JPH10508104A - 電気化学発光を用いる生体分子反応の速度測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生体分子反応の速度を決定するために、酵素反応または親和性結合反応のような生体分子反応は、電気化学発光の強度に反応体、反応パートナーまたは反応パートナーの反応生成物の濃度に関係させる発光団を含む試薬の混合物を用いて電気化学セル中で行なわれる。反応パートナーは、反応体と反応しそしてそれ自身またはその反応生成物が発光団と関与してＥＣＬ発光を生じさせる試薬である。ＥＣＬ強度は予かじめ選ばれた時間間隔および持続時間について予かじめ選ばれた電位で試薬の混合物に適用される一連の電気パルスで変調される。強度はこれらの間隔の間に測定されて値（Ｐ）の時限シリーズを提供する。同じ実験はもう２回繰り返えされ、その一回は反応が完了してしまった後に変調が行なわれて、値（Ｃ）の時限シリーズを得そして最後の回に反応は反応パートナーの不存在下に行なわれて値（Ｂ）の時限シリーズを得る。結果は式（Ｉ）を用いて正規化（Ｎ）されて一連の値（Ｎ）を得、これらの値（Ｎ）はプロットされて反応の時間コースを得る。

Description

【発明の詳細な説明】 電気化学発光を用いる生体分子反応の速度測定発明の背景 本明の分野 本発明は生体分子（biomolecular）反応の速度を測定するための分析方法およ びシステムに関する。さらに特定的には、本発明は生体分子反応の進行を、実際 の時間で監視するための電気化学発光（“ＥＣＬ”）の使用に関する。本方法は 親和性結合反応（affinity binding reactions）の進行を監視するために使用さ れることが出来そしてそのままで、取り分け、抗体−抗原結合速度測定において 使用されることが出来る。本方法はまた、酵素活性または濃度の診断決定のため にそして当業者に明らかであるような他の速度測定のために使用されることが出 来る。関連技術の記載 生体分子反応の進行を測定する種々の公知の方法がありそして本発明はそのよ うな反応の速度を監視する新しい方法を提供する。例えば、酵素反応の進行は分 光測光および蛍光により監視された。これらの方法および他の方法が現代の実験 室において用いられておりそして本発明の新しい分析技術の開発のための参考デ ータを得るために本出願人により用いられて来た。 抗原−抗体反応速度は生体分子相互作用を検出するために表面プラスモン共鳴 (surface plasmon resonance)を使用する実体時間生体特異性分析と称される技 術を用いて測定されることが出来る。その方法は、Biosensors & Biolectronics ，Vol.8，No.2，Products and Innovations pp.xi-xiv の“Label-Free Biosens or Technology Visualizes Biomolecular Interactions in Real Time”と題す る記事における検討の慣用方法の価値ある補足であると報告された。表面プラス モン共鳴の使用はまた、Analytical Chemistry 1991，Vol.63，pp.2338〜2345の “Integrated Fluid Handling System for Biomolecular Interaction Analysis ”においてSjolander,S.およびVrbaniczky,C．により論じられている。その方法 に よれば、抗原と抗体との間の生体分子相互作用についての速度論に標識化なしで 直接に従うことが出来る。その方法は、高い分子量を有する、低い濃度の生化学 的に活性な分子を、その場で検出するのに有用である。 溶液中の抗原−抗体平衡の解離定数（Ｋ_D）の決定のための一般的な方法はJou rnal of Immunological Method 1985 Vol.77，pp.305 〜319 の“Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen - Antibody Complexe s by Enzyme - Linked Immunosarbent Assay”においてFriguet，B．等により報 告されている。その方法は古典的な間接ＥＬＩＳＡを使用しそして非常に小さい 濃度の抗体の検出を可能にしそして１０^-9Ｍほどの小さなＫ_D値を決定するのを 可能にすることが報告されている。 本発明の方法およびシステムは化学的部分の定性的および定量的分析のために 、分析方法において従来用いられて来た電気化学発光を使用する。例えば米国特 許第５，３１０，６８７号において、１種またはそれ以上の電気化学発光有機金 属化合物に結合した化学、生化学または生物学的物質からなる化学部分が開示さ れている。化学発光手段、電気化学発光手段およびホトルミネセント手段を用い る、低濃度の化学部分を検出するための方法が開示されている。ルテニウム含有 標識およびオスミウム含有標識または他の電気化学発光標識を用いて関連物質を 標識化するのに有用である化合物が開示されている。標識化された物質は結合検 定法および競合結合検定法において関連分析物を検出しそして定量化する方法に おいて有用である。 本発明者等は生体分子反応の進行を監視するための電気化学発光を使用する方 法およびシステムを今や見い出したそして本方法は臨床的用途、研究実験室、等 のための診断キットにおいて使用されることが出来る。本方法は市販の機器を使 用しそして酵素活性または濃度の診断測定のための高度に正確な手段を提供する 。本方法はまた抗体−抗原結合速度を測定するための手段を提供しそしてそれは 高い結合速度の抗体をスクリーニングするために有用である。１つの態様におい て、癌胎児性抗原(carcinoma embryonic antigen)に結合する抗体の速度を測定 するための方法が誘導された。他の態様において、臨床適用のための乳酸デヒド ロゲナーゼ（脱水素酵素）を測定するための方法が誘導された。発明の概要 本発明に従って監視されるべき生体分子反応は、反応体または反応の生成物の 濃度がＥＣＬ強度に関係する、反応条件下の発光団(励起されると光を発する分 子群：luminophore)を用いて行なわなければならない。したがって反応において 使用される試薬は反応体と反応しそして発光団に関与してＥＣＬの発光を生じさ せる反応パートナーを含む。或る態様においてそれは発光団と関与してＥＣＬの 発光を生じさせる反応パートナーの反応生成物である。本発明の方法はまた生体 分子反応のＥＣＬ強度の変調（modulation）および測定そして強度測定の復調（ demodulation）を必要とする。 生体分子反応は電気化学セルにおいて行われそしてＥＣＬ出力を調節するため の予かじめ選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた一定の時間間隔および一定の 持続時間で一連の電気的パルスが適用される。得られた発光の強度が同じ間隔で 測定されて進行反応と称される値（Ｐ）の時限シリーズを提供する。同じ実験が 繰り返されるが但し、完了まで進行させ、その後に同じ条件下でパルスを送りそ して測定することによりＥＣＬ強度が測定されて反応完了と称される値（Ｃ）の 時限シリーズを提供する点が異なる。反応パートナーの不存在下に同じ実験が第 ３回目に繰り返えされそしてＥＣＬ強度が同じ間隔で測定されてブランク（背景 反応）と称される値（Ｂ）の時限シリーズを提供する。 反応の時間コース、濃度対時間は強度測定と復調（demodulating）することに より決定される。これは進行反応（Ｐ）からブランク（Ｂ）を差し引き、そして 反応完了（Ｃ）からブランク（Ｂ）を引いての差により割ることにより行なわれ る。したがって、酵素反応（Ｐ）は次の式により正規化（Ｎ）される。 時間コースは時間にわたっての濃度を決定するために既知の標準と比較されそ して、時間における任意の点で、濃度対時間曲線上でのその点での第１導関数（ derivative）（接線勾配）を得ることにより反応速度を測定することが出来る。 本発明の酵素速度測定方法はＥＣＬ活性である物質を生成するかまたは消費す る酵素反応を必要とする。反応が進行するにつれ、ＥＣＬ活性物質の濃度ととも にＥＣＬ強度が変化する。発光団およびＥＣＬ活性物質（またはＥＣＬ活性物質 を生成する物質）は他の反応体と混合される。酵素は最後に加えられそして電気 化学セル中で反応を進行させる。上に説明したように一連の電気パルスが適用さ れそして反応の時間コースを得るためにＥＣＬ強度が測定されそして復調（demo dulate）される。結合反応速度、例えば抗体−抗原結合速度の測定において、結 合事象(event)のまえに２種の試薬が造られる。Ｒｕ（２，２′−ビピリジン）₃ ²⁺ （ときには本明細書において“Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺”と略述されそしてビピリ ジン配位子それ自体はときには本明細書において“ｂｐｙ”と略述される）のよ うな発光団は、結合速度が決定されるべき抗体に結合されそして抗原（反応パー トナー）は磁気ビーズに結合される。アメリカ合衆国２０８５２メリーランド州 、ロックビル イーストジファーソンストリート１５３０のＩｇｅｎ Ｉｎｃ． から市販のＯＲＩＧＥＮ^TMアナライザーが磁気ビーズを含有するサンプルを分配 しそして分析を行うために使用されることが出来る。サンプルはアナライザーの 電気化学流体セル中に引き入れられそして抗原で被覆された磁気ビーズは磁気を 直接下に置くことにより流体流から作用電極上に均一に付着される。アナライザ ーの電気化学流体セル中に標識化された抗体を連続的に引き入れることにより結 合事象が開始され且つ進行する。結合事象が進行するにつれて、ＥＣＬ活性標識 が磁気ビーズに結合する。一連の電気パルスが上記のとおりに適用される。