반응에 기인하는 쇠퇴율과 비교된다.(효소 반응 없이 진행되는 ECL 반응에서, 높은 값에서 하나의 긴 펄스가 시간에 대해 쇠퇴하는 ECL 세기를 제공한다.) 펄스사이의 시간 간격에서, 신규한 물질이 전극에 산포되고 다음 전압 펄스가 올때까지 반응할 준비가 되고, 따라서 각 ECL 피크는 앞의 피크보다 약간 작게된다.
몇 개의 파라미터가 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백한 바와 같이, 각 특정 생체분자 반응을 위한 속도 측정을 위한 더 좋은 조건을 제공하기 위해 이러한 펄스 전위 및 지속, 휴지 전위(즉, 펄스사이의 간격중 전위)와 각 펄스 사이의 시간 및 반응물의 농도가 조절될 수 있다.
전기적 펄스의 시리즈가 ECL 출력을 조절하기 위해 예비선택된 전위 및 예비선택된 시간의 일정한 간격 및 일정한 지속에서 적용되고, 생성된 발광의 세기는 과정(P)에서 반응으로 불리는 값의 시간 시리즈를 제공하기 위해 동일한 간격에서 측정된다. ECL 세기가 반응 완결(C)으로 불리는 값의 시간 시리즈를 제공하기 위한 동일한 조건하에서 펄싱 및 발광 측정에 의해 측정하기 전에 완결로 가는 것을 허용하는 것을 제외하고는 동일한 실험을 반복한다. 동일한 실험을 반응 파트너없이 3번 반복하고 ECL 세기를 불랭크(B)로 불리는 값의 시간 시리즈를 제공하기 위해 동일한 간격에서 3번 반복한다.
시간 과정, 반응의 농도 대 시간은 세기 측정 탈조절에 의해 측정된다. 이것은 방법(P)에서 반응으로부터 블랭크(B)를 제하고 블랭크(B)보다 반응 완결(C)의 차이점에 의해 나뉨으로써 수행된다. 따라서, 효소 반응(P)은 수학식 1에 의하여 표준화(N)된다.
Figure pct00002
시간 과정은 시간에 걸쳐 농도를 측정하기 위해 공지된 방법과 비교하고 반응 속도는 농도 대 시간 곡선상에서 제 1 유도체(탄젠트 기울기)를 취함으로써 시간내 임의의 시점에서 결정될 수 있다.
효소 반응에 적용되는 바와 같이 본 발명의 방법은 일반적으로 옥시도-리덕타제 반응의 속도를 측정하기에 맞추어져 있다. 옥시도 리덕타제는 산화 환원 반응을 촉매하고 (1) >CH-OH; (2) >C=O; (3) >C=CH-; (4) >CH-NH2; (5) > CH-NH-; 및 (6) NADH; NADPH 로 작용하는 바와 같이 6개의 부류로 분류된다.
본 발명의 방법에 특히 적절한 옥시도 리덕타제의 부류는 데하이드로게나제이다. 그룹으로서, 데하이드로게나제는 조인자로서 이들의 활성이 필요하다. 조인자는 비단백질 성분이고 금속 이온 또는 조효소로 불리는 유기 분자일 수 있다. 데하이드로게나제를 위한 적절한 조인자(옥시다제 및 다른 효소)는 문헌에 기재되어 있고 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 데하이드로게나제를 위한 통상적인 조효소는 예를 들면, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH) 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(NADPH)이다.
일반적으로, 데하이드로게나제, 예로서 NADH를 사용하여 촉매된 반응은
환원된 기질 + NAD+= 산화된 기질 + NADH
와 같고 반응은 양 방향으로 진행할 수 있다. 기질은 효소가 촉매성 반응을 일으킬 수 있는 분자이다. 환원된 기질의 예에는 이소사이트레이트, 에탄올, 락테이트, 말레이트, 및 글루코오스-6-포스페이트가 포함된다.
본 발명의 효소 속도 측정 방법에 따라, ECL 활성(즉, 반응 파트너) 및 효소 반응의 반응물과 공-반응하는 물질(조인자)이 사용된다. 대안적으로는, ECL 활성 물질이 반응 파트너의 반응 생성물일 수 있다. 앞서 지적한 바와 같이, 조인자는 NADH와 NADPH 및 이들의 각각 산화된 형태인 NAD+와 NADP+를 포함하고, 옥시다제와 사용하기 특히 적절한 데하이드로게나제 및 과산화수소(H2O2)의 사용에 특히 적절하다.
효소 반응은 ECL 활성 물질을 생산하거나 소비해야 한다. 과정이 진행되는 동안, 물질은 ECL 세기에 대한 물질의 농도에 관계된 ECL을 위해 사용된다. 예를 들면, NADH는 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제용 효소 반응 속도를 측정하기 위해 다음 반응식이 사용된다.
(1) 글루코오스-6-포스페이트 + NAD+= 6-포스포글루코네이트 + NADH
(2) NADH + Ru(bpy)3 2+= ECL
상기식에서, 반응 (1)은 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및 Ru(bpy)3 2+의 존재하에서 수행된다. NADH가 생성됨에 따라 반응 (2)에 따른 Ru(bpy)3 2+와 반응하고, 전기적 펄스가 적용될 때, ECL을 생성한다. ECL의 세기는 NADH의 생산 증가율에 따라 증가하고 NADH 생산 감소율에 따라 감소한다.
대안적으로는, 다음 반응식에서 소비되는 NADH는 락테이트 데하이드로게나제(LDH)용 효소 반응 속도를 측정하기 위해 사용된다:
(3) 피루베이트 + NADH = NAD++ 락테이트
(4) NADH + Ru(bpy)3 2+= ECL
상기식에서, 반응 (3)은 LDH 및 Ru(bpy)3 2+의 존재하에서 수행된다. NADH는 반응 (4)에 따른 Ru(bpy)3 2+와 다소 반응하여 소비되고, 전기적 펄스가 적용될 때, ECL을 생성한다. ECL의 세기는 NADH의 소비 증가율에 따라 증가하고 NADH 소비 감소율에 따라 감소한다.
NADH는 다양한 효소 반응에 참여하기 때문에 본 발명의 효소 속도 측정 방법에 따른 사용을 위해 특히 적절한 공반응물이다. 기질은 효소에 의해 생성물로 전환되고, 과정중에서 NADH가 반응에 따라 NAD+또는 반대로 전환된다. NADH가 생산(또는 소비)됨에 따라 발광단과 함께 ECL을 수득한다. 빛의 세기는 각 시간 점에서 NADH의 농도에 비례한다. NADH 농도 변화는 효소 촉매 반응의 활성과 관련있다. 신호는 배경의 점-점 삭제 및 시간 과정을 수득하기 위한 NADH의 개시(또는 최종) 농도로 발광단의 신호를 표준화시킨 후에 시간에 대해 도시한다.
궁극적으로 전기화학발광을 생성하는 공반응물로서 Ru(bpy)3 2+와 NADH 사이의반응 메카니즘은 다음 (1)에 따른 전극에서 Ru(bpy)3 2+를 산화시키는 제 1 단계를 포함한다.
(1) Ru(bpy)3 2+→ Ru(bpy)3 3++ e-
NADH는 또한 양성자 손실에 의한 전극에서 산화되고 다음 (2)에 따른 강력한 환원제, NAD 라디칼을 생성한다.
