FI111758B - Lyoluminesenssin käyttö analyyttisiin tarkoituksiin - Google Patents

Description

Lyoluminesenssin käyttö analyyttisiin tarkoituksiin 111758

Lyoluminesenssiksi (LL) kutsutaan prosesseja, joissa aineen liukeneminen tuottaa valoa (G. Reynolds, Journal of Luminescence, 54(1992)43.). Tämä keksintö koskee 5 lyoluminesenssi-ilmiön hyväksikäyttöä leima-aineiden detektoinnissa biokemiallisissa ja analyyttisen sekä kliinisen kemian määritysmenetelmissä.

Erilaisissa analyyttisissä menetelmissä käytetään usein apuna luminoivia (fluoresoivia tai fosforesoivia) leima- eli merkkiaineita. Niiden avulla jokin toinen aine 10 (X) on merkattu eli leimattu ja (X) voidaan tunnistaa ja sen määrä analysoida leima- aineen avulla erilaisia tunnettuja tekniikoita käyttäen. Tällaisia leima-aineita, orgaanisia yhdisteitä ja metallikelaatteja, voidaan virittää valolla tai sähköisesti ja tuottaa täten leima-aineille spesifistä luminesenssia (I. Hemmilä, "Applications of Fluorescence in Immunoassays", John Wiley & Sons, New York, 1991; E. 15 Diamandis, Clinical Biochemistry, 23 (1990) 437., L. Faulkner and A. Bard, in "Electroanalytical Chemistry " Voi. 10., A. Bard, (Ed.), Marcel Dekker, New York, 1977, pp. 191-228). Mekanismiltaan vain osittain tunnettua lyoluminesenssia on aiemmin sovellettu vain radioaktiivisen säteilyn annosmittaukseen siten, että säteily muodostaa kiinteässä tilassa olevissa alkalihalideissa tai sokereissa loukkuuntuneita 20 aukkoja ja elektroneja, joiden määrä on verrannollinen säteilyn kestoon ja intensiteettiin. Radioaktiivisen säteilyn annos saadaan liuottamalla kiteet luminoforiliuokseen ja mittaamalla muodostuvan valon intensiteetti(G. Reynolds, Journal of Luminescence, 54 ^992)43.).

: ,· 25 Säteilydosimetrisista tutkimuksista tiedetään, että eräitä hydratoituneita metalli-ioneja : ·· ja orgaanisia luminoforeja voidaan virittää vesiliuoksissa tapahtuvissa LL- ;\t prosesseissa (G. Reynolds, Journal of Luminescence, 54(1992)43.). Kuitenkaan tiedolla erilaisten harvinaisten metalli-ionien tai monimutkaisten fluoroforien väkevyyksistä ei ole yleensä käytännön merkitystä. Lisäksi aiemmissa tutkimuksissa ;v, 30 LL-intensiteetin riippuvuus luminoforien konsentraatiosta on tuottanut kapeilla .·*·. konsentraatioalueilla kellomaisia käyriä, joissa kaksi eri luminoforikonsentraatiota • t tuottavat saman signaalin (G. Reynolds, Journal of Luminescence, 54(1992)43., ‘ ’ kuvat 24 ja 25). Tällaisella systeemillä ei ole käyttöä analyyttisessa kemiassa eikä LL:a ole näistä syistä osattu soveltaa käytännön analytiikkaan.

:T: 35 Tämän keksinnön mukaisilla koejärjestelyillä kellokäyrät voidaan välttää ja esitetyillä tekniikoilla savutetaan erinomaisia leima-aineiden vasteita, joiden kuvaajat ovat lineaarisia useiden 10-kertalukujen alueilla. Näissä menetelmissä toimitaan 2 111758 päinvastoin kuin säteilydosimetrisissa menetelmissä eli suolaa säteilytetään vakioannoksella, ja mitataan luminoforilla leimattujen molekyylien määrä yleisimmin liuotuksessa muodostuvan valon perusteella. Tämä keksintö koskee lähinnä tapauksia, joissa itse analyytti ei ole saatettavissa LL-prosessin avulla luminoivaksi, 5 vaan analyytin määrä mitataan välillisesti käyttäen apuna luminoivia leima-aineita (L). Ne on yleensä sidottu kovalenttisesti joko analyyttiin (X) tai analyytin kanssa valikoivasti sitoutuvaan aineeseen (B), kuten vasta-aineeseen. Analyytin (X) määrä saadaan mitattua välillisesti joko kilpailureaktion avulla (X):n ja leimatun (X):n, (X-L):n kanssa, tai antamalla leimatun (B):n, (B-L), reagoida valikoivasti (X):n kanssa jolloin 10 muodostuu kompleksi (X-B-L). Kaikissa tapauksissa mitattava parametri on viimevaiheessa leima-aine, joka tässä keksinnössä mitataan LL:lla useimmiten sopivien erotus- tai pesuvaiheiden jälkeen. Tämän keksinnön mukaisesti LL:iin perustuva mittaus muodostaa merkittävän edun tietylle osalle bioaffiniteettiin perustuvia määritysmenetelmiä.

15

Tyypillisesti analyytti (X) on biomolekyyli, joka mitataan siihen äärimmäisen valikoivasti sitoutuvan vasta-aineen avulla bioaffiniteettiin perustuen. Kyseessä voi yhtä hyvin olla myös nukleiinihappojen väliset valikoivat sitoutumisreaktiot tai mitkä tahansa muut prosessit, joissa pystytään leimattu sitoutunut analyytti (X-L, X-B-L tai vastaava) 20 erottamaan vapaasta (X-L).stä tai (B-L):stä. Olennaista on, että vapaan ja leman välille saadaan valikoivan sitoutumisen ja/tai puhdistus- ja erotusprosessien aikana . . vastaavuus, jonka avulla (X):n alkuperäinen määrä näytteessä saadaan suoraan tai » · ! kääntäen verrannolliseen vastaavuuteen LL-signaaliin. Toisin kuin itse leima-aineiden ; mittauksella, ei-luminoivien analyyttien mittauksella on huomattavaa taloudellista ’ ; 25 merkitystä kliinisessä diagnostiikassa sekä ympäristö- ja agrokemiassa.

• ·

I I

• ’* Biologisten molekyylien sitoutumisominaisuuksiin perustuvissa mittauksissa, kuten

• · I

immunomäärityksissä, voidaan mitattava analyytti (X) valikoivasti kiinnittää erilaisten molekyylien seoksesta kiinteään faasiin liitettyyn vasta-aineeseen ja siihen tarttuneet : 30 molekyylit mitata toisen, myös aineeseen (X) valikoivasti kiinnittyvän vasta-aineen ’·.. * avulla, joka on merkattu eli leimattu sopivalla merkkiaineella. Merkkiaineita voivat olla ·:·· radioaktiiviset isotoopit, entsyymit, valoa absorboivat, fluoresoivat tai fosforesoivat molekyylit, tietyt metallikelaatit jne, jotka on liitetty kiinteällä sidoksella vasta- I I « aineeseen. Vaihtoehtoisesti puhdistettu (X) voidaan merkata ja määrittää sen avulla • i i ! . 35 tuntemattoman näytteen merkkaamattoman (X):n määrä kilpailureaktiolla. Monet • > * DNA:n ja RNA:n mittausmenetelmät perustuvat valikoivaan bioaffiniteettiiin ja voidaan siten mitata analogisesti. Myös muita kemiallisia ja biokemiallisia analyysejä voidaan tehdä näin. Erilaisia mittaustapoja ja -strategioita, joita voidaan käyttää 3 111758 immunodiagnostiikassa on kuvattu kirjassa The Immunoassay Handbook, Edited by David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, sivuilla 1-618.

Biokemiallisen, kliinisen kemian ja ympäristökemiallisen analyysin kaksi 5 pääkehityslinjaa, joilla kummallakin on omat etunsa, ovat toisaalta isoilla monimutkaisilla automaattisilla laitteilla tutkimuskeskuksissa ja isoissa sairaalalaboratorioissa suoritetut tarkat, nopeat ja standardisoidut analyysit ja toisaalta vähemmän tarkat, paikan päällä tehdyt analyysit.

10 Tämän keksinnön kohteena ovat erityisesti jälkimmäiset menetelmät. Niitä voidaan käyttää esimerkiksi potilaan itsensä kotonaan tekemään sairauden seurantaan, lääkärien vastaanotolla tehtäviin pikadiagnooseihin, tai luonnossa tehtäviin agrokemiallisiin tai ympäristöanalyyseihin. Näissä kaikissa tulosten saamisen nopeus ja näytteen tuoreus sekä analyysituloksen saamisen helppous ovat tärkeimmät 15 tekijät. Tällöin kuitenkin mittauslaitteen pitää olla mahdollisimman halpa ja helppo käyttää niin, että sen hankinta tai käytön oppiminen eivät ole esteenä. Toisaalta, koska mitattavien analyysien määrä on usein suhteellisen vähäinen, yhteen analyysiin tarvittavien kemikaalien hinta voi olla paljon korkeampi kuin isojen laboratorioiden automaattilaitteilla. Optimaalisesti analyysimenetelmä on pitkälle 20 kehitelty ja vähän asiantuntemusta vaativa, mieluiten kaupallisesti valmistettu testisarja, jossa kemikaalit on valmiiksi annosteltu. Näytteen lisäämisen jälkeen ;v analyysitulos saadaan yksinkertaisella helposti siirrettävällä laitteella, jossa on vähän

• I

! rikkimeneviä tai huoltoa tarvitsevia osia.

