CN114675026A - 一种溶解增强长余辉发光检测方法 - Google Patents
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Abstract
溶解增强长余辉发光检测试剂盒及检测方法，使用溶解增强长余辉检测试剂盒对生物样本中的抗原进行检测，试剂盒包括捕获抗体、连接生物素的检测抗体、亲和素、生物素化的纳米探针和余辉增强液；纳米探针为带有氨基的介孔二氧化硅负载碱式碳酸铕复合纳米材料；纳米探针表面的氨基可以与生物素稳定连接，确保检测结果的准确性，纳米探针负载的碱式碳酸铕可以在两分钟内溶出高浓度的铕离子激活光化学长余辉体系，用于AFP的灵敏检测；光化学长余辉发光材料可以在激发光停止后发出强烈的红色余辉光，用于溶解增强余辉发光检测AFP时，能够避免基质中自发荧光干扰，提高检测的灵敏度，从而实现血清样本中AFP的超灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于抗原检测的技术领域，特别涉及一种溶解增强长余辉发光检测方法。
背景技术
原发性肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见癌症以及由于癌症死亡的第三大病因。甲胎蛋白(AFP)通常被用作监测HCC的肿瘤标志物。灵敏地检测和追踪肿瘤标志物AFP能够为肝癌的早期诊断提供更多机会，并最终提高患者的生存率。近年来，很多免疫分析技术发展起来用于肿瘤标志物的检测，比如酶联免疫分析法(enzyme-linked immunoassay,ELISA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)、化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)和时间分辨荧光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)。其中RIA方法中通常用放射性元素125I作为示踪标记物，具有潜在的健康危害，ELISA技术以酶作为标记物，但仍存在酶底物不稳定等问题。由于TRFIA和CLIA方法的灵敏度，作为TRFIA方法的一个分支，解离增强荧光免疫分析(dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay,DELFIA)是最初在1984年由Hemmila等人报道的。DELFIA的检测过程一般是由稀土螯合物将三价稀土离子(Ln3+)定量标记到抗原或抗体上，然后通过免疫反应生成三明治夹心复合结构，由于稀土螯合物荧光信号很弱，所以采用加入酸性余辉增强液的方法将Ln3+解离下来，与余辉增强液中的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)和三正辛基氧化膦(TOPO)两种配体生成较强发光的Ln3+-配合物胶束，胶束可以避免水对荧光的淬灭，最后用紫外光激发配合物，通过检测时间分辨信号来定量检测抗原。很多商用试剂盒都采用DELFIA进行检测肿瘤标志物。2014年，Chen等人报道了基于镧系纳米粒子(NPs)的溶解增强发光测定方法(dissolution-enhanced luminescent bioassay,DELBA)，这种方法是从DELFIA的基础上发展起来的。DELBA的策略是利用具有更高浓度Ln3+的纳米粒子代替DELFIA中的稀土螯合物，来定量标记分析物。在NPs溶于余辉增强液后，每个NPs会释放出多达成千上万个Ln3+(取决于NPs的尺寸)，提高了稀土离子Ln3+的标记数量，这些Ln3+与余辉增强液反应，形成高浓度的镧系配合物胶束，胶束的时间分辨荧光作为检出信号，实现了信号的放大和输出，提高了检测灵敏度。2014年Chen等人将这种方法应用于癌胚抗原(CEA)的高灵敏检测，比传统解离增强的方法在检测限方面有三个数量级的改进，这一报道已获中美日等国际专利授权并入选“2014年中国稀土十大科技新闻”。Chen等人在2016年将这种DELBA方法应用于前列腺癌肿瘤标志物(PSA)的检测以及肝癌肿瘤标志物(AFP)的检测，在2017年将DELBA方法应用于miRNA的检测以及在2019年将其应用于循环肿瘤细胞的检测，均达到了比传统DELFIA检测方法更高的灵敏度和更低的检测限。
由于DELBA方法中Ln3+-NPs不能直接与抗体相连，Ln3+-NPs(如Eu3+-NPs)通常与生物素的羧基(-COOH)配位进而定量标记抗原或抗体，并进行常规免疫反应，形成免疫复合物。然而，据本发明的发明人所知，Eu3+与PO4 3-结合能力高于Eu3+与-COOH结合能力，稳定常数KEuPO4>KEu(COOH)3，在检测过程中Eu3+与生物素的-COOH可能存在不稳定的连接，因此，需要一种更稳定的连接方式来确保检测结果的准确性。