Figure pct00003
다음 NAD 라디칼은 균일한 반응 (3)에서 Ru(bpy)3 3+와 반응한다. 에너지 전환이 루테늄 복합체를 이의 여기 상태로 다음과 같이 올리기 위해 충분하다.
Figure pct00004
바닥 상태로 붕괴시 꼬리 분자는 반응 (4)에 따라 620 nm에서 검출가능한 빛을 방출한다.
(4) Ru(bpy)3 2+*→ Ru(bpy)3 2++ hv
본 발명의 효소 속도 측정 방법은 샘플 튜브내에서 모든 반응물을 혼합함으로써 수행되고, 효소는 최종적으로 첨가된다. 효소 첨가시, 샘플이 ORIGEN?분석기의 전기화학적 셀내로 들어간다. 전기적 펄스의 시리즈는 시간의 일정한 간격 및 일정한 지속에서 적용된다.(ORIGEN?분석기는 방형파를 발생하지만, 삼각 또는 싸인파가 또한 사용될 수 있다.) 발광단으로부터 생성된 발광은 측정되고 효소 반응 과정으로서 형성된 생성물의 양을 나타낸다.
결합 반응에 적용된 본 발명의 방법은
항-CEA에 대한 CEA같은 항체-항원;
호르몬의 수용체에 대한 호르몬 결합과 같은 리간드-수용체;
아비딘-바이오틴;
DNA 하이브리드화 반응과 같은 염기 짝짓기;
레씨틴-탄수화물; 및
효소-억제제 같은 반응을 모니터하기 위해 사용될 수 있다.
결합 반응 속도의 측정에서, 2개의 시약이 결합전에 제조된다. 예를 들면, 항체-항원반응이 포함될 때, 발광단이 결합 속도가 결정된 항체(반응물인 항체)에 부착되고, 항체(반응 파트너)가 마그네틱 비드에 부착된다. ORIGEN?분석기는 마그네틱 비드를 함유한 샘플을 분배하고 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 샘플이 분석기의 전기화학적 유동 셀에서 끌어낸 샘플과 마그네틱 비드 코팅된 항체가 자기를 직접적으로 아래에 위치시킴으로써 유동 스트림으로부터 작동 전극상에균일하게 침착된다. 결합이 개시되고 분석기의 전기화학적 유동 셀을 통해 연속적으로 표지된 항체를 빼냄으로써 진행된다. 결합이 마그네틱 비드에 대한 ECL 활성 표지를 나타낸다. 전기적 펄스의 시리즈는 전술한 바와 같이 적용된다. ECL내 솟음은 결합으로서 반응 과정을 나타낸다. ECL 세기는 반응의 시간 과정을 수득하기 위해 탈조절된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 발광단은 2개의 부류, 즉, 유기 화합물 및 무기 화합물로 나뉜다. 유기 화합물에는 루브렌, 9, 10-디페닐안트라센, 프탈로시나닌, 및 페난트렌 같은 형광 또는 인광 폴리방향족 탄화수소가 포함된다. 무기 화합물에는 루테늄 트리스-비피리딘, 오스뮴 트리스-비피리딘, 백금 디포스포네이트, Mo6Cl12 2-; 유기금속 화합물; 테르븀 테노일트리플루오로아세토네이트 같은 희토류 킬레이트; 유로퓸 디벤조일메티드; 및 실리콘 프탈로시아닌 같은 주요 그룹 킬레이트 같은 형광 또는 인광 전이 금속 킬레이트가 포함된다. 특히 유용한 발광단은 Ru-함유 및 Os-함유 화합물이다.
미국 특허 제 5,310,687 호에 기재된 발광단은 본 발명에 따른 발광단으로서 사용할 수 있고 이렇게 기재된 것 중에 Ru(2,2-비피리딘)3 2+같은 루테늄 복합체가 바람직하다.
본 발명에 대한 특정 표지는 전기화학발광에 관한 것이다. 특정 표지는 전자기적 복사 또는 통상적인 옥살레이트-H2O2시스템에 의해 생성되는 것과 같은 화학적 에너지에 화합물을 노출시킴으로써 이들의 산화 또는 환원없이 발광 상태로 여기될 수 있다. 또한, 이러한 화합물의 발광은 산화 및 환원을 수반하는 전기화학적 방법에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 방법은 전기적 펄스로 이러한 표지의 여기를 사용해야 한다.
확장된 작업이 광발광, 화학발광, 및 전기화학발광의 방법을 사용하여 Ru(2,2'-비피리딘)3 2+를 검사하는 방법에 대해 보고되어 있다 : [참고문헌 ; Rubenstein and Bard(1981), "Electrogenerated Chemiluminescence. 37. Aqueous Ecl Systems based on Ru(2,2'-비피리딘)2 2+and Oxalate or Organic Acids", J. Am. Chem. Soc. 103, pp 512-516; and White and Bard(1982), "Electrogenerated Chemiluminescence. 41. Electrogenerated Chemiluminescence and Chemiluminescence of the Ru(bpy)3 2+-S2O8 2- System in Acetonitrile-Water Solution", 104, p. 6891.] 이러한 작업은 밝은 오렌지색 화학발광이 화학적으로 발생한 또는 전기 발생한 Ru(bpy)3 3+의 옥살레이트 이온 또는 기타 유기산의 산화의 중간체로서 생성된 강한 환원제와의 수상 반응을 기본으로 할 수 있다는 것을 나타낸다. 발광은 또한 화학적으로 발생한 또는 전기발생한 Ru(bpy)3 1+의 퍼옥시디설페이트의 환원동안 발생한 강한 산화제와의 반응에 의해 유기 용매 H2O 용액에서 수행될 수 있다. Ru(bpy)3 2+로부터 전기화학발광 생성의 세번째 메카니즘은 Ru(bpy)3 1+를 생성하기에 충분히 음인 전위와 Ru(bpy)3 3+를 생성하기에 충분히 양인 전위 사이에서의 전극 전위의 진동을 포함한다. 이러한 세가지 방법은 각각 "산화적-환원", "환원적-산화", 및 " Ru(bpy)3 3+/+재발생 시스템"이라고 불린다.
산화적-환원 방법은 물에서 수행되어 산소 또는 불순물의 존재시에 상대적으로 비민감성인 강력하고, 효율적이며, 안정한 발광을 생성할 수 있다. Ru(bpy)3 2+로부터의 이러한 발광은 옥살레이트 또는 피루베이트, 락테이트, 말로네이트, 타트레이트 및 시트레이트와 같은 기타 유기산의 존재, 및 Ru(bpy)3 3+종을 산화적으로 생성하는 방법에 좌우된다. 이러한 산화는 PbO2또는 Ce(Ⅳ)염과 같은 강한 산화제에 의해 화학적으로 수행될 수 있다. 이것은 연속적으로 또는 간헐적으로 적용된 충분히 양인 전위에 의해 전기화학적으로 수행될 수 있다. Ru(bpy)3 3+의 전기화학적 산화에 적합한 전극은 예를 들면 Pt, 퓨로리틱 흑연 및 유리 탄소이다.
환원-산화 방법은 예를 들면 아세토니트릴과 같은 유기 공용매를 함유하는 부분적 수상 용액에서 수행될 수 있다. 이러한 발광은 퍼옥시디설페이트의 존재와 여기된 종을 환원적으로 생성하는 방법에 좌우된다. 환원은 연속적으로 또는간헐적으로 적용된 충분히 음인 전위에 의해 전기화학적으로 수행될 수 있다. Ru(bpy)3 2+의 전기화학적 환원에 적합한 전극은 예를 들면 광낸 유리-탄소 전극이다.