’ ; 25 Radioaktiivisten leima-aineiden käyttö tämän keksinnön kohteena olevissa menetelmissä on säteilylainsäädännön vuoksi poissuljettu, vaikka tarvittavat laitteet • voisivat olla yksinkertaisia ja muuten soveliaita. Saatavilla on fotometrejä, joilla ’·* voidaan mitata värillisten liuosten valon absorptiota, mutta tähän perustuvat menetelmät ovat useimmiten liian epäherkkiä. Lisäksi fotometreissä optisten ·' ·* 30 komponenttien tarve tekee laitteen kalliiksi. Erityistarkoituksiin valmistetaan pieniä '··. halpoja kannettavia valonmittauslaitteita, luminometreja. Näissä valodetektorina on ·;·',* valomonistinputki tai valodiodi, jotka pystyvät mittaamaan hyvin pieniä valointensiteettejä. Luminometreja on pääasiassa käytetty biokemiallisista . |. lusiferaasireaktioista syntyvän valon mittaukseen. Periaatteessa lusiferaasientsyymiä ' . 35 voidaan käyttää leima-aineena. Lusiferaasireaktio on tällöin aina kytkettävä biokemiallisiin ATP:n tai NADH:n muodostumis- tai poistumisreaktioihin, mikä tekee menetelmän vaikeaksi, ja koska kyseessä on herkästi hajoavat reaktiokomponentit, testisysteemin huonosti säilyväksi. Fluoresenssiin ja fosforesenssiin (luminesenssiin) 4 111758 perustuvat menetelmät ovat yleensä hyvin herkkiä. Tällaiset laitteet vaativat erityisen sähköllä tai valopulsseilla tapahtuvan virityksen. Tämä tekee mittauslaitteesta monimutkaisen ja kalliin.

5 Keksinnön tavoitteena on yksinkertainen menetelmä ja laitteisto leima-yhdisteiden detektointiin, jota voidaan hyödyntää erityisesti bioaffiniteettiin perustuvissa määritysmenetelmissä, kuten immunoanalyysi- ja DNA-koetinmenetelmissä, joita käytetään ei-asiantuntijoiden toimesta tai erityisissä olosuhteissa kotona, lääkärien vastaanotolla, maatiloilla, tai ympäristökemian tehtävissä.

10 Tähän tavoitteeseen päästään käyttämällä luminoivia leima-aineita oikein valituissa olosuhteissa siten, että kyseiset leimat viritetään kemiallisesti LL:lla ja syntyvä valo mitataan yksinkertaisella luminometrilla tai syntyvän valon määrä voidaan analysoida laitteella, jossa ei ole lainkaan sähköisiä komponentteja valoherkän filmin avulla 15 patenttivaatimuksissa 1-4 esitetyillä tavoilla. Lyoluminesenssivirityksen erityisenä etuna on, että laitteistossa ei tarvita kalliita valolähteitä, optiikkaa, potentiostaatteja, kalliita elektrodimateriaaleja kuten kultaa tai platinaa, tai ympäristölle ja käyttäjille vaarallisia kemikaaleja. Tällaisen laitteen hankintahinta on pieni ja käyttö on yksinkertaista tai joissain tapauksissa varsinaista laitetta ei tarvita lainkaan. Itse 20 immunologiset menetelmät voivat olla pitkälle kehitettyjä tehden analyysin suorituksen helpoksi.

i ‘t Menetelmän perustana on säteilyenergian varastoiminen kiinteän tilan reagensseihin ! UV-säteilytyksen aikana tai energeettisten pelkistävien metallien hyädyntäminen ja

• > I

! 25 varastoituneen energian vapauttaminen liukenemisprosessilla. Analysoitavan aineen määrään verrannollinen määrä leima-ainetta annetaan virittyä liukenemisprosessin ,,, aikana kiinteästä tilasta liuokseen siirtyvien radikaalien tuottamien redox-reaktioiden * I, · ‘ ' seurauksena, tai energian siirrolla näistä radikaaleista muodostuneilta virittyneiltä ioneilta tai molekyyleiltä. Myös eräät metallit, kuten alumiini ja magnesium, voivat 30 tuottaa liuetessaan erittäin reaktiivisia intermediaatteja, jotka toimivat LL- • * ' systeemeissä usein yhtä tehokkaasti kuin säteilytettyjen suolojen tuottamat ’:"intermediaatit. Seuraavaksi havainnollistetaan LL.iin liittyviä otaksuttuja fysikaalisia ja kemiallisia mekanismeja.

,·, i 35 Gamma- tai röntgensäteilytyksen aikana tapahtuva energian varastoituminen perustuu loukkuuntuneiden elektronien ja aukkojen muodostumiseen kiinteässä reagenssissa (reaktio 1). Tällainen säteilytetty tuote soveltuu kuitenkin huonosti käytännön analytiikkaan johtuen siitä, että sekä valo että lämpötilan kohoaminen 111758 5 aiheuttavat elektroni-aukko -parien rekombinoitumista, mikä ongelma voidaan välttää seuraavaksi esitettävillä muilla värjäysmenetelmillä. Energiaa voidaan varastoida kiinteään tilaan myös ns. additiivisilla väritysmenetelmillä (reaktiot 2a-2b) ja elektrolyyttisillä väritysmenetelmillä (J. Schulman and W. Compton, "Color Centers in 5 Solids", Pergamon Press, New York, 1962) (reaktiot 3a-3b). F-keskus on halidi- ionivakanssiin loukkuuntunut elektroni ja V-keskus F-keskuksen aukkoanalogi.

hv> 10 eV

(1) alkalihalidit —> ^keskuksia+ ^keskuksia 10 alkalimetallihöyry korkeassa paineessa ja lämpötilassa (2a) alkalihalidit -> Fkeskuksia 15 halogeenikaasu korkeassa paineessa ja lämpötilassa (2b) alkalihalidit Vkeskuksia 20 pistemäinen katodi korkeassa lämpötilassa (3a) alkalihalidit -> Fkeskuksia 2 5 pistemäinen anodi • · korkeassa lämpötilassa : .·. (3b) alkalihalidit ->Vkeskuksia t * · · • · • · • · 30 Energian varastoituminen voi myös perustua molekyylien fragmentoitumiseen, esim ... peroksodisulfaatin homolyyttinen pilkkoutuminen UV-säteilytyksen aikana (reaktio 4) tai isomeroitumiseen (reaktio 6).

» · * hv > 4eV

C: 35 (4) S2082- -»2 S04-

• h v > 4eV

(5) P2082- -> 2 P042-

; ; ; h v > 4.8 eV

. ·. : 4 0 (6) KN03 -> kalium peroksonitriitti 6 111758

Edellä mainittujen reaktioiden (1-6) aikana varastoitunut energia voidaan vapauttaa liuottamalla käsitelty kiinteä materiaali liuokseen. Tällöin muodostuvat radikaalit voivat tuottaa luminesenssia redox-mekanismeilla (esim. reaktiot 7a-7b). Reaktioissa 7c-7e A tarkoittaa orgaanista redox-mekanismilla virittyvää molekyyliä (esim. luminoli 5 tai fluoreskeiini) tai metallikelaattia (esim. Ru(bpy)32+ tai Tb-kelaatit, joissa on ligandissa aromaattinen rakenneosa).

h2o (7a) Fkeskus eaq- (hydratoitunut elektroni) 10 H20 (7b) Vkeskus -+X (X = F, Cl tai Br) (7o) A + eaq- (tai + X:) -> Ared (tai Aox + X-) 15 (7d) Ared (tai Aox) + X (tai eaq-) A* (7e) A* -> A + hv (näkyvää valoa) 20

Leima-aineelle ominaisen luminesenssin viritys voi perustua myös energian siirtoon (reaktiot 7f-7h).

* · ; (7f) eaq-+ X· -> (X-)* : 25 * * · •; - | (7g) (X-)* + A ^ X-+ A* (7h) A* -> A + hv (näkyvää valoa) 30 I · ,··*. Jos liuotin itsessään tai sen lisäaineet voivat toimia energeettisesti sopivana • · • t hapettimena tai pelkistimenä, virittäminen on mahdollista suorittaa lisäämällä kiinteää ‘ LL:n muodostajaa, joka liuetessaan tuottaa yksinomaan hapettavaa tai yksinomaan • · pelkistävää radikaalia. Esimerkiksi additiivisesti värjätyn alkalihalidin lisäämisellä : 35 peroksodisulfaatti-ioneja sisältävään liuokseen saadaan vesiliuokseen ; samanaikaisesti äärimmäisen hapettavat ja pelkistävät olosuhteet, jolloin luminoiviin reaktioihin voidaan energiaa täten tuoda maksimissaan 6.3 eV (8a-8b).

7 111758 h2o

(8a) Fkeskus -> eaq . E°(eaq-) = -2.9 V vs. SHE 5 (8b) eaq- + S2082- -> S04- + S042-. E°(S04 /S042') = 3.4 V vs. SHE

(8c) eaq- + P2084- P04·2- + P043-· E°(P04-2-/P043-) = 2.5 V vs. SHE

(8d) eaq- + H202 -» OH + OH-, E°( OH/OH’) = 2.7 V vs. SHE

10

Vastaavasti luminesenssiprosessi voidaan aloittaa liuottamalla hapettavan hydratoituneen radikaalin muodostajaa. Esimerkkitapauksessa (reaktiot 9a-9c) liuotin 15 toimii virittävänä pelkistimenä. Liuottimen sijasta usein pelkistimeksi soveltuu paremmin radikaalin muodostaja, joka tuottaa yksielektronisen hapettumisen seurauksena voimakkaasti pelkistävän radikaalin (esim. formiaatti-ioni).

20 h2o (9) UV- käsitelty K2S208 -> 2 S04‘ + 2 K+ ; (9a) Tb(lll) + S04 -» Tb(IV) + S042' - i 25 (9b) Tb(IV) + vesi -> Tb(lll)* : (9c) Tb(lll)* -> Tb(lll) + hv t * 30 ; V Eräät leima-aineet kuten luminolin ja isoluminolin johdannaiset voidaan virittää tuottamalla voimakkaita hapettimia, kuten sulfaatti-, fosfaatti-, hydroksyyliradikaaleja, halogeeniatomeja tai dihalogeeniradikaali-ioneja leima-aineiden lähiympäristössä siten, että voimakkaan pelkistimen läsnäolo systeemissä on tarpeeton, mutta ei 35 välttämättä haitallinen. Tällöin luminoforit voidaan virittää seuraavan reaktiokaavion ’;* * mukaisesti: (10a) Luminofori + n Ox- -» intermediaatit + n Οχ-(10b) intermediaatit -> tuote + hv 8 111758

Edellä Ox on jokin edellä mainituista voimakkaista yksielektronisista hapettimista ja Luminofori esimerkiksi luminolin tai isoluminolin johdannainen. Esimerkiksi luminoli tuottaa hapetettaessa radikaali-intermediaatteja ja viimeisenä intermediaattina 3-5 aminoftalaattia virittyneessä tilassa, joka lopulta emittoi valoa.