結合 が進行するにつれてＥＣＬにおける上昇が起こりそして反応進行を示す。次に反 応の時間コースを得るためにＥＣＬ強度が復調される。 本発明に従って使用される電気化学発光標識は感度がよく、危険がなくそして 費用がかからず、そしてそれらは広い種々の適用において用いられることが出来 る。好ましい態様の記載 生体分子反応の時間コースは、反応体、発光団および反応体を含有する第１の 試薬混合物を形成することにより本発明に従って決定される。反応体は反応パー トナーと反応しそして発光団は反応パートナーに関与して、電気エネルギーに試 薬混合物がさらされた際に電気化学発光を発生する。本発明の或る態様において 、反応パートナーそれ自体よりもむしろ反応パートナーの反応生成物は発光団と 関 与して、電気化学発光を発生する。一連の電気パルスが、予かじめ選ばれた電位 でそして予かじめ選ばれた時間間隔および持続時間で第１試薬混合物に適用され 、そして電気化学発光が同じ間隔で測定されて各々の間隔についての値を得る。 第１試薬混合物と同じである第２の試薬混合物が形成される。反応が完了する まで第２試薬混合物の試薬を反応させそして次に第１試薬混合物が使用したと同 じ電位、時間間隔および持続時間で、混合物を一連の電気パルスにさらす。電気 化学発光がまた第１試薬混合物についてと同じ間隔で測定されて各々の間隔につ いての値を得る。 反応パートナーを含有していない以外は第１試薬混合物と同じである第３の試 薬混合物が形成される。第１試薬混合物が使用したと同じ電位、時間間隔および 持続時間で一連の電気パルスを第３試薬混合物に適用する。第１試薬混合物につ いてと同じ間隔で電気化学発光が測定されて各々の間隔についての値を得る。 第３試薬混合物についての第１間隔について得られた値が第１試薬混合物につ いての第１間隔について得られた値から差し引かれて第１の差を得る。第３試薬 混合物についての第１間隔について得られた値がまた第２試薬混合物についての 第１間隔について得られた値から差し引かれて第２の差を得る。第１の差は第２ の差で割られて第１間隔についての正規化された値を得る。次に各々続く間隔に ついて同じ方法で正規化値が計算されて、時間コース（濃度対時間）をグラフ的 に例示するためにプロットされることが出来る一連の正規化値を得る。当業者に 明らかであるような他の数学的操作を該データについて行なうことが出来る。例 えば任意な点での反応速度を決定するために正規化値曲線上の該任意な点での第 １導関数（derivative）を得ることが出来る。 本発明のシステムは反応体、発光団および反応パートナーを含有する第１試薬 混合物を含む。反応体は反応パートナーと反応し、そして発光団は反応パートナ ーあるいは反応パートナーの反応生成物と関与して、試薬混合物が電気エネルギ ーにさらされた際に電気化学発光を発生する。本システムは、試薬を反応させそ して反応した試薬を含む以外は、第１試薬混合物と同じである第２試薬混合物を さらに含む。反応パートナーを含有しない以外は第１試薬混合物と同じである第 ３の試薬混合物がまた本システムに用意される。最後に、本システムは予かじめ 選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた時間間隔および持続期間で一連の電気パ ルスに第１、第２および第３試薬混合物の各々を別々にさらすための手段および 同じ間隔で電気化学発光を測定するための手段を設けている。 本発明の方法は電気化学的セルのような、電極を設けた装置中で行なわれる。 本発明に従って監視される生体分子反応はＥＣＬ強度に、反応体、反応パートナ ーまたは反応パートナーの反応生成物の濃度を関係させる、反応条件下の発光団 を用いて、装置中で行なわれそして反応パートナーは反応体と反応しそして発光 団と関与してＥＣＬの発生を生じさせる試薬である（あるいはその反応生成物が 発光団と関与してＥＣＬの発生を生じさせる）。 生体分子反応のＥＣＬ強度は電極に適用された入力電位の手段により変調され る。入力電位は、周囲の温度で約２００ナノメータ（“ｎｍ”）〜９００ｎｍの 波長で発光する発光団の励起状態を生じさせることにより測定出来るＥＣＬ出力 を発生するように発光団を誘発する。入力電位は時間とともに増大され（例えば ＲＡＭＰ法）、そしてＥＣＬ出力は電圧変化への応答として検出される。ＥＣＬ ピークは入力電位により駆動される電気化学反応の電位（ピーク電位）で起こる 。 ＥＣＬを生じさせる他の方法はピーク電位でまたはピーク電位より高い、入力 電圧を段階化することによる。次にＥＣＬは鮮鋭なピークとして観察され、これ は時間とともに減衰する。 本発明の方法に従えば、またピーク電位よりやや高い電圧で一連の短かいパル スが電極に適用される。その結果は各々の電圧パルスに相当する一連のＥＣＬピ ークである。この方法で、一定の時間間隔でＥＣＬシグナルの“サンプル取り出 し”が得られそして時間とともにの反応の進行が続いて起こる。この変調された ＥＣＬシグナルの強度は各々の時間間隔で測定されそして次に反応の時間コース を得るために測定が復調される。 ＥＣＬ反応は狭い電圧パルスを用いることによる本発明の方法によりゆっくり と低下しそして生体分子反応に起因する減衰速度がＥＣＬ反応に起因する減衰速 度と比較される。（酵素反応を行なわないＥＣＬ反応において、高い値での１つ の長いパルスは時間にわたって減衰するＥＣＬ強度を提供する。パルス間の時間 間隔において、新しい物質は電極に拡散しそして次の電圧パルスが来るときの反 応に取りかかるようにし、それ故に、各々のＥＣＬピークはまえのピークよりほ んのわずか低い。 当業者に明らかであるように、各々の特定の生体分子反応についての速度測定 のための良好な条件を提供するために、パルス電位および持続時間、休止電位（ 即ちパルス間の間隔中での電位）および各パルス間の時間ならびに反応体の濃度 のような幾かのパラメータはコントロールされることが出来る。 予かじめ選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた一定の時間間隔および一定の 持続時間で一連の電気パルスが適用されてＥＣＬ出力を変調したときに、得られ た発光の強度は同じ間隔で測定されて進行反応と称せられる値（Ｐ）の時限シリ ーズを提供する。同じ実験が繰り返えされるが、ただし、反応を完了まで進行さ せ、その後に同じ条件下でパルスを送りそして発光を測定することによりＥＣＬ 強度が測定されて反応完了と称せられる値（Ｃ）の時限シリーズを提供する点で 異なる。第３回目に、反応パートナーの不存在下同じ実験が繰り返えされそして ＥＣＬ強度が同じ間隔で測定されてブランクと称せられる値（Ｂ）の時限シリー ズを提供する。 反応の時間コース、濃度対時間は強度測定を復調（demodulating）することに より決定される。これは進行反応（Ｐ）からブランク（Ｂ）を差し引き、そして 反応完了（Ｃ）からブランク（Ｂ）を引いての差により割ることにより行なわれ る。したがって、酵素反応（Ｐ）は次の式により正規化（Ｎ）される。 時間コースは時間にわたっての濃度を決定するために既知の標準と比較されそ して時間の任意の点での反応速度は濃度対時間曲線上でのその点での第１導関数 （derivative）（接線勾配）を得ることにより決定されることが出来る。 酵素反応に適用されるときの本発明の方法は酸化還元酵素（オキシド−レダク ターゼ）反応の速度を測定するのに一般に適している。酸化還元酵素は酸化還元 反応に触媒作用しそして次に作用するように６つのカテゴリーに分類される： (1)＞ＣＨ−ＯＨ；(2)＞Ｃ＝Ｏ；(3)＞Ｃ＝ＣＨ−；(4)＞ＣＨ−ＮＨ₂； (5)＞ＣＨ−ＮＨ−；及び(6)ＮＡＤＨ；ＮＡＤＰＨ． 本発明の方法に特に適している酸化還元酵素のカテゴリーは脱水素酵素（デヒ ドロゲナーゼ）である。一つのグループとして脱水素酵素はそれらの活性のため に補助因子（コファクター）を必要とする。補助因子は非たんぱく質成分であり そしてそれは金属イオンまたは補酵素と称せられる有機分子であってよい。脱水 素酵素（ならびに酸化酵素（オキシダーゼ）および他の酵素）のための適当な補 助因子は文献類に記載されておりそして当業界に周知である。脱水素酵素のため の代表的な補酵素は、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸（ＮＡＤＰＨ）である。 一般に一例としてＮＡＤＨを用いる、脱水素酵素により触媒作用される反応は 次のとおりに記載されることが出来る： 還元基質＋ＮＡＤ⁺＝酸化基質＋ＮＡＤＨ そしてその反応はどちらの方向にも進行することが出来る。基質は、触媒がそれ に触媒作用を発揮する分子である。還元基質の例はイソくえん酸イオン、エタノ ール、乳酸イオン、りんご酸イオンおよびグルコース−６−りん酸イオンを包含 する。 本発明の酵素速度測定方法に依れば、ＥＣＬ活性である（即ち反応パートナー ）そして酵素反応の反応体と共反応する物質（補助因子）が使用される。別法と してＥＣＬ活性物質は反応パートナーの反応生成物であることが出来る。上記し たように、補助因子はＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ、そして脱水素酵素とともに使 用するのに適しているそれぞれのその酸化形態、ＮＡＤ⁺およびＮＡＤ⁺、そして 酸化酵素とともに使用するのに特に適している過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を包含する 。 酵素反応はＥＣＬ活性物質を生成するかまたは消費しなければならない。方法 が生ずるときに、物質の濃度がＥＣＬ強度に関係する物質がＥＣＬのために使用 される。