Ru(bpy)3 3+/+재발생 시스템은 Ru(bpy)3 2+를 환원하기에 충분히 음인 전위와 Ru(bpy)3 2+를 산화하기에 충분히 양인 전위 사이에서 전극 전위에 펄스를 발생시킴으로써 아세토니트릴과 같은 유기 용매 또는 부분 수상 시스템에서 수행될 수 있다. 이러한 재발생 시스템에 적합한 전극은 예를 들면 Pt 전극이다. 이러한 시스템은 화학적인 시약을 소모하지 않고 원칙적으로 무제한의 기간동안 진행할 수 있다.
발광 Ru-함유 화합물을 생성하는 이러한 세가지 방법은 공통적으로 Ru-함유 화합물의 반복적인 산화-환원 또는 환원-산화를 지닌다. 그러므로 이러한 화합물을 함유하는 용액의 발광은 적용된 에너지원의 전기 전위에 주로 좌우되고, 따라서 Ru-함유 화합물의 존재에 대해 매우 진단적이다.
본 발명에 따라서, 화학적인 잔기가 하기 화학식을 갖는 데에 사용될 수 있다.
[화학식]
Figure pct00005
상기식에서,
M은 루테늄 또는 오스뮴이고;
P는 M의 다좌 리간드이며;
L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6는 M의 리간드이고, 각각은 각각의 다른 리간드와 동일하거나 상이할 수 있으며;
D는 하나 이상의 아미드 또는 아민 결합을 통하여 하나 이상의 P, L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6에 공유 결합한 물질이며;
m, t, u는 1 이상의 정수이며;
각각의 n, o, p, q, r 및 s는 0 또는 정수이며;
P, L1, L2, L3, L4, L5, L6및 D는 화학적 잔기가 전자기 방사선을 방출하도록 유도될 수 있는 이러한 조성물과 번호이고, M의 리간드에 의해 제공된 M에의 결합의 총수는 M의 배위수와 동일하다.
본 발명은 또한 발광 루테늄- 또는 오스뮴-함유 표지를 화학적, 생화학적 및 생물학적 물질의 아미노 그룹에 부착하는 데에 중간체로서 특히 적합한 화합물을 사용한다. 따라서 이러한 중간체는 특히 본 발명에 따라서 사용된 화학적 잔기를 생성하는 데에 특히 적합하다. 중간체는 루테늄 또는 오스뮴 비스(2,2'-비피리딘)(2,2'-비피리딘-4,4'디카복실산)의 모노- 및 디-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 및 이의 염; 및 루테늄 또는 오스뮴 비스(2,2'-비피리딘)(4,4'-디(클로로메틸)-2,2'-비피리딘이다. 이러한 화합물은당분야에 공지되어 있는 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 루테늄-함유 또는 오스뮴-함유 화학적 잔기를 흥미의 분석을 포함하는 비율 측정의 결합 방법에 사용할 수 있다.
[화학식]
(A)k(D)u
상기식에서,
A는 전기화학적 에너지원으로의 직접적인 노출에 의해 반복적으로 ECL을 방출하도록 유도할 수 있는 화합물이고;
D는 A에 부착된 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 혈청-유도 항체 또는 모노클론 항체와 같은 물질 ( 및 본 명세서에서 후술될 다른 물질)이며;
k와 u는 1 이상의 정수이며;
a) 화학적 잔기를 함유하는 적합한 상태하에서 시약 혼합물을 형성하고,
b) 본 발명의 방법에 따라서 조절된 전기 에너지를 적용한 다음 ECL을 탈조절시킴으로써 화학적 잔기가 반복적으로 ECL을 방출하도록 유도하는 과정을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서 M은 루테늄이다. 본 발명의 다른 양태에서 M은 오스뮴이다.
화학적 잔기는 적어도 하나의 M의 다좌 리간드를 가져야 한다. 잔기가 하나 이상의 다좌 리간드를 가질 경우, 다좌 리간드는 동일하거나 상이할 수 있다. 다좌 리간드에는 방향족 및 지방족 리간드가 포함된다. 적합한 방향족 다좌 리간드에는 방향족 헤테로사이클 리간드가 포함된다. 바람직한 방향족 헤테로사이클 리간드는 예를 들면 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 페난트롤릴 및 포피린과 같은 질소-함유물이다.
적합한 다좌 리간드는 당분야에 공지되어 있는 치환체의 여타 대수에 의해 비치환 또는 치환될 수 있다. 적합한 치환체에는 예를 들면 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴, 아랄킬, 치환 아랄킬, 카복실레이트, 카복시알데하이드, 카복스아미드, 시아노, 아미노, 하이드록시, 이미노, 하이드록시카보닐, 아미노카보닐, 아미딘, 구아니디늄, 유레이드, 말레이미드, 황-함유 그룹, 인-함유 그룹 및 N-하이드록시숙신이미드의 카복실레이트 에스테르가 포함된다.
추가로, L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6의 적어도 하나는 다좌 방향족 헤테로사이클 리간드일 수 있다. 더욱이 이러한 다좌 방향족 헤테로사이클 리간드는 질소를 함유할 수 있다. 적합한 다좌 리간드에는 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 페난트롤릴, 포피린, 치환 비피리딜, 치환 비파라질, 치환 터피리딜, 치환 페난트롤릴 또는 치환 포피린이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 치환 다좌 리간드는 알킬, 치환 아킬, 아릴, 치환 아릴, 아랄킬, 치환 아라킬, 카복실레이트, 카복스알데하이드, 카복스아미드, 시아노, 아미노, 하이드록시, 이미노, 하이드록시카보닐, 아미노카보닐, 아미딘, 구아니디늄, 유레이드, 말레이미드, 황-함유 그룹, 인-함유 그룹 또는 N-하이드록시숙신이미드의 카복살레이트 에스테르로 치환될 수 있다.
화학적 잔기는 각각 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 페난트롤릴, 치환 비피리딜, 치환 비피라질, 치환 터피리딜 또는 치환 페난트롤릴인 2개의 2좌 리간드를 함유할 수 있다.
또한 화학적 잔기는 각각 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 페난트롤릴, 치환 비피리딜, 치환 비피라질, 치환 터피리딜 또는 치환 페난트롤릴인 3개의 2좌 리간드를 함유할 수 있다. 화학적 잔기는 루테늄을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 화학적 잔기는 루테늄, 2개의 2좌 비피리딜 리간드 및 하나의 치환 2좌 비피리딜 리간드를 포함한다. 또다른 양태에서 화학적 잔기는 포피린 또는 치환 포피린과 같은 4좌 리간드를 함유할 수 있다.
화학적 잔기는 당분야에 공지되어 있는 매우 다양한 하나 이상의 단좌 리간드를 가질 수 있다. 적합한 단좌 리간드에는 예를 들면 일산화탄소, 시아나이드, 이소시아나이드, 할라이드 ,및 지방족, 방향족 및 헤테로사이클릭 포스핀, 아민, 스티빈 및 아르신이 포함된다.
화학적 잔기는 특히 바람직한 양태에는 비스(2,2-비피리딜)루테늄(Ⅱ) 및 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(Ⅱ)이 포함된다.
M의 하나 이상의 리간드는 예를 들면 방사표지 동위원소, 형광 성분 또는 부가적인 발광 루테늄- 또는 오스뮴-함유 센터와 같은 부가적인 화학적 표지에 부착될 수 있다.
