CN115629208A - 采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法 - Google Patents

采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115629208A
CN115629208A CN202110957653.9A CN202110957653A CN115629208A CN 115629208 A CN115629208 A CN 115629208A CN 202110957653 A CN202110957653 A CN 202110957653A CN 115629208 A CN115629208 A CN 115629208A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ecl
signal
bpy
voltage
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110957653.9A
Other languages
English (en)
Inventor
周明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Accucise Diagnostics Inc
Suzhou Ansai Diagnostic Technology Co ltd
Original Assignee
Accucise Diagnostics Inc
Suzhou Ansai Diagnostic Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Accucise Diagnostics Inc, Suzhou Ansai Diagnostic Technology Co ltd filed Critical Accucise Diagnostics Inc
Priority to CN202110957653.9A priority Critical patent/CN115629208A/zh
Publication of CN115629208A publication Critical patent/CN115629208A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于生物分析的方法，特别是，涉及在低电压下产生电化学发光信号以获取高信噪比和改进的浓度‑信号响应关系，从而改进电化学发光(ECL)免疫分析性能的方法。

Description

采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法
技术领域
本发明涉及一种通过调节电化学反应条件而改进电化学发光免疫分析性能的方法。
发明背景
电化学发光(ECL，Electrogenerated chemiluminescence orelectrochemiluminescence)免疫分析是一种广泛应用于临床检验的免疫分析方法。在ECL免疫分析中，三联吡啶钌(通常表示为Ru(bpy)3 2+)的琥珀酰亚胺酯(NHS酯，见图1A)或其它发光金属配合物被用作标记物，对被测物抗体或抗原进行标记。在抗体与样本中的被测物在一定条件下反应形成抗体/抗原复合体之后，发光金属配合物在电化学流动池中通过电化学反应和一系列的后续化学反应，最终导致发光金属配合物的发光激发态的形成，产生可检测的发光信号。
ECL免疫分析涉及到抗体(在夹心法中)或被测物(在竞争法中)如何被标记，被测物如何被捕获，ECL反应如何被触发以及工作电极如何再生等诸多技术细节。以ECL夹心法免疫分析为例，在一个典型的商业ECL分析中，使用图1A所示的标记分子，在一个被测物的抗体的赖氨酸残基的ε-氨基位点处标记抗体(信号抗体)，而另一个抗体(捕获抗体)被生物素化。当一个临床样本与这两类抗体以及链霉亲和素包裹的磁珠按预设的一段时间在一定温度下互相混合后，一种夹心结构免疫复合体就在磁珠表面形成。然后，磁珠被带入一个电化学发光测量池(流动池)并被位于测量池下的可移动磁铁捕获在电化学工作电极表面。含三丙胺(tri-n-propylamine，TPA或N(C3H7)3)的缓冲溶液冲洗掉不需要的物质并提供一种使Ru(bpy)3 2+发光基团经历描述在以下反应路径一中的ECL反应的化学环境。
在一个特定的电压下(比如相对于Ag/AgCl而言1.4V)，缓冲溶液中的三丙胺被氧化成阳离子自由基N(C3H7)3 ·+(反应1)，并进一步失去一个质子成为中性自由基H6C3 ·N(C3H7)2(反应2)。该中性自由基具有强还原能力，能将Ru(bpy)3 2+还原到Ru(bpy)3 1+(反应3)。具有氧化能力的阳离子自由基N(C3H7)3 ·+再将Ru(bpy)3 1+氧化为激发态Ru(bpy)3 2+*(反应3)。Ru(bpy)3 2+*发出波长为620nm的光后回到原始的Ru(bpy)3 2+基态(反应5)。
反应路径一
N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3 ·+ (1)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3 ·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 2++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 ++P (3)
Ru(bpy)3 ++N(C3H7)3 ·+→Ru(bpy)3 2+*+N(C3H7)3 (4)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
