ES2260767T3

ES2260767T3 - Mediciones de la velocidad de las reacciones biomoleculares utilizando electroluminiscencia.

Info

Publication number: ES2260767T3
Application number: ES95944075T
Authority: ES
Inventors: Laurette Nacamulli; Jonathan K. Leland; Stephanie A. Jameison
Original assignee: Bioveris Corp
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-12-04
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2015-12-04
Also published as: US20080057559A1; US5527710A; EP0871891A1; AU4596696A; CA2206335A1; AU711459B2; DE69534856D1; DK0871891T3; JPH10508104A; DE69534856T2; EP0871891A4; ATE320004T1; KR100381462B1; PT871891E; EP0871891B1; WO1996017248A1

Abstract

UNA REACCION BIOMOLECULAR, COMO POR EJEMPLO UNA REACCION DE UNION ENZIMATICA O DE AFINIDAD, SE EFECTUA EN UNA CELULA ELECTROQUIMICA CON UNA MEZCLA DE REACTIVOS QUE INCLUYE UN LUMINOFORO QUE RELACIONARA LA CONCENTRACION DE UN REACTIVO, UN PARTICIPE DE LA REACCION O PRODUCTO DE LA REACCION DE UN PARTICIPE DE REACCION DE LA INTENSIDAD DE ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA, CON OBJETO DE DETERMINAR LA VELOCIDAD DE LA REACCION BIOMOLECULAR. EL PARTICIPE DE LA REACCION ES UN REACTIVO QUE REACCIONA CON EL REACTANTE, Y QUE EL MISMO O EL PRODUCTO DE LA REACCION PARTICIPAN CON EL LUMINOFORO PARA ORIGINAR EMISIONES DE ECL. LA INTENSIDAD ECL SE MODULA CON UNA SERIE DE PULSOS ELECTRICOS QUE SE SUMINISTRAN A LA MEZCLA DE REACTIVOS SEGUN UN POTENCIAL PRESELECCIONADO PARA INTERVALOS PRESELECCIONADOS DE TIEMPO Y DURACION. LA INTENSIDAD SE MIDE DURANTE DICHOS INTERVALOS PARA SUMINISTRAR UNA SERIE TEMPORIZADA DE VALORES (P). EL MISMO EXPERIMENTO SE REPITE DOS VECES MAS, UNO EN EL QUE LA MODULACION SE REALIZA UNA VEZQUE LA REACCION HA FINALIZADO PARA OBTENER LA SERIE TEMPORIZADA DE VALORES (C), Y LA ULTIMA VEZ QUE SE REALIZO LA REACCION EN AUSENCIA DEL PARTICIPE DE LA REACCION PARA OBTENER LAS SERIES TEMPORIZADAS DE VALORES (B). LOS RESULTADOS SE NORMALIZAN (N) USANDO LA FORMULA I PARA OBTENER UNA SERIE DE VALORES (N) QUE SON REPRESENTADOS EN UN GRAFICO PARA OBTENER EL TIEMPO TRANSCURRIDO DE LA REACCION.

Description

Mediciones de la velocidad de las reacciones biomoleculares utilizando electroluminiscencia.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas y métodos analíticos para medir la velocidad de las reacciones biomoleculares. Más particularmente, la invención tiene que ver con el uso de la electroquimioluminiscencia ("ECL") para monitorizar en tiempo real el progreso de una reacción biomolecular. El método puede utilizarse para monitorizar el progreso de las reacciones de unión por afinidad y, como tal, puede utilizarse en mediciones de la velocidad de unión anticuerpo-antígeno, entre otras. El método también puede utilizarse para la determinación diagnóstica de una concentración o actividad enzimática y para otras mediciones de velocidad, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica.

Descripción de la técnica relacionada

Hay varios métodos conocidos para medir el progreso de las reacciones biomoleculares y la presente invención proporciona un nuevo método para monitorizar las velocidades de tales reacciones. El progreso de las reacciones enzimáticas, por ejemplo, se ha monitorizado mediante espectrofotometría y fluorescencia. Estos y otros métodos se utilizan en los laboratorios modernos y los solicitantes los han utilizado para obtener datos de referencia para el desarrollo de la nueva técnica analítica de la presente invención.

Las velocidades de reacción antígeno-anticuerpo pueden medirse utilizando una tecnología denominada de análisis de interacción bioespecífica en tiempo real que utiliza resonancia por plasmón de superficie para detectar interacciones biomoleculares. Se informó de que el método era un complemento valioso a los métodos de investigación convencionales en un artículo titulado "Label-Free Biosensor Technology Visualizes Biomolecular Interactions in Real Time", Biosensors & Bioelectronics, Vol. 8, Nº 2, Products and Innovations, págs. xi-xiv. El uso de resonancia por plasmón de superficie también lo tratan Sjolander, S. y Urbaniczky, C. en "Integrated Fluid Handling System for Biomolecular Interaction Analysis", Analytical Chemistry 1991, Vol. 63, págs. 2338-2345. Según el método, la cinética para las interacciones biomoleculares entre un antígeno y un anticuerpo pueden seguirse directamente sin marcaje. El método es útil para detectar, in situ, bajas concentraciones de moléculas bioquímicamente activas que tienen un peso molecular alto.

Friguet, B., et al., en "Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complexes by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Journal of Immunological Methods 1985, Vol. 77, págs. 305-319 informan de un procedimiento general para la determinación de la constante de disociación (K_{D}) de los equilibrios antígeno-anticuerpo en solución. El método emplea un ELISA indirecto clásico y se informa de que permite la detección de concentraciones muy pequeñas de anticuerpo y la determinación de valores de K_{D} de tan solo 10^{-9} M.

El método y el sistema de la presente invención emplean electroquimioluminiscencia que hasta ahora se ha utilizado en métodos analíticos para el análisis cualitativo y cuantitativo de restos químicos. En la patente de los EE.UU. número 5.310.687, por ejemplo, se describe un resto químico que comprende una sustancia química, bioquímica o biológica unida a uno o más compuestos organometálicos electroquimioluminiscentes. Se describen métodos para detectar concentraciones bajas del resto químico utilizando medios quimioluminiscentes, electroquimioluminiscentes y fotoluminiscentes. Se describen compuestos que son útiles para marcar sustancias de interés con marcadores que contienen rutenio y que contienen osmio u otros marcadores electroquimioluminiscentes. Las sustancias marcadas son útiles en métodos para detectar y cuantificar analitos de interés en ensayos de unión y ensayos de unión competitiva.

Ahora se ha descubierto un método y un sistema de empleo de electroquimioluminiscencia para monitorizar el progreso de reacciones biomoleculares y el método puede emplearse en kits diagnósticos para uso clínico, laboratorios de investigación, y similares. El método emplea equipo comercialmente disponible y proporciona un medio sumamente preciso para la determinación diagnóstica de una concentración o actividad enzimática. El método también proporciona un medio para medir velocidades de unión anticuerpo-antígeno y es útil para seleccionar anticuerpos de alta velocidad de unión. En una realización, se ha obtenido un método para medir las velocidades de unión del anticuerpo al antígeno carcinoembrionario. En otra realización, se ha obtenido un método para determinar la lactato deshidrogenasa para aplicaciones clínicas.

Sumario de la invención

Una reacción biomolecular que va a monitorizarse según la presente invención debe llevarse a cabo utilizando un luminóforo en condiciones de reacción que relacionarán la concentración de un reactante o un producto de la reacción con la intensidad de ECL. Por tanto, los reactivos empleados en la reacción incluirán un componente de la reacción que reacciona con el reactante y participa con el luminóforo para producir la emisión de ECL. En algunas realizaciones, es el producto de reacción del componente de la reacción el que participa con el luminóforo para producir la emisión de ECL. El método de la invención también requiere la modulación y la medición de la intensidad de ECL de la reacción biomolecular y la desmodulación de la medición de la intensidad.

Según la invención se proporciona un método para realizar una determinación del transcurso de tiempo de una reacción biomolecular o enzimática en una composición que contiene un luminóforo, un reactante y un componente de la reacción, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a): exponer dicha composición a una serie de impulsos de energía eléctrica en los intervalos de tiempo seleccionados, siendo dichos impulsos de magnitud suficiente para inducir al luminóforo a que emita una señal de electroquimioluminiscencia, por la que se produce una serie de picos de señal de electroquimioluminiscencia que se corresponden con los impulsos individuales;

(b): medir la señal de electroquimioluminiscencia en una pluralidad de dichos intervalos de tiempo seleccionados;

(c): correlacionar la señal de electroquimioluminiscencia medida en cada una de dicha pluralidad de dichos intervalos de tiempo seleccionados con la concentración respectiva de dicho reactante, dicho componente de la reacción, dicho producto de la reacción o combinaciones de los mismos en cada una de dicha pluralidad de dichos intervalos de tiempo seleccionados para determinar el transcurso de tiempo de la reacción biomolecular o enzimática; y

(d): efectuar dicha determinación partiendo de la base de dicha correlación.