적합한 물질(D)에는 다수의 생물학적 물질, 예를 들면 모든 세포, 바이러스, 아세포 입자, 단백질, 지방단백질, 당단백질, 펩티드, 핵산, 다당류, 지방다당류, 지방, 지방산, 세포 대사산물, 호르몬, 약리학적 제제, 정신안정제, 바비츄레이트,알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산 및 당이 포함된다. 모든 세포는 동물, 식물 또는 박테리아의 세포일 수 있고, 생존하거나 치사한 것일 수 있다. 실시예에는 곰팡이와 선충류와 같은 식물 병원체가 포함된다. 이러한 출원에서, 용어 "아세포 입자"는 생존하는 유기체로부터 유도된 아세포 기관, 분쇄된 세포의 막 입자, 세포벽의 분획, 리보솜, 다효소 복합체 및 기타 입자를 의미한다. 또한 이러한 적용에서, 핵산은 다수 근원으로부터 유도된 염색체 RNA, 플라스미드 RNA, 바이러스 RNA 및 재조합 INA를 의미한다. 핵산에는 또한 RiAs, 예를 들면 메신저 RiAs, 리보솜 IRNAs 및 운반 RNAS가 포함된다. 폴리펩티드에는 예를 들면 효소, 전달 단백질, 수용체 단백질 및 바이러스 코트 단백질과 같은 구조 단백질이 포함된다. 바람직한 폴리펩티드는 효소 및 혈청-유도 항체이다. 특히 바람직한 폴리펩티드는 모노 클론 항체이다. 호르몬에는 예를 들면 인슐린 및 T4 갑상선 호르몬이 포함된다. 약리학적 제제에는 예를 들면 심장 글리코시드가 포함된다. 합성 펩티드, 합성 핵산 및 합성 막, 소포 및 리포좀과 같은 생물학적 물질과 화학적으로 유사한 합성물질이 포함된다는 것이 또한 본 발명의 범주에 속한다. 전문은 본 발명에 사용하기 적합한 생물학적 물질의 포괄적인 리스트를 의도하지 않았으나 본 발명의 방대한 범주를 설명하고자 한다.
생물학적, 비생물학적 물질(D)는 하나 이상의 아미드 또는 아민 결합을 통하여 M의 리간드에 공유 결합한다. 아미드 결합인 경우에 결합은 물질(D)이 아미드 결합의 카보닐 또는 질소에 직접적으로 결합되도록 생성될 수 있다. 이러한 화학적 잔기는 이온화 될 수 있다. 이온화될 경우, 다수의 상이한 상대이온이 화학적잔기의 제조 전하를 중화하는 역할을 한다는 것이 당분야에 공지되어 있다. 적합한 양이온에는 예를 들면 H+, NH4 +, 구아니디늄, Ag+, Li+, N+, K+, Mg2+, 및 Mn2+이 포함된다. 적합한 음이온에는 예를 들면 할라이드, OH-, 카보네이트, SO4 2-, 헥사플루오로포스페이트 및 테트라플루오로보레이트가 포함된다.
화학적 잔기는 또한 발광 루테늄-함유 또는 오스뮴-함유 표지를 화학적, 생화학적 및 생물학적 물질에 부착시키기 위한 중간체로서 특히 적합하다. 따라서 이러한 중간체는 본 발명에 따라 화학적 잔기를 합성하는 데에 특히 적합하다. 중간체는 루테늄 및 오스뮴 4,4'-(디카복시)-2,2'-비피리딜, 비스(2,2'-비피리딜)의 모노- 및 디-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 및 이의 염; 및 루테늄과 오스뮴 4,4'-(디클로로메틸)-2,2'-비피리딜, 비스(2,2'-비피리딜) 및 이의 염이다.
이러한 중간체의 화학적 구조와 이들의 제조 방법이 전술된 U.S 특허 제 5,310,687 호에 기재되어 있다.
루테늄-함유 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 합성하는 바람직한 방법은 먼저 루테늄 디클로로비스(2,2'-비피리딘)을 나트륨 디카보네이트의 고온의 메탄올 수용액에서 2,2'-비피리딘-4,4'-디카복실산과 반응시키는 것이다. 산성화능 후, NAPF6수용액을 카복실화 루테늄 화합물 용액에 첨가한다. 이어서 루테늄 착물의 분리된 헥사플루오로포스페이트염을 디메틸포름아미드 중의 디사이클로헥실카보디이미드의 존재하에 N-하이드록시숙신이미드와의 반응에 의해 에스테르화한다. 물론, N-하이드록시숙신이미드 성분의 구조에 다수의 변종이 실질적으로 쓸모없는 중간체를 선택하지 않고도 가능하다.
중간체는 이온화될 수 있다. 이온화될 경우, 다수의 상이한 상대이온이 중간체의 제조 전하를 중화하고 염을 형성하는 역할을 한다는 것이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 염을 형성하기에 적합한 양이온에는 예를 들면 NH4+, 구아니디늄, Ag+, Li+, N+, K+, Mg2+, 및 Cd2+이 포함된다. 이러한 염을 형성하기에 적합한 음이온에는 예를 들면 할라이드, 카보네이트, SO4 2-, 헥사플루오로포스페이트 및 테트라플루오로보레이트가 포함된다.
중간체는 카복실레이트 에스테르를 부착하여 이에 의해 N-하이드록시숙신이미드를 치환하거나 클로로메틸 그룹을 부착하여 이에 의해 클로라이드를 치환할 수 있는 유리 아미노 그룹을 함유하는 물질을 표지하는 데에 유용하다.
Ru(bpy)3 2+-표지 물질에 대한 출원인의 경험은 화학적 표지로서 루테늄-함유 및 오스뮴-함유 화합물을 사용하는 것의 장점을 나타낸다. 이들은 장기간 동안 안정하고 매우 다양한 화학적, 생화학적 및 생물학적 물질에 효율적으로 부착될 수 있다. 표지는 안전하고 상대적으로 저렴하다. 이들은 매우 특징적인 신호를 부여하고 자연적으로 발생하지 않는다. 표지의 발광에 기초한 측정은 민감하고 신속하며 재생이 가능하다. 포스페이트 완충제 염류, 트윈(Tween)\(계면활성제), 간 조직 추출물 또는 혈청과 같은 성분에 의한 이러한 표지의 발광에 기초한 검사에는 간섭이 거의 없다. 이러한 표지의 발광을 기초로 하는 측정은 샘플 또는 표지된 물질을 손상하지 않고, 반복적으로 수행될 수 있다. 신호는 각각의 표지 분자에 의해 반복적으로 발생되며, 이로인해 이러한 표지가 검사될 수 있는 민감성이 발생한다.
시약 혼합물을 형성하기에 적합한 조건은 당분야 숙련가들에게 공지될 것이고, 시약 혼합물이 포함된 유형에 좌우될 것이다. 예를 들어, 수성 시약 혼합물에 적합한 조건에는 화학적 잔기의 적당한 농도 및 산화제, Ph, 염 농도 등과 같은 기타 시약이 포함될 수 있다. 고체 샘플에 대해서, 시약 혼합물을 형성하기에 적합한 조건에는 수행 액체의 첨가가 포함된다.