因此，在ECL过程中，Ru(bpy)3 2+不被消耗掉，而是经历一个氧化态的循环变化，即，Ru(bpy)3 2+→Ru(bpy)3 1+→Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2+(见W.Miao，J.-P.Choi，A.J.Bard，J.Am.Chem.Soc.2002，124，14478-14485)。在测量过程中，这个循环不断重复，一个长延时的ECL信号由此产生并被检测。在某一时间段(例如0.5-5秒)的全部ECL光发射的积分可以作为ECL强度的度量并与被测物的量相关联。测量结束后，磁珠和附着其上的免疫复合体被水性液流冲走，测量池被清洗，电极表面再通过电化学过程再生使其处于下一个测试的准备状态。这些按时序进行的实验细节在美国专利5,147,806，5,538,687and 6,599,473中有所披露。
事实上，反应路径一只是一种可以产生ECL的反应路径。其它可能的反应路径(如以下反应路径二至四)也被提出来解释不同条件下激发态Ru(bpy)3 2+*的形成和ECL的产生(见J.K.Leland and M.J.Powell，J.Electrochem.Soc.1990，137，3127-3131，and W.Miao，J.-P.Choi，A.J.Bard，J.Am.Chem.Soc.2002，124，14478-14485)。
反应路径二
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+ (6)
N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3 ·+ (1)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 3++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 2+*+P (7)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
反应路径三
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+ (6)
Ru(bpy)3 3++N(C3H7)3→Ru(bpy)3 2++N(C3H7)3 ·+ (8)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 3++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 2+*+P (7)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
反应路径四
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+ (6)
N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3 ·+ (1)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3 ·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 2++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 ++P (3)
Ru(bpy)3 ++Ru(bpy)3 3+→Ru(bpy)3 2++Ru(bpy)3 2+* (9)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
以上反应路径二、三和四发生在电极电压高到足以把Ru(bpy)3 2+氧化成为Ru(bpy)3 3+(即反应6)的条件下，而在反应路径一所涉及的几个反应中，不存在Ru(bpy)3 2+被氧化成Ru(bpy)3 3+的反应6。但在能够导致反应路径二、三和四发生的高电压条件下，反应路径一中的反应也同时发生。尽管本领域的研究人员倾向于认为绝大多数的ECL光发射来自于反应路径一，但在实际的ECL免疫分析系统中所采用的工作电压为1.4V(相对于Ag/AgCl参比电极)，在这个电压下，反应路径一、二、三和四都能发生。
上述Ru(bpy)3 2+的ECL反应路径也适用于其衍生物和类似物。但由于不同化合物的氧化还原性质和化学反应性存在差异，不同反应路径对总的ECL的贡献可能会有差异。无论发光来自于哪一种路径，ECL过程的速率控制步骤是TPA的电化学氧化(即反应1)。工作电压越高，该反应进行得越快，从而发光信号越强。但在高的工作电压下，由于副反应导致的单线态氧(1ΔgO2)产生的背景噪音也高(S.S.Kumar and A.J.Bard，Anal.Chem.2013，85，292-295)。在ECL技术发展的早期中，采用的工作电压远远高于1.4V，如美国专利5,147,806披露的，在铂电极上和TPA溶液中，所应用的电压大于1.8V，最大的发光值在2.2V时获得。美国专利5,538,687披露了在改进的测量池中，工作电压可以降低到1.4V。自那以后，商业化的ECL免疫分析系统(Elecsys和cobas)采用的工作电压为1.4V(见E.Faatz，A.Finke，H.-P.Josel，G.Prencipe，S.Qunit，M.Windfuhr，Automated immunoassays for thedetection of biomarkers in body fluids，in Analytical ElectrogeneratedChemiluminescence：From Fundamental to Bioassays，N.Sojic，Ed.，Royal Socity ofChemistry，2019；pp 443-470)。