例えば次の反応で生成されたＮＡＤＨはグルコース−６−りん酸脱水素 酵素についての酵素反応速度を測定するために使用される： （１）グルコース−６−りん酸イオン＋ＮＡＤ⁺＝ ６−ホスホグルコン酸イオン＋ＮＡＤＨ （２）ＮＡＤＨ＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＝ＥＣＬ （但し、上記において反応（１）はグルコース−６−りん酸脱水素酵素およびＲ ｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の存在下に行なわれる）。電気パルスが適用されたとき、ＮＡ ＤＨが生成されるにつれて、それは反応（２）に従ってＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺と反 応してＥＣＬを生成する。ＥＣＬの強度はＮＡＤＨの生成の増大した速度ととも に増大しそしてＮＡＤＨの生成の減少した速度とともに減少する。 別法として次の反応において消費されるＮＡＤＨ反応は乳酸脱水素酵素（ＬＤ Ｈ）についての酵素反応速度を測定するために用いられる： （３）ピルビン酸イオン＋ＮＡＤＨ＝ＮＡＤ⁺＋乳酸イオン、 （４）ＮＡＤＨ＋Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺＝ＥＣＬ （但し、上記において反応（３）はＬＤＨおよびＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の存在下に 行なわれる）。電気パルスが適用されるとき、ＮＡＤＨが消費されるにつれてそ れは反応（４）に従ってＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺との反応が低下してＥＣＬを生ずる 。ＥＣＬの強度はＮＡＤＨの消費の増大した速度とともに減少しそしてＮＡＤＨ の消費の減少した速度とともに増大する。 ＮＡＤＨは、それが多くの酵素反応に関与するので、本発明の酵素速度測定方 法に従って使用するために特に適している共反応体である。基質は酵素によって 生成物に変換されそして本方法において、ＮＡＤＨはＮＡＤ⁺に変換されるかあ るいは反応に依存してその逆が起こる。ＮＡＤＨが生成される（または消費され る）につれてそれは発光団と関与してＥＣＬを生成する。光の強度は各々の時点 でＮＡＤＨの濃度に比例する。ＮＡＤＨ濃度における変化は反応を触媒作用する 酵素の活性に関連する。背景の逐一の引き算そしてＮＡＤＨの初期（または最終 ）濃度を用いての発光団のシグナルの正規化の後に、シグナルが時間に対してプ ロットされて時間コースを得る。 究極的に電気化学発光を生ずるＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺と共反応体としてのＮＡＤ Ｈとの間の反応メカニズムは次のとおりに（１）に従って電極でのＲｕ（ｂｐｙ ）₃ ²⁺を酸化する第１工程を包含する： ＮＡＤＨは以下のとおりの（２）に従って電極で酸化され、次にプロトンを損失 して強い還元剤、ＮＡＤラジカルを生成する： 次にＮＡＤラジカルは均質反応（３）においてＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺と反応する。 エネルギー伝達は次のとおりに励起状態にそのルテニウム錯体を上昇させるのに 十分である： 基底状態に減衰の際、標識分子は以下のとおりの反応（４）に従って６２０ｎｍ の検出出来る光を発生する 本発明の酵素速度測定方法はサンプルチューブ中ですべての試薬を混合するこ とにより行なわれそして酵素は最後に加えられる。酵素の添加の際、 の電気パルスが一定の時間間隔および一定の持続時間で適用される。 wave）または正弦波がまた使用されることが出来る）。発光団からの得られた発 光が測定されそして酵素反応が進行するにつれて形成された生成物の量を示す。 結合反応に適用するときの本発明の方法は下に挙げられた反応のような反応を 監視するために用いられることが出来る： ＣＥＡ対抗ＣＥＡのような抗体−抗原； ホルモン受容体へのホルモン結合のような配位子−受容体； アビジン−ビオチン； ＤＮＡ雑種形成反応を用いてのような塩基の対合； レシチン−炭水化物； 酵素−酵素阻害物質。 結合反応速度の測定において、結合事象の前に２種類の試薬が造られる。抗体 −抗原反応が包含されるとき、例えば結合速度が測定されるべき抗体（抗体は反 応体である）に発光団が結合されそして抗原（反応パートナー）が磁気ビーズに 配しそして分析を行なうために用いられることが出来る。サンプルはアナライザ ーの電気化学流体セルに入れられそして抗原が被覆された磁気ビーズは下に磁気 を直接に置くことにより流体流から作用電極上に均一に付着される。アナライザ ーの電気化学流体セル中に標識化抗体を連続的に引き入れることにより結合事象 が開始され且つ進行される。結合事象が進行するにつれてＥＣＬ活性標識が磁気 ビーズに結合する。一連の電気パルスは上記のように適用される。ＥＣＬにおけ る上昇は結合が進行するにつれて起こりそして反応進行を示す。次にＥＣＬ強度 は反応の時間コースを得るために復調（demodulate）される。 本発明に従って使用されることが出来る発光団は２つのクラス、即ち有機化合 物および無機化合物に入る。有機化合物はルブレン(rubrene)、９，１０−ジフ ェニルアントラセン、フタロシアニンおよびフェナントレンのような蛍光または 燐光ポリ芳香族炭化水素を包含する。無機化合物はルテニウムトリス−ビピリジ ン、オスミウムトリス−ビピリジン、白金ジホスフェート、ＭＯ₆Ｃｌ₁₂ ^2-のよ うな蛍光または燐光遷移金属キレート類；有機金属化合物；テルビウムテノイル トリフルオロアセトネートのような希土類キレート類；ユウロピウムジベンゾイ ルメチド；および珪素フタロシヤニンのような主族キレートを包含する。特に有 用な発光団はＲｕ−含有化合物およびＯｓ−含有化合物である。 米国特許第５，３１０，６８７号に開示されている発光団は本発明に従う発光 団として使用されることが出来そして開示されている発光団の中で、Ｒｕ（２， ２′−ビピリジン）₃ ²⁺のようなルテニウム錯体が好ましい。 本発明が関係する特定の標識は電気化学発光性である。それらは、しばしば化 合物を電磁放射線に露光することによるまたは代表的なオキサレート−Ｈ₂Ｏ₂シ ステムにより生じた化学エネルギー源のような化学エネルギー源に化合物をさ らすことによる、それらの酸化または還元なしに発光状態に励起されることが出 来る。また、これらの化合物の発光はそれらの酸化および還元を引き起こす電気 化学的方法により誘発されることが出来る。本発明の方法は電気パルスを用いて これらの標識を励起することと関係がある。 光ルミネセント手段、化学発光手段および電気化学発光手段を用いてＲｕ（２ ，２′−ビピリジン）₃ ²⁺を検出するための方法について広範な研究が報告され 来た：J.Am.Chem.Soc.103(1981) 第５１２頁〜第５１６頁におけるRubensteinお よびBardによる“Electrogenerated Chemiluminescence．37．Aqueous Ecl Syst ems based on Ru(2,2'−bipyridine)₂ ²⁺and Oxalate or Organic Acids”および WhiteおよびBardによる“Elactrogenerated Chemilluminescence．41．Electrog enerated Chemilluminescence and Chlemilluminescence of the Ru(bpy)₃ ²⁺− Ｓ₂Ｏ₈ ²−System in Acetonitrile−Water Solutions”104(1982)第６８９１頁 。この研究は、明るいオレンジの化学発光が、修酸イオンまたは他の有機酸の酸 化における中間体として生成された強い還元剤との、化学的に生成されたまたは 電気生成されたＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺の水性反応に基づくことが出来ることを示し ている。発光はまた、ペルオキシジサルフェートの還元中生成された強い酸化剤 との、電気生成されたまたは化学的に生成されたＲｕ（ｂｐｙ）₃ ¹⁺の反応によ り、有機溶媒Ｈ₂Ｏ溶液中で達成されることが出来る。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺から電 気化学発光の生成のための第３のメカニズムはＲｕ（ｂｐｙ）₃ ¹⁺を生成するの に十分に負である電位とＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺を生成するのに十分に正である電位 との間の電極電位の振動を包含する。これらの３つの方法はそれぞれ“酸化的還 元(oxidative-reduction)”、“還元的酸化（reductive-oxidation”および“Ｒ ｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/+再生システム”と称さされる。 酸化的還元(oxidative-reduction)法は水中で行なわれることが出来そして酸 素または不純物の存在に比較的に敏感でない、強い、効率のよい安定な発光を生 成する。修酸イオンまたはピルビン酸イオン、りんご酸イオン、酒石酸イオンお よびくえん酸イオンのような他の有機酸、およびＲｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺種を酸化的 に生成する手段の存在に、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺からのこの発光は依存している。 この酸化はＰｂＯ₂またはＣｅ（ＩＶ）塩のような強い酸化剤により化学的に行 われることが出来る。それは連続的にかまたは断続的に適用された十分に正の電 位により電気化学的に行なわれることが出来る。