본 발명은 리간드의 화학적 구조를 변화시킴으로써 제조될 수 있는 매우 다양한 발광 잔기와 루테늄-함유 잔기 및 오스뮴-함유 잔기를 사용할 수 있다. 금속과 리간드에서의 이러한 각각의 변이는 발광 여기 상태를 생성하기 위해 요구되는 에너지 유입의 정확한 값을 변화시킬수 있다. 유사하게도, 방출된 전자기 방사의 파장은 루테늄-함유 또는 오스뮴-함유 물질의 성질 및 환경에 좌우될 수 있다. 일반적으로, 광발광 여기 및 방출은 약 200 ㎚ 및 약 900 ㎚ 파장 사이의 전자기 방사로 발생할 수 있다. 화학발광 및 전기화학발광 방출은 일반적으로 약 200 ㎚ 및 약 900 ㎚ 사이에 존재하는 방출된 전자기 방사로 발생할 것이다. 화학적 잔기의 산화 또는 환원이 발생할 전위는 용액의 Ph 및 사용된 전극의 성질과 같은 요소 및 정확한 화학적 구조에 좌우된다. 일반적으로, 광발광 시스템의 광학적 방출 및 여기 파장, 및 전기화학발광 및 화학발광 시스템의 광학적 전위 및방출 파장을 측정하는 방법이 당분야에 익히 공지되어 있다.
ORIGEN?분석기가 하기의 실험적인 작업에 사용되었다. 소모할 샘플을 공급하기에 앞서 기기의 규칙적인 작동이 샘플당 하나의 ELC 결과를 검사하기 위해서 수행된다. 규칙적인 작동을 변경하여 각각의 시험관이 개별적으로 분석될 수 있게 한다. 즉, 각 시험관의 내용물이 세포로 부여되고 일련의 펄스가 샘플에 적용되는 동안 거기에 남아 있도록 한다. 각각의 펄스는 데이터 포인트를 제공하여 일련의 테이터 포인트가 각각의 샘플에 대해 수득된다.
전형적으로, 효소 반응의 경우, 실행될 제 1 샘플(진행중인 반응)은Ru(bpy)3 2+분자와 효소를 제외한 효소 반응을 위한 모든 시약을 포함한다. 시험관은 분석기의 캐러젤에 부가되고 분석기가 가동된다. (전극의 표면을 작동에 앞서 소제한다.)
샘플 혼합물은 역시 시험관에서 와동된다. 이때 분석기는 정지하고 작동기가 효소에서 피펫팅하도록 경보를 발하도록 프로그래밍되어 있다. 일단 이것이 수행되면, 분석기의 작동은 초단위 시간을 순간적으로 기록하도록 회복된다. ECL 결과를 생성하는 각각의 전압 펄스와 함께 시간 스탬프가 제공된다. 이러한 방법으로 ECL 신호의 시간 경로가 수득된다.
제 1 시험관에 대해 모든 데이터를 수집한 후, 제 1 시험관과 동일한 조성물이 함유된 제 2 시험관이 이어진다. 이러한 경우를 제외하고 효소는 작용할 시간이 허용되고 반응이 완료된다. 이어서 샘플은 동일한 전압 체계에 포함된다. 제 1 시험관의 결과는 단지 ECL 결과(또는 ECL 붕괴)인 제 2 시험관의 결과로 정상화된다. (또한, 제 1 시험관과 동일한 농도로 NADH 및 RU(bpy)3 2+를 함유하는 시험관이 이러한 의도로 분석될 수 있다.)
기질을 제외한 모든 것을 함유한 제 3 의 시험관을 또한 백그라운드 목적으로 실행한다. 수적 정상화에 앞서 이러한 시험관의 ECL 결과를 한 항목씩 진행중인 시험관과 완료된 시험관으로부터 제거한다.
기기는 10 msec 당 하나의 데이터 포인트의 비율로 샘플링된다. 그러므로, 100 msec 길이의 펄스는 예를 들면 그 기간 동안 10개 샘플링을 수득한다.
이어지는 항체-항원 비율 측정에 대한 유사한 실험 프로토콜이 하기에 좀더 상세하게 설명되어 있다.
실시예 1
NADH가 발생되는 효소 반응
글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제("G-6-PDH")는 NADH로 환원되는 공반응제로서 NAD+와 함께 글루코스-6-포스페이트의 6-포스포글루코네이트로의 산화를 촉매한다. 반응은 하기와 같다:
[반응식]
G-6-PDH
글루코스-6-포스페이트 + NAD+──────→ 6-포스포글루코네이트 + NADH
실험은 pH 7.5, 50 ㎖ 인산 완충제에서 수행된다. 7.0 내지 7.5의 pH가 사용될 수 있고, 카보네이트 완충제가 인산 완충제 대신 사용될 수 있다. 용액은 0.53 g/L 트리톤(Triton) X-100을 함유한다. 완충제는 분석 완충제 및 샘플에 대한 배양 완충제 모두로서 사용될 수 있다. 발광단의 농도는 1E-4M Ru(bpy)3 2+이고, 발광단에 대한 전형적인 농도는 약 1E-6M 내지 약 1E-4M일 수 있다.
샘플은 ORIGEN?분석기가 0으로 기록될 때 시험관으로부터 ORIGEN?분석기의 전기화학적 셀에 부여된다. 셀 구획내인 동안 전극은 주로 0 내지 1800 mV의 일련의 펄스 대 Ag/AgCl이다. 펄스 기간은 460 msec이고 휴지 전위는 250 msec에 대해 0이다. 전형적인 펄스 비율은 100 내지 500 msec일 수 있다. 펄스의 수는 20이고, 약 10 내지 40일 수 있다.
반응의 역학 다음으로 ECL 결과를 NADH가 발생되어 Ru(bpy)3 2+과 반응하는 시간으로 모니터링하는 것이 이어진다. 반응은 약 7분후 약 50%의 완료에 도달한다.
실험은 ECL 강도가 측정되기 전에 반응이 완료되도록 한다는 점을 제외하고는 동일한 조건하에서 반복된다.
실험은 다시 NAD+가 반응 혼합물에 첨가되지 않는다는 점을 제외하고는 동일한 조건하에서 반복된다.
제 4의 실험은 반응을 분광측광기를 사용하여 분석한다는 점을 제외하고는 제 1 실행과 동일한 반응제를 사용하여 실행한다. 반응은 약 7분 후에 약 50%의 완료에 도달한다. 분광측광 결과를 본 발명에 대해 정상화된 곡선에 비교하면 이들은 잘 연관된다.
실시예 2
인 그룹의 억제 효과
포스페이트 완충제의 농도가 인산 그룹의 억제 효과를 설명하기 위해서 다양화된다는 점을 제외하고는 실시예 1의 실험이 반복된다. 절반 양의 기질을 산물로 전환하는 데에 소요되는 시간(t1/2)으로 표현된 결과는 하기의 표로 요약된다:
포스페이트 완충액농도(mM) 분광측광기로부터의t1/2(분) 전기화학발광으로부터의t1/2(분)
50 1.33 1.37
100 2.36 2.30
150 - 4.73
200 7.20 7.03
완충제의 농도가 증가함에 따라, t1/2이 증가되고, 역학에서의 감소가 표시된다. 두 방법의 결과가 잘 일치한다.
실시예 3
NADH가 소모되는 효소 반응
락테이트 데하이드로게나제("LDH")는 하기와 같이 NAD+를 형성하기 위해 소모되는 공반응제로서 NADH와 함께 피루베이트의 락테이트로의 전환을 촉매한다.
