JP2718618B2 - 電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法 - Google Patents

電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、金属レニウムを含む電
気化学的ルミネッセンス性（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）化学的モイエティに関する。
本願に記載されるレニウム含有化学的モイエティ及びそ
の錯体は、分析試験で使用されるように提案されてきた
トリス−２，２′−ビピリジン ルテニウム（ＩＩ）及
び関連する錯体よりも幾つかの利点を有する。これらの
利点には：（ｉ）発光量子効率（φｒ）がトリス−２，
２′−ビピリジン ルテニウム（ＩＩ）誘導体で認めら
れているものよりも一般に一層良くなっていること；
（ｉｉ）金属からリガンドへの電荷移動（ＭＬＣＴ）励
起状態の性質を、トリス−２，２′−ビピリジンルテニ
ウム（ＩＩ）誘導体で利用される値よりも一層広い範囲
の値内で選択することができること；及び（ｉｉｉ）ビ
ピリジル及び非ビピリジル誘導体は両方共検査したいア
ナライトを錯体へ接合するのに用いることができるの
で、合成方法が簡単で一層経済的なこと；が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】本願中、幾つかの刊行物が（ ）の中に
入れたアラビア数字により引用されている。これらの引
用の完全な文献名は、請求の範囲の前の本明細書本文の
終わりに記載してある。これらの刊行物の記載は、本発
明が関与する技術の状態を一層完全に記述するために、
本願中に参考のため入れてある。化学的、生化学的及び
生物学的物質を検出し且つ定量する迅速で極めて特殊な
方法に対する要求が依然として大きくなりつつある。医
薬、代謝物質、微生物及び他の診断上の価値がある物質
の少量を測定する方法は特に価値がある。そのような物
質の例には、麻酔薬及び毒物、治療のため投与される薬
剤、ホルモン、病原性細菌及びウイルス、抗体、代謝物
質、酵素及び核酸が含まれる。
【０００３】これらの物質の存在は、多くの生化学的及
び生物学的系を特徴づける高度の特異性を利用した結合
方法によって屡々決定することができる。例えば、屡々
用いられている方法は、抗原・抗体系、核酸交雑法及び
蛋白質・リガンド系に基づいている。これらの方法で
は、診断上の価値がある錯体の存在は、典型的には、一
種類以上の錯化用物質に結合された観察可能な「標識
（ｌａｂｅｌ）」が存在するかしないかによって示され
る。選択された特別な標識法は、屡々検査したい物質を
検出するための特別な系の有用性及び融通性を示してい
る。好ましい標識は、安価で安全であり、種々の化学
的、生化学的及び生物学的物質に、それらの物質の重要
な結合特性を変えることなく、効果的に結合することが
できるのがよい。標識は、極めて特徴的な信号を与え、
自然界では滅多に見出されず、好ましくは決して見出さ
れないものであるのがよい。標識は、何カ月にも達する
時間に亙って水性系で安定で且つ検出できるものである
べきである。標識の検出は、高価な専門的な設備或は人
を必要とすることなく迅速で、敏感な再現性のあるもの
であるべきである。標識の定量化は、分析される混合物
の温度及び組成の如き変数には比較的左右されないのが
よい。均質な系、即ち、錯化された標識物質と錯化され
ていないものとの分離を必要としない系中で用いること
ができる標識が最も有利である。これは、その標識の検
出性が、標識が付けられた物質が特定の複合体中へ組込
まれた時変化するならば可能である。
【０００４】夫々特別な利点及び欠点を持つ種々の標識
が開発されている。例えば、放射性標識は極めて用途の
広いものであり、非常に低い濃度で検出することができ
る。しかし、それらは高価で危険であり、それらの使用
には専門的な設備及び熟練した人が必要である。更に、
放射性標識の感度は、検出事項がその本質的な性質とし
て標識付けされた物質中の放射性原子一個当たり唯一回
しか起きないことのために限界がある。更に、放射性標
識は均質な方法では用いることができない。従って、非
放射性標識には大きな関心がもたれている。これらに
は、分光光度計、スピン共鳴、及びルミネッセンス法に
よって観察できる分子の外、そのような分子を生ずる酵
素によって観察できる分子が含まれる。有用な非放射性
標識物質の中には有機金属化合物がある。生物学的系で
は或る金属は希であるため、その有機金属化合物の金属
成分を特別に分析できる方法を成功裡に用いることがで
きる。例えば、カイス（Ｃａｉｓ）による米国特許第
４，２０５，９５２号明細書（１９８０）には、特異抗
原を定量化するのに用いられる或る有機金属化合物で標
識付けした免疫化学的に活性な物質を使用することが記
載されている。これらの標識と共に、発酵、吸収及び蛍
光分光学、原子吸収及び中性子活性化を含めた、選択さ
れた金属を検出するどんな一般な方法をでも用いること
ができる。それらの方法は屡々感度が欠如している欠点
を持ち、均質系に対しては滅多に用いることができず、
原子吸収の場合にように、試料の破壊をもたらすことが
時々ある。
【０００５】特に関心が持たれているものは、光化学
的、化学的及び電気化学的手段によって発光させること
ができる標識である。「光ルミネッセンス」は、或る物
質が電磁気的輻射線を吸収した時発光を惹き起こさせる
方法である。蛍光及び燐光は光ルミネッセンスの中に入
る。「化学的ルミネッセンス」法は、エネルギーの化学
的転移による発光物質の生成を伴なう。「電気化学的ル
ミネッセンス」は、発光物質の電気化学的生成を伴う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】これらの発光系は益々
重要になって来ている。例えば、マンドレ（Ｍａｎｄｌ
ｅ）による米国特許第４，３７２，７４５号明細書（１
９８３）には、免疫化学的用途で化学的ルミネッセンス
標識を用いることが記載されている。記載された系で
は、標識は、Ｈ2 Ｏ2 及びオキサレートとその標識との
反応による如き化学的手段によって発光状態へ励起され
る。これらの系では、Ｈ2 Ｏ2 がオキサレートを酸化し
て高エネルギー誘導体へ変換させ、それが次に標識を励
起する。この系は、原理的には分析の酸化条件で安定
で、高エネルギーオキサレート誘導体によって励起する
ことができるどのようなルミネッセンス性（ｌｕｍｉｎ
ｅｓｃｅｎｔ）物質を用いても有効であろう。残念なが
ら、この大きな融通性がその技術の主な制約原因になっ
ている。検査したいアナライトを含む典型的な生物学的
流体は、多量の潜在的にルミネッセンス性の物質を含
み、それがルミネッセンスの高い水準のバックグランド
発光を惹き起こすことがある。
【０００７】同じ欠点を有する化学的ルミネッセンスの
免疫化学的用法の別の例は、オーベルハルトその他によ
る米国特許第４，２８０，８１５号明細書（１９８１）
にあり、そこには化学的ルミネッセンス性物質で標識付
けされた免疫反応物質に非常に接近して酸化剤（例え
ば、Ｈ2 Ｏ2 ）がその場で電気化学的に発生することが
記載されている。電気的に発生した酸化剤は化学的ルミ
ネッセンス性物質の方へ拡散し、それを化学的に酸化
し、電気的に発生した酸化剤へ正味一つ以上の電子を移
動させる結果になる。酸化すると化学的ルミネッセンス
性物質はフォトンを放出する。
【０００８】これに対し、本発明は、電気化学的エネル
ギー源からの電子を、繰り返しフォトンを放出すること
ができる化学的ルミネッセンス性物質へ直接移動させる
ことを必要とする。本発明は、電気化学的ルミネッセン
ス性標識に関する。適切な標識は、有機化合物及び有機
金属化合物を含めた電気化学的ルミネッセンス性化合物
からなる。標識付けされた物質の存在を決定する電気化
学的ルミネッセンス法は、多くの理由から他の方法より
も好ましい。それらは、特別な標識の存在の診断に極め
て役に立ち、感度が高く、危険がなく、安価であり、極
めて広い用途に利用することができる。適切な電気化学
的標識になる有機化合物には、例えばルブレン及び９，
１０−ジフェニル アントラセンが含まれる。多くの有
機金属化合物が適切な電気化学的標識になるが、特に有
用なのは、Ｒｕ含有及びＯｓ含有化合物である。
【０００９】Ｒｕ含有及びＯｓ含有有機金属化合物は文
献に論じられている。カイスは、Ｒｕの如き第ＶＩＩＩ
族の貴金属を含めたどのような金属元素又は金属元素の
組合せでも、原子吸収法により検出可能な有機金属標識
の適切な成分になるであろうと言うことを開示している
（カイスの特許の第１１欄第２０行）。しかし、ルテニ
ウムはカイスの好ましい金属ではなくオスミウムは特に
言及されておらず、記載された方法のいずれについても
Ｒｕ又はＯｓを用いた効率については何のデータも与え
られておらず、好ましい検出法、原子吸収では試料の破
壊を伴っている。ウエーバー（Ｗｅｂｅｒ）による米国
特許第４，２９３，３１０号明細書（１９８１）には、
イムノアッセイでのアナライト（分析剤）のための電気
化学的標識としてＲｕ含有又はＯｓ含有錯体を使用する
ことが記載されている。記載された錯体は、結合によっ
てアナライトのアミノ基に結合される。ウエーバーは、
それら標識と他のアナライトのヒドロキシ基とからカル
ボン酸エステルが形成される可能性を示唆している。
【００１０】標識付けされた物質の存在は、ウエーバー
によれば、光手段を持つ電気化学的流動電池及び消光剤
を含む方法及び装置で決定することができる。光電気化
学的に活性な標識は、光励起により、電子を消光分子へ
移動させ、次に酸化された分子は、適当な電位に保たれ
た流動電池の電極からの電子によって還元される。この
電子が光電流として測定される。その系中の遊離の標識
付けされたアナライトの量は、その光電流信号によって
決定される。この方法は発光物質の電気化学的ルミネッ
センス検出法の逆である。後の報告で、ウエーバーその
他は、Ｒｕ含有標識を検出するのにこの方法を用いるこ
とに伴われる問題を論じている。(1) ウエーバーその他
(1) の表２には、トリス（ビピリジル）ルテニウム（Ｉ
Ｉ）の外挿検出限界は最適条件下で１．１×１０-10 モ
ル／Ｌであることが示されている。これらの標識を実際
に用いることは錯体混合物の存在下での測定を伴うであ
ろうと言うことを予想して、ウエーバーその他は、彼ら
の系での電位干渉物に付いて試験した。ウエーバーその
他の表３には、恐らく実際的検出限界を実質的に１．１
×１０-10 モル／Ｌより高く上昇させるであろう干渉物
として、ジメチルアルキルアミン、ＥＤＴＡ、Ｎ−メチ
ルモルホリン、Ｎ，Ｎ′−ジメチルピペラジン、ヒドロ
キシド、オキサレート、アスコルベート、尿酸及び血清
が列挙されている。これらの研究は簡単なＲｕ含有化合
物で行われた。ウエーバー又はウエーバーその他による
報告には、Ｒｕ含有標識で標識付けされた錯体物質を検
出する限界、或は標識付けされた物質と標識との間のチ
オ尿素結合が検査条件で安定であるか否かに付いての研
究は報告されていない。
【００１１】本発明が関与する特別な標識は電気化学的
ルミネッセンス性である。それらは屡々、それら化合物
を電磁波又は典型的なオキサレート−Ｈ2 Ｏ2 系によっ
て生ずるような化学的エネルギー源に露出することによ
り、それらを酸化又は還元することなく、発光状態へ励
起することができる。更に、これらの化合物のルミネッ
センスは、それらの酸化及び還元を伴う電気化学的方法
によって惹き起こすことができる。光ルミネッセンス、
化学的ルミネッセンス及び電気化学的ルミネッセンス手
段を用いてＲｕ（２，２′−ビピリジン）3 2+を検出す
る方法について多くの研究が報告されている。（２，
３）この研究は、明るいオレンジ色の化学的ルミネッセ
ンスは、化学的に発生した又は電気的に生じたＲｕ（ｂ
ｐｙ）3 3+（式中、“ｂｐｙ”はビピリジル リガンド
を表す）と、オキサレートイオン又は他の有機酸の酸化
で中間体として生じた強い還元剤との水性反応に基づい
ていることを示している。ルミネッセンスは、電気的に
発生した、又は化学的に生じたＲｕ（ｂｐｙ）3 1+と、
ペルオキシジサルフェートの還元中に生じた強い酸化剤
との反応により有機溶媒−Ｈ2 Ｏ溶液中で達成すること
も出来る。Ｒｕ（ｂｐｙ）3 2+から電気化学的ルミネッ
センスが生ずる第三の機構には、Ｒｕ（ｂｐｙ）3 1+を
生ずるのに充分な負の電位とＲｕ（ｂｐｙ）3 3+を生ず
るのに充分な正の電位との間の電極電位の振動が含まれ
る。これらの三つの方法は、夫々“酸化的還元（ｏｘｉ
ｄａｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）”、“還元的酸化
（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）”及び
“Ｒｕ（ｂｐｙ）3 3+/+再生方式”と呼ばれている。
【００１２】酸化的還元法は水中で行なうことができ、
酸素又は不純物の存在に比較的不感性で、強く効率的で
安定なルミネッセンスを生ずる。Ｒｕ（ｂｐｙ）3 2+か
らのこのルミネッセンスは、オキサレート又は、ピルベ
ート、ラクテート、マロネート、タートレート及びシト
レートの如き他の有機酸の存在及びＲｕ（ｂｐｙ）3 3+
を酸化的に生ずる手段に依存する。この酸化は、ＰｂＯ
2 又はＣｅ（ＩＶ）塩の如き強い酸化剤によって化学的
に達成することができる。それは、連続的に又は間欠的
に適用される充分に正の電位によって電気化学的に達成
することができる。Ｒｕ（ｂｐｙ）3 2+の電気化学的酸
化に適した電極は、例えば、Ｐｔ、熱分解黒鉛及びガラ
ス状炭素である。オキサレート又は他の有機酸は化学的
ルミネッセンス中消費されるが、反応室中で消費される
物質を過剰存在させることにより何時間も強く一定の化
学的ルミネッセンスを得ることができる。還元的酸化法
は、例えば、アセトニトリルの如き有機共溶媒を含む部
分的に水性の溶液中で行なうことができる。このルミネ
ッセンスはペルオキシジサルフェートの存在及びＲｕ
（ｂｐｙ）3 1+物質を還元的に生ずる手段に依存する。
還元は、例えば、マグネシウム又は他の金属の如き強い
還元剤によって化学的に行なうことができる。それは、
連続的又は間欠的に適用される充分に負の電位によって
電気化学的に行なうことができる。Ｒｕ（ｂｐｙ）3 2+
の電気化学的還元に適した電極は、例えば、研磨したガ
ラス状炭素電極である。酸化的還元法の場合のように、
過剰の反応物を含有させるか、反応混合物へ消費される
反応物を連続的に添加することにより連続的で強いルミ
ネッセンスを何時間も得ることができる。
【００１３】Ｒｕ（ｂｐｙ）3 3+/+再生方式は、アセト
ニトリルの如き有機溶媒中又は部分的に水性の系中で、
Ｒｕ（ｂｐｙ）3 2+を還元するのに充分な負の電位とＲ
ｕ（ｂｐｙ）3 2+を酸化するのに充分な正の電位との間
の電極でをパルス化することにより行なうことができ
る。そのような再生方式に適した電極は、例えばＰｔ電
極である。この方式は化学的反応物を消費せず、原理的
に際限なく進行させることができる。ルミネッセンス性
Ｒｕ含有化合物を生成させるこれら三つの方法では、共
通してＲｕ含有化合物の酸化的還元又は還元的酸化が反
復して行なわれる。従って、これら化合物を含有する溶
液のルミネッセンスは、適用されるエネルギー源の電位
に高度に依存し、従って、Ｒｕ含有化合物の存在の診断
に極めて役立つものである。マンドレはカーチス（Ｃｕ
ｒｔｉｓ）その他(4) を化学的ルミネッセンス用の可能
な標識として引用している。カーチスその他は、Ｒｕ錯
体を、オキサレート／Ｈ2 Ｏ2 系によって化学的に励起
された時、光を発するように誘導することができると言
う未公表の観察だけを報告している（カーチスその他、
ｐ．３５０）。マンドレもカーチスも、化学的ルミネッ
センスの用途或は電気化学的ルミネッセンス方式の利用
で、ルテニウム及びオスミウムの錯体が異常な有用性を
持つことに気が付いていない。
【００１４】シュプリントシュニック（Ｓｐｒｉｎｔｓ
ｃｈｎｉｋ）Ｇ．その他(5) は、オクタデカノール又は
デヒドロコレステロールでエステル化されたトリス
（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）の錯体を
記述し、これら表面活性剤錯体の単分子層膜を創ってい
る。これら錯体は光ルミネッセンス性である。しかし、
それらの膜を水に曝し、次に光に当てると、Ｒｕ錯体は
光ルミネッセンス性を失う。これは光の存在下でのエス
テル基の光加水分解に起因する。親出願の米国特許出願
Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．８５８，３５４及びＰＣＴ８７／
００９８７に記載されているように、検査したい種々の
アナライト及びそれら検査したいアナライトに結合する
化学的物質は、アミド又はアミン結合によってＲｕ含有
又はＯｓ含有標識に都合よく付けることができるであろ
う。次にそれら標識付けされた物質を、種々の手段のい
ずれかによって検出することができるが、今までの所最
も効率的で信頼性のある感度の高い手段は、光ルミネッ
センス、化学的ルミネッセンス及び電気化学的ルミネッ
センスによる手段である。Ｒｕ含有及びＯｓ含有標識を
含む電気化学的ルミネッセンス性標識と特に融通性があ
り、有利である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、次の式を有す
る化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）にある： 〔Ｒｅ（Ｐ）m （Ｌ1 ）n （Ｌ2 ）o （Ｌ3 ）p （Ｌ4 ）q （Ｌ5 ）r （Ｌ6 ）s 〕t （Ｂ）u （Ｉ） 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテート（ｐｏｌｙｄｅｎｔ
ａｔｅ）リガンドであり；Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 、Ｌ4 、Ｌ
5 及びＬ6 はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じ
でも異なっていてもよく；ＢはＲｅのリガンドである
か、又はＰ、Ｌ1、Ｌ2 、Ｌ3 、Ｌ4 、Ｌ5 又はＬ6 の
一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか
又はそれより大きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及
びｓの各々は０又は整数であり；ｔは１に等しいか又は
それより大きい整数であり；ｕは１に等しいか又はそれ
より大きい整数であり；Ｐ、Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 、Ｌ4 、
Ｌ5、Ｌ6 及びＢは、前記化学的モイエティが電磁波を
放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドに
よって与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等
しくなるような組成及び数を有する〕。この化学的モイ
エティの特に好ましい例は、次のものからなる：
【００１６】
【化１】
【００１７】〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも
異なっていてもよく、Ｘ及びＸ′はＮ（ＣＨ
2 Ｈ5 ）2 、ＣＨ3 、ＣＨ3 Ｏ、Ｃ6 Ｈ5 、Ｃｌ、ＣＯ
2 ＣＨ3 、ＣＮ、又はＮＯ2 でよく、Ｙ及びＹ′はＨ又
はＣＨ3 でよく、もしＸとＸ′及びＹとＹ′が同じで、
ＸがＣＯ2 ＣＨ3 であるならば、ＹはＨではなく、更に
もしＸとＸ′及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及び
ＹがＨではなく；そしてＲは陰イオンである〕。金属レ
ニウムを含有する電気化学的ルミネッセンス性化学的モ
イエティの主な利点の第一は、これらのモイエティの製
造が容易なことである。ビピリジル及び非ビピリジル誘
導体の両方を、それらモイエティの合成に用いることが
でき、検査したいアナライトと接合（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）するこれらのモイエティの最終的機能のために用い
ることができる。同様なＲｕ（ＩＩ）錯体に対し、Ｒｅ
（Ｉ）錯体によって与えられる更に重要な利点は、Ｒｅ
へ結合するリガンドの一つ以上の置換基を選択すること
により、可視スペクトル領域（即ち、５００ｎｍ〜８０
０ｎｍ）の殆どに亙ってＲｅ（Ｉ）錯体による発光波長
（即ち色）を調節することができることである。この性
質の原因は、それら錯体の量子力学的性質に存在する。
これらの錯体の量子効率もＲｕ（ＩＩ）のものより優れ
ている。
【００１８】Ｒｅ錯体は、式Ｉを有する化学的モイエテ
ィの存在を検出するための方法で用いられる。その方法
は広義には：（ａ）試薬混合物を、Ｒｅ含有化学的モイ
エティを含む適当な条件下で形成し；（ｂ）前記試薬混
合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電
磁波エネルギーに曝すことにより前記モイエティが電磁
波を発するように誘導し；そして（ｃ）その放出された
電磁波を検出し、それによって前記化学的モイエティの
存在を決定することからなる。本発明のこれらの方法に
は、化学的モイエティが化学物質と結合し、即ち、化学
物質と特別な複合体を形成することができる場合のその
モイエティを検出することが含まれる。式Ｉを有する化
学的モイエティに結合する検査したいアナライトの存在
を決定するための方法も、アナライトと化学的モイエテ
ィが競争的に相補的物質に結合する場合に、検査したい
アナライトの存在を決定する方法と同様に記述される。