La reacción biomolecular se lleva a cabo en una célula electroquímica y se aplica una serie de impulsos eléctricos a un potencial preseleccionado y a intervalos de tiempo constantes y a duración constante preseleccionados para modular la producción de ECL. La intensidad de la luminiscencia resultante se mide en los mismos intervalos para proporcionar una serie temporizada de valores denominados reacción en progreso (P). Se repite el mismo experimento, excepto en que se permite que finalice antes de que se mida la intensidad de ECL mediante la emisión de impulsos y la medición de la luminiscencia en las mismas condiciones para proporcionar una serie temporizada de valores denominados reacción completa (C). Se repite el mismo experimento una tercera vez en ausencia del componente de reacción y se mide la intensidad de ECL en los mismos intervalos para proporcionar una serie temporizada de valores denominados blanco (reacción de fondo) (B).

El transcurso de tiempo, la concentración frente al tiempo, de la reacción se determina mediante la desmodulación de las mediciones de intensidad. Esto se lleva a cabo restando el blanco (B) de la reacción en progreso (P) y dividiendo entre la diferencia de la reacción completa (C) menos el blanco (B). En consecuencia, la reacción enzimática (P) se normaliza (N) mediante la fórmula siguiente:

(I)N = \frac{P - B}{C - B}

El transcurso de tiempo se compara con un patrón conocido para determinar la concentración con respecto al tiempo y la velocidad de la reacción puede determinarse en cualquier punto de tiempo tomando la primera derivada (pendiente tangencial) en ese punto en la curva de la concentración frente al tiempo.

El método de medición de la velocidad enzimática de la invención requiere una reacción enzimática que produzca o consuma una sustancia que sea activa en ECL. A medida que la reacción progresa, la intensidad de ECL variará con la concentración de la sustancia activa en ECL. Se mezclan un luminóforo y la sustancia activa en ECL (o la sustancia que produce la sustancia activa en ECL) con los otros reactantes. La enzima se añade al final y se permite que la reacción continúe en una célula electroquímica. Se aplica una serie de impulsos eléctricos, tal como se explicó anteriormente, y se mide la intensidad de ECL y se desmodula para obtener el transcurso de tiempo de la reacción.

En la medición de las velocidades de la reacción de unión, por ejemplo, las velocidades de unión anticuerpo-antígeno, se preparan dos reactivos antes del acontecimiento de unión. Se une un luminóforo, tal como Ru(2,2'-bipiridina)_{3}^{2+} (se abrevia en ocasiones en el presente documento como "Ru(bpy)_{3}^{2+}" y el propio ligando de bipiridina se abrevia en ocasiones en el presente documento como "bpy"), al anticuerpo cuya velocidad de unión va a determinarse, y el antígeno (el componente de la reacción) se une a una perla magnética. Puede utilizarse un analizador ORIGEN® disponible de Igen, Inc., 1530 East Jefferson Street, Rockville, Md. 20852, EE.UU. para dispensar las muestras que contienen las perlas magnéticas y realizar el análisis. Las muestras se llevan a la célula de flujo electroquímico del analizador y las perlas magnéticas recubiertas con el antígeno se depositan uniformemente en el electrodo de trabajo desde la corriente de flujo colocando el imán directamente por debajo. El acontecimiento de unión se inicia y continúa mediante la extracción continua del anticuerpo marcado a través de la célula de flujo electroquímico del analizador. A medida que continúa el acontecimiento de unión, el marcador activo en ECL se une a la perla magnética. Se aplica una serie de impulsos eléctricos tal como se describió anteriormente. Se produce un aumento en la ECL a medida que continúa la unión e indica el progreso de la reacción. La intensidad de ECL se desmodula entonces para obtener el transcurso de tiempo de la reacción.

Los marcadores electroquimioluminiscentes utilizados según la invención son sensibles, no peligrosos y económicos, y pueden utilizarse en una amplia variedad de aplicaciones.

Descripción de las realizaciones preferidas

El transcurso de tiempo de una reacción biomolecular se determina según la presente invención mediante la formación de una primera mezcla de reactivos que contiene un reactante, un luminóforo y un componente de la reacción. El reactante reacciona con el componente de la reacción, y el luminóforo participa con el componente de la reacción para emitir electroquimioluminiscencia con la exposición de la mezcla de reactivos a la energía eléctrica. En algunas realizaciones de la invención, el producto de la reacción del componente de la reacción, en lugar del propio componente de la reacción, participa con el luminóforo para emitir electroquimioluminiscencia. Se aplica una serie de impulsos eléctricos a la primera mezcla de reactivos a un potencial preseleccionado y a intervalos de tiempo y duración preseleccionados, y se mide la electroquimioluminiscencia en los mismos intervalos para obtener un valor para cada intervalo.

Se forma una segunda mezcla de reactivos que es igual a la primera mezcla de reactivos. Se permite que los reactivos de la segunda mezcla de reactivos reaccionen hasta que se complete la reacción y después se expone la mezcla a una serie de impulsos eléctricos con el mismo potencial, intervalos de tiempo y duración que en la primera mezcla de reactivos. La electroquimioluminiscencia también se mide en los mismos intervalos que para la primera mezcla de reactivos para obtener un valor para cada intervalo.

Se forma una tercera mezcla de reactivos que es igual a la primera mezcla de reactivos, excepto en que no contiene el componente de la reacción. Se aplica una serie de impulsos eléctricos a la tercera mezcla de reacción con el mismo potencial, intervalos de tiempo y duración que en la primera mezcla de reactivos. La electroquimioluminiscencia se mide en los mismos intervalos que para la primera mezcla de reactivos para obtener un valor para cada intervalo.

El valor obtenido para el primer intervalo para la tercera mezcla de reactivos se resta del valor obtenido para el primer intervalo para la primera mezcla de reactivos para obtener una primera diferencia. El valor obtenido para el primer intervalo para la tercera mezcla de reactivos también se resta del valor obtenido para el primer intervalo para la segunda mezcla de reactivos para obtener una segunda diferencia. La primera diferencia se divide entre la segunda diferencia para obtener un valor normalizado para el primer intervalo. El valor normalizado se calcula entonces de la misma forma para cada intervalo sucesivo para obtener una serie de valores normalizados que pueden representarse para ilustrar el transcurso de tiempo (concentración frente al tiempo) gráficamente. Pueden realizarse otras operaciones matemáticas con los datos, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede tomarse la primera derivada en cualquier punto de la curva de valores normalizados para determinar la velocidad de la reacción en ese punto.

El sistema de la invención comprende una primera mezcla de reactivos que contiene un reactante, un luminóforo y un componente de la reacción. El reactante reacciona con el componente de la reacción, y el luminóforo participa con el componente de la reacción, o con el producto de la reacción del componente de la reacción, para emitir electroquimioluminiscencia al exponer la mezcla de reactivos a la energía eléctrica. El sistema comprende además una segunda mezcla de reactivos que es igual a la primera mezcla de reactivos, excepto en que se ha permitido que los reactantes reaccionen y, por tanto, comprende los reactivos reaccionados. También se proporciona con el sistema una tercera mezcla de reactivos que es igual a la primera mezcla de reactivos, excepto en que no contiene el componente de la reacción. Finalmente, se proporciona el sistema con un medio para exponer por separado cada una de las mezclas de reactivos primera, segunda y tercera a una serie de impulsos eléctricos a un potencial preseleccionado y a intervalos de tiempo y duración preseleccionados, y un medio para medir la electroquimioluminiscencia en los mismos intervalos.

El método de la invención se realiza en un aparato equipado con un electrodo, tal como una célula electroquímica. La reacción biomolecular que se monitoriza según la invención se lleva a cabo en el aparato utilizando un luminóforo en condiciones de reacción que relacionarán la concentración de un reactante, un componente de la reacción o el producto de la reacción del componente de la reacción con la intensidad de ECL, y el componente de la reacción es un reactivo que reacciona con el reactante y que participa (o su producto de reacción participa) con el luminóforo para producir la emisión de ECL.

La intensidad de ECL de la reacción biomolecular se modula mediante un potencial de entrada aplicado al electrodo. El potencial de entrada induce a que el luminóforo emita una producción de ECL medible creando un estado excitado del luminóforo que produce luminiscencia a longitudes de onda de entre aproximadamente 200 nanometros ("nm") y 900 nm a temperaturas ambiente. El potencial de entrada se incrementa con el tiempo (por ejemplo, por el método RAMP), y la producción de ECL se detecta como la respuesta al cambio de voltaje. El pico de ECL se produce en el potencial de la reacción electroquímica (potencial pico) que es conducido por el potencial de entrada.

Otra forma de generar ECL es mediante el escalonamiento del voltaje de entrada a o mayor que el potencial pico. La ECL se observa entonces como un pico definido que disminuye con el tiempo.