[반응식]
LDH
피루베이트 + NADH ───── 락테이트 + NAD+
NADH는 10-2M의 농도로, 10-4M Ru(bpy)3 2+과 함께 존재하고, 실시예 1에 이어지는 것과 동일한 실험적 프로토콜이 여기에서 반복된다. 전극은 460 msec에 대해 1800 mV에서 20번 펄스를 발생시키고, 휴지 전위는 250 msec에 대해 0이다. 총 시간 경로는 3000 msec 약간 이상이다. 정상화된 결과를 분광측광기 분석과 잘 비교한다.
이러한 반응 과정에서 Ru(bpy)3 2+와 반응하는 NADH는 더 적고 ECL 신호는 점차적으로 감소한다. 그러나 ECL 붕괴의 성질 때문에 두 반응은 경쟁관계이다. 각각의 펄스를 갖는 NADH 기질이 더욱 적기 때문에, 전반적인 반응으로부터의 붕괴는 흡수 데이터에 더욱 신속하게 비교되는 것으로 보인다.
ECL 붕괴의 비율이 감소되어 측정된 네트 효과가 효소 반응에 기인할 경우, 그것은 유효하다. 이러한 효과로 NADH와 Ru(bpy)32+의 펄스 및 농도의 변수는 좀더 안정한 ECL 신호를 제공하기 위해서 선택된다. 결과는 3분의 시간에 걸친 매우 안정된 ECL 결과이다.
혈청내 LDH의 정상적인 임상 범주는 100 내지 200 U/L이고, 이것은 효소 활성에 기초한 산정으로부터 1 내지 2 nM의 효소와 동등하다. 이러한 값은 분석된 범주내에서 정당하고, 따라서 시험은 임상 적용에 대해 LDH를 측정하기 위해서 사용될 수 있다.
실시예 4
스트렙타비딘 - 바이오틴화된 DNA
측정 방법은 전술된 NADH 및 효소 역학 반응을 측정하기 위해 사용된 것과 매우 유사하다. 그러므로, NADH/효소 실험에서, 반응 비율은 매우 신속하고, 샘플은 실행이 시작되기 직전에 재빨리 흡출기로 빨아 내져야 한다. 그러나, 항원-항체 측정에 대하여, 훨씬 더 긴 반응 시간이 예상되고 실험은 약간 다르게 개시되어야 한다.
ORIGEN?분석기를 통제하는 소프트웨어 프로그램은 항체의 연속적인 유동이 전극 표면에서 항체 표지 비드를 가로질러 부여될 수 있도록 설정된다. 기기는 두 개의 시험관 설치로부터 반응을 실행하도록 프로그래밍된다. 항체-표지 비드는 제 1 시험관으로부터 부여되어 자기를 갖는 전극상에 포획된다. 캐러젤이 증가되고, (농도에 의해서 실질적으로 초과된) 항체 표지 용액이 전극 표면의 비드를 가로질러 제 2 시험관으로부터 부여되고, 결합 반응이 시작된다.
NADH/효소 역학 방법과 유사하게, 이 실험에서의 단계 전위 전압 파형의 펄스 변이를 사용하도록 결정되어, 각각의 펄스가 생성된 후 경과된 시간의 트랩을 유지하기 위해 포함된 시계 타이머를 가지고 확장된 시간 간격에 걸쳐 다중 펄스가생성된다.
반복적인 펄스 파형을 사용할 경우, 여러 변수가 특정 반응이 측정되도록 활용될 수 있고, 이들은 본 명세서에 의해 제공된 지도에 기초하여 당분야 숙련가들에 의해 수월하게 측정될 수 있다. 변수에는 펄스의 수, 펄스 폭, 펄스간 지연 시간, 단계 전위 전압 및 휴지 전위를 포함된다.
측정 방법은 NADH 및 효소 역학 반응에 사용된 것과 매우 유사하다. 세가지 개별적인 반응이 실행되고, 각각은 전술된 바와 같은 두 개의 시험관을 사용한다. 실험 준비시, 280 자기 비드를 스트렙타비딘으로 코팅하고, 이들을 제 1 시험관에 첨가하고, 이어서 바이오틴화된 DNA 표지를 첨가한다. 바이오틴화된 DNA 표지 검정기를 제 2 시험관에 첨가한다.
본 명세서에 정의된 용어를 사용하여, 반응은 하기에 기재된 바와 같이 수행된다.
진행 반응- 일단 측정 사이클이 시작되면 농도는 반응이 일어나서 반응이 완료된 시간에 걸쳐서 변화시킨다.
튜브 1 : 스트렙타비딘 코팅 비드
튜브 2 : 바이오틴화된 DNA 표지 검정기
반응 완료-반응은 미리 완료쪽으로 진행하도록 하고, 이에 따라 강도 측정은 ECL 감쇠만의 결과이다.
튜브 1: 스트렙타비딘 코팅된 비드와 바이오틴화된 DNA 표지물을 합하여 완전히 결합시킴.
튜브 2: 바이오틴화된 DNA로 검정기를 표지함.
백그라운드 반응- 비드가 존재하지 않고, 따라서 생성된 신호는 표지물(백그라운드)만의 결과이다.
튜브 1: 분석 완충액(결합을 위한 비드가 존재하지 않음).
튜브 2: 바이오틴화된 DNA로 검정기를 표지함.
3종의 반응을 수행한 후에 하기 수학식 1을 이용하여 정규 반응 곡선을 수득한다.
[수학식 1]
Figure pct00006
이어서 비드의 20개의 튜브 및 상기에서 사용한 동일 농도로 표지물을 사용하여 튜브-튜브 시간 경과를 수행한다. 이들을 피펫팅하고 즉시 실행한다. 따라서, 결합 반응은 각각의 튜브내에서 일어나고, 완료시간은 곡선(ECL강도 : 시간)이 안정수준에 이르기 시작할 때 측정될 수 있다. 이러한 시간 경과에 따라, 반응은 6분 경에 완료된다. 이러한 사실은 3 단계 시간 경과법에 의하여 수득된 것 보다 월등히 빠른 완료시간이다.
이 시점에서 스트렙타비딘-바이오틴 반응이 3 단계법을 사용할 때 확산 제한되었음이 추정된다. 이러한 결론을 더욱 지지하기 위해서는, 3 단계 시간 경과법을 사용하여 반감기 연구를 수행한다.
비드의 6 가지 상이한 농도: 20㎍, 4㎍, 2㎍, 1.3㎍, 1.0㎍, 및 0.8㎍(300㎕당)을 사용하여 3 단계 시간 경과법을 반복한다. 예상되는 바와 같이, 비드 농도가 감소됨에 따라 반응은 훨씬 신속히 완료되었다.
후속적으로, 각 농도의 반감기가 수득된다. 표지물이 상당 과량으로 존재하므로, 반응은 의(pseudo) 1차 동력학을 따르도록 재촉된다. 1차 반응에서, 반감기("t1/2")는 농도와 무관하고 다음과 같이 정의된다:
t1/2=0.693/k
(여기에서 k는 결합상수이다)
따라서, 반감기는 반응이 1차일 경우 농도와 무관하게 일정하여야 한다. 비드 농도 : 반감기의 작도에 있어서, t1/2값이 0.5분에 취해진 경우, 모든 정규 반응이 1.0의 상대치에서 안정상태로 있게 된다고 가정하면, 반감기는 농도 감소에 따라 꾸준히 감소된다. 결과를 하기에 요약하였다:
비드 농도(㎍) 반감기(분)
0.8 7.5
1.0 8
1.3 10
2 12
4 16
20 35
t1/2값의 이러한 지속적인 감소는 스트렙타비딘-바이오틴 시스템이 전극 표면에서 질량 이동 제한됨을 시사한다. 이러한 현상은 3 단계법 : 튜브-튜브법을 사용할 때 반응이 완료되는 데 더 오래 걸리는 이유를 설명한다.