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ³⁺の電気化学 的酸化のために適当な電極は例えばＰｔ、ピュロリチック(purolytic)グラファ イトおよびガラス質炭素である。 還元性酸化方法は、例えばアセトニトリルのような有機共溶媒を含有する部分 的に水性の溶液中で行なわれることが出来る。この発光はペルオキシジサルフェ ートおよび励起された種を還元的に生成する手段の存在に依存する。還元は連続 的にかまたは断続的に適用された十分に負の電位により電気化学的に行なわれる ことが出来る。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の電気化学的な還元のために適当な電極は例 えばみがかれたガラス質−炭素電極である。 Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/+再生システムはＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺を還元するのに十分に 負の電位とＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺を酸化するのに十分に正の電位との間の電極電位 を脈動することにより、アセトニトリルのような有機溶媒においてまたは部分的 に水性の系において行なわれることが出来る。そのような再生システムのために 適当な電極は、例えばＰｔ電極である。このシステムは化学試薬を消費せずそし て原則として、無限の期間進行することが出来る。 発光Ｒｕ−含有化合物を生成するこれらの３つの方法はＲｕ−含有化合物の反 復性酸化−還元または還元−酸化を、共通して有している。それ故にこれらの化 合物を含有する溶液の発光は適用されたエネルギー源の電位に非常に依存してお りそしてそれ故にＲｕ−含有化合物の存在の大きな特徴である。 本発明に従えば、式 [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L⁴)q(L⁵)r(L⁶)s]t(D)u （式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり；ＰはＭの多座配位子であり； Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵およびＬ⁶はＭの配位子であり、それらの各々はお互い に同じであってもまたは異なっていてもよく；Ｄは１つまたはそれ以上のアミド 結合またはアミン結合を介してＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵またはＬ⁶の１つま たはそれ以上に共有的に結合された物質であり；ｍは１に等しいかまたは１より 大きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまた は整数であり；ｔは１に等しいかまたは１より大きい整数であり；ｕは１に等し いかまたは１より大きい整数でありそしてＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵、Ｌ⁶お よびＤは下記化学部分が誘発されて電磁放射線を発生することが出来そしてＭの 配位子により提供されるＭへの結合の合計数がＭの配位数に等しいような組成お よび数のものである）を有する化学部分が使用されることが出来る。 本発明はまた、化学物質、生化学物質および生物学的物質のアミノ基に発光ル テニウム−またはオスミウム−含有標識を付着させるための中間体として特に適 している化合物を使用する。したがってこれらの中間体は本発明に従がって使用 される化学部分を生成するために特に適している。中間体はルテニウムまたはオ スミウムビス（２，２′−ビピリジン）（２，２′−ビピリジン−４，４′−ジ カルボン酸）のモノ−およびジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび それらの塩；およびルテニウムまたはオスミウムビス（２，２′−ビピリジン） （４，４′−ジ（クロロメチル）−２，２′−ビピリジン）である。これらの化 合物は当業界に公知の手段により合成されることが出来る。 本発明はまた、本発明の方法に従って、ａ）化学部分を含有する、適当な条件 下試薬混合物を形成しそしてｂ）変調された電気エネルギーを適用することによ り該化学部分を誘発してＥＣＬを繰り返して発生させそして次にＥＣＬを復調さ せることを包含する、関係分析物 （Ａ）_k（Ｄ）_u （式中、Ａは電気化学エネルギー源に直接さらすことにより誘発されて繰り返し てＥＣＬを発生することが出来る化合物であり；ＤはＡに結合される、ヌクレオ チド、ポリヌクレオチド、血清由来の抗体またはモノクローナル抗体（および本 明細書においてあとで記載されるような他の物質）のような物質であり；ｋは１ に等しいかまたは１より大きい整数でありそしてｕは１に等しいかまたは１より 大きい整数）を含む、速度決定のための結合方法において、ルテニウム−含有ま たはオスミウム−含有化学部分を使用を使用することが出来る。 本発明の１つの態様においてＭはルテニウムである。本発明の他の態様におい てＭはオスミウムである。 化学部分はＭの少なくとも１つの多座配位子を有しなければならない。もしそ の部分が１つより大きい多座配位子を有するならば、多座配位子は同じであって もまたは異なっていてもよい。多座配位子は芳香族配位子および脂肪族配位子を 包含する。適当な芳香族多座配位子は芳香族複素還式配位子を包含する。好まし い芳香族複素還式配位子は例えばビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェ ナントロリルおよびポルフィリンのような窒素含有配位子である。 適当な多座配位子は置換されていなくてもよくまたは当業界に既知の多くの置 換基の中のいずれかによって置換されていてもよい。適当な置換基は、例えばア ルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アルアルキル、置換アルアル キル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、 アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミ ジン、グァニジニウム、ウレイド、マレイミド、硫黄含有基、りん含有基および Ｎ−ヒドロシキスクシンイミドのカルボン酸エステルを包含する。 さらに、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵およびＬ⁶の少なくとも１つは多座芳香族複 素還式配位子であってよい。さらにこれらの多座芳香族複素還式配位子の少なく とも１つは窒素を含有してもよい。適当な多座配位子は、ビピリジル、ビピラジ ル、テルピリジル、フェナントロリル、ポルフィリン、置換ビピリジル、置換ビ ピラジル、置換テルピリジル、置換フェナントロリルまたは置換ポルフィリンを 包含するがしかしそれらに限定されない。これらの置換多座配位子はアルキル、 置換アルキル、アリール、置換アリール、アルアルキル、置換アルアルキル、カ ルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、 ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グ ァニジニウム、ウレイド、マレイミド、硫黄含有基、りん含有基またはＮ−ヒド ロキシスクシンイミドのカルボン酸エステルで置換されていてよい。 化学部分は、２つの二座配位子を含有することが出来、その各々はビピリジル ビピラジル、テルピリジル、フェナントロリル、置換ビピリジル、置換ビピラジ ル、置換テルピリジルまたはフェナントロリルである。 別法として化学部分は３つの二座配位子を含有することが出来、その各々はビ ピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロリル、置換ビピリジル、置 換ビピラジル、置換テルピリジルまたは置換フェナントロリルである。化学部分 はルテニウムを含んでもよい。本発明の他の態様において、化学部分はルテニウ ム、２つの二座ビピリジル配位子および１つの置換二座ビピリジル配位子を含む 。なお他の態様において、化学部分はポルフィリンまたは置換ポルフィリンのよ うな四座配位子を含有することが出来る。 化学部分は１つまたはそれ以上の単座配位子を有してもよく、その広い種々の 配位子が当業界に知られている。適当な単座配位子は、例えば一酸化炭素、シア ン化物類、イソシアン化物類、ハロゲン化物類、そして脂肪族、芳香族および複 素還式のホスフィン、アミン、スチビンおよびアルシンを包含する。 化学部分の特に好ましい態様はビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（II ）およびトリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（II）を包含する。 Ｍの１つまたはそれ以上の配位子は例えば放射性同位元素、蛍光化合物あるい は追加の発光ルテニウム−またはオスミウム−含有センターのような追加の化学 標識に結合されることが出来る。 適当な物質（Ｄ）は多くの生物学的物質、例えば全細胞、ウイルス、細胞下位 粒子(subcellular particles)、たんぱく質、リポたんぱく質、糖たんぱく質、 ペプチド、核酸、多糖、リポ多糖、脂質、脂肪酸、細胞代謝物、ホルモン、薬理 学剤、トランキライザー、バルビツル酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミ ン、アミノ酸および蔗糖を包含する。全細胞（whole cell）は動物、植物または バクテリアであってよくそして生存していてもまたは死んでいてもよい。