JP4377689B2 - 同時尋問及び酵素仲介検出による多型遺伝子座の複合分析 - Google Patents

Description

関連出願
本発明は、２００１年１０月１４日付の米国暫定出願第６０／３２９，４２７号、２００１年１０月１５日付の米国暫定出願第６０／３２９，６２０号、２００１年１０月１４日付の米国暫定出願第６０／３２９，４２８号、及び、２００１年１０月１５日付の米国暫定出願第６０／３２９，６１９号より優先権を主張するものである。これらの出願は、すべて本明細書に明確に引用されている。

発明の分野
本発明は、分子診断および遺伝型による分類あるいはプロファイリングに関する。本発明は高多型遺伝子の複合分析方法、プロセスおよびプローブに関する。また、本発明は、ヒト白血球特異抗原（Human Leukocyte Antigen: ＨＬＡ抗原）遺伝子コンプレックスおよび嚢胞性繊維症コンダクタンス膜内外調節因子遺伝子（Cystic Fibrosis Conductance Trans-membrane Regulator: ＣＦＴＲ）の分子タイピング及びプロファイリング、およびこれらに関する組成、方法、およびデザインに関する。

発明の背景
関心がもたれている遺伝子の核酸シーケンスにおいて多型を効率よく、迅速に、かつ明確に分析する能力は、分子診断試験の発達に重要な役割を果たしており、そのアプリケーションには、遺伝子テスト、キャリアスクリーニング、遺伝子型あるいは遺伝子プロファイリング、及び同一性テストなどがある。例えば、遺伝子テストおよびキャリアスクリーニングの目的は、関心が持たれている遺伝子内に特定の疾病に伴う変異が存在するかどうかを決定することである。多型性遺伝子座の分析、すなわちこれらの変異が疾病を引き起こすことが知られている変異を含むか否かは、一般的に、例えば薬理遺伝学的な遺伝子型のコンテキストにおいて、あるいはＨＬＡ分子型による分類のコンテキストにおいて、臨床上の利点を提供するものであり、移植ドナーと受容候補者のＨＬＡ遺伝子座における対立遺伝子のマッチングの度合いは、同種異型細胞と骨髄移植のコンテキストにおいて決定される。

多型の複合分析は、多数の患者サンプルの分析を容易にすることが望まれている一方で、新規な多型、遺伝マーカ、及び変異が同定され、分析に含めなくてはならなくなるにつれて複雑性のレベルが有意に高くなるという問題が生じる。
分析の複合フォーマットにおいてこの複雑性を取り扱う現行の方法は、アッセイパフォーマンスを信頼のおけるものとする一方、多量のサンプルを処理するという制限があり、多型及び変異の複合分析の新規な方法が必然的に求められており、これが本発明の主題である。例えば、遺伝子座をコード化する嚢胞性繊維症コンダクタンス導電膜内外調節因子遺伝子（ＣＦＴＲ）チャネルと、ヒト白血球特異抗原（ＨＬＡ抗原）が、本発明の方法によって分析される。嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、コーカソイドにおいて最も普通に見られる劣性異常の一つであり、米国では２０００人の正常出産に一人の割合で生じる。人口の約４％が、ＣＦ変異の一つを保有している。ＣＦＴＲ遺伝子は大変変化しやすく、現在まで９００以上の変異が同定されている（http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr参照、本明細書に引用されている）。ＣＦＴＲ遺伝子の特徴付けは、シーケンス特定プローブの発達を容易にすることによってＣＦの分子診断にキーを提供する（Rommens et al., 1989; Riordan, et al., 1989; Kerem et al., 1989, 各々、本明細書に引用されている）。コンセンサス開発会議を発起した国立保険研究所（ＮＩＨ：The National Institutes of Health）は、ＣＦの家族歴が陽性である成人に対してＣＦＴＲ変異のキャリアスクリーニングを推奨している（ＮＩＨ 1997）。アメリカ遺伝医学協会（ＡＣＭＧ：American College of Medical Genetics）のキャリアスクリーニング委員会は、一般大衆のキャリアスクリーニング用に、パン−エスニック変異パネルを推奨している。このパネルは、米国の一般大衆の０．１％以上という対立遺伝子頻度で、２５の疾病を引き起こすＣＦ変異セットを含む。（http://www.faseb.org/genetics/acmg参照。これは、本明細書中に引用されている）。ＡＣＭＧパネルの変異は、アシュケナージユダヤ人およびアフリカ系アメリカ人に最も普通に見られる変異も含む。

ＣＦＴＲ変異を検出するいくつかの方法があり、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Devoto et al., 1991）；一本鎖ＤＮＡ高次構造多型法分析（Plieth et al., 1992）；ＲＦＬＰ（Friedman et al., 1991）；対立遺伝子特定プライマ（ASPs）を用いた増幅（Gremonesi et al., 1992）；及び、対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドを用いたプロービング（ASO）（Saiki et al., 1986）などを含む。広く用いられている方法は、ＰＣＲ増幅を行い、次いで増幅したターゲットストランドを膜の上で吸い取り、正常（幅広型）か、突然変異体のいずれかにマッチするよう設計されたオリゴヌクレオチドを伴うストランドをプローブする方法である。特に、複合ＰＣＲは、このドットブロットフォーマットにおけるＡＳＯハイブリダイゼーションと共に用いられ、１２のＣＦ変異をスクリーンする（Shuber et al., 1993）。いくつかの場合では、基体に固定したオリゴヌクレオチドプローブのアッセイを、「リバースドットブロット」フォーマット中の既知の遺伝子ＤＮＡシーケンスの変異の検出に用いている（Saiki, RK et al., 1989）。ホトリソクラフィックプロセスによってその位置に合成した短いオリゴヌクレオチドのアレイが、ＣＦＴＲ遺伝子のコード化領域における既知の変異を検出するのに用いられている（Cronin, MT., et al., 1996）。反転転写酵素を用いたプライマ伸長法が、ＣＦＴＲ中のΔ５０８変異の検出方法として報告されている（Pastinen, T., 2000）。このアプローチは１９８９年に早くも書かれている（Wu, D.Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 2757-2760(1989), Newton, C. R. et al, Nucleic Acids Res. 17: 2503-2506(1989) ）。以下に更に述べるとおり、開発研究所のセッティングで適当な検出法を提供してはいるものの、これらの方法は相当の労働力を必要とし、ターンアラウンドが遅く、サンプル処理量が少なく、従ってサンプル当たりのコストが高くなる。

スポッティッドマイクロアレイに関して、基体材料や、プローブ固定法と共に様々なスポッティング法が書かれている。しかしながら、現行の方法のスポッティッドアレイは、有意なアレイからアレイの変異性を検出するのみならず、有意なスポットからスポットの変異性も検出してしまい、アッセイの信頼性と感度に限度がある。さらに、スポッティッドアレイは、現在の５００μｍのセンター上の典型的な１００μｍのスポット径以上に小型化することが困難である。従って、トータルのサンプル数が増え、スポットアレイの終了に１８時間もかかり、ハイブリダイゼーション法の能力を制限するアッセイの遅い動きを助長することになる。さらに、スポットアレイの使用には、高度に特化された共焦点レーザスキャンニング装置を介して読み出しを行うことが含まれる。代替のアプローチには、ホトリソグラフィックプロセスによってその位置で合成されるオリゴヌクレオチドアレイがある。しかしながら、アレイ製造が複雑であるためのルーチンのカスタマイゼーションを制限してしまい、相当の費用がかかるとともに診断アプリケーションに対する柔軟性が欠如することになる。

主要組織相容性遺伝子複合体（major histocompatibility complex: ＭＨＣ）は、ＨＬＡ抗原遺伝子複合体を含んでおり、ヒト第６番染色体の短腕に位置する。この領域は、免疫応答における細胞間相互作用を規定する細胞蛋白質をコード化する。様々なＨＬＡクラスＩの遺伝子座が、細胞表面においてβ−２ミクログロブリンに関連する４４，０００のダルトンポリペプチドをコード化し、細胞障害Ｔリンパ球によってターゲット細胞の認識を行う。ＨＬＡクラスII遺伝子座は、ヘルパーリンパ球によってターゲット細胞の確認を行う、２９，０００ダルトンおよび３４，０００ダルトンのポリペプチドからなる細胞表目ヘテロダイマをエンコードする。ＨＬＡ抗原は、外部からの病原性ペプチド（foreign pathogenic peptides）を「セルフ」プロテインのコンテキストにおけるＴ−細胞に与えることによって、免疫反応を開始させる。従って、宿主の免疫反応ポテンシャルを増やすため、広いレパートリにわたるペプチドが望ましい。一方、相当に高次の免疫原生多型は、同種移植片拒絶の主な原因の一つであるＨＬＡ遺伝子座のミスマッチを伴うため、同種移植術が有意に困難なもとなる。ドナーと受容者候補のＨＬＡ遺伝子座における対立遺伝子のマッチングの度合いは、同種細胞移植および骨髄移植の成功の主要ファクタである。

ＨＬＡクラスＩ領域のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子座は、ＨＬＡクラスII領域のＨＬＡ−ＤＲＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子座と同様に、非常に高次の多型を示す。現在までに、ＨＬＡシステムのファクタのＷＨＯ命名委員会は、ＨＬＡ−Ａについて２２５の対立遺伝子（ＨＬＡ Ａ＊０１０１、Ａ＊０２０１，他）、ＨＬＡ−Ｂについて４４４の対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｃについて１１１の対立遺伝子、３５８のＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子、２２のＨＬＡ−ＤＱＡ対立遺伝子、４７のＨＬＡ−ＤＱＢ対立遺伝子、２０のＨＬＡ−ＤＰＢ対立遺伝子、及び９６のＨＬＡ−ＤＰＡ対立遺伝子を認定している。（IMGT/HLA Sequence Database, （http://2223.ebi.ac.uk:80/imgt/hla/index.html）及び、Schreuder, G.M. Th. et al, Tissue Antigens. 54: 409-437(1999)参照）。これらは本明細書に引用されている。

ＨＬＡタイピングは、移植ドナーの免疫原生プロファイルを決定するのに使用されているルーチン手順である。ＨＬＡタイピングの目的は、関心のある遺伝子座内の認定されたの多型セットの分析に基づいて、患者の対立遺伝子構造を必須レベルの分解能で決定することである。ＨＬＡタイピングは、伝統的な血清タイピングを越える選択方法である。なぜなら、生存可能な細胞の必要性を少なくし、より高次の対立遺伝子分解能を提供し、血清学が適当でないクラスIIへＨＬＡタイピングを拡大するためである（Erlich, H.A. et al., Immunity 14: 347-356(2001)）。

現在臨床ＨＬＡタイピングに適用されている一方法では、シーケンス特定オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯあるいはＳＳＯＰ）とポリメラーゼ鎖反応（polymerase chain reaction: ＰＣＲ）を使用している。これは、増幅したターゲットシーケンスにハイブリダイズさせ、ＨＬＡタイピングのベースとしてのパターンを生成する。

すべての入手可能なＨＬＡ対立遺伝子用のシーケンス情報の入手が可能であるため、ハイブリダイゼーションによるシーケンス用と同様に既知のＨＬＡ多型の特徴化用のシーケンス特定オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）と対立遺伝子特定オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の設計ができる（Saiki, R.K. Nature 324: 163-166(1986), Cao, K. et al, Rev Immunogenetics, 1999: 1: 177-208）。

「ドットブロットフォーマット」ともいう、ＳＳＯ分析の一実施例では、ＤＮＡサンプルを患者から抽出して、増幅し、８×１２グリッドフォーマットセットのナイロン膜の上にプロットする。一の放射線同位元素標識オリゴヌクレオチドプローブを各膜の各スポットに加えて、次いでハイブリダイゼーションを行って、スポットをオートラジオグラフィで精査し、陽性（１）か陰性（０）のいずれかを記録する。各患者サンプルについて、すべての膜を分析して得られる1'sと0'sのストリングが、対立遺伝子構造を決定する。「反転ドットブロットフォーマット」のＳＳＯ分析複合フォーマットは、平坦な支持体上に固定したオリゴヌクレオチドプローブセットを使用している。（Saiki, R. et al, Immunological Rev. 167: 193-199 (1989), Erlich, H.A. Eur. J. Immunogenet. 18: 33-55 (1991))。

その他のＨＬＡタイピング方法として、シーケンス特定プライマ（ＳＳＰｓ）のポリメラーゼ触媒伸長を使用して、対立遺伝子間で識別を行うものがある。ＤＮＡポリメラーゼの高い特異性により、一般に、この方法は飛び抜けて特異性なものである。ＳＳＰ法では、ＰＣＲ増幅が、各多型シーケンスモチーフに対する特定プライマ対、または、モチーフと３’-＞５’エキソヌクレーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼとの対を用いて行われるため、その３’末端が完全にテンプレートと相補である（マッチしている）プライマにのみ伸長（従って増幅）が生ずることになる。対応するＰＣＲ生成物の存在は、ゲル電気泳動分析によって確認される。高次多型遺伝子座の一例はＨＬＡクラスIIＤＲ遺伝子の２８０ｎｔＤＮＡフラグメントであり、これは多型発生数が高いという特徴がある。

シーケンス特定プローブ（ＳＳＰ）の使用したＨＬＡタイピングは、ホトタイピングとも呼ばれ（Dupont, B. Tissue Antigen. 46: 353-354 (1995))、クラスＩおよびクラスIIタイピングのルーチン使用における商用技術として発達してきた（Bunce, M. et al, Tissue Antigens. 46: 355-367(1995), Krausa, P and Browning, M. J. Tissue Antigens. 47: 237-244(1996), Bunce, M. .et al, Tissue Antigens. 45: 81-90 (1995))。しかしながら、従来のＳＳＰ法における増幅産物（amplicons）の個々の検出を行う大ゲル多型分析の要件は、高スループットを実現することができる複合アッセイフォーマット手段に有意な障害を与える。本発明によれば、この不利益を克服することができる。

伸長反応のコンテキストにおいて、高次多型遺伝子座及び妨害多型としての非指定多型サイトの影響は、特に複合フォーマットにおいて、前回の出願では考慮されていなかった。したがって指定サイトの検出が可能であり、非指定サイトの存在を受け入れ、かつこのような非指定サイトからの妨害がない多型遺伝子座の複合分析方法、組成およびプロセスを提供する必要がある。

発明の概要
本発明は、非指定多型サイトの存在下において非指定サイトから妨害を受けない複合指定多型の同時尋問方法およびプロセスを提供するものである。複数セットのプローブを提供して、同時尋問を容易にする。本発明はまた、ＨＬＡ遺伝子コンプレックスおよびＣＦＴＲ遺伝子の同定方法、プロセスおよびプローブを提供するものである。

プローブ延長（extension）あるいは伸長（elongation）を利用した検出方法の特性は、特に複合フォーマットにおいては、ハイブリダイゼーションを利用した方法の特性より本質的に優れている。なぜなら、シーケンス形状の識別は、もはや比較ハイブリダイゼーション（differential hybridization）ではなく酵素認識の忠実度に依存しているためである。今日、酵素による分析のアプリケーションの圧倒的多数は、単一の塩基プローブ伸長を使用している。しかしながら、ＨＬＡタイピングのＳＳＰ法で使用されているものと類似するプローブ伸長は、ここに開示されている通り、多型の複合分析に様々な利点を提供する。したがって、単一ヌクレオチド多型は、多ヌクレオチド多型と同様に、容易に適用される。ここで述べる方法は、一般にシングルラベル検出を用いて実行され、多型遺伝子座の同時かつ連続的尋問を適用し、また、ブローブの設計が複雑になる。

本発明の特徴のひとつは、一又はそれ以上のターゲットヌクレオチドシーケンス内に位置する指定多型サイトにおけるヌクレオチド組成を同時に決定する方法を提供することである。この方法は、以下のステップを具える：（ａ）一またはそれ以上のプローブセットを提供し、各プローブが指定多型サイトの近位の範囲内に位置する一又はそれ以上のターゲットヌクレオチドシーケンスのサブシーケンスにアニーリング可能であり、（ｂ）前記プローブセットを一又はそれ以上のターゲットヌクレオチドシーケンスに接触させて、プローブシーケンス内の尋問サイトを指定多型サイトと直接にアラインメントするところに位置させることによってハイブリダイゼーション複合体の構築を可能とし、（ｃ）各ハイブリダイゼーション複合体に対して、尋問サイトと指定多型サイトとの間のマッチあるいはミスマッチの存在を決定し；及び（ｄ）指定多型サイトの組成を決定する。

本発明の他の特徴は、生物サンプル中の関心のある核酸シーケンスの分析中に生成されるアッセイ信号のシーケンス特定増幅方法を提供することである。この方法は以下のステップを具える：（ａ）関心のあるシーケンスを有するハイブリダイゼーション複合体を形成可能な固定プローブセットを提供し；（ｂ）関心のあるシーケンスを前記固定プローブの少なくとも一つにアニールしてハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、関心のあるシーケンスを含む生物サンプルに当該固定プローブセットを接触させ；（ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体をポリメラーゼに接触させてプローブの伸長あるいは延長を前記ハイブリダイゼーション複合体内に含めるようにし；（ｄ）当該プローブの伸長あるいは延長を光学的信号に変換し；及び（ｅ）当該光学的信号を固定プローブのセットからリアルタイムで読み取る。