비록 스트렙타비딘-바이오틴 반응이 확산 제한되지만, ECL 3 단계 시간 경과 측정법은 결합속도가 현저히 느리고 이에 따라 확산 제한되지 않는 시스템에 적용될 수 있다.
실시예 5
CEA 항체-항원 시스템
이들 실험에 사용된 CEA 분석 포맷은 차후에 표지된 CEA 특이 항체에 결합되게 될 바이오틴화된 CEA 항원에 결합된 스트렙타비딘-코팅된 비드로 이루어진다. 이러한 시스템에서 측정되는 반응 속도는 스트렙타비딘-바이오틴 반응이 아니고 CEA 항체-항원 반응이다.
1F3로 언급되는 CEA 항체가 수득되고, ECL 3 단계 시간 경과법이 동일한 1F3 항체를 사용하여 BIA코어 시스템상에서 사전에 수득된 값과 비교하기 위하여 상기 시스템에 대하여 시도된다. (BIA코어 시스템은 표면 플라스몬 공명을 이용하며 Pharmacia Biosensor AB로부터 입수가능).
3 단계법을 이용하여 수행하기 위하여 선택된 1F3 표지물의 최고 농도는 11nM이고, 이러한 농도는 BIA코어상에서 수행된 10 nM 하한 농도에 농도에 있어 필적한다. 추가로, 2 가지 저농도 5.5 nM 및 2.7 nM이 수행된다. 11 nM 1F3 표지물 용액으로부터 수득된 정규 프로필은 목적하는 형태를 취하지만, 매우 노이지하다. 이러한 이유는 전술한 바와 같이 ECL법을 사용함에 따라, 비드와 결합하는 표지물, 및 결합하지 않는 유리 표지물(백그라운드 신호로 생각됨) 모두 전극 표면에 동시에 존재하기 때문이다. 표지물의 고 농도에서, 결합상과 비결합상을 식별하기 곤란해지고, 이에 따라 매끄러운 정규 반응 프로필이 수득될 수 없다. 1F3 항체의 5.5 nM 및 2.7 nM 농도에 대한 정규 프로필은 훨씬 매끄럽고 이는 재차 전극에서의 비결합 표지물의 기여가 어떻게 신호에 있어서의 노이즈 양에 영향을 미칠 수 있는지를 지지한다. 전극에 존재하는 비결합 표지물의 농도가 적기 때문에, 결합상 신호를 식별하기가 훨씬 수월하며 한층 매끄러운 프로필이 수득된다.
BIA코어 시스템에 대하여, 10 내지 500nM에 이르는 일련의 1F3 표지물 농도가 실행된다. ECL 시스템에 대한 현행 3 단계법은 10 nM보다 높은 표지물 농도는 허용하지 않는다.
ECL 3 단계법과 BAI코어법의 비교결과를 수득하기 위하여, 3개의 정규 농도 곡선에 대하여 수득된 데이터에 대하여 수학적 분석을 수행하여 실험 연관 속도상수 ka를 추론해낸다. BIA코어에 대하여 수득된 데이터에 대한 ka값은 4.0 x 105M-1sec-1이었다. ECL 데이터의 경우 9.0 x 105(±4.7 x 105)M-1sec-1의 평균(±SD)ka값이 수득되었다.

Claims (14)

  1. (a) 반응물, 발광단, 및 반응 파트너를 함유하는 제 1 시약 혼합물(여기에서, 반응물은 반응 파트너와 반응하고, 발광단은 반응 파트너, 또는 반응 파트너의 반응 산물과 참여하여 시약 혼합물을 전기 에너지에 노출시킬 때 전기화학발광을 방출한다)을 형성시키고;
    (b) 제 1 시약 혼합물을 일련의 전기 펄스에 설정된 전위와 설정된 시간 간격 및 지속기간으로 노출시키고, 전기화학발광을 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (c) 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 2 시약 혼합물을 형성시키며;
    (d) 반응이 완료될 때까지 제 2 시약 혼합물을 반응시키고 이어서 혼합물을 일련의 전기 펄스에 단계(b)에서와 동일한 전위, 시간 간격 및 지속기간으로 노출시킨 다음 전기화학발광을 단계(b)에서와 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (e) 반응 파트너를 함유하지 않는 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 3 시약 혼합물을 형성시키며;
    (f) 제 3 시약 혼합물을 일련의 전기 펄스에 단계(b)에서와 동일한 전위, 시간 간격 및 지속기간으로 노출시킨 다음 전기화학발광을 단계(b)에서와 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (g) 단계(b)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값으로부터 단계(f)에서의 제1 간격에 대하여 수득된 값을 감하여 제 1 차이를 수득하며;
    (h) 단계(d)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값으로부터 단계(f)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값을 감하여 제 2 차이를 수득하며;
    (i) 제 1 차이를 제 2 차이로 나누어 제 1 간격에 대한 정규치를 수득한 다음;
    (j) 각 연속 간격에 대한 단계(g), (h) 및 (i)를 반복하여 각 연속 간격에 대한 정규치를 수득하는 단계로 이루어지는, 생체분자 반응의 시간경과를 측정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 반응물과 발광단이 하기 화학식의 화학물질 잔기
    형태로 결합되는 방법.
    [화학식]
    Figure pct00007
    상기식에서,
    M은 루테늄 또는 오스뮴이고,
    P는 M의 다좌 리간드이며,
    L1, L2, L3, L4, L5및 L6는 M의 리간드이며, 이들 각각은 상호 동일하거나 상이할 수 있으며,
    D는 하나 이상의 아미드 또는 아민 결합을 통하여 하나 이상의 P, L1, L2, L3, L4, L5또는 L6에 공유 결합된 물질이며;
    m은 1 이상의 정수이며,
    n, o, p, q, r 및 s 각각은 0 또는 정수이며,
    t는 1 이상의 정수이며,
    u는 1 이상의 정수이며,
    P, L1, L2, L3, L4, L5, L6및 D는 화학물질 잔기가 전자기 방사선을 방출하도록 유도될 수 있고 M의 리간드에 의하여 제공된 M에 대한 결합 총수가 M의 배위수와 동등해지도록 하는 조성과 수이다.
  3. 제 1 항에 있어서, 발광단이 Ru-함유 및 Os-함유 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 발광단이 루테늄 트리스-비피리딘 또는 오스뮴 트리스-비피리딘인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 생체분자 반응이 결합 반응인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 결합 반응이 항체-항원, 리간드-수용체, 아비딘-바이오틴, 염기 짝짓기, 렉틴-탄수화물, 및 효소-억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 반응물과 발광단이 하기 화학식의 화학물질 잔기 형태로 결합되는 방법.
    [화학식]
    Figure pct00008
    상기식에서,
    M은 루테늄 또는 오스뮴이고,
    P는 M의 다좌 리간드이며,
    L1, L2, L3, L4, L5및 L6는 M의 리간드이며, 이들 각각은 상호 동일하거나 상이할 수 있으며,
    D는 하나 이상의 아미드 또는 아민 결합을 통하여 하나 이상의 P, L1, L2, L3, L4, L5또는 L6에 공유 결합된 물질이며;
    m은 1 이상의 정수이며,
    n, o, p, q, r 및 s 각각은 0 또는 정수이며,
    t는 1 이상의 정수이며,
    u는 1 이상의 정수이며,
    P, L1, L2, L3, L4, L5, L6및 D는 화학물질 잔기가 전자기 방사선을 방출하도록 유도될 수 있고 M의 리간드에 의하여 제공된 M에 대한 결합 총수가 M의 배위수와 동등해지도록 하는 조성과 수이다.