【００１９】本発明は、検査したいアナライトの存在又
はその量を、多成分液体試料の予め定められた体積中で
検出する方法にもあり、それは：（ａ）レニウム含有化
合物を含む電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエテ
ィを有する試薬と試料とを接触させ、然も、前記化合物
は（ｉ）前記試薬が繰り返し輻射線を発するように誘導
するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学
的又は電磁気的エネルギーに曝すことによって繰り返し
電磁波を発するように誘導することができ、そして（ｉ
ｉ）検査したいアナライトと前記試薬とを結合するよう
な適当な条件で接触を行なうことにより、前記アナライ
トと結合することができ；（ｂ）得られた試料を、前記
試薬が輻射線を繰り返し発するように誘導するのに有効
な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気
的エネルギーに露出し、然もその露出を、前記試薬が電
磁波を繰り返し発するように誘導するのに適切な条件下
で行い；そして（ｃ）そのようにして放出された電磁波
の量を検出又は定量的に測定し、それによって試料中の
検査したいアナライトの存在を検出し、或は定量するこ
とからなる。
【００２０】本発明は、多成分液体試料の予め定められ
た体積中で、その試料中に存在する検査したいアナライ
トの存在又はその量を検出する方法にもあり、それは：
（ａ）レニウム含有化合物を含む電気化学的ルミネッセ
ンス性化学的モイエティを有する試薬と試料とを接触さ
せ、然も、前記化合物は（ｉ）前記試薬が繰り返し輻射
線を発するように誘導するのに有効な量の、適当な源か
らの化学的、電気化学的又は電磁気的エネルギーに曝す
ことによって繰り返し電磁波を放出するように誘導する
ことができ、そして（ｉｉ）試料中には通常存在しない
相補的物質の結合部位を求めて、検査したいアナライト
と、その相補的物質と共に、競争することができるよう
な化合物であり、然も、前記接触は、検査したいアナラ
イトと前記試薬とを前記相補的物質に競争的に結合する
ような適当な条件で行ない；（ｂ）得られた試料を、前
記試薬が輻射線を繰り返し発するように誘導するのに有
効な量の、適当な源からの電気化学的エネルギーに露出
し、然もその露出を、前記試薬が繰り返し電磁波を発す
るように誘導するのに適切な条件下で行い；そして
（ｃ）そのようにして放出された電磁波の量を検出又は
定量的に測定し、それによって試料中の検査したいアナ
ライトの存在を検出し、或は、定量することからなる。
【００２１】本発明は、液体食物又は食物ホモジェネー
ト中の種々の検査したいアナライトの存在又はその量を
検出し、同定する方法にもある。その方法は：（ａ）液
体食物又は食物ホモジェネート中に、液体又は固体懸濁
物中へ浸漬するのに適した診断薬保持体で、複数の試薬
がそれに固定されている診断薬保持体の一部を浸漬し、
然も、前記試薬の各々は、前記診断薬保持体に明確に区
別できる領域に固定されており、検査したい唯一つのア
ナライトと複合体を形成し、固体された試薬−検査した
いアナライト複合体を形成することができ；（ｂ）前記
液体食物又は食物ホモジェネートから前記診断薬保持体
を取り出し；（ｃ）前記診断薬保持体を適当な濯ぎ溶液
で濯ぎ；（ｄ）前記固定試薬−検査したいアナライト複
合体を含む前記診断薬保持体の一部を検出溶液へ浸漬
し、然も、その溶液は前記固定試薬−検査したいアナラ
イト複合体との複合体を形成することができる少なくと
も一つの検出試薬を含み、固定試薬−検査したいアナラ
イト−検出試薬複合体を形成することができ；（ｅ）診
断薬保持体の前記区別可能な領域上の、固定試薬−検査
したいアナライト−検出試薬複合体の存在を検出し、そ
れによって前記液体食物又は食物ホモジェネート中の複
数の検査したいアナライトの存在又は量を検出し且つ同
定することからなる。
【００２２】新規なＲｅ含有化学的モイエティ 本発明は、次の式を有する化学的モイエティにある： 〔Ｒｅ（Ｐ）m （Ｌ1 ）n （Ｌ2 ）o （Ｌ3 ）p （Ｌ4 ）q （Ｌ5 ）r （Ｌ6 ）s 〕t （Ｂ）u （Ｉ） 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテート リガンドであり；
Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 、Ｌ 4 、Ｌ5 及びＬ6 はＲｅのリガン
ドでその各々は互いに同じでも異なっていてもよく；Ｂ
はＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ1 、Ｌ2 、
Ｌ3 、Ｌ4 、Ｌ5 又はＬ6 の一つ以上に共役している物
質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大きい整数で
あり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数で
あり；ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であ
り；ｕは１に等しいか又はそれより大きい整数であり；
Ｐ、Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 、Ｌ4 、Ｌ5 、Ｌ6 及びＢは、前
記化学的モイエティが電磁波を放出するように誘導する
ことができ、Ｒｅのリガンドによって与えられるＲｅへ
の全結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及び
数を有する〕。
【００２３】この化学的モイエティは、Ｒｅの少なくと
も一つのポリデンテート リガンドをもたなければなら
ない。もしそのモイエティが一つより多くのポリデンテ
ートリガンドを有するならば、それらポリデンテート
リガンドは同じでも異なっていてもよい。ポリデンテー
ト リガンドには芳香族及び脂肪族リガンドが含まれ
る。適当な芳香族ポリデンテート リガンドには、芳香
族複素環リガンドが含まれる。好ましい芳香族複素環リ
ガンドは、例えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリ
ジル、フェナントロイル及びポルフィリンの如く窒素を
含有する。適当なポリデンテート リガンドは、当分野
で知られている多くの置換基のいずれかによって置換さ
れていてもいなくてもよい。適当な置換基には、例え
ば、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリー
ル、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシレート、
カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミ
ノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミ
ノカルボニル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、マ
レイミド、硫黄含有基、燐含有基及びＮ−ヒドロキシス
クシンイミドのカルボキシレートエステルが含まれる。
【００２４】更に、Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 、Ｌ4 、Ｌ5 及び
Ｌ6 の少なくとも一つは、ポリデンテート芳香族複素環
リガンドであってもよい。更に、これらポリデンテート
芳香族複素環リガンドの少なくとも一つは窒素を含んで
いてもよい。適当なポリデンテート リガンドには、ビ
ピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロイ
ル、ポルフィリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、
置換テルピリジル、置換フェナントロイル又は置換ポル
フィリンが含まれるがそれに限定されるものではない。
これらの置換ポリデンテート リガンドは、アルキル、
置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、
置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデ
ヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、
イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、ア
ミジン、グアニジニウム、ウレイド、マレイミド、硫黄
含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドの
カルボキシレートエステルで置換されてもよい。
【００２５】本発明の一つの態様として、化学的モイエ
ティは二つのビデンテート（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）リガ
ンドを含み、その各々はビピリジル、ビピラジル、テル
ピリジル、フェナントロイル、置換ビピリジル、置換ビ
ピラジル、置換テルピリジル、又は置換フェナントロイ
ルである。本発明の別な態様として、化学的モイエティ
は三つのビデンテート リガンドを含み、その各々はビ
ピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロイ
ル、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジ
ル、又は置換フェナントロイルである。本発明の更に別
な態様として、二つのビデンテート ビピリジルリガン
ド、及び一つ置換ビデンテート ビピリジル リガンド
を用いてもよい。本発明の更に別の態様として、化学的
モイエティはポルフィリン又は置換ポルフィリンの如き
テトラデンテート リガンドを含んでいる。この化学的
モイエティは一つ以上のモノデンテート リガンドを持
っていてもよく、その種々のものが当分野で知られてい
る。適当なモノデンテート リガンドには、例えば、一
酸化炭素、シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化
物、及び脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミ
ン、スチルビン及びアルシンが含まれる。適当なリガン
ドには、次の構造を持つ化合物が含まれる：
【００２６】
【化２】
【００２７】（式中、ｎは整数である）。好ましい態様
として、ｎは２である。別の適当なリガンドは次の構造
を持つ化合物である：
【００２８】
【化３】
【００２９】（式中、ｎは整数である）。好ましい態様
として、ｎは３である。別なリガンドは次の構造を持つ
化合物である：
【００３０】
【化４】 （Ｙは結合腕である）。一つの態様として、Ｙは次の構
造を持つ：
【００３１】
【化５】（ＣＨ2 ）m −ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2 ）n
【００３２】（式中、ｍ及びｎは、同じでも異なってい
てもよく、１に等しいか又はそれより大きな整数であ
る）。本発明の一つ態様として、ｍは３であり、ｎは２
である。更に別なリガンドは次の構造を持つ化合物であ
る：
【００３３】
【化６】
【００３４】（式中、ｍ及びｎは整数であり、同じでも
異なっていてもよい）。本発明の一つ態様として、ｍ及
びｎは共に１である。好ましいレニウム含有モイエティ 本発明の好ましいレニウム含有モイエティは、次の式を
持つ：
【００３５】
【化７】
【００３６】〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも
異なっていてもよく、Ｘ及びＸ′はＮ（ＣＨ
2 Ｈ5 ）2 、ＣＨ3 、ＣＨ3 Ｏ、Ｃ6 Ｈ5 、Ｃｌ、ＣＯ
2 ＣＨ3 、ＣＮ、又はＮＯ2 でよく、Ｙ及びＹ′はＨ又
はＣＨ3 でよく、もしＸとＸ′及びＹとＹ′が同じで、
ＸがＣＯ2 ＣＨ3 であるならば、ＹはＨではなく、更に
もしＸとＸ′及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及び
ＹがＨではなく；そしてＲは陰イオンである〕。有利に
用いられる化合物は、Ｘ及びＹが下の表１に示されてい
るような化合物である。製造方法、収率及びλ（ＣＨ3
ＣＮ）も示されている。
【００３７】
【表１】 分光データーは次の表に与えられている。
【００３８】
【表２】 ｄｇ−脱ガス、又は量子収率、ｎ ｓｅｃ．での蛍光寿
命。1 −３５５での励起2 −Ｎ2 ガスレーザー励起３３７3 −これらの化合物は、脱イオン水で８倍に希釈した１
０Ｘ連続緩衝溶液（ｐＨ７．５に、０．１Ｍ ＭｇＣｌ
2 、０．５Ｍ ＮａＣｌで緩衝された０．１Ｍトリス−
ＨＣｌ）中で６５℃で１５分間加熱すると安定になるこ
とが見出された。他の化合物は試験されなかったが、同
様に挙動するものと思われる。───────────
───────────────────────── 本発明の適切な化合物は次の構造を持つ
【００３９】
【化８】
【００４０】（式中、ｎは整数であり、好ましくは２又
は３であり、ｍは１、２又は３であり、好ましくは１で
あり、ＷはＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2 又はＢｒであり、
Ｒは陰イオンである）。ビピルジル基は上で述べた如
く、置換されていてもいなくてもよい。一つの化合物は
次の通りである：
【００４１】
【化９】
【００４２】（式中、Ｒは陰イオンであり、ｎは好まし
くは２又は３である）。別の化合物は次の通りである：
【００４３】
【化１０】
【００４４】（式中、ｎは２又は３である）。更に、別
の化合物は次の通りである：
【００４５】
【化１１】
【００４６】（式中、ｎは２又は３である）。更に、別
の化合物は次の通りである：
【００４７】
【化１２】
【００４８】（式中、ｎは２又は３である）。これらの
化合物は次の構造を有する組成物からなっていてもよ
い：
【００４９】
【化１３】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ
【００５０】（式中、Ｘは、一つ以上の同じか又は異な
るヌクレオチド、一つ以上の同じ又は異なるアミノ酸、
抗体、検査したいアナライト又は検査したいアナライト
のアナローグを表し、ＹはＺに結合する結合基を表し、
ｎは整数を表し、Ｚは本発明によって与えられる化合物
を表す）。Ｘは、例えば、テオフィリン、ジゴキシゲニ
ン、又はｈＣＧから誘導されたペプチドでもよい。本発
明によって次の構造を有する組成物も与えられる。
【００５１】
【化１４】Ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ2 ）n −
ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2 ）m −Ｚ
【００５２】（式中、Ｘは一つ以上の同じか又は異なる
ヌクレオチドを表し、Ｚは電気化学的ルミネッセンス性
化学的モイエティを表し、ｎは１に等しいか又はそれよ
り大きな整数を表し、そしてｍは１に等しいか又はそれ
より大きな整数を表す）。本発明の一つ態様として、Ｚ
はビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−
アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕レニウ
ムである。本発明の更に別の態様として、チミジンヌク
レオチドは、ヌクレオチド配列 ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＯＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣ
ＣＯＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧ に結合した３′末端ヌクレオチドである。次の構造を有
する組成物も与えられる：
【００５３】
【化１５】〔Ｔ−Ｙ−Ｚ〕1+（Ｒ）
【００５４】（式中、Ｔはテオフィリンを表し、ＹはＺ
に結合する結合基を表し、Ｚはビス−（２，２′−ビピ
リジン）〔４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−
イル〕（Ｉ）を表し、Ｒは陰イオンを表す）。本発明の
一つ態様として、ＹはＴの８位置の炭素に結合してい
る。本発明の更に別の態様として、Ｙは次の構造を有す
る：
【００５５】
【化１６】（ＣＨ2 ）m ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n
【００５６】（式中、ｍ及びｎは同じか又は異なる１に
等しいか又はそれより大きな整数を表す）。本発明の別
の態様として、ｍは３であり、ｎは４である。本発明の
別の態様として、ｍ及びｎは両方共３である。本発明の
更に別の態様として、Ｙは次の構造を有する
【００５７】
【化１７】
【００５８】（式中、ｍ、ｎ及びｒは、同じか又は異な
る１に等しいか又はそれより大きな整数を表す）。本発
明の一つの態様として、ｍは１であり、ｎは１であり、
ｒは４である。本発明の更に別の態様として、ＹはＴの
７の位置の窒素に結合している。本発明の一つの態様と
して、Ｙは次の構造を有する： （ＣＨ2 ）n （式中、ｎは１に等しいか又はそれより大きな整数を表
す）。本発明の更に別の態様として、ｎは４である。次
の構造を有する組成物も本発明に含まれる。 Ｘ−Ｚ （式中、Ｘは、システィン又はメチオニンである少なく
とも一種類のアミノ酸を含み、同じか又は異なる一つ以
上のアミノ酸を表し、Ｚは、システィン又はメチオニン
の硫黄置換基へマレイミドの３又は４位置の炭素によっ
て結合したビス（２，２′−ビピリジン）マレイミドヘ
キサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−
ブチルアミドレニウムである。Ｒｅのリガンドの一つ以
上が、例えば、放射性アイソトープ、蛍光成分、又は付
加的ルミネッセンス性ルテニウム含有又はオスミウム含
有中心の如き付加的な化学的標識に結合される場合も本
発明の範囲に入る。標識付けされた物質（Ｂ）が、一つ
より多くの、例えば、二つ、三つ、四つ又はそれ以上の
電気化学的ルミネッセンス中心によって標識付けされる
場合も本発明の範囲に入る。
【００５９】適当な物質（Ｂ）には、多くの生物学的物
質、例えば、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、蛋白質、
脂質蛋白質、糖質蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、リ
ポ多糖類、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビツ
レート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ
酸及び砂糖が含まれる。全細胞は動物、植物又は細菌の
ものでもよく、生きてるものでも死んでいるものでもよ
い。例として菌類及び線虫類の如き植物病原菌が含まれ
る。本明細書中、用語「細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａ
ｒ）粒子」とは、細胞内の細胞器官、破壊した細胞から
の膜粒子、細胞壁断片、リボソーム、多酵素複合体、及
び生きている有機体から導くことができる他の粒子を意
味する。また本明細書中、「核酸」とは染色体ＤＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、及び種々の源から
誘導された組替えＤＮＡを意味する。また核酸には、Ｒ
ＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮ
Ａ及びトランスファーＲＮＡが含まれる。ポリペプチド
には、例えば、酵素、輸送蛋白質、レセプター蛋白質、
及びウィルス外皮蛋白質の如き構造蛋白質が含まれる。
好ましいポリペプチドは酵素及び血清から誘導された抗
体である。特に好ましいポリペプチドはモノクローナル
抗体である。ホルモンには、例えばインシュリン及びＴ
４チロイドホルモンが含まれる。薬理学的薬剤には、例
えば強心薬糖体が含まれる。合成ペプチド、合成核酸、
及び合成の膜、小胞及びリポソームの如き生物学的物質
に化学的に類似した合成物質を含めることも本発明の範
囲に入る。上述したことは、本発明で用いるのに適した
生物学的物質の包括的リストにすることを意図している
のではなく、本発明の広い範囲を単に例示しているだけ
である。
【００６０】重合体材料を含めた標識付けした非生物学
的物質を含むことも本発明の範囲内に入る。これらの物
質は可溶性重合体分子の形でもよく、或は、例えばビー
ズ、或は試験管、瓶、試験容器等のような容器の如き種
々の既知の巨大な形をしたもののいずれかの形をしてい
てもよい。生物学的及び非生物学的物質（Ｂ）はＲｅの
リガンドに共役していてもよい、その共役はアミド又は
アミン結合による。それら結合は、物質（Ｂ）がアミド
結合のカルボニル又は窒素に直接結合するように配向し
ていてもよい。これらの化学的モイエティはイオン化し
ていてもよい。そのような場合には、その化学的モイエ
ティの形成電荷を中和するのに多くの異なった反対イオ
ンを有するものが役立つことは当業者には分かるであろ
う。適当な陽イオンには、例えば、Ｈ+ 、ＮＨ4 + 、グ
アニジニウム、Ａｇ+ 、Ｌｉ+ 、Ｎａ+ 、Ｋ+ 、Ｍ
ｇ2+、Ｍｎ2+及びＣｄ2+が含まれる。適当な陰イオンに
は、例えば、ハロゲン化物、ＯＨ- 、炭酸塩、Ｓ
Ｏ4 2- 、ヘキサフルオロホスフェート及びテトラフルオ