Voimakkaasti pelkistäviä metalleja voidaan käyttää lyoluminesenssin tuottamiseen, mikä voi tapahtua esimerkiksi saattamalla paljas metallipinta kontaktiin vesiliuoksen kanssa syövyttämällä suojaava oksidikerros pois hapolla tai emäksellä, minkä 10 jälkeen joko aktiivinen metallipinta sinällään toimii radikaaleja generoivana pelkistimenä, tai liuenneet alivalenttiset metalli-ionit kuten esim Mg(l), Al(l) tai Al(ll) toimivat pelkistimenä myös vähän kauempana liuoksessa (ts. elektronin tunneloitumisetäisyyden ylittävällä etäisyydellä metalli/liuos -rajapinnalta). Pelkistimen tulee yleensä tuottaa sekundaarisia voimakkaasti hapettavia radikaaleja 15 (esimerkiksi hydroksyyli-, sulfaatti-, tai fosfaattiradikaalia) sopivista lähtöaineista kuten esim. liuenneesta hapesta, vetyperoksidista, peroksodisulfaatti- tai peroksodifosfaatti-ioneista edellä esitettyjen reaktioiden (8b)-(8d) mukaisesti kuitenkin siten, että reaktioissa hydratoituneen elektronin tilalla voi pelkistimenä olla pelkistävä metalli, metalli-ioni tai atomaarinen vety.

20

Edellä mainituissa liuotusprosessissa vapautuva energia muunnetaan valoksi . , leimayhdisteen avulla perustuen redox-reaktioiden (tai energian siirron) tuottamaan » ; ; leimayhdisteen luminesenssiin. Itse analyyttinen menetelmä perustuu ; ; leimamolekyylien määrän mittaukseen. Leimamolekyylien ja analyytin välinen » * ; 25 vastaavuus saadaan aikaan tunnetuilla tavoilla, kuten bioaffiniteettiin perustuen (kts.

1 > · V » esim. The Immunoassay Handbook, Edited by David Wild, Stockton Press Ltd., New ; " York, 1994, sivuilla 1-618). Leimayhdiste voi olla luminoiva metallikelaatti tai

I I I

'·' ‘ orgaaninen molekyyli tai luminoforeja sisältävä polymeeripartikkeli, joka on liitetty sopivan rakenneosan välityksenä bioaktiiviseen molekyyliin. Keksinnön mukaisesti, I t Ί ! 30 kun liuotusprosessi vakioidaan, samasta määrästä leimamolekyylejä saadaan sama I t » ·...· valosignaali. Valon määrä voidaan integroida yli koko liuotusprosessin tai vain osan *;·· sitä.

i i r

Lyoluminometrillä viritys suoritetaan tavallisimmin siten, että kertakäyttöinen koeputki ! , 35 sisältää vakioisen määrän LL:a tuottavaa kiinteää materiaalia, ja kiinteältä kantajalta I * » ’ : irroitettu leima-aine, tai lateksipartikkelien toimiessa kiinteänä kantajana partikkelisuspensio, injektoidaan suolan päälle samalla kun valoa mitataan. Paramagneettiset lateksipartikkelit ovat erityisen edullisia, koska niiden avulla pesut 9 111758 ovat yksinkertaisia ja nopeita suorittaa. Myös muita vaihtoehtoisia menettelyjä voidaan käyttää. Esimerkiksi UV-säteilytetyn kaliumnitraatin sisältämä peroksonitriitti on hyvin stabiilia emäksisessä liuoksessa (0.1 M NaOH), jolloin tätä liuotustuotetta voidaan käsitellä kuten mitä tahansa nestemäistä kemilunesenssireagenssia ja 5 luminesenssiprosessi voidaan laukaista happolisäyksellä. Myöskin LL:a tuottava materiaali voidaan kuivata kalvoksi haluttuun reaktioastiaan ennen säteilytystä, jolloin sadaan LL:a tuottavia ohuita kalvoja tai LL:a tuottava jauhe voidaan annostella nestevirtaan revolverityyppisestä annostimesta.

10 Lyoluminesenssi voidaan mitata analyytin määritysalueen laajuudesta riippuen joko käyttäen halpaa puolijohdedetektoria tai äärimmäistä herkkyyttä vaativien analyyttien kyseessä ollen käyttäen valomonistinputkea. Hankalissa sähköttömissä olosuhteissa voidaan käyttää paristoilla varustettuja laitteita, tai laite voi myös perustua valoherkän filmin käyttöön. Filmin kehitysprosesseissa tapahtuvien erojen vuoksi tällöin voidaan 15 tarvita vertailuksi standardivalolähde, jollaisena voi toimia ns. tritiumlamppu. Se kostuu tritiumia sisältävästä lasikapselista, jonka sisäpuoli on pinnoitettu luminoivalla kerroksella, joka virittyy tritiumin vaikutuksesta tuottaen standardivalotehon. Lasikapseli estää β-säteilyn pääsyn lampun ulkopuolella, joten tämä standardivalolähde on käytössä täysin turvallinen, ja niitä käytetäänkin mm.

20 suomalaisten aseiden yötähtäimien komponentteina. Tritiumlampulta filmille saapuva valoteho voidaan standardoida halutulle tasolle optisten suodattimien ja etäisyyssäädön avulla. Käytettäessä filmiä detektoreina tarkka määritystulos voidaan t * lukea filmiltä erityisillä densitometreilla, mutta silloin kuin Polaroid-filmien herkkyys '. ! riittää, analyysitulos saadaan välittömästi ilman valokuvauslaboratorion apua ’ ; 25 vertaamalla näytteen aiheuttaman täplän vaaleusastetta kahden eri tavoin kalibroidun standardivalolähteen tuottamiin ala- ja ylärajastandarditäplien vaaleusasteisiin. Suurin herkkyys valoherkkää filmiä käytettäessä saavutetaan röntgenfilmien tai muiden erityisen herkkien filmien (esim. Kodak 3200 ASA) avulla, mutta tällöin filmin kehitys valokuvausiaboratoriossa on välttämätöntä. Etuna on : ·’ 30 kuitenkin se, että voidaan käyttää tuoretta näytettä ja vain filmi lähetetään kehitettäväksi. Tällöin analyysitulos on luotettava, vaikkakaan tulosta ei saada :··; käyttöön välittömästi analyysin suorittamisen jälkeen. Kuten on tunnettua, erityisesti ’ ’ ’: biologiset näytteet pilaantuvat ei-edustaviksi varsin nopeasti, ja aiheuttavat tuloksissa J -, suuria virheitä. Valokuvausfilmi voidaan myös korvata akkukäyttöisellä CCD- tai ; 35 digitaalikameralla, jolloin koetulos saadaan helposti tietokoneella käsiteltävään muotoon.

10 111758

Keksinnössä käytettävistä käyttökelpoisista leima-aineista ovat esimerkiksi seuraavien orgaanisten luminoforien johdannaiset: 9- fuorenyylimetyylikloroformaatti (emissio 309 nm), luminoli (emissio 420 nm), fluoreskeiini (emissio 516 nm), salisyylaattijohdannaiset (emissio alueella 400-450 5 nm), aminonaftaleenisulfonaattien johdannaiset (emissio alueella 400-500 nm) ja kumariinit (emissio alueella 450 nm - 550 nm), aromaattisten lantanidi(lll) kelaatien johdannaiset, kuten esimerkiksi sopivat johdannaiset terbium(lll) komplekseista 1 12 3 3 seuraavien ligandien kanssa: N -(4-aminobentsyyli)diethylenetriamine-N ,N ,N ,N - tetra-asetaatti (lyhenne Tb(lll)-1), 4-(fenyyliletyyli)(1-hydroksibentseeni)-2,6-diyl)bis- 10 metyleeninitrilo)tetrakis(asetaatti) (Tb(lll)-2);4-bentsoyyli(1-hydroksibentseen1 )-2,6- o diyyli)-bis(metyleeninitrilo)tetrakis(asetaatti) (Tb(lll)-3), N -(4-aminobentsyyli)-dietyleenitriamiini-N1 ,N1 ,N3,N3,-tetra-asetaatti (Tb(lll)-4); 4-metyyli(1- hydroksibentseeni)-2,6-diyyli)bis(metyleeninitrilo)tetrakis(asetaatti) (Tb(lll)- 5)(voimakkain emissioviiva kaikilla Tb(lll)-kelaateilla 545 nm), eräiden 15 transitiometallikelaattien johdannaiset kuten esim. rutenium(ll) ja osmium(ll) -trisbipyridyyli ja trispyratsyylikompleksien (emissio alueella 550 - 650 nm) johdannaiset.

Keksinnön selitysosassa on kuvattu eräitä lyoluminesenssin aikaansaamisessa 20 mahdollisia kemiallisia reaktiomekanismeja, mutta keksinnön mukainen menetelmä voi perustua myös johonkin muuhun kiinteän aineen liukenemiseen liittyvään kemialliseen prosessiin, jolla saadaan aikaan leima-aineen virittyminen. Samoin | ^ leima-aineiden rakenne voi vaihdella siten, että ne voivat emittoida valoa UV-valon ' ' ! alueelta infrapuna-alueelle ja vastaavasti mittauslaite on muunneltavissa laajoissa * · · ! 25 rajoissa. Itse LL-viritys voidaan käytännössä suorittaa monilla eri tavoilla riippuen käytettävästä laitteesta. Keksinnölle on luonteenomaista patenttivaatimuksissa 1 ja 2 * · esitetyt ominaispiirteet.

* 1 » * · ·

Seuraavassa keksintöä havainnollistetaan edelleen kaaviokuvin sekä ei-rajoittavin

t I I

• ; ‘ 30 esimerkein ja niihin liittyvin kuvin.

• » • 1 ••Il • · : ’ : Kuva 1. Lyoluminometrin lohkokaavio. (1) Koeputki tai kenno, joka sisältää lyoluminesenssin tuottavan kiinteän materiaalin. (2) Putki, jota pitkin leima-aineen : 35 liuos tai suspenssio injektoidaan lyoluminometrin kennoon. (3) Optinen suodin, joka valitaan leima-aineen emissiospektrin perusteella.

