JP2538083B2 - 電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法 - Google Patents

電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本願は、1986年４月30日に出願された係属中の米国特
許出願Serial No.858,354のCIP及び1987年４月30日に出
願されたPCT出願Serial No.U.S.87/00987であり、それ
ら出願の内容は本願中に参考のためここ入れてある。
本発明は、金属レニウムを含む電気化学的ルミネッセ
ンス性（electrochemiluminescent）化学的モイエティ
に関する。本願に記載されるレニウム含有化学的モイエ
ティ及びその錯体は、分析試験で使用されるように提案
されてきたトリス−2,2′−ビピリジン ルテニウム（I
I）及び関連する錯体よりも幾つかの利点を有する。こ
れらの利点には：（ｉ）発光量子効率（φｒ）がトリス
−2,2′−ビピリジン ルテニウム（II）誘導体で認め
られているものよりも一般に一層良くなっていること；
（ii）金属からリガンドへの電荷移動（MLCT）励起状態
の性質を、トリス−2,2′−ビピリジン ルテニウム（I
I）誘導体で利用される値よりも一層広い範囲の値内で
選択することができること；及び（iii）ビピリジル及
び非ビピリジル誘導体は両方共検査したいアナライトを
錯体へ接合するのに用いることができるので、合成方法
が簡単で一層経済的なこと；が含まれる。
〔本発明の背景〕
本願中、幾つかの刊行物が（ ）の中に入れたアラビ
ア数字により引用されている。これらの引用の完全な文
献名は、請求の範囲の前の本明細書本文の終わりに記載
してある。これらの刊行物の記載は、本発明が関与する
技術の状態を一層完全に記述するために、本願中に参考
のため入れてある。
化学的、生化学的及び生物学的物質を検出し且つ定量
する迅速で極めて特殊な方法に対する要求が依然として
大きくなりつつある。医薬、代謝物質、微生物及び他の
診断上の価値がある物質の少量を測定する方法は特に価
値がある。そのような物質の例には、麻酔薬及び毒物、
治療のため投与される薬剤、ホルモン、病理性細菌及び
ウイルス、抗体、代謝物質、酵素及び核酸が含まれる。
これらの物質の存在は、多くの生化学的及び生物学的
系を特徴づける高度の特異性を利用した結合方法によっ
て屡々決定することができる。例えば、屡々用いられて
いる方法は、抗原・抗体系、核酸交雑法及び蛋白質・リ
ガンド系に基づいている。これらの方法では、診断上の
価値がある錯体の存在は、典型的には、一種類以上の錯
化用物質に結合された観察可能な「標識（label）」が
存在するかしないかによって示される。選択された特別
な標識法は、屡々検査したい物質を検出するための特別
な系の有用性及び融通性を示している。好ましい標識
は、安価で安全であり、種々の化学的、生化学的及び生
物学的物質に、それらの物質の重要な結合特性を変える
ことなく、効果的に結合することができるのがよい。標
識は、極めて特徴的な信号を与え、自然界では滅多に見
出されず、好ましくは決して見出されないものであるの
がよい。標識は、何カ月にも達する時間に亙って水性系
で安定で且つ検出できるものであるべきである。標識の
検出は、高価な専門的な設備或は人を必要とすることな
く迅速で、敏感で再現性のあるものであるべきである。
標識の定量化は、分析される混合物の温度及び組成の如
き変数には比較的左右されないのがよい。均質な系、即
ち、錯化された標識物質と錯化されていないものとの分
離を必要としない系中で用いることができる標識が最も
有利である。これは、その標識の検出性が、標識が付け
られた物質が特定の複合体中へ組込まれた時変化するな
らば可能である。
夫々特別な利点及び欠点を持つ種々の標識が開発され
ている。例えば、放射性標識は極めて用途の広いもので
あり、非常に低い濃度で検出することができる。しか
し、それらは高価で危険であり、それらの使用には専門
的な設備及び熟練した人が必要である。更に、放射性標
識の感度は、検出事項がその本質的な性質として標識付
けされた物質中の放射性原子一個当たり唯一回しか起き
ないことのために限界がある。更に、放射性標識は均質
な方法では用いることができない。従って、非放射性標
識には大きな関心がもたれている。これらには、分光光
度計、スピン共鳴、及びルミネッセンス法によって観察
できる分子の外、そのような分子を生ずる酵素によって
観察できる分子が含まれる。有用な非放射性標識物質の
中には有機金属化合物がある。生物学的系では或る金属
は希であるため、その有機金属化合物の金属成分を特別
に分析できる方法を成功裡に用いることができる。例え
ば、カイス（Cais）による米国特許第4,205,952号明細
書（1980）には、特異抗原を定量化するのに用いられる
或る有機金属化合物で標識付けした免疫化学的に活性な
物質を使用することが記載されている。これらの標識と
共に、発酵、吸収及び蛍光分光学、原子吸収及び中性子
活性化を含めた、選択された金属を検出するどんな一般
な方法をでも用いることができる。それらの方法は屡々
感度が欠如している欠点を持ち、均質系に対しては滅多
に用いることができず、原子吸収の場合のように、試料
の破壊をもたらすことが時々ある。
特に関心が持たれているものは、光化学的、化学的及
び電気化学的手段によって発光させることができる標識
である。「光ルミネッセンス」は、或る物質が電磁気的
輻射線を吸収した時発光を惹き起こさせる方法である。
蛍光及び燐光は光ルミネッセンスの中に入る。「化学的
ルミネッセンス」法は、エネルギーの化学的転移による
発光物質の生成を伴なう。「電気化学的ルミネッセン
ス」は、発光物質の電気化学的生成を伴う。
これらの発光系は益々重要になって来ている。例え
ば、マンドレ（Mandle）による米国特許第4,372,745号
明細書（1983）には、免疫化学的用途で化学的ルミネッ
センス標識を用いることが記載されている。記載された
系では、標識は、H2O2及びオキサレートとその標識との
反応による如き化学的手段によって発光状態へ励起され
る。これらの系では、H2O2がオキサレートを酸化して高
エネルギー誘導体へ変換させ、それが次に標識を励起す
る。この系は、原理的には分析の酸化条件で安定で、高
エネルギーオキサレート誘導体によって励起することが
できるどのようなルミネッセンス性（luminescent）物
質を用いても有効であろう。残念ながら、この大きな融
通生がその技術の主な制約原因になっている。検査した
いアナライトを含む典型的な生物学的流体は、多量の潜
在的にルミネッセンス性の物質を含み、それがルミネッ
センスの高い水準のバックグランド発光を惹き起こすこ
とがある。
同じ欠点を有する化学的ルミネッセンスの免疫化学的
用法の別の例は、オーベルハルトその他による米国特許
第4,280,815号明細書（1981）にあり、そこには化学的
ルミネッセンス性物質で標識付けされた免疫反応物質に
非常に接近して酸化剤（例えば、H2O2）がその場で電気
化学的に発生することが記載されている。電気的に発生
した酸化剤は化学的ルミネッセンス性物質の方へ拡散
し、それを化学的に酸化し、電気的に発生した酸化剤へ
正味一つ以上の電子を移動させる結果になる。酸化する
と化学的ルミネッセンス性物質はフォトンを放出する。
これに対し、本発明は、電気化学的エネルギー源からの
電子を、繰り返しフォトンを放出することができる化学
的ルミネッセンス性物質へ直接移動させることを必要と
する。
本発明は、電気化学的ルミネッセンス性標識に関す
る。適切は標識は、有機化合物及び有機金属化合物を含
めた電気化学的ルミネッセンス性化合物からなる。標識
付けされた物質の存在を決定する電気化学的ルミネッセ
ンス法は、多くの理由から他の方法よりも好ましい。そ
れらは、特別な標識の存在の診断に極めて役に立ち、感
度が高く、危険がなく、安価であり、極めて広い用途に
利用することができる。適切な電気化学的標識になる有
機化合物には、例えばルブレン及び9,10−ジフエニル
アントラセンが含まれる。多くの有機金属化合物が適切
な電気化学的標識になるが、特に有用なのは、Ru含有及
びOs含有化合物である。
Ru含有及びOs含有有機金属化合物はは文献に論じられ
ている。カイスは、Ruの如き第VIII族の貴金属を含めた
どのような金属元素又は金属元素の組合せでも、原子吸
収法により検出可能な有機金属標識の適切な成分になる
であろうと言うことを開示している（カイスの特許の第
11欄第20行）。しかし、ルテニウムはカイスの好ましい
金属ではなくオスミウムは特に言及されておらず、記載
された方法のいずれについてもRu又はOsを用いた効率に
ついては何のデーターも与えられておらず、好ましい検
出法、原子吸収では試料の破壊を伴っている。
ウエーバー（Weber）による米国特許第4,293,310号明
細書（1981）には、イムノアッセイでのアナライト（分
析剤）のための電気化学的標識としてRu含有又はOs含有
錯体を使用することが記載されている。記載された錯体
は、結合によってアナライトのアミノ基に結合される。
ウエーバーは、それら標識と他のアナライトのヒドロキ
シ基とからカルボン酸エステルが形成される可能性を示
唆している。
標識付けされた物質の存在は、ウエーバーによれば、
光手段を持つ電気化学的流動電池及び消光剤を含む方法
及び装置で決定することができる。光電気化学的に活性
な標識は、光励起により、電子を消光分子へ移動させ、
次に酸化された分子は、適当な電位に保たれた流動電池
の電極からの電子によって還元される。この電子が光電
流として測定される。その系中の遊離の標識付けされた
アナライトの量は、その光電流信号によって決定され
る。この方法は発光物質の電気化学的ルミネッセンス検
出法の逆である。
後の報告で、ウエーバーその他は、Ru含有標識を検出
するのにこの方法を用いることに伴われる問題を論じて
いる。(1)ウエーバーその他(1)の表２には、トリス（ビ
ピリジル）ルテニウム（II）の外挿検出限界は最適条件
下で1.1×10-10モル/Lであることが示されている。これ
らの標識を実際に用いることは錯体混合物の存在下での
測定を伴うであろうと言うことを予想して、ウエーバー
その他は、彼らの系での電位干渉物に付いて試験した。
ウエーバーその他の表３には、恐らく実際的検出限界を
実質的に1.1×10-10モル/Lより高く上昇させるであろう
干渉物として、ジメチルアルキルアミン、EDTA、Ｎ−メ
チルモルホリン、N,N′−ジメチルピペラジン、ヒドロ
キシド、オキサレート、アスコルベート、尿酸及び血清
が列挙されている。これらの研究は簡単なRu含有化合物
で行われた。ウエーバー又はウエーバーその他による報
告には、Ru含有標識で標識付けされた錯体物質を検出す
る限界、或は標識付けされた物質と標識との間のチオ尿
素結合が検査条件で安定であるか否かに付いての研究は
報告されていない。
本発明が関与する特別な標識は電気化学的ルミネッセ
ンス性である。それらは屡々、それら化合物を電磁波又
は典型的なオキサレート−H2O2系によって生ずるような
化学的エネルギー源に露出することにより、それらを酸
化又は還元することなく、発光状態へ励起することがで
きる。更に、これらの化合物のルミネッセンスは、それ
らの酸化及び還元を伴う電気化学的方法によって惹き起
こすことができる。
光ルミネッセンス、化学的ルミネッセンス及び電気化
学的ルミネッセンス手段を用いてRu（2,2′−ビピリジ
ン）3 2+を検出する方法について多くの研究が報告され
ている。（2,3）この研究は、明るいオレンジ色の化学
的ルミネッセンスは、化学的に発生した又は電気的に生
じたRu(bpy)3 3+（式中、“bpy"はビピリジル リガンド
を表す）と、オキサレートイオン又は他の有機酸の酸化
で中間体として生じた強い還元剤との水性反応に基づい
ていることを示している。ルミネッセンスは、電気的に
発生した、又は化学的に生じたRu(bpy)3 1+と、ペルオキ
シジサルフェートの還元中に生じた強い酸化剤との反応
により有機溶媒−H2O溶液中で達成することも出来る。
Ru(bpy)3 2+から電気化学的ルミネッセンスが生ずる第三
の機構には、Ru(bpy)3 1+を生ずるのに充分な負の電位と
Ru(bpy)3 3+を生ずるのに充分な正の電位との間の電極電
位の振動が含まれる。これらの三つの方法は、夫々“酸
化的還元（oxidative reduction）”、“還元的酸化（r
eductive oxidation）”及び“Ru(bpy)3 3+/+再生方式”
と呼ばれている。
酸化的還元法は水中で行なうことができ、酸素又は不
純物の存在に比較的不感性で、強く効率的で安定なルミ
ネッセンスを生ずる。Ru(bpy)3 2+からのこのルミネッセ
ンスは、オキサレート又は、ピルベート、ラクテート、
マロネート、タートレート及びシトレートの如き他の有
機酸の存在及びRu(bpy)3 3+を酸化的に生ずる手段に依存
する。この酸化は、PbO2又はCe（IV）塩の如き強い酸化
剤によって化学的に達成することができる。それは、連
続的に又は間欠的に適用される充分に正の電位によって
電気化学的に達成することができる。Ru(bpy)3 2+の電気
化学的酸化に適した電極は、例えば、Pt、熱分解黒鉛及
びガラス状炭素である。オキサレート又は他の有機酸は
化学的ルミネッセンス中消費されるが、反応室中で消費
される物質を過剰存在させることにより何時間も強く一
定の化学的ルミネッセンスを得ることができる。
還元的酸化法は、例えば、アセトニトリルの如き有機
共溶媒を含む部分的に水性の溶液中で行なうことができ
る。このルミネッセンスはペルオキシジサルフェートの
存在及びRu(bpy)3 1+物質を還元的に生ずる手段に依存す
る。還元は、例えば、マグネシウム又は他の金属の如き
強い還元剤によって化学的に行なうことができる。それ
は、連続的又は間欠的に適用される充分に負の電位によ
って電気化学的に行なうことができる。Ru(bpy)3 2+の電
気化学的還元に適した電極は、例えば、研磨したガラス
状炭素電極である。酸化的還元法の場合のように、過剰
の反応物を含有させるか、反応混合物へ消費される反応
物を連続的に添加することにより連続的で強いルミネッ
センスを何時間も得ることができる。
Ru(bpy)3 3+/+再生方式は、アセトニトリルの如き有機
溶媒中又は部分的に水性の系中で、Ru(bpy)3 2+を還元す
るのに充分な負の電位とRu(bpy)3 2+を酸化するのに充分
な正の電位との間の電極でをパルス化することにより行
なうことができる。そのような再生方式に適した電極
は、例えばPt電極である。この方式は化学的反応物を消
費せず、原理的に際限なく進行させることができる。
ルミネッセンス性Ru含有化合物を生成させるこれら三
つの方法では、共通してRu含有化合物の酸化的還元又は
還元的酸化が反復して行なわれる。従って、これら化合
物を含有する溶液のルミネッセンスは、適用されるエネ
ルギー源の電位に高度に依存し、従って、Ru含有化合物
の存在の診断に極めて役立つものである。
マンドレはカーチス（Curtis）その他(4)を化学的ル
ミネッセンス用の可能な標識として引用している。カー
チスその他は、Ru錯体を、オキサレート／H2O2系によっ
て化学的に励起された時、光を発するように誘導するこ
とができると言う未公表の観察だけを報告している（カ
ーチスその他、p.350）。マンドレもカーチスも、化学
的ルミネッセンスの用途或は電気化学的ルミネッセンス
方式の利用で、ルテニウム及びオスミウムの錯体が異常
な有用性を持つことに気が付いていない。
シュプリントシュニック（Sprintschnik）G.その他
(5)は、オクタデカノール又はデヒドロコレステロール
でエステル化されたトリス（2.2′−ビピリジン）ルテ
ニウム（II）の錯体を記述し、これら表面活性剤錯体の
単分子層膜を創っている。これら錯体は光ルミネッセン
ス性である。しかし、それらの膜を水に曝し、次に光に
当てると、Ru錯体は光ルミネッセンス性を失う。これは
光の存在下でのエステル基の光加水分解に起因する。
親出願の米国特許出願Serial No.858.354及びPCT87/0
0987に記載されているように、検査したい種々のアナラ
イト及びそれら検査したいアナライトに結合する化学的
物質は、アミド又はアミン結合によってRu含有又はOs含
有標識に都合よく付けることができるであろう。次にそ
れら標識付けされた物質を、種々の手段のいずれかによ
って検出することができるが、今までの所最も効率的で
信頼性のある感度の高い手段は、光ルミネッセンス、化
学的ルミネッセンス及び電気化学的ルミネッセンスによ
る手段である。Ru含有及びOs含有標識を含む電気化学的
ルミネッセンス性標識は特に融通性があり、有利であ
る。
〔本発明の要約〕 本発明は、次の式を有する化学的モイエティ（moiet
y）にある： ［Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s］ｔ（Ｂ）ｕ
（Ｉ） 〔式中、ＰはReのポリデンテート（polydentate）リガ
ンドであり；L1、L2、L3、L4、L5及びL6はReのリガンド
で、その各々は互いに同じでも異なっていてもよく;Bは
Reのリガンドであるか、又はＰ、L1、L2、L3、L4、L5又
はL6の一つ以上に共役している物質であり;mは１に等し
いか又はそれより大きい整数であり;n、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ
及びｓの各々は０又は整数であり;tは１に等しいか又は
それより大きい整数であり;uは１に等しいか又はそれよ
り大きい整数であり;P、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢ
は、前記化学的モイエティが電磁波を放出するように誘
導することができ、Reのリガンドによって与えられるRe