美国专利US 10203333和中国专利ZL 201480045420披露了一类电中性金属钌的配位化合物(Neutral Ruthenium Complexes，简称NRC)。这些电中性的ECL标记物能降低免疫分析中的非特异性信号，一些电中性ECL标记分子(如图1C的NRC)还产生了更强的发光。美国专利申请US 2021/0130876 A1和WO 2021/084472 A1进一步披露了含有两个或多个ECL发光体的标记分子(图2)。这些性能更好的ECL发光体及其构成的标记分子丰富了电化学发光免疫分析方法学-如同化学发光具有基于不同化学发光体的多个平台技术，电化学发光也具有基于不同ECL发光体的多个平台(如图3所示)。
由于图1C的NRC，即Ru(2，2′-联吡啶)(红菲咯啉二磺酸盐)[4-(2，2′-联吡啶-4-基)丁酸]，同时具有高的发光效率和降低免疫分析中的非特异吸附的能力，在优化其ECL电化学反应条件的过程中，本发明申请者意外地发现-不同于Ru(bpy)3 2+的发光信号随工作电压升高而升高的性质，NRC在较高工作电压下产生的ECL信号对电压不敏感。表一展示了10nM的Ru(bpy)3 2+和NRC在含TPA的磷酸盐缓冲溶液中的ECL(Relative Light Unit)随工作电压的变化情况。如其所示，在工作电压1.3-1.5V之间，ECL信号值相差不大，甚至在高于1.4V时，NRC的发光不再升高，反而略有下降。这一特点也可以从图4看出。图4所示是几个不同浓度的Ru(bpy)3 2+和NRC溶液在不同电压下产生的ECL随时间变化的情况。很明显，不含发光物质的TPA磷酸盐缓冲溶液的背景噪音随电压变化最大，而NRC的ECL随电压变化最小。
由于TPA磷酸盐缓冲溶液存在背景发射(S.S.Kumar and A.J.Bard，Anal.Chem.，2013，85，292-295)，较强的ECL所需要的较高工作电压会产生较高的背景(表一也给出了不同电压下的背景发射值)。就信噪比而言，最优的工作电压是1.1V。在这个电压下，Ru(bpy)3 2+和NRC两个化合物的信噪比(分别为2732和7076)都达到最大值。
Figure BDA0003220457660000041
Figure BDA0003220457660000051
进一步令本发明申请者惊讶的是，在信噪比最大时的1.1V，NRC的信号值(RLU＝120292)仍然高于Ru(bpy)3 2+的最大信号值(RLU＝112037，1.5V)。这一发现启示我们在采用NRC作为信号分子进行免疫分析时，可以不必追求更强的发光，而采用较低的电压将ECL信号维持在与现有商业系统中使用的Ru(bpy)3 2+的水平上，以获得一个更高的信噪比。
表1和图4的实验结果是采用Ru(bpy)3Cl2和NRC的均相溶液而获得的，在高电压情况下，ECL反应路径一、二、三和四都可能发生。但在免疫反应中，ECL发光体通过抗体-抗原免疫反应而被固定在磁珠表面，在通常直径为微米(如1-5微米)大小的磁珠表面，只有极小部分与电极表面相距约2纳米的NRC能被电极氧化成阳离子(对应于Ru(bpy)3 2+的反应6)，所以反应路径一是信号产生的主要路径(W.Miao，J.-P.Choi，A.J.Bard，J.Am.Chem.Soc.2002，124，14478-14485)。另一方面，在免疫分析中，不含被测物的样本产生的噪音(零值样本的空白值)主要来自于三部分：一是与均相溶液相同的TPA磷酸盐缓冲溶液的背景发射(由于磁珠占据了部分电极表面，这部分发射应比在均相溶液中低)，二是由于非特异性吸附产生的来自于NRC的ECL，三是磁珠表面的生物分子(链酶亲和素、抗体以及非特异吸附的其它生物分子)中存在的可氧化还原基团可能参与产生的发光。因此，在均相溶液中获得的表一中的结果不能直接外推到在电极/磁珠表面产生ECL的非均相免疫分析中。
本发明申请者意识到通过低电压产生ECL提高信噪比的价值，于是通过降钙素原(procalcitonin，PCT)的免疫分析实验证明，与均相溶液中NRC的表现相似(但不完全相同)，在ECL免疫分析过程中，当工作电压在1.2和1.4V之间时，信噪比变化不大(对2ng/mL样本是84-90，而对20ng/mL样本是1071-1154)，而当工作电压降低到1.1V时，信噪比有显著提升(对2ng/mL样本是118，而对20ng/mL样本是1465)；电压进一步降低到1.05V时，信噪比又进一步提升一倍(表2)。
Figure BDA0003220457660000061
表二的实验结果启示我们，在非均相免疫分析中，虽然噪音(不含被测物的空白值)有多个可能的来源，但仍然可以通过调整电压从而在信号值和信噪比之间寻找一个最佳的平衡。表二结果显示，引起信噪比变化大约三倍的电压范围是1.05-1.2V，而在这个范围内，ECL信号值(RLU)变化大约两倍。也就是说，如果信噪比在免疫分析性能评估时更重要，牺牲一半的信号值可以赢得信噪比的三倍提升。表二实验结果的原始ECL信号随时间的变化(图5)在不同电压时稍有不同，根据其特点，采样和积分的时间也是一个可以优化的参数。
Ru(bpy)3 2+及其很多衍生物和类似物(包括本发明中采用的NRC)的氧化还原电位在1.25V(vs.Ag/AgCl)左右(见M.Zhou and J.Roovers，Macromolecules，2001，34，244-252；M.Zhou，et al，Anal.Chem.，2003，75，6708-6717；L.Yu，Y.Liu，M.Zhou，Anal.Bioanal.Chem.2016，408，7095-7103)。在低于其氧化还原电位的低电压下产生ECL早有报导(Y.Zu and A.J.Bard，Anal.Chem.2000，72，3223-3232)，反应路径一就是基于没有Ru(bpy)3 2+被氧化为Ru(bpy)3 3+的反应而提出的。但已有的知识是低电压下TPA的氧化(反应1，影响ECL的关键步骤)太慢，产生的ECL信号太低，也没有任何研究者发现低电压下产生的ECL具有高信噪比并认识到其价值，所以商业ECL免疫分析系统都采用1.4V的工作电压(高于Ru(bpy)3 2+的氧化还原电位1.25V)。目前尚未见任何现有技术开发低电压下(低于Ru(bpy)3 2+的氧化还原电位1.25V)的ECL及其应用，更未见以获得高的信噪比为目的而应用低电压ECL。