ロボレートが含まれる。Ｒｅ含有モイエティの利点 金属レニウムを含む電気化学的ルミネッセンス性化学的
モイエティの主な利点は、それらモイエティを製造しや
すいことにある。ビピリジル及び非ビピリジル誘導体の
両方共、それらモイエティの合成、及び検査したいアナ
ライトに共役するそれらモイエティの最終的機能で用い
ることができる。レニウムモイエティは、３、４又は５
工程を必要とするオスミウム及びルテニウム錯体とは対
照的に２工程法で合成することができる。第１図は本発
明のレニウム含有モイエティを製造するのに用いられる
二つの方法工程を概略的に示している。第１図に関し、
ルミネッセンス性Ｒｅ（Ｉ）錯体を製造するための出発
材料はＲｅ（ＣＯ）5 Ｃｌである。希望のＲｅ（Ｉ）錯
体の合成には二つの工程が含まれている。第一の工程で
は、キレート性２，２′−ビピリジンリガンドによって
ＣＯを置換して平面異性体（ｆａｃｉａｌ ｉｓｏｍｅ
ｒ）、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌを生成させ
る。Ｌはキレート性２，２′−ビピリジンリガンドで、
例えば、ｂｐｙ、Ｃｌ2 ｂｐｙ、（ＣＯ2 ＣＨ3 ）2 ｂ
ｐｙ、（ＮＯ2 ）2ｂｐｙ、Ｍｅ2 ｂｐｙ、Ｐｈ2 ｂｐ
ｙ、（ＣＨ3 Ｏ）2 ｂｐｙ、Ｍｅ4 ｂｐｙ、或は（ＮＥ
ｔ2 ）2 ｂｐｙである。ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3
の対応するｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）
（ＲＫ（式中、ＲはＣＦ3 ＣＯ3 - 、ＰＦ6 - 、ＣｌＯ
4 - である）への転化は、酸法か又は銀法によって達成
することができる。
【００６１】酸法は、強い酸性媒体に対し不感性、即ち
安定なビピリジルリガンドにとって有用である。それに
は、中間体Ｒｅ（Ｉ）トリフレート物質を製造し、分離
し、次に４−ピリジルエタン誘導体に転化することが含
まれる。銀法は極めて酸性の環境中で分解を受けやすい
ビピリジルリガンドを含む錯体、例えばＬ＝（ＣＨ
3 Ｏ）2 ｂｐｙ又は（ＣＯＯＣＨ3 ）2 ｂｐｙの場合に
用いられる。この方法では、可溶性銀トリフルオロメタ
ンスルホネート塩をｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ−（ＣＯ）3 Ｃ
ｌ物質と反応させ、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ−（ＣＯ）
3（Ｏ3 ＳＣＦ3 ）モイエティ及び不溶性ＡｇＣｌを形
成させる。濾過によりＡｇＣｌ沈澱物を除去した後、溶
液をその場で４−ピリジルエタンと反応させ、希望の生
成物を生成させる。ここに記載するＲｅ（Ｉ）錯体によ
って与えられる、同様なＲｕ（ＩＩ）錯体に勝る他の重
要な利点は、Ｒｅ（Ｉ）錯体の発光波長（即ち色）を可
視スペクトル範囲の殆ど（即ち、５００ｎｍ〜８００ｎ
ｍ）に亘って調節することができるそれらの能力に関す
る。この性質の原因は、それら錯体の発光機構の量子力
学的特性にある。Ｒｕ（ＩＩ）錯体のルミネッセンス機
構の量子力学的分析では、（１）僅かな例外を除いて、
流体溶液中で室温ルミネッセンスが観察されるために
は、Ｒｕ（ＩＩ）へ三つのキレート性ビピリジル又はフ
ェナントロイル型リガンドを配位させることが必要であ
り；（２）発光状態に近いエネルギーで存在する量子状
態は、Ｒｕ（ＩＩ）錯体から得られるルミネッセンス強
度を制限し；（３）キレート性ビピリジル又はフェナン
トロイルリガンドに置換基を入れても、Ｒｕ（ＩＩ）錯
体の発光エネルギーにほんの僅かな変化しか与えず；
（４）Ｒｕ（ＩＩ）錯体では最大発光波長が増大する
と、一般に発光効率が低下する；ことが示されている。
これらの因子は流体溶液中室温で利用可能な波長範囲を
５８０ｎｍ〜７５０ｎｍへ制限している。レニウム錯体
の発光機構についての同様な分析では、（１）室温流体
溶液中での発光には、Ｒｅ（Ｉ）中心に僅か一つの配位
ビピリジル又はフェナントロイルリガンドが存在しさえ
すればよいことが示されている。三つのＣＯリガンドも
必要であるが最終的モノデンテート配位リガンド（例え
ば、Ｃｌ、ピリジン、ＣＨ 3 ＣＮ等）の選択にはかなり
の余裕がある。最大発光波長は、このモノデンテートリ
ガンドの種類及びキレート性ビピリジル又はフェナント
ロイルモイエティの置換模様によって調節される。この
ことが一つには、Ｒｕ（ＩＩ）錯体よりもこれらの錯体
の場合に一層広い範囲の発光波長を利用できる結果を与
えている。
【００６２】Ｒｅ（Ｉ）錯体の場合には、発光を妨げる
ことがある発光状態に近いエネルギーを持つ量子状態は
存在しない。これに対しＲｕ（ＩＩ）錯体の場合には、
最大発光波長が増大するに従って一般に発光効率は低下
する。即ち、Ｒｅ（Ｉ）錯体の利用可能な発光波長範囲
は約５００ｎｍ〜８００ｎｍである。Ｒｕ（ＩＩ）錯体
よりもＲｅ（Ｉ）錯体のほうが赤色応答が僅かに増大し
ているのは、主にＲｕ（ＩＩ）発光スペクトルよりもＲ
ｅ（Ｉ）発光スペクトルのほうが幾らか増大した広さを
もつことに起因する。このように、Ｒｅ（Ｉ）錯体はＲ
ｕ（ＩＩ）化合物に比較して広い範囲の利用可能な発光
波長を有する。Ｒｅ（Ｉ）錯体の独特な構造によって、
Ｒｕ（ＩＩ）錯体で可能になるよりも、一層大きな融通
性が得られ、且つ錯体の構造的変更による希望の最大発
光波長を一層選択し易くなっている。Ｒｕ（ＩＩ）より
もＲｅ（Ｉ）の方が利用できる発光波長の範囲が広くな
っていることにより、幾つかのルミネッセンス性Ｒｅ
（Ｉ）物質の溶液中の一つのＲｅ（Ｉ）錯体による発光
を、競合するＲｅ（Ｉ）ルミネッセンス発光体による干
渉及び誤差を最小にして測定することができる。Ｒｅ含有モイエティを用いた改良された検査方法 本発明は、式Ｉを有する化学的モイエティの存在を決定
する方法にもある。その方法は：（ａ）試薬混合物をＲ
ｅ含有化学的モイエティを含む適当な条件下で形成し；
（ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネ
ルギー又は電磁波エネルギーに曝すことにより前記部分
が電磁波を発するように誘導し；そして（ｃ）その放出
された電磁波を検出し、それによって前記化学的モイエ
ティの存在を決定することからなる。試薬混合物を形成
するのに適切な条件は、当業者に知られており、含まれ
る試薬混合物の種類に依存するであろう。例えば、水性
試薬混合物に適した条件には、化学的モイエティ、酸化
剤の如き他の試薬の適切な濃度、ｐＨ、塩濃度等が含ま
れるであろう。固体試料の場合、試薬混合物を形成する
ために適した条件には、伝導性液体の添加が含まれるで
あろう。本発明の方法には、化学的モイエティが化学物
質と結合することができ、即ち、化学物質と特別な錯体
を形成することができるその部分のような、化学的モイ
エティを検出する方法が含まれる。適当な化学物質に
は、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋
白質、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂
肪酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬
剤、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び砂糖或は非生
物学的重合体が含まれる。本発明の一つの態様として、
化学物質は検査容器の表面に固定されていてもよい。別
の態様として、化学物質は血清から誘導された抗体又は
モノクローナル抗体であってもよい。特に重要なものは
抗体−抗原対物質である。この結合方法は、例えば、血
液、尿又は合成反応混合物の如き複雑な混合物中のジゴ
キシン又はジギトキシンの如き標識付けされた抗原の存
在を、先ずその混合物を、検査したい抗原に対し特異性
の固定された抗体に曝し、次にその固定された抗体に結
合した標識付けされた物質の量を測定することにより決
定するのに用いることができる。
【００６３】本発明には、式Ｉを有する化学的モイエテ
ィに結合する検査したいアナライトの存在を決定するた
めの方法にも含む。その方法は：（ａ）試薬混合物を、
Ｒｅ含有化学的モイエティを含む適当な条件下で形成
し；（ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的
エネルギー又は電磁波エネルギーに曝すことにより前記
モイエティが電磁波を発するように誘導し；そして
（ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって検
査したいアナライトの存在を決定することからなる。ア
ナライト及び、式Ｉを有する化学的モイエティが競争的
に相補的物質に結合する場合に検査したいアナライトの
存在を決定する方法も与えられる。“相補的物質”と
は、検査したいアナライトと検査したい標識付けされた
アナライト又は検査したいアナライトの標識付けされた
アナローグの両方と複合体を形成することができる物質
を意味する。その方法は： （ａ）相補的物質、Ｒｅ含有化学的モイエティを含む化
学的モイエティ、及びアナライトを試薬混合物を形成す
るような適当な条件下で接触させ；（ｂ）試薬混合物を
化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波エ
ネルギーに曝すことにより前記化学的モイエティが電磁
波を発するようにさせ；そして（ｃ）その放出された電
磁波を検出し、それによって検査したいアナライトを決
定することからなる。
【００６４】“電磁波を発生するよう誘導し”と言う言
葉は、外囲温度で２００ナノメーター（ｎｍ）〜９００
ｎｍの波長で発光する化学的モイエティの励起状態を創
りだすことを意味する。リガンドの化学的構造の変化
は、発光励起状態を創りだすのに必要な入力エネルギー
の値を変化させる。同様に、放出される電磁波の波長
は、レニウム含有物質の性質及び環境に依存する。一般
に光ルミネッセンス励起及び発光は、約２００ｎｍ〜約
９００ｎｍの波長の電磁波で起きる。同様に、化学的ル
ミネッセンス及び電気化学的ルミネッセンス発光は、一
般に約２００ｎｍ〜９００ｎｍの波長の放出電磁波で起
きる。化学的モイエティの還元又は酸化が起きる電位
は、その正確な化学的構造の外、溶液のｐＨ及び用いら
れる電極の性質の如き因子に依存する。光ルミネッセン
ス系中の最適発光及び励起波長及び、電気化学的ルミネ
ッセンス及び化学的ルミネッセンス系の最適電位及び発
光波長の決定の仕方は良く知られている。
【００６５】存在するルミネッセンス性物質の量を定量
する多くの方法がある。系へのエネルギー入力率はルミ
ネッセンス物質の尺度を与える。例えば、適当な測定方
法にはルミネッセンス性物質が電気化学的に発生した時
の電流の測定、ルミネッセンス性物質が化学的発生した
時の還元体又は酸化体の使用速度、或は光ルミネッセン
ス法での電磁波エネルギーの吸収が含まれる。更に、ル
ミネッセンス性物質は、放出された電磁波を測定するこ
とによって検出することができる。これらの測定方法
は、全て連続的、レート依存（ｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ）
測定、或は長い時間に亘って信号を追加する累積法とし
て行うことができる。レート依存測定は、光電子増倍
管、光ダイオード、光トランジスターを用いて、入射光
強度に大きさが比例した電流を生ずるように行われる
か、又は電荷結合装置を用いて行うことができる。累積
法の例は、レート依存データーの積分及び累積データー
を直接与える写真フィルムの使用がある。これらのルミ
ネッセンスに基づく方法は、全てレニウム含有化合物に
よって繰り返えされるルミネッセンスを用いている。検
出可能な事項のこの反復性により、これらの標識を、放
射性アイソトープ又はルミノールの如き結合化学的ルミ
ネッセンス性分子から区別することができる。後者の標
識は、標識分子（又は原子）一つ当たり唯一回しか検出
可能な事項を生ぜず、そのためそれらの検出性が制約さ
れている。
【００６６】これらの方法に有用な化学的モイエティ中
に生物学的及び非生物学的物質Ｂを、Ｒｅに直接配位さ
せるか、又はＲｅのリガンドに結合することによりそれ
らの部分中に組み込むことができる。結合は共有結合、
又は静電気的又は水素結合により行われてもよい。物質
ＢをＲｅのリガンドに共有結合させる多くの手段が利用
できる。例えば、結合は、アミド又はアミン結合、エス
テル又はチオエステル、エーテル又はチオエーテル、又
は当分野で知られている多くの結合のいずれかでよい。
結合の種類は、リガンドの置換基、及び標識付けされる
物質のリガンドと結合するのに用いられる適当な化学基
によって決定されるであろう。検査したいアナライトと
化学的モイエティは、特別な仕方で一緒に結合すること
ができるどのような対になった物質でもよい。そのよう
な物質には、例えば、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、
核酸、多糖類、蛋白質、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ
多糖類、脂質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホル
モン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビツレー
ト、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、
砂糖及び非生物学的重合体が含まれる。特に重要なもの
は抗体−抗原対である。本発明の一つの態様として、細
胞表面抗原の存在を決定するため、或は細胞分類法によ
って検出するのに特別の細胞に標識付けするために、標
識付けされた抗体を使用することが含まれる。例えば、
固定された標識のない抗体に取り付けることにより固定
された抗原は、「はさみ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）」法とし
て一般に知られている方法で標識付けされた抗体によっ
て検出することができる。
【００６７】本発明の一つの態様として、Ｂはヌクレオ
チド又はポリヌクレオチドである。他の態様として、Ｂ
は血清から誘導された抗体又はモノクローナル抗体であ
る。競争結合検査方法では、Ｂは検査したいアナライト
又はアナライトのアナローグと同じ物質で、相補的物質
と特異性複合体を形成するのに関与することができるも
のでよい。そのようなアナライト及相補的な物質には、
全細胞、ビールス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白
質、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪
酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬
剤、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖及び非生物
学的重合体が含まれる。そのようなアナライト及び相補
的物質の例には、インシュリン、ジゴキシン、ジギトキ
シン、Ｔ４チロイドホルモン、菌類又は線虫類、血清由
来抗体又はモノクローナル抗体、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ
断片が含まれる。特に重要なものは抗体−抗原に基づく
方法である。これらの方法は当分野でよく知られている
ラジオイムノアッセイに似ており、原理的に放射性標識
付けされた化合物の代わりに、本発明による標識付けさ
れたモイエティを用いることにより有利に用いることが
できる。
【００６８】本発明は、更にここで与える化学的モイエ
ティを用いた不均質又は均質結合方法にある。不均質結
合方法では、結合された標識付けされた物質は、標識の
存在を測定する前に、結合されていない標識付けされた
物質から物理的に分離されなければならない。これは屡
々、一つの成分、例えば、抗体をフィルターの如き不溶
性マトリックス又はビーズ試験管の如き反応容器の表面
に付着させて固定することにより抗体−抗原系で達成す
ることができる。抗原含有溶液をフィルターを通し、又
は反応容器中へ注ぎ、次にフィルター又は反応容器の側
から洗浄除去する。抗体に特異的に結合した抗原だけが
残り、決定される。これに対し均質方法では、結合及び
結合されていない標識付けされた物質が、標識の存在を
測定する時、同じ反応混合物中に存在する。これは、結
合が、標識から検出可能な信号の性質を変化するときに
可能である。均質系でルミネッセンス性標識を用いる多
くの方法が存在する。例えば、化学的モイエティにアナ
ライトを結合することは、標識から検出できる信号に直
接影響を与えることがある。更に、ルミネッセンス消光
物質を抗体に配置し、標識付けされた抗原がその抗体に
結合すると、抗体のルミネッセンス消光物質により標識
のルミネッセンスが抑制されるようにしてもよい。ルミ
ネッセンス性標識のための多くの均質方法が当分野で知
られており、その幾つかはボグスラスキー及びＬｉによ
る「均質免疫検査」Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：
４０１−４１４（１９８２）に再掲されている。
【００６９】本発明の一つの態様として、アナライトは
不溶性マトリックスに固定される。そのような方法は、
はさみ検査として行われてもよい。即ち、化学的モイエ
ティが固定されたアナライトに結合し、結合していない
部分がマトリックスから洗浄除去される。他の態様とし
て、化学的モイエティが結合することのできる化学物質
を不溶性マトリックスに固定し、化学的モイエティを生
物学的流体又は反応混合物の一成分とする。相補的物質
は不溶性マトリックスに固定してもよい。本発明の不均
質又は競争法の両方で、相補的物質はモノクローナル抗
体で、不溶性マトリックスが検査容器の表面でもよい。
本発明の方法は、試薬混合物を化学的、電気化学的、又
は電磁気的エネルギーに曝すことにより行なってもよ
く、或は試薬混合物を化学的、電気化学的、又は電磁気
的エネルギーの組合せに曝してもよい。化学的モイエテ
ィはエネルギー源に曝すことにより酸化されてもよい。
そのような源の一つは酸化剤である。そのような酸化剤
の例には、Ｃｅ（ＩＶ）塩又はＰｂＯ2 が含まれる。化
学的モイエティはエネルギー現に曝すことにより還元さ
れてもよい。一つのそのような源は化学的還元剤であ
る。適当な還元剤の例はマグネシウムである。本発明の
方法には、化学的モイエティが一回より多く電磁波を発
するように誘導することが含まれる。
【００７０】試薬混合物は、オキサレート、ピルベー
ト、ラクテート、マロネート、シトレート、タートレー
ト、ペルオキシジサルフェートを含んでいてもよい。更
に、化学的モイエティは、エネルギー源に曝すことによ
って還元されてもよく、試薬混合物はペルオキシジサル
フェートを含んでいてもよい。化学的モイエティは、エ
ネルギー源に曝すことによって酸化されてもよく、試薬
混合物は、オキサレート、ピルベート、ラクテート、マ
ロネート、シトレート又はタートレート、を含んでいて
もよい。化学的モイエティを検出する種々の方法が与え
られ、その場合試薬混合物は連続的に電極に曝され、そ
の電極の電位は、前記化学的モイエティの還元を行なう
のに充分な電位と、化学的モイエティの酸化を行なうの
に充分な電位との間で振動する。
【００７１】化学的モイエティは、電位が化学的モイエ
ティの酸化を行なうのに充分な電位の上下で振動する電
極に曝されることによって酸化されてもよく、試薬混合
物は、オキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネ
ート、シトレート、タートレート、ペルオキシジサルフ
ェートを含んでいてもよい。更に、化学的モイエティ
は、エネルギー源に曝すことによって酸化されてもよ
く、試薬混合物は、オキサレート、ピルベート、ラクテ
ート、マロネート、シトレート又はタートレート、を含
んでいてもよい。化学的モイエティは、電位がそれを還
元するのに充分な電位の上下で振動する電極に曝される
ことによって還元されてもよく、試薬混合物は、ペルオ
キシジサルフェートを含んでいてもよい。そのような試
薬混合物は更にアセトニトリルを含んでいてもよい。更
に、化学的モイエティは、電位がそれを還元するのに充
分で一定な電極に曝されることによって還元されてもよ
く、試薬混合物は、ペルオキシジサルフェートを含んで
いてもよい。そのような試薬混合物はアセトニトリルを
含んでいてもよい。化学的モイエティが電気化学的又は
化学的エネルギーに曝されると、放出された電磁波が連
続的に検出される。そのような電磁波は目で見て又は光
ダイオードを用いて検出してもよい。更に、化学的モイ
エティが電気化学的又は化学的エネルギーに曝された
時、放出された電磁波を累積的に、例えば、写真フィル
ムを用いて検出してもよい。
【００７２】本発明は、式Ｉを有するレニウム含有化学
的モイエティの存在の検出又はその量を測定するための
装置にも関する。その装置は：（ａ）レニウム含有化学
的モイエティを含む試薬混合物；（ｂ）化学的モイエテ
ィが電磁波を発するようにさせるための手段；及び
（ｃ）放出された電磁波を検出する手段を有する。本発
明は、式Ｉを有するレニウム含有化学的モイエティに結
合する検査したいアナライトの存在の検出又はその量を
測定するための装置にも関する。その装置は：（ａ）レ
ニウム含有化学的モイエティ；（ｂ）化学的モイエティ
を検査したいアナライトと接触させ、試薬混合物を形成
するための手段；（ｃ）化学的モイエティが電磁波を発
するようにさせるための手段；及び（ｄ）放出された電
磁波を検出する手段を有する。特に有用な独特な種類の