11 111758

Kuva 2. Sähköisiä komponentteja sisältämättömän lyoluminometrin kaavio. (1) Valotiiviisti suljettava kotelo. (2) Valoherkkä filmi. (3) Koeputki tai kenno, joka sisältää lyoluminesenssin tuottavan kiinteän materiaalin. (4) Putki, jota pitkin liuos tai lateksipartikkelisuspenssio injektoidaan lyoluminometrin kennoon. (5) 5 Tritiumlamppui. (6) Tritiumlamppu2. (7) TritiumlammppuTrn etäisyydensäätöruuvi. (8) Tritiumlammppu2:n etäisyydensäätöruuvi. (9) Harmaasuodin,. (10) Harmaasuodin2.

Kuva 3. N-(6-aminobutyyli)-N-etyyli-isoluminolin (ABEI) detektoiminen eri lyoluminesenssimenetelmillä. (a) Additiivisesti väritetty KCI, pH 11,5, 3x1 O^M K2S208 10 (avoin ympyrä, katkoviiva), (b) Elektrolyyttisesti väritetty KCI, pH 11,5, 3x10'4M K2S208 (avoin neliö, katkoviiva), (c) UV-säteilytetty K2S2C>8, pH 12 (ympyrä), (d) UV-säteilytetty IC^Og, (kärkineliö), (e) UV-säteilytetty KN03, pH 11 (neliö), (f) Alumiini, pH 12, 0,03 M K4P208.

15 Kuva 4. p2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys lateksipartikkeleilla leiman detektiovaiheen perustuessa UV-säteilytetyn K2S208:n tai K4P208:n tai KN03:ntuottamaan LL:iin leimayhdisteen ollessa AHEI.

Kuva 5. p2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys (a) alumiinikupin 20 sisäpinnalla, (b) alumiinipartikkelien pinnalla tai (c) lateksipartikkelien pinnalla leiman detektiovaiheen perustuessa alumiinin emäksisissä olosuhteissa tuottamaan LL:iin leimayhdisteen ollessa AHEI.

* n * ",l ; Kuva 6. p2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys Al-kuppien ’ ; 25 sisäpinnalla leiman detektiovaiheen perustuessa elektrolyyttisesti alkalisoidun alumiinielektrodin tuottamaan LL:iin leimayhdisteen ollessa Tb(lll) kelaatin isotiosyanaattijohdannainen.

1 t

Kuva 7. Kilpirauhasta stimuloivan hormonin (TSH) iyoiuminometrinen 30 immunomääritys lateksipartikkeleilla leiman detektiovaiheen perustuessa ’*;·* magnesiumin happamissa olosuhteissa tuottamaan LL:iin (a), alumiinin emäksisissä olosuhteissa tuottamaan LL.iin (b) tai additiivisesti värjätyn KCI.n tuottamaan LL.iin (c) leimayhdisteen ollessa Ru(bpy)32+ kelaatin johdannainen.

> · > : 35 Kuva 8. Fosfolipaasi A2:n lyoluminometrinen immunomääritys lateksipartikkeleilla leiman detektiovaiheen perustuessa additiivisesti väritetyn KCI.n tuottamaan LL.iin leimayhdisteen ollessa Tb(lll)-kelaatin isotiosyanaattijohdannainen.

12 111758

Kuva 9. Fosfolipaasi A2:n lyoluminometrinen immunomääritys määritys lateksipartikkeleilla leiman detektiovaiheen perustuessa additiivisesti värjätyn KCI:n tuottamaan LL.iin leimayhdisteen ollessa AHEI.

5 Kuva 10. Fosfolipaasi A2.n lyoluminometrinen immunomääritys lateksipartikkeleilla leiman detektiovaiheen perustuessa alumiinin P2084"-ionien läsnäollessa tuottamaan LL:iin leiman ollessa alkaalinen fosfataasi ja substraattina 5-fluorisalisyylihapon fosfaattiesteri. (a) Substraatista saatu tuote detektoitiin sellaisenaan, (b) Tuotteesta muodostettiin ternäärinen kompleksi Tb(lll)-EDTA kelaatin kanssa ennen detektiota.

10

Kuva 11. li2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys mikrotiitterilevyillä irroittamalla ensin Tb(lll)-ioni immunokemiallisen reaktion jälkeen vasta-aineesta ja mittaamalla vapautunut Tb(lll)-ioni uuden kompleksin avulla leiman detektiovaiheen perustuessa UV-säteilytetyn K2S208:n tai additiivisesti värjätyn KCI:n tuottamaan 15 LL:iin leimayhdisteen ollessa Tb(lll)-kelaatin isotiosyanaattijohdannainen.

Kuva 12. l$2-Mikroglobuliinin lyoluminometrisen immunomäärityksen standardikuvaaja leiman ollessa luminoforeja sisältäviä liposomeja ja leiman detektion perustuessa elektrolyyttisesti värjätyn KCI:n tuottamaan LL:iin S2082'-ionien 20 läsnäollessa.

, Kuva 13. ft2-Mikroglobuliinin lyoluminometrisen immunomäärityksen ; ;* standardikuvaaja leiman ollessa UV-valolla irroitettavaa luminoforia ja leiman • · *’; ; detektiovaiheen perustuessa additiivisesti värjätyn KCI:n tuottamaan LL:iin.

25

Kuva 14. β2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys määrityksen perustuessa AHEI-leimattuun vasta-aineeseen ja leima-aineen irroitukseen kiinteästä kantajasta ennen LL.n tuottamista UV-säteilytetyllä kaliumperoksodisulfaatilla.

: 30 Kuva 15. Filadelfia-kromosomin osoittaminen lyoluminometrisesti DNA- ·...’ hybridisaatiomenetelmällä leiman ollessa Tb(lll)-kelaatin ; · · · isotiosyanaattijohdannainen.

! 35 ** : Esimerkki 1. Energeettisten suolojen valmistus ja N-(6-aminobutyyli)-N-etyyli- isoluminolin (ABEI, Wallac Oy) kalibraatiokäyriä eri LL-menetelmillä.

13 111758

Kaliumkloridin additiivinen värjäys. 500 mg mikrokiteistä KCI (Merck, Suprapur) värjättiin additiivisesti kaliumhöyryn paineen olleessa 15 torr ja lämpötilassa 630° C 12 h ajan.

5 Kaliumkloridin elektrolyyttinen värjäys. KCI (Merck, Suprapur) kuivattiin alussa lämmittämällä 500° C vakuumissa, minkä jälkeen yksittäiskide kasvatettiin Czochralskin menetelmällä argonatmosfäärissä. 12x12x20 mm pala kiteestä värjättiin elektrolyyttisesti matriisikatodimenetelmällä 700° C lämpötilassa 1 mA virralla.

10

Kaliumperoksodisulfaatin, kaliumperoksodifosfaatin ja kaliumnitraatin UV-säteilytys. Kukin suola levitettiin vuorollaan lasilevyn pinnalle ohueksi kerrokseksi (noin jyväskoon paksuiseksi kerrokseksi) ja säteilytettiin 4 h Philips TUV/15W, G15T8 UV-lampulla n. 6 cm etäisyydeltä. Säteilytyksen jälkeen suola kerättiin koeputkeen ja 15 homogenisoitiin ravistelemalla.

Konvektiivinen injektio. Kun injektioputken halkaisija ja putken pään geometria sekä LL-kennona toimivan koeputken muoto on oikein valittu, tavallisella laboratorioissa 20 käytössä olevilla tarkkuuspipeteillä voidaan suorittaa vakioinen liuoksen injektio siten, että kennossa tapahtuva konvektio liuoksessa on toistettavasti samanlainen injektiosta toiseen. Suosituimmasti injektio suoritetaan akkukäyttöisellä ; ;* askelmoottorilla varustetulla pipetillä, jonka injektionopeutta voidaan säätää.

I · I » - 25 ABEI:n kalibraatiokäyrät. (a) 1,2 mL:n kertakäyttöiseen koeputkeen punnittiin 15,0 * » mg additiivisesti värjättyä KCI:a ja koeputkeen injektoitiin 1,00 ml. ABEI-liuosta 3 • " mM NaOH liuoksessa, joka sisälsi 3x10"4 mol/L kaliumperoksodisulfaattia (avoin v ‘ ympyrä, katkoviiva), (b) 1,2 ml_:n kertakäyttöiseen koeputkeen punnittiin 15,0 mg

elektrolyyttisesti värjättyä KCi.a, joka oli jauhettu värjäyksen jälkeen hienoksi i \: 30 jauheeksi agaattimorttelissa, ja koeputkeen injektoitiin 1,00 mL ABEI-liuosta 3 mM

NaOH liuoksessa, joka sisälsi 3x10‘4 mol/L kaliumperoksodisulfaattia (avoin neliö, j katkoviiva), (c) 1,2 mL.n kertakäyttöiseen koeputkeen punnittiin 10,0 mg UV- säteilytettyä K2S208:a ja koeputkeen injektoitiin 1,00 mL ABEI-liuosta 0,01 M NaOH liuoksessa (ympyrä), (d) 1,2 mL.n kertakäyttöiseen koeputkeen punnittiin 10,0 mg 35 UV-säteilytettyä K4P208:a ja koeputkeen injektoitiin 1,00 mL ABEI-liuosta 0,01 M * NaOH liuoksessa (pystyneliö), (e) 1,2 mL:n kertakäyttöiseen koeputkeen punnittiin 10,0 mg UV-säteilytettyä KN03:a ja koeputkeen injektoitiin 1,00 mL ABEI-liuosta 1 mM M NaOH liuoksessa (neliö), (f) 1,0 ml luminoliliuosta 0,01 M NaOH liuoksessa, 14 111758 joka sisälsi 0,03 mol/L K4P208:a injektoitiin alumiinikuppiin. Mittaukset tehtiin fotonilaskentaan perustuvalla lyoluminometrillä (S. Kulmala ja K. Haapakka, Analytica Chimica Acta, 294 (1994) 13.), jonka injektioputken rakenne ja geometria ja siten injektion hydrodynamiikka oli suunniteltu uudelleen ja interferenssisuotimeksi 5 oli vaihdettu 450 nm interferenssisuodin 546 nm suotimen tilalle. Mitatut kalibraatiokäyrät on esitetty kuvassa 3.

