CN116448999A - 一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法及应用，属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域；本文所构建的以Cu NCs为发光体、以K2S2O8为共反应剂、以MnCo2O4为共反应剂促进剂的三元ECL体系具有良好的发光性能，首次提出了一种用于非小细胞肺癌疾病标志物CYFRA 21‑1的高灵敏检测的免疫传感器的制备方法，金属纳米簇具有发光特性较好、毒性较小、易于标记的优点，本文中我们开发铜纳米簇(Cu NCs)作为发光体并研究其在过硫酸钾(K2S2O8)中的阴极ECL发光。同时，为了改善其发光性能，以此提高传感器的灵敏度，我们利用共反应剂促进剂MnCo2O4加速共反应剂K2S2O8的还原，使之产生更多硫酸根自由基，达到放大信号的目的线性范围50 pg/mL‑50 ng/mL，在非小细胞肺癌早期诊断中具有明显的潜在应用价值。

Description

一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器 的制备方法
技术领域
本发明属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域。
背景技术
CYFRA 21-1是细胞角蛋白19的可溶性片段，被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌的诊断具有重要价值。如果肺部存在不清晰的环形阴影，同时血清CYFRA21-1浓度高于30 ng/mL，原发性支气管肺癌的可能性非常高，各类非小细胞肺癌阳性检出率为70%～85%，CYFRA21-1的血清浓度水平高低与肿瘤临床分期正相关，也可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发的有效指标，CYFRA 21-1的血清高浓度水平提示疾病处于进展期和预后不良，质量成功的标志是CYFRA 21-1的血清浓度迅速下降，反之则表示病灶未完全清除，CYFRA 21-1对各型肺癌诊断的敏感性依次为：鳞癌>腺癌>大细胞癌>小细胞癌。到目前为止，只有荧光法、电化学分析、色谱分析等几种分析方法得到了发展。因此，发展一种简单、快速、准确的测定方法，对于CYFRA 21-1的即时检测具有重要意义。
作为一门由生物、化学、医学、电子技术等多种学科相互交叉而兴起的研究热点，电致化学发光免疫分析是电致化学发光技术与免疫分析方法的有机结合，制得的免疫传感器具有成本低、选择性好、灵敏度高、分析速度快，易于自动化、微型化与集成化等优点，已被广泛应用于疾病标志物分析、食品安全分析、环境污染分析等领域。
因为其金属纳米团簇有独特的物理化学性质，尤其是基础科研和新技术的探索方面。多数金属纳米簇具有良好的荧光特性、出色的光稳定性、独特的亚纳米尺寸和低细胞毒性，已经成为量子点(QDs)和传统荧光团的良好替代品。同时，金属纳米簇避免了QDs的细胞毒性和传统荧光团的光淬灭性的缺点。此外，部分金属纳米簇(如Au NCs，Ag NCs，和Cu NCs等)具有低毒性，易合成、易标记、良好的电化学性质的优点，已经成为ECL领域研究的热点。开发铜纳米簇(Cu NCs)作为发光体并研究其在过硫酸钾(K2S2O8)中的阴极ECL发光。同时，为了改善其发光性能，以此提高传感器的灵敏度，我们利用共反应剂促进剂MnCo2O4加速共反应剂K2S2O8的还原，使之产生更多的硫酸根自由基，从而大大增强过硫酸钾体系的电致化学发光反应实现信号高效稳定输出。
发明内容
本发明的任务之一是为了拓宽过硫酸钾体系在电致化学发光传感的应用，开发了一种ECL生物传感器，用Cu NCs作为发光体，K2S2O8作为共反应剂，MnCo2O4作为共反应剂促进剂。在K2S2O8中，作为发光体的Cu NCs具有稳定的ECL发射。同时，ECL发光信号因为共反应剂K2S2O8的还原反应被作为共反应剂促进剂的MnCo2O4很好地催化而产生了更多的SO4·-，可显著增强过硫酸钾体系的发光效率；本发明的技术任务之二是弥补现有CYFRA 21-1检测技术的不足，提供一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的用途，该传感器能够快速检测CYFRA 21-1，具有灵敏度高、特异性强、重现性好的优点，检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
（1）功能化的MnCo2O4的制备
首先，称取0.49 g乙酸锰、0.249 g乙酸钴和0.2 g聚乙烯吡咯烷酮溶于1 mL超纯水中，再加入60 mL乙二醇溶液，搅拌条件下反应2 h，再将上述反应物放入高温反应釜中于180 ℃下高温反应12 h，最后，将上述得到的产品离心，并多次使用无水乙醇进行洗涤，干燥后用研钵研磨后获得样品；
将50 mg的MnCo2O4溶于30 mL无水乙醇和2 mL超纯水的混合溶液中，超声处理0.5~ 2 h，形成了分散均匀的混合溶液；经上述操作后，随后依次加入2 mL的NH3∙H2O(25%)和200 µL的APTMS，超声作用10 h；离心获得功能化的MnCo2O4，多次用超纯水和无水乙醇进行洗涤。在10 mL超纯水中溶解上述操作后的所得反应物，待用；
（2）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（3）在玻碳电极表面滴涂6 μL 功能化后的MnCo2O4溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为100 μg/mL的CYFRA 21-1抗体溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（5）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（6）滴加6 μL、一定浓度的 CYFRA 21-1标准溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕；
（7）在10 mL磷酸盐缓冲溶液中，对传感器进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL。
本发明的有益成果
（1）本发明首次提出一种，开发了一种ECL生物传感器，用Cu NCs作为发光体，K2S2O8作为共反应剂，MnCo2O4作为共反应剂促进剂。在K2S2O8中，作为发光体的Cu NCs具有稳定的ECL发射。同时，ECL发光信号因为共反应剂K2S2O8的还原反应被作为共反应剂促进剂的MnCo2O4很好地催化而产生了更多的SO4·-，可显著增强过硫酸钾体系的发光效率
（2）本发明基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光原理提出了一种精准可靠的免疫传感技术。弥补了现有电化学检测技术操作复杂、灵敏度低、重现差的问题，将该技术应用于CYFRA 21-1的样品检测，检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL，具有响应速度快、灵敏度高、重现好、制备简单、成本低、绿色环保的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1. 一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL 功能化后的MnCo2O4溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加6 μL、浓度为100 μg/mL的CYFRA 21-1抗体溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（5）滴加6 μL、一定浓度的 CYFRA 21-1标准溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕；
（6）在10 mL磷酸盐缓冲溶液中，对传感器进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL。
实施例2.一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1. 一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL 功能化后的MnCo2O4溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加6 μL、浓度为100 μg/mL的CYFRA 21-1抗体溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（5）滴加6 μL、一定浓度的 CYFRA 21-1标准溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕；
（6）在10 mL磷酸盐缓冲溶液中，对传感器进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL。
实施例3.一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1. 一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL 功能化后的MnCo2O4溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加6 μL、浓度为100 μg/mL的CYFRA 21-1抗体溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（5）滴加6 μL、一定浓度的 CYFRA 21-1标准溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕；
（6）在10 mL磷酸盐缓冲溶液中，对传感器进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL。
实施例4. 所述功能化的MnCo2O4，按以下步骤制备：
首先，称取0.49 g乙酸锰、0.249 g乙酸钴和0.2 g聚乙烯吡咯烷酮溶于1 mL超纯水中，再加入60 mL乙二醇溶液，搅拌条件下反应2 h，再将上述反应物放入高温反应釜中于180 ℃下高温反应12 h，最后，将上述得到的产品离心，并多次使用无水乙醇进行洗涤，干燥后用研钵研磨后获得样品；
将50 mg的MnCo2O4溶于30 mL无水乙醇和2 mL超纯水的混合溶液中，超声处理0.5~ 2 h，形成了分散均匀的混合溶液；经上述操作后，随后依次加入2 mL的NH3∙H2O(25%)和200 µL的APTMS，超声作用10 h；离心获得功能化的MnCo2O4，多次用超纯水和无水乙醇进行洗涤。在10 mL超纯水中溶解上述操作后的所得反应。
实施例5. 所述功能化的MnCo2O4，按以下步骤制备：
首先，称取0.49 g乙酸锰、0.249 g乙酸钴和0.2 g聚乙烯吡咯烷酮溶于1 mL超纯水中，再加入60 mL乙二醇溶液，搅拌条件下反应2 h，再将上述反应物放入高温反应釜中于180 ℃下高温反应12 h，最后，将上述得到的产品离心，并多次使用无水乙醇进行洗涤，干燥后用研钵研磨后获得样品；
将50 mg的MnCo2O4溶于30 mL无水乙醇和2 mL超纯水的混合溶液中，超声处理0.5~ 2 h，形成了分散均匀的混合溶液；经上述操作后，随后依次加入2 mL的NH3∙H2O(25%)和200 µL的APTMS，超声作用10 h；离心获得功能化的MnCo2O4，多次用超纯水和无水乙醇进行洗涤。在10 mL超纯水中溶解上述操作后的所得反应。
实施例6. 所述功能化的MnCo2O4，按以下步骤制备：
首先，称取0.49 g乙酸锰、0.249 g乙酸钴和0.2 g聚乙烯吡咯烷酮溶于1 mL超纯水中，再加入60 mL乙二醇溶液，搅拌条件下反应2 h，再将上述反应物放入高温反应釜中于180 ℃下高温反应12 h，最后，将上述得到的产品离心，并多次使用无水乙醇进行洗涤，干燥后用研钵研磨后获得样品；
将50 mg的MnCo2O4溶于30 mL无水乙醇和2 mL超纯水的混合溶液中，超声处理0.5~ 2 h，形成了分散均匀的混合溶液；经上述操作后，随后依次加入2 mL的NH3∙H2O(25%)和200 µL的APTMS，超声作用10 h；离心获得功能化的MnCo2O4，多次用超纯水和无水乙醇进行洗涤。在10 mL超纯水中溶解上述操作后的所得反应。