均質結合検査方法が本発明によって与えられる。前に述
べた如く、これらの標識は、検査したい標識付けされた
物質の溶液を電極に曝す手段により電気化学的に測定す
ることができる。溶液中に存在するが、電極の表面に達
することができない標識付けされた物質は検出されない
であろう。これは、例えば、標識付けされた物質が電極
の入った反応容器の表面に直接又は間接的に結合されて
いるか、又は標識が、抗原−抗体複合体内部の如く、特
殊な複合体の内部に深く埋め込まれるか、又は電極自身
が、標識付けされた物質が通過することができるが複合
体化した標識付けされた物質は通過することができない
層によって被覆されている場合に起きる。更に、電極の
表面を抗体で被覆し、固定された抗体に結合した標識付
けされた抗原だけが電極に接近することができ、それに
よって検出されるようにすることができる。この特別な
均質方法は、必要な電極電位を短いパルスとして印加す
る場合に最も有効であろう。
【００７３】標識付けされた化合物の存在を決定するた
めの手段の組合せを用いることも本発明の範囲に入る。
例えば、光ルミネッセンス又は化学的ルミネッセンスの
如き、結合された標識付け物質と結合されていない標識
付け物質とを区別しない手段によって標識付けされた物
質の全量を測定し、例えば、電気化学的ルミネッセンス
の如き、結合された標識付け物質と結合されていない標
識付け物質とを区別する手段によって結合された標識付
け物質の量を測定することが望ましいであろう。そのよ
うな方法の組合せは、同じ試料で行なうことができ、そ
れによって個々に用いられた方法で得られるよりも豊富
な情報源を試料について与えることができるであろう。
同じ反応混合物中に存在する二つ以上の異なる標識付け
をされた化合物を決定することも本発明の範囲に入る。
これは、もし標識が異なった波長の電磁波を発生するな
らば、或はもし標識が異なった値又は源のエネルギーに
曝されることによって電磁波を発生するようにさせるこ
とができるならば可能である。
【００７４】検査方法 本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中で、
約１０-3モルより低い濃度でその試料中に存在する検査
したいアナライトを検出する改良された方法にもあり、
それは：（ａ）レニウム含有有機化合物を含む電気化学
的ルミネッセンス性化学的モイエティを有する試薬と試
料とを接触させ、然も、前記試薬は（ｉ）前記試薬が繰
り返し輻射線を放出できるように誘導するのに有効な量
の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気的エ
ネルギーに曝すことによって繰り返し電磁波を放出する
ように誘導することができ、そして（ｉｉ）検査したい
アナライトと一緒にすることができ、然も前記接触は、
アナライトと前記試薬とを結合するような適当な条件で
行なわせ；（ｂ）得られた試料を、前記試薬が繰り返し
輻射線を発することができるように誘導するのに有効な
量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁波エ
ネルギーに露出し、然も、その露出を前記試薬が繰り返
し電磁波を放出できるように誘導するのに適切な条件下
で行い；そして（ｃ）そのようにして放出された電磁波
を検出し、それによって試料中の検査したいアナライト
の存在を検出することからなる。
【００７５】「モル」とは、１リットル当たりの溶液中
のアナライトのモル濃度、又は１リットル当たりの液体
試料中に存在する粒子又は構成単位（ｕｎｉｔ）の数を
意味する。例えば、１リットル当たり１×１０23個の粒
子は１モルとして表してもよい。不均質検査、即ち、非
結合標識付け試薬が結合標識付け試薬から、結合標識付
け試薬が電気化学的エネルギーに曝す前に分離される検
査、及び均質検査、即ち、非結合標識付け試薬と結合標
識付け試薬が電気化学的エネルギーに一緒に曝される検
査として行なうことができる。本発明の均質検査では、
結合標識付け試薬によって放出された電磁波は、非結合
標識付け試薬によって放出された電磁波から、非結合標
識付け試薬と比較して結合標識付け試薬によって放出さ
れた電磁波の量が多いか又は少ないか、又は異なった波
長の電磁波であるかないかによって区別することができ
る。従って、本発明の一つの態様として、検査したいア
ナライトと結合していないいかなる試薬も、試薬と接触
させられていた試料から、その試料を電気化学的エネル
ギーに曝す前に分離される。本発明の別の態様として、
試料と試薬とを接触させる前に、試料を、検査したいア
ナライトを固定するように処理する。
【００７６】検査したいアナライトを固定する種々の方
法が当分野でよく知られており、それには、試料を、ポ
リスチレン、ニトロセルロース又はナイロン表面、又は
全細胞、細胞内粒子、ウィルス、プリオン（ｐｒｉｏ
ｎ）、ビロイド（ｖｉｒｏｉｄ）、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖類、蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、糖質蛋
白質、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬
剤、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖、非生物学
的重合体、合成有機分子、有機金属分子、又は無機分子
で被覆された表面と接触させることが含まれる。検査し
たいアナライトは、これらの物質のいずれでもよく、或
は検査したいアナライトは、試料中に約１０-12 モルよ
り低い濃度で存在する全細胞、細胞内粒子、ウィルス、
プリオン、ビロイド、核酸、蛋白質、脂質蛋白質、リポ
多糖類、糖質蛋白質、ペプチド、ホルモン、薬理学的薬
剤、非生物学的重合体、合成有機分子、有機金属分子、
又は無機分子でもよい。検査したいアナライトは、試料
中に約１０-15 モルより低い濃度で存在する全細胞、細
胞内粒子、ウィルス、プリオン、ビロイド又は核酸でも
よい。
【００７７】試料と接触させる試薬は、全細胞、細胞内
粒子、ウィルス、プリオン、ビロイド、脂質、脂肪酸、
核酸、多糖類、蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、糖質
蛋白質、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的
薬剤、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖、非生物学
的重合体、合成有機分子、有機金属分子、又は無機分
子、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンに接合
したＲｅ−含有電気化学的ルミネッセンス性化学的モイ
エティである。本発明の一つの態様として、試薬は、抗
体、抗原、核酸、ハプテン、リガンド又は酵素、又はビ
オチン、アビジン又はストレプトアビジンに接合した電
気化学的ルミネッセンス性モイエティである。試料は、
固体、エマルジョン、懸濁物、液体又は気体から誘導さ
れたものでよい。更に、試料は、水、食物、血液、血
清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶媒又は空気から誘
導されてもよい。更に、試料は、アセトニトリル、ジメ
チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチル
ピロリドン又はｔ−ブチルアルコールを含んでいてもよ
い。試料は、還元剤又は酸化剤を含んでいてもよい。
【００７８】本発明は、多成分液体試料の予め定められ
た体積中で、約１０-3モルより低い濃度でその試料中に
存在する検査したいアナライトを検出する改良された競
争的方法にもあり、それは：（ａ）レニウム含有有機化
合物を含む電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエテ
ィを有する試薬と試料とを接触させ、然も、前記試薬
は、（ｉ）前記試薬が繰り返し輻射線を放出できるよう
に誘導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電
気化学的又は電磁気的エネルギーに曝すことによって繰
り返し電磁波を放出するように誘導することができ、そ
して（ｉｉ）検査したいアナライトと、試料中に通常は
存在しない相補的物質上の結合部位を求めて、その相補
的物質と共に競争することができ、然も、前記接触は、
検査したいアナライトと前記試薬とが前記相補的物質に
競争的に結合するような適当な条件で行なわせ；（ｂ）
得られた試料を、前記試薬が繰り返し輻射線を発するこ
とができるように誘導するのに有効な量の、適当な源か
らの化学的、電気化学的又は電磁波エネルギーに露出
し、然も、その露出を前記試薬が繰り返し電磁波を放出
できるように誘導するのに適切な条件下で行い；そして
（ｃ）そのようにして放出された電磁波を検出し、それ
によって試料中の検査したいアナライトの存在を検出す
ることからなる。
【００７９】
【実施例】前置き 材料及び方法 リガンド ２，２′−ビピリジン（ＢＰＹ）（アルドリッヒ）を更
に精製することなく用いた。４，４′−ジメチル−２，
２′−ビピリジン（Ｍｅ2 ｂｐｙ）（レイリー・タール
・ケミカルズ）を使用する前に昇華させた（９０〜１０
０℃、１０-3トール）。４，４′−ジフェニル−２，
２′−ビピリジン（Ｐｈ2 ｂｐｙ）（アルドリッヒ）を
使用する前にベンゼン／石油エーテルで１度再結晶させ
た。４−エチルピリジン（Ｅｔｐｙ）（アルドリッヒ）
を更に精製することなく用いた。用いられた他のピリジ
ル及びビピリジルリガンドには次のものが含まれてい
た：４，４′−ビス（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−２，
２′−ビピリジン〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕〔メエカー
Ｇ．及びケースＦ．Ｈ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，８０：２７４５（１９５８）〕；４，４′−
（ジメトキシ）−２，２′−ビピリジン〔（ＣＨ3 −
Ｏ）2 ｂｐｙ〕〔ウェンケルト Ｄ．ウッドワード
Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４８：２８３（１
９８３）〕；４，４′−，５，５′−テトラメチル−
２，２′−ビピリジン（Ｍｅ4 ｂｐｙ）〔エリオット
Ｍ．Ｃ．、フライターク Ｒ．Ａ．、ブラネイＤ．
Ｄ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７：４
６４７（１９８５）〕；４，４′−ジクロロ−２，２′
−ビピリジン（Ｃｌ2 ｂｐｙ）〔ウエンケルトＤ．、ウ
ッドワード Ｒ．Ｂ．（１９８３）、前掲〕；４，４′
−ビス（カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン
〔（ＣＯ2 ＣＨ3）2 ｂｐｙ〕〔メエカーＧ．及びケー
スＦ．Ｈ．，（１９５８）、前掲〕；４，４′−ジニト
ロ−２，２′−ビピリジン〔（ＮＯ2 ）− 2ｂｐｙ〕
〔メエカーＧ．及びケースＦ．Ｈ．，（１９５８）、前
掲〕；
【００８０】溶媒 塩化メチレン（ＣＨ2 Ｃｌ2 ）、石油エーテル、ジエチ
ルエーテル（無水）、及びメタノールは、全てカーチン
・マチソン・サイエンティフィック（ニューヨーク フ
ローレンス）からのケンピュア（Ｃｈｅｍｐｕｒｅ）級
で、受け取ったまま用いた。ＥＭサイエンティフィック
（ニュージャージー チェリーヒル）からのアセトン
（Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬級）及びアセトニトリル（オムニ−
ソルブ）は更に精製することなく用いた。ベンゼンはフ
ィッシャー・サイエンティフィック（ニュージャージー
スプリングフィールド）からのＡ．Ｃ．Ｓ．試薬級で
あり、受け取ったまま用いた。Ｊ．Ｔ．ベーカー・ケミ
カルズ（ニュージャージーフィリップスバーグ）からの
トルエン（ベンカー・アナライズド試薬、ＨＰＬＣ級）
は更に精製することなく用いた。Ｊ．Ｔ．ベーカー・ケ
ミカルズからのテトラヒドロフランは、使用直前にアル
ゴン雰囲気中でナトリウム／ベンゾフェノンから蒸留し
て乾燥した。無水エタノール（２００プルーフ）はワー
ナー・グラハム社（メリーランド カッケイスビル）か
ら得られた。２−メトキシエタノール（アルドリッヒＨ
ＰＬＣ級）は受け取ったまま用いた。ピリジン（アルド
リッヒ・ゴールドラベル）は無水型で得られ、用いるま
でシュア・シール（Ｓｕｒｅ−Ｓｅａｌ）（商標名）
（アルドリッヒ）瓶中に保存した。ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）はＡ．Ｃ．Ｓ．試薬級（ＤＭＦ）で、受け
取ったまま用いた。水はミリポア・ミリ・Ｑ（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）装置を用いて脱イオン化
した。
【００８１】クロマトグラフ 中性吸収アルミナ（フィッシャー）は受け取ったまま用
いた。クロマトグラフ用オタワサンド及びガラスウール
はアルドリッヒから得られた。セファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０はファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）から購入され、使用直前に１２時間攪拌メタノ
ール中に懸濁することにより活性化して使用した。ＳＰ
−セファデックスＣ−２５（ミズーリ セントルイス、
シグマ）は、使用直前に２時間沸騰水中で攪拌すること
により活性化した。他の試薬 ナトリウム金属、ベンゾフェノン（ゴールドラベル）、
トリフルオロメタンスルホン酸〔ＨＯ3 ＳＣＦ3 、即
ち、トリフリ酸（ｔｒｉｆｌｉｃ ａｃｉｄ）〕及びト
リフルオロメタンスルホン酸銀（ＡｇＣＦ3 ＳＯ3 、即
ち、トリフリ酸銀）は全てアルドリッヒから受け取った
まま用いた。トリフルオロメタンスルホン酸無水物
〔（ＣＦ3 ＳＯ2 ）2 Ｏ〕（マサチューセッツ ダンバ
ーズ、アルファー・ベントロン）は得られたまま用い
た。アンモニウムヘキサフルオロホスフェート（ＮＨ4
ＰＦ6 ）（アルドリッヒ）は更に精製することなく用い
た。ＮａＣｌ及びＮａＣｌＯ4 は共にフィッシャー・サ
イエンティフィックからのＡ．Ｃ．Ｓ．試薬級で、受け
取ったまま用いた。ペンカルボニルレニウム（Ｉ）クロ
ライド、（ＣＯ）5 ＲｅＣｌ、はプレッシャー・ケミカ
ル社（ペンシルバニア ピッツバーグ）から購入され
た。無水硫酸ナトリウム及び指示ドリエライト（商標
名）（ＣａＳＯ4 、無水物）はアルドリッヒから得られ
た。ロバーツ・オキシゲン社（メリーランド ロックビ
ル）からのアルゴンガスは、使用前に指示ドリエライト
のカラム（内径３ｉｎ×高１２ｉｎ）に通過させること
により乾燥した。
【００８２】アルドリッヒからの１，３−ジメチル−
４，５−ジアミノウラシル（ＤＡＤＭＵ）は使用前にア
ルゴン中メタノール／石油エーテルにより再結晶した。
無水ＬｉＣｌＯ4 及び塩化イソニコチノイル塩酸塩は、
アルドリッヒから受け取ったまま用いた。フィッシャー
からのＡ．Ｃ．Ｓ．試薬級ＮａＯＨは更に精製すること
なく用いた。カーチン・マチソン・サイエンティフィッ
クからのイソプロパノール（ケンピュア ブランド）は
受け取ったまま用いた。モデルＲｅ（Ｉ）錯体の合成 ルミネッセンス性Ｒｅ（Ｉ）錯体のための一般的合成方
法は第１図に例示されている。ルミネッセンス性Ｒｅ
（Ｉ）錯体を製造するための出発材料はＲｅ（ＣＯ）5
Ｃｌであった。乾燥Ｒｅ（Ｉ）錯体の合成には二つの工
程が含まれている。第一の工程では、キレート性２，
２′−ビピリジン リガンドによってＣＯを置換して平
面異性体、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌを生成さ
せる。Ｌはキレート性２，２′−ビピリジン リガンド
で、例えば、ｂｐｙ、Ｃｌ2 ｂｐｙ、（ＣＯ2 ＣＨ3 ）
2 ｂｐｙ、（ＮＯ2 ）2 ｂｐｙ、Ｍｅ2 ｂｐｙ、Ｐｈ2
ｂｐｙ、（ＣＨ3 Ｏ）2 ｂｐｙ、Ｍｅ4 ｂｐｙ、或は
（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙである。一般的合成法を下に記述
する。
【００８３】還流凝縮器及び撹拌棒を具えた２５０ｍｌ
に３６１．７ｍｇ（１ｍＭ）の（ＣＯ）5 ＲｅＣｌ、
１．０２ｍＭの希望のビピリジル リガンド、例えば、
１８７ｍｇのＭｅ2 ｂｐｙ及び８０〜１００ｍｌのトリ
エンを添加した。溶液にアルゴンを気泡として通し、１
５分間脱ガスし、撹拌しながら９０分間アルゴン雰囲気
中で還流した。この期間中、生成物は通常溶液から沈澱
した。フラスコを室温へ冷却した後、沈澱した生成物を
吸引濾過により収集し、１５ｍｌずつの冷却トルエンで
二度洗浄し、次に１５ｍｌずつのジエチルエーテルで三
回洗浄し、３０分間空気吸引乾燥した。乾燥は、一晩Ｃ
ａＳＯ4 の入った真空乾燥器で完了した。もし冷却中に
生成物の沈澱が起きなかった場合には、撹拌したトルエ
ン溶液にジエチルエーテルを滴下することにより沈澱を
おこさせた。この反応から得られた生成物は分析的に純
粋であった。生成物ｆａｃ−（１）Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌ
の収率は最初の（ＣＯ）5 ＲｅＣｌに基づき９０％より
大きかった。ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 を対応する
ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｂｐｙ）（Ｒ）
（式中、ＲはＣＦ3 ＣＯ3 - 、ＰＦ6 - 、ＣｌＯ4 - ）
への転化は次の二つ方法のいずれかによって達成され
た。
【００８４】方法Ｉ--酸方法 この方法は、強い酸性媒体に対し不感性、即ち安定なビ
ピリジル リガンドに有効である。それは、中間体のト
リフリ酸Ｒｅ（Ｉ）錯体の生成及び分離と、それに続く
４−ピリジルエタン誘導体への転化を含んでいる。次の
例はその手順を例するものである。ｆａｃ−〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ3 ＳＣＦ
3 ）の製造 撹拌棒を具えた２５０ｍｌの丸底フラスコに、４５６ｍ
ｇ（０．７５ｍＭ）のｆａｃ−〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐ
ｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌ及び３０ｍｌの塩化メチレンを
添加した。その撹拌した懸濁物へ１．３４ｍｌ（必要量
の２０倍）のトリフルオロメタンスルホン酸ＨＯ3 ＳＣ
Ｆ3 及び３〜５滴のトリフルオロメタンスルホン酸無水
物（ＣＦ3 ＳＯ2 ）2 Ｏを添加した。固体は直ちに溶解
し、暗黄色の溶液を与えた。フラスコに蓋をし、溶液を
室温で３時間撹拌し、その後で生成物を、撹拌した溶液
へ無水ジエチルエーテルを２００ｍｌ添加することによ
って分離した。吸引濾過により黄色の生成物ｆａｃ−
〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ
3 ）が分離された。沈澱した生成物を３０ｍｌずつの無
水ジエチエーテルで６回洗浄し、微量のトリフルオロメ
タンスルホン酸を除去し、空気吸引により３０分間乾燥
した。ＣａＳＯ4 を入れた真空乾燥器中に一晩入れてお
くことにより乾燥を完了した。５００ｍｇの〔（ＮＥｔ
2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3 ）
〔〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌに基づ
き９３％〕を生じた。生成物は次の反応で用いるのに充
分純粋であった。今記述したＲｅ（Ｉ）トリフレート物
質は、図３に示すように、対応するＥｔｐｙ錯体へ変換
することができる。次にその手順を例示する。
【００８５】ｆａｃ−〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ
（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）（ＣＦ3 ＳＯ 3 ）の製造 撹拌棒及び還流凝縮器を具えた２５０ｍｌの丸底フラス
コに、１５０ｍｇ（０．２ｍＭ）のｆａｃ−〔（ＮＥｔ
2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3）及び５
０ｍｌのエタノールを添加した。その混合物へ０．２４
ｍｌ（必要量の１０倍）の４−ピリジルエタンを添加し
た。溶液にアルゴンを気泡として通すことにより１５分
間脱ガスし、撹拌しながらアルゴン雰囲気中で２時間還
流した。溶液を室温に冷却した後、回転蒸発器〔ブチ
（Ｂｕｃｈｉ）モデルＲＥ−１２１〕を用いて蒸発によ
りエタノールを除去した。粗製生成物ｆａｃ−〔（ＮＥ
ｔ2）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）（ＣＦ3
ＳＯ3 ）からなる残留試料を過剰の４−ピリジルエタン
中に溶解した。試料を再少量（５〜１５ｍｌ）の１：２
（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ／トルエン中に溶解し、３０ｃｍ
×３ｃｍ内径カラムを用いた中性アルミナ（吸着アルミ
ナ、フィッシャー・サイエンティフィック）によりクロ
マトグラフにかけた。１：２（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ／ト