本発明の更なる特徴は、一又はそれ以上のターゲット核酸シーケンス内に位置する指定多型サイトの同時尋問用カバリングプローブセットを形成する方法を提供することである。この方法は、以下のステップを具える：（ａ）プローブの尋問サイトの指定多型サイトとのアラインメントを可能とする伸長プローブのシーケンスを決定し；（ｂ）更に、この指定された多型サイトを伴うプローブの尋問サイトのシーケンスを保持しながら、非選択指定多型サイトと同様に非指定多型サイトを適用する変形プローブの完全なセットを決定し；および（ｃ）許容誤差の範囲にあるすべての多型を除去することによって変性度を減少させる。

本発明の特徴の一つは、ターゲットポリヌクレオチドシーケンス内の一又はそれ以上の指定サイトにおける多型を同定する方法を提供することである。この方法は、以下のステップを具える：（ａ）前記指定されたサイトを尋問できる一またはそれ以上のプローブを提供し；（ｂ）このような指定サイトの各々に値を割り振り、かつ、各多型の近位の範囲内に位置する非指定多型サイト受け入れる。

本発明の他の特徴は、ターゲットポリヌクレオチドシーケンス内の一またはそれ以上の指定サイトにおける多型を決定する方法を提供することである。この方法は、指定サイト用のプローブセットを提供するステップと、このプローブセットを、各プローブの端部での伸長開始に応じて別々のプローブサブセットにグループ分けするステップを具える。

本発明の他の特徴は、複合多型サイトの同時尋問方法を提供することであり、この方法は、一またはそれ以上の温度サイクルを適用して複合伸長アッセイを実行してターゲットのリニア増幅を行うステップを具える。

本発明の更なる特徴は、複合多型サイトの同時尋問方法を提供することである。この方法は、温度管理下で、アニーリングステップと伸長ステップとを組み合わせて複合伸長アッセイを実行するステップを具える。

本発明の他の特徴は、Ｓ個の多型サイト、すなわち一またはそれ以上の近接するターゲットシーケンス内に位置するＰｓ：＝｛ｃ_ｐ（ｓ）；１＜ｓ＜Ｓ｝におけるヌクレオチド組成の同時尋問方法を提供することであり、この方法は以下のステップを実行することにより、各Ｃｐに可能な価の一の限定セットを割り振る：（ａ）伸長プローブとして既知の指定固定オリゴヌクレオチドプローブセットを提供し、各プローブが指定多型サイトの近位にあるターゲットのサブシーケンスへの好ましいアラインメント内でアニーリング可能であり、この好ましいアラインメントが指定多型サイトに直接近位にあるプローブシーケンス内に尋問サイトを位置させ、このプローブは更に、伸長あるいは延長反応を開始させる末端伸長開始（ＴＥＩ）領域を含む；（ｂ）一又はそれ以上のターゲットシーケンスを固定オリゴヌクレオチドプローブセットにアニールして、プローブターゲットハイブリダイゼーション複合体を形成し；（ｃ）各プローブターゲットハイブリダイゼーション複合体について、尋問サイトに対応する指定多型サイト間の組成におけるマッチあるいはミスマッチを判定する。

本発明の他の目的、特徴、利点を、以下に述べる実施例の説明によってより明らかにする。この実施例は、説明的なものでしかない。

発明の詳細な説明
本発明は、高多型遺伝子座の複合分析に関する組成物、方法およびデザインを提供するものである。すなわち、遺伝子座は、高密度の特定（指定）多型サイトであることを特徴とし、非特定多型サイトを妨害するものである。従って、このようなサイトの複合分析は、一般的に、同じターゲット上の隣接するサイトに向けられるプローブのシーケンスに有意なオーバーラップがあり、特定または指定サイトに対するプローブは、一般に隣り合う多型サイトをカバーする。ＣＦＴＲおよびＨＬＡを含む重要な遺伝子の分析における妨害については、従来技術においては研究されていない。本発明の方法を実証するべく、ＨＬＡ遺伝子複合体とＣＦＴＲ遺伝子を分析する。

本発明は、高密度多型サイトを示す核酸シーケンスにおける多型の平行あるいは複合分析（ＭＡＰ）に用いる組成物および方法を提供するものである。所定の核酸シーケンスにおいて、各多型サイトは一あるいはそれ以上のヌクレオチドを有しており、各々に差異がある。

本発明は、核酸シーケンス内の指定多型全セットの同時尋問に用いる方法および組成物に関する。本発明は、このようなサイトの各々の組成を決定する組成物、方法およびデザインを提供するものであり、これによって、関心のあるシーケンス構造セットから、所定の特定サンプルにおける実際の構造を選択するために必要な情報を提供する。本発明はまた、このサンプル中に存在しうるシーケンスのセットを狭くするよう働くものである。したがって、ある実施例においては、ヌクレオチドのアイデンティティに対応する可能な値を指定サイトに割り振ることによってシーケンス組成を決定することが有用あるいは必要になる。他の実施例では、コンテキスト変異分析における「ワイドタイプ」あるいは「変異」の割り当てのように、既知の基準シーケンスに対してマッチングあるいは非マッチングであることは、サイト組成を決定するのに十分である。これによって可能となるシーケンス決定能力が、ここでは確証シーケンシングあるいは再シーケンシングと呼ばれている。好ましい実施例においては、本発明はＣＦＴＲ（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator）遺伝子およびＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen）遺伝子複合体の伸長による多型複合分析を（ｅＭＡＰ）提供する。

本発明の方法および組成物は、尋問用に指定された多型サイト以外の多型サイトを含むターゲット領域の多型分析における信頼度と正確さを改善するのに有用である。これらの非指定サイトは、分析における妨害源をあらわしている。特定のアッセイアプリケーションによっては、組成の異なる一またはそれ以上のプローブが、ここに述べるいくつかの実験例において同化されるので、同じ多型サイトに指定されることもある。関心のある遺伝子の多型を十分、迅速、かつ明確に分析を行う組成及び方法を提供することが、本発明の特定の目的である。この分析は、例えば、遺伝子テスト、キャリアスクリーニング、ゲノタイピングまたは遺伝子プロファイリング、同一性テスト、パターン性テストおよび法医学用に設計されたものと同様に、分子診断アッセイにおいて有益である。

ターゲットシーケンスの準備は、公知の方法を用いて行うことができる。限定されない実施例においては、セルあるいはティッシュのサンプルを患者から得るようにしている。次いで、ターゲットシーケンスを含む核酸領域（すなわち、ＨＬＡのエキソン２および３）を、ＰＣＲ（すなわち、非対称ＰＣＲ）などの標準技術を用いて増幅する。

多型サイト検出用プローブは、分析する多型サイトの組成物が、プローブ中で整列したサイトの組成物と相補（「マッチ」）である場合に、ポリメラーゼ触媒伸長反応の開始点として機能する。一般に、本発明のプローブは、関係のないＤＮＡターゲットシーケンスへのアニーリングを防止するために十分に長くなくてはならない。ある実施例では、プローブの長さは約１０〜５０塩基、より好ましくは、１５〜２５塩基、より好ましく１８〜２０塩基である。プローブは公知の方法および組成物を用いてリンカー成分を介して固相支持体上に固定することができる。

ここで、使われているように、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」の用語は、シングルまたはダブルスタンダード形式におけるデオキシリボ核酸の意味である。この用語はまた、合成バックボーンを伴う核酸のような構造もカバーしている。ＤＮＡのバックボーン類似体は、ホスホジエステル、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、メチルホスホネート、ホスホラミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸、3'-チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、3'-N-カルバミン酸、モルフォリノカルバミン酸、およびペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含む。Oligonucleotides and Analogies, A Practical Approach （F. Eckstein編）、IRL press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 600, Eds.; Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan, J. Med. Chem., vol. 36, pp. 1923-1937; アンチセンスリサーチおよびアプリケーション（1993, CRC Press）、参照。ＰＮＡｓは、N-2(2-アミノエチル）グリシンユニットなどの非イオンバックボーンを含む。ホスホロチオ酸リンケージは、ＷＯ97/03211; WO96/39159;及びMata Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197 (1997)に記載されている。他の合成バックボーンは、メチル−ホスホネートリンケージまたは、代替のメチルホスホネートおよびホスホジエステルリンケージ（Strauss-Soukup, Biochemistry, 36: 8962-8698(1997)、及びベンジルホスホネートリンケージ（Samsta, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 6: 153-156 (1996))を含む用語で囲まれている。核酸の用語は遺伝子、ｃＤＮＡｓ、およびｍＲＮＡｓを含む。

ここで使用されている、「ハイブリダーゼーション」なる用語は、緊縮条件の下で核酸分子を特定のヌクレオチドシーケンスへ優先的に結合する、デュプレックスする、ハイブリダイジングすることを意味する。「緊縮条件」なる用語は、プローブが、対応するターゲットシーケンスに、より少ない延長か、全く他のシーケンスに、優先的にハイブリダイズする条件を意味する。「緊縮ハイブリダイゼーション」は、シーケンスによって異なり、条件が違えば意味も異なる。核酸のハイブリダイゼーションへの拡大は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier, NY (1993) などに見られる。一般的に、高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよびウオッシュ条件は、規定のイオン強度とｐＨで、特定のシーケンスの熱的な融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、ターゲットシーケンスの５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度とｐＨの下）である。非常に緊縮した条件は、特定プローブのＴｍと同じになるように設定した温度でアッセイを実行することによって選択される。高ストリンジェントウオッシュ条件の例は、７２℃で、約１５分間、０．１５Ｍ NaClである。ストリンジェントウオッシュ条件の例は、１５分間、６５℃で、０．２ｘＳＳＣウオッシュである。Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Ed), vol. 1-3 (1989) 参照。

ここに使用されている、「指定サイト」の用語は、所定の核酸上の関心のある多型サイトとして定義される（例えば、同定しようとする多型サイトなどである）。「非指定サイト」の用語は、指定サイトと共在する多型サイトあるいは、所定の核酸上にあるが、関心のないサイトを意味する。

ここに使用されている、「相互に関連する指定サイト」の用語は、相互に関連して発生する多型サイトを意味する。典型的には、このような多型サイトセットの各員は、当該セットが属する対立遺伝子を同定するために同定する必要がある。

ここで使用されている「選択指定サイト」の用語は、本発明のプローブシーケンスの３’末端にオーバーラップする、所定の核酸上の関心のある多型サイトを意味する。「非選択指定サイト」は、本発明のプローブシーケンスの３’末端部にオーバーラップしない関心のある多型サイトを意味する。

ここに使用されている「妨害非指定サイト」の用語は、本発明のプローブシーケンスの３’末端から１〜５塩基以内にある非指定多型サイトを意味する。「非妨害非指定サイト」の用語は、本発明のプローブシーケンスの３’末端から５塩基以上にある非指定サイトを意味する。非妨害非指定サイトは、３’末端部よりプローブシーケンスの５’末端部に近い。

ある実施例では、本発明のプローブは、「末端伸長開始（terminal elongation initiation）」領域（以下、「ＴＥＩ」領域と言う）と、デュプレックス固定（Duplex Anchoring）領域（以下、「ＤＡ」という）を具えている。ＴＥＩ領域は、プローブシーケンスのセクションであり、典型的には、プローブの３つまたは４つの３’末端位置である。ＴＥＩ領域は、指定多型サイトでターゲット核酸シーケンスの一部と整列して、プローブのポリメラーゼ触媒による伸長を開始するように設計されている。ＤＡ領域は、典型的には、プローブシーケンスの残りの位置を具え、また、好ましくは、指定多型の近く（３〜５塩基以内）に位置する領域中のターゲットシーケンスの一部と整列するように設計されている。

ここで使用されている「近位の近い範囲」の用語は、所定の核酸ストランドに沿った１〜５塩基の長さを意味する。「近位の範囲」は、所定の核酸ストランドに沿った１〜１０塩基の長さを意味する。「認容範囲」の用語は、プローブのアニーリングおよび伸長を行うターゲットシーケンスにハイブリダイズしたプローブのＴＥＩ領域におけるミスマッチのトータル数を意味する。通常、ハイブリダイズしたプローブのＴＥＩ領域における２以上のミスマッチは、認容範囲を越えるものである。

「ミクロスフェア」「ミクロ粒子」「ビーズ」「粒子」の用語は、ここでは交換可能に使用されている。ビーズの組成は、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリリックポリマ、パラマグネティック物質、トリアゾル（thoria sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、または、セファローズ（sepharose）、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、およびテフロンなどの架橋デキストランを含むが、これらに限定されるものではない。Bangs Laboratories, Fishers IN.の「ミクロスフェア検出ガイド」を参照。粒子は球形である必要はなく、多孔質でもよい。ビーズのサイズは、ナノメータ（例えば１００ｎｍ）からミリメータ（例えば１ｍｍ）の範囲であり、約０．２ミクロンないし約２００ミクロンのビーズが好ましく、更に、約０．５乃至５ミクロンのものが特に好ましい。

本発明は、ターゲット核酸ストランドに固定シーケンス特定オリゴヌクレオチドプローブセットを第１のアニーリングを行い、及び、このアニールした固定シーケンス特定オリゴヌクレオチドプローブセットのポリメラーゼ触媒伸長によって指定多型サイトの形状をプロ−ビングすることによって、一またはそれ以上のターゲットストランド内における指定多型サイトセットの同時尋問を提供する。伸長プローブは、所定のターゲットにおけるシーケンスにアニーリングすることによって指定サイトを尋問するように設計されており、これによって、ハイブリダイゼーション複合体（「デュプレックス」）を形成する。プローブの３’末端は、ターゲット内の指定サイトにあるいはその近傍に配置されており、この３’末端プローブの組成が尋問サイトにおけるターゲットの組成にマッチ、（すなわち、相補的である）すれば、ポリアミラーゼ触媒プローブ伸長が開始する。ここで述べるとおり、指定サイトが３’末端の近位範囲内になるようにアニールするようプローブを設計することができる。

本発明の一実施例においては、２またはそれ以上のプローブを用いて特定の指定サイトの尋問を提供することができる。このプローブは、指定多型サイトの所定の近位範囲内において、多型の可能性あるいは尋問サイトと非指定多型サイトにおける変異を考慮するように設計されている。このコンテキストにおいて、「多型」なる用語は、核酸シーケンスの変形を意味し、一方で、「変異」なる用語は、表現型（pheno type）に関連する、あるいは関連すると考えられる遺伝子のシーケンスの変形を意味する。好ましい実施例では、このプローブシーケンスの多様性は、近位範囲内のすべての位置における特定ターゲットシーケンスにマッチする少なくとも一つのプローブを含み、伸長を確実なものにする。

ある実施例では、本発明は、Ｌ≧Ｓのオリゴヌクレオチドプライマセットによって長さＮのターゲットシーケンスから選択されたＳ個の多型サイトの平行尋問のための組成物および方法を開示している。

ここに記載されているいくつかの実験例のように、特定のアッセイのアプリケーションの必要に応じて、組成の異なる一またはそれ以上のプローブを、同じ多型サイトに指定するようにしても良い。

各指定プローブは、長さＭのヌクレオチドシーケンスからなり、これは、３’末端に、あるいは末端近傍に尋問サイト（ハイブリダイゼーションにおいて、分析を行っている多型サイトと整列するもの）を含む。３’末端が好ましいが、３’末端から３〜４塩基内のものを使用しても良い。プライマは固相キャリア上に固定されており（架橋シーケンス、あるいは他の架橋部分を介してリンクしていても良い）、そのキャリアとの関連によって同定される。プローブシーケンスは、ブローブとターゲット間のハイブリダイゼーション複合体を形成し、指定多型サイトを伴う尋問サイトのアラインメントを確実なものにするようにターゲットを伴うプライマのアニーリングを行うように、設計されており、好ましい形状は、プローブの３’末端における尋問サイトと指定多型サイトを伴う３’末端のアラインメントを提供している。所定の尋問サイトの組成の指定プローブを伴う指定多型サイトのヌクレオチド組成を尋問するステップは、このサイトを二つの値の一方に割り振る、すなわち、数１で表されるマッチ、あるいは数０で表される非マッチに割り振る。ＨＬＡ分子タイピングでは、結果として得られる長さＬの二値ストリングが、対立遺伝子を同定して所望のタイピング結果を得る。

好ましい実施例において、尋問ステップは、指定プローブの延長を使用する。ポリメラーゼを触媒とするこの反応は、一又はそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを、存在するハイブリダイゼーション複合体におけるターゲットシーケンスのシーケンスを反映する順番でプローブシーケンスに加えることによって、延長ハイブリダイゼーション複合体を生成する。この延長反応を進めるために、長さＭの指定プライマが、長さＭ＊≦Ｍの末端延長開始領域を含んでいなければならない。ここでは、尋問サイトを含む末端延長開始シーケンス（あるいはＴＥＩシーケンス）の意味である。指定尋問サイトの組成が指定多型サイトの組成とマッチすれば、延長が進展する。

成功した延長を検出する従来の方法が記載されており、これは、使用ラベルを付したデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）またはジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰｓ）を含む。本発明はまた、ラベルを付したｄＮＴＰｓまたはｄｄＮＴＰｓの必要性を軽減する成功した延長を検出する光学的サインを提供する新規な方法具え、ラベルを付したｄＮＴＰｓまたはｄｄＮＴＰｓを適用するに際して入手可能なポリメラーゼの効率が減少することから利点が生じる。

しかしながら、本発明に関連する高次多型遺伝子座における多型サイトの密度によっては、指定多型サイト近位でターゲットサブシーケンスにアニーリングする場合に、選択多型サイトに導かれる指定プライマが多型サイト近傍でオーバーラップする。

すなわち、選択多型サイトの一つにおいてそのターゲットの形状を尋問するように設計され、正しいターゲットサブシーケンスにアニーリングするに当たって特性と熱安定性を確実にするのに十分な長さを持って構成された、オリゴヌクレオチドプローブは、他の近接する多型サイトと整列してしまう。これらの妨害多型サイトは、ターゲットシーケンスにおける非選択指定サイトと同様に非指定サイトを含むことがある。