Según el método de la invención se aplica una serie de impulsos cortos al electrodo, también a un voltaje ligeramente superior que el potencial pico. El resultado es una serie de picos de ECL que corresponden a los impulsos de voltaje individuales. De esta forma se obtiene una "toma de muestras" de la señal de ECL a intervalos constantes en el tiempo y puede seguirse la progresión de la reacción. Se mide la intensidad de esta señal de ECL modulada en cada intervalo de tiempo y las mediciones se desmodulan entonces para obtener el transcurso de tiempo de la reacción.

La reacción de ECL se ralentiza mediante el método de la invención utilizando pulsos de escaso voltaje y la velocidad de disminución debida a la reacción biomolecular se compara con la velocidad de disminución debida a la reacción de ECL. (En una reacción de ECL en la que no se produce reacción enzimática, un pulso largo a un valor alto proporcionará una intensidad de ECL que disminuirá a lo largo del tiempo). En el intervalo de tiempo entre impulsos, difunde nuevo material al electrodo y está listo para reaccionar cuando llega el siguiente impulso de voltaje, por lo que cada pico de ECL es sólo ligeramente inferior que el anterior.

Pueden controlarse varios parámetros tales como el potencial y la duración del impulso, el potencial de reposo (es decir, el potencial durante el intervalo entre pulsos) y el tiempo entre cada pulso, así como la concentración de reactantes para proporcionar mejores condiciones para las mediciones de la velocidad para cada reacción biomolecular particular, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica.

Cuando se aplica la serie de impulsos eléctricos a un potencial preseleccionado y a intervalos de tiempo constantes y a una duración constante preseleccionados para modular la producción de ECL, se mide la intensidad de la luminiscencia resultante en los mismos intervalos para proporcionar una serie temporizada de valores denominados reacción en progreso (P). Se repite el mismo experimento, excepto en que se permite que finalice antes de que se mida la intensidad de ECL mediante la emisión de impulsos y la medición de la luminiscencia en las mismas condiciones para proporcionar una serie temporizada de valores denominados reacción completa (C). Se repite el mismo experimento una tercera vez en ausencia del componente de reacción y se mide la intensidad de ECL en los mismos intervalos para proporcionar una serie temporizada de valores denominados blanco (B).

El transcurso de tiempo, la concentración frente al tiempo, de la reacción se determina mediante la desmodulación de las mediciones de intensidad. Esto se lleva a cabo restando el blanco (B) de la reacción en progreso (P) y dividiendo por la diferencia de la reacción completa (C) menos el blanco (B). En consecuencia, la reacción enzimática (P) se normaliza (N) mediante la fórmula siguiente:

(I)N = \frac{P - B}{C - B}

El método de la presente invención, dado que se aplica a reacciones enzimáticas, es adecuado generalmente para medir la velocidad de las reacciones de la oxido-reductasa. Las óxido-reductasas catalizan las reacciones de oxidación-reducción y se clasifican en seis categorías según actúen sobre (1)> CH-OH; (2)>C=O; (3)> C=CH; (4)> CH-NH_{2}; (5)> CH-NH; y (6) NADH; NADPH.

La categoría de las óxido-reductasas que es particularmente adecuada para el método de la presente invención es la de las deshidrogenasas. Como grupo, las deshidrogenadas requieren un cofactor para su actividad. Un cofactor es un componente no proteico y puede ser un ion metálico o una molécula orgánica denominada coenzima. Cofactores adecuados para las deshidrogenasas (así como para las oxidasas y otras enzimas) se describen en la bibliografía y son bien conocidas en la técnica. Coenzimas habituales para las deshidrogenasas son, por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH).

Generalmente, una reacción catalizada por una deshidrogenasa, utilizando NADH como ejemplo, puede describirse tal como sigue:

sustrato \ reducido + NAD^{+} = sustrato \ oxidado + NADH

y la reacción puede continuar en cualquier sentido. El sustrato es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica. Ejemplos de sustratos reducidos incluyen isocitrato, etanol, lactato, malato y glucosa-6-fosfato.

Según el método de medición de la velocidad enzimática de la presente invención, se emplean sustancias (cofactores) que son activas en ECL (es decir, el componente de la reacción) y que correaccionan con el reactante de una reacción enzimática. Alternativamente, la sustancia activa en ECL puede ser el producto de la reacción del componente de la reacción. Tal como se observó anteriormente, los cofactores incluyen NADH y NADPH y las formas oxidadas respectivas de los mismos, NAD^{+} y NADP^{+}, que son particularmente adecuadas para su uso con deshidrogenasas y el peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) que es particularmente adecuado para su uso con oxidasas.

La reacción enzimática debe producir o consumir la sustancia activa en ECL. A medida que se produce el proceso, la sustancia se utiliza para ECL, que relaciona la concentración de las sustancias con la intensidad de ECL. Por ejemplo, el NADH producido en la siguiente reacción se utiliza para medir la velocidad de la reacción enzimática para la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa:

(1)glucosa-6-fosfato + NAD^{+} = 6-fosfogluconato + NADH

(2)NADH + Ru(bpy)_{3}{}^{2+} = ECL

en la que la reacción (1) se lleva a cabo en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y Ru(bpy)_{3}^{2+}. A medida que se produce NADH, reacciona con Ru(bpy)_{3}^{2+} según la reacción (2), cuando se aplican impulsos eléctricos, para producir ECL. La intensidad de la ECL aumentará con un aumento de la velocidad de producción de NADH y disminuirá con una disminución de la velocidad de producción de NADH.

Alternativamente, el NADH consumido en la siguiente reacción se utiliza para medir la velocidad de la reacción enzimática para la lactato deshidrogenasa (LDH):

(3)piruvato + NADH = NAD^{+} + lactato

(4)NADH + Ru(bpy)_{3}{}^{2+} = ECL

en la que la reacción (3) se lleva a cabo en presencia de LDH y Ru(bpy)_{3}^{2+}. A medida que se consume el NADH, reacciona menos con Ru(bpy)_{3}^{2+}, según la reacción (4), cuando se aplican impulsos eléctricos, para producir ECL. La intensidad de la ECL disminuirá con un aumento de la velocidad de consumo del NADH y aumentará con una disminución de la velocidad de consumo del NADH.

El NADH es un correactante particularmente adecuado para su uso según el método de medición de la velocidad enzimática de la presente invención porque participa en numerosas reacciones enzimáticas. El sustrato se convierte en productos por la enzima y, en el proceso, el NADH se convierte en NAD^{+} o viceversa dependiendo de la reacción. A medida que se produce (o se consume) el NADH, participa con el luminóforo para dar ECL. La intensidad de la luz es proporcional a la concentración del NADH en cada punto de tiempo. El cambio en la concentración de NADH está relacionado con la actividad de la enzima que cataliza la reacción. La señal se representa frente al tiempo tras la resta punto por punto del fondo y la normalización de la señal del luminóforo con la concentración inicial (o final) de NADH para obtener un transcurso de tiempo.

El mecanismo de la reacción entre Ru(bpy)_{3}^{2+} y el NADH como el correactante que finalmente produce electroquimioluminiscencia supone una primera etapa de oxidación de Ru(bpy)_{3}^{2+} en el electrodo según (1) tal como sigue:

(1)Ru(bpy)_{3}{}^{2+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{3+} + e^{-}.

El NADH también se oxida en el electrodo seguido por una pérdida de protón que produce el fuerte agente reductor, el radical NAD según (2) tal como sigue:

1

A continuación, el radical NAD reacciona con Ru(bpy)_{3}^{3+} en una reacción (3) homogénea. La transferencia de energía es suficiente para que el complejo de rutenio pase a su estado excitado tal como sigue:

2

\newpage

Al disminuir el estado fundamental, la molécula de marcaje emite luz detectable a 620 nm según la reacción (4) tal como sigue:

(4)Ru(bpy)_{3}{}^{2+*} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+} + hv

El método de medición de la velocidad enzimática de la invención se lleva a cabo mezclando todos los reactivos en un tubo de ensayo, y la enzima se añade al final. Con la adición de la enzima, la muestra se lleva a la célula electroquímica de un analizador ORIGEN®. Se aplica una serie de impulsos eléctricos a intervalos de tiempo constantes y de duración constante. (El analizador ORIGEN® genera una onda cuadrada, pero también pueden utilizarse ondas triangulares o sinusoidales). Se mide la luminiscencia resultante procedente del luminóforo y se indica la cantidad de productos formados a medida que progresa la reacción enzimática.

El método de la presente invención, dado que se aplica para reacciones de unión, puede utilizarse para monitorizar reacciones tales como las enumeradas a continuación:

: anticuerpo-antígeno, tal como CEA (antígeno carcinoembrionario) a anti-CEA;

: ligando-receptor, tal como la unión de una hormona a su receptor;

: avidina-biotina;

: apareamiento de bases, tal como con las reacciones de hibridación del ADN;

: lecitinas-hidratos de carbono; y

: enzima-inhibidor.