ルエンによる溶離で過剰の４−ピリジルエタンリガンド
を除去した。黄色の生成物帯、ｆａｃ−〔（ＮＥｔ2 ）
2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）（ＣＦ3 Ｓ
Ｏ3 ）を１：１（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ／トルエンで溶離
した。幾らかあとを引くのが観察されたが、少量の未同
定の紫色物質からの完全な分離が行われた。生成物を含
む溶媒部分を、回転蒸発器で乾燥するまで蒸発した。残
渣を５ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、再び回転蒸発器
を用い溶媒を蒸発した。淡黄色の薄片状のｆａｃ−
〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）
（ＣＦ3 ＳＯ3 ）が出発〔（ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ
（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3 ）に基づき５０％の収率で得
られた。生成物は分析的に純粋であった。 Ｃ29Ｇ35Ｎ5 Ｏ6 ＳＦ3 Ｒｅ Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ 理論 ４２．２４ ４．２４ ８．５０ １１．６４ 分析値 ４２．９４ ４．５１ ８．２４ １１．９９
【００８６】方法II--銀方法 極めて酸性の環境中で分解を受けやすいビピリジル リ
ガンド、例えば、Ｌ＝（ＣＨ3 Ｏ）2 ｂｐｙ又は（ＣＯ
ＯＣＨ3 ）2 ｂｐｙを含む錯体のために銀法を用いた。
この方法では、可溶性銀トリフルオロメタンスルホン酸
塩をｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌ物質と反応さ
せ、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3ＳＣＦ3 ）モ
イエティ及び不溶性ＡｇＣｌを形成した。濾過によりＡ
ｇＣｌ沈澱物を除去した後、溶液をその場で４−ピリジ
ルエタンと反応させ、希望の生成物を得た。この手順で
は中間生成物ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣ
Ｆ3）塩を分離する試みは行なわれなかった。次にその
方法を例示する：ｆａｃ−〔Ｃｌ2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）
（ＯＦ3 ＳＯ3 ）の製造 銀トリフルオロメタンスルホネート、ＡｇＣＦ3 ＳＯ3
は感光性なので、全ての操作は赤色安全光の元で暗室で
行なった。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）をＮａ／ベン
ゾフェノンでアルゴン雰囲気中で９０分間還流すること
により乾燥した。溶媒を使用直前に蒸留により収集し
た。撹拌棒及び還流凝縮器を具えた乾燥２５０ｍｌの丸
底フラスコに、５００ｍｇ（０．９４ｍＭ）のｆａｃ−
（Ｃｌ2 ）2 ｂｐｙＲｅ（ＣＯ）3 Ｃｌ、２４２ｍｇ
（０．９４ｍＭ）のＡｇＣＦ3 ＳＯ3 及び１００ｍｌの
乾燥ＴＨＦを添加した。フラスコの内容物にアルゴンを
気泡として通すことにより１５分間脱ガスし、そしてア
ルゴン雰囲気中で撹拌しながら３時間還流し、その時
に、フラスコ内容物をガラスフリットロート（微細気
孔）を用いて吸引濾過し、ＡｇＣｌ沈澱物を除去した。
ＡｇＣｌ沈澱物を１５ｍｌずつのメタノールで３回洗浄
した。ＣＨ3ＯＨ洗浄は濾液と組合せて行い、撹拌棒を
具えた清浄な２５０ｍｌの丸底フラスコに添加した。
０．７５ｇ（６．５９ｍＭ）の４−ピリジルエタンを添
加し、溶液にアルゴンを気泡として通すことにより１５
分間脱ガスし、アルゴン雰囲気中で２時間還流した。
【００８７】橙褐色の溶液を室温に冷却した後、回転蒸
発器を用いて除去した。生成物スラリーを次の二つの方
法のいずれかで精製した。手順１ ｆａｃ−〔ＮＥｔ2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔ
ｐｙ）（ＯＦ3 ＳＯ3）を精製するための方法Ｉに記載
したように１：２（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ／トルエンを用
いたアルミナカラム（高さ１５ｉｎ×内径２ｉｎ）を調
製した。試料を１０〜１５ｍｌの１：２（ｖ／ｖ）ＣＨ
3 ＣＮ／トルエン中に溶解し、カラムに入れた。１：２
（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ／トルエンによる溶離で、（Ｃｌ
2 ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 Ｃｌとして同定された小さい
黄色の帯を除去した。１：１（ｖ／ｖ）ＣＨ3 ＣＮ／ト
ルエンによる溶離で、狭い橙褐色帯を除去した。この重
複は反応の収率をｆａｃ−（Ｃｌ2 ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ
Ｏ）3 Ｃｌに基づき１７％に限定した。黄色の生成物の
帯があとを引いたが、それは、カラム上の幾つかの連続
した黄色、紫色及び褐色の帯から明確に分離された。こ
れらの副生成物を分離或いは同定する試みは行われなか
った。ｆａｃ−（Ｃｌ2 ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ） 3 （Ｅｔ
ｐｙ）（ＣＦ3 ＳＯ3 ）生成物の分離は、方法Ｉでｆａ
ｃ−〔（ＮＥｔ 2 ）2 ｂｐｙ〕Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐ
ｙ）（ＣＦ3 ＳＯ3 ）について記述したのと同じであっ
た。
【００８８】手順２ 精製手順としてイオン交換クロマトグラフを用いること
によって錯体の収率が改善された。ＳＰ−セファデック
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−２５イオン交換樹脂のカラ
ム（内径２ｃｍ×長さ３０ｃｍ）を水中で調製した。生
成物調製で得られたスラリーを約１０ｍｌ Ｈ2 Ｏと混
合し、アセトンを均質な溶液が観察されるまで滴下し
た。ＳＰ−セファデックスＣ−２５樹脂を、生成物が樹
脂に吸収されるまで粗製生成物スラリー溶液へ添加し
た。アセトンを回転蒸発器を用いて除去した。吸収され
た反応生成物を含む樹脂をカラムへ導入した。Ｈ2 Ｏで
溶離し、４−ピリジルエタンを除去し、０．２５Ｍ Ｎ
ａＣｌ水溶液を用いてＣｌ- 塩として非荷電ｆａｃ−
（Ｃｌ2 ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）+ 陽イオ
ンを溶離した。反応の副生成物がカラム上に残った。そ
の生成物を、その生成物を含有する０．２５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液へＮＨ4 ＰＦ6 飽和水溶液を滴下することにより
ＰＦ6 - 塩として分離した。ｆａｃ−（Ｃｌ2 ｂｐｙ）
Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｅｔｐｙ）（ＰＦ6 ）沈澱物をガラス
フリットフィルター（中程度気孔）で吸引濾過により収
集した。生成物を、一滴のＮＨ4 ＰＦ6 飽和溶液を含む
１０ｍｌのＨ 2 Ｏ中に懸濁した。アセトンを固体が完全
に溶解するまで添加した。回転蒸発器でアセトンを室温
でゆっくり蒸発させることにより、錯体を純粋な形で沈
澱させた。錯体をガラスフリットフィルター（中程度気
孔）で吸引濾過により収集し、氷で冷却した１０ｍｌの
Ｈ2 Ｏで洗浄した。次に錯体を１５ｍｌずつのジエチル
エーテルで２回洗浄し、空気吸引で３０分間乾燥した。
ＣａＳＯ4 を入れた真空乾燥器に一晩入れることにより
乾燥を完了した。（Ｃｌ2 ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ） 3 Ｃｌ
に基づき２４％の収率が得られた。少量の明るい黄色の
結晶であるｆａｃ−（Ｃｌ2 ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）
3 （Ｅｔｐｙ）（ＰＦ6 ）は分析的に純粋であった。
【００８９】一般に、ＮＥｔ2 、ＣＨ3 Ｏ、ＣＨ3 、等
の如き電子放出置換基を有する錯体はきれいに反応し、
手順１を用いて容易に精製された。２，２′−ビピリジ
ンリガンドのＣｌ又はＮＯ2 の如き電子吸引基を含む錯
体は、手順２を用いて最もよく精製される。そのような
錯体中の２，２′−ビピリジン リガンドの電子吸引性
は、見掛けのＲｅ（Ｉ）中心から電子雲を引きつける。
その結果起きるＲｅ中心での部分的正電荷の増大は、Ｒ
ｅ（Ｉ）とＣｌ- との間の静電気的引力を増大する結果
になる。得られたＲｅ−Ｃｌ結合の強化は、銀陽イオン
Ａｇ+ 又はＨＯ3 ＳＣＦ3 存在で遊離性基としてのＣｌ
- の効果を減少する。結局、副生成物を発生させるＲｅ
（Ｉ）−Ｃｌ錯体内の他の点に対するそれら物質の攻撃
は、単純なＣｌ- 置換と競争的になる。明らかに得られ
る荷電生成物はイオン交換樹脂を用いて最もよく分離さ
れる。今日まで合成されたｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（ＣＯ）
3 （Ｅｔｐｙ）（ＣＦ3 ＳＯ 3 ）錯体及び精製後の収率
及び製造方法（酸--方法Ｉ；銀--方法II）の要約が表４
に示されている。ＣＨ3 ＣＮ中の錯体の最大放射も列挙
されている。放射スペクトルはパーキン・エルマーＬＳ
−５型蛍光分光計を用いて得られた。放射スペクトルは
波長による検出器感度の変動に対し補正しておらず、こ
れらの化合物を用いて得られる放射波長範囲を定性的に
示すために与えられているだけである。二種類の蛍光性
Ｒｅ（Ｉ）−テオフィリン物質も、センサー・アナライ
ト接合体モデルとして製造されている。その製造を下に
記述する。
【００９０】実施例１ テオフィリン−８−ブチル酸、３−プロピルピリジルア
ミド（Ｔ８ＢＡ３ＰＰＡ）：化合物Ｉの製造 ０．１６３ｇ（１．２ｍＭ）の３−（４−ピリジル）−
プロピルアミンを、無水ピリジン１０ｍｌ中に０．７７
６ｇ（１ｍＭ）のジシクロヘキシルカルボジイミドを入
れたものと一緒にした。得られた溶液を一晩撹拌した。
沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾過して除去し、濾液
を真空中で濃縮した。残留固形物を５０％イソプロパー
ノール水溶液中で沸騰させることにより溶解した。冷却
で少量の固体が沈積し、それを濾過して除去した。濾液
を濃縮すると、油が生じ、それは放置するとゆっくり固
化した。その固体を１０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに溶解
し、再び濾過して少量の不溶性物質を除去した。次にｐ
Ｈを炭酸ナトリウム水溶液で７に調節した。溶液を氷上
で冷却し、結晶白色生成物を得た（収率３９％、０．１
４９ｇ）。生成物は元素分析及びプロトンＮＭＲにより
特徴を調べ次の構造が明らかにされた。
【００９１】
【化１８】
【００９２】実施例２ ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｔ８ＢＡ３ＰＰ
Ａ）（ＣｌＯ4 ）：化合物IIの製造 ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3 ）を
酸方法（方法Ｉ）を用いて上述の如く製造した。撹拌棒
及び凝縮器を具えた１００ｍｌの丸底フラスコに、１５
５ｍｇ（０．２７ｍＭ）のｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ
Ｏ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3 ）、１２９ｍｇ（０．３７ｍＭ）
の化合物Ｉ、２０ｍｌのＨ2 Ｏ及び２０ｍｌのエタノー
ルを添加した。溶液にアルゴンを気泡として通すことに
より１５分間脱ガスし、アルゴン雰囲気中で３時間還流
した。室温に冷却した後、回転蒸発器を用いて溶媒を蒸
発させた。乾燥固体を１０〜１５ｍｌのメタノールに溶
解し、０．２ｇの無水ＬｉＣｌＯ4 を添加した。そのＬ
ｉＣｌＯ4 が溶解した時、溶液をセファディックスＬＨ
−２０カラム（高さ７５ｃｍ×内径２ｃｍ）へ移し、ク
ロマトグラフ精製にかけた。カラムをメタノールで平衡
させた。試料を０．１〜０．２ｍｌ／分の流量で流し
た。三つの帯が分離された。最初の帯はＣＨ3 ＯＨ中で
５６７ｎｍで蛍光を発し、希望の生成物（化合物II）で
あった。それは残りの帯からきれいに分離した。これら
の帯に表わされる微少量の生成物の同定を試みなかっ
た。回転蒸発器でＣＨ3 ＯＨを蒸発させることにより、
生成物を分離した。錯体を５ｍｌのＣＨ3 ＯＨ中に溶解
し、１５０ｍｌの撹拌している無水ジエチルエーテル中
へ滴下した。錯体は明るい黄緑色の粉末として沈澱し
た。それをガラスフリットフィルター（中程度気孔）で
吸引濾過により収集し、１５ｍｌずつの無水ジエチルエ
ーテルで２回洗浄した。空気吸引による乾燥は行なわな
かった。ＣａＳＯ4 を入れた真空乾燥器に一晩入れるこ
とにより乾燥を完了した。ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ
Ｏ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3 ）に基づき４８％の収率で化合物
IIが得られた。錯体は分析的に純粋であった。 Ｃ32Ｈ32Ｎ8 Ｏ10ＣｌＲｅ〔９１０．０５ｇｔ／ｍＭ〕 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｃｌ 理論値 ４２．２３ ３．５２ １２．３２ １７．５８ ３．９０ 分析値 ４１．７２ ４．００ １２．５８ １７．９８ ３．７４ 生成物は次の構造をもっていた。
【００９３】
【化１９】
【００９４】実施例３ １，３−ジメチル−４−アミノ−５−（イソニコチニル
アミド）−ウラシル：化合物III の製造 化合物III を、塩化イソニコチニル塩酸塩（ＩＮＣ）
と、１，３−ジメチル−４，５−アミノウラシル（ＤＡ
ＤＭＵ）との乾燥ピリジン中での反応により、下に記載
する如く製造した。ＤＡＤＭＵは、アルゴン雰囲気中メ
タノールにより再結晶して精製し、ＣａＳＯ4 を入れた
真空乾燥器中で一晩乾燥した。青白い黄色の化合物をア
ルゴン中に保存した。撹拌棒を具えた１００ｍｌの丸底
フラスコをアルゴンで脱気し、氷浴中で冷却した。注射
器を用い３５ｍｌの乾燥ピリジンを添加し、系をアルゴ
ンで脱気した。１５分後１．０４ｇ（５．８４ｍＭ）の
塩化イソニコチノイル塩酸塩を１５分間隔で三つの部分
に分けて添加した。溶解により褐色の溶液が得られた。
この溶液に０．９８ｇ（５．７６ｍＭ）のＤＡＤＭＵを
アルゴン雰囲気中撹拌しながら添加した。還流凝縮器を
フラスコに取り付け、フラスコを水浴へ移した。フラス
コの内容物を、アルゴン中で２．５時間撹拌しながら８
０℃で還流した。褐色混合物をアルゴン中で一晩室温へ
ゆっり冷却した。黄褐色の沈澱物をガラスフリットフィ
ルター（中程度気孔）で吸引濾過により収集した。沈澱
物を１５ｍｌずつの冷却トルエンで４回洗浄し、ピリジ
ン及び溶解性褐色の不純物を除去した。沈澱した生成物
を３０ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、Ｃａ
ＳＯ4 を入れた真空乾燥器に一晩入れて乾燥した。次に
生成物ＣＨ3 ＯＨ／ジエチルエーテルによりアルゴン雰
囲気中で再結晶し、黄色の生成物III を０．５２ｇ（最
初のＩＮＣに基づき３８％）を得た。生成物は次の構造
をもっていた。
【００９５】
【化２０】
【００９６】実施例４８−（４−ピリジル）−テオフィリン：化合物IVの製造 化合物III は、次の方法により、対応するテオフィリン
物質（化合物IV）へ容易に環化された。撹拌棒を具えた
３００ｍｌのエーレンメイヤーフラスコに、６．７５ｇ
（２４ｍＭ）の化合物III 及び化合物III を溶解するの
に充分な２．５ＭのＮａＯＨ水溶液（約１００ｍｌ）を
添加した。黄橙色の溶液を沸騰が始まるまで穏やかに撹
拌しながら加熱した。穏やかな沸騰を３０分間持続し、
その間に沈澱物が分離し始めた。溶液を室温へ冷却しｐ
Ｈを６ＭのＨＣｌ（水溶液）を用いて５〜６へ注意深く
調節した。中和の間に最初の沈澱物が溶解してオレンジ
色の溶液になった。中和が完結に近付くに従って再沈澱
が起きた。溶液を氷浴上で１時間冷却し、青白い黄色の
固体をガラスフリットフィルター（中程度気孔）で吸引
濾過により収集した。沈澱物を２０ｍｌずつのジエチル
エーテルで３回洗浄した。粗生成物をＣａＳＯ4 を入れ
た真空乾燥器中で乾燥した。生成物をジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）により再結晶して精製した。結晶を上述
の如く、吸引濾過により収集し、２０ｍｌずつの氷冷却
イソプロパノールで２回洗浄し、次に３０ｍｌずつのジ
エチルエーテルで３回洗浄した。真空乾燥器中に一晩入
れることにより乾燥を完了した。化合物IVの金属的白色
結晶１．８７ｇ（化合物III の最初の量に基づき３０
％）が得られた。化合物IVは３３７．９〜３３９．５℃
で溶融し、透明な橙色の液体になった。化合物IVは分析
的に純粋であった。 Ｃ12Ｈ11Ｎ5 Ｏ2 〔２５７．１７ｇ／Ｍ〕 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ 理論値 ５６．０４ ４．２８ ２７．２４ １２．４４ 分析値 ５６．０８ ４．３８ ２７．１７ １２．５３ 生成物は次の構造をもっていた。
【００９７】
【化２１】
【００９８】実施例５ ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 〔８−（４−ピリジ
ル）テオフィリン〕（ＣＦ3 ＳＯ3 ）：化合物Ｖの製造 撹拌棒を具えた１００ｍｌの丸底フラスコに、１５０ｍ
ｇ（０．２６１ｍＭ）のｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ
Ｏ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3 ）、２５０ｍｇ（１．０４ｍＭ）
の８−（４−ピリジル）−テオフィリン及び４０ｍｌの
２−メトキシエタノールを添加した。２−メトキシエタ
ノールは、８−（４−ピリジル）−テオフィリンがエタ
ノール及び水に不溶性であるため溶媒として用いた。ア
ルゴンで１５分間脱気した後、アルゴン雰囲気中で４時
間溶液を還流した。冷却した後、回転蒸発器で溶媒を蒸
発することにより除去した。固体を２０ｍｌのメタノー
ルで抽出し、ガラスウールプラグを通して不溶性の８−
（４−ピリジル）−テオフィリン リガンドを除去し
た。濾液をセファディックスＬＨ−２０カラム（高さ７
５ｃｍ×内径２ｃｍ）により溶離剤としてメタノールを
用いクロマトグラフにかけた。二つの帯が観察された。
最初の帯は（主生成物）化合物Ｖで、少量の同定されな
い不純物帯から分離された（溶離速度０．１〜０．２ｍ
ｌ／分）。回転蒸発器で、化合物Ｖを含有する部分を５
ｍｌメタノール体積まで濃縮し、次に１００ｍｌの撹拌
したジエチルエーテル中で再沈澱させることにより青白
いライムグリーン色の粉末として得られた。化合物Ｖを
ガラスフリットフィルター（中程度気孔）で吸引濾過に
より収集し、ＣａＳＯ4 を入れた真空乾燥器に一晩入れ
て乾燥した。収量＝１２０ｍｇ〔ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒ
ｅ（ＣＯ）3 （Ｏ3 ＳＣＦ3）に基づき４２％〕。生成
物は分析的に純粋であった。 Ｃ26Ｈ19Ｏ8 ＲｅＳ〔８３２．６ｇ／Ｍ〕 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ 理論値 ３７．５０ ２．２８ １１．１７８ １５．３７ 分析値 ３８．１９ ２．５３ １１．７７ １５．７８ 生成物は次の構造をもっていた。
【００９９】
【化２２】
【０１００】実施例６ ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 〔３−（４−ピリジ
ル）−プロピオン酸〕ＣｌＯ4 ・Ｈ2 Ｏ：化合物VIの製
造 撹拌棒を具えた２５０ｍｌの丸底フラスコに、３００ｍ
ｇ（０．５２２ｍＭ）のｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ
Ｏ）3 ＣＦ3 ＳＯ3 、７９．２ｍｇ（０．５２４ｍＭ）
の３−（４−ピリジル）−プロピオン酸、７０ｍｌのエ
タノール（無水）及び３０ｍｌの水を添加した。混合物
をアルゴンで１５分間脱気した後、アルゴン雰囲気中で
４時間を還流した。溶液を冷却し、溶媒を追い出した。
残渣を少量の水に溶解し、ＳＰ−２５セファデックスカ
ラムに入れ、水で洗浄し、０．２５Ｍ ＮａＣｌで溶離
した。第一の黄緑色の部分を収集し、回転蒸発器により
約２５ｍｌへ体積を減少させた。フラスコの内容物を加
熱銃で暖め、１ｍｌの濃過塩素酸を滴下した。ライムグ
リーン色の結晶が形成された。これらを１５ｍｌの中程
度気孔のフリットロートで吸引濾過により分離し、非常
に少量の氷水で洗浄し、３０分間空気乾燥した。結晶を
更にドリエライト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ商標名）を入れた