Esimerkki 2. &2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys käyttäen leimana 10 N-(6-aminoheksyyli)-N-etyyli-isoluminolia). LL tuotettiin UV-säteilytetyllä kaliumperoksodisulfaatilla.

Lateksipartikkelien pinnoittaminen vasta-aineella. Lateksipartikkelien kantasuspensiota (Sigma, LB-8) laimennettiin 1:100 TSA-puskuriin (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, 0,9% 15 NaCI, 0,05% NaN3). Tätä laimennosta otettiin 100 pL, johon määrään lisättiin 100 pL liuosta, joka sisälsi 6 mg/mL hiiren anti-IJ2-mikroglobuliini vasta-aineella (klooni 6G12, Labmaster Oy, Turku) TSA-puskurissa ja inkuboitiin yön yli. Partikkelit erotettiin sentrifugoimalla supernatantista ja pestiin pesuliuoksella ( 0,01 M Tris-HCI, pH 7,75, 0,9% NaCI ja 0,02% Tween 20). Tämän jälkeen lateksipartikkelit saturoitiin yli yön 2 0 TSA-puskurissa, johon oli lisätty 0,1 % naudan seerumin albumiinia.

t

Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Toinen hiiren anti-ft2-mikroglobuliini vasta-aine ; (klooni 1F10, Labmaster Oy, Turku) leimattiin N-(6-aminoheksyyli)-N-etyyli- * » 25 isoluminolilla (AHEI) Schroeder et ai. menetelmällä (Methods in Enzymology, Voi 57, M. DeLuca (Toim.), Academic Press, N.Y., 1978).

# · v * Bz-Mikroglobuliini-standardi. Ihmisen askitesnesteestä puhdistetusta β2- mikroglobuliinista (75,5 mg/mL, Labmaster Oy, Turku) valmistettiin standardit (0,4, 1,6, i ’.· 30 4,0, 8,0 ja 16 mg/L) TSA-puskuriin, johon on lisätty 7,5 % naudan seerumin albumiinia.

* · *

• I

• < » •: · j Immunokemiallinen määritys. Lisättiin 20 μΙ pinnoitetun lateksipartikkelin 1:20 laimennettua suspensiota (noin 180 milj. lateksipartikkelia) polypropeenista valmistettuihin 1,5 mL.n sentrifuugiputkiin, jotka oli saturoitu naudan seerumin

I · I

! , 35 albumiinilla. Standardit laimennettiin määrityspuskuriin 1:50 (0,05 mol/L Tris-HCI, pH

’ ’ 7,75, jossa on 0,9% NaCI, 0,05% NaN3, 0,5% naudan seerumin albumiinia ja 0,01%

Tween 20) ja lisättiin kyvetin pohjalle (40 pL). Seuraavaksi lisättiin määrityspuskurissa 120 pL leimattua vasta-ainetta ja inkuboitiin 1 tunti ravistellen huoneenlämpötilassa, 15 111758 minkä jälkeen partikkelit erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin 3 kertaa pesuliuoksella ja yhden kerran tislatulla vedellä, johon oli lisätty 0,02 % TWEEN 40 (p/p). Tämän jälkeen partikkelit suspentoitiin LL-mittausliuokseen (0,01 M NaOH) ja injektoitiin mittauskyvettiin, jossa oli 10,0 mg UV-säteilytettyä K2S208:a. LL mitattiin kuten 5 esimerkissä 1e. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 4.

Esimerkki 3. R2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys käyttäen leima-aineena AHELta. LL tuotettiin liuottamalla alumiinia NaOH:lla P2084'-ionien 10 läsnäollessa.

Alumiinikupin pinnoittaminen vasta-aineella. Alumiinilevystä (0,3 mm paksu) puristettiin alumiinikuppeja, joiden tilavuus oli 500 μί. Kupit pinnoitettiin hiiren anti-IJ2-mikroglobuliinivasta-aineella (klooni 6G12, Labmaster Oy, Turku) seisottamalla kupissa 15 yli yön 500 μί vasta-ainetta (10 pg/mL) 0,2 M NaH2P04-liuoksessa. Seuraavana päivänä elektrodi pestiin kuusi kertaa pesuliuoksella ja tasapainotettiin yli yön saturointiliuoksessa (0,05 M Tris-HCI, pH 7,75, jossa on yhtä litraa kohti 1 g naudan seerumin albumiinia, 60 g sorbitolia ja 1 mmol CaCI2). Alumiinikuppi imettiin tyhjäksi ja säilytettiin kuivana.

20

Alumiiniviilajauheen pinnoittaminen vasta-aineella. Alumiiniviilajauhe pinnoitettiin hiiren anti-IJ2-mikroglobuliini vasta-aineella (klooni 6G12, Labmaster Oy, Turku) vastaavalla ,·, tavalla kuin esimerkissä 1 pinnoitettiin lateksipartikkeleita.

’! 25 Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Toinen hiiren anti-l32-mikroglobuliini vasta-aine (klooni 1F10, Labmaster Oy, Turku) leimattiin AHEUla kuten esimerkissä 2.

£2-m/'krog/obu//'/>7/-stendard/. Standardit valmistettiin B2-mikroglobuliinista kuten .. , esimerkissä 2.

30

Immunokemiallinen määritys alumiinikupeilla. Standardit laimennettiin määrityspus-kuriin 1:50 (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, jossa on 0,9% NaCI, 0,05% NaN3, 0,5% naudan seerumin albumiinia ja 0,01% Tween 20) ja lisättiin Al-kupin pohjalle (40 μί). Seuraavaksi lisättiin määrityspuskurissa 120 μί leimattua vasta-ainetta ja inkuboitiin 1 35 tunti ravistellen huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen kupit pestiin 4 kertaa pesuliuoksella ja yhden kerran tislatulla vedellä. Tämän jälkeen kupit siirrettiin yksi kerrallaan lyoluminometriin ja kuhunkin Al-kuppiin injektoitiin 400 pL 0,01 M NaOH

16 111758 liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/L «4P208:a. Valoa integroitiin 300 s ajan ja mitattu kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 5, käyrä (a).

Immunokemiallinen määritys alumiinijauhetta käyttäen. Lisättiin 30 μΙ pinnoitetun 5 alumiinijauheen 1:20 laimennettua suspensiota polypropeenista valmistettuhin 1,5 mL.n sentrifuugiputkiin, jotka oli saturoitu naudan seerumin albumiinilla. Standardit laimennettiin määrityspuskuriin 1:50 (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, jossa on 0,9% NaCI, 0,05% NaN3, 0,5% naudan seerumin albumiinia ja 0,01% Tween 20) ja lisättiin kyvetin pohjalle (40 μί). Seuraavaksi lisättiin määrityspuskurissa 120 μί leimattua 10 vasta-ainetta ja inkuboitiin 1 tunti ravistellen huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen alumiinijauhe erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin 3 kertaa pesuliuoksella ja yhden kerran tislatulla vedellä, johon oli lisätty 0,02 % TWEEN 40 (p/p). Koeputki imettiin kuivaksi ja siirrettiin LL-mittauskennoon, minkä jälkeen koeputkeen injektoitiin 400 μί 0,01 M NaOH liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/L K4P208:a. Valoa integroitiin 300 s ajan ja 15 mitattu kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 5, käyrä (b).

Immunokemiallinen määritys käyttäen lateksipartikkeleita. Määritys tehtiin vastaavasti kuin esimerkissä 2 paitsi, että partikkelit pestiin lopuksi tislatulla vedellä, johon oli lisätty 0,02 % TWEEN 40 (p/p), minkä jälkeen partikkelit suspentoitiin 400 pL:aan 0,01 M 2 0 NaOH liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/L K4P208:a, ja suspensio injektoitiin alumiinikupiin. Valoa integroitiin 300 s ajan ja mitattu kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 5, käyrä (c).

: Esimerkki 4. B2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys Al-kuppien : 25 sisäpinnalla käyttäen leima-aineena Tb(lll)-kelaatti-isotiosyanaattia. LL tuotettiin elektrolyyttisesti katodisoimalla alumiinia S2082'-ionien läsnäollessa.

Alumiinikupit pinnoitettiin vasta-aineella samoin kuin esimerkissä 3.

* · 30 Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Toinen hiiren anti^-mikroglobuliinivasta-aine (klooni 1F10, Labmaster Oy, Turku) leimattiin Tb(lll)-4 kelaatin isotiosyanaatti-' ’ johdannaisella [Tb3+- N2-(4-isotiosyanatobetsyyli)-dietyleenitriamiini-N1, N1, N3, N3 - ' tetra-asetaatti] (Wallac Oy, Turku) antamalla vasta-aineen reagoida kelaatin kanssa moolisuhteessa 1:60 pH:ssa 9,5. pH säädetään 1 M Na2C03-liuoksella. Leimattu 35 vasta-aine puhdistettiin ylimäärästä reagoimatonta kelaattia geelisuodatuksella (Sepharose 6B 1 x 50 cm, Sephadex G-50 1 x 5 cm) käyttäen TSA-puskuria (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, 0,9% NaCI, 0,05% NaN3) eluaattina. Tyypillisesti tällä 17 111758 tavalla saadaan 5-10 kelaattimolekyyliä sidottua yhteen vasta-ainemolekyyliin. Säilyvyyden parantamiseksi lisättiin leimatun vasta-aineen joukkoon 0,1% naudan seerumin albumiinia.

5 Immunomääritys alumiinikupeilla suoritettiin vastaavasti kuin esimerkissä 3. Tämän jälkeen Al-kuppiin pipetoitiin 0,5 M Na2S04 liuosta, joka sisälsi 0,01 mol/L K2S2C>8:a. Kennoon asetettiin platinalanka vastaelektrodiksi ja elektrolysointi käynnistettiin 10 V tasajännitteellä Al-elektrodin ollessa katodina. Valoa mitattiin 300 s ajan interferenssifiltterin ollessa 546 nm suodin. Mitattu kalibraatiokäyrä on esitetty 10 kuvassa 6.

Esimerkki. 5. TSH:n lyoluminometrinen immunomääritys. LL tuotettiin liuottamalla magnesiumia suolahappoon, alumiinia natriumhydroksidiliuokseen tai additiivisesti värjätyllä KCI:lla S2082' ionien läsnäollessa.