への全結合数がReの配位数に等しいくなるような組成及
び数を有する〕。
この化学的モイエティの特に好ましい例は、次のもの
からなる： 〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも異なっていて
もよく、Ｘ及びＸ′はN(CH2H5)2、CH3、CH3O、C6H5、C
1、CO2CH3、CN、又はNO2でよく、Ｙ及びＹ′はＨ又はCH
3でもよく、もしＸとＸ′及びＹとＹ′が同じで、ＸがC
O2CH3であるならば、ＹはＨではなく、更にもしＸと
Ｘ′及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及びＹがＨで
はなく；そしてＲは陰イオンである〕。
金属レニウムを含有する電気化学的ルミネッセンス性
化学的モイエティの主な利点の第一は、これらのモイエ
ティの製造が容易なことである。ビピリジル及び非ビピ
リジル誘導体の両方を、それらモイエティの合成に用い
ることができ、検査したいアナライトと接合（conjugat
e）するこれらのモイエティの最終的機能のために用い
ることができる。
同様なRu（II）錯体に対し、Re（Ｉ）錯体によって与
えられる更に重要な利点は、Reへ結合するリガンドの一
つ以上の置換基を選択することにより、可視スペクトル
領域（即ち、500nm〜800nm）の殆どに亙ってRe（Ｉ）錯
体による発光波長（即ち色）を調節することができるこ
とである。この性質の原因は、それら錯体の量子力学的
性質に存在する。これらの錯体の量子効率もRe（II）の
ものより優れている。
Re錯体は、式Ｉを有する化学的モイエティの存在を検
出するための方法で用いられる。その方法は広義には：
（ａ）試薬混合物を、Re含有化学的モイエティを含む適
当な条件下で形成し；（ｂ）前記試薬混合物を化学的エ
ネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波エネルギー
に曝すことにより前記モイエティが電磁波を発するよう
に誘導し；そして（ｃ）その放出された電磁波を検出
し、それによって前記化学的モイエティの存在を決定す
ることからなる。
本発明のこれらの方法には、化学的モイエティが化学
物質と結合し、即ち、化学物質と特別な複合体を形成す
ることができる場合のそのモイエティを検出することが
含まれる。
式Ｉを有する化学的モイエティに結合する検査したい
アナライトの存在を決定するための方法も、アナライト
と化学的モイエティが競争的に相補的物質に結合する場
合に、検査したいアナライトの存在を決定する方法と同
様に記述される。
本発明は、検査したいアナライトの存在又はその量
を、多成分液体試料の予め定められた体積中で検査する
方法にもあり、それは：（ａ）レニウム含有化合物を含
む電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを有す
る試薬と試料とを接触させ、然も、前記化合物は（ｉ）
前記試薬が繰り返し輻射線を発するように誘導するのに
有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電
磁気的エネルギーに曝すことによって繰り返し電磁波を
発するように誘導することができ、そして（ii）検査し
たいアナライトと前記試薬とを結合するような適当な条
件で接触を行なうことにより、前記アナライトと結合す
ることができ；（ｂ）得られた試料を、前記試薬が輻射
線を繰り返し発するように誘導するのに有効な量の、適
当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気的エネルギ
ーに露出し、然もその露出を、前記試薬が電磁波を繰り
返し発するように誘導するのに適切な条件下で行い；そ
して（ｃ）そのようにして放出された電磁波の量を検出
又は定量的に測定し、それによって試料中の検査したい
アナライトの存在を検出し、或は定量することからな
る。
本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中
で、その試料中に存在する検査したいアナライトの存在
又はその量を検出する方法にもあり、それは：（ａ）レ
ニウム含有化合物を含む電気化学的ルミネッセンス性化
学的モイエティを有する試薬と試料とを接触させ、然
も、前記化合物は（ｉ）前記試薬が繰り返し輻射線を発
するように誘導するのに有効な量の、適当な源からの化
学的、電気化学的又は電磁気的エネルギーに曝すことに
よって繰り返し電磁波を放出するように誘導することが
でき、そして（ii）試料中には通常存在しない相補的物
質の結合部位を求めて、検査したいアナライトと、その
相補的物質と共に、競争することができるような化合物
であり、然も、前記接触は、検査したいアナライトと前
記試薬とを前記相補的物質に競争的に結合するような適
当な条件で行ない；（ｂ）得られた試料を、前記試薬が
輻射線を繰り返し発するように誘導するのに有効な量
の、適当な源からの電気化学的エネルギーに露出し、然
もその露出を、前記試薬が繰り返し電磁波を発するよう
に誘導するのに適切な条件下で行い；そして（ｃ）その
ようにして放出された電磁波の量を検出又は定量的に測
定し、それによって試料中の検査したいアナライトの存
在を検出し、或は定量することからなる。
本発明は、液体食物又は食物ホモジェネート中の種々
の検査したいアナライトの存在又はその量を検出し、同
定する方法にもある。その方法は：（ａ）液体食物又は
食物ホモジェネート中に、液体又は固体懸濁物中へ浸漬
するのに適した診断薬保持体で、複数の試薬がそれに固
定されている診断薬保持体の一部を浸漬し、然も、前記
試薬の各々は、前記診断薬保持体に明確に区別できる領
域に固定されており、検査したい唯一つのアナライトと
複合体を形成し、固体された試薬−検査したいアナライ
ト複合体を形成することができ；（ｂ）前記液体食物又
は食物ホモジェネートから前記診断薬保持体を取り出
し；（ｃ）前記診断薬保持体を適当な濯ぎ溶液で濯ぎ；
（ｄ）前記固定試薬−検査したいアナライト複合体を含
む前記診断薬保持体の一部を検出溶液へ浸漬し、然も、
その溶液は前記固定試薬−検査したいアナライト複合体
との複合体を形成することができる少なくとも一つの検
出試薬を含み、固定試薬−検査したいアナライト−検出
試薬複合体を形成することができ；（ｅ）診断薬保持体
の前記区別可能な領域上の、固定試薬−検査したいアナ
ライト−検出試薬複合体の存在を検出し、それによって
前記液体食物又は食物ホモジェネート中の複数の検査し
たいアナライトの存在又は量を検出し且つ同定すること
からなる。
〔図面の簡単な説明〕
第１図は、本発明のRe含有モイエティを製造するため
の方法の概略的工程図である。
第２図は、オスミウム含有内部標準物質の電気化学的
ルミネッセンス強度に与えるレニウム含有キャリブラン
ト（calibrant）の濃度の影響を示す較正グラフであ
る。
第３図は、レニウム含有キャリブラントの電気化学的
ルミネッセンスに与えるオスミウム含有内部標準物質の
影響を示す曲線を示す図である。
〔本発明の詳細な記述〕
新規なRe含有化学的モイエティ 本発明は、次の式を有する化学的モイエティにある： ［Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s］ｔ（Ｂ）ｕ
（Ｉ） 〔式中、ＰはReのポリデンテートリガンドであり；L1、
L2、L3、L4、L5及びL6はReのリガンドでその各々は違い
に同じでも異なっていてもよく;BはReのリガンドである
か、又はＰ、L1、L2、L3、L4、L5又はL6の一つ以上に共
役している物質であり;mは１に等しいか又はそれより大
きい整数であり;n、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又
は整数であり;tは１に等しいか又はそれより大きい整数
であり;uは１に等しいか又はそれより大きい整数であ
り;P、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、前記化学的モ
イエティが電磁波を放出するように誘導することがで
き、Reのリガンドによって与えられるReへの全結合数が
Reの配位数に等しくなるような組成及び数を有する〕。
この化学的モイエティは、Reの少なくとも一つのポリ
デンテート リガンドをもたなければならない。もしそ
のモイエティが一つより多くのポリデンテート リガン
ドを有するならば、それらポリデンテート リガンドは
同じでも異なっていてもよい。ポリデンテート リガン
ドには芳香族及び脂肪族リガンドが含まれる。適当な芳
香族ポリデンテート リガンドには、芳香族複素環リガ
ンドが含まれる。好ましい芳香族複素環リガンドは、例
えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナ
ントロイル及びポルフィリンの如く窒素を含有する。
適当なポリデンテート リガンドは、当分野で知られ
ている多くの置換基のいずれかによって置換されていて
もいなくてもよい。適当な置換基には、例えば、アルキ
ル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキ
ル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシア
ルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキ
シ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ
ル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、マレイミド、
硫黄含有基、燐含有基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドのカルボキシレートエステルが含まれる。
更に、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも一つ
は、ポリデンテート芳香族複素環リガンドであってもよ
い。更に、これらポリデンテート芳香族複素環リガンド
の少なくとも一つは窒素を含んでいてもよい。適当なポ
リデンテート リガンドには、ビピリジル、ビピラジ
ル、テルピリジル、フェナントロイル、ポルフィリン、
置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル、
置換フェナントロイル又は置換ポルフィリンが含まれる
がそれに限定されるものではない。これらの置換ポリデ
ンテート リガンドは、アルキル、置換アルキル、アリ
ール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カ
ルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミ
ド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシ
カルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニ
ウム、ウレイド、マレイミド、硫黄含有基、燐含有基又
はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエ
ステルで置換されてもよい。
本発明の一つ態様として、化学的モイエティは二つの
ビデンテート（bidentate）リガンドを含み、その各々
はビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナント
ロイル、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピ
リジル、又は置換フェナントロイルである。
本発明の別な態様として、化学的モイエティは三つの
ビデンテートリガンドを含み、その各々はビピリジル、
ビピラジル、テルピリジル、フェナントロイル、置換ビ
ピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル、又は置
換フェナントロイルである。本発明の更に別な態様とし
て、二つのビデンテート ビピリジル リガンド、及び
一つ置換ビデンテート ビピリジル リガンドを用いて
もよい。
本発明の更に別の態様として、化学的モイエティはポ
ルフィリン又は置換ポルフィリンの如きテトラデンテー
ト リガンドを含んでいる。
この化学的モイエティは一つ以上のモノデンテート
リガンドを持っていてもよく、その種々のものが当分野
で知られている。適当なモノデンテート リガンドに
は、例えば、一酸化炭素、シアン化物、イソシアン化
物、ハロゲン化物、及び脂肪族、芳香族及び複素環ホス
フィン、アミン、スチルビン及びアルシンが含まれる。
適当なリガンドには、次の構造を持つ化合物が含まれ
る： （式中、ｎは整数である）。好ましい態様として、ｎは
２である。
別の適当なリガンドは次の構造を持つ化合物である： （式中、ｎは整数である）。好ましい態様として、ｎは
３である。
別なリガンドは次の構造を持つ化合物である： （Ｙは結合腕である）。一つの態様として、Ｙは次の構
造を持つ： (CH2)m-NH-CO(CH2)n （式中、ｍ及びｎは、同じでも異なっていてもよく、１
に等しいか又はそれより大きな整数である）。本発明の
一つ態様として、ｍは３であり、ｎは２である。
更に別なリガンドは次の構造を持つ化合物である： （式中、ｍ及びｎは整数であり、同じでも異なっていて
もよい）。本発明の一つ態様として、ｍ及びｎは共に１
である。
好ましいレニウム含有モイエティ 本発明の好ましいレニウム含有モイエティは、次の式
を持つ： 〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも異なっていて
もよく、Ｘ及びＸ′はN(CH2H5)2、CH3、CH3O、C6H5、C
l、CO2CH3、CN、又はNO2でよく、Ｙ及びＹ′はＨ又はCH
3でよく、もしＸとＸ′及びＹとＹ′が同じで、ＸがCO2
CH3であるならば、ＹはＨではなく、更にもしＸとＸ′
及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及びＹがＨではな
く；そしてＲは陰イオンである〕。有利に用いられる化
合物は、Ｘ及びＹが下の表１に示されているような化合
物である。製造方法、収率及びλ(CH3CN)も示されてい
る。
分光データーは次の表に与えられている。
本発明の適切な化合物は次の構造を持つ （式中、ｎは整数であり、好ましくは２又は３であり、
ｍは１、２又は３であり、好ましくは１であり、ＷはCH
O、COOH、NH2又はBrであり、Ｒは陰イオンである）。ビ
ピリジル基は上で述べた如く、置換されていてもいなく
てもよい。
一つの化合物は次の通りである： （式中、Ｒは陰イオンであり、ｎは好ましくは２又は３
である）。
別の化合物は次の通りである： （式中、ｎは２又は３である）。
更に、別の化合物は次の通りである： （式中、ｎは２又は３である）。
更に、別の化合物は次の通りである： （式中、ｎは２又は３である）。
これらの化合物は次の構造を有する組成物からなって
いてもよい： X-（Ｙ）n-Z （式中、Ｘは、一つ以上の同じか又は異なるヌクレオチ
ド、一つ以上の同じ又は異なるアミノ酸、抗体、検査し
たいアナライト又は検査したいアナライトのアナローグ
を表し、ＹはＺに結合する結合基を表し、ｎは整数を表
し、Ｚは本発明によって与えられる化合物を表す）。Ｘ
は、例えば、テオフィリン、ジゴキシゲニン、又はhCG
から誘導されたペプチドでもよい。
本発明によって次の構造を有する組成物も与えられ
る。
X-CH＝CH-CO-NH（CH2）n-NH-CO-（CH2）n-Z （式中、Ｘは一つ以上の同じか又は異なるヌクレオチド
を表し、 Ｚは電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを
表し、 ｎは１に等しいか又はそれより大きな整数を表し、そ
して ｍは１に等しいか又はそれより大きな整数を表す）。
本発明の一つ態様として、Ｚはビス（2,2′−ビピリ
ジン）［４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−2,
2′−ビピリジン］レニウムである。
本発明の更に別の態様として、チミジン ヌクレオチ
ドは、ヌクレオチド配列 TCACCAATAAACOGCAAACACCATCCOGTCCTGCCAG に結合した３′末端ヌクレオチドである。
次の構造を有する組成物も与えられる： ［T-Y-Z］1+（Ｒ） （式中、Ｔはテオフィリンを表し、ＹはＺに結合する結
合基を表し、Ｚはビス−（2,2′−ビピリジン）［４−
メチル−2,2′−ビピリジン−４′−イル］（Ｉ）を表
し、Ｒは陰イオンを表す）。
本発明の一つ態様として、ＹはＴの８位置の炭素に結
合している。本発明の更に別の態様として、Ｙは次の構
造を有する： （CH2）m-CO-NH-（CH2）ｎ （式中、ｍ及びｎは同じか又は異なる１に等しいか又は
それより大きな整数を表す）。本発明の別の態様とし
て、ｍは３であり、ｎは４である。本発明の別の態様と
して、ｍ及びｎは両方共３である。
本発明の更に別の態様として、Ｙは次の構造を有する （式中、ｍ、ｎ及びｒは、同じか又は異なる１に等しい
か又はそれより大きな整数を表す）。本発明の一つの態
様として、ｍは１であり、ｎは１であり、ｒは４であ
る。
本発明の更に別の態様として、ＹはＴの７の位置の窒
素に結合している。本発明の一つの態様として、Ｙは次
の構造を有する： （CH2）ｎ （式中、ｎは１に等しいか又はそれより大きな整数を表
す）。本発明の更に別の態様として、ｎは４である。
次の構造を有する組成物も本発明に含まれる。
X-Z （式中、Ｘは、システイン又はメチオニンである少なく
とも一種類のアミノ酸を含み、同じか又は異なる一つ以
上のアミノ酸を表し、Ｚは、システイン又はメチオニン
の硫黄置換基へマレイミドの３又は４位置の炭素によっ