鉴于以上发现，本发明申请者提出，为提高某些免疫分析的检测灵敏度，可以牺牲一部分信号值，从而赢来更高的信噪比。本发明具体实施例中采用的NRC以及其它高效ECL发光体(如在美国专利US 10203333、中国专利ZL 201480045420以及WO 202I/084472 A1中披露的化合物)具有高于Ru(bpy)3 2+的ECL，当需要在信号值和信噪比之间寻找一个最佳平衡而牺牲一部分信号值时，这些高效ECL发光体能比传统的Ru(bpy)3 2+更能满足要求。
当采用NRC作为ECL标记物在较低的电压下开展ECL免疫分析，并绘制浓度-信号响应关系曲线时，本发明申请者更加惊奇地发现，除了获得更高的信噪比，低电压产生的低溶液背景显著地改善了低浓度端的浓度-信号响应关系(图6)，从而有助于提升基于低电压ECL信号的免疫分析的检测能力。关于这一意外发现的数据支持在具体的实施例中详述。
发明内容
本发明提供一种以牺牲一部分ECL信号值来换取更高的信噪比的方法。该方法涉及采用电中性金属配位化合物作为ECL的标记物，并在低于电中性金属配位化合物的氧化还原电位的条件下产生ECL。利用低电压产生的ECL对被测物进行定量分析时，浓度-信号响应关系以及检测能力得到显著改善。
附图说明
将结合以下附图描述本发明，在以下附图中，相同的附图标记表示相同的要素，并且其中：
图1若干ECL标记物的化学结构式(美国专利5,744,367(A)、美国专利6,808,939(B)、WO 2014203067A1(C)和美国专利申请US2016/0145281A1(D)中公开的ECL标记分子)
图2中国专利申请202010983872.X、美国专利申请2021/0130876 A1和WO 2021/084472 A1中公开的多标记ECL标记分子
图3基于不同检测信号的常规免疫分析方法
图4不同电压下在均相溶液中Ru(bpy)3 2+和NRC的电化学发光和缓冲溶液背景噪音
图5在免疫分析中NRC在不同电压下的电化学发光随时间衰减曲线
图6在免疫分析中NRC在低电压下的浓度-信号曲线优于Ru(bpy)3 2+
图7一个包含预处理和测试步骤(工作电压从在先技术的1.4V降低到1.1V)的电化学发光信号产生程序
图8不同电压下PCT免疫分析的浓度-信号曲线。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本文所述的方法所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。这些术语和含义在技术文献中有充分的解释，例如《生物偶联技术》(G.T.Hermanson，Elservier，阿姆斯特丹，2008)和《免疫测定手册》(D.Wild等人，第4版，Elservier，阿姆斯特丹，2013)。
本发明其范围内被称为“标记物”、“标记物分子”、“钌(II)标记物”和“ECL标记物”的物质可与其他物质共价键结合，该其他物质如生物活性被测物或其类似物、基于生物亲和性的被测物识别伴侣或其类似物(例如被测物特异性试剂)、以及上述识别伴侣的其他结合伴侣、或一种能够与被测物形成共价键的反应性化学物质、或如上所述的其类似物或其结合性伴侣。上述物质也可以与一种或多种结合伴侣和/或一种或多种反应性组分的组合结合。另外，上述物质也可被结合到与结合伴侣、反应性组分、或一种或多种结合伴侣和/或一种或多种反应性组分的组合连接的被测物或其类似物上。将多个上述物质直接结合或通过如上所述的其他分子结合至被测物或其类似物也在本发明的范围内。
如本文所用，术语“标记物”是指任何化学或生化物质，其本身或通过与其他试剂的物理/化学相互作用，产生能与目标被测物的量相关联的可检测信号(无论是可见的信号还是通过使用合适的仪器可检测的信号)。标记物包括但不限于含有放射性原子(放射性)的分子、发光化合物(通过光激发或通过化学反应发光)、电活性化合物(通过氧化还原反应生成电信号)、磁性颗粒(磁信号)、酶(通过与底物的反应生成可检测的物质或光学信号)、酶或酶促底物(催化化学/生化反应)。一种标记物可以由一个或多个信号产生单元和一个或多个反应性基团组成。
术语“发光”是指电子从低能态转变为“激发”高能态，然后再回落到较低能量状态时以电磁辐射(光发射)形式释放的能量。这种光的发射通常发生在电磁光谱的可见光谱或近可见光谱范围内。术语“发光”通常包括但不限于诸如磷光、荧光、生物发光、放射线发光、电致发光、电化学发光和热致发光的发光现象，但在本发明中，如无特指，发光就是电化学发光。
在本发明的范围内，术语“发光基团”和“发光体”是指化合物中负责产生发光现象的官能团。在具有复杂结构的化合物中，例如，具有多个官能团(例如，反应性基团、亲水/疏水/两亲基团、吸电子/供电子基团、电平衡基团、间隔基团、连接基团、支化基团等)的结构，发光基团是产生发光现象所需的最小结构部分(例如，参见图1中的圆圈部分)。
术语“发光标记物”是指由一个或多个发光基团和一个或多个反应性基团组成的标记物，其易于与待标记的化学或生化分子形成共价键。发光标记物可以是例如荧光分子、磷光分子、放射发光分子、本发明中的电化学发光分子(即，ECL标记物)、或在点表面上具有反应性基团的量子点。但在本发明中，如无特指，“发光标记物”就是电化学发光标记物(ECL标记物)。具有一个发光基团和一个反应基团的电化学发光(ECL)标记物的例子在现有技术中被最频繁地公开(参见，例如，图1中的标记物和WO2003002974A2，WO 2014203067A1中的其他钌配合物标记物和WO2014019711A1中的铱配合物标记物)。在US 2005/0059834A1中公开了具有三个发光基团(三个钌配合物单元)和一个反应性基团(-COOH或NHS酯)的发光标记物的例子。美国专利6140138公开了具有一个发光基团(一个钌配合物)和两个反应性基团(-COOH或NHS酯)的发光标记物的例子。中国专利申请202010983872.X、美国专利申请2021/0130876A1和WO2021/084472 A1中公开的多含两个和多个发光基团的ECL标记分子