En la medición de las velocidades de las reacciones de unión, se preparan dos reactivos antes del acontecimiento de unión. Cuando está implicada una reacción anticuerpo-antígeno, por ejemplo, el luminóforo se une al anticuerpo (siendo el anticuerpo el reactante) cuya velocidad de unión va a determinarse, y el antígeno (el componente de la reacción) se une a una perla magnética. Puede utilizarse el analizador ORIGEN® para dispensar las muestras que contienen las perlas magnéticas y realizar el análisis. Las muestras se llevan a la célula de flujo electroquímico del analizador y las perlas magnéticas recubiertas con el antígeno se depositan uniformemente en el electrodo de trabajo desde la corriente de flujo colocando el imán directamente por debajo. El acontecimiento de unión se inicia y continúa mediante la extracción continua del anticuerpo marcado a través de la célula de flujo electroquímico del analizador. A medida que continúa el acontecimiento de unión, el marcador activo en ECL se une a la perla magnética. Se aplica una serie de impulsos eléctricos tal como se describió anteriormente. Se produce un aumento en la ECL a medida que continúa la unión e indica el progreso de la reacción. La intensidad de ECL se desmodula entonces para obtener el transcurso de tiempo de la reacción.

Los luminóforos que pueden utilizarse según la presente invención se incluyen en dos clases, concretamente, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. Los compuestos orgánicos incluyen hidrocarburos poliaromáticos fosforescentes o fluorescentes, tales como rubreno, 9,10-difenilantraceno, ftalocianinas y fenantreno. Los compuestos inorgánicos incluyen quelatos de metales de transición fosforescentes o fluorescentes, tales como tris-bipiridina rutenio, tris-bipiridina osmio, difosfonato de platino, Mo_{6}Cl_{12}^{2-}; compuestos organometálicos; quelatos de tierras raras tales como tenoiltrifluoroaectonato de terbio; dibenzoilmetiluro de europio; y quelatos de grupo principal tales como ftalocianina de silicio. Luminóforos particularmente útiles son los compuestos que contienen Ru y los que contienen Os.

Los luminóforos que se describen en la patente de los EE.UU. número 5.310.687 pueden utilizarse como luminóforos según la presente invención y, entre los descritos, se prefieren los complejos de rutenio tales como Ru(2,2'-bipiridina)_{3}^{2+.}

Los marcadores particulares a los que se refiere la presente invención son electroquimioluminiscentes. A menudo pueden excitarse hasta un estado luminescente sin su oxidación o reducción, exponiendo los compuestos a radiación electromagnética o a una fuente de energía química, tal como la creada por los sistemas habituales de oxalato-H_{2}O_{2}. Además, puede inducirse la luminiscencia de estos compuestos mediante métodos electroquímicos que suponen su oxidación y reducción. El método de la presente invención tiene que ver con la excitación de estos marcadores con impulsos eléctricos.

Se ha informado de un extenso trabajo sobre los métodos para detectar Ru(2,2'-bipiridina)_{3}^{2+} utilizando medios fotoluminescentes, quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes: Rubenstein y Bard (1981), "Electrogenerated Chemiluminescence. 37. Aqueous Ecl Systems based on Ru(2,2'-bipiridina)_{2}^{2+} and Oxalate or Organic Acids", J. Am. Chem. Soc. 103, págs. 512-516; y White y Bard (1982), "Electrogenerated Chemilluminescence. 41. Electrogenerated Chemilluminescence and Chemilluminescence of the Ru(bpy)_{3}^{2+}-S_{2}O_{8}^{2-} System in Acetonitrile-Water Solutions", 104 pág. 6891. Este trabajo demuestra que la quimioluminiscencia naranja brillante puede basarse en la reacción acuosa de Ru(bpy)_{3}^{2+} químicamente generado o electrogenerado, produciéndose reductores fuertes como productos intermedios en la oxidación de los iones oxalato u otros ácidos orgánicos. La luminiscencia también puede lograrse en soluciones H_{2}O con disolvente orgánico mediante la reacción de Ru(bpy)_{3}^{1+} electrogenerado o químicamente generado, generándose oxidantes fuertes durante la reducción de peroxidisulfato. Un tercer mecanismo para la producción de electroquimioluminiscencia a partir de Ru(bpy)_{3}^{2+} supone la oscilación de un potencial del electrodo entre un potencial suficientemente negativo para producir Ru(bpy)_{3}^{1+} y suficientemente positivo para producir Ru(bpy)_{3}^{3+}. Estos tres métodos se denominan, respectivamente, "reducción oxidativa", "oxidación reductora" y "sistema regenerativo de Ru(bpy)_{3}^{3+/+}".

El método de reducción oxidativa puede llevarse a cabo en agua y produce una luminiscencia intensa, eficaz y estable, que es relativamente insensible a la presencia de oxígeno o impurezas. Esta luminiscencia a partir de Ru(bpy)_{3}^{2+} depende de la presencia de oxalato u otros ácidos orgánicos tales como piruvato, lactato, malonato, tartrato y citrato, y de un medio para producir oxidativamente las especies de Ru(bpy)_{3}^{3+}. Esta oxidación puede llevarse a cabo químicamente mediante oxidantes fuertes tales como PbO_{2} o una sal de Ce (IV). Puede realizarse electroquímicamente mediante la aplicación de un potencial suficientemente positivo o bien continua o bien intermitentemente. Electrodos adecuados para la oxidación electroquímica del Ru(bpy)_{3}^{3+} son, por ejemplo, Pt, grafito pirolítico y carbono vítreo.

El método de oxidación reductora puede llevarse a cabo en soluciones parcialmente acuosas que contienen un codisolvente orgánico tal como, por ejemplo, acetonitrilo. Esta luminiscencia depende de la presencia de peroxidisulfato y un medio para producir reductoramente una especie excitada. La reducción puede llevarse a cabo electroquímicamente mediante la aplicación de un potencial suficientemente negativo o bien continua o bien intermitentemente. Un electrodo adecuado para la reducción electroquímica de Ru(bpy)_{3}^{2+} es por ejemplo, un electrodo de carbono vítreo pulido.

El sistema regenerativo de Ru(bpy)_{3}^{3+/+} puede llevarse a cabo en disolventes orgánicos tales como el acetonitrilo o en sistemas parcialmente acuosos, mediante la emisión de impulsos con un potencial del electrodo entre un potencial suficientemente negativo para reducir Ru(bpy)_{3}^{2+} y un potencial suficientemente positivo para oxidar Ru(bpy)_{3}^{2+}. Un electrodo adecuado para un sistema regenerativo tal es, por ejemplo, un electrodo de Pt. Este sistema no consume reactivos químicos y puede continuar, en principio, durante una duración ilimitada.

Estos tres métodos de producir compuestos que contienen Ru luminiscentes tienen en común la repetitiva oxidación-reducción o reducción-oxidación del compuesto que contiene Ru. Por tanto, la luminiscencia de las soluciones que contienen estos compuestos es altamente dependiente del potencial eléctrico de la fuente de energía aplicada y, por tanto, es altamente diagnóstica de la presencia del compuesto que contiene Ru.

Según la presente invención, puede emplearse un resto químico que tiene la fórmula

[M(P)m(L^{1})n(L^{2})o(L^{3})p(L^{4})q(L^{5})r(L^{6})s]t(D)u

en la que M es rutenio u osmio; P es un ligando polidentado de M; L^{1}, L^{2}, L^{3}, L^{4}, L^{5} y L^{6} son ligandos de M, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente a cada uno de los otros ligandos; D es una sustancia unida covalentemente a uno o más de P, L^{1}, L^{2}, L^{3}, L^{4}, L^{5} o L^{6} a través de uno o más enlaces amida o amina; m es un número entero igual o mayor que 1; cada uno de n, o, p, q, r y s es cero o un número entero; t es un número entero igual o mayor que 1; u es un número entero igual o mayor que 1; y P, L^{1}, L^{2}, L^{3}, L^{4}, L^{5}, L^{6} y D son de una composición y número tales que puede inducirse que el resto químico emita radiación electromagnética y el número total de uniones a M proporcionados por los ligandos de M equivale al número de coordinación de M.

La invención también emplea compuestos que son particularmente adecuados como productos intermedios para unir un marcador luminiscente que contiene rutenio u osmio a grupos amino de sustancias químicas, bioquímicas y biológicas. Por tanto, estos productos intermedios son particularmente adecuados para crear los restos químicos empleados según la presente invención. Los productos intermedios son los ésteres de mono y di-N-hidroxisuccinimida de bis(2,2'-bipiridin) (ácido 2,2'-bipiridin-4,4'-dicarboxílico)rutenio u osmio y sus sales; y bis (2,2'-bipiridin) (4,4'-di(clorometil)-2,2'-bipiridin)rutenio u osmio. Estos compuestos pueden sintetizarse mediante medios conocidos en la técnica.