て結合したビス（2,2′−ビピリジン）マレイミドヘキ
サン酸、４−メチル−2,2′−ビピリジン−４′−ブチ
ルアミドレニウムである。
Reのリガンドの一つ以上が、例えば、放射性アイソト
ープ、蛍光成分、又は付加的ルミネッセンス性ルテニウ
ム含有又はオスミウム含有中心の如き付加的な化学的標
識に結合される場合も本発明の範囲に入る。
標識付けされた物質（Ｂ）が、一つより多くの、例え
ば、二つ、三つ、四つ又はそれ以上の電気化学的ルミネ
ッセンス中心によって標識付けされる場合も本発明の範
囲に入る。
適当な物質（Ｂ）には、多くの生物学的物質、例え
ば、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、蛋白質、脂質蛋白
質、糖質蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、リポ多糖
類、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビツレー
ト、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及
び砂糖が含まれる。全細胞は動物、植物又は細菌のもの
でもよく、生きてるものでも死んでいるものでもよい。
例として菌類及び線虫類の如き植物病原菌が含まれる。
本明細書中、用語「細胞内（subcellular）粒子」と
は、細胞内の細胞器官、破壊した細胞からの膜粒子、細
胞壁断片、リボソーム、多酵素複合体、及び生きている
有機体から導くことができる他の粒子を意味する。また
本明細書中、「核酸」とは染色体DNA、プラスミドDNA、
ウィルスDNA、及び種々の源から誘導された組替えDNAを
意味する。また核酸には、RNA、例えば、メッセンジャ
ーRNA、リボソームRNA及びトランスファーRNAが含まれ
る。ポリペプチドには、例えば、酵素、輸送蛋白質、レ
セプター蛋白質、及びウィルス外皮蛋白質の如き構造蛋
白質が含まれる。好ましいポリペプチドは酵素及び血清
から誘導された抗体である。特に好ましいポリペプチド
はモノクローナル抗体である。ホルモンには、例えばイ
ンシュリン及びT4チロイド ホルモンが含まれる。薬理
学的薬剤には、例えば強心薬糖体が含まれる。合成ペプ
チド、合成核酸、及び合成の膜、小胞及びリポソームの
如き生物学的物質に化学的に類似した合成物質を含める
ことも本発明の範囲に入る。上述したことは、本発明で
用いるのに適した生物学的物質の包括的リストにするこ
とを意図しているのではなく、本発明の広い範囲を単に
例示しているだけである。
重合体材料を含めた意識付けした非生物学的物質を含
むことも本発明の範囲内に入る。これらの物質は可溶性
重合体分子の形でもよく、或は、例えばビーズ、或は試
験管、瓶、試験容器等のような容器の如き種々の既知の
巨大な形をしたもののいずれかの形をしていてもよい。
生物学的及び非生物学的物質（Ｂ）はReのリガンドに
共役していてもよい、その共役はアミド又はアミン結合
による。それら結合は、物質（Ｂ）がアミド結合のカル
ボニル又は窒素に直接結合するように配向していてもよ
い。これらの化学的モイエティはイオン化していてもよ
い。そのような場合には、その化学的モイエティの形成
電荷を中和するのに多くの異なった反対イオンを有する
ものが役立つことは当業者には分かるであろう。適当な
陽イオンには、例えば、H+、NH4 +、グアニジニウム、Ag
+、Li+、Na+、K+、Mg2+、Mn2+及びCd2+が含まれる。適
当な陰イオンには、例えば、ハロゲン化物、OH-、炭酸
塩、SO4 2-、ヘキサフルオロホスフェート及びテトラフ
ルオロボレートが含まれる。
Re含有モイエティの利点 金属レニウムを含む電気化学的ルミネッセンス性化学
的モイエティの主な利点は、それらモイエティを製造し
やすいことにある。ビピリジル及び非ビピリジル誘導体
の両方共、それらモイエティの合成、及び検査したいア
ナライトに共役するそれらモイエティの最終的機能で用
いることができる。
レニウムモイエティは、３、４又は５工程を必要とす
るオスミウム及びルテニウム錯体とは対照的に２工程法
で合成することができる。第１図は本発明のレニウム含
有モイエティを製造するのに用いられる二つの方法工程
を概略的に示している。
第１図に関し、ルミネッセンス性Re（Ｉ）錯体を製造
するための出発材料はRe(CO)5Clである。希望のRe
（Ｉ）錯体の合成には二つの工程が含まれている。第一
の工程では、キレート性2,2′−ビピリジン リガンド
によってCOを置換して平面異性体（facial isomer）、f
ac-(L)Re(CO)3Clを生成させる。Ｌはキレート性2,2′−
ビピリジン リガンドで、例えば、bpy、Cl2bpy、(CO2C
H3)2bpy、(NO2)2bpy、Me2bpy、Ph2bpy、(CH3O)2bpy、Me
4bpy、或は(MEt2)2bpyである。
fac-(L)Re(CO)3の対応するfac-(L)Re(CO)3（Etpy）
（RK（式中、ＲはCF3CO3 -、PF6 -、ClO4 -である）への転
化は、酸法か又は銀法によって達成することができる。
酸法は、強い酸性媒体に対し不感性、即ち安定なビピ
リジル リガンドにとって有用である。それには、中間
体Re（Ｉ）トリフレート物質を製造し、分離し、次に４
−ピリジルエタン誘導体に転化することが含まれる。
銀法は極めて酸性の環境中で分解を受けやすいビピリ
ジルリガンドを含む錯体、例えば、Ｌ＝(CH3O)2bpy又は
(COOCH3)2bpyの場合に用いられる。この方法では、可溶
性銀トルフルオロメタンスルホネート塩をfac-(L)Re(C
O)3Cl物質と反応させ、fac-(L)Re(CO)3(O3SCF3)モイエ
ティ及び不溶性AgClを形成させる。過によりAgCl沈澱
物を除去した後、溶液をその場で４−ピリジルエタンと
反応させ、希望の生成物を生成させる。
ここに記載するRe（Ｉ）錯体によって与えられる、同
様なRu（II）錯体に勝る他の重要な利点は、Re（Ｉ）錯
体の発光波長（即ち色）を可視スペクトル範囲の殆ど
（即ち、500nm〜800nm）に亙って調節することができる
それらの能力に関する。この性質の原因は、それら錯体
の発光機構の量子力学的特性にある。
Ru（II）錯体のルミネッセンス機構の量子力学的分析
では、（１）僅かな例外を除いて、流体溶液中で室温ル
ミネッセンスが観察されるためには、Ru（II）へ三つの
キレート性ビピリジル又はフェナントロイル型リガンド
を配位させることが必要であり；（２）発光状態に近い
エネルギーで存在する量子状態は、Ru（II）錯体から得
られるルミネッセンス強度を制限し；（３）キレート性
ビピリジル又はフェナントロイル リガンドに置換基を
入れても、Ru（II）錯体の発光エネルギーにほんの僅か
な変化しか与えず；（４）Ru（II）錯体では最大発光波
長が増大すると、一般に発光効率が低下する；ことが示
されている。これらの因子は流体溶液中室温で利用可能
な波長範囲を580nm〜750nmへ制限している。
レニウム錯体の発光機構についての同様な分析では、
（１）室温流体溶液中での発光には、Re（Ｉ）中心に僅
か一つの配位ビピリジル又はフェナントロイル リガン
ドが存在しさえすればよいことが示されている。三つの
COリガンドも必要であるが最終的モノデンテート配位リ
ガンド（例えば、Cl、ピリジン、CH3CN等）の選択には
かなりの余裕がある。最大発光波長は、このモノデンテ
ート リガンドの種類及びキレート性ビピリジル又はフ
ェナントロイルモノイエティの置換模様によって調節さ
れる。このことが一つには、Ru（II）錯体よりもこれら
の錯体の場合に一層広い範囲の発光波長を利用できる結
果を与えている。
Re（Ｉ）錯体の場合には、発光を妨げることがある発
光状態に近いエネルギーを持つ量子状態は存在しない。
これに対しRu（II）錯体の場合には、最大発光波長が増
大するに従って一般に発光効率は低下する。
即ち、Re（Ｉ）錯体の利用可能な発光波長範囲は約50
0nm〜800nmである。Ru（II）錯体よりもRe（Ｉ）錯体の
ほうが赤色応答が僅かに増大しているのは、主にRu（I
I）発光スペクトルよりもRe（Ｉ）発光スペクトルのほ
うが幾らか増大した広さをもつことに起因する。
このように、Re（Ｉ）錯体はRu（II）化合物に比較し
て広い範囲の利用可能な発光波長を有する。Re（Ｉ）錯
体の独特な構造によって、Ru（II）錯体で可能になるよ
りも、一層大きな融通性が得られ、且つ錯体の構造的変
更による希望の最大発光波長を一層選択し易くなってい
る。Ru（II）よりもRe（Ｉ）の方が利用できる発光波長
の範囲が広くなっていることにより、幾つかのルミネッ
センス性Re（Ｉ）物質の溶液中の一つのRe（Ｉ）錯体に
よる発光を、競合するRe（Ｉ）ルミネッセンス発光体に
よる干渉及び誤差を最小にして測定することができる。
Re含有モイエティを用いた改良された検査方法 本発明は、式Ｉを有する化学的モイエティの存在を決
定する方法にもある。その方法は：（ａ）試薬混合物を
Re含有化学的モイエティを含む適当な条件下で形成し；
（ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネ
ルギー又は電磁波エネルギーに曝すことにより前記部分
が電磁波を発するように誘導し；そして（ｃ）その放出
された電磁波を検出し、それによって前記化学的モイエ
ティの存在を決定することからなる。
試薬混合物を形成するのに適切な条件は、当業者に知
られおり、含まれる試薬混合物の種類に依存するであろ
う。例えば、水性試薬混合物に適した条件には、化学的
モイエティ、酸化剤の如き他の試薬の適切な濃度、pH、
塩濃度等が含まれるであろう。固体試料の場合、試薬混
合物を形成するために適した条件には、伝導性液体の添
加が含まれるであろう。本発明の方法には、化学的モイ
エティが化学物質と結合することができ、即ち、化学物
質と特別な錯体を形成することができるその部分よう
な、化学的モイエティを検出する方法が含まれる。適当
な化学物質には、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核
酸、多糖類、蛋白質、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多
糖類、脂質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモ
ン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビツレー
ト、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及
び砂糖或は非生物学的重合体が含まれる。本発明の一つ
の態様として、化学物質は検査容器の表面に固定されて
いてもよい。別の態様として、化学物質は血清から誘導
された抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。特
に重要なものは抗体−抗原対物質である。この結合方法
は、例えば、血液、尿又は合成反応混合物の如き複雑な
混合物中のジゴキシン又はジギトキシンの如き標識付け
された抗原の存在を、先ずその混合物を、検査したい抗
原に対し特異性の固定された抗体に曝し、次にその固定
された抗体に結合した標識付けされた物質の量を測定す
ることにより決定するのに用いることができる。
本発明には、式Ｉを有する化学的モイエティに結合す
る検査したいアナライトの存在を決定するための方法に
も含む。その方法は：（ａ）試薬混合物を、Re含有化学
的モイエティを含む適当な条件下で形成し；（ｂ）試薬
混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は
電磁波エネルギーに曝すことにより前記モイエティが電
磁波を発するように誘導し；そして（ｃ）その放出され
た電磁波を検出し、それによって検査したいアナライト
の存在を決定することからなる。アナライト及び、式Ｉ
を有する化学的モイエティが競争的に相補的物質に結合
する場合に検査したいアナライトの存在を決定する方法
も与えられる。“相補的物質”とは、検査したいアナラ
イトと検査したい標識付けされたアナライト又は検査し
たいアナライトの標識付けされたアナローグの両方と複
合体を形成することができる物質を意味する。その方法
は：（ａ）相補的物質、Re含有化学的モイエティを含む
化学的モイエティ、及びアナライトを試薬混合物を形成
するような適当な条件下で接触させ；（ｂ）試薬混合物
を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波
エネルギーに曝すことにより前記化学的モイエティが電
磁波を発するようにさせ；そして（ｃ）その放出された
電磁波を検出し、それによって検査したいアナライトを
決定することからなる。
“電磁波を発生するよう誘導し”と言う言葉は、外囲
温度で200ナノメーター（nm）〜900nmの波長で発光する
化学的モイエティの励起状態を創りだすことを意味す
る。リガンドの化学的構造の変化は、発光励起状態を創
りだすのに必要な入力エネルギーの値を変化させる。同
様に、放出される電磁波の波長は、レニウム含有物質の
性質及び環境に依存する。
一般に光ルミネッセンス励起及び発光は、約200nm〜
約900nmの波長の電磁波で起きる。同様に、化学的ルミ
ネッセンス及び電気化学的ルミネッセンス発光は、一般
に約200nm〜900nmの波長の放出電磁波で起きる。化学的
モイエティの還元又は酸化が起きる電位は、その正確な
化学的構造の外、溶液のpH及び用いられる電極の性質の
如き因子に依存する。光ルミネッセンス系中の最適発光
及び励起波長及び、電気化学的ルミネッセンス及び化学
的ルミネッセンス系の最適電位及び発光波長の決定の仕
方は良く知られている。
存在するルミネッセンス性物質の量を定量する多くの
方法がある。系へのエネルギーの入力率はルミネッセン
ス物質の尺度を与える。例えば、適当な測定方法にはル
ミネッセンス性物質が電気化学的に発生した時の電流の
測定、ルミネッセンス性物質が化学的発生した時の還元
体又は酸化体の使用速度、或は光ルミネッセンス法での
電磁波エネルギーの吸収が含まれる。更に、ルミネッセ
ンス性物質は、放出された電磁波を測定することによっ
て検出することができる。これらの測定方法は、全て連
続的、レート依存（rate-based）測定、或は長い時間に
亙って信号を追加する累積法として行うことができる。
レート依存測定は、光電子増倍管、光ダイオード、光ト
ランジスターを用いて、入射光強度に大きさが比例した
電流を生ずるように行なわれるか、又は電荷結合装置を
用いて行うことができる。累積法の例は、レート依存デ
ーターの積分及び累積データーを直接与える写真フイル
ムの使用がある。
これらのルミネッセンスに基づく方法は、全てレニウ
ム含有化合物によって繰り返えされるルミネッセンスを
用いている。検出可能な事項のこの反復性により、これ
らの標識を、放射性アイソトープ又はルミノールの如き
結合化学的ルミネッセンス性分子から区別することがで
きる。後者の標識は、標識分子（又は原子）一つ当たり
唯一回しか検出可能な事項を生ぜず、そのためそれらの
検出性が制約されている。
これらの方法に有用な化学的モイエティ中に生物学的
及び非生物学的物質Ｂを、Reに直接配位させるか、又は
Reのリガンドに結合することによりそれらの部分中に組
み込むことができる。結合は共有結合、又は静電気的又
は水素結合により行われてもよい。物質ＢをReのリガン
ドに共有結合させる多くの手段が利用できる。例えば、
結合は、アミド又はアミン結合、エステル又はチオエス
テル、エーテル又はチオエーテル、又は当分野で知られ
ている多くの結合のいずれかでよい。結合の種類は、リ
ガンドの置換基、及び標識付けされる物質のリガンドと
結合するのに用いられる適当な化学基によって決定され
るであろう。
検査したいアナライトと化学的モイエティは、特別な
仕方で一緒に結合することができるどのような対になっ
た物質でももよい。そのような物質には、例えば、全細
胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質、糖
質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、ペ
プチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トラ
ンキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステロ
イド、ビタミン、アミノ酸、砂糖及び非生物学的重合体
が含まれる。特に重要なものは抗体−抗原対である。本
発明の一つの態様として、細胞表面抗原の存在を決定す
るため、或は細胞分類法によって検出するのに特別の細
胞に標識付けするために、標識付けされた抗体を使用す
ることが含まれる。例えば、固定された標識のない抗体
に取り付けることにより固定された抗原は、「はさみ
（sandwich）」法として一般に知られている方法で標識
付けされた抗体によって検出することができる。
本発明の一つの態様として、Ｂはヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドである。他の態様として、Ｂは血清から
誘導された抗体又はモノクローナル抗体である。
競争結合検査方法では、Ｂは検査したいアナライト又
はアナライトのアナローグと同じ物質で、相補的物質と
特異性複合体を形成するのに関与することができるもの
でよい。そのようなアナライト及相補的な物質には、全
細胞、ビールス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質、
糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、
ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、ト
ランキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステ
ロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖及び非生物学的重合
体が含まれる。そのようなアナライト及び相補的物質の
例には、インシュリン、ジゴキシン、ジギトキシン、T4
チロイドホルモン、菌類又は線虫類、血清由来抗体又は
モノクローナル抗体、DNA断片又はRNA断片が含まれる。
特に重要なものは抗体−抗原に基づく方法である。これ
らの方法は当分野でよく知られているラジオイムノアッ
セイに似ており、原理的に放射性標識付けされた化合物
の代わりに、本発明による標識付けされたモイエティを
用いることにより有利に用いることができる。
本発明は、更にここで与える化学的モイエティを用い
た不均質又は均質結合方法にある。不均質結合方法で
は、結合された標識付けされた物質は、標識の存在を測
定する前に、結合されていない標識付けされた物質から
物理的に分離されなければならない。これは屡々、一つ
の成分、例えば、抗体をフイルターの如き不溶性マトリ
ックス又はビーズ試験管の如き反応容器の表面に付着さ
せて固定することにより抗体−抗原系で達成することが
できる。抗原含有溶液をフイルターを通し、又は反応容
器中へ注ぎ、次にフイルター又は反応容器の側から洗浄
除去する。抗体に特異的に結合した抗原だけが残り、決
定される。
これに対し均質方法では、結合及び結合されていない
標識付けされた物質が、標識の存在を測定する時、同じ
反応混合物中に存在する。これは、結合が、標識から検
出可能な信号の性質を変化するときに可能である。均質
系でルミネッセンス性標識を用いる多くの方法が存在す
る。例えば、化学的モイエティにアナライトを結合する
ことは、標識から検出できる信号に直接影響を与えるこ
とがある。更に、ルミネッセンス消光物質を抗体に配置
し、標識付けされた抗原がその抗体に結合すると、抗体
のルミネッセンス消光物質により標識のルミネッセンス
が抑制されるようにしてもよい。ルミネッセンス性標識
のための多くの均質方法が当分野で知られており、その
幾つかはボグスラスキー及びLiによる「均質免疫検査」
Applied Biochemistry and Biotechnology,７:401-414
（1982）に再掲されている。
本発明の一つの態様として、アナライトは不溶性マト
リックスに固定される。そのような方法は、はさみ検査
として行われてもよい。即ち、化学的モイエティが固定
されたアナライトに結合し、結合していない部分がマト
リックスから洗浄除去される。他の態様として、化学的
モイエティが結合することのできる化学物質を不溶性マ
トリックスに固定し、化学的モイエティを生物学的流体
又は反応混合物の一成分とする。相補的物質は不溶性マ
トリックスに固定してもよい。本発明の不均質又は競争
法の両方で、相補的物質はモノクローナル抗体で、不溶
性マトリックスが検査容器の表面でもよい。
本発明の方法は、試薬混合物を化学的、電気化学的、
又は電磁気的エネルギーに曝すことにより行なってもよ
く、或は試薬混合物を化学的、電気化学的、又は電磁気
的エネルギーの組合せに曝してもよい。
化学的モイエティはエネルギー源に曝すことにより酸
化されもよい。そのような源の一つは酸化剤である。そ
のような酸化剤の例には、Ce（IV）塩又はPbO2が含まれ
る。化学的モイエティはエネルギー源に曝すことにより
還元されてもよい。一つのそのような源は化学的還元剤
である。適当な還元剤の例はマグネシウムである。本発
明の方法には、化学的モイエティが一回より多く電磁波
を発するように誘導することが含まれる。
試薬混合物は、オキサレート、ピルベート、ラクテー
ト、マロネート、シトレート、タートレート、ペルオキ
シジサルフェートを含んでいてもよい。更に、化学的モ
イエティは、エネルギー源に曝すことによって還元され
てもよく、試薬混合物はペルオキシジサルフェートを含
んでいてもよい。化学的モイエティは、エネルギー源に
曝すことによって酸化されてもよく、試薬混合物は、オ
キサレート、ピルベート、ラクテート、マロネート、シ
トレート又はタートレート、を含んでいてもよい。
化学的モイエティを検出する種々の方法が与えれ、そ
の場合試薬混合物は連続的に電極に曝され、その電極の
電位は、前記化学的モイエティの還元を行なうのに充分
な電位と、化学的モイエティの酸化を行なうのに充分な
電位との間で振動する。
化学的モイエティは、電位が化学的モイエティの酸化
を行なうのに充分な電位の上下で振動する電極に曝され
ることによって酸化されてもよく、試薬混合物は、オキ
サレート、ピルベート、ラクテート、マロネート、シト
レート、タートレート、ペルオキシジサルフェートを含
んでいてもよい。更に、化学的モイエティは、エネルギ
ー源に曝すことによって酸化されてもよく、試薬混合物
は、オキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネー
ト、シトレート又はタートレート、を含んでいてもよ
い。
化学的モイエティは、電位がそれを還元するのに充分
な電位の上下で振動する電極に曝されることによって還
元されてもよく、試薬混合物は、ペルオキシジサルフェ
ートを含んでいてもよい。そのような試薬混合物は更に
アセトニトリルを含んでいてもよい。更に、化学的モイ
エティは、電位がそれを還元するのに充分で一定な電極
に曝されることによって還元されてもよく、試薬混合物
は、ペルオキシジサルフェートを含んでいてもよい。そ
のような試薬混合物はアセトニトリルを含んでいてもよ
い。
化学的モイエティが電気化学的又は化学的エネルギー
に曝されると、放出された電磁波が連続的に検出され
る。そのような電磁波は目で見て又は光ダイオードを用
いて検出してもよい。更に、化学的モイエティが電気化
学的又は化学的エネルギーに曝された時、放出された電
磁波を累積的に、例えば、写真フイルムを用いて検出し
てもよい。
本発明は、式Ｉを有するレニウム含有化学的モイエテ
ィの存在の検出又はその量を測定するための装置にも関
する。その装置は：（ａ）レニウム含有化学的モイエテ
ィを含む試薬混合物；（ｂ）化学的モイエティが電磁波
を発するようにさせるための手段；及び（ｃ）放出され
た電磁波を検出する手段を有する。
本発明は、式Ｉを有するレニウム含有化学的モイエテ
ィに結合する検査したいアナライトの存在の検出又はそ
の量を測定するための装置にも関する。その装置は：
（ａ）レニウム含有化学的モイエティ；（ｂ）化学的モ
イエティを検査したいアナライトと接触させ、試薬混合
物を形成するための手段；（ｃ）化学的モイエティが電
磁波を発するようにさせるための手段；及び（ｄ）放出
された電磁波を検出する手段を有する。
特に有用で独特な種類の均質結合検査方法が本発明に
よって与えられる。前に述べた如く、これらの標識は、
検査したい標識付けされた物質の溶液を電極に曝す手段
により電気化学的に測定することができる。溶液中に存
在するが、電極の表面に達することができない標識付け
された物質は検出されないであろう。これは、例えば、
標識付けされた物質が電極の入った反応容器の表面に直
接又は間接的に結合されているか、又は標識が、抗原−
抗体複合体内部の如く、特殊な複合体の内部に深く埋め
込まれるか、又は電極自身が、標識付けされた物質が通
過することができるが複合体化した標識付けされた物質
は通過することができない層によって被覆されている場
合に起きる。更に、電極の表面を抗体で被覆し、固定さ
れた抗体に結合した標識付けされた抗原だけが電極に接
近することができ、それによって検出されるようにする
ことができる。この特別な均質方法は、必要な電極電位
を短いパルスとして印加する場合に最も有効であろう。
標識付けされた化合物の存在を決定するための手段の
組合せを用いることも本発明の範囲に入る。例えば、光
ルミネッセンス又は化学的ルミネッセンスの如き、結合
された標識付け物質と結合されていない標識付け物質と
を区別しない手段によって標識付けされた物質の全量を
測定し、例えば、電気化学的ルミネッセンスの如き、結
合された標識付け物質と結合されたていない標識付け物
質とを区別する手段によって結合された標識付け物質の
量を測定することが望ましいであろう。そのような方法
の組合せは、同じ試料で行なうことができ、それによっ
て個々に用いられた方法で得られるよりも豊富な情報源
を試料について与えることができるであろう。同じ反応
混合物中に存在する二つ以上の異なる標識付けをされた
化合物を決定することも本発明の範囲に入る。これは、
もし標識が異なった波長の電磁波を発生するならば、或
はもし標識が異なった値又は源のエネルギーに曝される
ことによって電磁波を発生するようにさせることができ
るならば可能である。
検査方法 本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中
で、約10-3モルより低い濃度でその試料中に存在する検
査したいアナライトを検出する改良された方法にもあ
り、それは：（ａ）レニウム含有有機化合物を含む電気
化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを有する試薬
と試料とを接触させ、然も、前記試薬は（ｉ）前記試薬
が繰り返し輻射線を放出できるように誘導するのに有効
な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気
的エネルギーに曝すことによって繰り返し電磁波を放出
するように誘導することができ、そして（ii）検査した
いアナライトと一緒にすることができ、然も前記接触
は、アナライトと前記試薬とを結合するような適当な条
件で行なわせ；（ｂ）得られた試料を、前記試薬が繰り
返し輻射線を発することができるように誘導するのに有
効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁
波エネルギーに露出し、然も、その露出を前記試薬が繰
り返し電磁波を放出できるように誘導するのに適切な条
件下で行い；そして（ｃ）そのようにして放出された電
磁波を検出し、それによって試料中の検査したいアナラ
イトの存在を検出することからなる。
「モル」とは、１当たりの溶液中のアナライトのモ
ル濃度、又は１当たりの液体試料中に存在する粒子又
は構成単位（unit）の数を意味する。例えば、１当た
り１×1023個の粒子は１モルとして表してもよい。
不均質検査、即ち、非結合標識付け試薬が結合標識付
け試薬から、結合標識付け試薬が電気化学的エネルギー
に曝す前に分離される検査、及び均質検査、即ち、非結
合標識付け試薬と結合標識付け試薬が電気化学的エネル
ギーに一緒に曝される検査として行なうことができる。
本発明の均質検査では、結合標識付け試薬によって放出
された電磁波は、非結合標識付け試薬によって放出され
た電磁波から、非結合標識付け試薬と比較して結合標識
付け試薬によって放出された電磁波の量が多いか又は少
ないか、又は異なった波長の電磁波であるかないかによ
って区別することができる。
従って、本発明の一つの態様として、検査したいアナ
ライトと結合していないいかなる試薬も、試薬と接触さ
せられていた試料から、その試料を電気化学的エネルギ
ーに曝す前に分離される。本発明の別の態様として、試
料と試薬とを接触させる前に、試料を、検査したいアナ
ライトを固定するように処理する。
検査したいアナライトを固定する種々の方法が当分野
でよく知られており、それには、試料を、ポリスチレ
ン、ニトロセルロース又はナイロン表面、又は全細胞、
細胞内粒子、ウィルス、プリオン（prion）、ビロイド
（viroid）、脂質、脂肪酸、核酸、多糖類、蛋白質、脂
質蛋白質、リポ多糖類、糖質蛋白質、ペプチド、細胞代
謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、
バルビツレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸、砂糖、非生物学的重合体、合成有機分
子、有機金属分子、又は無機分子で被覆された表面と接
触させることが含まれる。検査したいアナライトは、こ
れらの物質のいずれでもよく、或は検査したいアナライ
トは、試料中に約10-12モルより低い濃度で存在する全
細胞、細胞内粒子、ウィルス、プリオン、ビロイド、核
酸、蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、糖質蛋白質、ペ
プチド、ホルモン、薬理学的薬剤、非生物学的重合体、
合成有機分子、有機金属分子、又は無機分子でもよい。
検査したいアナライトは、試料中に約10-15モルより低
い濃度で存在する全細胞、細胞内粒子、ウィルス、プリ
オン、ビロイド又は核酸でもよい。
試料と接触させる試薬は、全細胞、細胞内粒子、ウィ
ルス、プリオン、ビロイド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖
類、蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、糖質蛋白質、ペ
プチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トラ
ンキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステロ
イド、ビタミン、アミノ酸、砂糖、非生物学的重合体、
合成有機分子、有機金属分子、又は無機分子、ビオチ
ン、アビジン又はストレプトアビジンに接合したRe−含
有電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティであ
る。本発明の一つの態様として、試薬は、抗体、抗原、
核酸、ハプテン、リガンド又は酵素、又はビオチン、ア
ビジン又はストレプトアビジンに接合した電気化学的ル
ミネッセンス性モイエティである。
試料は、固定、エマルジョン、懸濁物、液体又は気体
から誘導されたものでよい。更に、試料は、水、食物、
血液、血清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶媒又は空
気から誘導されてもよい。更に、試料は、アセトニトリ
ル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ
−メチルピロリドン又はｔ−ブチルアルコールを含んで
いてもよい。試料は、還元剤又は酸化剤を含んでいても
よい。
本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中
で、約10-3モルより低い濃度でその試料中に存在する検
査したいアナライトを検出する改良された競争的方法に
もあり、それは：（ａ）レニウム含有有機化合物を含む
電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを有する
試薬と試料とを接触させ、然も、前記試薬は、（ｉ）前
記試薬が繰り返し輻射線を放出できるように誘導するの
に有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は
電磁気的エネルギーに曝すことによって繰り返し電磁波
を放出するように誘導することができ、そして（ii）検
査したいアナライトと、試料中に通常は存在しない相補
的物質上の結合部位を求めて、その相補的物質と共に競
争することができ、然も、前記接触は、検査したいアナ
ライトと前記試薬とが前記相補的物質に競争的に結合す
るような適当な条件で行なわせ；（ｂ）得られた試料
を、前記試薬が繰り返し輻射線を発することができるよ
うに誘導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、
電気化学的又は電磁波エネルギーに露出し、然も、その
露出を前記試薬が繰り返し電磁波を放出できるように誘
導するのに適切な条件下で行い；そして（ｃ）そのよう
にして放出された電磁波を検出し、それによって試料中
の検査したいアナライトの存在を検出することからな
る。
〔実施例〕
前置き 材料及び方法 リガンド 2,2′−ビピリジン（BPY）（アルドリッヒ）を更に精
製することなく用いた。4,4′−ジメチル−2,2′−ビピ
リジン（Me2bpy）（レイリー・タール・ケミカルズ）を
使用する前に昇華させた（90〜100℃、10-3トール）。
4,4′−ジフエニル−2,2′−ビピリジン（Ph2bpy）（ア
ルドリッヒ）を使用する前にベンゼン／石油エーテルで
１度再結晶させた。４−エチルピリジン（Etpy）（アル
ドリッヒ）を更に精製することなく用いた。用いられた
他のピリジル及びビピリジルリガンドには次のものが含
まれていた： 4,4′−ビス（N,N−ジエチルアミノ）−2,2′−ビピ
リジン［(NEt2)2bpy］〔メエカーG.及びケースF.H.,J.A
mer.Chem.Soc.，80:2745（1958）〕； 4,4′−（ジメトキシ）−2,2′−ビピリジン［(CH3-
O)2bpy］〔ウェンケルト D.ウッドワード R.B.,J.Or
g.Chem. 48:283（1983）〕； 4,4′,5,5′−テトラメチル−2,2′−ビピリジン（Me
4bpy）〔エリオット M.C.、フライタークR.A.、ブラネ
イD.D.,J.Amer.Chem.Soc.，107:4647（1985）〕； 4,4′−ジクロロ−2,2′−ビピリジン（Cl2bpy）〔ウ
エンケルト D.、ウッドワード R.B.（1983）、前掲； 4,4′−ビス（カルボメトキシ）−2,2′−ビピリジン
［(CO2CH3)2bpy］〔メエカーG.及びケースF.H.,（198
5）、前掲〕； 4,4′−ジニトロ−2,2′−ビピリジン［(NO2)-2bpy］
〔メエカーG.及びケースF.H.,（1985）、前掲〕； 溶媒 塩化メチレン（CH2Cl2）、石油エーテル、ジエチルエ
ーテル（無水）、及びメタノールは、全てカーチン・マ
チソン・サイエンティフィック（ニューヨーク フロー