可以测量的“被测物”包括但不限于全细胞、细胞表面抗原、蛋白质配合物、细胞信号传导因子和/或组分、第二信使、第二信使信号传导因子和/或组分、亚细胞颗粒(例如、细胞器或膜碎片)、病毒、朊病毒、尘螨或其片段、类病毒、免疫因子、抗体、抗体片段、抗原、半抗原、脂肪酸、核酸(和合成类似物)、核糖体、蛋白质(和合成类似物)、脂蛋白、多糖、抑制剂、辅因子、半抗原、细胞受体、受体配体、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、酶、酶底物、酶产物、核酸加工酶(例如聚合酶、核酸酶、整合酶、连接酶、解旋酶、端粒酶等)、蛋白质加工酶(例如蛋白酶、激酶、蛋白磷酸酶、泛素蛋白连接酶等)、细胞代谢产物、内分泌因子、旁分泌因子、自分泌因子、细胞因子、激素、药理学药物、药物、治疗药物、合成有机分子、有机金属分子、镇定剂、巴比妥酸盐、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸、糖、凝集素、重组或衍生蛋白、生物素、亲和素、链霉亲和素或样品中存在的无机分子。
根据本发明方法和试剂，一种“被测物特异性试剂”(ASR)是一类具有特异性结合被测物的能力的分子或生物分子，如抗体、多克隆抗体和单克隆抗体、特异性受体蛋白、配体、核酸序列和类似物。它们通过与样品中的物质发生特异性结合或特异性化学反应，旨在生物分析应用中用来对生物样本中的个别化学或生物化学物质或配体进行鉴定和定量。
根据本申请，“检测试剂”包括标记有至少一个ECL发光基团的被测物特异性试剂(ASR)、或标记有一个ECL发光基团的被测物类似物/同源物。本领域技术人员已知，在分析中，检测试剂最终固定在固相上。“固相”，也称为“固体载体”，是指非流体物质，如磁珠和颗粒(包括微粒和珠子)，由诸如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃、和陶瓷的材料制成；凝胶物质，例如二氧化硅、氧化铝、和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；以及比色皿、试管、薄片或其他光谱仪的样品容器。分析过程中的固相组分不同于所述分析过程可能接触到的惰性固体表面之处在于，“固相”在其表面上含有至少一个旨在与捕获抗体或捕获分子相互作用的结构部分。固相可以是固定的成分，例如试管、条、比色皿、薄片、或微量滴定板，也可以是非固定的成分，例如磁珠、珠子和微粒。
在一个实施方案中，该方法可以夹心法分析形式进行。在一个实施方案中，该方法可以竞争性分析形式进行。在一个实施方案中，该方法也可以双抗原桥接分析形式(DAGS)进行。已知的免疫测定形式在以下书籍中有详细的描述：D.Wild等人，《免疫测定手册》，第4版，Elservier，阿姆斯特丹(2013)以及E.P.Diamondis和T.K.Christopoulos，《免疫测定为，圣地亚哥，学术出版社(1996)。
“电化学发光免疫分析”或“ECL免疫分析分析”是通过电化学激发使ECL发光基团产生发光信号的一种分析方法。工作电极和参比电极之间的一个电压以电化学方式启动与结合到ASR或被测物类似物/同源物的ECL发光基团发光。从ECL发光基团发出的光由光电探测器测量，并指示目标被测物的存在或数量。美国专利No.5,543,112、5,935,779、和6,316,607详细描述了ECL方法。
在本发明中的术语“工作电压”是本发明的一个关键概念和实验参数。在由工作电极、对电极和参比电极组成的三电极电化学测量系统中，“工作电压”是工作电极和参比电极之间的电压。如无特指，本发明提到的工作电压或电压都是相对于银/氯化银(Ag/AgCl，饱和氯化钾)参比电极，其相对于标准氢电极(Standard Hydrogen Electrode，SHE)的电极电位为+0.197V。在产生电化学发光或开展电化学发光免疫分析时，不同的仪器系统也许配置有不同的参比电极，其与工作电极之间的电压与本发明中的工作电压有差异，差异的大小可以通过参比电极的电极电位换算而得到。本领域的技术人员知道，不同参比电极相对于标准氢电极(SHE)的电极电位以及其换算方法可以在涉及电化学的文献和书籍中找到。本发明的核心精神是通过“工作电压”的调节来改变背景噪音并控制ECL反应速度，从而获得更好的信噪比和浓度-响应曲线。
在ECL分析程序中，可以将磁珠悬浮在样品和检测试剂中以有效结合被测物。磁珠可具有0.05μm至200μm、0.1μm至100μm、或0.5μm至10μm的直径，并具有能够结合生物分子的表面组分。在本发明申请者使用的ECL分析系统(安赛诊断YnY 2020、YnY2050和YnY 3030系统)中，磁珠的直径为2.8μm。磁珠可由以下物质形成：有机聚合物、聚苯乙烯、苯乙烯共聚物例如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、乙烯基乙酰丙烯酸酯共聚物、氯乙烯/丙烯酸酯共聚物、惰性无机材料、二氧化铬、铁的氧化物、二氧化硅、二氧化硅混合物、蛋白质物质或它们的混合物，
根据本申请，“试剂组分”包含支持ECL信号产生的试剂，例如共反应剂(如三丙胺TPA)、用于pH控制的缓冲剂、表面活性剂、防腐剂或抗菌剂、以及可选的其他组分。技术人员知道在电化学发光检测方法中产生ECL信号所需的试剂构成中存在的组分。
如本文所用，“水溶液”是溶解于水中的颗粒、物质或液体化合物的均相溶液，或具有悬浮在水溶液中的微粒(直径从0.05μm至200μm)的非均相悬浮液。水溶液也可以包含有机溶剂。有机溶剂是本领域技术人员已知的，例如胺、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。如本文所用，还应理解，水溶液可包含至多50％的有机溶剂。