介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)具有独特的介孔结构、良好的单分散性。近年来，表面多种基团修饰的介孔二氧化硅纳米粒子被广泛用于多功能纳米材料的制备，在药物的负载和传递方面也显示出巨大潜力。它还可以与量子点、镧系纳米粒子、贵金属纳米团簇等结合形成纳米复合物用于体内外检测和成像。
长余辉发光材料是一类特殊的发光材料，其在去除激发光源后还可以持续长时间的发光。已有的技术中，长余辉发光材料的发光寿命通常要大于一百毫秒，其在许多重要领域内均具有重要的应用价值。在检测领域中，由于无背景荧光干扰，有助于提高检测的灵敏度。
发明内容
本发明为解决传统的DELBA方法中纳米粒子与生物素、抗体连接不稳定的问题，发展了一种基于介孔二氧化硅负载碱式碳酸铕MSNs@Eu(OH)CO3的纳米探针，与生物素共价连接，进而溶解产生高浓度Eu3+激活光化学余辉体系，余辉信号作为检出信号，确保了检测结果的准确性。
本发明的目的一是为了提供：用于溶解增强余辉发光生物检测的过程中的产品，包括抗原和抗体识别、生物素连接抗体、纳米探针与生物素共价连接、余辉增强液用于溶解纳米探针和光化学长余辉发光检测；所述纳米探针为MSNs@Eu(OH)CO3；所述纳米探针与生物素共价连接本质上为-NH2和-COOH的缩合反应；所述余辉增强液中包含与Eu3+形成配合物的配体以及光化学长余辉体系的组成部分。
优选的，所述的抗体为抗甲胎蛋白(AFP)抗体，固定于96孔板上，用于识别抗原。
优选的，所述MSNs@Eu(OH)CO3复合纳米材料为球形介孔结构，孔道中负载Eu(OH)CO3，用于溶解产生Eu3+，与余辉增强液中的配体发生反应，生成Eu配合物。
优选的，所述MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针表面存在较高浓度的-NH2，浓度范围为10.63-23.75μmol/g，用于与生物素的-COOH通过共价键稳定连接。
优选的，所述MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针中的硅和铕的摩尔比Si/Eu为0.4-0.8：1。
优选的，所述MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针中Eu3+与-NH2的摩尔比为203.7：1。
纳米探针的形貌和粒径可以通过电子显微镜拍摄图像表征，并且将多次测量得到的纳米微球的平均直径记录为粒径。这样的纳米微球的表征方法是技术人员已知的并且可以例如采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)仪器测得的。
优选的，所述MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针的粒径为172-175nm左右。
优选的，余辉增强液为酸性胶束分散液pH值为2-3之间，用于快速溶解纳米探针产生Eu3+，用于激活余辉发光。进一步优选的，余辉增强液的pH为2.61。
优选的，所述余辉增强液的胶束中包含光化学长余辉的吸光剂、光能缓存剂以及与Eu3+形成配合物的配体，所生成的Eu-配合物作为光化学长余辉的发光剂。
优选的，所述光化学缓存剂经过加成、重排或断键反应步骤，于吸光剂与发光剂之间进行能量储存和能量交换。
优选的，吸光剂为酞菁分子，其吸收波长集中在600nm-700nm，具有好的组织穿透能力。其光敏化能力好，能够高效地将O2转化为单线态氧(1O2)。
优选的，所述吸光剂为以下物质(SiPc[OSi(n-C6H13)3]2)：
优选的，光化学缓存剂为含乙烯基的材料，能够与1O2反应生成1,2-二氧杂环丁烷结构高能中间体。
优选的，所述光化学缓存剂为以下物质(PCU-1)：
优选的，发光剂为铕配合物Eu(TOPO)2(β-NTA)3，其发光量子效率为71.5％。
优选的，所述发光剂为以下物质：
优选的，所述溶解增强长余辉发光检测方法的检测AFP灵敏度为0.12ng mL-1(优于0.2ng mL-1)，检测范围为0-100ng mL-1。
优选的，所述余辉增强液中胶束为聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)胶束；所述胶束的合成方法为超声破碎法；所述Triton X-100的浓度为0.1wt％；吸光剂与光能缓存剂的摩尔比为1:100；与Eu3+反应形成配合物的两种配体(β-NTA和TOPO)的摩尔比为3:10。
在一种优选的方案中，发光剂的配体结构上修饰有柔性链，光能缓存剂上修饰柔性链，柔性链的增加可以增加光能缓存剂和发光剂分子在纳米胶束中的负载量，对增强发光和提高检测灵敏度是有利的。
本发明的目的之二是为了提供：一种溶解增强余辉检测方法，该方法包括如下的操作步骤：