La presente invención también puede emplear los restos químicos que contienen rutenio o que contienen osmio en métodos de unión para determinaciones de velocidad que incluyan los analitos de interés,

(A)k(D)u

en los que A es un compuesto que puede inducirse para que emita ECL repetidamente mediante la exposición directa a una fuente de energía electroquímica; D es una sustancia tal como un nucleótido, un polinucleótido, un anticuerpo derivado del suero o un anticuerpo monoclonal (y otras sustancias tal como se describe más adelante en esta memoria descriptiva) que se une a A; k es un número entero igual o mayor que 1, y u es un número entero igual o mayor que 1 que comprende a) formar una mezcla de reactivos en condiciones adecuadas que contenga el resto químico, y b) inducir al resto químico para que emita ECL repetidamente mediante la aplicación de energía eléctrica modulada y desmodular después la ECL según el método de la presente invención.

En una realización de la invención M es rutenio. En otra realización de la invención M es osmio.

El resto químico debe tener al menos un ligando polidentado de M. Si el resto tiene más de un ligando polidentado, los ligandos polidentados pueden ser iguales o diferentes. Los ligandos polidentados incluyen ligandos aromáticos y alifáticos. Ligandos polidentados aromáticos adecuados incluyen ligandos heterocíclicos aromáticos. Ligandos heterocíclicos aromáticos preferidos son los que contienen nitrógeno, tales como, por ejemplo, bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo, fenantrolilo y porfirinas.

Los ligandos polidentados adecuados pueden estar no sustituidos o sustituidos por cualquiera de un gran número de sustituyentes conocidos en la técnica. Sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, carboxilato, carboxaldehído, carboxamida, ciano, amino, hidroxilo, imino, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo, amidina, guanidinio, ureido, maleimida, grupos que contienen azufre, grupos que contienen fósforo y el éster de carboxilato de N-hidroxisuccinimida.

Adicionalmente, al menos uno de L^{1}, L^{2}, L^{3}, L^{4}, L^{5} y L^{6} puede ser un ligando heterocíclico aromático polidentado. Además, al menos uno de estos ligandos heterocíclicos aromáticos polidentados puede contener nitrógeno. Ligandos polidentados adecuados incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo, fenantroílo, una porfirina, bipiridilo sustituido, bipirazilo sustituido, terpiridilo sustituido, fenantroílo sustituido o una porfirina sustituida. Estos ligandos polidentados sustituidos pueden sustituirse con un alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, carboxilato, carboxaldehído, carboxamida, ciano, amino, hidroxilo, imino, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo, amidina, guanidinio, ureido, maleimida, un grupo que contiene azufre, un grupo que contiene fósforo o el éster de carboxilato de N-hidroxisuccinimida.

El resto químico puede contener dos ligandos bidentados, cada uno de los cuales es bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo, fenantrolilo, bipiridilo sustituido, bipirazilo sustituido, terpiridilo sustituido o fenantrolilo sustituido.

Alternativamente, el resto químico puede contener tres ligandos bidentados, cada uno de los cuales es bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo, fenantrolilo, bipiridilo sustituido, bipirazilo sustituido, terpiridilo sustituido o fenantrolilo sustituido. El resto químico puede comprender rutenio. En otra realización de la invención, el resto químico comprende rutenio, dos ligandos de bipiridilo bidentados y un ligando de bipiridilo bidentado sustituido. Todavía en otra realización, el resto químico puede contener un ligando tetradentado, tal como una porfirina o porfirina
sustituida.

El resto químico puede tener uno o más ligandos monodentados, una amplia variedad de los cuales se conocen en la técnica. Ligandos monodentados adecuados incluyen, por ejemplo, monóxido de carbono, cianuros, isocianuros, haluros, y fosfinas alifáticas, aromáticas y heterocíclicas, aminas, estibinas y arsinas.

Realizaciones particularmente preferidas del resto químico comprenden bis(2,2'-bipiridil)rutenio(II) y tris(2,2'-bipiridil)rutenio(II).

Uno o más de los ligandos de M puede estar unido a marcadores químicos adicionales, tales como, por ejemplo, isótopos radiactivos, componentes fluorescentes o centros luminiscentes adicionales que contienen rutenio o que contienen osmio.

Sustancias (D) adecuadas incluyen muchas sustancias biológicas, por ejemplo, células completas, virus, partículas subcelulares, proteínas, lipoproteínas, glucoproteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, lipopolisacáridos, lípidos, ácidos grasos, metabolitos celulares, hormonas, agentes farmacológicos, tranquilizantes, barbituratos, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos y azúcares. Las células completas pueden ser animales, vegetales o bacterianas, y pueden ser viables o muertas. Ejemplos incluyen patógenos de plantas, tales como hongos y nemátodos. Dentro de esta solicitud, el término "partículas subcelulares" significa orgánulos subcelulares, partículas de membrana procedentes de células rotas, fragmentos de paredes celulares, ribosomas, complejos multienzimáticos y otras partículas que pueden obtenerse de organismos vivos. Además, dentro de esta solicitud, ácidos nucleicos significa ARN cromosómico, ARN de plásmido, ARN viral y ARN recombinante derivados de múltiples fuentes. Los ácidos nucleicos también incluyen ARN, por ejemplo ARN mensajeros, ARN ribosómicos y ARN de transferencia. Los polipéptidos incluyen, por ejemplo, enzimas, proteínas de transporte, proteínas receptoras y proteínas estructurales tales como proteínas de la cubierta viral. Los polipéptidos preferidos son las enzimas y los anticuerpos derivados del suero. Los polipéptidos particularmente preferidos son los anticuerpos monoclonales. Las hormonas incluyen, por ejemplo, la insulina y la hormona tiroidea T4. Los agentes farmacológicos incluyen, por ejemplo, los glucósidos cardiacos. También está dentro del alcance de esta invención incluir sustancias sintéticas que se parecen químicamente a materiales biológicos, tales como péptidos sintéticos, ácidos nucleicos sintéticos y membranas sintéticas, vesículas y liposomas. Lo anterior no pretende ser una lista exhaustiva de las sustancias biológicas adecuadas para su uso en esta invención, sino que sólo pretende ilustrar el amplio alcance de la invención.

Las sustancias (D) biológicas y no biológicas se unen covalentemente a un ligando de M a través de uno o más enlaces amida o amina. En el caso de los enlaces amida, los enlaces pueden orientarse de modo que el material (D) se una directamente o bien al carbonilo o bien al nitrógeno del enlace amida. Estos restos químicos pueden ionizarse. En este caso, se entiende en la técnica que muchos contraiones diferentes servirán para neutralizar la carga de las preparaciones del resto químico. Los cationes adecuados incluyen, por ejemplo H^{+}, NH_{4}^{+}, guanidinio, Ag^{+}, Li^{+}, N^{+}, K^{+}, Mg^{2+} y Mn^{2+}. Los aniones adecuados incluyen, por ejemplo, haluros, OH^{-}, carbonato, SO_{4}^{+}, hexafluorofosfato y tetrafluoroborato.

Los restos químicos también son particularmente adecuados como productos intermedios para unir un marcador luminescente que contiene rutenio o que contiene osmio a grupos amino de sustancias químicas, bioquímicas y biológicas. Por tanto, estos productos intermedios son particularmente adecuados para sintetizar restos químicos según la presente invención. Los productos intermedios son los ésteres de mono y di-N-hidroxisuccinimida de 4,4'-(dicarboxi)-2,2'-bipiridilo, bis(2,2'-bipiridil)rutenio y osmio y sus sales; y 4,4'-(diclorometil)-2,2'-bipiridilo, bis(2,2' bipiridil)rutenio y osmio y sus sales.

Las estructuras químicas de estos productos intermedios y los métodos para prepararlos se establecen en la patente de los EE.UU. número 5.310.687 mencionada anteriormente.

Un método preferido para sintetizar los esteres de N-hidroxisuccinimida que contienen rutenio es hacer reaccionar primero dicloro-bis(2,2'-bipiridin)rutenio con ácido 2,2'-bipiridin-4,4'-dicarboxílico en una solución acuosa caliente de metanol de bicarbonato de sodio. Tras la acidificación, se añade una solución acuosa de NAPF_{6} a la solución del compuesto de rutenio carboxilado. La sal de hexafluorofosfato aislada del complejo de rutenio se esterifica entonces mediante la reacción con N-hidroxisuccinimida en presencia de diciclohexilcarbodiimida en dimetilformamida. Naturalmente, son posibles muchas variaciones en la estructura del componente de N-hidroxisuccinimida sin alterar sustancialmente la utilidad de los productos intermedios.

Los productos intermedios pueden ionizarse. En este caso, se entiende en la técnica que muchos contraiones diferentes servirán para neutralizar la carga de las preparaciones de los productos intermedios y formar una sal. Los cationes adecuados para formar estas sales incluyen, por ejemplo NH_{4}^{+}, guanidinio, Ag^{+}, Li^{+}, Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+} Mg^{2+} y Cd^{2+}. Los aniones adecuados para formar estas sales incluyen, por ejemplo, haluros, carbonato, SO_{4}^{2-}, hexafluorofosfato y tetrafluoroborato.

Los productos intermedios son útiles para marcar sustancias que contienen un grupo amino libre que puede unirse al éster de carboxilato y así desplazar a la N-hidroxisuccinimida, o que puede unirse al grupo clorometilo y así desplazar al cloruro.

La experiencia de los solicitantes con las sustancias marcadas con Ru(bpy)_{3}^{2+} indica las ventajas de utilizar compuestos que contienen rutenio y que contienen osmio como marcadores químicos. Son estables durante largos periodos y pueden unirse eficazmente a una amplia variedad de materiales químicos, bioquímicos y biológicos. Los marcadores son seguros y relativamente baratos. Producen una señal sumamente característica y no se producen en la naturaleza. Las mediciones basadas en la luminiscencia de los marcadores son sensibles, rápidas y reproducibles. Hay muy poca interferencia con la detección basada en la luminiscencia de estos marcadores por componentes tales como la solución salina tamponada con fosfato, Tween (un tensioactivo), extracto de tejido hepático o suero. La medición basada en la luminiscencia de estos marcadores no destruye la muestra ni los materiales marcados y puede realizarse repetitivamente. La señal se genera repetidamente mediante cada molécula de marcador, mejorando así la sensibilidad con la que pueden detectarse estos marcadores.

Los expertos en la técnica conocerán las condiciones adecuadas para formar la mezcla de reactivos y dependerán del tipo de mezcla de reactivos implicada. Por ejemplo, las condiciones adecuadas para una mezcla de reactivos acuosa pueden incluir las concentraciones apropiadas del resto químico y otros reactivos tales como oxidantes, el pH, la concentración salina y similares. Para una muestra sólida, las condiciones adecuadas para formar una mezcla de reactivos pueden incluir la adición de un líquido conductor.

La presente invención puede emplear restos que contienen osmio, así como restos que contienen rutenio y la amplia variedad de restos luminiscentes que pueden obtenerse variando la estructura química de los ligandos. Cada una de estas variaciones en el metal y los ligandos puede cambiar el valor preciso de la entrada de energía requerida para crear el estado excitado luminiscente. De manera similar, la longitud de onda de la radiación electromagnética emitida dependerá de la naturaleza y del entorno del material que contiene rutenio o que contiene osmio. Generalmente, la emisión y la excitación de fotoluminiscencia se producirán con radiación electromagnética de entre aproximadamente 200 nanometros y aproximadamente 900 nanometros en la longitud de onda. Las emisiones quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes se producirán generalmente estando la radiación electromagnética emitida entre aproximadamente 200 nanometros y aproximadamente 900 nanometros en longitud de onda. El potencial al que se producirá la reducción o la oxidación del resto químico depende de su estructura química exacta, así como de factores tales como el pH de la solución y la naturaleza del electrodo utilizado. En general, se conoce bien en la técnica cómo determinar las longitudes de onda óptimas de excitación y emisión en un sistema fotoluminiscente, y el potencial óptimo y la longitud de onda de emisión de un sistema electroquimioluminiscente y quimioluminiscente.

Ejemplos

En el siguiente trabajo experimental se utilizó un analizador ORIGEN®. Se configuró el funcionamiento regular del instrumento para detectar un resultado de ECL por muestra antes de desechar el lavado de esa muestra. Se modificó el funcionamiento regular, de manera que cada tubo pudiera analizarse individualmente. Es decir, el contenido de cada tubo se llevo a la célula y se dejó que permaneciera allí mientras se aplicaba una serie de impulsos a la muestra. Cada impulso proporcionó un punto de datos, de modo que se obtuvo una serie de puntos de datos para cada
muestra.

Normalmente, en el caso de las reacciones enzimáticas, la primera muestra en ejecutarse (reacción en progreso) contenía la molécula de Ru(bpy)_{3}^{2+} y todos los reactivos para la reacción enzimática, excepto la enzima. El tubo se cargó en el carrusel del analizador y se puso en marcha el analizador. (La superficie del electrodo se había limpiado antes del funcionamiento.)

La mezcla de muestras, todavía en el tubo, se agitó en un vórtex. En este punto, el analizador se programó para detenerse y alertar al operario para que añadiera la enzima con una pipeta. Una vez realizado esto, se reanudó el funcionamiento del analizador con el registro instantáneo del tiempo en segundos. Con cada impulso de voltaje que genera una producción de ECL, se proporcionó un registro de tiempo. De esta forma se obtuvo un transcurso de tiempo de la señal de ECL.

Una vez recogidos todos los datos para el primer tubo, le siguió un segundo tubo de muestra que contenía la misma composición que el primero. Excepto que en este caso, se había dejado tiempo a la enzima para actuar y la reacción se había completado. La muestra se sometió entonces al mismo esquema de voltaje. Los resultados del primer tubo se normalizaron con respecto a los resultados del segundo tubo, que era la producción de ECL (o la disminución de ECL) únicamente. (Alternativamente, pudo someterse a ensayo un tubo que contenía NADH y Ru(bpy)_{3}^{2+} en las mismas concentraciones que el primer tubo para este fin.)

También se ejecutó un tercer tubo con contenía todo excepto el sustrato, para fines de fondo (blanco). Los resultados de ECL de este tubo se restaron tanto del tubo en progreso como del completado, antes de la normalización numérica, punto por punto.

El instrumento tomó muestras a una velocidad de un punto de datos por 10 milisegundos ("ms"). Por tanto, un impulso que durara 100 ms, por ejemplo, daría 10 tomas de muestra durante ese periodo.

Se siguió un protocolo experimental similar para las mediciones de velocidad anticuerpo-antígeno tal como se explica en más detalle a continuación.

Ejemplo 1 Reacción enzimática en la que se genera NADH

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G-6-PDH") cataliza la oxidación de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconato con NAD^{+} como correactante que se reduce a NADH. La reacción es tal como sigue:

Glucosa-6-fosfato + NAD^{+}\ \xrightarrow{G-6-PDH}\ 6-fosfogluconato + NADH

El experimento se llevó a cabo en tampón fosfato 50 mM a pH 7,5. Puede utilizarse un pH de 7,0 - 7,5 y puede utilizarse un tampón carbonato, en lugar de fosfato. La solución contenía 0,53 g/L de Triton X-100. El tampón se utilizó como tampón del ensayo y como tampón de incubación para la muestra. La concentración del luminóforo fue de Ru(bpy)_{3}^{2+} 1E-4 M y las concentraciones habituales para el luminóforo pueden ser de desde aproximadamente 1E-6 M hasta aproximadamente 1E-4 M.

La muestra se llevó del tubo a la célula electroquímica del analizador ORIGEN® en el tiempo registrado como cero. Mientras, en el compartimento de la célula, el electrodo se sometió a una serie de impulsos desde cero hasta 1.800 milivoltios ("mV") frente a Ag/AgCl. La duración del impulso fue de 460 milisegundos ("ms") y el potencial de reposo fue cero para 250 ms. Las velocidades de impulso habituales pueden ser de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 500 milisegundos. El número de impulsos fue de 20, y el número puede ser de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40.

Se siguió la cinética de la reacción mediante la monitorización de la producción de ECL con el tiempo a medida que se generaba NADH y reaccionaba con Ru(bpy)_{3}^{2+}. La reacción alcanzó aproximadamente el 50% de su finalización tras aproximadamente 7 minutos.

Se repitió el experimento en las mismas condiciones, excepto en que se permitió que la reacción continuara hasta su finalización antes de medir la intensidad de ECL.

Se repitió de nuevo el experimento en las mismas condiciones, excepto en que no se añadió NAD^{+} a la mezcla de reacción.

Se ejecutó un cuarto experimento utilizando los mismos reactantes que en la primera ejecución en este ejemplo, excepto en que la reacción se analizó utilizando un espectrofotómetro. La reacción alcanzó aproximadamente el 50% de su finalización tras aproximadamente 7 minutos. Los resultados espectrofotométricos se compararon con la curva normalizada para el método de la invención y se correlacionaron bien.

Ejemplo 2 El efecto de inhibición del grupo fosfórico

Se repitieron los experimentos del ejemplo 1, excepto en que se varió la concentración del tampón fosfato para demostrar el efecto de inhibición del grupo fosfórico. Los resultados expresados en el tiempo que se tarda en convertir la mitad de la cantidad del sustrato en los productos ("t½") se resumen en la tabla siguiente:

Concentración del tampón	t½ del espectrofotómetro	t½ de electroquimioluminiscencia
fosfato (mM)	(min)	(min)

50	1,33	1,37
100	2,36	2,30
150	-	4,73
200	7,20	7,03

A medida que se aumentaba la concentración del tampón, aumentaba t½, marcando una ralentización en la cinética. Los resultados de los dos métodos concordaban bien.

Ejemplo 3 Reacción enzimática en la que se consume NADH

La lactato deshidrogenasa ("LDH") cataliza la conversión de piruvato a lactato con NADH como correactante que se consume para formar la forma oxidada NAD^{+} tal como sigue:

Piruvato + NADH\ \xrightarrow{LDH}\ Lactato + NAD^{+}

El NADH estaba presente en una concentración de 10^{-2} M, con Ru(bpy)_{3}^{2+} 10^{-4} M, y se repitió aquí el mismo protocolo experimental que el seguido en el ejemplo 1. El electrodo se expuso a impulsos veinte veces a 1.800 mV durante 460 ms y el potencial de reposo fue cero para 250 ms. El transcurso de tiempo total estuvo un poco por encima de 3.000 ms. Los resultados normalizados fueron comparables con los del análisis espectrofotométrico.

A medida que progresa esta reacción, hay menos NADH para reaccionar con Ru(bpy)_{3}^{2+} y la señal de ECL disminuye gradualmente. Sin embargo, debido a la naturaleza de la disminución de ECL, las dos reacciones están en competencia. La disminución de la reacción global parece ser más rápida, en comparación con los datos de absorbancia, porque hay menos sustrato de NADH con cada impulso.

Desempeñaría un papel decisivo si la velocidad de la disminución de ECL se redujera de modo que el efecto neto medido fuera debido a la reacción enzimática. Para tal efecto, se seleccionaron los parámetros del impulso y las concentraciones de NADH y Ru(bpy)_{3}^{2+} para proporcionar una señal de ECL más estable. El resultado fue una producción de ECL muy regular durante un periodo de tres minutos.

El intervalo clínico normal de LDH en suero es de 100 a 200 U/L, lo que es equivalente a de 1 a 2 nM de la enzima, a partir de un cálculo basado en la actividad de la enzima. Estos valores son correctos en el intervalo sometido a ensayo y, en consecuencia, puede utilizarse la prueba para determinar la LDH para aplicaciones clínicas.

Ejemplo 4 ADN marcado con estreptavidina-biotina

El método de medición es muy similar al utilizado para medir reacciones cinéticas enzimáticas y NADH, tal como se trató anteriormente. En los experimentos de NADH/enzimáticos, la velocidad de la reacción es muy rápida, por lo que la muestra debe aspirarse rápidamente justo antes de comenzar la ejecución. Sin embargo, para las mediciones de anticuerpo-antígeno, se prevé un tiempo de reacción mucho más largo y el experimento debe configurarse de modo ligeramente diferente.

El programa de software que controla el analizador ORIGEN® se modificó de modo que pudiera extraerse un flujo continuo de anticuerpo a través de las perlas marcadas con antígeno en la superficie del electrodo. El instrumento se programó para ejecutar la reacción a partir de un montaje de dos tubos. Las perlas marcadas con antígeno se extrajeron de un primer tubo y se capturaron en el electrodo con el imán. Se aumentó el carrusel y la solución marcada con anticuerpo (que estaba en un exceso sustancial en lo que se refiere a la concentración) se extrajo del segundo tubo a través de las perlas en la superficie del electrodo y comenzó la reacción de unión.

\newpage

De manera similar al método de NADH/cinética enzimática, se decidió utilizar una variación de impulsos de la forma de onda del voltaje de potencial de la etapa en estos experimentos, de modo que se generaran múltiples impulsos durante un intervalo de tiempo prolongado con un temporizador incorporado para seguir la pista del tiempo transcurrido tras la generación de cada impulso.

Cuando se utiliza la forma de onda de impulso repetitivo, pueden optimizarse varios parámetros para la reacción particular que va a medirse y los expertos en la técnica pueden determinar éstos fácilmente partiendo de la base de la guía proporcionada por la presente memoria descriptiva. Los parámetros incluyen el número de impulsos, la anchura del impulso, el tiempo de retraso entre los impulsos, el voltaje de potencial de la etapa y el potencial de reposo.

El método de medición fue muy similar al utilizado para medir NADH y reacciones cinéticas enzimáticas. Se ejecutaron tres reacciones por separado y con cada una se emplearon dos tubos, tal como se observó anteriormente. En la preparación para el experimento, se recubrieron 280 perlas magnéticas con estreptavidina, se añadieron a un primer tubo y después se añadieron a un marcador de ADN biotinilado. Se añadió un calibrador marcado de ADN biotinilado a un segundo tubo.

Utilizando los términos definidos en esta memoria descriptiva, se llevaron a cabo las reacciones tal como se describe a continuación:

Reacción en progreso - Una vez que comenzó el ciclo de medición, la concentración cambió con el tiempo a medida que se producía la unión y se completaba la reacción.

Tubo 1: Perlas recubiertas con estreptavidina

Tubo 2: Calibrador marcado de ADN biotinilado

Reacción completa - Se permitió previamente que la reacción transcurriera hasta su finalización, de modo que las mediciones de la intensidad fueran únicamente un resultado de la disminución de ECL.

Tubo 1: Las perlas recubiertas con estreptavidina se combinaron con el marcador de ADN biotinilado y se permitió que se unieran completamente.

Tubo 2: Calibrador marcado de ADN biotinilado.

Reacción de fondo - No hubo perlas presentes, por lo que la señal generada fue únicamente el resultado del marcador (fondo).

Tubo 1: Tampón de ensayo (sin perlas presentes para la unión).

Tubo 2: Calibrador marcado de ADN biotinilado.

Una ver ejecutadas las tres reacciones, se obtuvo la curva de reacción normalizada utilizando la fórmula:

(I)N = \frac{P - B}{C - B}

tal como se explicó anteriormente.

A continuación se ejecutó un transcurso de tiempo tubo por tubo utilizando veinte tubos de perlas y el marcador en las mismas concentraciones que las utilizadas anteriormente. Se pipetearon y se comenzó inmediatamente la ejecución. Por tanto, la reacción de unión tuvo lugar en cada tubo, y pudo determinarse el tiempo de finalización cuando la curva (intensidad de ECL frente al tiempo) alcanzó una meseta. Según este transcurso de tiempo, la reacción se completó en aproximadamente 6 minutos. Esto fue un tiempo de finalización mucho más rápido que el obtenido mediante el método de transcurso de tiempo de 3 etapas.

En este punto se sospechó que la reacción de estreptavidina-biotina estaba limitada por la difusión cuando se utilizaba el método de 3 etapas. Para dar más apoyo a esta conclusión, se realizó un estudio de semivida utilizando el método de transcurso de tiempo de 3 etapas.

El método de transcurso de tiempo de 3 etapas se repitió utilizando 6 concentraciones diferentes de perlas: 20 ug, 4 ug, 2 ug, 1,3 ug, 1,0 ug y 0,8 ug (por 300 uL). Tal como se esperaba, a medida que la concentración de perlas disminuía, la reacción se completaba mucho más deprisa.

Posteriormente, se obtuvo la semivida de cada concentración. Dado que el marcador estaba en exceso sustancial, se empujó a que la reacción siguiera una cinética de seudo-primer orden. En una reacción de primer orden, la semivida ("t½") es independiente de la concentración y se define como

t^{^{1}/_{2}} = 0,693/k

en la que k es la constante de unión. Por tanto la semivida debe ser constante, independientemente de la concentración si la reacción es de primer orden. En una representación gráfica de la concentración de perlas frente a la semivida, en la que se tomó el valor de t½ a los 0,5 minutos, suponiendo que todas las reacciones normalizadas alcanzaran una meseta a un valor relativo de 1,0, la semivida disminuyó a un ritmo constante a medida que disminuía la concentración. Los resultados se resumen a continuación:

	concentración de perlas		semivida
	(ug)		(minutos)

	0,8		7,5
	1,0		8
	1,3		10
	2		12
	4		16
	20		35

Esta disminución a ritmo constante en el valor de t½ es una indicación de que el sistema de estreptavidina-biotina está limitado por la transferencia de masas en la superficie del electrodo. Esto explica por qué la reacción tardó mucho más tiempo en completarse cuando se utilizó el método de 3 etapas frente al método de tubo por tubo.

Aunque la reacción estreptavidina-biotina estaba limitada por la difusión, el método de medición del transcurso de tiempo en 3 etapas de ECL debe ser factible en un sistema en el que las velocidades de unión son significativamente más lentas y, por tanto, no están limitadas por la difusión.

Ejemplo 5 El sistema anticuerpo-antígeno de CEA

El formato del ensayo del CEA utilizado en estos experimentos consistió en perlas recubiertas de estreptavidina unidas a un antígeno CEA biotinilado que se une posteriormente a un anticuerpo específico de CEA marcado. La velocidad de la reacción que se está midiendo en este sistema no es la reacción estreptavidina-biotina, sino la reacción anticuerpo-antígeno de CEA.

Se obtuvo un anticuerpo de CEA denominado 1F3, y se intentó el método del transcurso de tiempo de 3 etapas de ECL en este sistema para compararse con los valores obtenidos anteriormente en el sistema BIAcore utilizando el mismo anticuerpo 1F3. (El sistema BIAcore emplea resonancia por plasmón de superficie y está disponible de Pharmacia Biosensor AB.)

La concentración más alta del marcador 1F3 escogido para la ejecución utilizando el método de 3 etapas fue de 11 nM, que es comparable en concentración a la concentración inferior de 10 nM ejecutada en el BIAcore. Además, se ejecutaron dos concentraciones inferiores de 5,5 nM y 2,7 nM. El perfil normalizado obtenido a partir de la solución del marcador 1F3 11 nM tenía la forma deseada; sin embargo tenía mucho ruido. Esto se debe a que al utilizar del método de ECL tal como se ha descrito, tanto el marcador que se une a las perlas, como el marcador libre que no se une (que se considera señal de fondo) están presentes simultáneamente en la superficie del electrodo. A las elevadas concentraciones del marcador, se hace difícil distinguir entre las fases de unión y no unión, por lo que no puede obtenerse un perfil de reacción normalizado uniforme. Los perfiles normalizados para las concentraciones de 5,5 nM y 2,7 nM del anticuerpo 1F3 eran mucho más uniformes, lo que apoya de nuevo cómo puede afectar la contribución del marcador no unido al electrodo a la cantidad de ruido en la señal. Dado que la concentración de marcador no unido presente en el electrodo es inferior, es mucho más fácil distinguir la señal de fase unida y se obtiene un perfil mucho más uniforme.

En el sistema BIAcore, se ejecutó una serie de concentraciones de marcador 1F3, que oscilan desde 10 nM hasta 500 nM. El método actual de 3 etapas en el sistema de ECL no permite concentraciones de marcador mucho más altas de 10 nM.

Para obtener una comparación del método de 3 etapas de ECL con el método BIAcore, se llevó a cabo un análisis matemático de los datos obtenidos para las tres curvas de concentración normalizadas para obtener la constante de velocidad de asociación experimental, k_{a}. El valor de k_{a} para los datos obtenidos en el BIAcore fue de 4,0 x 10^{5} M^{-1} s^{-1}. Para los datos de ECL se obtuvo un valor medio (\pmDE)k_{a} de 9,0 x 10^{5} (\pm 4,7 x 10^{5}) M^{-1} s^{-1}. Este valor es una media de tres valores de k_{a} para cada concentración.

Claims

1. Método para realizar una determinación del transcurso de tiempo de una reacción biomolecular o enzimática en una composición que contiene un luminóforo, un reactante y un componente de la reacción, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) exponer dicha composición a una serie de impulsos de energía eléctrica en los intervalos de tiempo seleccionados, siendo dichos impulsos de magnitud suficiente para inducir al luminóforo a que emita una señal de electroquimioluminiscencia, por la que se produce una serie de picos de electroquimioluminiscencia que se corresponden con los impulsos individuales;

(b) medir la señal de electroquimioluminiscencia en dichos intervalos de tiempo seleccionados;

(c) correlacionar la señal de electroquimioluminiscencia medida en cada una de dicha pluralidad de dichos intervalos de tiempo seleccionados con la concentración respectiva de un componente seleccionado de dicho reactante, dicho componente de la reacción y dicho producto de la reacción en cada una de dicha pluralidad de dichos intervalos de tiempo seleccionados para determinar el transcurso de tiempo de la reacción biomolecular o enzimática; y

(d) efectuar dicha determinación partiendo de la base de dicha correlación.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende:

(a) formar dicha composición que contiene dicho luminóforo y dicho reactante, en la que el reactante reacciona para formar dicho producto de la reacción; y

(b) exponer dicha composición a la energía eléctrica en dichos intervalos de tiempo seleccionados y medir la señal de electroquimioluminiscencia en dicha pluralidad de intervalos de tiempo seleccionados para determinar el transcurso de tiempo de la reacción,

en el que la intensidad de la señal de electroquimioluminiscencia depende de la concentración de dicho reactante o dicho producto de la reacción.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha composición comprende dicho reactante y dicho componente de la reacción, y en el que dicho reactante y dicho componente de la reacción reaccionan para formar dicho producto de la reacción.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho método es para llevar a cabo la determinación del transcurso de tiempo de una reacción de unión, que comprende:

(a) formar dicha composición que contiene dicho luminóforo, dicho reactante y dicho componente de la reacción, en la que

(i): el reactante y el componente de la reacción se unen para formar un complejo;

(ii): el luminóforo puede inducirse para que emita una señal de electroquimioluminiscencia; y

(iii): el luminóforo está unido a dicho reactante;

(b) exponer la composición a la energía eléctrica en dichos intervalos de tiempo seleccionados y medir la señal de electroquimioluminiscencia en dicha pluralidad de intervalos de tiempo para determinar el transcurso de tiempo de la reacción de unión.

5. Método según las reivindicaciones 1 - 4, en el que dicho método es para realizar la determinación del transcurso de tiempo de una reacción enzimática, comprendiendo dicho método:

(a) formar dicha composición que contiene dicho luminóforo, dicho reactante, dicho componente de la reacción y una enzima, siendo el reactante un sustrato para dicha enzima, en el que

(i): la enzima cataliza la reacción del sustrato para formar dicho producto de la reacción;

(ii): el luminóforo puede inducirse para que emita una señal de electroquimioluminiscencia y dicha señal de electroquimioluminiscencia emitida a partir de dicho luminóforo varía con la concentración de dicho sustrato o dicho producto de la reacción; y

(iii): la intensidad de la señal de electroquimioluminiscencia emitida por la exposición de dicha composición a la energía eléctrica cambia a medida que progresa dicha reacción;

(b) exponer la composición a la energía eléctrica en dichos intervalos de tiempo seleccionados y medir la señal de electroquimioluminiscencia en dicha pluralidad de intervalos de tiempo seleccionados para determinar el transcurso de tiempo de la reacción.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que comprende además la normalización de dicha señal de electroquimioluminiscencia.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha normalización comprende preparar una segunda mezcla de reacción que tiene los componentes de dicha composición, permitir que la reacción finalice, exponer dicha segunda mezcla de reacción a la energía eléctrica y medir la electroquimioluminiscencia emitida.

8. Método según las reivindicaciones 2 - 6, en el que dicha normalización comprende preparar una mezcla de reacción blanco que comprende dicho luminóforo y dicho reactante, pero en condiciones en las que dicha reacción no continúe, exponer dicha mezcla de reactantes blanco a la energía eléctrica y medir la electroquimioluminiscencia emitida.

9. Método según las reivindicaciones 3 - 5, que comprende además:

(c) formar una segunda mezcla de reactivos que tiene los componentes contenidos en la composición;

(d) permitir que la segunda composición de reactivo reaccione hasta que se complete la reacción y luego exponer la segunda mezcla de reactivos a la energía eléctrica en dichos intervalos de tiempo seleccionados tal como se realizó en la etapa (b) y medir la electroquimioluminiscencia en los intervalos de tiempo seleccionados tal como se realizó en la etapa (b) para obtener un valor para cada intervalo;

(e) formar una tercera mezcla de reactivos que tiene los componentes contenidos en la composición, excepto que no contiene el componente de la reacción;

(f) exponer la tercera mezcla de reactivos a la energía eléctrica en dichos intervalos de tiempo seleccionados tal como se realizó en la etapa (b) y medir la electroquimioluminiscencia en los intervalos de tiempo seleccionados tal como se realizó en la etapa (b) para obtener un valor para cada intervalo;

(g) restar el valor obtenido para el primer intervalo en la etapa (f) del valor obtenido para el primer intervalo en la etapa (b) para obtener una primera diferencia;

(h) restar el valor obtenido para el primer intervalo en la etapa (f) del valor obtenido para el primer intervalo en la etapa (d) para obtener una segunda diferencia;

(i) dividir la primera diferencia entre la segunda diferencia para obtener un valor normalizado para el primer intervalo;

(j) repetir las etapas (g), (h) e (i) para cada intervalo sucesivo para obtener un valor normalizado para cada intervalo sucesivo, y

(k) efectuar la determinación del transcurso de tiempo de la reacción a partir del valor normalizado de todos los intervalos.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que los impulsos son de duración seleccionada.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 - 5, que comprende además la etapa de determinar la concentración del reactivo en una muestra.

12. Método según las reivindicaciones 2 - 5, en el que dicho luminóforo participa con el reactante o el producto de la reacción para emitir electroquimioluminiscencia con la exposición a dicha energía eléctrica.

13. Método según la reivindicación 4, en el que dicho complejo es un complejo anticuerpo-antígeno.

14. Método según las reivindicaciones 3 o 4, en el que el reactante se une al luminóforo y el componente de la reacción se une a una perla magnética.

15. Método según la reivindicación 5, en el que el sustrato es un cofactor.

16. Método según la reivindicación 5, en el que el componente de la reacción es un cofactor.

17. Método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el cofactor es el NADH.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 17, en el que el luminóforo comprende un luminóforo orgánico.

19. Método según una de las reivindicaciones 1 - 17, en el que el luminóforo comprende un luminóforo organometálico.

20. Método según la reivindicación 19, en el que el luminóforo se selecciona del grupo que consiste en compuestos que contienen Ru y que contienen Os.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el luminóforo es tris-bipiridina rutenio o tris-bipiridina osmio.