在本文中，与ECL标记物共同参与ECL过程的物质被称为ECL“共反应剂”。ECL常用的共反应剂包括叔胺(例如三正丙胺TPA)及其类似物/同系物(例如2-(二丁基氨基)乙醇等)、草酸盐和过硫酸盐。本领域技术人员知道可用于ECL检测方法的共反应剂。
如本文所用，“过渡金属配合物”涉及包含与合适的络合剂或螯合剂结合的过渡金属离子的ECL发光基团。在一个实施方案中，过渡金属选自由钌、铱、铼、锇、铕、铽、镝组成的集合；在另一个实施方案中，过渡金属是钌、铱、铼、或锇；在进一步的实施方案中，过渡金属是钌或铱。
在一个实施方案中，ECL发光基团是美国专利US 10203333和中国专利ZL201480045420披露了一类电中性金属钌的配位化合物。
在另一个实施方案中，ECL发光基团是铱配合物，并且选自下面的ECL标记物。Ir(6-苯基菲啶)2-吡啶-2-羧酸或其衍生物，包括，例如Ir(6-苯基菲吡啶)2-3-羟基吡啶-2-羧酸、Ir(6-苯基菲啶)2-4-(羟甲基)吡啶-2-羧酸、Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-羧酸、Ir(6-苯基菲啶)2-5-(甲氧基)吡啶-2-羧酸、或Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-羧酸酯、或其衍生物，例如配体被一种或多种磺酸取代的铱配合物、或者如WO2012107419(A1)、WO2012107420(A1)、WO2014019707(A2)、WO2014019708(A1)、WO2014019709(A2)、WO2014019710(A1)、WO2014019711(A1)中所述的铱配合物。本领域技术人员众所周知，铱(III)配合物在水溶液中的溶解性较差，可以使用上述ECL化合物的亲水性衍生物。因此，在另一个实施方案中，可以用亲水性取代基对上述铱(III)ECL发光基团进行修饰。在另一个实施方案中，ECL发光基团是具有两个苯基菲啶配体的铱配合物，所述苯基菲啶配体具有两个磺酰基丙氧基取代基、两个磺甲基，其包含2，9-菲啶二甲磺酸、6-苯基-钠盐(CAS登记号1554465-50-7)、或两个聚乙二醇取代基、或每个苯基菲啶配体中含有上述基团中的三个，或每个苯基菲啶配体中含有上述基团的组合。
在另一个实施方案中，ECL标记物是中国专利申请202010983872.X、美国专利申请2021/0130876 A1和WO 202I/084472 A1中公开的多标记ECL标记分子(如图2中的示例)。
由于以上这几类ECL标记物都表现出比Ru(bpy)3 2+更强的发光，能够承受牺牲一部分信号来换取更高的信噪比。
本领域技术人员知道，在ECL免疫分析中，发光信号由一个恒定的工作电压触发ECL反应，最终导致被固定在磁珠表面的ECL发光体产生光信号。恒定电压激发的时间通常在0.2到10秒之间，优选1.0到3.0秒之间。在此电压激发期间，ECL发光信号逐渐衰减(如图5所示)。在一定时间内，ECL发光衰减曲线下的面积就是相对发光强度(RLU)。在一个特定的免疫分析中，不同的RLU对应于不同的被测物浓度。以RLU表示的信号响应与浓度的关系通常由拟合得到的函数关系(线性或非线性)来描述。图6中的两条拟合曲线符合四参数logistics方程。
本领域技术人员也知道，在一个自动ECL测试系统中，通常有一个电极表面的预处理程序，在样本测试前应用该程序能确保电极表面在测试前保持同样的表面化学状态。一个测试结束后，需对电化学测量池和电极表面进行清洗和再生处理。这些步骤在美国专利5147806中有所披露，美国专利6599473进一步地披露了改进的方案。在描述这些步骤时，在先专利使用的术语是preoperative，conditioning，cleaning。图7描述了一个包含预处理和测试步骤的电化学发光信号产生程序，该程序不包括测试步骤结束后的清洗程序。在不同的ECL系统中，预处理和清洗程序可能不同，比如，美国专利6599473披露的电化学程序中增加了一个被认为可以改进磁珠在电极上的沉积状态的电压脉冲。本发明不涉及预处理和清洗程序的任何改进，本发明的要点是将电化学程序中的测试步骤的工作电压降低到低于ECL发光体的氧化还原电位以下，如图7所示，把通常应用的1.4V降为1.1V。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本精神，可以对每种实施方式做出不同程度的修改，只要不脱离或偏离本发明的基本精神(即，应用一个低于ECL发光体的氧化还原电位的工作电压来产生ECL信号)，该实施方式就在本发明的范围之内。
在一个实施例中，本发明涉及一种检测样品中被测物的方法，该方法包括以下步骤：
a)将所述样品与检测试剂一起孵育以提供结合有被测物的检测试剂，
其中，所述样品中含有被测物，
其中，所述检测试剂被一个或多个ECL标记物标记，含有一个或多个发光基团；
其中ECL发光基团是过渡金属配合物，并且
其中所述结合有被测物的检测试剂被固定在固相上；
b)将所述结合有被测物的检测试剂与未结合被测物的检测试剂和其他未固定化的物质分开，以提供分开的结合有被测物的检测试剂，其中，所述分开的结合有被测物的检测试剂被固定在所述固相上；
c)使所述分开的结合有被测物的检测试剂与缓冲水溶液接触，其中该缓冲水溶液包含至少一种叔胺；
d)在工作电极和参比电极之间应用一个低于1.25V(相对于Ag/AgCl在包含氯化钾溶液中的参比电极)的工作电压触发所述叔胺的电化学氧化反应和后续的ECL反应，从而释放ECL信号；和
e)检测所述电化学发光信号，并通过适当的算法将信号强度与被测物浓度相关联。
在一个实施例中，该方法进一步包括通过用一个或多个ECL标记物标记被测物特异性试剂来提供检测试剂的初始步骤。