真空乾燥で更に乾燥した Ｃ21Ｈ17Ｏ9 Ｎ3 ＲｅＣｌ・Ｈ2 Ｏ〔６９５．０４ｇ／Ｍ〕 Ｃ Ｈ Ｎ 理論値 ３６．２９ ２．７６ ６．０５ 分析値 ３６．１９ ２．４９ ５．８６ 生成物は次の構造をもっていた。
【０１０１】
【化２３】
【０１０２】実施例７種々のレニウム化合物の電気化学的ルミネッセンス 種々のレニウム化合物の電気化学的性質を、０．１Ｍの
テトラブチルアンモニウム テトラフルオロボレートを
支持電解質として窒素脱気したアセトニトリル１０ｍｌ
中に入れた１ｍＭ溶液として測定した。作用電極は、イ
ンディアナ州ウエストラファイエットのバイオアナリテ
カル・システムズ社から得られた白金円盤であった。白
金線を対電極として用い、１．０ｍｍ銀線を参照電極と
して用いた。測定は１００ｍＶ／秒の走査速度で−２．
２Ｖから＋２．２Ｖ（対ＳＣＥ）まで走査することによ
り行なった。各電気化学的測定後、飽和カロメル参照電
極（ＳＣＥ）と銀線との間の電位差を測定した。これに
より報告された値をＳＣＥに対する電位に補正した。電
気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）測定を、０．１Ｍホ
スフェート−シトレート緩衝液（ｐＨ４．２）、２５ｍ
Ｍ蓚酸及び１％トリトンR Ｘ−１００を含む水溶液中で
行なった。用いた電極系は、０．１ｉｎの白金線によっ
て「無線電信室」トランジスターソケット（＃２７６−
５４８）に接続した２枚の白金（５２ゲージ）電極から
なっていた。電極を、酢酸セルロースプラスチックの６
０ｍｌ厚の片の外側に取り付けた。このプラスチック
に、溶液が作用電極と対−参照電極との間に容易に流れ
るように１／４ｉｎ直径の穴をあけた。電極をポテンシ
ョスタットに接続し、一つの電極が作用電極（光電子増
倍管に近い方）として働かせ、一つの電極を対−参照電
極として働かせるようにした。測定は、５０ｍＶ／秒の
走査速度で１．５Ｖから２．５Ｖ（バイアス電位）まで
走査することにより行なった。ＥＣＬ測定値は、与えら
れた化合物濃度について信号対ノイズ比（又は信号対バ
ックグランド比）として報告されている。バックグラン
ドはＥＣＬ化合物が添加されていない緩衝液で観察され
たルミネッセンス カウントとして定義される。ルミネ
ッセンス測定値は、第一又は第二線状走査中に観察され
た最大光出力である。各溶液の電気化学的ルミネッセン
ス（ＥＣＬ）及び循環電圧測定の両方共、ＥＧ＆Ｇ２７
３型ポテンショスタット又はオックスフォードビポテン
ショスタット（ウルサー・サイエンティフック・インス
トルメンツ）を用いて行なった。各ＥＣＬ測定のフォト
ンフラックスは、二つ又は三つの電極系を０．５ｍｌ測
定溶液中に入れることができるように修正したベルソル
ド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）発光計で検査した。電気化学的
測定値及び電気化学的ルミネツセンス測定値の両方は、
キップ・アンド・ゾネン（Ｋｉｐｐ＆Ｚｏｎｅｎ）ＢＤ
９１型Ｘ，Ｙ，Ｙ′記録計に記録された。
【０１０３】蛍光測定は、前に記述したＥＣＬ緩衝液
３．０ｍｌ中に、又はその緩衝液に不溶性の時にはアセ
トニトリルに、希望の化合物を入れた５０μＭ溶液で行
われた。測定はパーキン・エルマーＬＳ−５蛍光分光光
度計で行われた。溶液の励起発光スペクトルの前走査
は、励起及び発光スペクトルを記録する前に行ない、発
光スペクトルを最大励起波長で照射しながら測定し、逆
に励起スペクトルを最大発光波長を調べながら記録でき
るようにした。表２には、幾つかの化合物の電気化学的
ルミネッセンスデータが要約されている。
【０１０４】
【表３】 電気化学的ルミネッセンスを、示した濃度で測定し、結
果をバックグランドに対する信号の比として表してあ
る。
【０１０５】実施例８ＥＣＬ基礎検査のための内部標準の使用 電気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）のために内部標準
を使用することについて研究するため幾つかの実験を行
なった。ＥＣＬ測定のために内部標準を使用するには、
試料溶液中に第二のルモフォール（ｌｕｍｏｐｈｏｒ）
即ち、“ＴＡＧ”を添加する必要がある。一つのＴＡＧ
はキャリブラント又はアナライトであり、第二のものは
内部標準である。各ＴＡＧからの発光は独立に同時に測
定されなければならない。これを行なう一つの方法は、
二つのＴＡＧが異なった波長で発光するので、光学的フ
ィルターを用いることによって行なう。材料及び装置 内部標準とキャリブラントの両方からのＥＣＬは、“フ
ロ・スルー（Ｆｌｏ−Ｔｈｒｕ）”室中で測定された。
その室は光遮断囲いからなり、その中で流体及び電気的
接続が電気化学的セルに対して行なわれ、そのセルが正
面の光電子増倍管と並べられている。光の強度は浜松光
電子増倍管（ＰＭＴ）及びオリエル（Ｏｒｉｅｌ）７０
７０型ＰＭＴ検出装置を用いて測定された。ポテンショ
スタットはプリンストン・アプライド・リサーチ（ＰＡ
Ｒ）１７３型で、ＰＡＲ１７５型でプログラムされてい
た（１００ｍＶ／ｓでＡｇ／ＡｇＣｌに対し１．８〜
１．０Ｖで走査された）。電気化学的セルは、セルブロ
ック中の溶液出入口を与えるように修正されたバイオア
ナリテカル・システムズのセルであった。作用電極材料
は、ブロックの中に埋め込まれた金であった。対電極と
して、ＰＭＴをセルへ入れるための窓のついたステンレ
ス鋼の前面板を用いた。参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）は
セルブロックの外にあり、下流におかれた。流体の流れ
及び試料の導入は、蠕動ポンプを用いて手動で行われ
た。光強度グラフは、キップ・アンド・ゾネンのＸ−Ｙ
−Ｙ記録装置で記録された。ＴＡＧの保存溶液は、緩衝
液中に溶解することにより調製された。緩衝液は０．１
５Ｍのホスフェート、０．１０Ｍのトリプロピルアミン
及び０．０５％のトウィー（Ｔｗｅｅｎ）２０からな
り、ｐＨ７．０であった。
【０１０６】較正研究 Ｏｓ（ｂｐｙ）3 2+、ＯｓＴＡＧのＥＣＬを研究した。
陽極方向に電位を走査して、二つの発光グラフを観察し
た。Ｏｓ（ｂｐｙ）3 3+/2+ （Ａｇ／ＡｇＣｌに対し
０．８Ｖ）の見掛け電位近くにプラトーの形の発光が観
察された。第二の発光はピーク状の形で１．４６Ｖで一
層起きた。この第二発光は遙かに強く、トリプロピルア
ミン酸化の近くにあった。この外挿検出限界は１００ｐ
Ｍ（浜松Ｒ３７４ＰＭＴを用いて）であった。（Ｍｅ4
ｂｐｙ）Ｒｅ（４−Ｅｔ−ｐｙｒ）（ＣＯ）3 + 、Ｒｅ
ＴＡＧのＥＣＬを研究した。酸化のための見掛けの電位
はＡｇ／ＡｇＣｌに対し１．７Ｖ（循環ボルタンメトリ
ーによりアセトニトリル中で測定した）であった。最大
ＥＣＬは、ＯｓＴＡＧに対し正の方向に移動し（１．５
８Ｖ）、それは酸化のための遙かに正の見掛けの電位を
反映している。この材料は５４５ｎｍ（水）で発光する
ので重要である。ＲｅＴＡＧ発光は、Ｏｓ（ｂｐｙ）3
2+ の発光（７５０ｎｍ）から波長により良く分離され
ており、従って、簡単なフィルターを用いて光学的に分
離することができる。ＲｅＴＡＧの外挿検出限界は１０
０ｐＭ（浜松Ｒ２６８ＰＭＴ）であった。上述の二つの
方法によるＥＣＬ性能に基づき、これらの化合物を、Ｅ
ＣＬのための内部標準を用いることができるか否かを試
験するために用いた。内部標準（ＯｓＴＡＧ）のための
一つの条件は、それがキャリブラントＴＡＧ（ＲｅＴＡ
Ｇ）とは独立に発光すること、即ち、次の消光反応が起
きないと言うことである：
【０１０７】
【化２４】
【０１０８】次の実験を行なった。一定のＯｓＴＡＧ濃
度（１μＭ）で、ＲｅＴＡＧ濃度を変え（０〜１００ｎ
Ｍ）、ＯｓＴＡＧのＥＣＬをＲ２６８ＰＭＴ及びＬＰ７
００ロングパス フィルターを用いて観測した。第２図
参照。実験誤差内で、ＲｅＴＡＧによるＯｓＴＡＧへの
影響は観察されなかった。同じ実験を繰り返した。但し
ＬＰ７００を、ショートパス フィルター６２０で置き
換え、ＲｅＴＡＧ ＥＣＬだけが観察されるようにし
た。ＲｅＴＡＧのための較正曲線は第３図に示されてい
る。ＯｓＴＡＧのないＲｅＴＡＧのための補正曲線も第
３図に示されている。この場合も実験誤差内で、ＯｓＴ
ＡＧの添加はＲｅＴＡＧ ＥＣＬに影響を与えていな
い。データは、Ｏｓ（ｂｐｙ）3 2+ がＲｅＴＡＧをアナ
ライトとした内部標準としてよく適していることを示し
ている。 実施例９ レニウム標識付けされたウサギ−抗マウス免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）抗体の電気化学的ルミネッセンス検出感
度 Ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 〔３−（４−ピリジ
ル）−プロピオン酸〕ＣｌＯ4 ・Ｈ2 Ｏ（化合物VI）で
標識付けした抗−マウスＩｇＧ抗体（レニウム標識付け
ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体）の電気化学的ルミネッセ
ンスを、下に記述するようにして調製された溶液１０ｍ
ｌを含む１５ｍｌ三口丸底フラスコ中で測定した、即
ち；１．５ｍｍ×１０ｍｍ磁気撹拌棒；１．０ｍｍ直径
の銀線擬参照電極；組み合わせ２８ゲージ白金線対電
極；及び０．１ｍｍ厚高研磨白金箔の１ｃｍ×１ｃｍの
四角の片に溶接した２２ゲージ白金線からなる作用電
極。（作用白金箔電極は、２８ゲージ白金線対電極を３
／３２ｉｎ等距離的に取り巻いた３／１６ｉｎ直径の半
円形に作用白金箔電極を成形した）。
【０１０９】銀線はＥＧ＆Ｇ１７３型ポテンショスタッ
ト／ガルバノスタットのＥＧ＆Ｇ１７８型電位計プロー
ブに接続した。白金線対電極及び白金作用電極はＥＧ＆
Ｇ１７３型ポテンショスタットの陽極及び陰極に夫々接
続した。装置は接地した。レニウム標識付けウサギ抗−
マウスＩｇＧ抗体溶液から発した電気化学的ルミネッセ
ンスを、コダック＃２３Ａゼラチン（赤色）フィルター
を取りつけたプロダクツ・フォア・リサーチＰＲ１４０
２ＲＦ光電子倍増管内に設定された浜松Ｒ９２８光電子
増倍管を用いて検出された。光電子増倍管室をオリエル
７０７０型光電子増倍管検出装置に接続した。０〜−
２．０Ｖの陰極電位で１秒間隔でパルスを発生させるこ
とにより、電気化学的ルミネッセンスを誘導した。電気
化学的ルミネッセンスの測定は、ミクロンタ２２１９１
でデジタルマルチメーターに接続した積分器を用いて、
得られた電気化学的ルミネッセンス光電子増倍管信号を
積分することにより行なわれた。電気化学的ルミネッセ
ンス信号は、パルス発生中１０秒間積分し、ｍＶで記録
された。１．２５×１０-7Ｍレニウム標識付けウサギ抗
−マウスＩｇＧ抗体の保存溶液を標識付けした抗体の濃
厚溶液（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｅ／抗体）から、ホス
フェート緩衝塩水（ＰＢＳ）中に希釈することにより調
製した。この溶液の一部分（８０μｌずつ）を、反応容
器中、０．１Ｍのテトラブチルアンモニウム テトラフ
ルオロボレート（ＴＢＡＢＦ4 ）及び１８ｍＭの過硫酸
アンモニウムを含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍｌに添加した。最終
レニウム標識付け抗体濃度は１×１０-9Ｍであった。上
述の如く、電気化学的ルミネッセンスが測定された。
【０１１０】レニウム標識付けウサギ抗−マウスＩｇＧ
抗体保存溶液を種々に薄めた付加的溶液を作り、それら
溶液の一部分ずつ（８０μｌずつ）を反応容器中、同じ
レニウム標識付け抗体の溶液へ少しずつ添加し、それに
よって標識付け抗体の濃度を、５×１０-9Ｍ、１×１０
-8Ｍ及び５×１０-8Ｍにした。記載の各溶液について電
気化学的ルミネッセンスの測定を行なった。これらの結
果は、標識付け抗体（１×１０-9Ｍ）の電気化学的メミ
ネッセンス検出の感度を示し、レニウム標識付け抗−マ
ウスＩｇＧ抗体の濃度に対する電気化学的ルミネッセン
ス強度の依存性を示している。 実施例１０ウシ血清アルブミン抗体についての均質電気化学的ルミ
ネッセンス免疫検査 ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 〔３−（４−ピリジ
ル）−プロピオン酸〕ＣｌＯ4 ・Ｈ2 Ｏ〔化合物VI〕で
標識付けされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を７．８
×１０-6Ｍ含有する溶液を、レニウム標識付けＢＳＡの
保存溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ、６Ｒｅ／ＢＳＡ）をホス
フェート緩衝塩水（ＰＢＳ）で希釈することにより調製
した。この溶液２６μｌずつを、反応容器中、０．１Ｍ
ＴＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含む
１０ｍｌのＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）に添加
した。最終レニウム標識付けＢＳＡ濃度は２×１０-8Ｍ
であった。実施例９に記載した如く、電気化学的ルミネ
ッセンスが測定された。
【０１１１】同様なやり方で、７．８×１０-6Ｍの無標
識ＢＳＡを含有する溶液を調製し、反応容器へ添加して
５×１０-8Ｍの最終的無標識ＢＳＡ濃度を与えた。この
溶液及びＢＳＡを含まない同様な溶液の電気化学的ルミ
ネッセンスを測定した。３．７５×１０-5Ｍのウサギ抗
ＢＳＡ抗体を含有する溶液を、ウサギ抗ＢＳＡ抗体保存
溶液（６．０ｍｇ／ｍｌ）から、ＰＢＳで希釈すること
により調製し、一部分（２６μｌずつ）を、反応容器
中、レニウム標識付けＢＳＡの溶液へ添加し、１×１０
-7Ｍの最終ウサギ抗ＢＳＡ抗体濃度を与えた。得られた
レニウム標識付けＢＳＡ抗原と抗体（ウサギ抗ＢＳＡ）
との混合物の電気化学的ルミネッセンスを測定した。そ
れらの結果はウサギ抗ＢＳＡ抗体を添加することにより
レニウム標識付けＢＳＡの電気化学的ルミネッセンスが
減少することを示し、ＢＳＡに対する抗体の均質電気化
学的ルミネッセンス検出を達成することができることを
示している。これらの結果に基づき、当業者には、他の
検査したいアナライトを検出するための均質電気化学的
ルミネッセンス免疫検査を開発することができることが
分かるであろう。
【０１１２】実施例１１ マウス抗−レギネラ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及
びレニウム標識付けウサギ抗−マウス免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）抗体を用いたレギネラのための不均質電気化
学的ルミネッセンス免疫検査 クテリウム レギネラ ｍｉｃｄａｄｅｉのホルマリン
懸濁物を、ＰＢＳ懸濁液で希釈することにより１．００
の光学密度（４２５ｎｍで）に調節した。約３×１０9
個の細胞を円錐状マイクロ遠心分離管に入れた。細胞を
遠心分離にかけ（１０分間、１０，０００ｒｐｍ）、上
澄み液を傾瀉し、細胞を、ＰＢＳ（１ｍｌ）中レギネラ
ｍｉｃｄａｄｅｉに特異性のマウス モノクローナル
ＩｇＧ抗体の１：５０希釈液（１．４５ｍｇ／ｍｌ）に
再懸濁した。室温で１時間培養した後、細胞を遠心分離
にかけ、上澄み液を傾瀉し、細胞を、ＰＢＳ緩衝液中に
再懸濁し、再び遠心分離にかけた。上澄み液を傾瀉した
後、細胞を、Ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 〔３−
（４−ピリジル）−プロピオン酸〕ＣｌＯ4 ・Ｈ2Ｏ化
合物VIで標識付けされたウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体、
即ちレニウム標識付けウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体の
１：５０希釈液（ＰＢＳ）中に再懸濁した（２ｍｇ／ｍ
ｌ、７．５Ｒｅ／抗体）。室温で１時間培養した後、細
胞を遠心分離にかけ、上澄み液を傾瀉し、細胞を、ＰＢ
Ｓ中に再懸濁し、二度洗浄し、前の如く再び遠心分離に
かけた。最後の洗浄後、細胞を２００μｌのＰＢＳに再
懸濁した。その細胞懸濁物１００μｌを、０．１Ｍ Ｔ
ＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含む１０
ｍｌのＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）の入った反
応容器中に添加した。その細胞懸濁物について電気化学
的ルミネッセンスを測定した。更に１００μｌの細胞懸
濁物を反応容器へ添加し、電気化学的ルミネッセンスを
測定した。実施例９に記載した方法に従い、対照として
細胞を含まない溶液について電気化学的ルミネッセンス
を測定した。レニウム標識付けウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体を用いたレギネラのための不均質電気化学的ルミネッ
センス免疫検査を成功裡に行なうことができる。
【０１１３】実施例１２ ２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−プロピル〕−１，３′ジオキソランの製造 アルゴンの不活性雰囲気中、３０ｍｌの乾燥テトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）及び７．６５ｍｌの乾燥ジイソプロ
ピルアミン（５４．６ｍＭ）を、６００ｍｌの三口フラ
スコへ注射器により撹拌しながら入れた。溶液を、深底
ビーカー中のドライアイス−イソプロパノール混合物中
にフラスコを浸漬することにより−７８℃に冷却した。
２１．６ｍｌの２．５Ｍ ｎ−ブチルリチウム（５４ｍ
Ｍ）をゆっくりフラスコへ添加した。得られた溶液を１
５分間撹拌し、乾燥ＴＨＦ１００ｍｌ中に溶解した４，
４′−ジメチル−２，２′−ビピリジン（５２ｍＭ）
９．５８ｇの溶液を、１時間に亙って撹拌しながらカニ
ューレにより滴下した。得られた褐色の混合物を−７８
℃で２時間更に撹拌し、１０ｇの２−（２−ブロモエチ
ル）−１，３−ジオキソラン（５５ｍＭ）を注射器によ
り添加し、得られた混合物を−７８℃で５分間撹拌し
た。次に反応容器を氷浴（１０℃）中に入れると、３０
分後色が変化し始めた。１時間後色は暗紫色になり、２
時間後色は青くなり、２．５時間後色は緑になり、３．
２５時間後、色はレモン黄色になった。反応混合物は、
３０ｍｌの飽和ＮａＣｌ、続いて１０ｍｌの水及び５０
ｍｌエーテルで急冷した。水性相を３００ｍｌのエーテ
ルで２度抽出し、一緒にしたエーテル相を１００ｍｌの
水で逆抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。反応
生成物を精製するため、活性度III 中性のアルミナ（メ
ルク）９０で分離した。用いた溶離剤は、石油エーテル
／ジエチルエーテル（１：１）であった〔出発物質は石
油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）で完全に溶離
し、次に生成物が溶離した〕。プロトンＮＭＲ分析によ
り、分離された反応生成物の構造は次の通りであること
が確認された。
【０１１４】
【化２５】
【０１１５】実施例１３ （４−ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−
ビピリジンの製造及び精製 ２ｇの２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン
−４′−イル）−プロピル〕−１，３ジオキソランを５
０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、５０℃で２時間加熱し
た。溶液を冷却し、重炭酸ナトリウムでｐＨ７〜８へ調
節し、クロロホルム１００ｍｌで２度抽出した。一緒に
したクロロホルム相を少量の水で洗浄し、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、濾過し、回転蒸発させて黄色の油を生じ
た。黄色の油を、溶離剤として酢酸エチル／トルエン
（１：１）を用いたシリカゲルカラムで精製し、不純物
をメタノールで溶離した。 プロトンＮＭＲ分析〔１+ ９６−２+ １１（ｍ、２
Ｈ）；２+ ４３（ｓ、３Ｈ）；２+ ４６−２+ ５０）
（ｔ、２Ｈ）；２+ ５３−２+ ８０（Ｍ、２Ｈ）；７ +
１２−７+ １４（ｍ、２Ｈ）：８+ h17-8+２１（ｂｒ．
ｓ、２Ｈ）；８+ ５２−８+ ５８（ｍ、２Ｈ）；９+ ８
９（ｓ、１Ｈ）〕により、反応生成物が次の構造をもつ
ことが確認された。
【０１１６】
【化２６】
【０１１７】実施例１４４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）酪酸の製造 ０．５ｇの４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−
２，２′−ビピリジン（２．０ｍＭ）を１０ｍｌの無水
アセトンに溶解した。２２５ｍｇの微粉末過マンガン酸
カリウム（ＫＭn Ｏ4 ；１．４２ｍＭ）を溶液に撹拌し
ながら少しずつ添加した。反応物を薄層クロマトグラフ
（シリカ；酢酸エチル／トルエン５０：５０）にかけ、
それによりアルデヒドが徐々に消えるに従って、低Ｒｆ
のビピリジンが形成されたことが示された。反応が完結
した後、水を添加し、ＭｎＯ2 を濾過し、少量ずつのＮ
ａ2 ＣＯ3（水溶液）で洗浄した。アセトンを回転蒸発
させ、残留物をＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、非酸性ビピリジ
ンを除去した。水溶液を１．０Ｎ ＨＣｌを注意深く添
加して酸性にし、ｐＨを４．８にした。溶液はこのｐＨ
に達すると少し曇り、懸濁物はｐＨを低くすると再び溶
解した。混合物を同じ量のＣＨ2 Ｃｌ2 で５回抽出し、
Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥し、回転蒸発させて、油を得、そ
れは真空中ですぐに固化した。粗製固体をクロロホル
ム：石油エーテルで再結晶し、白色の結晶を得た。 融点：１０３．５℃−１０５．５℃；ＩＲ：１７０４ｃ
ｍ-1。プロトンＮＭＲ分析は次の構造に一致していた。
【０１１８】
【化２７】
【０１１９】実施例１５ テオフィリンに特異性の抗体を用いたＲｅ（Ｉ）−テオ
フィリン接合により発生した電気化学的ルミネッセンス
信号の変調 テオフィリンに共有結合（接合）された化合物ＶＩを、
０．３５Ｍのフッ化ナトリウムを含有する０．１Ｍホス
フェート緩衝液ｐＨ６．０（ＰＢＦ緩衝液）を用いて最
終濃度１５０ｎＭの最終濃度へ希釈した。テオフィリン
に対し特異性のモノクローナル抗体（クローン数９−４
９、腹水ロット番号ＷＯ３９９、カタログ番号０４６）
を、カレスタッド・ラボラトリーズ社（Ｋａｌｌｅｓｔ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（チャス
カ、ＭＮ）から得られた。そのモノクローナル抗体をＰ
ＢＦ緩衝液を用いて種々の濃度に希釈した（蛋白質２
１．９μｇ／ｍｌ〜７００μｇ／ｍｌ）。テオフィリン
と反応しない別のモノクローナル抗体（対照ＭＡＢ）
を、シグマ（セントルイス、Ｍ）から得、ＰＢＦ緩衝液
を用いて蛋白質２１．９μｇ／ｍｌ〜７００μｇ／ｍｌ
の種々の濃度へ希釈した。テオフィリンの標準溶液を、
アルドリッヒ・ケミカル社（ミルウォーキー、ＷＩ）か
ら得られたテオフィリン（カタログ番号２６−１４０−
８、Ｍ．Ｗ．１８０．１７）を用いて調製した。テオフ
ィリンをＰＢＦ緩衝液に溶液溶解し、７５μＭの最終濃
度にし、検査で用いるためＰＢＦ緩衝液で希釈した６μ
Ｍにした。電気化学的ルミネッセンス測定を行なう前
に、２５０ｍＭの蓚酸及び５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ
１００（ＥＣＬ溶液）を含む溶液を反応混合物へ添加し
た。測定は、二つの白金網電極を反応溶液の入った試験
管中へいれることができるように修正したベルトホルド
ルミノメーターを用いて行なった。電極はポテンショ
スタットへ接続し、電気化学的ルミネッセンスの測定
は、５０ｍＶ／秒の走査速度で１．５Ｖから２．５Ｖま
で電極に印加した電位を走査することにより行なった。
測定に用いたベルトホルド ルミノメーターは、高利得
の赤色感応性光電子増倍管を具えていた。記録計へのル
ミノメーターの出力は１０5 カウント／Ｖに調節され
た。測定値はＸ−Ｙ−Ｙ′記録計に記録され、ピークの
高さが電気化学的ルミネッセンスの測定値として用いら
れた。電極は測定の間で、０．１Ｍホスフェート、０．
１シトレート、０．０２５Ｍ蓚酸及び１％トリトンＸ−
１００を含有するｐＨ４．２の緩衝液で濯ぎ、この溶液
中の電極に＋２．２〜−２．２Ｖの間のパルスを６０秒
間かけ、次に１０秒間−２．２Ｖをかけることにより清
浄にした。次に電極をこの溶液から取り出し、蒸留水で
濯ぎ、そして拭いて乾かした。実験は下に概略述べるよ
うに行なった。
【０１２０】対照モノクローナル抗体、テオフィリンに
対する抗体又はＰＢＦ緩衝液の溶液を一組の試験管に入
れた（工程１）。試験管へテオフィリン又はＰＢＦ緩衝
液の溶液を添加した（工程２）。溶液を、試験管を簡単
に振ることにより混合し、それらを室温で２５分間反応
させた。次に接合体溶液を試験管へ添加した（工程
３）。試験管を振り、室温で１５分間保持した。最後に
ＥＣＬ溶液を各試験管に１００ｍｌずつ添加し、電気化
学的ルミネッセンスを上で述べた如く測定した。抗体−
Ｒｅ（Ｉ）−テオフィリン接合体（「接合体」）相互作
用の電気化学的ルミネッセンスを与える影響を研究する
ための実験工程 ─────────────────────────────────── 工 程 １ 工 程 ２ 工 程 ３ １００μｌ ２００μｌ １００μｌ ─────────────────────────────────── Ａ．対照モノクローナル抗体 緩衝液 「接合体」 （2.１９μｇ〜７０μｇ） 又は Ｂ．抗−テオフィリン抗体 緩衝液又は 「接合体」 （2.１９μｇから７０μｇ） テオフィリン 又は Ｃ．ＰＢＦ緩衝液 緩衝液 「接合体」又は 緩衝液
【０１２１】実験は、テオフィリンを特異的に認識する
モノクローナル抗体は、レニウム化合物（化合物６）が
結合されたテオフィリン、例えばＲｅ（Ｉ）−テオフィ
リン接合体、に接触すると、電気化学的ルミネッセンス
を減少することを示している。電気化学的ルミネッセン
スの減少は、接合体濃度が一定に保たれた場合、抗体の
濃度に比例する。テオフィリンと反応しない抗体を用い
た時、抗体の最大濃度の所で電気化学的ルミネッセンス
の僅かな減少しか見られない。データは、テオフィリン
が抗−テオフィリン抗体と接触し、次に接合体が混合物
へ添加された時、電気化学的ルミネッセンスの量が大き
くなることも示している。このことは、抗体の結合のた
めにテオフィリンが競争し、電気化学的ルミネッセンス
を発生することができる接合体の量を一層大きくするこ
とを示している。 実施例１６ 均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査に基づく血清中
のテオフィリンについての検査 実施例１５に記載した結果に基づいて、テオフィリンに
対する均質免疫検査法が、テオフィリンに対する抗体及
び実施例１５に記載したＲｅ（Ｉ）−テオフィリン接合
体（「接合体」）を競争結合方式で用いることにより開
発された。用いられた材料は実施例１５に記載されてい
る。但しＰＢＦ緩衝液は０．１Ｍフッ化ナトリウムを含
有する０．１Ｍホスフェート緩衝液ｐＨ６．０であっ
た。この検査のため、テオフィリンに対するモノクロー
ナル抗体の特別な濃度が選択された。抗体濃度は５５μ
ｇ／ｍｌであった。接合体濃度を１７５ｎＭに調節し
た。テオフィリンをヒト血清に添加し、血清に対するテ
オフィリンの最終濃度を２．５、５、１０、２０及び４
０μｇ／ｍｌにした。
【０１２２】検査は次のようにして行われた。１０μｌ
ずつの血清を、２９０μｌずつの抗−テオフィリンモノ
クローナル抗体へ添加し、その溶液を室温で２５分間保
持する。次に接合体１００μｌを各試験管に添加し、３
５ｎＭの最終濃度にし、この溶液を室温で１５分間保持
した。実施例３４に記述したＥＣＬ溶液１００μｌを次
に各試験管に添加し、それらの溶液の電気化学的ルミネ
ッセンス性を、前に記述した如く、５０ｍＶ／秒で１．
５Ｖから２．５Ｖへ走査するやり方を用いて測定した。
結果は、血清試料中のテオフィリンの濃度と、反応混合
物によって放出された電気化学的ルミネッセンスの量と
の間に相関関係があることを示している。この観察は、
テオフィリンのための検査方法を開発することができる
ことを示している。これらの結果に基づいて、当業者
は、生物学的マトリックス中の検査したいアナライトを
検出し、定量化する均質電気化学的ルミネッセンス免疫
検査を開発することができるであろう。 実施例１７ 均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査に基づく溶血、
脂肪血、黄疸及び正常血清試料中のテオフィリンについ
ての検査及び蛍光分極検査との比較 異なった種類の血清試料中のテオフィリンの濃度を、均
質電気化学的ルミネッセンス免疫検査法を用いて決定し
た。検査方式は、テオフィリンに対する特異性モノクロ
ーナル抗体及び実施例１５に記載した「接合体」を用い
た競争結合検査法である。電気化学的ルミネッセンスの
ための試薬及び方法は前の実施例に記載されている。
【０１２３】異なった血清試料中のテオフィリンの濃度
を測定するのに用いた蛍光分極試験は、アボット・ラボ
ラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）（イリノイ州ノースシカゴ）からの自動ＴＤＸ装置
を用いて行われた。溶血、脂肪血、黄疸及び正常血清を
検査で用い、異常血清についてのデータを下に列挙す
る。 潜在的に問題のある血清の均質テオフィリン検査特性 血 清 因子濃度 正常範囲 溶 血 ヘモグロビン １2.４ｍｇ／ｄｌ ０〜3.２ ｍｇ／ｄｌ 脂肪血 トリグリセリド ４０５ｍｇ／ｄｌ １０〜１９０ｍｇ／ｄｌ コレステロール １９６ｍｇ／ｄｌ １２０〜２００ｍｇ／ｄｌ 黄 疸 ビリルビン １０ｍｇ／ｄｌ ０〜1.５ ｍｇ／ｄｌ 種々の量のテオフィリンを血清試料へ添加し、テオフィ
リン２．５μｇ／ｍｌ〜テオフィリン４０μｇ／ｍｌの
最終濃度にした。均質電気化学的ルミネッセンス免疫検
査についてのデータを獲た。
【０１２４】各血清試料を、同じく蛍光分極検査により
テオフィリンの濃度について分析した。均質電気化学的
ルミネッセンス免疫検査及び蛍光分極検査により測定さ
れたテオフィリンの濃度を比較した。データを点点図
（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍ）としてプロットした。デー
タ点を直線回帰により分析し、相関係数を計算した。分
析値は二つの検査の間の優れた相関関係を示していた。
相関係数（ｒ）は大きかった。正常、溶血、及び脂肪血
血清試料についての直線の勾配は０．８〜１．２であ
り、これら血清試料からのテオフィリンの優れた回収を
示していた。テオフィリンを含有する黄疸血清試料によ
って放出された電気化学的ルミネッセンスは、他の血清
試料のものより高かったが、それは各テオフィリン濃度
で比例して高かった。相関係数は、電気化学的ルミネッ
センスと蛍光分極とを比較したデータ点について高かっ
たが、勾配は黄疸血清試料中のテオフィリンに対し一層
高回収を示していた。これらの結果に基づいて、黄疸試
料中のテオフィリンの濃度を、黄疸血清の各部分に既知
の量の「接合体」を添加することにより、試料について
の標準曲線を確立することにより決定することができる
であろう。これらのデータは、均質電気化学的ルミネッ
センス免疫検査を、ヘモグロビン、脂質及びビリルビン
を異常な量で含有する血清試料中に存在するテオフィリ
ンの濃度を測定するのに用いてもよいことを示してい
る。均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査は、蛍光分
極方法よりも幾つかの利点を有する。なぜなら、ＥＣＬ
検出の融通性、即ち生物学的分子の一層高い濃度では一
層敏感な検出が行えるからである。均質電気化学的ルミ
ネッセンス免疫検査は、蛍光分極方法よりも更に幾つか
の利点を有する。なぜなら、入射光源は不必要であり、
電気的励起は充分な光発生の場合だけ必要になるからで
ある。従って、複雑な光学的装置は不必要になる。測定
原理は電気化学的励起によって起こされる純粋に特性フ
ォトン発光であるので、系の感度は蛍光分極より潜在的
に遙かに大きく一層広いダイナミック範囲を達成するこ
とができるであろう。また、均質電気化学的ルミネッセ
ンス免疫検査を用いることにより、蛍光分極によって与
えられるよりも遙かに多種類のアナライトの測定が可能
であり、一層広いダイナミック範囲が達成されるであろ
う。また、生物学的分子認識事象、例えば抗体・抗原相
互作用による、電気的に励起された化学的ルミネッセン
スの選択的変調により、均質電気化学的ルミネッセンス
免疫検査を用いた場合には、蛍光分極によって与えられ
るよりも遙かに多種類のアナライトを測定することが可
能である。これらの結果に基づいて、当業者には異常血
清試料中の他の検査したいアナライトを検出するための
均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査法を開発するこ
とができることが分かるであろう。
【０１２５】実施例１８ 不均質電気化学的ルミネッセンス検査に基づく血清中の
テオフィリンについての検査 免疫検査方式を用いて、テオフィリンの為の不均質検査
法を、化合物ＶＩ標識付け抗−テオフィリン抗体及びバ
イオマグ磁気粒子に固定したテオフィリンＢＳＡを用い
て開発した。抗体濃度は、２０μｇ／ｍｌであった。磁
気粒子濃度は固体１％（重量／体積）であった。テオフ
ィリンは、最終濃度１０及び４０μｇ／ｍｌの血清へ添
加した。テオフィリン血清標準物は、０．１％のＢＳＡ
を含むＰＢＦ緩衝液（０．１Ｍフッ化ナトリウム含有燐
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で１０００倍に希釈
した。検査は次のようにして行われた。化合物ＶＩへ接
合した抗体の７５μｌへ希釈血清標準物７５μｌを添加
し、その溶液を室温で２０分間培養した。次にテオフィ
リン−ＢＳＡ−バイオマグ粒子５０μｌを添加し、懸濁
物を５分間放置した。粒子を磁気的に分離し、上澄み液
１００μｌを電気化学的ルミネッセンスについて測定し
た。結果に基づき、当業者は、生物学的マトリックス中
の検査したい他のアナライトについての不均質電気化学
的ルミネッセンス免疫検査法を開発することができるで
あろう。
【０１２６】実施例１９電気化学的ルミネッセンスモイエティを持つ標識付け用
ＤＮＡ 次の方法は電気化学的ルミネッセンスモイエティを有す
る標識ＤＮＡに対して用いられた。 １．０Ａ260 の慣用的合成３８ｍｅｒ（ＭＢＩ ３８） ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣ
ＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ＊ （式中、Ｔ＊は炭素５の所で −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ2 ）7 −ＮＨ2 により修飾されたチミジンである）をｐＨ８．７の０．
０１Ｍホスフェート緩衝液１００μｌ中に溶解した。ｆ
ａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）3 〔３−（４−ビピリジ
ル）−プロピオン酸〕ＣｌＯ 4 ・Ｈ2 Ｏ（化合物ＶＩ）
の溶液（ｐＨ８．７の燐酸カリウム０．０１Ｍ緩衝液３
００μｌ中に２．３ｍｇ入れたもの）１００μｌを添加
した。内容物を攪拌し、室温で一晩放置した。硼水素化
ナトリウムの飽和水溶液１００μｌを混合物へ添加し、
可逆性イミンシッフ塩基結合を非可逆性アミン結合へ転
化した。反応を室温で２時間行わせた。次に溶液を数滴
の希釈酢酸で注意深く処理し、硼水素化ナトリウムの過
剰を消失させた。反応溶液をＰ−２ゲル濾過カラム（１
８ｉｎ×１／２ｉｎ）中へ導入した。そのカラムは予め
ｐＨ６．７７の０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテ
ートで平衡状態にさせてあった。カラムを同じ緩衝液で
溶離し、２０ｍｌ／時の流量で２ｍｌずつの分画部分を
収集した。分画９及び１０で溶離されたＤＮＡは未反応
レニウム錯体とよく分離された。収集ＤＮＡ試料は典型
的なＵＶ吸収を示し、更に、励起した時蛍光発光スペク
トルを示した。蛍光発光は、ＤＮＡ試料中にレニウムモ
イエティが存在していたことを示している。生成物は、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で一本の蛍光帯として
移動する。標識付けしたＤＮＡ（ＭＢＩ ３８−化合物
ＶＩ「接合体」）の電気泳動易動度は、無標識ＤＮＡと
ほぼ同じであった。
【０１２７】実施例２０標識付けされたＤＮＡの電気的に発生させた化学的ルミ
ネッセンス性 実施例１９からの標識付けされたＤＮＡ試料、合成体Ａ
（ＭＢＩ ３８−化合物Ｉ）をその電気化学的ルミネッ
センス性を研究するために用いた。種々の濃度の標識付
けＤＮＡを、０．１Ｍのシトレート、２５ｍＭのオキサ
レート及び１．０％のトリトンＸ−１００を含むｐＨ
４．２の０．１Ｍホスフェート緩衝液０．５ｍｌ中に溶
解し、修正ベルトホルドルミノメータで測定した。電気
的ルミネッセンス信号は種々のＤＮＡ濃度に応答してい
た。 実施例２１ 化合物ＶＩ−標識付けされたオリゴヌクレオチドのハイ
ブリダイゼーション研究 実施例２０に記載した３８ｍｅｒに対する相補的鎖を、
ＡＢＩ３８０Ｂ型ＤＮＡ合成器を用いて合成し、ＭＧＥ
Ｎ−３８の記号を付けた。化合物Ｉのオリゴヌクレオチ
ドへの共有結合がＭＢＩ ３８オリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーション性に影響を与えるかどうかを決定す
るため、次の実験が考えられた。種々の濃度の標的断片
（ＭＧＥＮ−３８）を、一枚のゲルマン（Ｇｅｌｍａ
ｎ）ＲＰナイロン膜にスポットし、固定し、ＭＢＩ ３
８又はＭＢＩ３８−化合物ＶＩでプローブした。両方の
断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び32Ｐ〔ＡＴ
Ｐ〕で処理し、32Ｐで５′端に標識付けした。次にＤＮ
Ａ及び化合物ＶＩ標識付けＤＮＡのハイブリダイゼーシ
ョン感度を比較した。
【０１２８】ＭＧＥＮ−３８ＤＮＡの濃度は、５０ｎｇ
〜０．０５ｎｇの範囲であり、ナイロン膜にスポット
し、空気乾燥した。二枚の膜を作った。ブロット（ｂｌ
ｏｔ）を夫々２分ずつ次のように処理した：ＤＮＡを完
全に変性するため１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５ＮａＯ
Ｈ；ブロットを中和するため１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．
５Ｍ ＴＩＲＳ；及び最後に２Ｘ ＳＳＣ。ブロットを
真空炉中で８０℃で２時間加熱した。ハイブリダイゼー
ションプローブは次のようにして調製された：３μｇず
つのＭＢＩ ３８及びＭＢＩ ３８−化合物Ｉを、１０
単位ずつのＴ４キナーゼ及び１２５μキューリーのγ32
Ｐ−ＡＴＰでキナーゼ処理化した。ＤＮＡへのアイソト
ープ組込み％を決定した。プレハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーション溶液を、マニアテス（２
４）に従って調製した。ブロットを４時間５３℃で５０
μｇ／ｍｌの仔牛チマスＤＮＡでプレハイブリド化し
た。次にブロットを、１０，０００，０００ｃｐｍで各
プローブを含むハイブリダイゼーション溶液中に入れ、
５３℃で一晩（１２時間）ハイブリド化した。次の日ブ
ロットを次のように洗浄した： −夫々１５分ずつ５３℃で２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤ
Ｓで２回、 −（上述と同じく）０．２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ
で２回、 −（上述と同じく）０．１６Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤ
Ｓで２回。 次にブロットを空気乾燥し、コダックＸ−オマトフィル
ムへ−７０℃で露出した。
【０１２９】Ｘ線分析により、ＭＢＩ ３８及びＭＢＩ
３８−化合物ＶＩプローブで非常に似たハイブリダイ
ゼーション模様が観察されることが示された。両方の場
合とも、０．５ｎｇの標的へのプローブのハイブリダイ
ゼーションが観察され、０．０５ｎｇまでの低い標的Ｄ
ＮＡへのかすかな微量のハイブリダイゼーションが観察
された。負制御ＤＮＡ（５０ｎｇでスポットされたファ
ージλＤＮＡ）についてはプローブによるハイブリダイ
ゼーション活動は検出されなかった。 実施例２２ 実施例２１に記載した如く、
【０１３０】
【化２８】
【０１３１】で標識付けされた３８ｍｅｒ Ｅ．ｃｏｌ
ｉプローブを、マニアテスによるＥ．ｃｏｌｉ核酸の試
料でハイブリド化した〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｐ．１５０−１６０，Ｃｏｌ
ｄ Ｐｒｅｓｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８
２）（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ
ー）〕。次にハイブリド化複合体を、信号プローブに隣
接したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡの別の配列に相補的な別の
固体支持体結合プローブにより捕捉させた。捕捉手順
は、このプロトコルの最初の部分について用いられたの
と同じハイブリダイゼーション条件を用いた。ハイブリ
ド化された複合体を遠心分離により単一鎖核酸から分離
し、繰り返し洗浄した。次に分離された複合体を５分間
水中で１００℃で加熱し、複合体を解離した。今度は溶
液中へ放出された標識付けされたプローブを、電気化学
的ルミネッセンス信号を測定するため適当なカクテル
（ｃｏｃｋｔａｉｌ）中へ移行させた。信号の強度は標
的ＤＮＡの量に直線的に相当していた。アミノ結合ＤＮ
Ａ（Ｅ．ｃｏｌｉからの１５ヌクレオチド一致配列を含
む３８−ｍｅｒ）の試料を、ｐＨ８．７の０．０１Ｍホ
スフェート緩衝液１００μｌ中に溶解した。オスミウム
錯体
【化２９】 の溶液（ｐＨ８．７の０．０１Ｍ燐酸カリウム緩衝液３
００μｌ中２．３ｍｇ）１００μｌを添加した。内容物
を攪拌し、室温で一晩放置した。硼水素化ナトリウムの
飽和水溶液１００μｌを混合物へ添加し、可逆性イミン
シッフ塩基結合を非可逆性アミン結合へ転化した。反応
を室温で２時間行わせた。標識付けされたプローブをゲ
ル濾過クロマトグラフにより精製した。標識付けされた
ＤＮＡプローブはオスミウム錯体の結合と一致した分光
性を示した。
【０１３２】オスミウム錯体で標識付けされたプローブ
を、上記マニアテスによるＥ．ｃｏｌｉ核酸の試料でハ
イブリド化した。次にハイブリド化複合体を、信号プロ
ーブに隣接したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡの別の配列に相補
的な別の固体支持体結合プローブにより捕捉させた。捕