  8. (a) 효소, 반응물, 발광단, 및 반응 파트너를 함유하는 제 1 시약 혼합물(여기에서, 반응물은 반응 파트너와 반응하고, 발광단은 반응 파트너, 또는 반응 파트너의 반응 산물과 참여하여 시약 혼합물을 전기 에너지에 노출시킬 때 전기화학발광을 방출한다)을 형성시키고;
    (b) 제 1 시약 혼합물을 일련의 전기 펄스에 설정된 전위와 설정된 시간 간격 및 지속기간으로 노출시키고, 전기화학발광을 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (c) 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 2 시약 혼합물을 형성시키며;
    (d) 반응이 완료될 때까지 제 2 시약 혼합물을 반응시키고 이어서 혼합물을 일련의 전기 펄스에 단계(b)에서와 동일한 전위, 시간 간격 및 지속기간으로 노출시킨 다음 전기화학발광을 단계(b)에서와 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (e) 반응 파트너를 함유하지 않는 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 3 시약 혼합물을 형성시키며;
    (f) 제 3 시약 혼합물을 일련의 전기 펄스에 단계(b)에서와 동일한 전위, 시간 간격 및 지속기간으로 노출시킨 다음 전기화학발광을 단계(b)에서와 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (g) 단계(b)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값으로부터 단계(f)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값을 감하여 제 1 차이를 수득하며;
    (h) 단계(d)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값으로부터 단계(f)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값을 감하여 제 2 차이를 수득하며;
    (i) 제 1 차이를 제 2 차이로 나누어 제 1 간격에 대한 정규치를 수득한 다음;
    (j) 각 연속 간격에 대한 단계(g), (h) 및 (i)를 반복하여 각 연속 간격에 대한 정규치를 수득하는 단계로 이루어지는, 효소 반응의 시간경과를 측정하는 방법.
  9. (a) 반응물, 반응 파트너 및 발광단을 함유하는 제 1 시약 혼합물(여기에서, 반응물은 항체-항원, 리간드-수용체, 아비딘-바이오틴, 염기 짝짓기, 렉틴-탄수화물, 및 효소-억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반응으로 반응 파트너와 반응하고, 발광단은 반응 파트너와 참여하여 시약 혼합물을 전기 에너지에 노출시킬 때 전기화학발광을 방출한다)을 형성시키고;
    (b) 제 1 시약 혼합물을 일련의 전기 펄스에 설정된 전위와 설정된 간격의 시간 및 지속기간으로 노출시키고, 전기화학발광을 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (c) 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 2 시약 혼합물을 형성시키며;
    (d) 반응이 완료될 때까지 제 2 시약 혼합물을 반응시키고 이어서 혼합물을 일련의 전기 펄스에 단계(b)에서와 동일한 전위, 시간 간격 및 지속기간으로 노출시킨 다음 전기화학발광을 단계(b)에서와 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (e) 반응 파트너를 함유하지 않는 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 3 시약 혼합물을 형성시키며;
    (f) 제 3 시약 혼합물을 일련의 전기 펄스에 단계(b)에서와 동일한 전위, 시간 간격 및 지속기간으로 노출시킨 다음 전기화학발광을 단계(b)에서와 동일 간격으로 측정하여 각 간격에 대한 값을 수득하며;
    (g) 단계(b)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값으로부터 단계(f)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값을 감하여 제 1 차이를 수득하며;
    (h) 단계(d)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값으로부터 단계(f)에서의 제 1 간격에 대하여 수득된 값을 감하여 제 2 차이를 수득하며;
    (i) 제 1 차이를 제 2 차이로 나누어 제 1 간격에 대한 정규치를 수득한 다음;
    (j) 각 연속 간격에 대한 단계(g), (h) 및 (i)를 반복하여 각 연속 간격에 대한 정규치를 수득하는 단계로 이루어지는, 결합 반응의 시간경과를 측정하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 반응물이 발광단에 결합하여 하기 화학식의 화학물질 잔기를 형성하는 방법.
    [화학식]
    Figure pct00009
    상기식에서,
    M은 루테늄 또는 오스뮴이고,
    P는 M의 다좌 리간드이며,
    L1, L2, L3, L4, L5및 L6는 M의 리간드이며, 이들 각각은 상호 동일하거나 상이할 수 있으며,
    D는 하나 이상의 아미드 또는 아민 결합을 통하여 하나 이상의 P, L1, L2, L3, L4, L5또는 L6에 공유 결합된 물질이며;
    m은 1 이상의 정수이며,
    n, o, p, q, r 및 s 각각은 0 또는 정수이며,
    t는 1 이상의 정수이며,
    u는 1 이상의 정수이며,
    P, L1, L2, L3, L4, L5, L6및 D는 화학물질 잔기가 전자기 방사선을 방출하도록 유도될 수 있고 M의 리간드에 의하여 제공된 M에 대한 결합 총수가 M의 배위수와 동등해지도록 하는 조성과 수이다.
  11. 시약으로서 반응물, 발광단 및 반응 파트너를 함유하는 제 1 시약 혼합물(여기에서, 반응물은 반응 파트너와 반응하고, 발광단은 반응 파트너, 또는 반응 파트너의 반응 산물과 참여하여 시약 혼합물을 전기 에너지에 노출시킬 때 전기화학발광을 방출한다); 반응된 시약을 포함하는 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 2 시약 혼합물; 및 반응 파트너를 함유하지 않는 것을 제외하고는 제 1 시약 혼합물과 동일한 제 3 시약 혼합물;
    제 1, 제 2 및 제 3 시약 혼합물 각각을 별도로 일련의 전기 펄스에 설정된 전위와, 설정된 시간 간격 및 지속기간으로 노출시키기 위한 수단; 및 전기화학발광을 동일 간격으로 측정하기 위한 수단을 포함하는, 생체분자 반응의 시간 경과를 측정하는 시스템.
  12. 제 11 항에 있어서, 반응물 및 발광단이 하기 화학식의 화학물질 잔기를 포함하는 시스템.
    [화학식]
    Figure pct00010
    상기식에서,
    M은 루테늄 또는 오스뮴이고,
    P는 M의 다좌 리간드이며,
    L1, L2, L3, L4, L5및 L6는 M의 리간드이며, 이들 각각은 상호 동일하거나 상이할 수 있으며,
    D는 하나 이상의 아미드 또는 아민 결합을 통하여 하나 이상의 P, L1, L2, L3, L4, L5또는 L6에 공유 결합된 물질이며;
    m은 1 이상의 정수이며,
    n, o, p, q, r 및 s 각각은 0 또는 정수이며,
    t는 1 이상의 정수이며,
    u는 1 이상의 정수이며,
    P, L1, L2, L3, L4, L5, L6및 D는 화학물질 잔기가 전자기 방사선을 방출하도록 유도될 수 있고 M의 리간드에 의하여 제공된 M에 대한 결합 총수가 M의 배위수와 동등해지도록 하는 조성과 수이다.
  13. 제 11 항에 있어서, 발광단이 Ru-함유 및 Os-함유 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시스템.
  14. 제 11 항에 있어서, 발광단이 루테늄 트리스-비피리딘 또는 오스뮴 트리스-비피리딘인 시스템.
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