レンス）からのケンピュア（Chempure）級で、受け取っ
たまま用いた。EMサイエンティフィック（ニュージャー
ジー チェリーヒル）からのアセトン（A.C.S.試薬級）
及びアセトニトリル（オムニ−ソルブ）は更に精製する
ことなく用いた。ベンゼンはフィッシャー・サイエンテ
ィフィック（ニュージャージー スプリングフィール
ド）からのA.C.S.試薬級であり、受け取ったまま用い
た。J.T.ベーカー・ケミカルズ（ニュージャージー フ
ィリップスバーグ）からのトルエン（ベンカー・アナラ
イズド試薬、HPLC級）は更に精製することなく用いた。
J.T.ベーカー・ケミカルズからのテトラヒドロフラン
は、使用直前にアルゴン雰囲気中でナトリウム／ベンゾ
フェノンから蒸留して乾燥した。無水エタノール（200
プルーフ）はワーナー・グラハム社（メリーランド カ
ッケイスビル）から得られた。２−メトキシエタノール
（アルドリッヒHPLC級）は受け取ったまま用いた。ピリ
ジン（アルドリッヒ・ゴールドラベル）は無水型で得ら
れ、用いるまでシュア・シール（Sure-Seal）（商標
名）（アルドリッヒ）瓶中に保存した。ジメチルホルム
アミド（DMF）はA.C.S.試薬級（DMF）で、受け取ったま
ま用いた。水はミリポア・ミリ・Ｑ（Millipore Milli-
Q）装置を用いて脱イオン化した。
クロマトグラフ 中性吸収アルミナ（フィッシャー）は受け取ったまま
用いた。クロマトグラフ用オタワ サンド及びガラスウ
ールはアルドリッヒから得られた。セファデックス（Se
phadex）LH-20はファーマシア（Pharmacia）から購入さ
れ、使用直前に12時間撹拌メタノール中に懸濁すること
により活性化して使用した。SP−セファデックスC-25
（ミズーリ セントルイス、シグマ）は、使用直前に２
時間沸騰水中で撹拌することにより活性化した。
他の試薬 ナトリウム金属、ベンゾフェノン（ゴールドラベ
ル）、トルフルオロメタンスルホン酸〔HO3SCF3、即
ち、トリフリ酸（triflic acid）〕及びトルフルオロメ
タンスルホン酸銀（AgCF3SO3、即ち、トリフリ酸銀）は
全てアルドリッヒから受け取ったまま用いた。トリフル
オロメタンスルホン酸無水物〔（CF3SO2)2O〕（マサチ
ューセッツ ダンバース、アルファー・ベントロン）は
得られたまま用いた。アンモニウム ヘキサフルオロホ
スフェート（NH4PF6）（アルドリッヒ）は更に精製する
ことなく用いた。NaCl及びNaClO4は共にフィッシャー・
サイエンティフィックからのA.C.S.試薬級で、受け取っ
たまま用いた。ペンタカルボニル レニウム（Ｉ）クロ
ライド、(CO)5ReCl、はプレッシャー・ケミカル社（ペ
ンシルバニア ピッツバーグ）から購入された。無水硫
酸ナトリウム及び指示ドリエライト（商標名）（CaS
O4、無水物）はアルドリッヒから得られた。ロバーツ・
オキシゲン社（メリーランド ロックビル）からのアル
ゴンガスは、使用前に指示ドリエライトのカラム（内径
3in×高12in）に通過させることにより乾燥した。
アルドリッヒからの1,3−ジメチル−4,5−ジアミノウ
ラシル（DADMU）は使用前にアルゴン中メタノール／石
油エーテルにより再結晶した。無水LiClO4及び塩化イソ
ニコチノイル塩酸塩は、アルドリッヒから受け取ったま
ま用いた。フィッシャーからのA.C.S.試薬級NaOHは更に
精製することなく用いた。カーチン・マチソン・サイエ
ンティフィックからのイソプロパノール（ケンピュア
ブランド）は受け取ったまま用いた。
モデルRe（Ｉ）錯体の合成 ルミネッセンス性Re（Ｉ）錯体のための一般的合成方
法は第１図に例示されている。ルミネッセンス性Re
（Ｉ）錯体を製造するための出発材料はRe(CO)5Clであ
った。乾燥Re（Ｉ）錯体の合成には二つの工程が含まれ
ている。第一の工程では、キレート性2,2′−ビピリジ
ン リガンドによってCOを置換して平面異性体、fac-
（Ｌ）Re(CO)3Clを生成させる。Ｌはキレート性2,2′−
ビピリジン リガンドで、例えば、bpy、Cl2bpy、(CO2C
H3)2bpy、(NO2)2bpy、Me2bpy、Ph2bpy、(CH3O)2bpy、Me
4bpy、或は(NEt2)2bpyである。一般的合成法を下に記述
する。
還流凝縮器及び撹拌棒を具えた250mlに361.7mg（1m
M）の(CO)5ReCl、1.02mMの希望のビピリジル リガン
ド、例えば、187mgのMe2bpy及び80〜100mlのトルエンを
添加した。溶液にアルゴンを気泡として通し、15分間脱
ガスし、撹拌しながら90分間アルゴン雰囲気中で還流し
た。この期間中、生成物は通常溶液から沈澱した。フラ
スコを室温へ冷却した後、沈澱した生成物を吸引過に
より収集し、15mlずつの冷却トルエンで二度洗浄し、次
に15mlずつのジエチルエーテルで三回洗浄し、30分間空
気吸引乾燥した。乾燥は、一晩CaSO4の入った真空乾燥
器で完了した。もし冷却中に生成物の沈澱が起きなかっ
た場合には、撹拌したトルエン溶液にジエチルエーテル
を滴下することにより沈澱をおこさせた。この反応から
得られた生成物は分析的に純粋であった。生成物fac-
（１）Re(CO)3Clの収率は最初の(CO)5ReClに基づき90％
より大きかった。
fac-（Ｌ）Re(CO)3を対応するfac-（Ｌ）Re(CO)3（Et
py）（Ｒ）（式中、ＲはCF3CO3 -、PF6 -、ClO4 -）への転
化は次の二つ方法のいずれかによって達成された。
方法I--酸方法 この方法は、強い酸性媒体に対し不感性、即ち安定な
ビピリジル リガンドに有効である。それは、中間体の
トリフリ酸Re（Ｉ）錯体の生成及び分離と、それに続く
４−ピリジルエタン誘導体への転化を含んでいる。次の
例はその手順を例するものである。
fac-［(NEt2)2bpy］Re(CO3SCF3)の製造 撹拌棒を具えた250mlの丸底フラスコに、456mg（0.75
mM）のfac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3Cl及び30mlの塩化メ
チレンを添加した。その撹拌した懸濁物へ1.34ml（必要
量の20倍）のトリフルオロメタンスルホン酸HO3SCF3及
び３〜５滴のトリフルオロメタンスルホン酸無水物(CF3
SO2)2Oを添加した。固体は直ちに溶解し、暗黄色の溶液
を与えた。フラスコに蓋をし、溶液を室温で３時間撹拌
し、その後で生成物を、撹拌した溶液へ無水ジエチルエ
ーテルを200ml添加することによって分離した。吸引
過により黄色の生成物fac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(O3SC
F3)が分離された。沈澱した生成物を30mlずつの無水ジ
エチルエーテルで６回洗浄し、微量のトルフルオロメタ
ンスルホン酸を除去し、空気吸引により30分間乾燥し
た。CaSO4を入れた真空乾燥器中に一晩入れておくこと
により乾燥を完了した。500mlの［(NEt2)2bpy］Re(CO)3
(O3SCF3)〔［(NEt2)2bpy］Re(CO)3Clに基づき93％〕を
生じた。生成物は次の反応で用いるのに充分純粋であっ
た。今記述したRe（Ｉ）トリフレート物質は、第３図に
示すように、対応するEtpy錯体へ変換することができ
る。次にその手順を例示する。
fac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)の製造 撹拌棒及び還流凝縮器を具えた250mlの丸底フラスコ
に、150mg（0.2mM）のfac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(O3SC
F3)及び50mlエタノールを添加した。その混合物へ0.24m
l（必要量の10倍）の４−ピリジルエタンを添加した。
溶液にアルゴンを気泡として通すことにより15分間脱ガ
スし、撹拌しながらアルゴン雰囲気中で２時間還流し
た。溶液を室温に冷却した後、回転蒸発器〔ブチ（Buch
i）モデルRE-121〕を用いて蒸発によりエタノールを除
去した。粗製生成物fac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(Etpy)
(CF3SO3)からなる残留試料を過剰の４−ピリジルエタン
中に溶解した。試料を再少量（５〜15ml）の1:2（v/v）
CH3CN／トルエン中に溶解し、30cm×3cm内径カラムを用
いた中性アルミナ（吸着アルミナ、フィッシャー・サイ
エンティフィック）によりクロマトグラフにかけた。1:
2（v/v）CH3CN／トルエンによる溶離で過剰の４−ピリ
ジルエタンリガンドを除去した。黄色の生成物帯、fac-
［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)を1:1（v/v）CH3
CN／トルエンで溶離した。幾らかあとを引くのが観察さ
れたが、少量の未同定の紫色物質からの完全な分離が行
われた。生成物を含む溶媒部分を、回転蒸発器で乾燥す
るまで蒸発した。残渣を5mlの塩化メチレン中に溶解
し、再び回転蒸発器を用い溶媒を蒸発した。淡黄色の薄
片状のfac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)が出
発［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(O3SCF3)に基づき50％の収率
で得られた。生成物は分析的に純粋であった。
方法II--銀方法 極めて酸性の環境中で分解を受けやすいビピリジルリ
ガンド、例えば、Ｌ＝(CH3O)2bpy又は(COOCH3)2bpyを含
む錯体のために銀法を用いた。この方法では、可溶性銀
トリフルオロメタンスルホン酸塩をfac-（Ｌ）Re(CO)3C
l物質と反応させ、fac-（Ｌ）Re(CO)3(CO3SCF3)モイエ
ティ及び不溶性AgClを形成した。過によりAgCl沈澱物
を除去した後、溶液をその場で４−ピリジルエタンと反
応させ、希望の生成物を得た。この手順では中間生成物
fac-（Ｌ）Re(CO)3(O3SCF3)塩を分離する試みは行なわ
れなかった。次にその方法を例示する： fac-［Cl2bpy］Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)の製造 銀トリフルオロメタンスルホネート、AgCF3SO3は感光
性なので、全ての操作は赤色安全光の元で暗室で行なっ
た。
テトラヒドロフラン（THF）をNa/ベンゾフェノンでア
ルゴン雰囲気中で90分間還流することにより乾燥した。
溶液を使用直前に蒸留により収集した。
撹拌棒及び還流凝縮器を具えた乾燥250mlの丸底フラ
スコに、500mg（0.94mM）のfac-(Cl2)2bpyRe(CO)3Cl、2
42mg（0.94mM）のAgCF3SO3及び100mlの乾燥THFを添加し
た。フラスコの内容物にアルゴンを気泡として通すこと
により15分間脱ガスし、そしてアルゴン雰囲気中で撹拌
しながら３時間置流し、その時に、フラスコ内容物をガ
ラスフリットロート（微細気孔）を用いて吸引過し、
AgCl沈澱物を除去した。AgCl沈澱物を15mlずつのメタノ
ールで３回洗浄した。CH3OH洗浄は液と組合せて行
い、撹拌棒を具えた清浄な250mlの丸底フラスコに添加
した。0.75g（6.59mM）の４−ピリジルエタンを添加
し、溶液にアルゴンを気泡として通すことにより15分間
脱ガスし、アルゴン雰囲気中で２時間還流した。
橙褐色の溶液を室温に冷却した後、回転蒸発器を用い
て除去した。生成物スラリーを次の二つの方法のいずれ
かで精製した。
手順１ fac-［(NEt2)2bpy］Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)を精製す
るための方法Ｉに記載したように1:2（v/v）CH3CN／ト
ルエンを用いたアルミナカラム（高さ15in×内径2in）
を調製した。試料を10〜15mlの1:2（v/v）CH3CN／トル
エン中に溶解し、カラムに入れた。1:2（v/v）CH3CN／
トルエンによる溶離で、(Cl2bpy)Re(CO)3Clとして同定
された小さい黄色の帯を除去した。1:1（v/v）CH3CN／
トルエンによる溶離で、狭い橙褐色帯を除去した。この
重複は反応の収率をfac-(Cl2bpy)Re(CO)3Clに基づき17
％に限定した。黄色の生成物の帯があとを引いたが、そ
れは、カラム上の幾つかの連続した黄色、紫色及び褐色
の帯から明確に分離された。これらの副生成物を分離或
は同定する試みは行われなかった。fac-(Cl2bpy)Re(CO)
3(Etpy)(CF3SO3)生成物の分離は、方法Ｉでfac-［(NE
t2)2bpy］Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)について記述したのと
同じであった。
手順２ 精製手順としてイオン交換クロマトグラフを用いるこ
とによって錯体の収率が改善された。SP−セファデック
ス（Sephadex）C-25イオン交換樹脂のカラム（内径2cm
×長さ30cm）を水中で調製した。生成物調製で得られた
スラリーを約10mlH2Oと混合し、アセトンを均質な溶液
が観察されるまで滴下した、SP−セファデックスC-25樹
脂を、生成物が樹脂に吸収されるまで粗製生成物スラリ
ー溶液へ添加した。アセトンを回転蒸発器を用いて除去
した。吸収された反応生成物を含む樹脂をカラムへ導入
した。H2Oで溶離し、４−ピリジルエタンを除去し、0.2
5M NaCl水溶液を用いてCl-塩として非電荷fac-(Cl2bpy)
Re(CO)3(Etpy)+陽イオンを溶離した。反応の副生成物が
カラム上に残った。その生成物を、その生成物を含有す
る0.25M NaCl溶液へNH4PF6飽和水溶液を滴下することに
よりPF6 -塩として分離した。fac-(Cl2bpy)Re(CO)3(Etp
y)(PF6)沈澱物をガラスフリットフィルター（中程度気
孔）で吸引過により収集した。生成物を、一滴のNH4P
F6飽和溶液を含む10mlのH2O中に懸濁した。アセトンを
固体が完全に溶解するまで添加した。回転蒸発器でアセ
トンを室温でゆっくり蒸発させることにより、錯体を純
粋な形で沈澱させた。錯体をガラスフリットフィルター
（中程度気孔）で吸引過により収集し、氷で冷却した
10mlのH2Oで洗浄した。次に錯体を15mlずつのジエチル
エーテルで２回洗浄し、空気吸引で30分間乾燥した。Ca
SO4を入れた真空乾燥器に一晩入れることにより乾燥を
完了した。(Cl2bpy)Re(CO)3Clに基づき24％の収率が得
られた。少量の明るい黄色の結晶であるfac-(Cl2bpy)Re
(CO)3(Etpy)(PF6)は分析的に純粋であった。
一般に、NEt2、CH3O、CH3、等の如き電子放出置換基
を有する錯体はきれいに反応し、手順１を用いて容易に
精製された。2,2′−ビピリジン リガンドのCl又はNO2
の如き電子吸引基を含む錯体は、手順２を用いて最もよ
く精製される。そのような錯体中の2,2′−ビピリジン
リガンドの電子吸引性は、見掛けのRe（Ｉ）中心から
電子雲を引きつける。その結果起きるRe中心での部分的
正電荷の増大は、Re（Ｉ）とCl-との間の静電気的引力
を増大する結果になる。得られたRe-Cl結合の強化は、
銀陽イオンAg+又はHO3SCF3の存在で遊離性基としてのCl
-の効果を減少する。結局、副生成物を発生させるRe
（Ｉ）‐Cl錯体内の他の点に対するそれら物質の攻撃
は、単純なCl-置換と競争的になる。明らかに得られる
荷電生成物はイオン交換樹脂を用いて最もよく分離され
る。
今日まで合成されたfac-（Ｌ）Re(CO)3（Etpy）（CF3
SO3）錯体及び精製後の収率及び製造方法（酸‐‐方法
I;銀‐‐方法II）の要約が表４に示されている。CH3CN
中の錯体の最大放射も列挙されている。放射スペクトル
はパーキン・エルマーLS-5型蛍光分光計を用いて得られ
た。
放射スペクトルは波長による検出器感度の変動に対し
補正しておらず、これらの化合物を用いて得られる放射
波長範囲を定性的に示すために与えられているだけであ
る。
二種類の蛍光性Re（Ｉ）−テオフィリン物質も、セン
サー・アナライト接合体モデルとして製造されている。
その製造を下に記述する。
実施例１ テオフィリン−８−ブチル酸、３−プロピルピリジルア
ミド（T8BA3PPA）：化合物Ｉの製造 0.163g（1.2mM）の３−（４−ピリジル）−プロピル
アミンを、無水ピリジン10ml中に0.776g（1mM）のジシ
クロヘキシルカルボジイミドを入れたものと一緒にし
た。得られた溶液を一晩撹拌した。沈澱したジシクロヘ
キシル尿素を過して除去し、液を真空中で濃縮し
た。残留固形物を50％イソプロパーノール水溶液中で沸
騰させることにより溶解した。冷却で少量の固体が沈積
し、それを過して除去した。液を濃縮すると、油が
生じ、それは放置するとゆっくり固化した。その固体を
10mlの0.1NHClに溶解し、再び過して少量の不溶性物
質を除去した。次にpHを炭酸ナトリウム水溶液で７に調
節した。溶液を氷上で冷却し、結晶白色生成物を得た
（収率39％、0.149g）。生成物は元素分析及びプロトン
NMRにより特徴を調べ次の構造が明らかにされた。
実施例２ fac-（bpy）Re(CO)3（T8BA3PPA）（ClO4）：化合物IIの
製造 fac-（bpy）Re(CO)3(O3SCF3)を酸方法（方法Ｉ）を用
いて上述の如く製造した。
撹拌棒及び凝縮器を具えた100mlの丸底フラスコに、1
55mg（0.27mM）のfac-（bpy）Re(CO)3(O3SCF3)、129mg
（0.37mM）の化合物Ｉ、20mlのH2O及び20mlのエタノー
ルを添加した。溶液にアルゴンを気泡として通すことに
より15分間脱ガスし、アルゴン雰囲気中で３時間還流し
た。室温に冷却した後、回転蒸発器を用いて溶媒を蒸発
させた。乾燥固体を10〜15mlのメタノールに溶解し、0.