溶液中で行われる複合ＳＳＰ反応において、ほぼ選択多型に導かれた指定プローブ間に部分的に生じるオーバーラップは、同じターゲットに対するプローブ間に相互競合を引き起こすことがある。本発明は、プローブの固定によって生じるこの複雑さを有意に減少させるものである。

一般的に、複合比較ハイブリダイゼーションに見られるように、指定プローブとターゲット間の一又はそれ以上の位置におけるミスマッチは、ハイブリダイゼーション複合体の熱安定性に影響する。反応混合液全体に適用するアニーリング条件セットはいずれも、プローブとターゲット間のアニーリング度を変化させうるし、サブシーケンスプローブの延長反応の出力に影響することがあり、これによって、サブシーケンスの再シーケンスを要求するアッセイ内にアンビギュイティが生じる。

指定プローブの３’末端近傍あるいはその末端における尋問サイトのすぐ近位に位置する非指定多型サイトは、延長反応を開始するに際してプローブのＴＥＩシーケンスの有効性を特に害する。

指定プライマ内の尋問サイトと多型サイト間の組成におけるマッチおよびミスマッチを識別する伸長反応の触媒として働く現在入手可能なポリメラーゼ酵素のパワーは、複合ヌクレオチド多型と単一ヌクレオチドを考慮するとプライマの３’末端からの尋問サイトのずれに依存している。

最も望ましいパワーを生み出す好ましい実施例においては、尋問サイトはプローブの３’末端にある。式Ｐ_{Ｍ（ｓ＊）}：＝｛_{Ｃｐ（ｍ）}；１≦ｍ≦Ｍ｝において選択サイトｓ＊について指定された長さＭのプローブシーケンスは、インデックスｍがプライマの５’から３’の方向に増加し、この形状でプローブシーケンスにおける位置Ｍで指定サイトｓ＊の整列が行われる。複合ヌクレオチド多型の場合、位置Ｍ−１（ジヌクレオチド多型に対して）と、Ｍ−２（トリヌクレオチド多型に対して）、他も関与している。

高次多型遺伝子座の複合分析においてこれらが予測される場合、ポリメラーゼ触媒延長反応の適用による強化された特異性の利点は、ＳＳＯ分析性能を制限する条件に密接に関連する「サブオプティマル（sub-optimal）」なアニーリング条件から複雑性が生じる結果、大きく減少するか、あるいは、なくなってしまう。

所定の指定多型サイトのどれに対しても同じ尋問サイト組成物をシェアしている多重プローブシーケンスのデザインの最適性に関連して、妨害多型の許容性と言う概念を考慮することが有益である。一般性に制限のない単一ヌクレオチド多型の例を考慮すると、３’末端から位置Ｍ−１、Ｍ−２，…Ｍ−ｍ＊へｓ＊離れたアラインメントシフトは、識別力を徐々に減少させる。すなわち、指定多型サイトが内部のプローブ位置ｍ＊に整列すると、延長反応は、もはや、マッチとミスマッチを識別しない。逆に、尋問サイトがプローブの３’末端に位置する好ましい実施例では、延長反応の有効性についてのほとんどの非指定多型の有害な効果は、３’末端からの距離に応じて減少する。すなわち、１およびｍ＊間における位置で整列した非指定多型は、延長反応に影響しない。

プローブ内の長さＭ−ｍ＊＋１の末端シーケンスを、ここでは所定のプライマのＴＥＩシーケンスと呼ぶ。一般的に、１＜ｍ＊＜Ｍであり、ＴＥＩシーケンスは少数の末端プローブ位置を具える。あるケースでは、ｍ＊＝１であり、従ってプローブシーケンスが全プローブシーケンスを囲んでいる。

本発明は、複合プローブの設計における公知のシーケンス変形例を考慮することによって、指定プローブシーケンスの長さ以内の妨害多型サイトの存在を説明するものである。特に、所定のプローブ長Ｍに与えられる代替プローブシーケンス形状の数は、長さＭ−ｍ＊＋１のＴＥＩシーケンスが存在する結果、有意に減少している。すなわち、延長反応の有効識別パワーを確実なものとするために、先行する代替プローブシーケンスをＴＥＩシーケンスの長さに対して制限するのに十分である。好ましい実施例では、すべての可能な代替シーケンスが期待され、従って、これらの代替プローブシーケンスの一つが、位置ｍ＊、Ｍ＊＋１、…Ｍ−１，Ｍのすべてにおいてターゲットとマッチする。

これらのプローブすべてが、コード化された固相キャリアとユニークに関連することによって、別々にコード化されるのであれば、代替シーケンスに伴う指定プローブの多様性によって、各選択多型サイトについての、コード化の複雑性が高くなる。しかしながら、この複雑さは、このプローブセットを共通の固相キャリア上に置くことによって軽減される。すなわち、どの指定プローブでも尋問サイトの組成物のみがエンコードされる。この概念をここでは、ＴＥＩシーケンスプーリングまたはプローブプーリングと呼ぶ。完全なプローブシーケンスプーリングは、コード化の複雑さを、先行するプローブシーケンスがない独特の設計の複雑さにまで軽減する。部分的プーリングも可能である。

好ましい実施例において、プローブ伸長に使用するポリメラーゼは、３’ないし５’エクソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼである。このようなポリメラーゼの例としては、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼ、タークポリメラーゼなどがある。ターゲット核酸シーケンスはＲＮＡであり、リバース転写酵素を使用しても良い。ポリメラーゼに加えて、ヌクレオシドトリホスフェートが、好ましくは４つの塩基すべてが加えられる。例えばｄＮＴＰｓ、またはその類似体を加えることができる。他の実施例では、ｄｄＮＴＰｓを加えることができる。Ｃｙｅ３−ｄＵＴＰなどのラベル化したヌクレオチド類似体も使用可能であり、検出を容易にする。

成功した伸長検出の従来の方法では、ラベル化したデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）またはジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰｓ）を用いている。本発明は、成功した伸長を検出する光学的サインを提供する新規な方法を開示するものであり、従って、ラベルを付したｄＮＴＰｓやｄｄＮＴＰｓの必要性が削減される。このことは、現在入手可能なポリメラーゼが、ラベルを付したｄＮＴＰｓまたはｄｄＮＴＰｓの適用に不十分であるため、利点である。

本発明は高次多型ターゲット領域の正確な多型分析のための方法及び組成を提供するものである。ここで用いられているように、高次多型シーケンスは、シーケンスのプローブと接触する部分中に、指定あるいは尋問多型サイトのみならず、分析において潜在的なエラー源が存在する非指定多型サイトをも含むものである。同様の考え方が、ＰＣＲ反応を複合化するデザイン、組成および方法にも言える。好ましい実施例では、プライミングサブシーケンスとアニーリングサブシーケンスからなるＰＣＲプローブのカバリングセットがコード化したミクロ粒子上に表示されて、プローブ伸長によってビーズ表示された増幅産物（amplicons；アンプリコン）を生成する。ビーズアッセンブリは、プローブのデコードおよび映像化を容易にするために、増幅に先立って、あるいは増幅のサブシーケンスとして平坦な基体上に形成することができる。

一の実施例では、本発明は、ここで「末端伸長開始（Terminal Elongation Initiation(TEI)）」と呼んでいる３’末端「プライミング」サブシーケンスと、ここで「デュプレックスアンカリング（Duplex Anchoring(DA)）」と呼んでいる、アニーリングサブシーケンスと、を含むように設計されたプローブを提供している。ＴＥＩ領域は、典型的には、プローブシーケンスの３’末端位置を３つまたは４つ具える。ＴＥＩ領域は、指定多型サイトにおいてターゲットシーケンスの一部に整列するように設計されており、プローブのポリメラーゼ触媒伸長を開始する。プローブ伸長は、ＴＥＩ領域全体の組成およびターゲットシーケンスの対応する部分において完全なマッチを表示する。プローブシーケンス内の残りの位置を含むＤＡ領域は、好ましくは、指定多型に近接する（３〜５塩基以内）領域においてターゲットシーケンスの一部に整列するように設計されている。デュプレックスアンカリング領域は、特別かつ強いアニーリングを確実に行うように設計されており、多型分析用には設計されていない。ここに述べるように、ＤＡおよびＴＥＩ領域は、プローブ内における次の領域にすぐ近接していてもよく、あるいは分子テザー（molecular tether）によってリンクされていても良い。後者の方法は、ＤＡ領域の配置にフレキシビリティを与え、指定サイトのすぐ近傍に位置する非指定多型を回避する。ＤＡ領域の組成及び長さは、安定したシーケンス特定ハイブリダイゼーション複合体（デュプレックス）の形成を容易にする一方、ターゲットのその領域内に位置する一又はそれ以上の非指定多型の存在を受け入れる（すなわち、考慮する）ように選択される。アニーリングサブシーケンスの長さは、プローブとターゲットの非選択サブシーケンス間のシーケンス相同（homologies）を最小に抑えるように選択される。アニーリングサブシーケンスの長さは、一般的にプライミングサブシーケンスの長さを越え、従って、デュプレックス形成の失敗は、一般に、伸長生成物の生成の失敗を伴う。

伸長反応は、ＴＥＩ領域内に位置する多型を検出するに当たって高い特異性を提供する。ＤＡ領域内の非指定多型については、伸長反応は、所定の条件下で完全マッチのレベルと比較可能なレベルか、それより低いレベルのいずれかで行われる。これは、伸長反応の許容範囲効果と呼ばれている。許容範囲は、ここでの例で述べたように、指定及び非指定多型を分析するプローブのデザインにおいて利用されている。

本発明のある実施例において考慮されている高多型遺伝子座における多型サイト密度は、指定多型サイト近位のターゲットにアニーリングする際に、指定多型サイトに向けられたプローブがターゲットサブシーケンスに近位の多型サイトとオーバーラップする。すなわち、選択指定多型サイトにおけるターゲット形状を尋問するように設計され、正しいターゲットサブシーケンスにアニールする際の特異性及び熱安定性を確実にするのに十分な長さを持って構築されているオリゴヌクレオチドプローブが、近くの多型サイトに整列する。これらの妨害多型サイトは、指定されているが選択されていない多型サイトと同様にターゲットシーケンスの非指定サイトを含んでいても良い。

特に、本発明で意図している非指定多型サイトは、デュプレックス配置を妨害するものであっても良く、これによってプローブ伸長を妨害するかあるいは完全に禁止する。一実施例において、本発明はこのような非指定多型を受け入れるカバリングプローブセットのデザインを提供する。カバリングプローブセットは、核酸シーケンス内で指定多型サイトの所定の複合性を同時尋問するプローブを具える。カバリングプローブセットは、各サイトについて、ターゲットにアニーリング可能な少なくとも一のプローブを具え、サブシーケンス伸長反応に基づいて、そのサイトに「マッチした」（伸長）または「マッチしていない」（非伸長）の二つの値のうちの一方の割り振りを行うようにしている。

各指定サイトに関連するカバリングプローブセットは、一又はそれ以上の位置において異なる二またはそれ以上のプローブを含んでいても良い。ここでは、これを変性（degenerate）セットと呼ぶ。ある実施例において、プローブシーケンスは、ＤＮＡ内で出会ったヌクレオチドのどれとでも塩基対を作ることができるユニバーサルヌクレオチドを含んでいても良い。ある実施例においては、プローブをコード化したミクロ粒子に付けるようにしても良く、特に、カバリングセットあるいは変性セットにおける２又はそれ以上のプローブは、同じタイプのミクロ粒子に付けることができる。２又はそれ以上のプローブをミクロ粒子またはビーズに付けるプロセスは、「プローブプーリング」と呼ばれる。

カバリングプローブセットのデザインは、ここでは、遺伝子分析の二つの代表的な領域における伸長による多型複合分析に関連して述べられている：（１）ＣＦおよびアシュケナージユダヤ（ＡＪ）病キャリアスクリーニング用の突然変異分析の場合のように、マルチプル非相関指定多型および変異のスコアリング、及び（２）ＨＬＡ分子タイピングの場合のように、多型相関セットのスコアリング、である。第一に、マルチプル突然変異全体のカバリングセットは、マルチプルサブセットを含んでおり、各サブセットは、一の指定サイトに関連している。このような場合、異型接合性（heterozygosity）を確認するために２またはそれ以上のプローブが、設けられている。一般的なＳＮＰ同定と確認シーケンスの目的のために、各多型サイトにつき最大４つまでのラベルを付した（すなわち、ビーズ表示した）プローブを含む変性プローブセットが提供されている。第二に、カバリングセットは、ここに詳述するとおり、セット中のプローブ数を最小にするように構成されたサブセットを含んでいる。指定プローブのセットは、伸長パターンに基づいて対立遺伝子特定シーケンス形状を同定するように設計されている。

非指定多型サイトを受け入れる、あるいは同定するこの方法が、シーケンス特定プローブの複合伸長に関して有益であるのに加えて、これは、ミニシーケンシングとしても知られているプローブの単一塩基延長（single base extension）と共に使用することもできる。（例えば、本明細書に記載されているPastinen, et al. Genome Res. 7: 606~614 (1997) 参照）。

本発明の、伸長による分析法は、単一塩基プローブ延長と異なり、ＳＮＰｓのみならず、多重（例えば、ダブル、トリプル、他）ヌクレオチド多型など他の形の多型の検出、及びＨＬＡなどの高多型遺伝子座のタイピングで普通に観察される挿入および欠失にも使用することができる。これらの複雑なシステムでは、本発明の方法によるシーケンス特定プローブ伸長が、検出ステップを簡単にする。なぜなら、関心のある各多型ターゲット位置の各々について２またはそれ以上のプローブが用いられており、検出ステップは、単一塩基プローブ延長の場合のように、二つの延長されたプローブ間の識別を行うと言うよりは、むしろ、２またはそれ以上のプローブのどちらかが伸長されるかを決めるためのみに実行されるからである。従って、本発明の方法は、検出ステップにおいてマルチプルフルオロホア（fluorophore）またはクロモホア（chromophore）ラベルを使用しているが、シングルユニバーサルラベルは、一般的にシーケンス特定プローブ伸長に十分である。これは、複合フォーマットにおけるアプリケーションが少なくとも二つのフルオロフォア（fluorophore）またはクロモホア（chromophore）ラベルを必要とする単一塩基延長法と対照的である。

ＤＮＡメチル化： ある実施例には、ＤＮＡのメチル化ステータスを決定する方法および組成が記載されている。シトシンのメチル化は、長い間、ほ乳類の細胞の遺伝子発現抑制における重要ファクタとして認識されていた。相当数の転写ファクタの認識サイト内でシングルＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化は、いくつかの疾病との結合および関連をブロックするのに十分である。ｅＭＡＰは、診断用および他の目的でゲノミックＤＮＡのメチル化状態を決定するのに使用できる。このＤＮＡは、非メチル化シトシンをウラシルに変える亜硫酸水素ナトリウム処理を行うことによって変形する。亜硫酸を除去し化学変換が終了したら、この変形したＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いる。関心のある遺伝子用にもともとメチル化したＤＮＡ用の特定のプローブと、非メチル化ＤＮＡ用の特定のプローブとの、一対のプローブが設計されている。ｅＭＡＰは、ＤＮＡポリメラーゼと一のラベルを付したｄＮＴＰおよびラベルを付していない３つのｄＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓの混合物を用いて実行される。特定のビーズ表面上の伸長生成物は、メチル化状態を表示することができる。

選択的シーケンシング： 本発明の他の実施例においては、選択的シーケンシング（単に「シーケンシング」とも言う）が、核酸シーケンス内の指定多型セット全体の同時尋問に用いられ、この各サイトにおける組成を決定する。選択的シーケンシングは、関心のあるシーケンスに対する可能な構造セットから、所定の特定サンプル中の実際の構造を選択するか、または、このサンプル中の可能なシーケンスセットを狭くするのに必須の情報を提供するために使用されうる。選択的シーケンシングにおいては、延長反応におけるプローブ長が、決定しうるシーケンス長を決める。長いＤＮＡシーケンス用には、ジグザグなプローブデザインを用いて、シーケンス同士をリンクさせることができる。従って、既知のシーケンス組み合わせを確認することができ、更に、不知のシーケンス組み合わせを新規な対立遺伝子として同定することができる。

嚢胞性繊維症キャリアのスクリーニング
本発明の実用的な一アプリケーションは、嚢胞性繊維症膜内外導通（ＣＦＴＲ）遺伝子における非指定変異および多型のセットのコンテキスト内での指定変異セットの分析を含む。このセットにおける各指定変異は、この疾病に関連しており、独立してスコアを付ける必要がある。ポイント変異の最も単純な場合は、二つのコード化したプローブを提供して、各３’末端指定サイトへのアラインメントが確実に行われる。一方のプローブはワイルドタイプを予想し、他方は代替（変異した）ターゲットシーケンスを予想している。

しかしながら、指定サイト近傍にある特定ターゲットシーケンス構造に無関係に伸長を確実なものにするには、いくつかの実験例に述べたとおり、追加のプローブを設けて可能なあるいはそれらしい構造とマッチさせる。好ましい実施例では、カバリングプローブセットが、対応するターゲットサブシーケンスの既知のあるいはそのようなヴァリエーション全てに対応するＴＥＩシーケンスを表示するプローブを含むように構成されている。このことは、指定サイトの近位範囲内に位置する、さもなければ伸長を禁止する非指定多型の存在下での伸長を確実なものとする。