例には 菌のような植物病原体および線虫を包含する。この適用内において、用語“細胞 下位粒子（subcellular particle）”は細胞下位細胞小器管、分断された細胞か らのような膜粒子、細胞壁の断片、リボソーム、多酵素複合体、および生体から 誘導されることが出来る他の粒子を意味する。また、この適用内で、核酸は染色 体ＲＮＡ、プラスミドＲＮＡ、ウイルスＲＮＡおよび多源から由来する組み換え ＩＮＡを意味する。核酸はまた、ＲｉＡｓ、例えばメッセンジャーＲｉＡｓ、リ ボソームＩＲＮＡｓおよび転移ＲＮＡＳを包含する。ポリペプチドは例えば、酵 素、輸送たんぱく質、受容たくぱく質およびウイルス塗布たんぱく質のような構 造たんぱく質を包含する。好ましいポリペプチドは酵素および血清由来抗体であ る。特に好ましいポリペプチドはモノクローナル抗体である。ホルモンは、例え ばインシュリンおよびＴ４甲状腺ホルモンを包含する。薬理学剤は、例えば強心 配糖体を包含する。合成ペプチド、合成核酸、および合成膜、小胞およびリポソ ームのような、生物学的物質に化学的に類似している合成物質を包含することは 、またこの発明の範囲内である。上記のものは、この発明において使用するのに 適当な生物学的物質の総括的リストであることを意図せず、しかし本発明の広い 範囲を例示するためにのみ、意味される。 生物学的および非生物学的物質（Ｄ）は１つまたはそれ以上のアミドまたはア ミン結合を介してＭの配位子に共有的に結合される。アミド結合の場合において 、その結合はアミド結合のカルボニルまたは窒素のいずれかに物質（Ｄ）が直接 結合されるように配向されてもよい。これらの化学部分はイオン化されてよい。 もしイオン化されるならば、多くの異なる対イオンは化学部分の製造の電荷を中 和するのに役に立つことが当業界において理解される。適当な陽イオンは、例え ばＨ⁺、ＮＨ₄ ⁺、グアニジニウム、Ａｇ⁺、Ｌｉ⁺、Ｎ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ²⁺およびＭｎ^{2 +} である。適当な陰イオンは例えばハロゲンイオン、ＯＨ^-、炭酸イオン、ＳＯ₄ ^{2 -} 、ヘキサフルオロリん酸イオンおよびテトラフルオロほう酸イオンを包含する 。 化学部分はまた、化学物質、生化学物質および生物学的物質のアミノ基に、発 光ルテニウム−含有またはオスミウム−含有標識を結合させるための中間体とし て特に適している。したがってこれらの中間体は本発明に従う化学部分を合成す るために特に適している。中間体はルテニウムおよびオスミウム４，４′−（ジ カルボキシ）−２，２′−ビピリジル、ビス（２，２′−ビピリジル）およびそ れらの塩の、モノ−およびジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；および ルテニウムおよびオスミウム４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリ ジル、ビス（２，２′−ビピリジル）およびそれらの塩である。 これらの中間体の化学的構造およびこれらを造る方法は上記米国特許第５，３ １０，６８７号に記載されている。 ルテニウム含有−ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成する好ましい方法 は重炭酸ナトリウムの熱い水性メタノール溶液中でルテニウムジクロロビス（２ ，２′−ビピリジン）を２，２′−ビピリジン−４，４′−ジカルボン酸と まず反応させることである。酸性化の後に、ＮＡＰＦ₆の水性溶液をカルボキシ ル化ルテニウム化合物の溶液に加える。単離されたルテニウム錯体のヘキサフル オロりん酸塩は次に、ジメチルホルムアミド中のジシクロヘキシルカクボジイミ ドの存在下に、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドと反応させることによりエステ ル化される。勿論、中間体の有用性を実質的に変えることなしに、Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミド成分の構造上の多くの変更が可能である。 中間体はイオン化されてよい。もしイオン化されるならば、多くの異なる対イ オンは中間体の製造の電荷を中和しそして塩を形成するのに役に立つことが当業 界において理解される。これらの塩を形成するために適当な陽イオンは、例えば ＮＨ₄ ⁺、グアニジニウム、Ａｇ⁺、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺およびＣ ｄ²⁺を包含する。これらの塩を形成するために適当な陰イオンは、例えばハロゲ ンイオン、炭酸イオン、ＳＯ₄ ^2-、ヘキサフルオロりん酸イオンおよびテトラフ ルオロほう酸イオンを包含する。 カルボン酸エステルを結合しそしてそれによりＮ−ヒドロキシスクシンイミド を置き換えることが出来るかまたはクロロメチル基を結合しそれにより塩素イオ ンを置き換えることが出来る、遊離アミノ基を含有する物質を標識化するために 、該中間体は有用である。 Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺−標識化物質に関しての出願人の経験は化学標識としてル テニウム−含有およびオスミウム−含有化合物を用いる利点を示す。それらは長 期間安定でありそして広い種々の化学的物質、生化学的物質および生物学的物質 に効率よく結合されることが出来る。該標識は安全でありそして比較的に安価で ある。それらは高度に特徴的なシグナルを提供しそしてそれらは本来においては 起こらない。該標識の発光に基づく測定は、感度がよく、速くそして再現可能で ある。りん酸塩緩衝塩水、Ｔｗｅｅｎ（界面活性剤）、肝臓組織抽出液または血 清のような成分により、これらの標識の発光に基づく検出にほとんど妨げがない 。これらの標識の発光に基づく測定はサンプルまたは標識化材料を損傷せずそし て繰り返して行なわれることが出来る。シグナルは標識の各々の分子により生成 され、それによりこれらの標識が検出されることが出来る感度を高める。 試薬混合物を形成するための適当な条件は当業者に知られておりそして包含す る試薬混合物のタイプにより左右されるだろう。例えば、水性試薬混合物のため の適当な条件は、化学部分および酸化剤のような他の試薬の適当な濃度、ｐＨ、 塩濃度等を包含することが出来る。固体サンプルのために、試薬混合物を形成す るための適当な条件は導電性液体の添加を包含することが出来る。 本発明は配位子の化学構造を変えることにより造られることが出来る、オスミ ウム−含有一部分ならびにルテニウム−含有部分および広い種々の発光部分を使 用することが出来る。金属および配位子におけるこれらの変更の各々は発光励起 状態を生成するために必要とされるエネルギー入力の正確な値を変化させること が出来る。同様に、発射電磁放射線の波長はルテニウム−含有またはオスミウム −含有物質の種類および環境により左右される。一般に光ルミネセンス励起およ び発生は約２００ナノメーター〜約９００ナノメーターの波長の電磁放射線で起 こる。化学発光および電気化学発光の発生は一般に約２００ナノメーター〜約９ ００ナノメーターの波長である発射電磁放射線で起こる。化学部分の還元または 酸化が起こる電位はその正確な化学構造ならびに使用される溶液のｐＨおよび電 極の種類のようなファクターにより左右される。一般に光ルミネセントシステム における最適の発生および励起の波長、そして電気化学発光および化学発光シス テムの最適な電位および発生波長を決定する方法は当業界において周知である。 例 フラッシングして廃棄するまえにサンプルについての１つのＥＣＬ結果を検出す るために機器の正規な操作が計画された。本発明者は、各々のチューブが独立し て分析出来るように正規の操作を修正した。即ち、各々のチューブの内容物をセ ルに入れそしてそこに残留させ、一方一連のパルスをサンプルに適用した。各々 のパルスは１つのデーターポイントを提供しその結果一連のデータポイントが各 サンプルについて得られた。 典型的には、酵素反応の場合において、実験されるべき第１サンプル（進行反 応）は、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺分子、および酵素以外の酵素反応のためのすべての 試薬を含有した。チューブをアナライザーの回転台（carousel）上に置きそして アナライザーをスタートさせた。（電極の表面は操作前に清浄化された）。 チューブ中に静止しているサンプル混合物を渦流させた。この点でアナライザ ーをストップさせそして酵素においてピペットで移すために運転者を待機させる ように、アナライザーを計画した。これがいったん行なわれたならば、秒での時 間の瞬時記録でアナライザーの操作を再開させた。ＥＣＬ出力を生成する各々の 電圧パルスを用いてタイムスタンプが提供された。この方法でＥＣＬシグナルの 時間コースが得られた。 第１チューブについてのすべてのデータが集められた後に、第１チューブと同 じ組成を含有した第２サンプルチューブが続いて行なわれた。この場合において の例外は酵素をその時間作用させるままにしそして反応を完了に到達させた。次 にサンプルを同じ電圧計画に付した。第１チューブからの結果はＥＣＬ出力のみ （またはＥＣＬ減衰のみ）であった第２チューブからの結果に正規化された。（ 別法として、第１チューブと同じ濃度でＮＡＤＨおよびＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺を含 有するチューブはこの目的のために検定されることが出来る）。 背景の目的のために、基質以外はすべてを含有した第３のチューブを実験した 。数値正規化のまえに、このチューブからＥＣＬ結果を進行チューブからの結果 および完了チューブからの結果の両方から、逐一差し引いた。 １０ミリ秒（“ｍ秒”）あたり１つのデータポイントの速度で機器からサンプ ルを取り出した。したがって、例えば１００ｍ秒の長さであったパルスはその期 間中１０のサンプル取り出しを生ずる。 下に一層詳細に説明するように、 抗体−抗原速度測定のために同様な実験計画に従った。例１： ＮＡＤＨを生成する酵素反応 グルコース−６−りん酸デヒドロゲナーゼ（“Ｇ−６−ＰＤＨ”）はＮＡＤＨ に還元される共反応体としてＮＡＤ⁺を用いて６−ホスホグルコン酸イオンへの グルコース−６−りん酸イオンの酸化に触媒作用する。その反応は次のとおりで ある： その実験はｐＨ７．５での５０ｍＭりん酸塩緩衝液中で行なわれた。７．０〜 ７．５のｐＨを使用することが出来そしてりん酸塩の代りに炭酸塩緩衝液を使用 することが出来る。その溶液は０．５３ｇ／ｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有 した。緩衝液は、サンプルのための、検定緩衝液およびインキュベーション緩衝 液としての両方に用いられた。発光団の濃度はＩＥ−４ＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺ であったそして発光団についての典型的な濃度は約ＩＥ−６Ｍ〜約１Ｅ−４Ｍで あることが出来る。 ゼロとして記録される時間において、サンプルをチューブからＯＲＩＧＥＮ^TM アナライザーの電気化学セル中に入れた。セル区画中にある間に、電極はＡｇ／ ＡｇＣｌに対してゼロから１８００ミリボルト（“ｍＶ”）までの一連のパルス に付された。パルス持続時間は４６０ミリ秒（“ｍ秒”）であったそして休止電 位は２５０ｍ秒間ゼロであった。典型的なパルス速度は約１００〜約５００ミリ 秒であることが出来る。パルスの数は２０であったそしてその数は約１０〜約４ ０であることが出来る。 ＮＡＤＨを生成しそしてＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺と反応するにつれての時間ととも にＥＣＬ出力を監視することにより反応の速度論に従った。約７分後に、反応は 約５０％の完了に到達した。 反応を完了するまで進行させ、その後にＥＣＬ強度を測定した以外は同じ条件 下実験を繰り返した。 ＮＡＤ⁺を反応混合物に加えなかった以外は同じ条件下に実験を再び繰り返し た。 分光光度計を用いて反応を分析した以外はこの例における第１実験と同じ反応 体を用いて第４の実験を行なった。約７分後に反応は約５０％の完了に到達した 。分光測光的結果を本発明の方法についての正規化曲線と比較しそしてそれらは 十分に相関していた。例２： りん基の抑制作用 りん基の抑制作用を示すためにりん酸塩緩衝液の濃度を変化させた以外は例１ の実験を繰り返した。基質の半分の量を生成物に変換させるのにかかる時間 （“ｔ１／２”）で表わされた結果を次の表に要約する： 緩衝液の濃度が増大するにつれてｔ１／２が増大し、速度論における遅延化を 示す。２つの方法からの結果は十分に一致していた。例３： ＮＡＤＨが消費される酵素反応 乳酸デヒドロゲナーゼ（“ＬＤＷ”）は、消費されて酸化形態ＮＡＤ⁺を形成 する共反応体としてＮＡＤＨを用いての乳酸イオンへのピルビン酸イオンの転換 に次のとおりに触媒作用する： ＮＡＤＨは１０^-4ＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺に関して１０^-2Ｍの濃度で存在しそ して例１において行なったと同じ実験計画がこの例で繰り返えされた。電極を４ ６０ｍ秒間１８００ｍＶで２０回脈動させそして休止電位は２５０ｍ秒間ゼロで あった。合計時間コースは３０００ｍ秒を少し超えた。正規化結果は分光測光分 析と十分に匹敵していた。 この反応が進行するにつれてＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺と反応するＮＡＤＨが少なく りそしてＥＣＬシグナルは徐々に低下する。しかしながらＥＣＬ減衰の性質に起 因してその２つの反応は競合している。各パルスとともにＮＡＤＨ基質が少なく なるので、全体的反応からの減衰は吸光データに比較してより速くなるように思 われる。 測定された正味の作用が酵素反応に起因するようにＥＣＬ減衰の速度が減少さ れるならば、役に立つだろう。その作用に対して、パルス、およびＮＡＤＨおよ びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の濃度のパラメータは一層安定なＥＣＬシグナルを与える ように選ばれた。その結果は３分の期間にわたって非常に定常的なＥＣＬ出力で あった。 血清中のＬＤＨの通常の臨床的範囲は、酵素の活性に基づく計算から酵素の１ 〜２ｎＭに均等である、１００〜２００Ｕ／Ｌである。これらの値は検定された 範囲において正確でありそしてしたがって本試験は臨床上の適用のためのＬＤＨ 測定のために用いられることが出来る。例４： ストレプトアビジン・ビオチニル化ＤＮＡ （Streptavidin-Biotinylated ＤＮＡ） 測定方法は上記のとおりのＮＡＤＨおよび酵素速度論的反応を測定するために 用いられた方法に非常に類似している。ＮＡＤＨ／酵素実験において、反応速度 が非常に速く、したがってサンプルは実験が始まる直前に迅速に吸引されなけれ ばならない。しかしながら抗体−抗原測定については、ずっと長い反応時間が予 想されそして実験はやや異なって設定されなければならない。 ＯＲＩＧＥＮ^TMアナライザーをコントロールするソフトウェアプログラムは、 抗体の連続流が電極表面での抗原標識化ビーズを横切って入れられることが出来 るように修正された。機器は設けられた２つのチューブからの反応を実験するよ うにプログラム化された。抗原−標識化ビーズは第１チューブから引き入れられ そして磁気で電極上に捕獲された。回転板（carousel）を増大させそして（濃度 に関して実質的に過剰であった）抗体標識溶液は電極表面でのビーズを横切って 第２チューブから引き入れられそして結合反応が始まった。 ＮＡＤＨ／酵素速度論的方法と同様に、各々のパルスが生成した後の経過時間 の追跡を保つために時計タイマーを用いて延長した時間間隔にわたって多数のパ ルスが生成するように、これらの実験においてステップ電位電圧波形のパルス変 更を用いることが決定された。 反復パルス波形を用いる場合、幾つかのパラメーターは測定されるべき特定の 反応について最適化されることが出来そしてこれらは本明細書により提供された ガイダンスに基づいて当業者により決定されることが出来る。パラメーターはパ ルスの数、パルス幅、パルス間の遅延時間、ステップ電位電圧および休止電位を 包含する。 測定方法はＮＡＤＨおよび酵素速度論的反応を測定するために用いられる方法 に非常に類似していた。３つの別々の反応を実験しそして各々は上記のとおりに ２つのチューブを使用した。実験のための調整において、本発明者は２８０の磁 気ビーズをストレプトアビジンで被覆し、これらを第１チューブに加えそして次 にビオチニル化ＤＮＡ標識を加えた。ビオチニル化ＤＮＡ標識化キャリブレータ （calibrator）を第２チューブに加えた。 この明細書において定義された用語を用いて、反応は下に記載されたとおりに 行なわれた： 進行反応−いったん測定サイクルが始まったならば、結合が起るにつれて時間 にわたって濃度が変化しそして反応が完了される。 チューブ１：ストレプトアビジン被覆ビーズ。 チューブ２：ビオチニル化ＤＮＡ標識化キャリブレータ。 反応完了−反応を完了まで予かじめ進行させ、その結果、強度測定はＥＣＬ減 衰の結果のみであった。 チューブ１：ビオチニル化ＤＮＡ標識と組み合わされ且つ完全に結合させたス トレプトアビジン被覆ビーズ。 チューブ２：ビオチニル化ＤＮＡ標識化キャリブレータ。 背景反応−ビーズが存在せず、したがって生成されたシグナルは標識の結果（ 背景）のみであった。 チューブ１：検定緩衝液（結合のためのビーズ存在せず）。 チューブ２：ビオチニル化ＤＮＡ標識化キャリブレーター。 ３つの反応を実験した後、上に説明したとおりの下記式を用いて正規化反応曲 線が得られた： 次に上に用いられたと同じ濃度でのビーズおよび標識の２０のチューブを用い てチューブごとの時間コースを実験した。それらはピペットで移しそして実験を 直ちに開始させた。したがって結合反応は各々のチューブにおいて起こりそして 完了の時間は、曲線（ＥＣＬ強度対時間）が水平になり始めたときに決定するこ とが出来た。この時間コースに従えば、約６分で反応が完了した。これは３−ス テップ時間コース法により得られた完了時間よりずっと速い完了時間であった。 この点で、ストレプトアビジン−ビオチン反応は３−ステップ法を用いるとき に限られた拡散であったことが予想された。この結論になお支持を与えるために 、３−ステップ時間コース法を用いてハーフライフ研究を行なった。 （３００μｌあたり）２０μｇ、４μｇ、２μｇ、１．３μｇ、１．０μｇお よび０．８μｇの６つの異なる濃度のビーズを用いて３−ステップ時間コース法 を繰り返えした。予期されるようにビーズ濃度が減少するにつれて、反応はずっ と速く完了した。 次に、各々の濃度のハーフライフを得た。標識は実質的に過剰であったので反 応は疑似−一次速度論(pseudo-first order kinetics)に従うように押し進めら れた。一次反応においてハーフライフ（“ｔ１／２”）は濃度から独立しており 次のとおりに定義される： ｔ１／２＝０．６９３／ｋ （但し、ｋは結合定数である）。したがって、反応が一次であるならば、ハーフ ライフは濃度と無関係に一定であるべきである。ビーズ濃度対ハーフタイフのプ ロットにおいて、そのｔ１／２値が０．５分で得られた場合、すべての正規化反 応が１．０の相対値で水平であるはずであると仮定して、ハーフライフは、濃度 が減少するにつれて着実に減少した。結果を下に要約する： ビーズ濃度 ハーフライフ （μｇ） （分） ０．８ ７．５ １．０ ８ １．