S11.用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液将抗AFP抗体稀释至10μg/mL，加入到96孔板中，每孔加入100μL，在37℃条件下孵育1h，弃去孔内液体，用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗板三次。
S12.每孔加入用0.1mol/L的碳酸盐缓冲溶液配置的0.1％的乙醇胺300μL，将孔板置于37℃条件下孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板三次。
S13.每孔加血清样本100μL，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板三次。
S14.每孔加入生物素化的抗AFP抗体(2μg/mL，100μL/孔)，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板三次。
S15.将亲和素溶液(10μg/mL，100μL/孔)加入孔板中，37℃孵育0.5h，用PBST缓冲溶液洗板三次。
S16.在每孔中加入生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3纳米复合物(10μg/mL,200μL)，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板六次。
S17、每孔加200μL余辉增强液将Eu3+溶解下来。将余辉增强溶液吸入到微量比色皿中，在FS5荧光光谱仪上用外置680nm激光器照射比色皿，测试余辉强度。
本发明的有益效果包括：
本发明合成了介孔二氧化硅负载碱式碳酸铕(MSNs@Eu(OH)CO3)的纳米复合材料作为纳米探针。由于Eu(OH)CO3的负载占据了介孔二氧化硅(MSNs)表面-NH2的位点，因此通过调控合成过程中介孔二氧化硅的浓度，得到了负载Eu(OH)CO3和-NH2浓度均较高的纳米材料，Eu(OH)CO3和-NH2的浓度范围分别为3.82-4.29mmol/g和10.63-23.75μmol/g。
本发明在MSNs@Eu(OH)CO3表面共价连接了生物素，并通过磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析7天，离心洗涤，生物素浓度几乎不变。与传统的DELBA方法中的配位连接相比较，证明了共价连接的稳定性。
本发明的长余辉发光材料是基于光化学余辉体系的，该体系利用光化学反应的特性，在光能输入和光能输出之间引入光化学反应，将光物理与化学有机融合。在基于该有机体系的长余辉发光材料中，发光过程涉及多种化学物质间的光化学相互作用，其中经过一系列的光化学能量转化与代谢过程，输入的激发光能量最终以发光的形式释放出来，从而实现长余辉发光。能量转化与代谢过程包括能量输入、能量缓存、能量提取、能量转移和能量释放。通过光化学反应使原本非常迅速的光子辐射跃迁进程(纳秒量级至微秒量级)发生改变，能量缓慢释放并最终以光能的形式发射出来。
本发明利用胶束两亲性嵌段聚合物的性质，将光化学长余辉体系的有机分子转为水中可分散的纳米胶束，并优化了吸光剂、光能缓存剂和发光剂的浓度条件，有助于获得高效的余辉发光。
本发明所提出的溶解增强长余辉发光检测方法，用于检测临床血清样本的AFP浓度，检测值与临床化学发光分析法的相关性高达99％，证明检测结果准确有效。
附图说明
图1为MSNs@Eu(OH)CO3的透射电镜图片(a)和扫描电镜图片(b)。
图2为MSNs@Eu(OH)CO3的X射线晶体粉末衍射图。
图3为在不同的介孔二氧化硅浓度((a)0.1、(b)0.2、(c)0.3、(d)0.4、(e)0.5和(f)0.6mg/mL)条件下合成MSNs@Eu(OH)CO3的透射电镜图。
图4为不同Si/Eu比的MSNs@Eu(OH)CO3纳米复合材料中Eu3+浓度和-NH2浓度变化曲线。
图5为MSNs@Eu(OH)CO3和SiO2@Eu(OH)CO3中Eu3+浓度和-NH2浓度差异显著性分析。
图6为(a)MSNs@Eu(OH)CO3分别溶于PBS缓冲溶液(1mg/mL)和余辉增强液(100μg/mL)中的余辉发光光谱；插图：MSNs@Eu(OH)CO3分别溶于PBS缓冲溶液(左图)和余辉增强液(右图)中的余辉发光照片。(b)Eu(β-NTA)3(TOPO)2的荧光发射光谱。
图7为光化学长余辉体系发光过程示意图以及各组分的化学结构式。
图8为不同浓度的MSNs@Eu(OH)CO3溶于余辉增强液中(200μL)的溶解动力学曲线。(a)MSNs@Eu(OH)CO3的浓度为2、4、6、8和10μg/mL。(b)MSNs@Eu(OH)CO3的浓度为10、20、40、60和80μg/mL。
图9为分别用PBS透析生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3和生物素化的NaEuF4七天内生物素浓度曲线。
图10为MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针用于检测AFP的过程和原理示意图。
图11为(a)MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针用于检测AFP线性响应范围曲线；(b)溶解增强长余辉发光检测结果与临床化学发光分析法检测结果的相关性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。但本领域技术人员知晓，本发明并不局限于附图和以下实施例。
实施例1
复合纳米材料MSNs@Eu(OH)CO3的合成：复合纳米材料MSNs@Eu(OH)CO3的合成是在介孔二氧化硅MSNs-NH2的孔径中原位生长Eu(OH)CO3纳米材料。首先将Eu(NO3)3·6H2O(49.9mg，5.6×10-3mol/L)和尿素(600.6mg，0.5mmol/L)置于100mL圆底烧瓶中，并加入20mL去离子水使其溶解。为了得到负载不同Eu(OH)CO3浓度的MSNs@Eu(OH)CO3，我们分别向上述溶液中加入不同浓度的MSNs-NH2，使其在水溶液中的最终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6mg/mL。将混合物超声处理10min，使MSNs-NH2均匀分散，在85℃下回流2h。反应后，产物在4200rpm转速下离心12min，并用去离子水洗涤产物三次。最终将产物分散在去离子水中。所合成的6种不同载量的纳米复合材料的TEM图如图3所示，可以从TEM图像中直接观察到不同浓度的Eu(OH)CO3负载在介孔二氧化硅的孔道中(a-f)。随着合成过程中介孔二氧化硅浓度的增加，纳米复合材料负载的Eu(OH)CO3逐渐减少，TEM图中孔道的衬度也逐渐变浅。
实施例2
MSNs@Eu(OH)CO3中Eu3+的定量：首先制备了荧光增强液，其中Triton X-100、β-NTA和TOPO的浓度分别为0.1wt％、15μmol/L和50μmol/L，pH＝2.3。将一定浓度梯度的Eu3+直接加入到上述荧光增强液中，使Eu3+在最终浓度分别为2、4、6、8、10μmol/L，Eu3+与增强液中的β-NTA和TOPO形成配合物，测试其在614nm处的荧光强度，得到Eu(β-NTA)3(TOPO)2在614nm处荧光强度标准曲线。随后，将一定浓度的MSNs@Eu(OH)CO3溶于配置好的增强液中，Eu(OH)CO3在酸性增强液的作用下溶解出Eu3+，形成配合物，在相同条件下测试荧光强度，并通过标准曲线定量Eu3+浓度。所有样品均在FS5荧光光谱仪上测试三次。测试结果如图4所示，随着Si/Eu比的增加，六个样品的Eu3+浓度逐渐增加。
实施例3
MSNs@Eu(OH)CO3中氨基浓度测定。首先测试9-亚甲基-9H-芴(DBF)在λ＝300nm处的紫外吸收标准曲线。将MSNs@Eu(OH)CO3(2mg)分散在无水DMF(4mL)中，然后再加入氯甲酸-9-芴基甲酯(FmocCl)(50mg，1.9×10-4mol)的无水DMF(5mL)溶液，在氩气保护下，室温搅拌过夜。然后将混合物离心，用甲醇洗涤，在真空干燥箱中烘干过夜，得到Fmoc保护的MSNs@Eu(OH)CO3。加入0.8mL DMF超声使其再分散，再加入0.2mL哌啶后超声20min，离心后取上清液(DBF)测紫外吸收谱图，根据已经测得的DBF紫外吸收标准曲线，计算DBF的浓度，进而计算MSNs@Eu(OH)CO3中的氨基密度。测试结果如图4所示，随着Si/Eu比的增加，六个样品的-NH2密度逐渐降低，与Eu3+浓度成负相关，这是因为随着Eu3+浓度的升高，占据了介孔硅表面的-NH2位点。
实施例4
余辉增强液的制备：首先制备了包含Triton X-100、β-NTA和TOPO的胶束分散液，然后通过超声破碎法将光化学长余辉体系的光敏剂SiPc和光能缓存单元PCU-1加入到分散液中制成胶束。为了提高检测灵敏度，对余辉增强液的制备方法和各组分浓度进行了优化，最终增强液中各组分的浓度分别为Triton X-100(0.1wt％)、β-NTA(15μmol/L)、TOPO(50μmol/L)、SiPc(2μmol/L)和PCU-1(200μmol/L)。
实施例5
MSNs@Eu(OH)CO3溶于余辉增强液中余辉信号强度测试：将不同浓度的MSNs@Eu(OH)CO3(10-2-104μg/mL)溶于余辉增强液中，2min后，用FS5荧光光谱仪测试λ＝614nm处的余辉强度，余辉强度与浓度(0-10μg/mL)之间存在线性关系，随浓度增加，余辉强度线性增加(680nm激光器，激光功率为346.6mW/cm2，照射时间为2s)。
实施例6