ある実施例では、非指定サイト内にある特定ターゲット構造の同定は、カバリングプローブセット中の一のシーケンスが十分近くでターゲットシーケンスにマッチして伸長を確実なものにしないかぎり、従って、ＴＥＩ領域内で確実にターゲットシーケンスにマッチしない限り、不要である。この場合、同じ３’末端をシェアしているすべてのカバリングプローブ、あるいはそのうちのいくつかが、同じコードに割り振られることがある。好ましい実施例では、このようなプローブは、同じ固相基体（プローブプーリング）に関連している。プローブプーリングは、必須数のＴＥＩシーケンスを表すのに必要とされる識別可能な固相基体の数を低減させる。特に好ましい実施例では固相基体は、その位置で復号しうる識別可能なミクロ粒子のアレイセットの形で提供されている。ターゲット領域内の更なる多型を同定するためにカバリングプローブセットにプローブを追加することは、様々なハプロタイプを解明するのに有益な方法である。

ＨＬＡ
本発明の他のアプリケーションは、ＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen）複合体の遺伝学的分析である。これは、クラスＩのＨＬＡ抗体（好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃまたはこれらの組み合わせ）およびクラスIIのＨＬＡ抗体（好ましくはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、又はこれらの組み合わせを含む）を符号化するＨＬＡ領域内で一又はそれ以上の対立遺伝子の同定を行うことができる。クラスＩおよびIIの遺伝子座は、同時に分析することができる。

多重非相互関連指定変異の独立したスコアリングとは逆に、対立遺伝子（または対立遺伝子群）の同定は、伸長反応セット全部のスコアリングによって行われる。各反応は、選択された指定多型サイトセットの員に導かれる一またはそれ以上のプローブを具える。これらの伸長反応セットは、特徴的な伸長信号パターンを生成する。好ましい実施例では、二値パターンが生成され、値「１」がマッチング（従って伸長された）プローブに、値「０」が非伸長プローブに割り振られている。所定の長さの二値パターン（ストリング）は、対立遺伝子または対立遺伝子群を独自に同定する。

ＨＬＡタイピングに必要なプローブの総数は、求める解像度によって異なる。「解像度」なる用語は、ここでは、対立遺伝子の差別化の度合いを表示するために使用している。好ましくは、本発明の方法は、異なる抗体群を識別するのに十分なＨＬＡ対立遺伝子のタイピングを行う。例えば、Ａ＊０１およびＡ＊０３は、異なる抗体群であり、臨床アプリケーションにおいて識別しなくてはならない。全米骨髄バンク（The National Marrow Donor Program (NMDP)）は、ドナーの分子タイピング用のパネルを推奨している。ＮＭＤＰパネルが要求している低ないし中解像度は、様々な抗体群が、全回識別されるべきであることを意味する。さらに、すべての対立遺伝子の識別は不要であっても、一の群中の少なくともいくつかの対立遺伝子は識別されるべきである。ある実施例では、本発明は、本明細書で引用されている、ＮＭＤＰスタンダード（www.NMDPresearch.org）によって定義される低ないし中解像度にＨＬＡ対立遺伝子をタイピングすることができる。

Ａ＊０１、Ａ＊０３、他は、このような解像度をもって常に同定される。Ａ＊０１０１及びＡ＊０１０２は、必ずしも識別できないことがある。ＳＳＯ法用に、現行のＮＭＤＰパネルは、ＨＬＡ−Ａに３０の、ＨＬＡ−Ｂに４８の、ＨＬＡ−ＤＲ−Ｂに３１のプローブを具えている。高解像度ＨＬＡタイピングは、ほとんどの対立遺伝子が各グループ内で同定される時の状態を意味する。この場合、Ａ＊０１０１及びＡ＊０１０２は識別されるであろう。このような解像度に達するには、クラスＩおよびクラスIIの両タイピングについて約５００ないし１０００のプローブが必要となる。ある実施例における、本発明の方法は、少なくとも、本明細書に引用されているCao et al. Rev. Immunogentics, 1: 177~208 (1999) に記載されている程度に高解像度ＨＬＡタイピングを提供している。

本発明はまた、伸長反応の信号パターンに基づくユニークな対立遺伝子のアサインメントを行うためにサイトを指定し、このような指定サイト用のプローブセットを指定するための方法を提供するものである。カバリングプローブのデザインは、明らかに各プローブのＴＥＩおよびＤＡ領域のそれぞれの機能を考慮したものである。

所定の指定サイトに関連するプローブのカバリングセットは、サブセットを具えている。各サブセットは、同一のＴＥＩ領域を表わすプローブを具えている。ＴＥＩ領域内での単一の位置でのミスマッチ、あるいはＤＡ領域内での３またはそれ以上の位置でのミスマッチは、伸長を妨げる。従って、組成中でこのような差異を表示する二つのプローブの伸長は、識別伸長パターンを作る。このようなプローブはすべて、独立してコード化される限りは、平行な伸長反応において複合化することができる。好ましい実施例では、コード化は、カラーコード化したビーズにプローブを付着させて行う。

同一のＴＥＩサブシーケンスを表わし、２つより多くない位置で異なるＤＡサブシーケンスを表わすプローブは、完全マッチと比較可能であるか、あるいは完全マッチのそれより低い収率（すなわち信号強度）で伸長反応が行われる。ミスマッチの許容範囲を表わす前者の場合は、問題のプローブによってマッチした対立遺伝子セットが拡大して、ＤＡ領域内での許容ミスマッチシーケンス構造を表わす対立遺伝子を含むことになる。部分的にのみ許容範囲を表わす後者では、対立遺伝子マッチングパターンを更に明らかにする３つのアプローチがある。第１のアプローチは、各ＤＡ領域中の一又は二のヌクレオチド多型を表わすプローブが、カバリングセットに含まれている。ターゲットシーケンスに関する情報を、カバリングセット内の異なるプローブによって生成される信号強度を量的に比較することによって得られる。第２のアプローチは、テザーによって結合している別々のＴＥＩとＤＡ領域を有するプローブを使用して、ターゲット多型を防ぐべくＴＥＩ領域から離れたところにＤＡ領域を位置させるようにしている。第３のアプローチでは、マッチした対立遺伝子セットの拡大があまり大きくないような場合に、プローブを選択的にプールするものである。

本発明の実施例では、プローブは好ましくは、ＨＬＡ遺伝子座内の対立遺伝子の組み合わせに相関することが知られているターゲットシーケンスに相補となるように設計されている。既知の多型とは、文献に記載されているもの、あるいはシーケンスの検索可能なデータベース（例えば、www.NMDProcessing.org）から入手可能なものである。ある実施例では、関心のあるＨＬＡ遺伝子がＨＬＡクラスＩ群（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃまたはこれらの組み合わせ）に属する。他の実施例では、関心のあるＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡクラスII群（例えば、ＤＲ、ＤＱ、ＤＰまたはこれらの組み合わせ）に属する。ＨＬＡクラスＩおよびIIの遺伝子座は、組み合わせて、また、同時尋問によって検査することができる。

ＳＳＰ／ゲル法において従来から使用されているプローブを、本発明で使用することができる。好ましくは、Bunce et al., Tissue Antigen, 45: 355-367(1995)及び／又はBunce et al. Tissue Antigen, 45: 81-90 (1995)に記載のプローブ（両者とも本明細書で引用されている）は、本発明のプローブとして使用することができる。ＷＯ００／６５０８８，欧州特許出願第９８１１１６９６．５号、ＷＯ００／７０００６、及び、Erlich et al., Immunituty, 14: 347-356 (2001)（いずれも本明細書で引用されている）に記載のプローブシーケンスまたはＨＬＡシーケンス情報を、本発明のプローブの設計に使用することができる。

コード化したビーズアレイの複雑性は、必須のタイピング解像度を受け入れるべく容易に調整できる。例えば、３２のビーズタイプが４つの識別サブアレイの各々に使用されている場合、トータルで１２８のプローブが入手可能であり、複合伸長反応において高解像度のＨＬＡクラスＩおよびIIのタイピングを達成する。同様に、１２８のビーズタイプで４つのサブアレイを、あるいは６４のビーズタイプで８のサブアレイが使用されている場合、トータル５１２プローブが入手可能であり、複合伸長反応にいて高解像度のＨＬＡクラスＩおよびIIのタイピングを達成する。

コード化したビーズアレイフォーマットは、スループットの高い分析に適合している。例えば、本発明の実施例は、９６のウエルを具えるマイクロプレートの大きさに適合するフォーマットのマルチサンプルを受け入れるキャリアを提供しており、サンプルは、標準ロボット液体ハンドリング装置によって配分できる。このフォーマットは、チップに装填したマルチプルコード化ビーズアレイを受け入れ可能であり、シングルマルチチップキャリア上のマルチプルサンプルの各々について複合タイピング反応を同時に行うことができる。患者毎に１２８タイプをテストする９６個のウエルキャリアでは、１０、０００以上のゲノタイプを、現行のＳＳＰあるいはＳＳＯ方法論によっては達成できないようなスループットレートで決定することができる。

本発明の実施例では、同じＤＮＡターゲットストランド上のサブシーケンスに相互に関連するように伸長反応をサブシーケントハイブリダイゼーションと組み合わせることができる。この性能を「フェージング」と呼ぶ。フェージングは、対立遺伝子のさまざまな組み合わせによって所定の伸長パターンが生じる可能性から起きる対立遺伝子の割り振りにおける曖昧さ（アンビギュアス）を解決するものである。同様に、フェージングは同じＤＮＡストランドまたはクロモソームに多型を割り振るハプロタイピングのコンテキストにおいて有益である。

本発明の実施例では、アニーリングおよび伸長反応の伸長ステップを、組み合わせてワンステップ反応とすることができる。また、継続的にあるいは断続的に温度変化を上昇させる手段がシステム中に組み込まれており、複合反応において様々な融点でプローブのマルチプルオプティマル条件を受け入れることができる。

本発明の実施例では、コード化したビーズアレイが固相基体上に形成されている。これらの固相基体は、ガラスあるいは半導体など、機械的強度が十分であり、必要に応じて製造ステップに乗せることのできる好適な固体材料でできている。いくつかの実施例では、固相基体は、チップスと呼ばれる継続ユニットに分割されている。コード化したビーズアレイを具えるチップスは、マルチチップキャリアの中にロードされているのであれば、個別にあるいはグループで処理することができる。例えば、温度管理の標準的な方法は、シングルチップキャリアあるいはマルチチップキャリアの動作温度を設定したり、あるいは、予めプログラムされた温度変化シーケンスに適用される。更に、チップスは、本明細書に引用されているＰＣＴ／ＵＳ０１／２０１７９号に開示されているように、ランダムコード化アレイ検出（Random Encoded Array Detection (READ)）の直接撮像容量で分析することができる。ＲＥＡＤを用いて、チップス上でコード化したビーズの全体例の複合分析が可能である。更に、ＲＥＡＤフォーマットでは、予めプログラムした温度サイクルをチップ上の伸長生成物の増幅をリアルタイムで提供する。所定のゲノミック、ミトコンドリアル、又はその他のＤＮＡのリニアオンチップ増幅が、ＰＣＲなどのプリアッセイＤＮＡ増幅の必要をなくし、これによってタイピングアッセイ全体を完成するのに必要な時間が劇的に短くなる。したがって、例えば、死体のタイピングなど、時間にセンシティブな適用が可能となる。より重要なことは、このアプローチが、多くの遺伝子スクリーニングおよび多型分析における限定ステップである、ＰＣＲ複合の複雑性を緩和することである。好ましい実施例では、温度調整に加えて、サンプル及び試薬の注入用に、液体カートリッジを用いている。

一実施例においては、本発明は多型分析方法を提供しており、ここでは、各ターゲット核酸シーケンスが、一又はそれ以上の「アニーリング−延長−検出−変性」温度サイクルを適用することによってマルチプル伸長反応におけるテンプレートとして使用されている。この方法では、伸長生成物のその位置での検出に伴ってリニア増幅を実行する。この能力により、ポリヌクレオチドサンプルのシーケンスの特定増幅という第１ステップの必要がなくなる。

サイクリングによってアッセイ処理と信号増幅をひとつにしているので、遺伝子分析の完遂を簡単にし、早めるだけでなく、複合ＰＣＲ処理の開発、テスト、実行の必要性を軽減することになる。本発明の方法は、また、マルチ患者サンプルの同時遺伝子分析に高スループットフォーマットを提供するものである。

本発明のいくつかの実施例は、シーケンス特定プローブの複合伸長用に提供されたものであり、複数の異なるターゲットの同時評価を行うことができる。ある実施例では、オリゴヌクレオチドプローブが固相支持体上に固定されており、シリコンあるいはガラス表面などのシングル表面上にプローブの密度パターンを生成する。ある実施例では、予め合成したオリゴヌクレオチドプローブを固相支持体上に固定している。支持体の例としては、シリコン、化学的な変性シリコン、ガラス、化学的な変性ガラスあるいはプラスチックなどがある。これらの固相支持体は、微細なビーズの形状であってもよい。オリゴヌクレオチドアレイの解像度は、デリバリシステムの空間的解像度、及び配置されたヌクレオチド溶液のボリュームに必要な物理的な空間の両方によって決まる。（Guo, et al., Nucleic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994); Fahy, et al., Nucleic Acid Res. 21: 1819-1826 (1993): Wolf, et al., Nuc. Acids Res. 15: 2911-2926 (1987); 及びGhosh, et al., Nuc. Acids Res. 15: 5353-5372(1987) 参照）。

本発明は、複合アッセイ方法を提供するものである。ある実施例では、伸長プローブセットが、固相基体上に、そのアイデンティティを保存する形で、すなわち、異なるプローブを空間的に分離して、及び／又は、プローブのアイデンティティを化学的にコード化する事によって、固定されている。次いで、アニーリングおよび伸長反応において、一又はそれ以上の液体固定ターゲットを、多数の固定プローブに接触させる。固定したことによるこのプローブの空間的な分離は、伸長生成物を同定する際の不明確さを軽減する。従って、本発明は、現在のＰＣＲ−ＳＳＰ法を越える利益を提供するものである。ＰＣＲ−ＳＳＰ方法は、（ｉ）各ＰＣＲの増幅に二つのプローブが必要であること、（ii）複合ホモジェナス反応においてＨＬＡなどの高多型遺伝子用のオーバーラップしているプローブ間に競合があること、（iii）このような複合反応中に特定の生成物を識別することが困難であること、によって高スループットフォーマットに適合しない。

好ましい実施例では、プローブは、それぞれ５’末端を介して、コード化されたミクロ粒子（ビーズ）に付着しており、この粒子は、付着したプローブを独自に同定する化学的あるいは物理的な識別特性を有している。プローブは、ビーズに接触している溶液中に含まれている関心のあるターゲットシーケンスを補足する。特定のビーズ上に表わされたプローブの伸長は、光学的に検出可能なサインあるいは光学的に検出可能なサインに変換することのできる化学的サインを生成する。複合伸長反応では、ビーズの各々の光学的サインが、そのビーズ上に表わしているプローブに独自に対応している。プローブ伸長ステップに続いて、粒子の同定および検出、例えば、フロー血球計算などによってプローブのアイデンティティを決定することができる。

ある実施例では、ビーズを、伸長ステップの前に基体上の平坦アレイ内に配置するようにしている。また、ビーズを平坦な基体上に集めて、伸長ステップ後の撮像を容易にすることもできる。ここに述べるプロセスおよびシステムは、ビーズのアレイ全体の簡易撮像とマルチ患者サンプルの遺伝子的分析を同時に行うことができる高スループットアッセイフォーマットを提供する。

ビーズアレイは、アレイ内のビーズの化学的にまたは物理的に識別可能な特性が、ビーズに付着したオリゴヌクレオチドプローブのアイデンティティを表わす、ランダムにコード化されたアレイであってもよい。このアレイは、ＲＥＡＤフォーマットによって形成することができる。

ビーズアレイは、別々のバッチプロセスを使用してアプリケーションを特定した基体（例えば、ウエファスケールでのチップなど）を作って準備する。コード化され、オリゴヌクレオチドプローブに付着させたビーズ（例えば、約１０^８ビーズ／１００μｌ懸濁液のスケールで）を、基体（例えばシリコンチップ）と組み合わせて、まとめて、基体の指定領域上にデンスアレイを形成する。ある実施例では、このビーズアレイは、直径３．２μｍ、ディメンション３００μｍｘ３００μｍのビーズを４０００個含んでいる。ビーズのサイズが異なれば、密度が変化する。マルチビーズアレイも、同じチップ上で分けられている液体コンパートメント内で同時に形成することができる。このような方法は、本明細書に参考文献として記載されている、２００２年７月９日出願した米国特許出願第１０／１９２３５１号に開示されている。

ビーズアレイは、本明細書に参考文献として含められている、米国特許第６，２５１，６９１号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２５４６６に記載されているような、集合的に「ＬＥＡＰＳ」と呼ばれる方法によって形成することができる。

本発明で使用する基体（例えば、チップ）は、界面パターンニング法であるＬＥＡＰＳに従って、パターン化されたプラナ電極であってもよい。例えば、この基体は、酸化物あるいは他の誘電材料でパターン化して、交流電界が印可された状態で所望のインピーダンス分布を作るようにしても良い。このパターンは、所望のＡＣ電界が印可された流体フロー及び対応する粒子トランスポートを作るように設計することができる。基体は、半導体処理技術を用いてウエハスケール上にパターン化することができる。更に、基体は、ＵＶパターン可能な、光学的に透明なポリマでできた薄膜を蒸着したコンパートメントに分けて、この基体に所望のレイアウトの液状コンデュイットおよびコンパートメントを張り付けることができる。これらのコンデュイットおよびコンパートメントは、一又は複数の分離したコンパートメント内に液体を封じ込めるので、これによって、所定の基体上に多重サンプルを受け入れることができる。