３ １０ ２ １２ ４ １６ ２０ ３５ このｔ１／２値における着実な減少はストレプトアビジン−ビオチンシステム が電極表面での限定された物質移動であることの提示である。これはチューブ毎 の方法(tube-to-tube metlod)に対して３−ステップ法を用いる場合に反応が完 了までにずっと長くかかった理由を説明している。 ストレプトアビジン−ビオチン反応は限られた拡散であったけれども、ＥＣＬ ３−ステップ時間コース測定方法は結合速度がかなりゆっくりとしておりそして したがって限られた拡散でないシステムについて実施されるべきである。例５： ＣＥＡ抗体−抗原システム これらの実験において使用されたＣＥＡ検定様式は、ビオチニル化ＣＥＡ抗原 に結合されたストレプトアビジン−被覆ビーズが次に標識化ＣＥＡ特異抗体に結 合されることからなっていた。このシステムにおいて測定される反応速度はスト レプトアビジン−ビオチン反応でなく、しかしＣＥＡ抗体−抗原反応である。 １Ｆ３として称されるＣＥＡ抗体が得られそしてこのシステムについてＥＣＬ ３−ステップ時間コース方法が試みられて、同じ１Ｆ３抗体を用いるＢＩＡコア システムについて予かじめ得られた値と比較された。（ＢＩＡコアシステムは表 面プラスモン共鳴(surface plasmon resonance)を使用し、それは Plarmacia Bi osensor ABから市販されている。）。 ３−ステップ方法を用いて実験するために選ばれた１Ｆ３標識の最も高い濃度 は１１ｎＭであって、これはＢＩＡコアについて実験された１０ｎＭ低末端濃度 に濃度において匹敵している。また、５．５ｎＭおよび２．７ｎＭの２つの低い 濃度が実験された。１１ｎＭの１Ｆ３標識溶液から得られた正規化プロフィルは 所望の形を有したがしかしながらそれは非常に雑音的(noisy)であった。これは 記載されたとおりのＥＣＬ法を用いて、ビーズに結合されている標識と（背景シ グナルと考えられる）結合していない遊離標識の両方が電極表面に同時に存在す るからである。標識の高い濃度で、結合相と非結合相との間を識別することが困 難となり、したがってなめらかな正規化反応プロフィルを得ることが出来ない。 ５．５ｎＭおよび２．７ｎＭの濃度の１Ｆ３抗体についての正規化プロフィルは ずっとなめらかであり、これは電極での非結合標識の寄与がシグナルにおけるノ イズの量にいかに影響する可能性があるかを再び裏付けている。電極で存在する 非結合標識の濃度が小さいので結合相シグナルを識別することはずっと容易であ りそしてずっと平滑なプロフィルが得られる。 ＢＩＡコアシステムについて１０ｎＭ〜５００ｎＭの範囲にわたる一連のＩＦ ３標識濃度が実験された。ＥＣＬシステムについての現在の３−ステップ法は１ ０ｎＭよりずっと高い標識濃度を許容しない。 ＢＩＡコア方法に対してのＥＣＬ３−ステップ法の比較を得るために、３つの 正規化濃度曲線について得られたデータについて数学的分析を行なって本実験関 連速度定数Ｋａを誘導した。ＢＩＡコアについて得られたデータについてのＫａ 値は４．０×１０⁵Ｍ−¹秒^-1であった。そのＥＣＬデータについて、９．０×１ ０⁵ （±４．７×１０⁵）Ｍ^-1秒^-1の平均（±ＳＤ）Ｋａ値が得られた。この値 は各々の濃度についての３つのＫａ値の平均である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＶＮ (72)発明者 ヘイズ，ステファニー エイ. アメリカ合衆国 20879 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ロスト ナイフ サー クル 18453，アパートメント ナンバー 103

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）反応体、発光団および反応パートナーを含有する第１試薬混合物を 形成し、該反応体は該反応パートナーと反応しそして該発光体は該反応パートナ ーまたは該反応パートナーの反応生成物と関与して、該試薬混合物を電気エネル ギーにさらした際、電気化学発光を発生し； （ｂ）予かじめ選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた時間の間隔および持続 時間で該第１試薬混合物を一連の電気パルスにさらしそして同じ間隔で電気化学 発光を測定して各々の間隔についての値を得； （ｃ）第１試薬混合物と同じである第２試薬混合物を形成し； （ｄ）反応が完了するまで第２試薬混合物を反応させそして次に、工程（ｂ） におけると同じ電位、時間間隔および持続時間で該混合物を一連の電気パルスに さらしそして工程（ｂ）におけると同じ間隔で電気化学発光を測定して各々の間 隔についての値を得； （ｅ）反応パートナーを含有していない以外は第１試薬混合物と同じである第 ３の試薬混合物を形成し； （ｆ）工程（ｂ）におけると同じ電位、時間間隔および持続時間で該第３の試 薬混合物を一連の電気パルスにさらしそして工程（ｂ）におけると同じ間隔で電 気化学発光を測定して各々の間隔についての値を得； （ｇ）工程（ｂ）における第１間隔について得られた値から工程（ｆ）におけ る第１間隔について得られた値を差し引いて第１の差を得； （ｈ）工程（ｄ）における第１間隔について得られた値から工程（ｆ）におけ る第１間隔について得られた値を差し引いて第２の差を得； （ｉ）第１差を第２差で割って第１間隔についての正規化された値を得； （ｊ）各々続く間隔について工程（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）を繰り返して、 各々続く間隔についての正規化された値を得る、 ことからなる生体分子反応の時間コースを決定する方法。 ２．反応体と発光団とが式 [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L⁴)q(L⁵)r(L⁶)s]t(D)u （式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり；ＰはＭの多座配位子であり； Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵およびＬ⁶はＭの配位子であり、それらの各々はお互い に同じであってもよくまたは異なっていてもよく；Ｄは１つまたはそれ以上のア ミドまたはアミン結合を介してＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵またはＬ⁶の１つま たはそれ以上に共有的に結合された物質であり；ｍは１に等しいかまたは１より 大きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であり ；ｔは１に等しいかまたは１より大きい整数であり；ｕは１に等しいかまたは１ より大きい整数でありそしてＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵、Ｌ⁶およびＤは、下 記化学部分が電磁放射線を発生するように誘発されることが出来そしてＭの配位 子によって提供されるＭへの結合の合計数がＭの配位数に等しいような組成およ び数のものである）を有する化学部分において組み合わされる、請求項１の方法 。 ３．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項１の方法。 ４．遷移金属キレートが有機金属化合物である、請求項３の方法。 ５．発光団がＲｕ−含有化合物およびＯｓ−含有化合物からなる群から選ばれ る、請求項１の方法。 ６．発光団がルテニウムトリス−ビピリジンまたはオスミウムトリス−ビピリ ジンである、請求項１の方法。 ７．生体分子反応が酵素反応であり、試薬混合物は酵素を含有しそして反応体 は該酵素が触媒作用を発揮する基質でありそして反応パートナーは補助因子であ る、請求項１の方法。 ８．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項７の方法。 ９．酵素が酸化還元酵素である、請求項７の方法。 10．酸化還元酵素が脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）ある請求項９の方法。 11．補助因子が金属イオンである、請求項７の方法。 12．補助因子が補酵素である、請求項７の方法。 13．補酵素がその酸化された形にある、請求項１２の方法。 14．生体分子反応が結合反応である、請求項１の方法。 15．結合反応が、抗体−抗原、配位子−受容体、アビジン−ビオチン、塩基の 対合、レシチン−炭水化物および酵素−酵素阻害物質からなる群から選ばれる、 請求項１４の方法。 16．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項１４の方法。 17．反応体と発光団とが式 [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L⁴)q(L⁵)r(L⁶)s]t(D)u （式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり；ＰはＭの多座配位子であり； Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵およびＬ⁶はＭの配位子であり、それらの各々はお互い に同じであってもまたは異なっていてもよく；Ｄは１つまたはそれ以上のアミド またはアミン結合を介してＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵またはＬ⁶の１つまたは それ以上に共有的に結合された物質であり、ｍは１に等しいかまたは１より大き い整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であり；ｔ は１に等しいかまたは１より大きい整数であり；ｕは１に等しいかまたは１より 大きい整数であり；そしてＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵、Ｌ⁶およびＤは下記の 化学部分が電磁放射を発生するように誘発されることが出来そしてＭの配位子に より提供されるＭへの結合の合計数がＭの配位数に等しいような組成および数の ものである）を有する化学部分において組み合わされている、請求項１４の方法 。 18．（ａ）酵素、反応体、発光団および反応パートナーを含有する第１試薬混 合物を形成し、該反応体は該反応パートナーと反応しそして該発光体は該反応パ ートナーまたは該反応パートナーの反応生成物と関与して、該試薬混合物を電気 エネルギーにさらした際電気化学発光を発生し； （ｂ）予かじめ選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた時間間隔および持続時 間で該第１試薬混合物を一連の電気パルスにさらしそして同じ間隔で電気化学発 光を測定して各々の間隔についての値を得； （ｃ）第１試薬混合物と同じである第２試薬混合物を形成し； （ｄ）反応が完了するまで第２試薬混合物を反応させそして次に、工程（ｂ） におけると同じ電位、時間間隔および持続時間で該混合物を一連の電気パルスに さらしそして工程（ｂ）におけると同じ間隔で電気化学発光を測定して各々の間 隔についての値を得； （ｅ）反応パートナーを含有していない以外は第１試薬混合物と同じである第 ３の試薬混合物を形成し； （ｆ）工程（ｂ）におけると同じ電位、時間間隔および持続時間で該第３試薬 混合物を一連の電気パルスにさらしそして工程（ｂ）におけると同じ間隔で電気 化学発光を測定して各々の間隔についての値を得； （ｇ）工程（ｂ）における第１間隔について得られた値から工程（ｆ）におけ る第１間隔について得られた値を差し引いて第１の差を得； （ｈ）工程（ｄ）における第１間隔について得られた値から工程（ｆ）におけ る第１間隔について得られた値を差し引いて第２の差を得； （ｉ）第１差を第２差で割って第１間隔についての正規化された値を得； （ｊ）各々続く間隔について工程（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）を繰り返して、 各々続く間隔についての正規化された値を得る、 ことからなる酵素反応の時間コースを決定する方法。 19．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項１８の方法。 20．酵素が酸化還元酵素である、請求項１８の方法。 21．（ａ）反応体、反応パートナーおよび発光団を含有する第１試薬混合物を 形成し、該反応体は抗体−抗原、配位子−受容体、アビジン−ビオチン、塩基の 対合、レシチン−炭水化物および酵素−酵素阻害物質からなる群から選ばれた反 応における反応パートナーと反応し、そして該発光体は該反応パートナート関与 して、該試薬混合物を電気エネルギーにさらした際、電気化学発光を発生し； （ｂ）予かじめ選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた時間間隔および持続時 間で該第１試薬混合物を一連の電気パルスにさらしそして同じ間隔で電気化学発 光を測定して各々の間隔についての値を得； （ｃ）第１試薬混合物と同じである第２試薬混合物を形成し； （ｄ）反応が完了するまで第２試薬混合物を反応させそして次に、工程（ｂ） におけると同じ電位、時間間隔および持続時間で該混合物を一連の電気パルスに さらしそして工程（ｂ）におけると同じ間隔で電気化学発光を測定して各々の間 隔についての値を得； （ｅ）反応パートナーを含有していない以外は第１試薬混合物と同じである第 ３の試薬混合物を形成し； （ｆ）工程（ｂ）におけると同じ電位、時間間隔および持続時間で該第３の試 薬混合物を一連の電気パルスにさらしそして工程（ｂ）におけると同じ間隔で電 気化学発光を測定して各々の間隔についての値を得； （ｇ）工程（ｂ）における第１間隔について得られた値から工程（ｆ）におけ る第１間隔について得られた値を差し引いて第１の差を得； （ｈ）工程（ｄ）における第１間隔について得られた値から工程（ｆ）におけ る第１間隔について得られた値を差し引いて第２の差を得； （ｉ）第１差を第２差で割って第１間隔についての正規化された値を得； （ｊ）各々続く間隔について工程（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）を繰り返して、 各々続く間隔についての正規化された値を得る、 ことからなる結合反応の時間コースを決定する方法。 22．反応体が発光団に結合されて、式 [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L⁴)q(L⁵)r(L⁶)s]t(D)u （式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり；ＰはＭの多座配位子であり； Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵およびＬ⁶はＭの配位子であり、それらの各々はおたが いに同じであってもまたは異なっていてもよく；Ｄは１つまたはそれ以上のアミ ドまたはアミン結合を介してＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵またはＬ⁶の１つまた はそれ以上に共有的に結合された物質であり；ｍは１に等しいかまたは１より大 きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であり； ｔは１に等しいかまたは１より大きい整数であり；ｕは１に等しいかまたは１よ り大きい整数であり；そしてＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵、Ｌ⁶およびＤは下記 の化学部分が電磁放射線を発生するように誘発されることが出来そしてＭの配位 子によって提供されるＭへの結合の合計数がＭの配位数に等しいような組成およ び数のものである）を有する化学部分を形成する、請求項２ １の方法。 23．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項２１の方法。 24．試薬として反応体、発光団および反応パートナー（該反応体は該反応パー トナーと反応しそして該発光団は該反応パートナーまたは該反応パートナーの反 応生成物と関与して、下記試薬混合物が電気エネルギーにさらされた際電気化学 発光を発生する）を含有する第１試薬混合物；反応された試薬からなる以外は第 １試薬混合物と同じである第２試薬混合物；および反応パートナーを含有しない 以外は第１試薬混合物と同じである第３試薬混合物； 該第１試薬混合物、第２試薬混合物および第３試薬混合物の各々を、予かじめ 選ばれた電位でそして予かじめ選ばれた時間間隔および持続時間で一連の電気パ ルスに別々にさらすための手段；および同じ間隔で電気化学発光を測定するため の手段； を含む生体分子反応の時間コースを決定するためのシステム。 25．反応体と発光体とが式 [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L⁴)q(L⁵)r(L⁶)s]t(D)u （式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり；ＰはＭの多座配位子であり、 Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵およびＬ⁶はＭの配位子であり、それらの各々はおたが いに同じであってもまたは異なっていてもよく；Ｄは１つまたはそれ以上のアミ ドまたはアミン結合を介してＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵またはＬ⁶の１つまた はそれ以上に共有的に結合された物質であり；ｍは１に等しいかまたは１より大 きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であり； ｔは１に等しいかまたは１より大きい整数であり；ｕは１に等しいかまたは１よ り大きい整数であり；そしてＰ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｌ⁵、Ｌ⁶およびＤは、下 記の化学部分が電磁放射線を発するように誘発されることが出来そしてＭの配位 子により提供されるＭへの結合の合計数がＭの配位数に等しいような組成および 数のものである）を有する化学部分を含む、請求項２４のシステム。 26．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項２４のシステム。 27．遷移金属キレートが有機金属化合物である、請求項２６のシステム。 28．発光団がＲｕ−含有化合物およびＯｓ−含有化合物からなる群から選ばれ る、請求項２４のシステム。 29．発光団がルテニウムトリス−ビピリジンまたはルテニウムトリス−ビピリ ジンである、請求項２４のシステム。 30．生体分子反応は酵素反応であり、試薬混合物が酵素を含有してそして反応 体は該酵素が触媒作用を発揮する基質でありそして反応パートナーが補助因子で ある、請求項２４のシステム。 31．発光団が蛍光またはりん光ポリ芳香族炭化水素および蛍光またはりん光遷 移金属キレートからなる群から選ばれる、請求項３０のシステム。 32．酵素が酸化還元酵素である、請求項３１のシステム。 33．酸化還元酵素が脱水素酵素である、請求項３２のシステム。 34．補助因子が金属イオンである、請求項３１のシステム。 35．補助因子が補酵素である、請求項３１のシステム。 36．補酵素がその酸化された形にある、請求項３５のシステム。