15

Streptavidiinilla pinnoitetut paramagneettiset lateksipartikkelit, Ru(bpy)32+ -leimattu monoklonaalinen anti-TSH vasta-aine ja biotiinilla leimattu monoklonaalinen anti-TSH vasta-aine olivat Boehringer Mannheimin valmistamia (Elecsys TSH Immunoassay kit).

20

Standardien valmistaminen. Standardit laimennettiin TSH kantaliuoksesta (52300 . pU/mL, Wallac Oy) laimennuspuskuriin (Labmaster Oy, Turku). Standardien ! * pitoisuudet olivat 9,0, 54,0 ja 324 pU/mL.

• · = » » ' ; 25 Lyoluminometrinen immunoassay. Itse immunokemiallinen määritys tehtiin muuten ,, ’ Boehringer Manheimin ohjeiden mukaisesti paitsi, että standardeja pipetoitiin 50 pL, » »

Ru(bpy)32+ -leimatun anti-TSH:n liuosta 100 pL ja biotiinilla leimatun anti-TSH:n ' liuosta myös 100 pL koeputkeen, jossa ensimmäinen 25 min pituinen inkubointi suoritettiin ravistellen. Inkuboinnin jälkeen seokseen pipetoitiin 200 pL juuri : · * 30 sekoitettua streptavidiinilla pinnoitetun magneettisen lateksipartikkelin suspensiota ja ’*·< * ravisteltiin 10 min. Ohjeiden mukaisten pesujen jälkeen partikkelit pestiin vielä kerran tislatulla vedellä, johon oli lisätty 0,02 % TWEEN 40 (p/p). Partikkelit suspentoitiin :" *: lopuksi kunkin menetelmän mukaiseen mittausliuokseen.

. 35 Magnesiumin tuottamassa LL:ssa partikkelit suspentoitiin 1,00 mL:aan 0,1 M HCI

liuosta, joka sisälsi 0,005 % TWEEN 40. Suspensio injektoitiin lyoluminometrissä koeputkeen, jonka pohjalle oli puristettu 1,0 cm pituinen pala Mg-nauhaa (Merck art.

18 111758 no. 5812) ja LL:a integroitiin 400 s ajan lyoluminometrin interferenssisuotimen ollessa 620 nm suodin. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 7, käyrä (a).

Alumiinin tuottamassa LL:ssa partikkelit suspentoitiin 1,00 ml_:aan 0,1 M NaOH liuosta, 5 joka sisälsi 0,005 % TWEEN 40 ja 0,01 mol/L K2S208:a. Suspensio injektoitiin lyoluminometrissä Al-kuppiin ja LL:a integroitiin 600 s ajan. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 7, käyrä (b).

Additiivisesti värjätyn KCI:n tuottamassa LLssa partikkelit suspentoitiin 1,00 mL.aan 10 0,2 M boraattipuskuria, joka sisälsi 0,005 % TWEEN 20 ja 3x10'4 mol/L K2S208:a.

Suspensio injektoitiin lyoluminometrissä koeputkeen, jossa oli 25,0 mg additiivisesti värjättyä KCI jauhetta. LL:a integroitiin 10,0 s injektointihetkestä lukien. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 7, käyrä (c).

15 Esimerkki 6. Fosfolipaasi A2:n (PLA2) lyoluminometrinen immunomääritys lateksipartikkeleilla. LL tuotettiin additiivisesti värjätyllä KCI:llä leiman olleessa Tb(lll)-kelaatin isotiosyanaattijohdannainen.

Lateksipartikkelien pinnoittaminen vasta-aineella. Lateksipartikkelien 20 kantasuspensiota (Sigma, LB-8) laimennettiin 1:100 TSA-puskuriin (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, 0,9% NaCI, 0,05% NaN3). Tätä laimennosta otettiin 100 pL, johon määrään lisättiin 100 pL liuosta, joka sisälsi 5,7 mg/mL anti-PLA2 vasta-ainetta (klooni 2E1, Labmaster, Turku) TSA puskurissa ja inkuboitiin yön yli. Partikkelit 7 ! erotettiin sentrifugoimalla supernatantista ja pestiin pesuliuoksella. Tämän jälkeen ! 25 lateksipartikkelit saturoitiin yli yön TSA-puskurissa, johon oli lisätty 0,1 % naudan seerumin albumiinia.

’ " Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Polyklonaalinen lampaassa valmistettu vasta- aine ihmisen haiman fosfolipaasi Ä2:lle (affiniteettipuhdistettu, Labmaster Oy, Turku) * » * 30 leimattiin Tb(lll)-1 kelaatin isotiosyanaattijohdannainsella [Tb3+- N-(p- • * '··/' isotiosyanatobetsyyli)-dietyleenitriamiini-N1, N2, N3, -tetra-asetaatti], (Wallac Oy,

Turku) antamalla vasta-aineen reagoida kelaatin kanssa moolisuhteessa 1:60 pH.ssa 9,5. pH säädettiin 1 M Na2C03-liuoksella. Leimattu vasta-aine puhdistettiin ylimäärästä reagoimatonta kelaattia geelisuodatuksella (Sepharose 6B 1 x 50 cm, .·, ; 35 Sephadex G-50 1x5 cm) käyttäen TSA-puskuria liikkuvana faasina. Tyypillisesti » I * tällä tavalla saadaan 5-10 kelaattimolekyylia sidottua yhteen vasta-ainemolekyyliin. Säilyvyyden parantamiseksi lisättiin leimatun vasta-aineen joukkoon 0,1% naudan seerumin albumiinia.

i9 111758 5

Standardien valmistaminen. Ihmisen haiman PLA2:sta (Labmaster Oy, Turku) valmistettiin TSA-puskuriin, johon oli lisätty 7% naudan seerumin albumiinia, standardisarja 0, 1,5, 9, 54, 324 ng/mL.

Immunomääritys. Otettiin 20 pl pinnoitetun lateksipartikkelin 1.20 laimennettua suspensiota (noin 180 milj. lateksipartikkelia) polypropeenista valmistettuhin 1,5 mL:n sentrifuugiputkiin, jotka oli saturoitu naudan seerumin albumiinilla. 10 Suspensioon lisättiin 20 pl standardia ja 20 μΙ Tb(l 11)-1-leimattua vasta-ainetta (500 ng) ja inkuboitiin 20 min huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen partikkelit erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin 2 kertaa pesuliuoksella ja yhden kerran LL-mittauspuskurilla (0,2 mol/L boraattipuskuri, pH 7,3, johon oli lisätty 0,02 % TWEEN 40 (p/p)). Tämän jälkeen partikkelit suspentoitiin LL-mittauspuskuriin ja LL mitattiin 15 kuten esimerkissä 1(a), mutta siten, että lyoluminometrin suodattimena oli 546 nm interferenssisuodin. LL-mittauspuskuri oli tässä tapauksessa 0,2 M boraattipuskuri (pH 7,3), joka sisälsi 3x10'4 mol/L K2S208:a ja 0,02% TWEEN 40. Suspensio injektoitiin lyoluminometrissa koeputkeen, joka sisälsi 20,0 mg additiivisesti värjättyä KCI.a. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 8.

20

Esimerkki 7. Fosfolipaasi A2:n lyoluminometrinen immunomääritys ; lateksipartikkeleilla leiman detektiovaiheen perustuessa. LL tuotettiin elektrolyyttisesti ; 25 värjätyllä kaliumkloridilla.

’ Menetelmässä käytettiin samoja vasta-aineella pinnoitettuja lateksipartikkeleita ja standardeja kuin esimerkissä 6.

» I I

: ·' 30 Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Polyklonaalinen lampaassa valmistettu vasta- '···' aine ihmisen haiman fosfolipaasi A2:lle (affiniteettipuhdistettu, Labmaster Oy, Turku) •: : leimattiin AHEUla ja puhdistettiin vastaavasti kuin esimerkissä 2.

,. Immunomääritys suoritettiin vastaavasti kuin esimerkissä 6 paitsi, että

. 35 lateksipartikkelit suspentoitiin lopuksi 0,01 M NaOH liuokseen, joka sisälsi 1 mmol/L

K4P208:a. Suspensio injektoitiin välittömästi lyoluminometrissa (450 nm interferenssifiltteri) koeputkeen, joka sisälsi 20,0 mg jauhettua elektrolyyttisesti värjättyä KCI:a. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 9.

20 111758

Esimerkki 8. Fosfolipaasi A2:n lyoluminometrinen immunomääritys käyttäen lateksipartikkeleita kiinteänä kantajana määrityksessä, jossa hyödynnettiin entsymaattista amplifikaatiota. LL tuotettiin additiivisesti värjätyllä KCI:lla tai UV-5 säteilytetyllä K2S208:lla.

Lateksipartikkelit pinnoitettiin vasta-aineella samoin kuin esimerkissä 6.

Antibodien leimaaminen alkaalisella fosfataasilla. Polyklonaalinen lampaan anti-PLA^ 10 leimattiin alkaalisella fosfaataasilla (ALF) maleimidimenetelmällä (E. Ishikawa, M. Imagawa, S. Hashida, S. Yoshitake, Y. Hamuguchi and T. Ueno, J. Immunoassay, 1983, 4, 209.)

Immunomääritys. Otettiin 20 pL pinnoitetun lateksipartikkelin 1:20 laimennettua 15 suspensiota (noin 180 milj. lateksipartikkelia) polypropeenista valmistettuhin 1,5 mL:n sentrifugiputkiin, jotka oli saturoitu naudan seerumin albumiinilla. Suspensioon lisättiin 20 pL standardia ja 20 pl ALF-leimattua antibodia (600 ng) ja inkuboitiin 15 min huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen partikkelit erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin 2 kertaa pesuliuoksella. Partikkelit suspentoitiin 200 pL:aan liuosta, joka 20 sisälsi 1mmol/L substraattia (5-fluorisalisyylihapon fosfaatti-esteri, FSAF, Kronem

Systems Inc. Mississauga, Ontario, Canada). Supernatantti erotettiin 15 min ·. inkuboinnin jälkeen ja 100 pL supernatantista siirrettiin koeputkeen, joka sisälsi ; ,·. 0,900 mL 0,01 mol/L K2S208:a 0,5 M NaOH liuoksessa. Liuos injektoitiin Al-kuppiin ja : LL mitattiin 420 nm interferenssisuodattimen läpi, jolloin saatiin standardikuvaaja (a),

, ,,| 25 joka on esitetty kuvassa 10. Vaihtoehtoinen detektiotapa oli seuraava: 150 L

: . supernatanttia lisättiin 850 pL:aan 0,5 mM Tb(lll)-EDTA liuosta 0,2 M NaOH

, ;·, liuoksessa ja liuos sekoitettiin pipetillä ja inkuboitiin 15 min. Liuokseen lisättiin 25 pL

* * · 0,01 M kaliumperoksodisulfaattiliuosta ja sekoitettu liuos injektoitiin Al-kuppiin. LL-signaalia mitattiin 300 s aallonpituudella 545 nm, jolloin saatiin PLA2:lle • · ‘ ·*, 30 standardikuvaaja, joka on esitetty kuvassa 10 (b).