2gの無水LiClO4を添加した。そのLiClO4が溶解した時、
溶液をセファディックスLH-20カラム（高さ75cm×内径2
cm）へ移し、クロマトグラフ精製にかけた。カラムをメ
タノールで平衡させた。試料を0.1〜0.2ml/分の流量で
流した。三つの帯が分離された。最初の帯はCH3OH中で5
67nmで蛍光を発し、希望の生成物（化合物II）であっ
た。それは残りの帯からきれいに分離した。これらの帯
に表わされる微少量の生成物の同定を試みなかった。回
転蒸発器でCH3OHを蒸発させることにより、生成物を分
離した。錯体を5mlのCH3OH中に溶解し、150mlの撹拌し
ている無水ジエチルエーテル中へ滴下した。錯体は明る
い黄緑色の粉末として沈澱した。それをガラスフリット
フィルター（中程度気孔）で吸引過により収集し、15
mlずつの無水ジエチルエーテルで２回洗浄した。空気吸
引による乾燥は行なわなかった。CaSO4を入れた真空乾
燥器に一晩入れることにより乾燥を完了した。fac-（bp
y）Re(CO)3(O3SCF3)に基づき48％の収率で化合物IIが得
られた。錯体は分析的に純粋であった。
生成物は次の構造をもっていた。
実施例３ 1,3−ジメチル−４−アミノ−５−（イソニコチニルア
ミド）−ウラシル：化合物IIIの製造 化合物IIIを、塩化イソニコチニル塩酸塩（INC）と、
1,3−ジメチル−4,5−アミノウラシル（DADMU）との乾
燥ピリジン中での反応により、下に記載する如く製造し
た。
DADMUは、アルゴン雰囲気中メタノールにより再結晶
して精製し、CaSO4を入れた真空乾燥器中で一晩乾燥し
た。青白い黄色の化合物をアルゴン中に保存した。
撹拌棒を具えた100mlの丸底フラスコをアルゴンで脱
気し、氷浴中で冷却した。注射器を用い35mlの乾燥ピリ
ジンを添加し、系をアルゴンで脱気した。15分後1.04g
（5.84mM）の塩化イソニコチノイル塩酸塩を15分間隔で
三つの部分に分けて添加した。溶解により褐色の溶液が
得られた。この溶液に0.98g（5.76mM）のDADMUをアルゴ
ン雰囲気中撹拌しながら添加した。還流凝縮器をフラス
コに取り付け、フラスコを水浴へ移した。フラスコの内
容物を、アルゴン中で2.5時間撹拌しながら80℃で還流
した。褐色混合物をアルゴン中で一晩室温へゆっくり冷
却した。黄褐色の沈澱物をガラスフリットフィルター
（中程度気孔）で吸引過により収集した。沈澱物を15
mlずつの冷却トルエンで４回洗浄し、ピリジン及び溶解
性褐色の不純物を除去した。沈澱した生成物を30mlずつ
のジエチルエーテルで３回洗浄し、CaSO4を入れた真空
乾燥器に一晩入れて乾燥した。次に生成物をCH3OH／ジ
エチルエーテルによりアルゴン雰囲気中で再結晶し、黄
色の生成物IIIを0.52g（最初のINCに基づき38％）を得
た。生成物は次の構造をもっていた。
実施例４ ８−（４−ピリジル）−テオフィリン：化合物IVの製造 化合物IIIは、次の方法により、対応するテオフィリ
ン物質（化合物IV）へ容易に環化された。
撹拌棒を具えた300mlのエーレンメイヤーフラスコ
に、6.75g（24mM）の化合物III及び化合物IIIを溶解す
るのに充分な2.5MのNaOH水溶液（約100ml）を添加し
た。黄橙色の溶液を沸騰が始まるまで穏やかに撹拌しな
がら加熱した。穏やかな沸騰を30分間持続し、その間に
沈澱物が分離し始めた。溶液を室温へ冷却しpHを6NのHC
l（水溶液）を用いて５〜６へ注意深く調節した。中和
の間に最初の沈澱物が溶解してオレンジ色の溶液になっ
た。中和が完結に近付くに従って再沈澱が起きた。溶液
を氷浴上で１時間冷却し、青白い黄色の固体をガラスフ
リットフィルター（中程度気孔）で吸引過により収集
した。沈澱物を20mlずつのジエチルエーテルで３回洗浄
した。粗生成物をCaSO4を入れた真空乾燥器中で乾燥し
た。生成物をジメチルホルムアミド（DMF）により再結
晶して精製した。結晶を上述の如く、吸引過により収
集し、20mlずつの氷冷却イソプロパノールで２回洗浄
し、次に30mlずつのジエチルエーテルで３回洗浄した。
真空乾燥器中に一晩入れることにより乾燥を完了した。
化合物IVの金属的白色結晶1.87g（化合物IIIの最初の量
に基づき30％）が得られた。化合物IVは337.9〜339.5℃
で溶融し、透明な橙色の液体になった。化合物IVは分析
的に純粋であった。
生成物は次の構造をもっていた。
実施例５ fac-（bpy）Re(CO)3［８−（４−ピリジル）テオフィリ
ン］（CF3SO3）：化合物Ｖの製造 撹拌棒を具えた100mlの丸底フラスコに、150mg（0.26
1mM）のfac-（bpy）Re(CO)3(O3SCF3)、250mg（1.04mM）
の８−（４−ピリジル）−テオフィリン及び40mlの２−
メトキシエタノールを添加した。２−メトキシエタノー
ルは、８−（４−ピリジル）−テオフィリンがエタノー
ル及び水に不溶性であるため溶媒として用いた。アルゴ
ンで15分間脱気した後、アルゴン雰囲気中で４時間溶液
を還流した。冷却した後、回転蒸発器で溶媒を蒸発する
ことにより除去した。固体を20mlのメタノールで抽出
し、ガラスウールプラグを通して不溶性の８−（４−ピ
リジル）−テオフィリン リガンドを除去した。液を
セファディックスLH-20カラム（高さ75cm×内径2cm）に
より溶離剤としてメタノールを用いクロマトグラフにか
けた。二つの帯が観察された。最初の帯は（主生成物）
化合物Ｖで、少量の同定されない不純物帯から分離され
た（溶離速度0.1〜0.2ml/分）。回転蒸発器で、化合物
Ｖを含有する部分を5mlメタノール体積まで濃縮し、次
に100mlの撹拌したジエチルエーテル中で再沈澱させる
ことにより青白いライムグリーン色の粉末として得られ
た。化合物Ｖをガラスフリットフィルター（中程度気
孔）で吸引過により収集し、CaSO4を入れた真空乾燥
器に一晩入れて乾燥した。収量＝120mg〔fac-（bpy）Re
(CO)3(O3SCF3)に基づき42％〕。生成物は分析的に純粋
であった。
生成物は次の構造をもっていた。
実施例６ fac-（bpy）Re(CO)3［３−（４−ピリジル）−プロピオ
ン酸］ClO4・H2O：化合物VIの製造 撹拌棒を具えた250mlの丸底フラスコに、300mg（0.52
2mM）のfac-（bpy）Re(CO)3CF3SO3、79.2mg（0.524mM）
の３−（４−ピリジル）−プロピオン酸、70mlのエタノ
ール（無水）及び30mlの水を添加した。混合物をアルゴ
ンで15分間脱気した後、アルゴン雰囲気中で４時間を還
流した。溶液を冷却し、溶媒を追い出した。残渣を少量
の水に溶解し、SP-25セファデックスカラムに入れ、水
で洗浄し、0.25M NaClで溶離した。第一の黄緑色の部分
を収集し、回転蒸発器により約25mlへ体積を減少させ
た。フラスコの内容物を加熱銃で暖め、1mlの濃過塩素
酸を滴下した。ライムグリーン色の結晶が形成された。
これらを15mlの中程度気孔のフリットロートで吸引過
により分離し、非常に少量の氷水で洗浄し、30分間空気
乾燥した。結晶を更にドリエライト（Drierite商標名）
を入れた真空乾燥で更に乾燥した。
生成物は次の構造をもっていた。
実施例７ 種々のレニウム化合物の電気化学的ルミネッセンス 種々のレニウム化合物の電気化学的性質を、0.1Mのテ
トラブチルアンモニウム テトラフルオロボレートを支
持電解質として窒素脱気したアセトニトリル10ml中に入
れた1mM溶液として測定した。作用電極は、インディア
ナ州ウエストラファイエットのバイオアナリテカル・シ
ステムズ社から得られた白金円盤であった。白金線を対
電極として用い、1.0mm銀線を参照電極として用いた。
測定は100mV/秒の走査速度で−2.2Vから＋2.2V（対SC
E）まで走査することにより行なった。各電気化学的測
定後、飽和カロメル参照電極（SCE）と銀線との間の電
位差を測定した。これにより報告された値をSCEに対す
る電位に補正した。
電気化学的ルミネッセンス（ECL）測定を、0.1Mホス
フェート−シトレート緩衝液（pH4.2）、25mM蓚酸及び
１％トリトンRX‐100を含む水溶液中で行なった。用い
た電極系は、0.1inの白金線によって「無線電信室」ト
ランジスターソケット（＃276-548）に接続した２枚の
白金（52ゲージ）電極からなっていた。電極を、酢酸セ
ルロースプラスチックの60mm厚の片の外側に取り付け
た。このプラスチックに、溶液が作用電極と対−参照電
極との間に容易に流れるように1/4in直径の穴をあけ
た。電極をポテンショスタットに接続し、一つの電極が
作用電極（光電子増倍管に近い方）として働かせ、一つ
の電極を対−参照電極として働かせるようにした。測定
は、50mV/秒の走査速度で1.5Vから2.5V（バイアス電
位）まで走査することにより行なった。ECL測定値は、
与えられた化合物濃度について信号対ノイズ比（又は信
号対バックグランド比）として報告されている。バック
グランドはECL化合物が添加されていない緩衝液で観察
されたルミネッセンス カウントとして定義される。ル
ミネッセンス測定値は、第一又は第二線状走査中に観察
された最大光出力である。
各溶液の電気化学的ルミネッセンス（ECL）及び循環
電圧測定の両方共、EG＆G273型ポテンショスタット又は
オックスフォードビポテンショスタット（ウルサー・サ
イエンティフック・インストルメンツ）を用いて行なっ
た。各ECL測定のフォトンフラックスは、二つ又は三つ
の電極系を0.5ml測定溶液中に入れることができるよう
に修正したベルソルド（Berthold）発光計で検査した。
電気化学的測定値及び電気化学的ルミネッセンス測定値
の両方は、キップ・アンド・ゾネン（Kipp＆Zonen）BD9
1型X,Y,Y′記録計に記録された。
蛍光測定は、前に記述したECL緩衝液3.0ml中に、又は
その緩衝液に不溶性の時にはアセトニトリルに、希望の
化合物を入れた50μＭ溶液で行われた。測定はパーキン
・エルマーLS-5蛍光分光光度計で行われた。溶液の励起
発光スペクトルの前走査は、励起及び発光スペクトルを
記録する前に行ない、発光スペクトルを最大励起波長で
照射しながら測定し、逆に励起スペクトルを最大発光波
長を調べながら記録できるようにした。
表２には、幾つかの化合物の電気化学的ルミネッセン
スデーターが要約されている。
実施例８ ECL基礎検査のための内部標準の使用 電気化学的ルミネッセンス（ECL）のために内部標準
を使用することについて研究するため幾つかの実験を行
なった。ECL測定のために内部標準を使用するには、試
料溶液中に第二のルモフォール（lumophor）即ち、“TA
G"を添加する必要がある。一つのTAGはキャリブラント
又はアナライトであり、第二のものは内部標準である。
各TAGからの発光は独立に同時に測定されなければなら
ない。これを行なう一つの方法は、二つのTAGが異なっ
た波長で発光するので、光学的フィルターを用いること
によって行なう。
材料及び装置 内部標準とキャリブラントの両方からのECLは、“フ
ロ・スルー（Flo-Thru）”室中で測定された。その室は
光遮断囲いからなり、その中で流体及び電気的接続が電
気化学的セルに対して行なわれ、そのセルが正面の光電
子増倍管と並べられている。光の強度は浜松光電子増倍
管（PMT）及びオリエル（Oriel）7070型PMT検出装置を
用いて測定された。ポテンショスタットはプリンストン
・アプライド・リサーチ（PAR）173型で、PAR175型でプ
ログラムされていた（100mV/sでAg/AgClに対し1.8〜1.0
Vで走査された）。電気化学的セルは、セルブロック中
の溶液出入口を与えるように修正されたバイオアナリテ
カル・システムズのセルであった。作用電極材料は、ブ
ロックの中に埋め込まれた金であった。対電極として、
PMTをセルへ入れるための窓のついたステンレス鋼の前
面板を用いた。参照電極（Ag/AgCl）はセルブロックの
外にあり、下流におかれた。流体の流れ及び試料の導入
は、蠕動ポンプを用いて手動で行われた。光強度グラフ
は、キップ・アンド・ゾネンのＸ−Ｙ−Ｙ′記録装置で
記録された。TAGの保存溶液は、緩衝液中に溶解するこ
とにより調製された。緩衝液は0.15Mのホスフェート、
0.10Mのトリプロピルアミン及び0.05％のトウィー（Twe
en）20からなり、pH7.0であった。
較正研究 Os(bpy)3 2+、OsTAGのECLを研究した。陽極方向に電位
を走査して、二つの発光グラフを観察した。Os(bpy)3
3+/2+（Ag/AgClに対し0.8V）の見掛け電位近くにプラト
ーの形の発光が観察された。第二の発光は1.46Vの、よ
り高い酸化還元正電位でピーク状の形で起きた。この第
二発光は遥かに強く、トリプロピルアミン酸化の近くに
あった。この外挿検出限界は100pM（浜松R374PMTを用い
て）であった。
（Me4bpy）Re（4-Et-pyr）(CO)3 +、ReTAGのECLを研究
した。酸化のための見掛けの電位はAg/AgClに対し1.7V
（循環ボルタンメトリーによりアセトニトリル中で測定
した）であった。最大ECLは、OsTAGに対し正の方向に移
動し（1.58V）、それは酸化のための遥かに正の見掛け
の電位を反映している。この材料は545nm（水）で発光
するのでその発光の特異性のため重要である。ReTAG発
光は、Os(bpy)3 2+の発光（750nm）から波長により良く
分離されており、従って、簡単なフィルターを用いて光
学的に分離することができる。ReTAGの外挿検出限界は1
00pM（浜松R268PMT）であった。
上述の二つの方法によるECL性能に基づき、これらの
化合物を、ECLのための内部標準を用いることができる
か否かを試験するために用いた。内部標準（OsTAG）の
ための一つの条件は、それがキャリブラントTAG（ReTA
G）とは独立に発光すること、即ち、次の消光反応が起
きないと言うことである： Os(bpy)3 2++(Me4bpy)Re(4-Et-pyr)(CO)3 +★…… Os(bpy)3 2+★＋(Me4bpy)Re(4-Et-pyr)(CO)3 + 次の実験を行なった。一定のOsTAG濃度（１μＭ）
で、ReTAG濃度を変え（０〜100nM）、OsTAGのECLをR268
PMT及びLP700ロングパス フィルターを用いて観測し
た。第２図参照。実験誤差内で、ReTAGによるOsTAGへの
影響は観察されなかった。
同じ実験を繰り返した。但しLP700を、ショートパス
フィルター620で置き換え、ReTAG ECLだけが観察され
るようにした。ReTAGのための補正曲線は第３図に示さ
れている。OsTAGのないReTAGのための較正曲線も第３図
に示されている。この場合も実験誤差内で、OsTAGの添
加はReTAG ECLに影響を与えていない。データーは、Os
(bpy)3 2+がReTAGをアナライトとした内部標準としてよ
く適していることを示している。
実施例９ レニウム標識付けされたウサギ−抗マウス免疫グロブリ
ンＧ（IgG）抗体の電気化学的ルミネッセンス検出感度 fac-（bpy）Re(CO)3［３−（４−ピリジル）−プロピ
オン酸］ClO4・H2O（化合物VI）で標識付けした抗−マ
ウスIgG抗体（レニウム標識付けウサギ抗−マウスIgG抗
体）の電気化学的ルミネッセンスを、下に記述するよう
にして調製された溶液10mlを含む15ml三口丸底フラスコ
中で測定した、即ち;1.5mm×10mm磁気撹拌棒;1.0mm直径
の銀線擬参照電極；組み合わせ28ゲージ白金線対電極；
及び0.1mm厚高研磨白金箔の1cm×1cmの四角の片に溶接
した22ゲージ白金線からなる作用電極。（作用白金箔電
極は、28ゲージ白金線対電極を3/32in等距離的に取り巻
いた3/16in直径の半円形に作用白金箔電極を成形し
た）。
銀線はEG＆G173型ポテンショスタット／ガルバノスタ
ットのEG＆G178型電位計プローブに接続した。白金線対
電極及び白金作用電極はEG＆G173型ポテンショスタット
の陽極及び陰極に夫々接続した。装置は接地した。
レニウム標識付けウサギ抗−マウスIgG抗体溶液から
発した電気化学的ルミネッセンスを、コダック＃23Aゼ
ラチン（赤色）フィルターを取りつけたプロダクツ・フ
ォア・リサーチPR1402RF光電子倍増管内に設定された浜
松R928光電子増倍管を用いて検出された。光電子増倍管
室をオリエル7070型光電子増倍管検出装置に接続した。
０〜−2.0Vの陰極電位で１秒間隔でパルスを発生させ
ることにより、電気化学的ルミネッセンスを誘導した。
電気化学的ルミネッセンスの測定は、ミクロンタ22191
でデジタルマルチメーターに接続した積分器を用いて、
得られた電気化学的ルミネッセンス光電子増倍管信号を
積分することにより行なわれた。電気化学的ルミネッセ
ンス信号は、パルス発生中10秒間積分し、mVで記録され
た。
1.25×10-7Ｍレニウム標識付けウサギ抗−マウスIgG
抗体の保存溶液を標識付けした抗体の濃厚溶液（2mg/m
l、7.5Re/抗体）から、ホスフェート緩衝塩水（PBS）中
に希釈することにより調製した。この溶液の一部分（80
μｌずつ）を、反応容器中、0.1Mのテトラブチルアンモ
ニウム テトラフルオロボレート（TBABF4）及び18mMの
過硫酸アンモニウムを含むジメチルスルホキシド（DMS
O）／脱イオン蒸留水（1:1）10mlに添加した。最終レニ
ウム標識付け抗体濃度は１×10-9Ｍであった。上述の如
く、電気化学的ルミネッセンスが測定された。
レニウム標識付けウサギ抗−マウスIgG抗体保存溶液
を種々に薄めた付加的溶液を作り、それら溶液の一部分
ずつ（80μｌずつ）を反応容器中、同じレニウム標識付
け抗体の溶液へ少しずつ添加し、それによって標識付け
抗体の濃度を、５×10-9Ｍ、１×10-8Ｍ及び５×10-8Ｍ
にした。記載の各溶液について電気化学的ルミネッセン
スの測定を行なった。これらの結果は、標識付け抗体
（１×10-9Ｍ）の電気化学的ルミネッセンス検出の感度
を示し、レニウム標識付け抗−マウスIgG抗体の濃度に
対する電気化学的ルミネッセンス強度の依存性を示して
いる。
実施例10 ウシ血清アルブミン抗体についての均質電気化学的ルミ
ネッセンス免疫検査 fac-（bpy）Re(CO)3［３−（４−ピリジル）−プロピオ
ン酸］ClO4・H2O〔化合物VI〕で標識付けされたウシ血
清アルブミン（BSA）を7.8×10-6Ｍ含有する溶液を、レ
ニウム標識付けBSAの保存溶液（2.5mg/ml、6Re/BSA）を
ホスフェート緩衝塩水（PBS）で希釈することにより調
製した。この溶液26μｌずつを、反応容器中、0.1M TBA
BF4及び18mM過硫酸アンモニウムを含む10mlのDMSO/脱イ
オン蒸留水（1:1）に添加した。最終レニウム標識付けB
SA濃度は２×10-8Ｍであった。実施例９に記載した如
く、電気化学的ルミネッセンスが測定された。