ビーズアレイは、ギャップで分離されており、電解液などの分極可能な液状媒体を含む二つの電極を伴う、第２プラナ電極に実質的に平行な（「サンドイッチ」型）第１プラナ電極を提供し、ＬＥＡＰＳを用いて作ることができる。第２プラナ電極の表面あるいは内側は、界面パターニング法によってパターン化することができる。ビーズは、ギャップ内に取り込まれる。交流電圧がギャップに印可されると、ビーズが、第２電極上にランダムにコード化したアレイ（例えば、チップ）を形成する。

ＬＥＡＰＳの他の実施例では、ビーズアレイを、感光電極上に形成することができる。好ましくは、上述のサンドイッチ構造は、プラナ感光電極および他のプラナ電極と共に使用することもできる。上述したとおり、二つの電極はギャップで分離されており、電解液を含んでいる。機能化され、コード化されたビーズがギャップ内に取り込まれている。光と組み合わせてＡＣ電圧を印可すると、ビーズは感光電極上にアレイを形成する。

本発明のある実施例では、ビーズを化学的または物理的に識別可能な特性と関連させるようにしている。これは、例えば、励起波長、発光波長、励起状態のライフタイムあるいは発光強度によってスペクトル的に識別可能な一またはそれ以上の蛍光性あるいは染色性の染料を含むものなど、光学的に識別可能なタグセットを伴う染色ビーズを用いる。光学的に識別可能なタグは、例えば、Fulwylerの米国特許第４，７１７，６５５号（１９８８年１月５日）に開示されているように、特定の比率でビーズを染色する。染色は、当業者に公知の方法によって粒子を膨張させることによって行われる（Molday, Dreyer, Rembaum & Yen, J. Mol Biol 64, 75-88 (1975); L.Bangs, "Uniform latex Particles, Seragen Diagnostics, 1984）。例えば、最大１２までのビーズタイプが、膨張と各々が独立した４つの密度レベルにある二色のバルク染色によってコード化され、４つのノミナルモル率で混合される。代替として、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０７１９号（本明細書に全体が引用されている）に記載されている組み合わせ論的カラーコード化された最大１２のビーズタイプを使用して、光学的に識別可能なタグを付けたビーズアレイを与えることができる。化学的符号化に加えて、ＰＣＴ／ＵＳ０／２０７１９号に記載されているプロセスによって磁化するようにしても良い。

染料による化学的符号化に加えて、所定のオリゴヌクレオチドプライマを有するビーズを空間的に分離して（「空間的符号化」）、ビーズの位置がビーズのアイデンティティに関する情報を提供するようにしても良い。空間的符号化は、例えば、表面近傍の粒子の光制御エレクトロキネティックアッセンブリ（Light-controlled Electronikinetic Assembly of Particles near Surfaces: LEAPS）を用いて、アレイアッセンブリ中に単一の液相内で行われる。ＬＥＡＰＳを用いて、交流電界に反応して及び／又は基体上に照射される光パターンに応じて、平坦ビーズアレイを組み立てることができる。

ＬＥＡＰＳは、シリコンチップと溶液間のインターフェースにおいてインピーダンスにラテラルな傾きを生じさせ、アレイアッセンブリによる電気流体力学的な力を調整するのに使用することができる。電気的な要件はあまり大きくなく、典型的には１００μｍの２枚の平坦電極間の液状ギャップに１０Ｖｐｐ以下の低交流電圧を印可する。このアッセンブリプロセスは、迅速であり、光学的にプログラム可能である。すなわち、電界を印可して何千ものビーズを含むアレイを数秒間内で形成することができる。コンパートメントで仕切ったチップ表面に維持されている多重液層内に多数のサブアレイを作ることもできる。

アレイの形成に続いて、このアレイを固定するようにしても良い。例えば、直流電圧を印可して、ビーズアレイを固定してランダムに符号化したアレイを作成するようにする。この直流電圧は、典型的には５〜７Ｖ（２〜６μｍのビーズでギャップサイズが１００〜１５０μｍの場合）に設定され、３０秒間以下、逆バイアス状態で印可して、ｎ型にドープされたシリコン基体がアノードを形成するようにし、この結果、アレイ内の隣り合うビーズ間で接触させて、ある程度アレイを圧縮して、同時に電極表面のすぐ近位にある高電界領域にビーズを移動させる。一旦、十分近位になれば、ビーズは、物理的な吸着を仲立ちするバンデアワールス力によって固定される。この吸着プロセスは、ビーズ表面から延在する「テザーズ」群をビーズ表面に与えることによって容易になる。ポリリジンとストレプタヴィジンがこの目的に使用されている。

ある実施例では、粒子アレイを、例えば、コンポジットゲル粒子フィルムを形成するなどの、化学的方法によって固定するようにしている。このようなゲル−コンポジット粒子フィルムを形成する実験的な方法では、その位置でのゲル形成用のモノマ、クロスリンカ、イニシエータも含有するミクロ粒子の懸濁液が提供される。この粒子は、ＬＥＡＰＳを用いて基体上の平坦アッセンブリ内に形成されている。１００ヘルツないし数キロヘルツの周波数で、１〜２０Ｖ_ｐ−ｐ交流電圧を、液状ギャップの両側の電極間に印可する。ＡＣ電圧が印可された状態で、赤外線ランプまたは水銀ランプソースを用いてセルを４０〜４５℃に加熱してアレイアッセンブリを行った後、反応をホトイニシエーティングすることによって、液相のポリメリゼーションがトリガされる。ゲルは、モノマ濃度が２０％〜５％の、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドの混合物（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３７．５：１，モル比）からなるが、他の低粘度水溶性モノマあるいはモノマ混合物を使用するようにしても良い。このプロセスで作成した化学的に固定された機能を有するミクロ粒子アレイは、例えば、リガンドレセプタ結合アッセイなどの様々なビオアッセイに使用することもできる。

実験例では、熱イニシエータとして、アゾジイソブチルアミダイン ジヒドロクロライドを低濃度で用いてサーマルハイドロゲルを形成し、ポリメリゼーション混合物の全イオン強度が確実に０．１ｍＭから１．０ｍＭの範囲にくるようにしている。ＵＶポリメリゼーションに用いるイニシエータは、Irgacure2959（登録商標）(2-ヒドロキシ-4'-ヒドロキシエトキシ-2-メチルポロピオフェノン、Ciba Geigy, Tarrytown, NY）である。このイニシエータは、モノマーに加えて１．５重量％の溶液とする。

ある実施例では、粒子アレイを機械的手段によって固定するようにしている。例えば、マイクロウエルのアレイは、シリコン基体の低インピーダンス領域において標準的な半導体処理方法によって製造することができる。粒子アレイは、このような構造を用いて形成することができる。ある実施例ではハイドロダイナミック力および動重力（ponderomotive force）によるＬＥＡＰＳを用いて、分子を移動させ、ホールアレイに溜めるようにしている。次いで、交流電界を切って、粒子をマイクロウエル内にトラップし、機械的に閉じこめる。基体表面に空間的に順序付けられたランダムビーズアレイの後ろの残りのビーズは除去する。

基体（例えばチップ）を、一またはそれ以上の封入コンパートメント内において、液状の内部連結を介してサンプルおよび試薬をコンパートメントに出入りできるようにする。反応は、マイクロチタープレートのような、オープンコンパートメントフォーマット内で行われる。試薬は、ロボット液体操作装置によってチップの上にピペットし、複合サンプルを、同時に処理することができる。このようなフォーマットは、標準サンプル処理と既存のマイクロチタープレートフォーマット用の液体操作を行って、サンプル処理とアレイ検出を一体化して行う。

本発明のある実施例では、符号化されたビーズは、アレイ内ではなく、基体表面上に構築されている。例えば、基体の複数領域内にビーズ懸濁液を配置して、ビーズを重力で沈殿させ、ビーズアッセンブリを基体上に形成することができる。ＬＥＡＰＳで形成したビーズアッセンブリと逆に、これらのアッセンブリは、一般的に低密度の順不同の形状、あるいはくっつき合ったり、固まりになったビーズを含む非平坦形状となり、自然な形のビーズの撮像をさまたげる。しかしながら、化学的にコード化したビーズの混合物を、基体上の別々の複数位置に配置することによって行われる空間コード化と色コード化の組み合わせも、マルチプレキシングを可能とする。

ある実施例では、プローブの延長と共に、アレイの復号イメージと、アッセイ後のアレイのイメージとの比較によって、化学的あるいは物理的に識別可能な特徴を明らかにするようにしている。この比較は、例えば、イメージ検出器およびコンピュータ化したイメージカプチュア、および分析装置を具える光学顕微鏡を用いて行っている。アレイのアッセイイメージは、プローブ延長を表わす光学サインを検出するのに使用される。復号化したイメージは、ビーズ表面に表示わしたプローブを独自に同定する化学的及び／又は物理的に識別可能な特性を決定するために使用される。この方法において、アレイ中の各粒子上のプローブのアイデンティティが、識別可能な特徴によって同定される。

この復号とアッセイ画像から得られるデータの分析にイメージ分析アルゴリズムが使用される。このアルゴリズムは、アレイ内の各ビーズの数値データを得るのに使用される。分析ソフトウエアは、アレイの明フィールドイメージをテンプレートとして用いて、自動的にビーズを中央に位置させ、ビーズをタイプに応じてグループ分けし、個々のビーズに量的な強度を割り振り、血清サンプル中の異型「マトリックス」材料によって生成されたものなどの欠陥を除去し、バックグラウンド強度統計を分析し、対応する分散を伴うすべてのビーズについてバックグラウンドを補正した平均強度を評価する。このようなアルゴリズムの例は、ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０１７９号に開示されている。

プローブ伸長は、例えば、伸長したプローブを表わすビーズからの、光学的サインの変化によって、あるいは光学的サインの変化に変換できる化学的サインの変化として表示される。当業者に公知の直接的あるいは間接的なラベリング法を、この目的に使用することができる。直接的ラベリングは、伸長から生じる光学的な変化であり、間接的ラベリングは、検出可能な光学的サインを生成する一又はそれ以上の追加ステップを必要とする伸長によって導かれる変化である。ある実施例では、蛍光あるいはクロモ染色が、プローブ伸長の成分として加えられている一のヌクレオチドに付されており、例えば蛍光強度を変化させることによって、あるいは、伸長生成物を表わすビーズの光学的サインに他の変化を与えることによって、プローブ伸長がビーズの光学的サインを変化させる。

実験例
本発明は、以下に述べる実験例で理解するのがよい。これらの実験例は、明確にする目的で記載されており、本発明を減縮するものではない。

実験例１
複合ＳＳＰ分析用にジグザグに配置されたプローブデザイン
各多型用プローブは、固相キャリア上に固定されており、マルチ同時アニーリングおよび伸長反応を最小の相互干渉で行えるようなフォーマットを提供するものである。特に、この方法は図１に示すようなオーバーラップしたプローブを受け入れる設計である。この実験例では、対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ｂ、対立遺伝子Ｃの３つの対立遺伝子を考える。プローブ１及び２は、各々３’末端に整列するＳＮＰｓを検出し、プローブ３および４は、各々３’末端に整列する２−ヌクレオチド多型を検出する。プローブ１及び２のターゲットとなる多型サイトは、プローブ３および４のターゲットとなる多型サイトから５ヌクレオチドだけ上流側に位置している。このデザインは、各プローブにその対応ターゲットを結びつけると共に、指定多型サイトにおいて完全マッチがあるときに伸長を進める。従って、プローブ１および３は、対立遺伝子Ａに合致し、プローブ２、およびおそらくプローブ３は、対立遺伝子Ｂに合致し、プローブ１および４は対立遺伝子Ｃに合致する。

実験例２
ＨＬＡタイピング用のプローブデザイン
ＤＲＢ遺伝子の塩基１０６から１２５の範囲の多型領域の分析用のプローブを設計するために、２０の塩基ロングフラグメント用の２２の異なるシーケンスがＤＲＢデータベースにあった。これらは以下の表の通りである。

第１列は、第３列にリストされているシーケンスをシェアしている対立遺伝子の番号を含み、第２列はその対立遺伝子の一の名前を含む。我々は、ＴＥＩ領域として２０塩基フラグメントの最後の３つの塩基を選択し、そのＴＥＩ領域に応じてシーケンスセットをソートして、以下のグループを得た。

同じグループ内のシーケンスについて、そのグループの第１シーケンスと残りのシーケンス間の変化が下記の場合に表示される。３つのプローブシーケンスは、我々のプローブデザインルールの適用を明確にするために使用されている。第１のブループの第１シーケンスは、プローブｅ１として選択されており、第１のグループの第６シーケンスは、プローブｅ２として選択されており、第１グループの第７シーケンスはプローブｅ３として選択されている。

ターゲットとプローブのＴＥＩ領域とが完全に相補であるという要件があるため、グループ２からグループ１０のシーケンスはｅ１およびｅ２に対する伸長生成物を生成しない。同様に、第７グループ以外のグループのシーケンスは、ｅ３に対する伸長生成物を生成しない。各グループは、伸長反応パターンについて他から識別される。

同じグループのシーケンスについて、二つのシチュエーションがある。例えば、ｅ１とｅ２は、アニーリング領域内の６番位置における一のヌクレオチドによって異なる。従って、ｅ１とｅ２にマッチングするターゲットは、他のシーケンス用の伸長生成物を生成せず、ｅ１およびｅ２も、識別プローブである。同様に、グループ１の第７シーケンスの２番位置に対するターゲットは、プローブｅ１用の伸長生成物を生成しない。

ｅ１にマッチングするターゲットを除く、残る５つのシーケンスは、下記のとおり、ｅ２と、一又は二のヌクレオチドが異なるだけである。

これらのシーケンスはクロス反応である。位置Ｍ−７およびＭ−１４の一の塩基がｅ２と異なるシーケンスｂおよびｅのターゲットが、プローブｅ２にアニールするとき、アニーリング領域における非指定多型は許容され、伸長反応は、完全にマッチするシーケンスに対してほぼ同じ度合いで進むであろう。二つのヌクレオチドがｅ２と異なるシーケンスａ、ｂ、およびｄのターゲットが、プローブｅ２にアニールする場合、伸長反応は、非指定多型の一部のみを許容する。この状態を改善する方法のひとつは、ａ、ｃ、およびｄ用に別々のプローブを提供して、信号強度を分析することによって伸長生成物の産出を量的に分析し、正しいシーケンスを同定することである。代替として、ｅ２のプローブに物理的なリンカー（例えばテザー）を加えて、アニーリング領域とＴＥＩ領域を分離することによって、全アニーリング領域における非指定多型を架橋することができる。

第７グループにおけるシーケンスについては、他の二つのシーケンスがｅ３プローブによって部分的に許容される。これらの３つのシーケンスはプールするようにしても良い。ｅ２プローブは、２８の対立遺伝子の代わりに３０の対立遺伝子の伸長生成物を産生する。

実験例３
対立遺伝子結合パターンを変形するミスマッチ許容範囲の利用
プローブＤＲ−１３ｅ、ＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡを、ＤＲＢ遺伝子の塩基２８１−２９９をターゲットとするのに使用した。対立遺伝子ＤＲＢ１＊０１０３を含む３４の対立遺伝子は、このシーケンスに完全にマッチする。従って、結合パターンでは、１３ｅはこれらの３４の対立遺伝子に対してポジティブである（すなわち、１３ｅは、これらの３４の対立遺伝子を伴う伸長生成物を生成する）、いくつかの更なる対立遺伝子は、同じＴＥＩ領域を表わすが、アニーリング領域において非指定多型を表わしている。例えば、ＤＲＢ１＊０４１５など、５つの対立遺伝子は、位置４にＡではなくＴを含んでいるが、ＤＲＢ１＊１１３６などの４つの対立遺伝子は、その位置にＣを含んでいる。アニーリング領域におけるミスマッチ許容範囲によって、ターゲットシーケンスのこれらの９つの対立遺伝子に対する相補性が、完全にマッチしているシーケンスと同様に延長反応パターンを生成するであろう。この結果を図２に示す。ＴＯ−３及びＴＯ−４は、対立遺伝子＊０４１５および＊１１３６に対する、それぞれ、完全な相補シーケンスである。

実験例４
非指定多型を架橋するプローブのリンカー構造のデザイン
図３に示すとおり、特定の強いアニーリングを確実なものにするために保存されているシーケンス領域から、アンカーシーケンスを引き出すようにしている。これは、多型検出用にデザインされたものではない。この目的のために、多型検出用のものより短いシーケンスが、中性の化学リンカーによって、アンカーリングシーケンスに付着している。多型検出用にデザインされたシーケンスの短さは、指定サイトのすぐ近傍における非指定多型の潜在的な妨害を制限し、このような妨害する多型を受け入れるのに必要とされる可能なシーケンス組み合わせ数を少なくする。このアプローチは、ある状態における高密度の多型サイトを防止する。例えば、更なる多型を考慮したプローブを用いて、実験例３にリストされているシーケンスの識別が可能である。このリンカー及びシーケンスのデザインは、以下のリストに示すとおりである。