Esimerkki 9. B2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys mikrotiitterilevyillä irroittamalla ensin Tb-ioni immunokemiallisen reaktion jälkeen 35 vasta-aineesta ja mittaamalla vapautunut Tb-ioni uuden kompleksin avulla leiman detektiovaiheen perustuessa UV-säteilytetyn K2S208:n tai additiivisesti värjätyn KCI:n tuottamaan LL:iin leimayhdisteen ollessa Tb(lll)-kelaatin isotiosyanaattijohdannainen.

2i 111758

Mikrotiitterilevyn pinnoittaminen vasta-aineella. Mikrotiitterilevyn kuoppiin lisättiin 200 μΙ_ (10 mg/mL) hiiren anti-B2-mikroglobuliini vasta-ainetta (klooni 6G12, Labmaster Oy, Turku) 0,2 M NaH2P04-liuoksessa. Seuraavana päivänä kuopat pestiin kuusi kertaa 5 pesuliuoksella ( 0,01 M Tris-HCI, pH 7,75, 0,9% NaCI ja 0,02% Tween 20) ja tasapainotettiin liuoksella (200 pL/kuoppa), jossa oli 0,05 M Tris-HCI, pH 7,75, ja 1 g naudan seerumin albumiinia, 60 g sorbitolia ja 1 mmol CaCI2 yhtä litraa kohti liuosta. Seuraavaksi kuopat imettiin kuiviksi ja säilytettiin kosteana.

10 Vasta-aine leimattiin Tb(lll)-1 kelaatin isotiosyanaattijohdannaisella vastaavasti kuin esimerkissä 4.

Immunokemiallinen määritys. Standardit laimennettiin määrityspuskuriin 1:50 (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, jossa on 0,9% NaCI, 0,05% NaN3, 0,5% naudan seerumin 15 albumiinia ja 0,01% Tween 20) ja lisättiin kuoppaan (40 pL). Seuraavaksi lisättiin määrityspuskurissa 160 pL leimattua vasta-ainetta (500 ng kloonia 1F10, Labmaster

Oy, Turku). Immunikemiallisen reaktion annettiin tapahtua ja tunnin kuluttua kuopat pestiin kuusi kertaa pesuliuoksella ja kuoppaan lisättiin 200 pL 0,1 M glysiini^SO^ puskuria, pH 2,5), ja inkuboitiin 15 min. Tämän jälkeen edellistä liuosta otettiin 150 μ -4 20 L mittauskyvettiin ja lisättiin 50 pL 0,5 mol/L Na2S04 liuosta, joka sisälsi 5x10 mol/L ligandia 5. Liuos sekoitettiin ja lisättiin 800 pL 0,2 Na2B407 puskuria. Muodostunut Tb(lll)-5 kelaatti kvantitoitiin injektoimalla liuos lyoluminometrissä (545 nm : interferenssifiltteri) koeputkeen, joka sisälsi 10,0 mg UV-säteilytettyä K2S208:a.

I · , : Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 11.

• * :··; 25 '.;.t Esimerkki 10. B2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys käyttäen liposomeja Tb-5-kelaatin sitomiseen vasta-aineeseen. LL tuotettiin elektrolyyttisesti! ... värjätyn KCI:n ja S2082 ionien avulla.

30

Valmistettiin liposomeja, jotka sisälsivät terbium-5-kompleksin ja jotka sitten sidottiin * ' vasta-aineeseen (anti-U2-mikroglobuliini, klooni 6G12, Labmaster Oy, Turku) (GP.

Vonk, B. Wagner, Clinical Chemistry, 1991, 37, 1519). Immunokemiallinen reaktio tehtiin kuten esimerkissä 9, mutta puskurissa, joka ei sisältänyt pinta-aktiivisia 35 aineita. Pesun jälkeen kuoppaan lisättiin 230 pL 0,1% Triton X-100 liuosta 0,1 M glysiinipuskurissa (pH 3,2) ja inkuboitiin 10 min. Liuosta otettiin koeputkeen 200 pL ja lisättiin 60 pL 0,5 mol/L Na2C03 liuosta, joka sisälsi 1x10’3 mol/L ligandia 5.

22 111758

Lopuksi koeputkeen lisättiin 0,800 mL 0,05 M Na2B407 puskuria, sekoitettiin ja injektoitiin lyoluminometrissa (545 nm interferenssifiltteri) koeputkeen, jossa oli 20,0 mg hienoksi jauhettua elektrolyyttisesti värjättyä KCI:a. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 12.

5

Esimerkki 11. S2-Mikroglobuliinin immunometrinen määritys UV-valolla irrotettavalla leimalla. LL tuotettiin additiivisesti värjätyllä KCI:lla S2082' ionien läsnäollessa.

10 Mikrotiitterilevyn kuopat pinnoitettiin vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 9.

Vasta-aineen leimaus. Vasta-aine (klooni 1F10, Labmaster Oy, Turku) leimattiin UV-valolla irrotettavalla leima-aineella (Rhodamine Green sulfosuccinimidyl ester, Molecular Probes, R-7091, Eugene, USA) valmistajan ohjeen mukaisesti.

15

Immunomääritys tehtiin mikrotiitterilevyn kuopassa samoin kuin esimerkissä 9 paitsi, että pesun jälkeen stripsin kuoppiin pipetoitiin 200 μΐ 0,05 M Na2B407 liuosta.

2 0 Leiman irroitus UV-valolla ja EL-mittaus. Mikrotiitterilevyn stripsiä valotettiin ylhäältä päin UV-lampulla (Philips HPLR) 4,0 min. Kustakin kuopasta otettiin 180 μί liuosta .. koeputkeen. Tähän lisättiin 820 μί 0,05 M Na2B407 liuosta, joka sisälsi 5x1 O'4 mol/L

I ; K2S2Oe:a ja sekoitettu liuos injektoitiin lyoluminometrissa koeputkeen, joka sisälsi ; 30,0 mg additiivisesti värjättyä KCI:a. Lyoluminometrin optisena suotimena oli 500 • t 25 nm.n ylipäästösuodin. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 14.

» » \ Esimerkki 12. B2-Mikroglobuliinin lyoluminometrinen immunomääritys käyttäen leimana AHELta. Leima-aine irrotettiin kiinteästä kantajasta kaotrooppisella reagenssilla ja LL tuotettiin UV-säteilytetyllä kaliumperoksodisulfaatifla.

30

Mikrotiitterilevyn pinnoittaminen vasta-aineella. Mikrotiitterilevyn kuoppiin lisättiin 200 ·*: pL (10 mg/mL) hiiren anti-IJ2-mikroglobuliini vasta-ainetta (klooni 6G12, Labmaster Oy, : Turku) 0,2 M NaH2P04-liuoksessa. Seuraavana päivänä kuopat pestiin kuusi kertaa pesuliuoksella ( 0,01 M Tris-HCI, pH 7,75, 0,9% NaCI ja 0,02% Tween 20) ja ! , 35 tasapainotettiin liuoksella (200 μΙ/kuoppa), joka oli 0,05 M Tris-HCI, pH 7,75, jossa on yhtä litraa kohti 1 g naudan seerumin albumiinia, 60 g sorbitolia ja 1 mmol CaCI2. Seuraavaksi kuopat imettiin kuiviksi ja säilytettiin kosteana.

23 111758

Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Toinen hiiren anti-R2-mikroglobuliini vasta-aine (klooni 1F10, Labmaster Oy, Turku) leimattiin N-(6-aminoheksyyli)-N-etyyli-isoluminolilla (AHEI) Schroeder et ai. menetelmällä (Methods in Enzymology, Voi 57, 5 M. DeLuca (Toim.), Academic Press, N.Y., 1978).

βζ-mikroglobuliini-standardi. Ihmisen askitesnesteestä puhdistetusta β2-mikroglobuliinista (75,5 mg/mL, Labmaster Oy, Turku) valmistettiin standardit (0,4, 1,6, 4,0, 8,0 ja 16 mg/L) TSA-puskuriin, johon on lisätty 7,5 % naudan seerumin albumiinia.

10

Immunokemiallinen määritys. Standardit laimennettiin määrityspuskuriin 1:50 (0,05 mol/L Tris-HCI, pH 7,75, jossa on 0,9% NaCI, 0,05% NaN3, 0,5% naudan seerumin albumiinia ja 0,01% Tween 20) ja lisättiin kuoppaan (40 pL). Seuraavaksi lisättiin määrityspuskurissa 160 pL leimattua vasta-ainetta (500 ng, kloonia 1F10, Labmaster 15 Oy, Turku). Immunokemiallisen reaktion annettiin tapahtua ja tunnin kuluttua kuopat pestiin kuusi kertaa pesuliuoksella. Seuraavaksi immunokompleksiin kuopan seinämiin tarttunut leimattu vasta-aine irroitettiin kaotrooppisesti 0,2 mol/L boraattipuskurilla, pH

9.2, johon oli lisätty 1,75 mol/L NaSCN (250 mL). Lopuksi tästä siirrettiin 200 pL liuosta koeputkeen, johon lisättiin 800 pL 0,2 mol/L boraattipuskuria, pH 9.2. Sekoitettu liuos 20 injektoitiin lyoluminometrissä (450 nm interferenssifiltteri) koeputkeen, jossa oli 10,0 mg UV-säteilytettyä K2S208:a. LL mitattiin kuten esimerkissä 2. Standardikuvaaja on esitetty kuvassa 14. Tässä esimerkissä käytetyn kaotrooppisen reagenssin sijasta ; ;* leimattu vasta-aine tai leimattu antigeeni voidaan myös irroittaa kiinteältä kantajalta ; ; kuten suomalaisessa patentissa 88545.