MSNs@Eu(OH)CO3连接生物素：取5mg的MSNs@Eu(OH)CO3分散在5mL的DMF/DMSO(3:1，V/V)中，并加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，使其浓度为2.3×10-4mol/L。然后将25μL生物素琥珀酰亚胺酯(10mg/mL)加入到上述混合液中。混合物在磁力搅拌下反应12h后离心去除未反应的生物素。最后将产物分散到去离子水中在4℃条件下保存。
实施例7
生物素的定量：2-(对羟基苯偶氮)苯甲酸(HABA)可与亲和素结合，产生一种在λ＝500nm处吸收的橘黄色络合物。生物素化后的样品与亲和素/HABA复合物溶液混合后，生物素会取代HABA染料，使吸光度下降。实验中，在去离子水(10mL)中加入HABA(24.2mg)，然后加入0.2mL NaOH(1mol/L)制备HABA溶液，过滤去除未溶解的HABA颗粒。将亲和素(5mg)溶解于50mL PBS中，然后加入0.3mL的HABA溶液，制得亲和素/HABA溶液。采用上述亲和素/HABA配制不同生物素浓度(5、10、15、20、25μg/mL)的溶液，并测试溶液在λ＝500nm处的紫外吸收光谱，得到紫外吸收强度随生物素浓度改变的标准曲线。将10mg生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3溶于2mL亲和素/HABA溶液中。生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3中生物素的含量可以通过测试λ＝500nm处的吸光度来定量计算，生物素浓度计算结果为0.93μg/mg。
实施例8
基于MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针检测AFP实验步骤：用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液将抗AFP抗体稀释至10μg/mL，加入到96孔板中，每孔加入100μL，在37℃条件下孵育1h，弃去孔内液体，用PBST缓冲溶液洗板三次。每孔加入用0.1mol/L的碳酸盐缓冲溶液配置的0.1％的乙醇胺300μL，将孔板置于37℃条件下孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板三次。每孔加AFP标准溶液液100μL，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板三次。每孔加入生物素化的抗AFP抗体(2μg/mL，100μL/孔)，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板三次。将亲和素溶液(10μg/mL，100μL/孔)加入孔板中，37℃孵育0.5h，用PBST缓冲溶液洗板三次。然后在每孔中加入生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3纳米复合物(10μg/mL,200μL)，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板六次。接下来每孔加200μL余辉增强溶液将Eu3+溶解下来。将余辉增强溶液吸入到微量比色皿中，在FS5荧光光谱仪上用外置680nm激光器照射比色皿(照射时间2s，激光器功率密度346.6mW/cm2)，测试余辉强度，测试结果如图11所示。
对比例1
为了与MSNs@Eu(OH)CO3做对比，合成了SiO2@Eu(OH)CO3，并测试了SiO2@Eu(OH)CO3表面负载的可溶出Eu3+浓度和-NH2密度分别为0.44mmol/g和4.15μmol/g，均远低于MSNs@Eu(OH)CO3中的Eu3+浓度和-NH2密度。对这种差异做了显著性分析，每组数据分别测试三次，图5中表示了分析结果，计算P值在***P<0.01的范围，表明两组材料的Eu3+浓度和-NH2均存在显著性差异。由此可知，SiO2纳米粒子不能为Eu3+和-NH2提供足够的位点，不能作为提高灵敏度且稳定连接抗体的合适材料。
对比例2
为了证明MSNs@Eu(OH)CO3表面共价连接生物素的稳定性，合成了生物素配位的NaEuF4 NPs，并将两种方式连接生物素的纳米材料置于PBS缓冲溶液中透析7天，每天均取样离心且用PBS缓冲溶液洗涤后测试两者的生物素的浓度，如图9所示，MSNs@Eu(OH)CO3表面生物素浓度基本保持不变，证明了其与纳米探针表面的稳定连接，进一步确保了后续检测结果的准确性。而NaEuF4表面连接的生物素从最初的1.08μg/mL降至七天后的0.81μg/mL，说明NaEuF4连接生物素是不稳定的，可能会影响检测结果的准确性。这是因为NaEuF4是通过Eu3+与-COOH配位的方式连接生物素，在PBS缓冲溶液中配位作用不稳定，Eu3+更易与PO4 3-配位而导致生物素脱落。
对比例3
应用建立的溶解增强长余辉发光检测方法检测了20例临床血清样本中AFP(1.16～49.73ng/mL)，其中14份样本为AFP正常水平的血清样本(<10ng/mL)，6份为AFP异常的血清样本(>10ng/mL)。如图11所示，基于MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针的DELBA检测结果与临床化学发光分析法(CLIA)检测结果一致，两种方法的相关系数为0.99，表明基于MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针的检测结果是可靠的。
Claims (8)
1.一种溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述溶解增强长余辉发光检测试剂盒包括捕获抗体、生物素化的抗AFP抗体、亲和素、生物素化的纳米探针和余辉增强液。
2.根据权利要求1所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体和所述连接生物素的检测抗体均为抗AFP抗体。
3.根据权利要求1或2所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化的纳米探针为生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针，所述生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针粒径在172-175nm范围之间，纳米探针中氨基浓度为10.63-23.75μmol/g，其负载Eu3+浓度为3.82-4.29mmol/g。
4.根据权利要求1-3任一项所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述余辉增强液中包含聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)胶束、能够与Eu3+反应生成Eu配合物的配体、光化学余辉体系的吸光剂和光能缓存剂。
5.根据权利要求4所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述余辉增强液的pH为2.61。
6.根据权利要求4或5所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述配体为β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)和三正辛基氧化膦(TOPO)两种分子，其摩尔比为3:10。
7.根据权利要求4或5所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒，其特征在于，所述吸光剂与所述光能缓存剂分别为SiPc[OSi(n-C6H13)3]2和PCU-1，其摩尔比为1:100。
8.一种溶解增强长余辉发光检测方法，其特征在于：所述方法采用如权利要求1-7任一项所述的溶解增强长余辉发光检测试剂盒进行，所述方法包括以下步骤：
S11.用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液将抗AFP抗体稀释至10μg/mL，加入到96孔板中，每孔加入100μL，在37℃条件下孵育1h，弃去孔内液体，用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗板两次以上；
S12.每孔加入用0.1mol/L的碳酸盐缓冲溶液配置的0.1％的乙醇胺300μL，将孔板置于37℃条件下孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板两次以上；
S13.每孔加血清样本100μL，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板两次以上；
S14.每孔加入生物素化的抗AFP抗体(2μg/mL，100μL/孔)，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板两次以上；
S15.将亲和素溶液(10μg/mL，100μL/孔)加入孔板中，37℃孵育0.5h，用PBST缓冲溶液洗板两次以上；
S16.在每孔中加入生物素化的MSNs@Eu(OH)CO3纳米探针(10μg/mL,200μL)，37℃孵育1h，用PBST缓冲溶液洗板六次以上，以确保未连接亲和素的纳米探针被洗涤完全；
S17、每孔加200μL余辉增强液将Eu3+溶解下来，与β-NTA和TOPO反应生成Eu配合物，与吸光剂和光能缓存剂构成光化学余辉体系；将孔内溶液吸入到微量比色皿中，在荧光光谱仪上用外置680nm激光器照射比色皿，测试余辉强度(激光功率为346.6mW/cm2，照射时间为2s)。
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