実験例５
フェージング
本発明は、２またはそれ以上の対立遺伝子の組み合わせが同じ反応パターンを生じうる場合に生じる不明確さを減少させるのに有益である。図４及び図５に示すシミュレート状況において、プローブ１およびプローブ３にマッチする、従って、伸長生成物を生成する、対立遺伝子Ａと、同じ複合反応に存在するプローブ２及びプローブ４とマッチする対立遺伝子Ｂは、プローブ１及び２にマッチする対立遺伝子Ｃ、および、プローブ３及びプローブ４にマッチする対立遺伝子Ｄが行うのと同じ全反応パターンを作る。このような不明瞭性は、本発明における検出方法を用いて減少させ、プローブ３と同じ多型サイトをターゲットにするようにデザインされたラベル化した検出プローブを用いたハイブリダイゼーションによって、プローブ１の伸長生成物を分析することが可能である。この分析結果がポジティブであれば、一の対立遺伝子の組み合わせ、すなわち、組み合わせ１のみが可能である。なぜなら、プローブ１とプローブ３は同じ対立遺伝子に関連するものだからである。検出プローブは、本発明に開示した方法のいずれか、あるいは従来の方法を用いてラベル化することができる。この同定検出ステップが、複合伸長反応検出と共に行われるのであれば、図５に示すように、伸長検出およびプローブハイブリダイゼーション検出用に異なるラベルを使用する。

この方法では、二またはそれ以上の多型を、ハイブリダイゼーションに共働する伸長を用いて同じ相（フェーズ）に割り振ることによって、不明瞭さを解決している。フェージングは、この分野で設計される他の遺伝子学におけるハプロタイプ分析に重要な関連があるものとして、急速に出現したものである。ターゲットと共に順次反応させることによって、より多くのプローブが含まれる、このプローブは検出用の異なるラベルを付して同じ反応に配置することができる。

プローブ伸長とハイブリダイゼーション反応の組み合わせの性能が、ＨＬＡ−Ｂエキソン３からのサンプルシーケンスを用いた実験に示されている。この結果を図６に示す。プローブＳＢ３Ｐは、反応中に伸長し、この伸長した生成物は、ラベルを付したＤＮＡプローブを用いて検出した。図６Ａおよび６Ｂに表す二つのサンプルについて、ＳＢ１２７ｒとＳＢ３Ｐ、及びＳＢ２８５ｒとＳＢ３Ｐが、それぞれ同じフェーズにある。

実験例６
ランダム符号化プローブアレイを用いたＨＬＡタイピング反応モデル
多型の識別を行うために、合成シングルストランドをターゲットに用いてモデル反応を行った。色で符号化されたトシル機能を持つ直径３．２μｍのビーズが固相化キャリアとして使用された。３２の識別可能なカラーコードセットを公知の標準方法（Bangs. L.B., "Uniform Latex Particles", Seragen Diagnostics Inc., p. 40）を用いて、青の染料（吸着／発光 ４１９／４６６ｎｍ）及び緑の染料（吸着／発光 ５０４／５１１ｎｍ）で、粒子を染色して生成した。染色したビーズは、ビオチン結合プロテインであるニュートラビディン（Neutravidin, Pierce, Rockford, IL)を用いて機能化し、ビオチン化したプローブを固定した。典型的なスケールの小さい相引反応では、１％のビーズを含む懸濁液２００μｌを、５００μｌの１００ｍＭホスフェートバッファ／ｐＨ７．４（バッファＡ）でウオッシュし、このバッファ５００μｌで再度懸濁させた。５ｍｇ／ｍｌのニュートラビディン２０μｌのビーズ懸濁液に加え、反応容器をシールして、３７℃で一晩おいた。次いで、相引したビーズを、ＰＢＳ／ｐＨ７．４と１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（バッファＢ）５００μｌで一旦ウオッシュして、このバッファ５００μｌ内に再度懸濁させ、３７℃で１時間反応させて、ビーズ表面上の非反応サイトをブロックした。このブロッキングの後、バッファＢでビーズを３回ウオッシュして、このバッファ２００μｌ内に保存した。

このモデル反応システムでは、二組のプローブを合成して３’末端におけるＳＮＰｓを含むようにした。これらのシーケンスは以下の通りである。

プローブは、５’末端においてビオチン化した。炭素数１５のトリエチレングリコール架橋剤を、ビオチンとオリゴヌクレオチドの間に挿入し、サブシーケント反応での表面固定の崩壊効果を最小に抑えた。各プローブについて、符号化ビーズへの相引を、ビーズ懸濁液５０μｌを用いて行った。ビーズは、２０ｍＭトリス／ｐＨ７．４、０．５ＭＮａＣｌ（バッファＣ）５００μｌで一旦ウオッシュし、このバッファ３００μｌ内に再度懸濁させた。１００μＭプローブ溶液２．５μｌを、ビーズ懸濁液に加え、室温で３０分反応させた。次いで、ビーズを、２０ｍＭトリス／ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トリトンで３回ウオッシュし、２０ｍＭトリス／ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌに保存した。

以下に示す長さ３３塩基の合成ターゲットを得た。

ターゲットを、チップ上の４つのプローブ（ＳＳＰ１３、ＳＳＰ２４、ＳＳＰ１６、ＳＳＰ３６）と反応させた。０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％のトリトン（Triton）Ｘ−１００、１０ｍＭ トリス（Tris）／ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡのアニーリングバッファ中のターゲットの１００ｎＭ溶液のアリコート１０μｌをチップに塗布し、３０℃の温度で１５分間反応させた。次いで、チップを同じバッファで一旦ウオッシュして、伸長反応混合物でカバーした。伸長反応混合物は、製造者によって供給される関連バッファ中に、１００ｎＭのＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰ（吸光／発光：５５０／５８０）（PerkinElmer Bioscience, Boston, MA）、１０μＭ ｄＡＴＰ−ｄＧＴＰ−ｄＴＴＰ、ThermoSequenase(Amersham, Piscataway, NJ)を含む。この反応は、最低６０℃の温度で５分間行われ、次いでチップを水（Ｈ_２Ｏ）でウオッシュした。デコーディングチップのアッセイイメージは、ブルー、グリーン復号イメージ用およびアッセイイメージ用にヒドロキシクマリン、ＨＱナローバンドＧＦＰとＨＱＣｙ３を有する自動フィルタチェンジャニコン蛍光Ｅ８００顕微鏡を用いて、それぞれ、行った。アポギーＣＣＤＫＸ８５（Apogee Instruments, Auburn, CA）をイメージ獲得に使用した。各反応において、完全にマッチングしたターゲットのみが伸長されていた。ＳＮＰｓのテストを行う場合には、１３−フォールドないし３０−フォールドの範囲内でマッチング及び非マッチングターゲット間の識別を行った。これを図７にＴＡ１３として表す。

実験例７
患者サンプルのＨＬＡ−ＤＲタイピング
患者から抽出したＤＮＡサンプルを、標準ＰＣＲプロトコルを用いて処理した。以下のプライマを一般的なＤＲ増幅に使用した。

フォーワードプライマ： GATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG
リバースプライマ： GCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC

ＰＣＲプロトコルは、以下の通りである。９５℃、７分間を１サイクル、９５℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間を３５サイクル、及び７２℃、７分間を１サイクル。

２８７塩基の長さを持ち、ＤＲ遺伝子座を覆っているＰＣＲ生成物を、１００℃で５分間変性させ、氷の上で冷却し、実験例６のモデル反応で述べたアニーリングバッファと混合した。１０μｌのアリコートを各チップに塗布して、４０℃で１５分間反応させた。伸長反応とサブシーケントイメージを、実験例６に記載したとおりに取得した。

患者サンプルから生成したＰＣＲ生成物を用いたシーケンス特定プローブの複合延長は、プローブのデザインに応じた結果となった。平行してテストした４つのプローブ（ＳＳＰ１３、ＳＳＰ１６、ＳＳＰ２４、ＳＳＰ３６）のうち、ＳＳＰ１３が伸長し、一方、ＳＮＰプローブＳＳＰ２４は、関連のないＳＳＰ１６プローブとＳＳＰ３６プローブのように結合したバックグラウンドを示したのみであった。図８に示すとおり、ＳＳＰの複合伸長は、少なくとも２０回のフォールドへのマッチングと、非マッチングシーケンス特定オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに基づいて、分析のための約２回のホールドから、マッチング及び非マッチングＳＮＰｓ間の違いを有意に強化した。

実験例８
グループ特定増幅
グループ特定増幅（ＧＳＡ）用のプライマは、ＳＳＯｓを伴う複合ハイブリダイセーションが、異型接合の対立遺伝子の組み合わせの曖昧な割り振りを生じる場合に最も頻繁に使用される。このような場合に、ＧＳＡプライマを選択して、曖昧さを除去するべく選択された特定の対立遺伝子セットを増幅する。これは、人を介した集中力を要する追加アッセイステップであり、分析を遅らせる。本発明の方法、好ましくは、ランダムにコード化したビーズアレイ上の表示プローブの実施例を用いることによって、ＧＳＡプライマを、プローブとして複合反応に組み込んで、これによって、分析の第２ステップ全体を削減することができる。

実験例９
セルラインを用いたＨＬＡ−ＤＲ、−Ａ、−Ｂ遺伝子座の分析
ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂの伸長による複合分析用プローブは、標準セルラインを用いて設計されテストされる。プローブは、上述の文献（Bunce, M. et al, Tissue Antigens. 46: 355-367 (1995), Krausa, P and Browning, M. J., Tissue Antigens. 47: 237-244 (1996), Bunce, M. et al, Tissue Antigens. 45: 81-90 (1995)）に報告されているＳＳＰプローブから得た。

ＤＲ用のプローブは：

である。

このうちのいくつかのプローブは、各々の３’末端にＳＮＰサイトを有する。例えば、ＳＲ３及びＳＲ３３（それぞれ、Ｇ及びＡ）；ＳＲ１１、ＳＲ６７及びＳＲ７１（それぞれ、Ｔ、Ｃ及びＡ）である。更に、プローブＳＲ３および３３は、３’−末端において、ＳＲ１１、６７、および７１のグループのプローブと１塩基分食い違っている。

反応条件は、アニーリング温度を４０℃に代えて５５℃としたこと、及び伸長温度を６０℃に代えて７０℃としたことを除いて、実験例７のものと同じである。実験例７ではダブル標準ＤＮＡを使用した。この条件では、シングル標準ＤＮＡがより良い結果を出す。シングル標準ＤＮＡは、初期ＰＣＲ生成物を同じＰＣＲプログラムで、プローブを一つだけ用いて再増幅して作った。二つのセルライン、Ｗ５１とＳＰ００１０の結果を図９及び図１０に示す。ＮＥＧ、すなわちネガティブコントロールが、選択したビーズタイプと相引した。ＮＥＧをマイナスした他のプローブの信号強度が、そのプローブの正しい信号であると考えられ、その値を図面にプロットした。Ｙ軸ユニットは、実験で用いたカメラからの信号ユニットである。ポジティブプローブとネガティブプローブの区別は、各サンプルについて不明確であった。特に、ＳＳＯ分析において典型的に直面している状況とは対照的に、他のサンプルと比較して各プローブについて信頼できるスレッシュホールドを決定する必要がなかった。

ＨＬＡ−Ａに用いたプローブは：

であった。

図１１及び図１２に示すＡ遺伝子座エキソン３の結果は、やはり不明瞭でなかった。図１２は、非指定多型用のミスマッチ許容範囲の例を示す。すなわち、位置Ｍ−１８において、Ａに代わってＣを表示している対立遺伝子０２０１が、プローブＳＡＡＰに完全にマッチしておらず、一方で、それにも拘わらず、伸長反応が行われていた。なぜなら、ポリメラーゼが、プローブ３’末端において指定多型に完全なマッチを検出し、位置Ｍ−１８においてミスマッチを許容しているためである。

ＨＬＡ−Ｂに使用したプローブは：

であった。

ＨＬＡ−Ｂエキソン２のタイピング用にこれらのプローブを使用した実験を、基準セルラインを用いて行った。ＨＬＡ−Ａと同様に、不明瞭でない結果（個々には示していない）が得られた。

実験例１０
ＣＦ変異の分析−プローブ伸長用のプローブおよびアレイのデザイン
本実験例は、カラーコード化した粒子上に表示したプローブの平坦アレイの設計とアプリケーションに関し、これらのプローブは、各３’末端においてあるいはその近傍でいくつかの、最も頻繁には、２つの塩基の組成物を表示するように設計されており、また、ＣＦＴＲターゲット遺伝子内の関心のある指定領域に整列するように設計されている。

遺伝子バンク（www.ncbi.nlm.nih.gov）から得たＣＦＴＲ遺伝子シーケンスを用いて、ＡＣＭＧ−ＣＦ変異パネル内の２５ＣＦＴＲ変異の複合分析用に、１６−ｍｅｒプローブを設計した。プローブシーケンスは、ＰＲＯＢＥ３．０（http://www.genome.wi.mit.edu）を用いて設計されており、各エキソンシーケンス（http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/alighment.html）に整列した。オリゴヌクレオチドは、３０〜５０％Ｇ＋Ｃリッチな塩基組成を伴う１５〜２１のヌクレオチドを有するように設計され、５’ビオチンＴＥＧ（Synthegen TX）を含むように合成された。わずかな欠失を操作するために、ＴＥＩ領域の変化シーケンスは、プローブの３’末端の３−５位置にあるいはその位置内に置かれている。プローブ組成は下記の表のとおりである。

ピュアブルーあるいはブルーグリーンに染色した１７のビーズの組み合わせを、ＣＦ変異の分析に用いた。４８塩基長のヒトβ−アクチン遺伝子（アクセッション＃Ｘ００３５１）を合成し、内部のポジティブコントロールとして各反応に使用した。１６塩基長の相補プローブを各アレイに含めた。遺伝子バンク（www.ncbi.nlm.nih.gov）から得たＣＦＴＲ遺伝子シーケンスを、ＡＣＭＧ−ＣＦ変異パネル内の２５のＣＦＴＲ変異の分析用のプローブ設計に用いた。プローブシーケンスは、ＰＲＯＢＥ３．０（http://www.genome.wi.mit.edu）で設計した。各プローブシーケンスは、各エキソンシーケンス（http://searchlaunche.bcm.tmc.edu/seq-search/alignment.htm.）に整列した。オリゴヌクレオチドは、５’ビオチンＴＥＧ（Synthegen TX）と合成され、０．５Ｍ ＮａＣｌの存在下でビーズ表面に相引した。ビーズは、ＬＥＡＰＳによって、チップ表面に固定した。

エキソン変異シーケンス

０．５Ｍ ＮａＣｌの存在下で、様々にコード化されたビーズにプローブが付着して、ピュアブルーまたはブルーグリーンに染色されたビーズをＬＥＡＰＳを用いてチップ表面に固定した。４８の合成塩基ヒトβ−アクチン遺伝子（アクセッション＃Ｘ００３５１）を各反応に内部ポジティブコントロールとして含めた。

アレイデザイン
好ましい実施例において、２５のＣＦ変異を、４つの異なる群に分けて、各群の員間のシーケンス均一性を最小に抑えるようにした。すなわち、変異は、複数のグループに分けられ、どのグループにおいてもプローブシーケンス間のオーバーラップを最小にするようにし、これによって、複合分析の条件下でのクロスハイブリダイゼーションを最小にした。カラーコード化したビーズ上に表示した各群は、別のアレイに構築した。（この４チップアレイデザインの結果は、以下の実験例で述べる）。代替のロブストアレイデザインについてもここに開示している。

実験例１１
ＲＥＡＤを用いたプローブ延長による複合ＣＦ変異分析
何人かの患者から抽出したゲノムＤＮＡを、複合ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）反応において、ここに引用されている、L.McCurdy, Thesis, Mount Sinai School of Medicine, 2000 に記載されている方法を用いて対応するプローブで増幅した。このｍＰＣＲ反応は、５’末端にユニバーサルシーケンスでタグを付けたキメラのプライマを使用している。アンチセンスプライマは、５’末端（Synthegen,ＴＸ）にて、リン酸化した。Perkin Elmer 9600 熱サイクラを用いて２８の増幅サイクルを実行した。各サイクルは、４８秒のランプを伴う、９４℃、１０秒の変性ステップ、３６秒のランプを伴う、６０℃、１０秒のアニーリングステップ、及び３８秒のランプを伴う、７２℃、４０秒の延長ステップを含み、各反応液（５０μｌ）は、５００ｎｇのゲノムＤＮＡと、１ＸＰＣＲバッファ（１０mMTrisＨＣＬ、５０ｍＭＫＣＬ、０．１％TritonX-100）、１．５ｍＭ MgCl₂、ＰＣＲグレードｄＮＴＰｓ、５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼの各々が２００μＭを含む。最良のプローブ濃度は、各プローブ対ごとに決定した。増幅に続いて、生成物を純化し、商業的に入手可能なキット（Qiagen)を用いてすべての試薬を除去した。ＤＮＡ濃度は、分光光度計分析で決定した。

ＰＣＲ生成物は、アンチセンス５’−リン酸化プライマを用いて増幅した。一本鎖のＤＮＡテンプレートを生成するために、ＰＣＲ反応生成物を１Ｘバッファ中で３７℃の温度で２０分間、２．５ユニットのエキソヌクレアーゼでインキュベートして、次いで、７５℃で１０分間加熱して酵素を不活性化した。この条件下で、この酵素は５’−リン酸化末端から二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断して、５’ホスホモノヌクレオチドをリリースする（J.W.Little, et al., 1967）。一本鎖のターゲットも、この分野の公知の方法で生成することができる。

シングルＰＣＲ生成物あるいはプールしたＰＣＲ生成物（各２０ｎｇ）を、１０mM TrisＨＣＬ(pH 7.4)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ NaCl、０．１％TritonX-100を含むアニーリング混合液に加えた。アニーリング混合液は、ビーズ表わすＣＦプローブ（実験例１０のもの）に接触させて、３７−５５℃で２０分間インキュベートした。次いで、３Ｕのサーモシーケナーゼ（Amersham Pharmacia Biotech NJ）、蛍光ラベルあるいはＴＡＭＲＡラベルを付したデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）類似体（NEN Life Sciences）を有する１Ｘの酵素バッファ、及び各タイプの無ラベルｄＮＴＰ、１μモルを加え、６０℃で３分間伸長反応を行った。ビーズアレイを、脱イオン滅菌水（ｄｓＨ_２Ｏ）で５〜１５分間ウオッシュした。アレイ内で各ビーズからの蛍光信号を有する画像を、ＣＣＤカメラを具える蛍光顕微鏡を用いて記録した。画像を、分析して、伸長プローブの各々のアイデンティティを決定した。この結果を図１５に示す。

実験例１２
カバリングプローブの使用
いくつかのＳＮＰｓを、ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０内で同定した。エキソン１０の多型が、この実験例の最後にリストされている。以下の９つのＳＮＰｓは、ＣＦＴＲ遺伝子の最も通常の変異であるΔ５０８のシーケンス内で同定した。

プローブは、可能性のあるＳＮＰｓをすべて受け入れるようにデザインされており、合成され、カラーコード化したビーズに相引している。ターゲット増幅用のプライマ（実験例１１に記載）も、変形して、すべての可能なＳＮＰｓを計数するようにしている。ＰＣＲ増幅ターゲットは、末期にマッチしたプローブの延長を実現する。分析から得た情報は、２重、すなわち、変異とＳＮＰｓの同定である。

エキソン１０多型

実験例１３
ＣＦ変異分析−モデルシステムにおけるオン−ビーズプローブ伸長
図１３は、ＣＦ遺伝子変異Ｒ１１７Ｈの検出の概要を示す図である。ターゲットは、実験例１１に記載されているように、ＰＣＲによって増幅した。３’末端にて変化する二つの１７塩基プローブを、カラーコード化ビーズの上に固定した。ターゲットの核酸シーケンスを、ＴＡＭＲＡ−ラベルｄＣＴＰと無ラベルのｄＮＴＰｓと熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼと共に加えた。

３’末端で変化する相補１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブを、商業的ベンダー（Synthegen TX）によって合成し、１２−Ｃスペーサによって付着させた５’ビオチン（Biotin-TEG）を含み、リバースフェーズＨＰＬＣによって純化した。プローブは、カラーコード化ビーズに固定した。プローブは、カラーコード化ビーズに付着させた。合成４８−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、エキソン４（Ｒ１１７Ｈ）における嚢胞性繊維症遺伝子変異に対応する指定の変化サイトにおいてＡ、Ｔ、Ｃ、あるいはＧのいずれかを含むものであった。

１μＭの合成ターゲットを、１０ｍＭ Tris-HCL(pH7.4)１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Triton X-100を含むアニーリング混合液に加えた。アニーリング混合液を、コード化ビーズアレイに接触させ、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、３ＵのThermo Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech NJ)、ＴＡＭＲＡ−ラベルのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）類似体（ＮＥＮ Life Sciences）を有する１Ｘ酵素バッファ、および１μＭの各タイプの非ラベルｄＮＴＰ１Ｘを含むバッファ伸長混合液を加え、伸長反応を６０℃で三分間行った。次いで、ビーズアレイをｄｓＨ_２Ｏで５〜１５分間ウオッシュし、アレイ内の各ビーズからの蛍光信号を含むイメージを、ＣＣＤカメラを具える蛍光顕微鏡を用いて記録した。信号はＣＣＤカメラでイメージをとらえて、ビーズの色で復号できる二つのプローブ間の信号強度を比較して分析した。ワイルドタイプのプローブは、加えたターゲットに正しくマッチし、従って、伸長生成物を生成したが、変異プローブには伸長が観察されなかった。この結果を図１６ａに示す。

実験例１４
ＣＦ変異分析−ビーズタグプライマを用いたＰＣＲと集中検出
この実験例は、イメージ分析用のチップ表面上のビーズのアッセンブリ及び固定を行って、懸濁液中のビーズ表面上のプローブ伸長を明確にするものである。ＣＦＴＲ遺伝子変異Ｒ１１７Ｈに対応するオリゴヌクレオチドは、変化可能な３’末端を伴ってデザインされ、合成されて、１２Ｃスペーサ（Synthegen, Texas）を有する５’ビオチン−ＴＥＧを含んでいる。プローブは、ブルーに染色したビーズを以下のように付着させた。すなわち、２μＭのプローブを、１Ｘ ＴＥ（１００ｍＭ Tris-HCl, 10mM EDTA）、５００ｍＭ NaClのビーズ溶液に加え、室温で４５分間反応させた。ビーズを、３Ｘについて１Ｘ ＴＥ、１５０ｍＭ NaClでウオッシュし、同じ溶液５０μｌ中にサスペンドした。各ビーズタイプ１μｌを、１Ｘバッファ（１００ｍＭ Tris-HCL, pH. 9.0, 1.5mM MgCl₂, 500mM KCl）、４０μＭ Ｃｙ５−ラベルｄＣＴＰ（Amersham Pharmacia Biotech NJ）、及び他の三つのタイプのｄＮＴＰｓ８０μＭを含むＰＣＲ混合液と、Taq DNA ポリアミラーゼ３Ｕに加えた。ワイルドタイプの相補ターゲット（４０ｎｇ）を、増幅直前にＰＣＲ混合液に加えた。１１サイクルのＰＣＲ増幅を、Perkin Elmer 9600熱サイクラー内で実行した。各サイクルは、９０℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２０秒間の伸長を含む。増幅後に、１Ｘ ＴＥバッファ中で遠心分離によってビーズを４回ウオッシュし、チップ表面に位置させた。イメージは、上述の実験例と同様に記録し、ＷＯ０１／９８７６５号に記載のソフトウエアを用いて分析した。この結果は、ワイルドタイプのプローブに付着したビーズの特別な増幅を示すが、変性プローブに付着したビーズについては増幅を示さない。この結果を図１６ｂに示す。

簡易画像分析用の平坦面上のビーズのサブシーケントアッセンブリを有するビーズタグを付したプローブを用いた複合ＰＣＲの一体化を示すものである。好ましい実施例では、ミクロ液体で連結されたマルチコンパートメント装置を、ここで述べるテンプレート増幅に使用することができる。例えば、温度サイクリングおよびハウジングを可能とする複数のコンパートメントであって、各コンパートメントにおいて、所望のアンプリコン全てのサブセットを生成する一のｍＰＣＲ反応が以下の通り使用されている。すなわち、（１）本実施例で記載されているコード化ビーズタグを付したプライマを用いて、４つのコンパートメントの各々において、異なるプローブ対でＰＣＲを実行する、（２）全ＰＣＲ反応を完遂して、アンプリコン−表示ビーズをプールする、（３）ランダムアレイを構築する、及び（４）画像を記録して、データを分析する。アレイアッセンブリは、ＬＥＡＰＳを含む従来技術の方法を用いて行うことができる。

実験例１５
ＣＦ変位分析−ワンステップアニーリング及び温度制御リアクタ内の伸長
何人かの患者から抽出したゲノムＤＮＡを、対応するプライマで、実施例１１に記載されているように、複合ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）反応において、増幅した。増幅に続いて、生成物を純化して、商業的に入手可能なキット（Qiagen）を用いて全ての試薬を除去した。ＤＮＡ濃度は、分光光学的な分析によって決定した。シングルまたはプールしたＰＣＲ生成物（各２０ｎｇ）を、１０ｍＭTris-HCL(pH7.4) 1mM EDTA, 0.2M NaCl, 0.1% Triton X-100を含むアニーリング混合液に加えた。このアニーリング混合液は、3UのThermo Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech, NJ), 蛍光ラベルあるいはＴＡＭＲＡラベルデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）類似体（NEN Life Sciences）のいずれかを有する1X酵素バッファと、１〜１０μモルの各タイプの非ラベルｄＮＴＰと混合して、カラー符号化アレイ上に表示したオリゴヌクレオチドアレイに接触させた。オリゴヌクレオチドは、前述の実験例のように設計し合成した。アニーリング及び伸長反応は、温度制御サイクラ内で処理した。温度ステップは、３分ごとに６５℃、６０℃、５５℃、５０℃、および４５℃とし、温度間の傾きを３０秒以下とした。ビーズアレイを、ｄｓＨ_２Ｏで５〜１５分間ウオッシュし、アレイ内の各ビーズからの蛍光信号を、ＣＣＤカメラ付蛍光顕微鏡を用いて記録した。画像を分析して、伸長したプローブの各々のアイデンティティを決定した。典型的な結果を図１７に示す。

実験例１６
カバリングプローブのプーリング
指定多型を分析するために、３０〜５０％のＧ＋Ｃ塩基組成の２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド伸長プローブを３’末端に変化サイト（Ｇ／Ｔ）を含むように設計して、指定多型サイトに整列させた。二つの非指定サイトが、位置１０（Ｃ／Ａ）および１５（Ｔ／Ｇ）に期待された。設計の概要は以下の通りである。

プローブのすべてをプールして、上述の実験例のプロトコルを用いてシングルタイプのカラー符号化したビーズに付着させた。シングルストランドのターゲットを加えてプールしたプローブを表示するビーズに付着させるときに、プローブの一つが、指定多型に完全に整列する長い伸長生成物を生成する。

実験例１７
異型接合および同型接合形状における指定多型
異型接合と同型接合形状を区別するべく、上述の実験例の設計を増大させて、第２のプローブセットを含み、プローブの３’末端に整列したＣ／Ａ指定多型の同定を行って、異型接合変異対同型接合変異を得た。

上述の実験例にあるように、二つの非指定多型サイトが、位置１０（Ｃ／Ａ）および１５（Ｔ／Ｇ）に期待される。設計の概要は以下のとおりである。

セット＃１からのオリゴヌクレオチドをプールして、上述の実験例のプロトコルを用いてシングルタイプのカラーコード化ビーズ（例えば、グリーン）に付着させる。セット＃２からのオリゴヌクレオチドを、プールして、上述の実験例のプロトコルを用いて第２タイプのカラーコード化ビーズ（例えば、オレンジ）に付着させる。ビーズをプールし、前述したとおりチップ表面に固定した。次いで、ターゲットを導入して、上述の実験例で述べたとおり、オン−チップ反応を実行した。グリーンのビーズ上のプローブのみが伸長すると、その固体は通常（またはワイルドタイプ）の対立遺伝子を有する。グリーンのビーズとオレンジのビーズのプローブが伸長すれば、その固体はその対立遺伝子に対して異型接合である。この設計は、既知及び未知の変位の同定に使用される。

実験例１８
確認シーケンシング（再シーケンシング）
本発明の設計は、特定の分野の再シーケンシングに使用することができる。このテストは、ＣＦ変位パネルにおけるＩ５０６Ｖ、Ｉ５０７Ｖ、Ｆ５０８Ｃおよび７Ｔ用の反射テストのように、オン−チッププローブ伸長反応に確認が必要な場合に使用することができる。問題となるシーケンスは、ここでは２０〜３０塩基長で、すべての変化サイトの複合尋問によってオン−チップでシーケンスされる。これは不明瞭な位置に特定プローブを設計すること、および実験例１６及び１７に述べたプローブプーリングによって行われる。

実験例１９
一のラベルｄＮＴＰおよび三つの無ラベルｄＮＴＰｓ
少なくとも一のラベルｄＮＴＰを取り入れることによって、すべての伸長生成物がリアルタイムで検出され、そのコード化した固相キャリアとの関連によって同定される。実験例６及び７で述べたアッセイ条件を用いて、テトラメチリルホダミン−６−ｄＣＴＰと無ラベルｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰが、伸長反応に与えられ、図１８に示す蛍光ラベル伸長生成物を生成する。ｄＮＴＰｓのその他の染色ラベル（ＢＯＤＩＰＹ−ラベル化ｄＵＴＰおよびＣｙ５−ラベル化ｄＵＴＰにおける）が使用される。同様に、他のどのようなラベル化ｄＮＴＰも使用することができる。伸長生成物の長さは、ＤＮＡポリメラーゼによって許容されるラベル化ｄＮＴＰの量に依存する。入手可能な酵素は、一般に、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどのストランド変形成分用により高い許容誤差を示す。ビオチンまたはジゴキシゲニンは、次いで、第２ステップに置いてラベルアビジンまたは抗体と反応して、間接的に伸長生成物のラベリングを行う。これらの小さな分子を使用する場合に、何百もの塩基長を測定する伸長生成物が生成される。

実験例２０
一のラベルｄｄＮＴＰ、３つの無ラベルｄＮＴＰｓを用いた延長
ＴＡＭＲＡ−ラベル化ｄｄＣＴＰを取り入れて、図１９に示すとおり、延長反応を終了する。ＴＡＭＲＡ−ラベル化ｄｄＣＴＰを用いたオン−チップ反応を、実験例６および７に記載されているように実行した。ＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰと、無ラベルｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを含む反応混合液においては、マッチングするプローブへのターゲットのアニーリングに続いて、第１ｄｄＣＴＰの取り入れが終ると、延長反応が終了する。これは、大変早い塩基の取り入れを伴って生じ、シングル塩基延長生成物を生成するか、あるいは、いくつもの無ラベルｄＮＴＰｓを取り入れた後に生じる。

実験例２１
４つの無ラベルｄＮＴＰｓを伴う伸長、ハイブリダイゼーションによるラベルプローブの検出
プローブは、４つの型の非ラベルｄＮＴＰｓフルセットを用いて伸長し、このようなプリメラーゼに対して「自然な」条件下では、アニールテンプレートの長さ、及びオン−チップ反応条件によってのみ制限され、何百もの塩基長を測定する伸長生成物を生成する。この伸長生成物は、高温での変性に続いて、第２ステップにおいて、ラベルオリゴヌクレオチドプローブを伴うハイブリダイゼーションによって検出される。このプローブのシーケンスは、伸長生成物の一部に相補になるように設計される。このプロセスを図２０に示す。

実験例２２
４つの無ラベルｄＮＴＰｓを伴う伸長、ラベルテンプレートを介しての検出
複合ハイブリダイゼーションアッセイにおけるルーチン使用の標準プロトコルによって、分析すべきＤＮＡターゲット自体に、ラベルプローブの取り入れによってＰＣＲにおいて、ラベルが付される。実験例６および７に記載されているような条件下で、ラベルターゲットがプローブにアニールされる。マッチングプローブは、無ラベルｄＮＴＰｓを用いて伸長される。伸長反応の終了に続いて、温度（Ｔ_ｄｅｔ）をターゲットと非マッチプローブとの複合体の融点（Ｔ_{ｎｏｎ−ｍａｔｃｈ}）以上で、ターゲットとマッチ、すなわち、伸長したプローブとの複合体の融点（Ｔ_{ｍａｔｃｈ}）以下、の値にセットすることによって、検出が行われる。後者の複合体は、デュプレックス領域を表示するものであり、前者より有意に安定しており、従って（Ｔ_{ｎｏｎ−ｍａｔｃｈ}）＜Ｔ＜（Ｔ_{ｍａｔｃｈ}）となる。Ｔの典型的な値は、７０〜８０℃の範囲にある。これらの条件下で、ターゲット及び伸長プローブによって形成される複合体のみが安定となり、ターゲットと非マッチングプローブで形成される複合体、従って、対応する固相キャリアからの蛍光信号は、消えてしまう。すなわち、他のデザインとは対照的に、マッチングプローブに関連する強度の増加というよりは、検出される非マッチングプローブに関連する信号強度の減少である。図２１は、ラベルｄＮＴＰｓあるいはｄｄＮＴＰｓの必要を少なくするデザインを示す図である。これは、ラベルｄＮＴＰｓあるいはｄｄＮＴＰｓが特別ではなくコード化した粒子を吸収することができ、これによって、信号のバックグラウンドが増加し、アッセイの識別力が減少し、本発明の好ましい実施例において有益である。更に、ラベルターゲットを用いることによって、このプロトコルは、シーケンス特定オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる多型分析方法と直接的にコンパチブルになる。

実験例２３
リアルタイムのオン−チップ信号増幅
図２２に示すような平坦なジオメトリで用いられている標準温度制御装置は、プログラムした温度プロファイルをＳＳＰｓの複合延長に適用することができる。実験例６および７の条件下で、複数回繰り返される「変性−アニール−延長」サイクルのそれぞれにおいて、所定のテンプレートが一のプローブの伸長を行う。第１サイクルでは、ターゲット分子が、プローブに結合して、このプローブが伸長または延長される。次のサイクルでは、ターゲット分子は、「変性」相において（典型的な温度が９５℃）第１プローブから離れ、次いで、「アニール」相において（典型的な温度が５５℃）他のプローブ分子にアニールし、「延長」相において（典型的な温度が７２℃）そのプローブの延長を行う。Ｎサイクル中に、リニア増幅に対応するプロトコルを用いて（図３０）、各テンプレートがＮ個のプローブの延長を行う。本発明の好ましい実施例では、コード化したビーズのプラナアレイが、複合延長反応でプローブを表示するために使用されており、一連の温度サイクルが、二つの平坦で平行な基体間に含まれる反応混合液に適用される。一の基体は、直接的な光学アクセスと、コード化したビーズの全アレイの直接的な撮像を可能とする。好ましい実施例は、各サイクルの完了と同時に記録される全ビーズアレイの画像を撮影することによってリアルタイムの増幅を提供する。