同様なやり方で、7.8×10-6Ｍの無標識BSAを含有する
溶液を調製し、反応容器へ添加して５×10-8Ｍの最終的
無標識BSA濃度を与えた。この溶液及びBSAを含まない同
様な溶液の電気化学的ルミネッセンスを測定した。
3.75×10-5Ｍのウサギ抗BSA抗体を含有する溶液を、
ウサギ抗BSA抗体保存溶液（6.0mg/ml）から、PBSで希釈
することにより調製し、一部分（26μｌずつ）を、反応
容器中、レニウム標識付けBSAの溶液へ添加し、１×10
-7Ｍの最終ウサギ抗BSA抗体濃度を与えた。
得られたレニウム標識付けBSA抗原と抗体（ウサギ抗B
SA）との混合物の電気化学的ルミネッセンスを測定し
た。それらの結果はウサギ抗BSA抗体を添加することに
よりレニウム標識付けBSAの電気化学的ルミネッセンス
が減少することを示し、BSAに対する抗体の均質電気化
学的ルミネッセンス検出を達成することができることを
示している。これらの結果に基づき、当業者には、他の
検査したいアナライトを検出するための均質電気化学的
ルミネッセンス免疫検査を開発することができることが
分かるであろう。
実施例11 マウス抗−レジネラ免疫グロブリンＧ（IgG）抗体及び
レニウム標識付けウサギ抗−マウス免疫グロブリンＧ
（IgG）抗体を用いたレジネラのための不均質電気化学
的ルミネッセンス免疫検査 バクテリウム レジネラ ミクデディアイ（Legionel
la micdadei）のホルマリン懸濁物を、PBS懸濁液で希釈
することにより1.00の光学密度（425nmで）に調節し
た。約３×109個の細胞を円錐状マイクロ遠心分離管に
入れた。細胞を遠心分離にかけ（10分間、10,000rp
m）、上澄み液を傾瀉し、細胞を、PBS（1ml）中レジネ
ラ ミクデディアイ（Legionella micdadei）に特異性
のマウス モノクローナルIgG抗体の1:50希釈液（1.45m
g/ml）に再懸濁した。室温で１時間培養した後、細胞を
遠心分離にかけ、上澄み液を傾瀉し、細胞を、PBS緩衝
液中に再懸濁し、再び遠心分離にかけた。上澄み液を傾
瀉した後、細胞を、fac-（bpy）Re(CO)3［３−（４−ピ
リジル）−プロピオン酸］ClO4・H2O化合物VIで標識付
けされたウサギ抗−マウスIgG抗体、即ちレニウム標識
付けウサギ抗−マウスIgG抗体の1:50希釈液（PBS）中に
再懸濁した（2mg/ml、7.5Re/抗体）。室温で１時間培養
した後、細胞を遠心分離にかけ、上澄み液を傾瀉し、細
胞を、PBS中に再懸濁し、二度洗浄し、前の如く再び遠
心分離にかけた。最後の洗浄後、細胞を200μｌのPBSに
再懸濁した。その細胞懸濁物100μｌを、0.1M TBABF4及
び18mM過硫酸アンモニウムを含む10mlのDMSO/脱イオン
蒸留水（1:1）の入った反応容器中に添加した。その細
胞懸濁物について電気化学的ルミネッセンスを測定し
た。更に100μｌの細胞懸濁物を反応容器へ添加し、電
気化学的ルミネッセンスを測定した。実施例９に記載し
た方法に従い、対照として細胞を含まない溶液について
電気化学的ルミネッセンスを測定した。レニウム標識付
けウサギ抗マウスIgG抗体を用いたレギネラのための不
均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査を成功裡に行な
うことができる。
実施例12 ２−［３−（４−メチル−2,2′−ビピリジン−４′−
プロピル］−1,3′ジオキソランの製造 アルゴンの不活性雰囲気中、30mlの乾燥テトラヒドロ
フラン（THF）及び7.65mlの乾燥ジイソプロピルアミン
（54.6mM）を、600mlの三口フラスコへ注射器により撹
拌しながら入れた。溶液を、深底ビーカー中のドライア
イス・イソプロパノール混合物中にフラスコを浸漬する
ことにより−78℃に冷却した。21.6mlの2.5M n−ブチル
リチューム（54mM）をゆっくりフラスコへ添加した。得
られた溶液を15分間撹拌し、乾燥THF100ml中に溶解した
4,4′−ジメチル−2,2′−ビピリジン（52mM）9.58gの
溶液を、１時間に亙って撹拌しながらカニューレにより
滴下した。
得られた褐色の混合物を−78℃で２時間更に撹拌し、
10gの２−（２−ブロモエチル）−1,3−ジオキソラン
（55mM）を注射器により添加し、得られた混合物を−78
℃で５分間撹拌した。次に反応容器を氷浴（10℃）中に
入れると、30分後色が変化し始めた。１時間後色は暗紫
色になり、２時間後色は青くなり、2.5時間後色は緑に
なり、3.25時間後色はレモン黄色になった。
反応混合物は、30mlの飽和NaCl、続いて10mlの水及び
50mlエーテルで急冷した。水性相を300mlのエーテルで
２度抽出し、一緒にしたエーテル相を100mlの水で逆抽
出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。
反応生成物を精製するため、活性度III中性のアルミ
ナ（メルク）90で分離した。用いた溶離剤は、石油エー
テル／ジエチルエーテル（1:1）であった〔出発物質は
石油エーテル／ジエチルエーテル（2:1）で完全に溶離
し、次に生成物が溶離した〕。
プロトンNMR分析により、分離された反応生成物の構
造は次の通りであることが確認された。
実施例13 （４−ブタン−１−アル）−４′−メチル−2,2′−ビ
ピリジンの製造及び精製 2gの２−［３−（４−メチル−2,2′−ビピリジン−
４′−イル）−プロピル］−1,3ジオキソランを50mlの1
N HClに溶解し、50℃で２時間加熱した。溶液を冷却
し、重炭酸ナトリウムでpH7〜８へ調節し、クロロホル
ム100mlで２度抽出した。
一緒にしたクロロホルム相を少量の水で洗浄し、硫酸
ナトリウム上で乾燥し、過し、回転蒸発させて黄色の
油を生じた。
黄色の油を、溶離剤として酢酸エチル／トルエン（1:
1）を用いたシリカゲルカラムで精製し、不純物をメタ
ノールで溶離した。
プロトンNMR分析〔1.96-2.11(m、2H);2.43(s、3H);2.46
-2.50)(t、2H);2.53-2.80(M、2H);7.12-7.14(m、2H):8
.h17-8.21(br.s、2H);8.52-8.58(m、2H);9.89(s、1H)〕に
より、反応生成物が次の構造をもつことが確認された。
実施例14 ４−（４−メチル−2,2′−ビピリジン−４′−イル）
酪酸の製造 0.5gの４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−2,
2′−ビピリジン（2.0mM）を10mlの無水アセトンに溶解
した。225mgの微粉末過マンガン酸カリウム（KMnO4;1.4
2mM）を溶液に撹拌しながら少しずつ添加した。反応物
を薄層クロマトグラフ（シリカ；酢酸エチル／トルエン
50:50）にかけ、それによりアルデヒドが徐々に消える
に従って、低Rfのビピリジンが形成されたことが示され
た。
反応が完結した後、水を添加し、MnO2を過し、少量
ずつのNa2CO3（水溶液）で洗浄した。アセトンを回転蒸
発させ、残留物をCH2Cl2で抽出し、非酸性ビピリジンを
除去した。水溶液を1.0N HClを注意深く添加して酸性に
し、pHを4.8にした。溶液はこのpHに達すると少し曇
り、懸濁物はpHを低くすると再び溶解した。混合物を同
じ量のCH2Cl2で５回抽出し、Na2SO4上で乾燥し、回転蒸
発させて、油を得、それは真空中ですぐに固化した。粗
製固体をクロロホルム：石油エーテルで再結晶し、白色
の結晶を得た。
融点:103.5℃−105.5℃;IR:1704cm-1。プロトンNMR分
析は次の構造に一致していた。
実施例15 テオフィリンに特異性の抗体を用いたRe（Ｉ）−テオフ
ィリン接合により発生した電気化学的ルミネッセンス信
号の変調 テオフィリンに共有結合（接合）された化合物VIを、
0.35Mのフッ化ナトリウムを含有する0.1Mホスフェート
緩衝液pH6.0（PBF緩衝液）を用いて最終濃度150nMの最
終濃度へ希釈した。テオフィリンに対し特異性のモノク
ローナル抗体（クローン数9-49、腹水ロット番号WO39
9、カタログ番号046）を、カレスタッド・ラボラトリー
ズ社（Kallestad Laboratories,Inc.）（チャスカ、M
N）から得られた。そのモノクローナル抗体をPBF緩衝液
を用いて種々の濃度に希釈した（蛋白質21.9μg/ml〜70
0μg/ml）。
テオフィリンと反応しない別のモノクローナル抗体
（対照MAB）を、シグマ（セントルイス、Ｍ）から得、P
BF緩衝液を用いて蛋白質21.9μg/ml〜700μg/mlの種々
の濃度へ希釈した。テオフィリンの標準溶液を、アルド
リッヒ・ケミカル社（ミルウォーキー、WI）から得られ
たテオフィリン（カタログ番号26-140-8、M.W.180.17）
を用いて調製した。テオフィリンをPBF緩衝液に溶液溶
解し、75μＭの最終濃度にし、検査で用いるためPBF緩
衝液で希釈した６μＭにした。電気化学的ルミネッセン
ス測定を行なう前に、250mMの蓚酸及び５％（v/v）のト
リトンX100（ECL溶液）を含む溶液を反応混合物へ添加
した。測定は、二つの白金網電極を反応溶液の入った試
験管中へいれることができるように修正したベルトホル
ド ルミノメーターを用いて行なった。電極はポテンシ
ョスタットへ接続し、電気化学的ルミネッセンスの測定
は、50mV/秒の走査速度で1.5Vから2.5Vまで電極に印加
した電位を走査することにより行なった。測定に用いた
ベルトホルド ルミノメーターは、高利得の赤色感応性
光電子増倍管を具えていた。記録計へのルミノメーター
の出力は105カウント/Vに調節された。測定値はＸ−Ｙ
−Ｙ′記録計に記録され、ピークの高さが電気化学的ル
ミネッセンスの測定値として用いられた。電極は測定の
間で、0.1Mホスフェート、0.1シトレート、0.025M蓚酸
及び１％トリトンX-100を含有するpH4.2の緩衝液で濯
ぎ、この溶液中の電極に＋2.2から−2.2Vの間のパルス
を60秒間かけ、次に10秒間−2.2Vをかけることにより清
浄にした。次に電極をこの溶液から取り出し、蒸留水で
濯ぎ、そして拭いて乾かした。実験は下に概略述べるよ
うに行なった。
対照モノクローナル抗体、テオフィリンに対する抗体
又はPBF緩衝液の溶液を一組の試験管に入れた（工程
１）。試験管ヘテオフィリン又はPBF緩衝液の溶液を添
加した（工程２）。溶液を、試験管を簡単に振ることに
より混合し、それらを室温で25分間反応させた。次に接
合体溶液を試験管へ添加した（工程３）。試験管を振
り、室温で15分間保持した。最後にECL溶液を各試験管
に100mlずつ添加し、電気化学的ルミネッセンスを上で
述べた如く測定した。
抗体−Re（Ｉ）−テオフィリン接合接合体（「接合
体」）相互作用の電気化学的ルミネッセンスに与える影
響を研究するための実験工程 実験は、テオフィリンを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体は、レニウム化合物（化合物６）が結合された
テオフィリン、例えばRe（Ｉ）−テオフィリン接合体、
に接触すると、電気化学的ルミネッセンスを減少するこ
とを示している。電気化学的ルミネッセンスの減少は、
接合体濃度が一定に保たれた場合、抗体の濃度に比例す
る。テオフィリンと反応しない抗体を用いた時、抗体の
最大濃度の所で電気化学的ルミネッセンスの僅かな減少
しか見られない。
データーは、テオフィリンが抗−テオフィリン抗体と
接触し、次に接合体が混合物へ添加された時、電気化学
的ルミネッセンスの量が大きくなることも示している。
このことは、抗体の結合のためにテオフィリンが競争
し、電気化学的ルミネッセンスを発生することができる
接合体の量を一層大きくすることを示している。
実施例16 均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査に基づく血清中
のテオフィリンについての検査 実施例15に記載した結果に基づいて、テオフィリンに
対する均質免疫検査法が、テオフィリンに対する抗体及
び実施例15に記載したRe（Ｉ）−テオフィリン接合接合
体（「接合体」）を競争結合方式で用いることにより開
発された。用いられた材料は実施例15に記載されてい
る。但しPBF緩衝液は0.1Mフッ化ナトリウムを含有する
0.1Mホスフェート緩衝液pH6.0であった。この検査のた
め、テオフィリンに対するモノクローナル抗体の特別な
濃度が選択された。抗体濃度は55μg/mlであった。接合
体濃度を175nMに調節した。テオフィリンをヒト血清に
添加し、血清に対するテオフィリンの最終濃度を2.5、
５、10、20及び40μg/mlにした。
検査は次のようにして行われた。10μｌずつの血清
を、290μｌずつの抗−テオフィリンモノクローナル抗
体へ添加し、その溶液を室温で25分間保持する。次に接
合体100μｌを各試験管に添加し、35nMの最終濃度に
し、この溶液を室温で15分間保持した。実施例15に記述
したECL溶液100μｌを次に各試験管に添加し、それら溶
液の電気化学的ルミネッセンス性を、前に記述した如
く、50mV/秒で1.5Vから2.5Vへ走査するやり方を用いて
測定した。結果は、血清試料中のテオフィリンの濃度
と、反応混合物によって放出された電気化学的ルミネッ
センスの量との間に相関関係があることを示している。
この観察は、テオフィリンのための検査方法を開発する
ことができることを示している。
これらの結果に基づいて、当業者は、生物学的マトリ
ックス中の検査したいアナライトを検出し、定量化する
均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査を開発すること
ができるであろう。
実施例17 均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査に基づく溶血、
脂肪血、黄疸及び正常血清試料中のテオフィリンについ
ての検査及び蛍光分極検査との比較 異なった種類の血清試料中のテオフィリンの濃度を、
均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査法を用いて決定
した。検査方式は、テオフィリンに対する特異性モノク
ローナル抗体及び実施例15に記載した「接合体」を用い
た競争結合検査法である。電気化学的ルミネッセンスの
ための試薬及び方法は前の実施例に記載されている。
異なった血清試料中のテオフィリンの濃度を測定する
のに用いた蛍光分極試験は、アボット・ラボラトリーズ
（Abbott Laboratories）（イリノイ州ノースシカゴ）
からの自動TDX装置を用いて行われた。溶血、脂肪血、
黄疸及び正常血清を検査で用い、異常血清についてのデ
ーターを下に列挙する。
種々の量のテオフィリンを血清試料へ添加し、テオフ
ィリン2.5μg/ml〜テオフィリン40μg/mlの最終濃度に
した。均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査について
のデーターを獲た。
各血清試料を、同じく蛍光分極検査によりテオフィリ
ンの濃度について分析した。均質電気化学的ルミネッセ
ンス免疫検査及び蛍光分極検査により測定されたテオフ
ィリンの濃度を比較した。データーを点点図（scatterg
ram）としてプロットした。データー点を直線回帰によ
り分析し、相関関係を計算した。分析値は二つの検査の
間の優れた相関関係を示していた。相関係数（ｒ）は大
きかった。正常、溶血、及び脂肪血血清試料についての
直線の勾配は0.8〜1.2であり、これら血清試料からのテ
オフィリンの優れた回収を示していた。
テオフィリンを含有する黄疸血清試料によって放出さ
れた電気化学的ルミネッセンスは、他の血清試料のもの
より高かったが、それは各テオフィリン濃度で比例して
高かった。相関係数は、電気化学的ルミネッセンスと蛍
光分極とを比較したデーター点について高かったが、勾
配は黄疸血清試料中のテオフィリンに対し一層高回収を
示していた。
これらの結果に基づいて、黄疸試料中のテオフィリン
の濃度を、黄疸血清の各部分に既知の量の「接合体」を
添加することにより、試料についての標準曲線を確立す
ることにより決定することができるであろう。これらの
データーは、均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査
を、ヘモグロビン、脂質及びビリルビンを異常な量で含
有する血清試料中に存在するテオフィリンの濃度を測定
するのに用いてもよいことを示している。
均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査は、蛍光分極
方法よりも幾つかの利点を有する。なぜなら、ECL検出
の融通性、即ち生物学的分子の一層高い濃度では一層敏
感な検出が行えるからである。
均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査は、蛍光分極
方法よりも更に幾つかの利点を有する。なぜなら、入射
光源は不必要であり、電気的励起は充分な光発生の場合
だけ必要になるからである。従って、複雑な光学的装置
は不必要になる。測定原理は電気化学的励起によって起
こされる純粋に特性フォトン発光であるので、系の感度
は蛍光分極より潜在的に遥かに大きく一層広いダイナミ
ック範囲を達成することができるであろう。また、均質
電気化学的ルミネッセンス免疫検査を用いることによ
り、蛍光分極によって与えられるよりも遥かに多種類の
アナライトの測定が可能であり、一層広いダイナミック
範囲が達成されるであろう。また、生物学的分子認識事
象、例えば抗体・抗原相互作用による、電気的に励起さ
れた化学的ルミネッセンスの選択的変調により、均質電
気化学的ルミネッセンス免疫検査を用いた場合には、蛍
光分極によって与えられるよりも遥かに多種類のアナラ
イトを測定することが可能である。
これらの結果に基づいて、当業者には異常血清試料中
の他の検査したいアナライトを検出するための均質電気
化学的ルミネッセンス免疫検査法を開発することができ
ることが分かるであろう。
実施例18 不均質電気化学的ルミネッセンス検査に基づく血清中の
テオフィリンについての検査 免疫検査方式を用いて、テオフィリンの為の不均質検
査法を、化合物VI標識付け抗−テオフィリン抗体及びバ
イオマグ磁気粒子に固定したテオフィリンBSAを用いて
開発した。抗体濃度は、20μg/mlであった。磁気粒子濃
度は固体１％（重量／体積）であった。テオフィリン
は、最終濃度10及び40μg/mlの血清へ添加した。テオフ
ィリン血清標準物は、0.1％のBSAを含むPBF緩衝液（0.1
Mフッ化ナトリウム含有燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.0）
で1000倍に希釈した。
検査は次のようにして行われた。化合物VIへ接合した