'· j 25 » t I · * · : ** Esimerkki 13. Filadelfia-kromosomin DNA-hybridisaatiomenetelmä lateksipar- » · * tikkeleilla. Lyoluminesenssi tuotettiin UV-säteilytetyllä K2S208:lla.

: 30 Koettimen leimaaminen Tb-kelaatilla. Oligonukleotidi, johon oli lisätty aminoryhmiä (TTCGGGAAGTCGCCGGTCATCGTAGA-(C-NH2)25-5', Wallac, Turku) leimattiin *:··· Tb-kelaatin isotiosyanaattijohdannaisella kuten esimerkissä 4, paitsi että leimattu : ’ ‘ : nukleotidi puhdistettiin NAP-5 ja NAP-10 kolonneilla (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi).

! , 35 Koettimen leimaaminen biotiinillä. Menetelmää varten valmistettiin myös toinen

‘ t I

• koetin (C-(NH2-C)-GTCGTAAGGCGACTGGTAGTTATTCCTT-5', Wallac, Turku), joka oli leimattu biotiinillä. Biotiinin N-hydroksisukkinimidiesteri-johdannaisen (3,7 pL:ssa Ν,Ν-dimetyyliformamidia) annettiin reagoida koettimen kanssa yli yön (5 nmol 24 111758 50 pL.ssa, molaarisessa suhteessa 50:1) pH:ssa 9,5, +4°C:ssa. pH säädettiin lisäämällä Na2C03 niin paljon, että lopullinen molaarisuus oli 50 mmol/L. Koetin puhdistettiin kuten Tb-kelaatilla leimattu koetin.

5 Lateksipartikkeleiden pinnoittaminen streptavidiinilla. Lateksipartikkelit pinnoitettiin streptavidiinilla vastaavasti kuten esimerkissä 2 lateksipartikkelit pinnoitettiin vasta-aineella.

Hybridisaatio. Ihmisen solulinjan K562 solujen Ph1-kromosomin PCR:llä monistettua 10 170 emäsparin fraktiota (Turun Yliopistollinen Keskussairaala, Turku) käytettiin

positiivisena näytteenä ja tislattu vesi toimi negatiivisena kontrollina. Hybridisaatio tehtiin polypropeenista valmistetuissa 1,5 mL:n sentrifuugiputkissa, jotka oli saturoitu naudan seerumin albumiinilla. Putkiin lisättiin 20 pL pinnoitettujen lateksipartikkelien suspensiota (noin 180 milj. lateksipartikkelia). Positiivinen näyte ja negatiivinen 15 kontrolli pidettiin 100 °C:ssa 10 min ja jäähdytettiin jäähauteella, jonka jälkeen ne sentrifugoitiin mikrosentrifuugilla 1 min 12000 kierrosta minuutissa. Näytteestä pipetoitiin 50 μΙ_ lateksipartikkeleiden päälle ja se jälkeen 150 μΙ_ määrityspuskuria, jossa oli 2 ng biotinyloitua koetinta ja 2 ng Tb-kelaatilla leimattua koetinta. Määri-tyspuskuri sisälsi 33,72 g NaCI, 0,25 g NaN3, 2,5 g naudan seerumin albumiinia, 20 0,25 g naudan seerumin gammaglobuliinia ja 0,05 mL Tween 40 per litra 25 mM

Tris-HCI-puskuria, pH 7,75. Reaktion annettiin tapahtua 2 h 50 °C:ssa. Seuraavaksi partikkelit erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin kuten esimerkissä 5. Lopuksi partikkelit ! suspentoitiin 0,05 M Na2B407 liuokseen, ja injektoitiin lyoluminometrissä (545 nm * 1 ‘ i interferenssifiltteri) koeputkeen, joka sisälsi 10,0 mg UV-säteilytettyä K2S2O8.

; 25 Pylväsdiagrammi kokeesta on esitetty kuvassa 15.

Ml • · I 1 I ·

* I

’·: 30 < · 1 I » » · » . 35 • » ♦

Claims (4)

5 25 1 11758

1. Lyoluminesenssiin perustuva menetelmä käytettäväksi leimayhdisteiden detektiovaiheessa bioaffiniteettiin perustuvissa biokemiallisissa ja kliinisen kemian määritysmenetelmissä, tunnettu siitä, että energian varastointi kiinteään materiaaliin lyoluminesenssia tuottavassa muodossa tehdään additiivisilla 10 väritysmenetelmillä seuraavien reaktioiden mukaisesti: alkalimetallihöyry korkeassa paineessa ja lämpötilassa 15 alkalihalidit —> ^keskuksia , halogeenikaasu korkeassa paineessa ja lämpötilassa 20 alkalihalidit -> Vkeskuksia, tai elektrolyyttisillä väritysmenetelmillä seuraavien yleisten reaktioiden mukaisesti, : : pistemäinen katodi ; korkeassa lämpötilassa j alkalihalidit ^keskuksia ’ 30 pistemäinen anodi ; ; ; korkeassa lämpötilassa alkalihalidit -> Vkeskuksia, » · · * I i i * t 35 tai UV-säteilytyksellä seuraavien yleisten reaktioiden mukaisesti l t * * I 1 , , , ’ hv >4eV (4) S2082- ->2 S04-, > t ’ h v >4 eV ί 4 0 (5) P2082- -> 2 P04-2-, h v > 4.8 eV (6) KN03 -> kalium peroksonitriitti, 111758 tai energia voi olla varastoituneena voimakkaasti pelkistävien metallien, kuten alumiinin tai magnesiumin muodossa ja, että menetelmissä käytetään leimoja, jotka detektoi-daan lyoluminesenssin avulla ja leimayhdisteiden virittyminen perustuu energiaan, joka 5 vapautuu tai syntyy liukenemisprosessin yhteydessä ja, että liuokseen tuotu energia konvertoituu leimayhdisteiden emittoimaksi valoksi, jolloin varsinaisen analyytin määrä saadaan selville muodostuneen luminesenssin mittauksen perusteella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että leimayh-10 disteen luminesenssi joko muodostuu redox-reaktiomekanismeilla seuraavien yleisten reaktioiden mukaisesti: liuotin kiinteä aine -» liuennut aine + intermediaatit, 15 intermediaatit + liuotettu lisäaine sekundaariset lisäaineen tuottamat intermediaatit, joissa kiinteän aineen liukenemisessa muodostuvat intermediaatit ovat joko 20 pelkistäviä yksiköitöä, kuten alivalenttisia metalli-ioneja, solvatoituneita elektroneja, vetyatomeja, tai hapettavia yksiköitä, kuten sulfaatti-, hydroksyyli- tai fosfaattiradikaaleja, tai halogeeneja tai pseudohalogeenejä sisältäviä radikaaleja; ja ! lisäaine on peroksoyhdiste, amiini, oksaalaatti tai formiaatti ja, jossa leiman ! virittyminen perustuu reaktiohin, jotka kuuluvat seuraavaan reaktiosarjaan: ': 25 I : » · A + pelkistävä intermediaatti -> Ared + pelkistävän intermediaatin tuote, i « '.,. A + hapettava intermediaatti Aox + hapettavan intermediaatin tuote, * » * Ared + hapettava intermediaatti -> A* + hapettavan intermediaatin tuote, ... Aox + pelkistävä intermediaatti -> A*+ pelkistävän intermediaatin tuote, , * ’, 30 Ared + Aox —> A + A, ’ ” A* -»A + hv (näkyvää valoa), * » * * » ·...* joissa reaktioissa A on virittyvä leimayhdiste, Ared leimayhdisteen yksielektronisesti :‘j‘: pelkistynyt muoto, A^ leimayhdisteen yksielektronisesti hapettunut muoto, ja 35 intermediaatti on jokin kiinteän aineen liukenemisessa muodostunut primaarinen intermedeiaatti, tai liuoksessa olevan lisäaineen tuottama sekundaarinen intermediaatti; tai seuraavien yleisten yhtälöiden mukaisesti: 111758 Luminofori + hapettava intermediaatti luminofori-intermediaatit Luminofori-intermediaatit -> tuotteet + valo 5 tai energiansiirrolla seuraavien yleisten yhtälöiden mukaisesti: eaq- + X -*(Xf, (X-)* + A ->· X' + A*, A* A + hv (näkyvää valoa), 10 joissa A on virittyvä leima-aine ja X hapettava radikaali kuten sulfaatti-, fosfaatti-tai hydroksyyliradikaali, tai muu radikaali, joka on muodostunut halogenideistä tai pseudohalogenideistä sanottujen radikaalien tuottamana. 15

3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että leima-aineesta emittoituvan valon mittaus ja siten leiman ja välillisesti varsinaisen analyytin kvantitointi voidaan suorittaa lyoluminometrilla tai muulla vastaavalla laitteella siten, että laitteen mittauskammiooon tuodaan mitattava leima-aine ja 20 mittauskammioon muodostetaan patenttivaatimusten 1 ja 2 mukaiset olosuhteet, jonka jälkeen leima-aineen määrä mitataan joko hetkellisesti tai pitemmän ajan kuluessa. • > • * ‘ I

4. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että ! 25 bioaffiniteettiin perustuva määritysmenetelmä suoritetaan kiinteällä faasilla ja • · lyoluminesenssilla virittyvä luminofori tai luminoforilla leimattu vasta-aine tai antigeeni vapautetaan kiinteältä faasilta bioaffiniteettireaktion ja pesun jälkeen rikkomalla ' ’ ’ kiinteällä faasilla oleva bioaffiniteettiyhdisteiden välinen/väliset sidos/sidokset yhden tai useamman seuraavan tekijän vaikutuksesta: pH, lämpötila, UV-valo, ultraääni, 30 detergentti, kaotrooppinen suola, voimakkaasti pelkistävät tai hapettavat olosuhteet, ; · * orgaaninen liuotin ja/tai suuri ionivahvuus. t • * » » % » · » I Λ : 35 • »I 28 1 1 1758