捉手順は、このプロトコルの最初の部分について用いら
れたのと同じハイブリダイゼーション条件を用いた。ハ
イブリド化された複合体を遠心分離により単一鎖核酸か
ら分離し、繰り返し洗浄した。次に分離された複合体を
５分間水中で１００℃で加熱し、複合体を解離した。今
度は溶液中へ放出された標識付けされたプローブを、電
気化学的ルミネッセンス信号を測定するため適当なカク
テル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）中へ移行させた。信号の強度
は標的ＤＮＡの量に直線的に相当していた。 レニウム錯体
【０１３３】
【化３０】
【０１３４】を先ず、無水ジメチルホルムアミド６０μ
ｌ中に３ｍｇ溶解し、それを、９４ｍｇのジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で無水ＤＭＦ２
００μｌ中に入れたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５
２ｍｇ）の溶液で処理することにより、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド誘導体へ転化した。反応は０℃で４時間
進行させた。沈澱したジシクロヘキシル尿素を遠心分離
により除去し、上澄み液（２００μｌ）を、ｐＨ８．７
７の０．０１Ｍホスフェート緩衝液中にアミノ結合ＤＮ
Ａ（Ｅ．ｃｏｌｉからの１５ヌクレオチド一致配列を含
む３８−ｍｅｒ）を入れた溶液へ添加した（緩衝液１０
０μｌ中２Ａ260 ）。反応は室温で一晩進行させた。か
なりの量の固体が反応中に現れ、それをガラスウールで
濾過することにより除去した。濾液を濃縮し、１Ｍのト
リエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ６．８）０．５
ｍｌ中に溶解した。次に反応混合物をゲル濾過カラムで
クロマトグラフにかけた。標識付けされたＤＮＡプロー
ブはレニウム錯体の結合と一致した分光性を示した（ｅ
ｍ ５９４ｎｍ）。次にレニウムで標識付けされたプロ
ーブを、上記マニアテスによるＥ．ｃｏｌｉ核酸の試料
でハイブリド化した。次にハイブリド化複合体を、信号
プローブに隣接したＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡの別のセグメ
ントに相補的な別の固体支持体結合プローブにより捕捉
させた。捕捉手順は、このプロトコルの最初の部分につ
いて用いられたのと同じハイブリダイゼーション条件を
用いた。ハイブリド化された複合体を遠心分離により単
一鎖核酸から分離し、繰り返し洗浄した。次に分離され
た複合体を５分間水中で１００℃で加熱し、複合体を解
離した。今度は溶液中へ放出された標識付けされたプロ
ーブを、電気化学的ルミネッセンス信号を測定するため
適当なカクテル中へ移行させた。信号の強度は標的ＤＮ
Ａの量に直線的に相当していた。ルテニウム、レニウム
及びオスミウム錯体で独立に標識付けされたＥ．ｃｏｌ
ｉからの３８−ｍｅｒＤＮＡプローブを別々の実験で用
いて、それらの相補的配列とハイブリド化した。デュプ
レックスの電気化学的ルミネッセンス信号を、対応する
標識付けした単一鎖プローブの電気化学的ルミネッセン
ス信号と比較した。電気化学的ルミネッセンス信号の変
調が各デュプレックスについて観察された。
【０１３５】参考文献
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＲｅ含有モイエティを製造す
るための方法の概略的工程図である。
【図２】図２は、オスミウム含有内部標準物質の電気化
学的ルミネッセンス強度に与えるレニウム含有キャリブ
ラント（ｃａｌｉｂｒａｎｔ）の濃度の影響を示す較正
グラフである。
【図３】図３は、レニウム含有キャリブラントの電気化
学的ルミネッセンスに与えるオスミウム含有内部標準物
質の影響を示す曲線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｄ (72)発明者 ドレシック，ウォルター ジェイ. アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，マルベリイ コート 18215 (72)発明者 レランド，ジョナサン ケイ. アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，エヌ．サミット ア ベニュー 384 (72)発明者 ヒノ，ジャネル ケイ. アメリカ合衆国22201 バージニア州, アーリントン，ナンバー23 ノース カ ルバート ストリート 2020 (72)発明者 プーニアン，モヒンダー エス. アメリカ合衆国20879 メリーランド州, ゲイサースバーグ，ハイ ティンバー コート 224 (72)発明者 デラ シアナ，レオポルド アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，マルベリイ コート 18215

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の式： 〔Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）
    ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ〔式
    中、ＰはＲｅのポリデンテート リガンドであって、ビ
    ピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロリ
    ル、ポリフィリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、
    置換テルピリジル、置換フェナントロリル及び置換ポル
    フィリンからなる群より選ばれ、そしてこれらの置換さ
    れたリガンドは、それぞれ、アルキル、置換アルキル、
    アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボ
    キサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒド
    ロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グア
    ニジン、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒド
    ロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルで置
    換されており、； Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガン
    ドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよく、
    カルボニル、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、
    フェナントロリル、置換ビピリジル、置換ビピラジル、
    置換テルピリジル、置換フェナントロリル及び置換ポル
    フィリンからなる群より選ばれ、そしてこれらの置換さ
    れたリガンドは、それぞれ、アルキル、置換アルキル、
    アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボ
    キサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒド
    ロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グア
    ニジン、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒド
    ロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルで置
    換されており、； ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
    ３、Ｌ４、Ｌ５又はＬ６の一つ以上に共役している物質
    であって、生物学的物質、合成物質又は非生物学的物質
    であり； ｍは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数であり； ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； ｕは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、当
    該化合物が室温下２００ｍｍから９００ｍｍの範囲の波
    長の電気化学的ルミネッセンスを放出するように誘導す
    ることができ、Ｒｅのリガンドによって与えられるＲｅ
    への全共有結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組
    成及び数を有する〕を有する化合物の存在を決定する方
    法において、前記化合物を含む試薬混合物を形成し、該
    化合物の存在を検出することからなる、化合物存在の決
    定方法。
  2. 【請求項２】 請求項１の化合物の存在を決定する方法
    において、 （ａ）試薬混合物を、該化合物を含む適当な条件下で形
    成し； （ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネ
    ルギー又は電磁波エネルギーに曝すことにより、前記化
    合物が電磁波を発するよう誘導し；そして （ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって前
    記化合物の存在を決定する、 ことからなる決定方法。
  3. 【請求項３】 請求項１の化合物に結合する検査したい
    アナライトの存在を決定する方法において、 （ａ）前記アナライトを前記化合物と、試薬混合物を形
    成するような適当な条件下で接触させ； （ｂ）前記試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的
    エネルギー又は電磁波エネルギーに曝すことにより前記
    化合物が電磁波を発するように誘導し；そして （ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって前
    記検査したいアナライトの存在を決定する、 ことからなる決定方法。
  4. 【請求項４】 アナライトが、全細胞、ウイルス、細胞
    内粒子、核酸、多糖類、蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖
    類、脂質、脂肪酸、糖質蛋白質、ペプチド、細胞代謝物
    質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バル
    ビツレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、ア
    ミノ酸、砂糖又は非生物学的重合体である請求項３記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 試薬混合物が電磁波、化学的エネルギー
    及び電気化学的エネルギーの組み合わせに曝される請求
    項２又は３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 試薬混合物を、前記化合物の還元を行う
    のに充分な電位と、前記化合物の酸化を行うのに充分な
    電位との間で振動する電位をもつ電極に、連続的に曝す
    請求項２又は３に記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１の化合物の存在を決定するため
    のシステムにおいて、 （ａ）レニウム含有前記化合物を含む試薬混合物； （ｂ）前記化合物が電磁波を発するように誘導するため
    の手段；及び （ｃ）放出された電磁波を検出する手段； を有するシステム。
  8. 【請求項８】 請求項１の化合物に結合する検査したい
    アナライトの存在を決定するためのシステムにおいて、 （ａ）前記化合物； （ｂ）前記化合物を検査したいアナライトと接触させ、
    試薬混合物を形成するための手段； （ｃ）前記化合物が電磁波を発するように誘導するため
    の手段；及び （ｄ）放出された電磁波を検出する手段； を有するシステム。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の化合物及び異なった波
    長の電磁波を発するように夫々誘導することができる一
    種類以上の異なった前記化合物を含む組成物。
  10. 【請求項１０】 前記化合物が夫々異なった検査したい
    アナライトに結合されている請求項９に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 （ａ）試薬混合物を、前記化合物を含
    む適当な条件下で形成し； （ｂ）前記試薬混合物を電磁波エネルギー、化学的エネ
    ルギー又は電気化学的エネルギーに曝すことにより前記
    化合物が電磁波を発するよう誘導し；そして （ｃ）その放出された異なった電磁波を検出し、それに
    よって前記化合物の存在を決定する、 ことからなる請求項９に記載の化合物の存在を決定する
    方法。
  12. 【請求項１２】 （ａ）アナライトと前記化合物とを、
    試薬混合物を形成するような適当な条件下で接触させ； （ｂ）前記試薬混合物を電磁波エネルギー、化学的エネ
    ルギー、電気化学的エネルギーに曝すことにより前記化
    合物が電磁波を発するように誘導し；そして （ｃ）その放出された異なった波長の電磁波を検出し、
    それによって検査したいアナライトの各々の存在を決定
    する； ことからなる請求項９に記載の異なった化合物に選択的
    に結合する一種類以上の検査したいアナライトの存在を
    決定する方法。
  13. 【請求項１３】 多成分液体試料の予め定められた体積
    中で、約１０−３モルより低い濃度でその試料中に存在
    する検査したいアナライトを検出する方法において、 （ａ）請求項１の化合物からなる試薬と試料とを接触さ
    せ、然も、前記試薬は （ｉ）繰り返し電磁波を放出するように前記試薬を誘導
    するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学
    的又は電磁エネルギーに曝すことによって繰り返し電磁
    波を放出するように誘導することができ、そして（ｉ
    ｉ）検査したいアナライトと一緒にすることができ、然
    も、前記接触を、アナライトと前記試薬とを結合するよ
    うな適当な条件で行ない； （ｂ）得られた試料を、繰り返し電磁波を発するように
    前記試薬を誘導するのに有効な量の、適当な源からの化
    学的、電気化学的又は電磁エネルギーに露出し、然も、
    その露出を、繰り返し電磁波を放出するように前記試薬
    を誘導するのに適切な条件下で行い；そして （ｃ）そのようにして放出された電磁波を検出し、それ
    によって試料中の検査したいアナライトの存在を検出す
    る； ことからなる：検出方法。
  14. 【請求項１４】 複数のアナライトが多成分混合物中に
    あり、検査が、 （ｉ）ルテニウム及びレニウム （ｉｉ）オスミウム及びレニウム、又は （ｉｉｉ）ルテニウム、オスミウム及びレニウム を含む電気化学的ルミネッセンス性化合物の組み合わせ
    を用いて前記複数のアナライトに関し同時に行なわれる
    請求項１又は１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 次の式を有する組成物： 〔Ｘ−（Ｙ）ｕ−Ｚ〕ｖ＋（Ｒ）ｗ （式中、Ｘは、一つ以上の同じか又は異なるヌクレオチ
    ド、一つ以上の同じ又は異なるアミノ酸、抗体、検査し
    たいアナライト又は検査したいアナライトのアナローグ
    であり； Ｙは結合基であり、 Ｚは〔Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）
    ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ〔式中、ＰはＲ
    ｅのポリデンテート リガンドであって、ビピリジル、
    ビピラジル、テルピリジル、フェナントロリル、ポリフ
    ィリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピ
    リジル、置換フェナントロリル及び置換ポルフィリンか
    らなる群より選ばれ、そしてこれらの置換されたリガン
    ドは、それぞれ、アルキル、置換アルキル、アリール、
    置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキ
    シレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シ
    アノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボ
    ニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジン、ウレ
    イド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキシスクシ
    ンイミドのカルボキシレートエステルで置換されてお
    り； Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガン
    ドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよく、
    カルボニル、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、
    置換フェナントロリル及び置換ポリフィリンからなる群
    より選ばれ、そしてこれらの置換されたリガンドは、そ
    れぞれ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリ
    ール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシレー
    ト、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、
    アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、
    アミノカルボニル、アミジン、グアニジン、ウレイド、
    硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミ
    ドのカルボキシレートエステルで置換されており； Ｒは陰イオンであり、 ｍは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数であり； ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； そしてｕは０又は整数であり； ｖは０、１、２又は３であり、 ｗは０又は１であり、 Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、当該化
    合物が室温下２００ｍｍから９００ｍｍの範囲の波長の
    電気化学的ルミネッセンスを放出するように誘導するこ
    とができ、Ｒｅのリガンドによって与えられるＲｅへの
    全共有結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及
    び数を有し、但しｗはｖが０の時０である〕。
  16. 【請求項１６】 Ｙが、（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ
    −ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）
    ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−、
    又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（ＣＨ３）２（ＣＨ２）ｎ−Ｃ
    Ｏ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−であり、ｍ、ｎ及びｒは全て
    同じか又は必ずしも同じではなく、各各が１に等しいか
    又はそれより大きな整数である請求項１５に記載の組成
    物。
  17. 【請求項１７】 Ｚが、ビス（２，２′−ビピリジン）
    〔４−ブタン−１−アル）−４′メチル−２，２′ビピ
    リジン〕レニウム、（２，２′−ビピリジン）マレイミ
    ドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−
    ４′−ブチルアミド レニウム、又はビス（２，２′−
    ビピリジン）〔４−メチル−２，２′−ビピリジン−
    ４′−イル〕レニウムである請求項１５に記載の組成
    物。
  18. 【請求項１８】 Ｘがテオフイリンであり、ｕ、ｖ及び
    ｗが１である請求項１５に記載の組成物。
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