抗体の75μｌへ希釈血清標準物75μｌを添加し、その溶
液を室温で20分間培養した。次にテオフィリン−BSA−
バイオマグ粒子50μｌを添加し、懸濁物を５分間放置し
た。粒子を磁気的に分離し、上澄み液100μｌを電気化
学的ルミネッセンスについて測定した。
結果に基づき、当業者は、生物学的マトリックス中の
検査したい他のアナライトについての不均質電気化学的
ルミネッセンス免疫検査法を開発することができるであ
ろう。
実施例19 電気化学的ルミネッセンス モイエティを持つ標識付け
用DNA 次の方法は電気化学的ルミネッセンス モイエティを
有する標識DNAに対して用いられた。
1.0A260の慣用的合成38mer（MBI 38） TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAGT （式中、Ｔ★は炭素５の所で −CH＝CH−CO−NH(CH2)7-NH2 により修飾されたチミジンである） をpH8.7の0.01Mホスフェート緩衝液100μｌ中に溶解し
た。fac-（bpy）Re(CO)3［３−（４−ビピリジル）−プ
ロピオン酸］ClO4・H2O（化合物VI）の溶液（pH8.7の燐
酸カリウム0.01M緩衝液300μｌ中に2.3mg入れたもの）1
00μｌを添加した。内容物を撹拌し、室温で一晩放置し
た。
硼水素化ナトリウムの飽和水溶液100μｌを混合物へ
添加し、可逆性イミン シッフ塩基結合を非可逆性アミ
ン結合へ転化した。反応を室温で２時間行わせた。次に
溶液を数滴の希釈酢酸で注意深く処理し、硼水素化ナト
リウムの過剰を消失させた。反応溶液をＰ−２ゲル過
カラム（18in×1/2in）中へ導入した。そのカラムは予
めpH6.77の0.1Mトリエチルアンモニウムアセテートで平
衡状態にさせてあった。カラムを同じ緩衝液で溶離し、
20ml/時の流量で2mlずつの分画部分を収集した。分画９
及び10で溶離されたDNAは未反応レニウム錯体とよく分
離された。収集DNA試料は典型的なUV吸収を示し、更
に、励起した時蛍光発光スペクトルを示した。蛍光発光
は、DNA試料中にレニウムモイエティが存在していたこ
とを示している。生成物は、ポリアクリルアミド ゲル
電気泳動で一本の蛍光帯として移動する。標識付けした
DNA（MBI 38−化合物VI接合体）の電気泳動易動度は、
無標識DNAとほぼ同じであった。
実施例20 標識付けされたDNAの電気的に発生させた化学的ルミネ
ッセンス性 実施例19からの標識付けされたDNA試料、合成体Ａ（M
BI 38−化合物Ｉ）をその電気化学的ルミネッセンス性
を研究するために用いた。種々の濃度の標識付けDNA
を、0.1Mのシトレート、25mMのオキサレート及び1.0％
のトリトンX-100を含むpH4.2の0.1Mホスフェート緩衝液
0.5ml中に溶解し、修正ベルトホルド ルミノメーター
で測定した。電気的ルミネッセンス信号は種々のDNA濃
度に応答していた。
実施例21 化合物VI−標識付けされたオリゴヌクレオチドのハイブ
リダイゼーション研究 実施例20に記載した38merのオリゴマーに対する相補
的鎖を、ABI380B型DNA合成器を用いて合成し、MGEN-38
の記号を付けた。
化合物Ｉのオリゴヌクレオチドへの共有結合がMBI38
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション性に影響を
与えるかどうかを決定するため、次の実験が考えられ
た。種々の濃度の標的断片（MGEN-38）を、一枚のゲル
マン（Gelman）RPナイロン膜にスポットし、固定し、MB
I 38又はMBI 38−化合物VIでプローブした。両方の断片
は、T4ポリヌクレオチド キナーゼ及びγ32P［ATP］で
処理し、32Pで５′端に標識付けした。次にDNA及び化合
物VI標識付けDNAのハイブリダイゼーション感度を比較
した。
MGEN-38DNAの濃度は、50ng〜0.05ngの範囲であり、ナ
イロン膜にスポットし、空気乾燥した。二枚の膜を作っ
た。ブロット（blot）を夫々２分ずつ次のように処理し
た:DNAを完全に変性するため1.5M NaCl-0.5NaOH;ブロッ
トを中和するため1.5M NaCl-0.5M TIRS;及び最後に2X S
SC。ブロットを真空炉中で80℃で２時間加熱した。
ハイブリダイゼーション プローブは次のようにして
調製された:3μｇずつのMBI 38及びMBI 38−化合物Ｉ
を、10単位ずつのT4キナーゼ及び125μキューリーのγ
32P‐ATPでキナーゼ処理をした、即ち燐酸基をオリゴマ
ーへ転移させた。DNAへのアイソトープ組込み％を決定
した。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーシ
ョン溶液を、マニアテス（24）に従って調製した。ブロ
ットを４時間53℃で50μg/mlの仔牛チマスDNAでプレハ
イブリド化した。次にブロットを、10,000,000cpmで各
プローブを含むハイブリダイゼーション溶液中に入れ、
53℃で一晩（12時間）ハイブリド化した。次の日ブロッ
トを次のように洗浄した： −夫々15分ずつ53℃で2X SSC＋0.1％SDSで２回、 −（上述と同じく）0.2X SSC＋0.1％SDSで２回、 −（上述と同じく）0.16X SSC＋0.1％SDSで２回。
次にブロットを空気乾燥し、コダックＸ−オマト フ
イルムへ−70℃で露出した。
Ｘ線分析により、MBI 38及びMBI 38−化合物VIプロー
ブで非常に似たハイブリダイゼーション模様が観察され
ることが示された。両方の場合とも、0.5ngの標的への
プローブのハイブリダイゼーションが観察され、0.05ng
までの低い標的DNAへのかすかな微量のハイブリダイゼ
ーションが観察された。負制御DNA（50ngでスポットさ
れたファージλDNA）についてはプローブによるハイブ
リダイゼーション活動は検出されなかった。
実施例22 実施例21に記載した如く、 で標識付けされた38mer E.coliプローブを、マニアテス
によるE.coli核酸の試料でハイブリド化した〔Maniati
s,T.,Fritsch,E.F.＆Sambrook,J.,Molecular Cloning:A
laboratory manual,p.150-160,Cold Press Harbor Pre
ss,（1982）（ニューヨーク州コールド・スプリング・
ハーバー）〕。次にハイブリド化複合体を、信号プロー
ブに隣接したE.coli DNAの別の配列に相補的な別の固体
支持体結合プローブにより捕捉させた。捕捉手順は、こ
のプロトコルの最初の部分について用いられたのと同じ
ハイブリダイゼーション条件を用いた。ハイブリド化さ
れた複合体を遠心分離により単一鎖核酸から分離し、繰
り返し洗浄した。次に分離された複合体を５分間水中で
100℃で加熱し、複合体を解離した。今度は溶液中へ放
出された標識付けされたプローブを、電気化学的ルミネ
ッセンス信号を測定するため適当なカクテル（cocktai
l）中へ移行させた。信号の強度は標的DNAの量に直線的
に相当していた。
アミノ結合DNA（E.coliからの15ヌクレオチド一致配
列を含む38-mer）の試料を、pH8.7の0.01Mホスフェート
緩衝液100μｌ中に溶解した。オスミウム錯体 の溶液（pH8.7の0.01M燐酸カリウム緩衝液300μｌ中2.3
mg）100μｌを添加した。内容物を撹拌し、室温で一晩
放置した。
硼水素化ナトリウムの飽和水溶液100μｌを混合物へ
添加し、可逆性イミン シッフ塩基結合を非可逆性アミ
ン結合へ転化した。反応を室温で２時間行わせた。標識
付けされたプローブをゲル過クロマトグラフにより精
製した。標識付けされたDNAプローブはオスミウム錯体
の結合と一致した分光性を示した。
オスミウム錯体で標識付けされたプローブを、上記マ
ニアテスによるE.coli核酸の試料でハイブリド化した。
次にハイブリド化複合体を、信号プローブに隣接したE.
coli DNAの別の配列に相補的な別の固体支持体結合プロ
ーブにより捕捉させた。捕捉手順は、このプロトコルの
最初の部分について用いられたのと同じハイブリダイゼ
ーション条件を用いた。ハイブリド化された複合体を遠
心分離により単一鎖核酸から分離し、繰り返し洗浄し
た。次に分離された複合体を５分間水中で100℃で加熱
し、複合体を解離した。今度は溶液中へ放出された標識
付けされたプローブを、電気化学的ルミネッセンス信号
を測定するため適当なカクテル（cocktail）中へ移行さ
せた。信号の強度は標的DNAの量に直線的に相当してい
た。
と先ず、無水ジメチルホルムアミド60μｌ中に3mg溶解
し、それを、94mgのジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）の存在下で無水DMF200μｌ中に入れたＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド（52mg）の溶液で処理することに
より、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体へ転化し
た。反応は０℃で４時間進行させた。沈澱したジシクロ
ヘキシル尿素を遠心分離により除去し、上澄み液（200
μｌ）を、pH8.77の0.01Mホスフェート緩衝液中にアミ
ノ結合DNA（E.coliからの15ヌクレオチド一致配列を含
む38-mer）を入れた溶液へ添加した（緩衝液100μｌ中2
A260）。反応は室温で一晩進行させた。かなりの量の固
体が反応中に現れ、それをガラスウールで過すること
により除去した。液を濃縮し、1Mのトリエチルアンモ
ニウムアセテート（pH6.8）0.5ml中に溶解した。次に反
応混合物をゲル過カラムでクロマトグラフにかけた。
標識付けされたDNAプローブはレニウム錯体の結合と一
致した分光性を示した（em 594nm）。
次にレニウムで標識付けされたプローブを、上記マニ
アテスによるE.coli核酸の試料でハイブリド化した。次
にハイブリド化複合体を、信号プローブに隣接したE.co
li DNAの別のセグメントに相補的な別の固体支持体結合
プローブにより捕捉させた。捕捉手順は、このプロトコ
ルの最初の部分について用いられたのと同じハイブリダ
イゼーション条件を用いた。ハイブリド化された複合体
を遠心分離により単一鎖核酸から分離し、繰り返し洗浄
した。次に分離された複合体を５分間水中で100℃で加
熱し、複合体を解離した。今度は溶液中へ放出された標
識付けされたプローブを、電気化学的ルミネッセンス信
号を測定するため適当なカクテル中へ移行させた。信号
の強度は標的DNAの量に直線的に相当していた。
ルテニウム、レニウム及びオスミウム錯体で独立に標
識付けされたE.coliからの38-merDNAプローブを別々の
実験で用いて、それらの相補的配列とハイブリド化し
た。デュプレックスの電気化学的ルミネッセンス信号
を、対応する標識付けした単一鎖プローブの電気化学的
ルミネッセンス信号と比較した。電気化学的ルミネッセ
ンス信号の変調が各デュプレックスについて観察され
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポウエル，マイクル ジェイ. アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，ウォー アドミラル ウェイ ５ (72)発明者 ドレシック，ウォルター ジェイ. アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，マルベリイ コート 18215 (72)発明者 レランド，ジョナサン ケイ. アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，エヌ．サミット ア ベニュー 384 (72)発明者 ヒノ，ジャネル ケイ. アメリカ合衆国22201 バージニア州, アーリントン，ナンバー23 ノース カ ルバート ストリート 2020 (72)発明者 プーニアン，モヒンダー エス. アメリカ合衆国20879 メリーランド州, ゲイサースバーグ，ハイ ティンバー コート 224 (72)発明者 デラ シアナ，レオポルド アメリカ合衆国20877 メリーランド州, ゲイサースバーグ，マルベリイ コート 18215

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の式を有するRe錯体化合物： 〔Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、ＰはReのポリデンテート リガンドであって、
    ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロ
    リル、ポリフィリン、置換ビピリジル、置換ビピラジ
    ル、置換テルピリジル、置換フェナントロリル及び置換
    ポルフィリンからなる群より選ばれ、そしてこれらの置
    換されたリガンドは、それぞれ、アルキル、置換アルキ
    ル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラル
    キル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カル
    ボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グ
    アニジン、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒ
    ドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルで
    置換されており； L1、L2、L3、L4、L5及びL6はReのリガンドで、その各々
    は互いに同じでも異なっていてもよく、カルボニル、ビ
    ピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロリ
    ル、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジ
    ル、置換フェナントロリル及び置換ポルフィリンからな
    る群より選ばれ、そしてこれらの置換されたリガンド
    は、それぞれ、アルキル、置換アルキル、アリール、置
    換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシ
    レート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シア
    ノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニ
    ル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジン、ウレイ
    ド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキシスクシン
    イミドのカルボキシレートエステルで置換されており； ＢはReのリガンドであるか、又はＰ、L1、L2、L3、L4、
    L5及びL6の一つもしくはそれ以上に共役している物質で
    あって、全細胞、細胞内粒子、ポリペプチド、核酸、多
    糖類、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸
    又は非生物学的重合体であり； ｍは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数であり； ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； ｕは１に等しいか又はそれより大きい整数であり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、当該化合物が室
    温下200nmから900nmの範囲の波長の電気化学的ルミネッ
    センスを放出するように誘導することができそしてReの
    リガンドによって与えられるReへの全共有結合数がReの
    配位数６に等しくなるような組成及び数を有する。
  2. 【請求項２】Ｂが、血清由来抗体又はモノクローナル抗
    体である請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ｂが、一つ以上の直接アミド結合を通し
    て、Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも一つ以
    上に結合している請求項１に記載の化合物。
  4. 【請求項４】〔Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)
    r(L6)s〕tが次の構造を有するものである、請求項１に
    記載の化合物： （式中、ｎは１、２又は３である）
  5. 【請求項５】〔Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)
    r(L6)s〕tが次の構造を有するものである、請求項１に
    記載の化合物： （式中、ｎは１、２又は３である）
  6. 【請求項６】〔Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)
    r(L6)s〕tが次の構造を有するものである、請求項１に
    記載の化合物： 〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも異なっていて
    もよく、Ｘ及びＸ′はN(C2H5)2、CH3、CH3O、C6H5、C
    l、CO2CH3、CN、又はNO2でよく、Ｙ及びＹ′はＨ又はCH
    3でよく、もしＸとＸ′、及びＹとＹ′が同じで、ＸがC
    O2CH3であるならば、ＹはＨではなく、更にもしＸと
    Ｘ′、及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及びＹはＨ
    ではなく；そしてＲは陰イオンである〕。
  7. 【請求項７】〔Re(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)
    r(L6)s〕tが次の式を有するものである、請求項１に記
    載の化合物： （式中、ＷはCHO、COOH、NH2及びBrからなる群から選択
    されたものであり、Ｒは陰イオンであり、ｎは整数であ
    り、ｍは１、２又は３であり、ビピリジル基は置換され
    ていてもいなくてもよい）。
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