在另一个实施例中，该方法还包括通过用ECL标记物标记被测物或被测物类似物/同源物/衍生物来提供所述检测试剂的初始步骤。
在另一个实施方案中，所述ECL基团包括钌或铱配合物，所述工作电极为铂、金和碳。
在另一个实施例中，多个发光基团相同。
在另一个实施例中，多个发光基团可以不同。
在另一个实施方案中，所述叔胺是烷基叔胺。
在另一个实施方案中，所述叔胺是支链胺。
在另一个实施方案中，所述叔胺是三正丙胺(TPA)、三丁胺、或三乙胺、或N，N-二丁基乙醇胺。
在另一个实施方案中，所述被测物特异性试剂是单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述被测物特异性试剂是所述被测物或其类似物的蛋白质或核酸识别伴侣。
在另一个实施方案中，所述被测物特异性试剂是被测物的类似物/同源物/衍生物。
在另一个实施方案中，所述叔胺至少超过所述ECL标记物的浓度的10倍。例如，所述叔胺浓度为10μM至1M，优选10mM至500mM。
在另一个实施方案中，将低于1.25V的工作电压维持一段时间，这段时间通常在0.2秒到10秒之间，优选1.0秒到3.0秒之间。
但在所有的实施方案中，用于触发ECL反应的工作电压不高于1.25V.
以下实施例阐述了本发明的精神。就是说-采用一个低于ECL发光体的氧化还原电位的工作电压来产生ECL信号，在获得高的信噪比的同时，也获得改进的浓度-信号关系曲线。
实施例
实施例1-信号抗体标记
用图1C所示的NRC，即Ru(2，2′-联吡啶)(红菲咯啉二磺酸盐)[4-(2，2′-联吡啶-4-基)丁酸]，标记PCT抗体以形成NRC标记的信号抗体。
将2.5mg(2.5μmol)的NRC以5.0mmol L-1的浓度溶解于500μL的MES缓冲液(0.1molL-1，pH＝4.7)中。向该溶液中加入1.0mg(5.2μmol)的EDC和3.0mg(13.8μmol)磺基NHS，以获得浓度约10mmol L-1的EDC和27mmol L-1的磺基NHS。将该溶液在室温下摇动10分钟。将0.7μL(10μmol)的2-巯基乙醇添加到上述反应溶液中(最终浓度为20mmol L-1)。在室温下放置5分钟后，将8.0μL(含40nmol的NRC)的该孵育溶液添加到500μL AFP抗体(1.2mg/mL，约4nmol的纯PCT抗体，摩尔反应比为10)PBS(0.1mol L-1，pH＝7.4)中。将其混合并在室温下孵育2小时。
将以上获得的溶液(约0.5ml)加载到预先用PBS平衡的PD-10柱上。分离过程中形成两个黄色带。收集对应于标记抗体的第一洗脱带(约0.75ml)。确定标记物NRC与抗体的结合比为6.1∶1。
实施例2-捕获抗体的生物素化
向含有2.1mg脱盐的PCT捕获抗体的2mL CBS缓冲液(pH 9.5)中，加入20mM NHS-LC-生物素(MW 454.54)DMF溶液的一等分试样(15μL)，并孵育上述混合物1小时，然后在PBS缓冲液中透析总共20小时。通过BCA分析法将生物素化的PCT捕获抗体的终浓度确定为1.72mg mL。其生物化程度采用竞争法确定(见Y.Xu，Y.Pan，L.Li and M.Zhou，ACS Omega，2020，5，32591-32596)。
实施例3-免疫分析
用PBS缓冲液(pH 6.0)将NRC标记的PCT信号抗体和生物素化的PCT捕获抗体分别稀释至1μg mL-1和4μg mL-1。包覆有链霉亲和素的
Figure BDA0003220457660000162
M-280作为捕获生物素化抗体/抗原/钌标记的抗体免疫配合物的磁性介质。
在可变工作电压的全自动免疫分析仪器(深圳安赛诊断技术有限公司ProScientia 2020)上，将50μl的不同浓度PCT(被测物)的PBS溶液与85μl浓度为4μg mL-1的生物素化PCT捕获抗体PBS溶液和85μl浓度为1μg mL-1的NRC标记的信号抗体溶液混合。每种混合物在37.2摄氏度下孵育10分钟。将20μl链霉亲和素包被的
Figure BDA0003220457660000163
M-280的悬浮液(0.75mg mL-1)添加到上述反应混合物溶液中，继续在37.2摄氏度反应10分钟后，将150μl上述反应悬浮液注入全自动免疫分析仪的三电极测量池中，其工作电极上方为光电倍增管，工作电极下方为可移动磁体。通过在磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.18mol L-1三丙胺溶液)中进行的氧化还原过程产生ECL。每次测量后，使用美国专利5,538,687和6,599,473B1中描述的方法清洗所述测量池并对电极进行电化学再生处理。
表3是调整工作电压对不同浓度的PCT溶液进行ECL测量得到的结果。
Figure BDA0003220457660000161
将表三中的数据作图，并用四参数logistics方程进行拟合得到图8的浓度-信号曲线。可以明显看出，随着工作电压降低，低浓度端的曲线变得陡峭。在1.05V和1.1V时，尤其明显。这表明，更低的检测限可以得到。对PCT而言，采用1.4V得到的检测限为0.02ng mL-1，而在1.05V的工作电压下，最低检测限达到0.005ng mL-1。
根据前述说明书，本发明披露的低电压ECL对信噪比的提高以及对浓度-信号响应关系改善结果对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本领域技术人员将认识到，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施例进行改变或修改，从而应用于更多的免疫分析中。应当理解，本发明不限于在此描述的特定实施例，而是旨在包括在本发明的范围和精神内的所有改变和修改。

Claims (6)

1.一种采用低工作电压激发电化学发光的生物分析方法，其特征在于，所述的电化学发光来自金属配合物，所述的低工作电压低于金属配合物的氧化还原电位。