ゲノムの、ミトコンドリアＤＮＡあるいは他の濃縮ＤＮＡは、シーケンス特定増幅を行わないオン−チップリニア増幅を用いた直接的な検出に使用することができる。これは、検出に十分な量のＤＮＡがサンプル内にある場合に可能である。ビーズアレイフォーマットで、各ビーズからの信号検出に１０^４のフルオロフォアが必要であれば、３０サイクルのリニア増幅によって、必要な数は〜３００以下に減少する。アレイ内で１００ビーズの必要なタイプを使用すると、必要なフルオロフォアの総数は〜１０^５になり、この数は臨床サンプル内で入手可能である。例えば、ＨＬＡの臨床分子タイピング用の典型的なＰＣＲ反応は、０．１〜１μｇのゲノムＤＮＡを用いて行われる。１μｇのヒトのゲノムＤＮＡは、約１０^−１８モルに対応し、従って、関心のある遺伝子の６ｘ１０^５コピイに対応する。最小化したビーズアレイプラットフォームとオン−チップ増幅に必要とされるこの少量のサンプルは、プレＰＣＲサンプルｗｐ直接的に使用できるようにする。このことは、サンプルの準備を簡略にするばかりではなく、もっとも重要なことは、複合ＰＣＲの複雑性を少なくして、複合遺伝子分析の発達におけるレート限定ステップを頻繁に減らすことである。

実験例２４
ＣＦ変異分析用の指定及び非選択多型用のプローブライブラリ構造
伸長プローブの特異性を増加させ、擬陽性を防ぐために、伸長プローブは、ターゲットシーケンスに存在するすべての既知の多型を受け入れるように設計した。更に、ＰＣＲプライマは、指定及び非指定多型を考慮して設計した。

嚢胞性繊維症用の標準集団キャリアスクリーニングパネル内の２５の変異の一つである、ＣＦＴＲ遺伝子内のエキソン７上のＲ３４７Ｐの位置１１７２.でのＧ／Ｃ変異を、指定多型として選択した。一般的な集団キャリアスクリーニング用の変異パネルに含まれているエキソン７内には３つのＣＦ変異がある（http://www.faseb.org/genetics/acmg)。同じサイトで多型Ｇ／Ｔ／Ａが報告されており、（http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr) 、更に、非指定多型が、位置１１７５、１１７９、１１８６、１１８７および１１８９に報告されている。これらの多型はすべて、所望のプローブの伸長を阻害しうる。

多くの指定多型に囲まれ、大文字で表示されているＲ３４７Ｐ（太字のＧで表示されている）用の、ｅＭＡＰ用の変性プローブセットの構造を下記に示す。

ここで、Ｎ＝ａ，ｃ，ｇまたはｔ；Ｒ（ｐｕＲｉｎｅｓ）＝ａまたはｇ；およびＹ（pYrimidines）＝ｃまたはｔ、であり、セットに付き１２８の変性を伴う。

変性分析のためのプライマプーリング
変性セット構造の主な目的は、プローブのアニーリングと伸長を確実にするのに十分に近いターゲットシーケンスにマッチする少なくとも一のプローブシーケンスを提供することである。カバリングセット構成の好ましいモードにあるように、これは、指定多型に関連する可能なプローブシーケンス全セットを提供することによって常に達成しうる一方、このセットの変性の度合い、実験例では１２８は、すべてのプローブが完全なプローブプーリング用のシングルビーズタイプ上に位置していれば、アッセイ信号強度に２桁の減少をもたらす。分離したプールは、複合ビーズタイプ以上のプローブセットを配分することによって状態を改善するかも知れないが、アレイの複雑性が犠牲になることになる。

まず、プローブプールを、最小の２又はそれ以上のプールに分けた。指定多型サイトの各々の可能な組成に対して、各プールがプローブ位置Ｍ（すなわち、プローブの３’末端）に相補位置を提供するようにした。実施例では、特定ターゲット組成のポジティブな同定に４つのプールが必要である。次いで、指定サイトからの距離の順に非指定多型サイトを順次調べた。

この間に、伸長を確実にするためには、ＴＥＩ領域内の位置が特に重要である。すなわち、各プールは、ＴＥＩ領域内にある非指定サイトに対してすべての可能なプローブ組成を含むように構成されている。最後に、変化する遺伝子のクローニング及びシーケンシング用の変性プローブの構成について、ターゲット内のＧに並置されないとわかっていれば、ＴＥＩ領域外に位置するこれらのプローブ位置にイノシンなどの中性塩基を位置させることによって、上記セットの変性が最小限になる。実験例では、プローブ位置Ｍ−１６およびＭ−１８中の非指定多型が行う。すなわち、４つのプールの各々の最小変性が４つに増えて、これに対応して信号強度が減少する。実験ガイドラインとして、信号の減少は、好ましくは、８つのファクタに限定されるであろう。

全体で、４つのプールの各々が独自に一のビーズタイプに割り振られ、８つの変性プローブシーケンスを含み、ターゲットシーケンスをカバーする。これらのシーケンスは、Ｍで変化するプールの下記に示すシーケンスの類似体である。

一般的に、アンチセンスストランド上の非指定多型型は、センスストランド上のそれと異なることがある。また、これはアンチセンスストランド用の変性プローブセットを構成するのに有利になる。変性伸長プローブの構造のように、変性ハイブリダイゼーションプローブセットは、類似体ルールによって構成され、変性を最小にすることがある。

実験例２５
ｅＭＡＰによる「シングルチューブ」ＣＦ変位の分析
この実験例は、ｅＭＡＰアッセイを実行する方法および組成に関する。ここでは、アニーリングおよび伸長ステップが反応液内で生じる。この実施例は、純化あるいは抽出手順と、リアクタ間でのサンプル移動の必要性が不要となり、したがって、アッセイを単純化し、エラー発生の可能性を減少させるため、有益である。限定されない典型的なプロトコルは以下の通りである。

何人かの患者から抽出したゲノムＤＮＡを、複合ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）反応で、対応するプライマで増幅した。ＰＣＲ条件及び試薬の組成は、以下の通りである。

プライマデザイン
センスプライマを、変形することなく、また、アンチセンスプライマなしで、５’末端において、「ホスフェート」と合成した。複合ＰＣＲを、二つのグループで実行した。グループ１の増幅は、エキソン５，７，９，１２，１３，１４Ｂ、１６，１８，および１９を含む。グループ２の増幅は、エキソン３，４，１０，１１，２０，２１およびイントロン１９に対するプライマを含む。エキソン５、７、および１１上の５’ホスフェートグループの変形が、プローブ伸長用のアンチセンスターゲットを使用するフォーワードプライマ上に含まれていた。センスターゲットを、ホスフェートグループをリバースプライマ上に位置させて、他のすべてのアンプリコンについて使用した。

ＰＣＲマスターミックス組成

反応の大きさは、実験の必要に応じて調整することができる。増幅は、Perkin Ekner 9600熱サイクラを用いて行う。最適なプライマ濃度を、各プライマ対について決定した。増幅に続いて、５μｌの生成物を電気泳動用に取り分けた。シングルストランドＤＮＡターゲットを以下のようにして生成した。２マイクロリットルのエクソヌクレーゼを、５μｌのＰＣＲ生成物に加え、３７℃で１５分間インキュベートし、酵素を８０℃で１５分間変性させた。変性後に、１μｌの１０Ｘエクソヌクレーゼバッファを１μｌのλエクソヌクレーゼ（５Ｕ／μｌ）と共に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。７５℃で１０分間加熱して反応を止めた。

オンチップ伸長
２６ＣＦ変性用のワイルドタイプの変性プローブを、ビーズ表面に相引させて、チップアレイ上に構築した。このプローブも二組に分けた。第３グループを５Ｔ／７Ｔ／９Ｔ多型を含む反射テスト用にアッセンブルした。

伸長反応バッファを、ユニプレックスおよび／またはマルチプレックスターゲット伸長アッセイに使用するべく最適化した。これは、Tris-HCL(pH8.5)1.2mM, EDTA 1uM, DTT 10μM, KCL 1μM, MgCl₂ 13μM, 2-メルカプトエタノール10μM, グリセロール１０．５％、Tween-20 0.05%, 及びNonidet 0.05%からなる。ラベルｄＮＴＰの1X反応バッファ0.1μM, 1.0μMのｄＮＴＰｓ混合液、３ＵのＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌ（〜５ｎｇ）のターゲットＤＮＡ（患者サンプル）を含む伸長反応混合液１０μｌを、各チップに加えた。反応混合液を、チップ表面に加え、５３℃で１５分間、次いで６０℃で３分間インキュベートした。チップを．０１％のＳＤＳを含む洗浄バッファで洗浄し、清潔なカバースリップで覆い、Bioarray Solutions 撮像システムを用いて分析した。画像を分析して、各伸長プローブのアイデンティティを決定した。

実験例２６
ＣＦ変異分析−シングルチューブシングルチップ−ワンステップ伸長
２６ＣＦ変異および制御用プローブを、５１タイプのビーズ表面に相引した。プローブが相引したビーズを、シングルチップ表面上でアッセンブルした。ゲノムＤＮＡを何人かの患者から抽出して、上述の実験例で述べたように、複合ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）反応で対応するプライマを用いて増幅した。増幅に続いて、シングルストランドのＤＮＡ生成物を、λエクソヌクラーゼを用いて生成した。シングルあるいはプールしたＰＣＲ生成物（〜５ｎｇ）を、反応バッファ、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）類似体（ＮＥＮ Life Sciences）、各タイプの無ラベルｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech, NJ)を含む反応混合液に加えた。アニーリング／伸長反応を、温度制御サイクラ内で行った。温度ステップは、５３℃で２０分、６０℃で３分とした。ビーズアレイを０．０１％のＳＤＳを含むｄｓＨ_２Ｏで５〜１５分間洗浄した。アレイ内の各ビーズからの蛍光信号を含むイメージを、蛍光顕微鏡とＣＣＤカメラを用いて記録した。画像を分析して、伸長プローブの各々のアイデンティティを決定した。

実験例２７
ｅＭＡＰによる３またはそれ以上の塩基欠失及び／又は挿入の同定
伸長を用いて、３以上の塩基の欠失及び／又は挿入を伴う変異を分析した。プローブを、３’末端の前に変異塩基３−５を位置させるように設計した。ワイルドタイプのプローブを、変異塩基を含むあるいは含まない（変異以前に終了）ように設計した。以下は、ＡＴＣＴＣの欠失及び／又はＡＧＧＴＡの挿入によって生じる変異の例である。プローブデザインは以下の通りである。

ワイルドタイプのプローブを、別々にコード化したビーズの表面上に相引する、あるいは、本発明で述べたようにプールした。変異１（Ｍ１：削除）および変異２（Ｍ２：挿入）用のプローブを、別々のビーズに相引した。両方のワイルドタイププローブは同じ情報を提供するが、変異プローブは、特定のサンプル中で同定された変異型を示すことができる。

実験例２８
ヘアピンプローブ
本発明のある実施例において、プライミングプローブを表わすビーズはヘアピン構造をしている。ヘアピン構造は、図２３に示すように、ＴＥＩ領域とＤＡシーケンスに相補である５’末端においてシーケンス断片を含んでいることがある。競合的ハイブリダイゼーション反応の間、ＤＡ領域が優先的にターゲットシーケンスとハイブリダイズするときは、このヘアピン構造は常に開放されている。この状態の下、ＴＥＩ領域が指定多型サイトに整列し、伸長反応が生じる。この反応の競合的な特徴を、プローブの誤差レベルの調整に使用することができる。

実験例２９
カスタムビーズアレイ上に表わされた対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドの複合伸長による嚢胞性繊維症およびアシュケナージジューイッシュ病変異の分析
変異のスループットの高い複合分析用の新規なアッセイを、嚢胞性繊維症変異のＡＣＭＧ＋パネルにおいて評価した。さらに、アシュケナージジューイッシュ病パネルを発展させて、テイ−サックス病、キャナヴァン病、ゴシェ病、ニーマン−ピック病、ブルーム症候群、ファンコニー貧血、家族性自律神経障害、及びムコリピドーシスIVを引き起こす事が知られている通常の変異を検出した。

伸長による多型の複合分析（ｅＭＡＰ）においては、可変３’末端シーケンスを含む対立遺伝子特定オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、シリコンチップ上にアレイを形成するカラー符号化ビーズに付着する。通常および変異シーケンスの伸長生成物は、全アレイからの蛍光信号を簡易撮像することによって同時に検出できる。

本実験例では、何百もの臨床患者サンプルを用いてＡＣＭＧＣＦビーズチップを評価した。図２４に示すように、アッセイは標準ＤＮＡ分析で同定された全ての変異を正確に記録した。

要約すると、カスタマイズされたビーズを含む複合伸長アッセイを用いて、ＡＣＭＧ＋およびアシュケナージ病パネルに対応する変異を検証した。カスタマイズしたビーズは、ＤＮＡおよびプロテインの分析に使用することができる。これらのカスタマイズしたビーズの使用は、（１）撮像容易性−アッセイのターンアラウンド時間が２時間以内である、（２）自動化したイメージ取得及び分析、（３）ミニアチュライゼーション、すなわち試薬消費量が少ない、及び（４）ウエファ技術を用いてビーズチップを合成しており、したがって、必要に応じて、何百万ものチップを大量生産することができる、などの理由で有益である。

図１ａは、ＨＬＡ−ＤＲの指定サイトを尋問するべく設計されたプローブセットおよびその内部制御を示す図である。 図１ｂは、付着プライマのデザインを示す図である。 図２は、許容効果に基づく対立遺伝子の結合パターンの変形例を示す図である。 図３は、固定シーケンスと多型検出シーケンスを分離するリンクしたプライマ構造の使用を示す図である。 図４は、対立遺伝子の組み合わせによる対立遺伝子同定のシミュレートしたアンビギュイティを示す図である。 図５は、対立遺伝子の組み合わせから生じる対立遺伝子の同定におけるアンビギュイティを減少させる方法を示す図である。 図６は、ハイブリダイゼーションと伸長の組み合わせを示す図である。 図７は、ターゲットとして合成オリゴヌクレオチドを使用したモデル反応を示す図である。 図８は、ｅＭＡＰフォーマットにおける実際の患者サンプルテストを使用して得た結果を示す図である。 図９は、ＤＲ遺伝子座についてｅＭＡＰプライマ延長から得た結果を示す図である。 図１０は、ＤＲ遺伝子座についてｅＭＡＰから得た結果を示す図である。 図１１は、Ａ遺伝子座エキソン３についてｅＭＡＰから得た結果を示す図である。 図１２は、Ａ遺伝子座エキソン３についてｅＭＡＰＳＳＰから得た結果を示す図であり、非指定多型についての許容範囲の例を示す図である。 図１３は、変形可能な変異サイトのビーズに固定したプローブ伸長を示す図である。 図１４は、ビーズ表面に固定したプライマを使用したＰＣＲを示す図である。 図１５は、組み合わせたＰＣＲ生成物を使用した複合プローブの伸長を示す図である。 図１６は、複合ＣＦ変異体のプローブ伸長についての結果を示す図であり、図１６ａは、合成ターゲットを使用したプローブ伸長を示す図、図１６ｂは、ＰＣＲ反応においてビーズを使用したプローブ伸長を示す図である。 図１７は、温度制御サイクリング結果を伴う一ステップの伸長を示す図である。 図１８は、ラベルを付したｄＮＴＰと、ラベルを付していない他の三つのｄＮＴＰｓを伴うプライマ伸長を示す図である。 図１９は、ラベルを付したｄｄＮＴＰと、ラベルを付していない他の三つのｄＮＴＰｓを伴うプライマ伸長を示す図である。 図２０は、プライマ伸長を示す図であり、ラベルを付していない四つのｄＮＴＰｓを使用して伸長を行い、生成物をラベルを付した延長アンラベル生成物をハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブによって検出する。 図２１は、ラベルを付したターゲットと、ラベルを付していない四つのｄＮＴＰｓを加えたプライマ延長を示す図である。この図は、チップに高温を当てたときに、延長した生成物を伴うラベルを付したターゲットのみがビーズと共に保持され得ることを示す。 図２２は、シーケンス特定プローブが固定されている、リニア増幅を示す図である。 図２３は、ヘアピンプローブの利用を示す図である。 図２４は、嚢胞性繊維症と、アシュケナージユダヤ病変異の分析に本発明を適用した例を示す図である。

Claims (3)

1. 患者のゲノム中の多型サイトをプローブ伸長によって分析する方法であって、
   異なるプローブのセットを提供し、あるセット中の前記プローブは、１又はそれ以上のアンプリコンにアニーリング可能であり、前記アンプリコンは、ポリメラーゼ鎖反応を用いてゲノム領域を増幅させることによって生成され、さらに、前記プローブの３’末端のヌクレオチドがアンプリコン中の並んだヌクレオチドと相補性があって、アニーリングした場合に、前記プローブは検出可能にラベルされたヌクレオチドで伸長可能であり、前記プローブは、並んだヌクレオチドがゲノム中の１つの多型サイトのヌクレオチドと同一であるか、または相補性があるように設計され、
   アンプリコンの各セットを指定し、前記多型サイトのプローブ伸長によって分析されるセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方の鎖が、特定の前記プローブの３’末端の３つのヌクレオチドに並ぶ、３’末端の３つのヌクレオチドの相補性が大きい方の鎖に対応し、かつ、前記特定のプローブの３’末端の３つのヌクレオチドは、前記プローブが前記相補性が大きい方の鎖にアニーリングした後に伸長するように設計され、
   前記異なるプローブのセットのどのプローブタイプが伸長され、前記異なるプローブのセットのどのプローブタイプが伸長されなかったかを検出するために、前記プローブタイプと符号化されたビーズとが対応するように、異なるプローブタイプを符号化されたビーズに結合させる
   ことを特徴とする方法。
2. 異なるように符号化されたビーズが異なる光学信号を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記符号化が色によることを特徴とする請求項１に記載の方法。

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