Claims (1)

1.一种基于MnCo2O4高效促进铜纳米簇电化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）功能化的MnCo2O4的制备
首先，称取0.49 g乙酸锰、0.249 g乙酸钴和0.2 g聚乙烯吡咯烷酮溶于1 mL超纯水中，再加入60 mL乙二醇溶液，搅拌条件下反应2 h，再将上述反应物放入高温反应釜中于180℃下高温反应12 h，最后，将上述得到的产品离心，并多次使用无水乙醇进行洗涤，干燥后用研钵研磨后获得样品；
将50 mg的MnCo2O4溶于30 mL无水乙醇和2 mL超纯水的混合溶液中，超声处理0.5 ~ 2h，形成了分散均匀的混合溶液；经上述操作后，随后依次加入2 mL的NH3∙H2O(25%)和200 µL的APTMS，超声作用10 h；离心获得功能化的MnCo2O4，多次用超纯水和无水乙醇进行洗涤。在10 mL超纯水中溶解上述操作后的所得反应物，待用；
（2）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（3）在玻碳电极表面滴涂6 μL 功能化后的MnCo2O4溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为100 μg/mL的CYFRA 21-1抗体溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（5）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（6）滴加6 μL、一定浓度的 CYFRA 21-1标准溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕；
（7）在10 mL磷酸盐缓冲溶液中，对传感器进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为20 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL。
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