a)所述的低工作电压是工作电极和参比电极之间的电压，当测试系统的参比电极是Ag/AgCl(氯化钾溶液中)时，其在1.0V和1.25V之间。当测试系统的参比电极不是Ag/AgCl(氯化钾溶液中)时，按照不同参比电极之间的电位换算关系，所述的低工作电压在换算成Ag/AgCl(氯化钾溶液中)后为1.0V和1.25V之间。
b)所述金属配合物包括金属钌的配合物和金属铱的配合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在产生电化学发光的时间区间，所述的低工作电压可以是一个在1.0V和1.25V之间的一个恒定电压。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在产生电化学发光的时间区间，所述的低工作电压也可以是一个在1.0V和1.25V之间以任意方式变化的电压。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述金属配合物是电中性的钌或铱配合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其生物分析方法是免疫分析方法。
6.根据权利要求1所述的方法，其生物分析方法也可以是非免疫分析方法。
CN202110957653.9A 2021-08-19 2021-08-19 采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法 Pending CN115629208A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110957653.9A CN115629208A (zh) 2021-08-19 2021-08-19 采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110957653.9A CN115629208A (zh) 2021-08-19 2021-08-19 采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115629208A true CN115629208A (zh) 2023-01-20

Family

ID=84901876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110957653.9A Pending CN115629208A (zh) 2021-08-19 2021-08-19 采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115629208A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5308754A (en) Electrogenerated luminescence in solution
KR100381462B1 (ko) 전기화학발광을이용한생체분자반응속도측정방법
EP0580979B1 (en) Method of detection by inducing electrochemiluminescence
US6140138A (en) Electrochemiluminescent metal chelates and means for detection
JP3061416B2 (ja) 改良されたルミネセンス検定の方法と装置
EP0446245B1 (en) Electrochemiluminescent assays
JP3128541B2 (ja) 複数の磁石を含む磁性微粒子に基づいたルミネッセンス・アッセイのための装置
US6251690B1 (en) Electrical excitation of label substances at insulating film-coated conductors
WO1996017248A9 (en) Rate measurements of biomolecular reactions using electrochemiluminescence
US6881536B1 (en) Particle based electrochemiluminescent assays
CN112505023B (zh) 改进生物分析测定中的电化学发光信号的方法
JP2718618B2 (ja) 電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法
Yu et al. Improved electrochemiluminescence labels for heterogeneous microbead immunoassay
JPH01302144A (ja) 溶液中での電気発生のルミネセンスに基づく分析方法
CN115629208A (zh) 采用电中性金属配合物增强电化学发光免疫分析性能的方法
CN115480055A (zh) 电化学发光免疫分析试剂盒及其使用方法
KR102690985B1 (ko) 신규한 전기화학발광 공반응물 및 이를 포함하는 전기화학발광 시스템
CN111351938A (zh) 电激发标记分子的方法和绝缘膜涂覆的电极
FI111758B (fi) Lyoluminesenssin käyttö analyyttisiin tarkoituksiin
CN116448999A (zh) 一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法
Miao et al. Electrogenerated Chemiluminescence (ECL)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination