JPWO2005090565A1 - Dnaアレイと一塩基多型の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
このような一塩基の変異は、例えばコドン変異による変異アミノ酸の合成(ミスセンス変異)や終止コドンの生成による不完全タンパク質の合成(ナンセンス変異)を生じさせる場合がある。従って、SNPの有無が様々な疾病にも関連することが明らかになりつつあり(例えば肺癌に関するp53遺伝子のSNP:非特許文献1)、診断や遺伝的治療法等を目的としてSNPの有無を正確に判定すること(SNPタイピング)の重要性が強く認識されてきている。また、このSNPは疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーでもあり、テーラーメイド医療のための重要な遺伝子情報としても注目されている。
SNPタイピングの方法としては、「ハイブリダイゼーション効率を利用した方法」、「酵素認識効率を利用した方法」、「電気的手法を利用した方法」等が知られているが、特にハイブリダイゼーション効率を利用した方法は、DNAアレイ(例えば特許文献1−4、非特許文献2、3参照)への適用が様々に検討されており、例えば非特許文献4にはDNAアレイを用いたBRCA1遺伝子SNPの検出例が報告されている。
このSNP検出用のDNAアレイは、例えば、標的遺伝子の野性型配列に相補的な第1プローブスポットと、その遺伝子の一塩基多型配列に相補的な第2プローブスポットとを固相基体上に配置している。そして、SNPの検出に当たっては、蛍光標識プライマーを用いたPCR増幅等の手段によって調製された標的遺伝子cDNAをこのDNAアレイに接触させる。標的遺伝子が野性型の場合、その標識cDNAは第1プローブにハイブリダイズし、第1プローブのスポットからのみ蛍光シグナルが得られる(ホモ接合型野性型形態)。一方、標的遺伝子の両方の対立遺伝子がSNPの場合には、第2プローブスポットのみから蛍光シグナルが得られ(ホモ接合型SNP形態)、一方の対立遺伝子がSNPの場合には、第1プローブスポットと第2プローブスポットとの両方に同程度の蛍光シグナルがえられる(ヘテロ接合型SNP形態)。
そこでこの出願の発明は、より正確なSNP検出を可能とするDNAアレイと、このDNAアレイを用いたSNP検出方法を提供することを課題としている。
さらにこの出願の発明は、DNAアレイを用いたSNP検出において、より正確な検出を可能とするプローブ長を決定する方法と、この方法により決定された特定長のプローブを備えたDNAアレイを提供することを課題としている。
この出願の発明者らは、SNP検出の対象となる被験遺伝子毎に、SNP形態を正確に判定するための最適標識シグナルを得ることのできるプローブ長が異なることを見出してこの発明を完成させた。
この出願は、前記の課題を解決するための第1の発明として、遺伝子の一塩基多型を検出するためのDNAアレイであって、遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が遺伝子の第1の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第1のプローブスポット群と、同配列部分が遺伝子の第2の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第2のプローブスポット群とを固相基体上に有し、第1プローブスポット群と第2プローブスポット群のそれぞれを構成するプローブスポットは、プローブスポット毎にプローブの長さが異なる、ことを特徴とするDNAアレイを提供する。
この第1発明のDNAアレイにおいては、第1プローブスポット群と第2プローブスポット群は、それぞれ、2〜10のプローブスポットからなることを好ましい態様としている。
またこの第1発明の前記態様においては、2〜10のプローブスポットが、そのプローブの長さの順に配置されていることを好ましい態様としている。
この出願は、第2の発明として、前記第1発明のDNAアレイを少なくとも含む、遺伝子の一塩基多型を検出するためのキットを提供する。
この出願は、第3の発明として、前記第1発明のDNAアレイを用いて遺伝子の一塩基多型を検出する方法であって、以下のステップ:
(a) 被験遺伝子から、標識ポリヌクレオチドを調製するステップ;
(b) 標識ポリヌクレオチドをプローブ付固相基体に接触させるステップ;
(c) DNAアレイ上のプローブにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドより得られるシグナルを測定するステップ;
を含むことを特徴とする一塩基多型の検出方法を提供する。
この第3発明の方法においては、前記ステップ(c)において測定された、前記第1のプローブスポット群と前記第2のプローブスポット群のそれぞれのシグナルを比較することをさらに好ましい態様としている。
この出願は、第4の発明として、前記第1発明のDNAアレイを用いて、遺伝子の一塩基多型を検出するための適切なプローブ長を決定する方法であって、以下のステップ:
(a) 被験遺伝子から、標識ポリヌクレオチドを調製するステップ;
(b) 標識ポリヌクレオチドをDNAアレイに接触させるステップ;
(c) DNAアレイ上の各プローブに結合した標識ポリヌクレオチドの標識シグナルを測定し、
以下の基準:
(i) 被験遺伝子がホモ接合性第1多型形態の場合に第1のプローブスポット群に標識シグナルが観察されること、
(ii) 被験遺伝子がホモ接合性第2多型形態の場合に第2のプローブスポット群に標識シグナルが観察されること、
(iii) 被験遺伝子がヘテロ接合性多型形態の場合に第1のプローブスポット群と第2のプローブスポット群とに同程度の標識シグナルが観察されること、
を満たすプローブスポットのプローブ長を、その遺伝子の一塩基多型を検出するための適切なプローブ長と決定することを特徴とする方法を提供する。
さらにこの出願は、第5の発明として、遺伝子の一塩基多型を検出するためのDNAアレイであって、遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が遺伝子の第1の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第1のプローブスポットと、同配列部分が遺伝子の第2の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第2のプローブスポットとを固相基体上に有し、第1および第2のプローブスポットを構成するプローブ長が、前記第4発明の方法で決定された長さであるDNAアレイを提供する。
第1発明のDNAアレイは、様々な1塩基多型形態に対してより正確にハイブリダイズすることのできる様々なプローブ長からなるプローブスポットを備えている。従って、この第1発明のDNAアレイを用いた第3発明の方法によって、より正確なSNP検出が可能となる。
また第4発明の方法によって、SNP検出の対象となる遺伝子毎に適切なプローブ長が決定される。そして、この方法によって、各遺伝子のSNP検出に適したプローブ長からなるプローブスポットを含む第5発明のDNAアレイが提供される。
なおこの出願の発明において、「一塩基多型」とは例えば遺伝子データベース等に登録された遺伝子配列とは異なる一塩基変異を有する場合を言う。従って、データベース等に登録された遺伝子配列が必ずしも野性型(正常型)を意味するわけではなく、また一塩基変異を有する遺伝子が変異遺伝子であるわけでもない。ただし、一塩基の変異が疾患等に関連することが知られている遺伝子については、野性型を「正常型」、一塩基多型を「変異型」と定義することもできる。この出願の発明においては、従って、遺伝子の「第1の多型形熊」と「第2の多型形態」とは、基本的に「野性型」および「変異型」を意味するものではなく、以下の説明では、第1の多型形態はデータベース等に登録されている遺伝子配列の形態、第2の多型形態は第1多型形態の配列中の一塩基が他の塩基に置換した配列からなる形態と定義する。
この出願の発明における「遺伝子ポリヌクレオチド」とは、具体的には、SNP検出の対象となる遺伝子のゲノムDNA、ゲノムDNAから転写されたmRNA、またはmRNAから合成されたcDNAを意味する。またこのポリヌクレオチドは、複数のヌクレオチド、好ましくは30以上、より好ましくは50以上のヌクレオチドが結合した分子である。
この出願の各発明における具体的構成は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく説明する。またこの発明に係る用語や概念は、特別に規定したものを除き、当該技術分野において通常使用されている範囲のものである。さらにこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis,in Molecular Cloning−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989;Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y,1995等に記載されている。
図2はこの発明のDNAアレイの別の構成例を示した模式図である。
図3は、この発明のDNAアレイを用いて遺伝子GNB3のSNPを検出した例を示した蛍光画像である。
図4は、この発明のDNAアレイを用いて遺伝子MTHFRのSNPを検出した例を示した蛍光画像である。
図5は、この発明のDNAアレイを用いて遺伝子CYP 2C19−2およびCYP2C19−3のそれぞれのSNPを検出した例を示した蛍光画像である。
さらに詳しくは、「プローブスポット」とは、1以上、好ましくは103〜1013個の同一プローブ(同一配列、同一長のプローブ)の集団が他のプローブスポットと分離されて存在する領域を言う。「プローブスポット群」とは、同一配列で、かつ長さの異なるプローブからなるプローブスポットの集団を意味する。この集団は、一つの好ましい態様として、2〜10のプローブスポットからなる集団である。またこれらのプローブスポットは、それを構成するプローブの長さの順に整列配置されていることを好ましい態様としている。以下、このように整列配置されているプローブスポット群を「プローブスポット列」と記載することがある。さらに、第1プローブスポット列と第2プローブスポット列は、互いに同一プローブ長からなるプローブスポットが相対向してもよい。
図1は、第1発明のDNAアレイの構成例である。この第1図の例では、第1プローブスポット(黒丸)の列と、第2プローブスポット(白丸)の列は、それぞれ8個のプローブスポットによって構成されている。また、各プローブスポットは、それぞれに含まれるプローブが長→短の順に1〜8段目までに整列配置されている。すなわち、第1段目の第1プローブスポット列と第2プローブスポット列のそれぞれを構成するプローブはn個のヌクレオチドであり(nmer)、以下第2段目スポットのプローブから順に、n−1 mer、n−2 mer、n−3mer、n−4 mer、n−5 mer、n−6 mer、n−7 merである。この場合の「n」は10〜100程度、好ましくは20〜50程度である。
「長さの順番」は長→短の順番であってもよく、短→長の順番であってもよい。また、プローブ長の違いは1塩基づつの違いでもよく、あるいは2または3塩基づつの違いであってもよい。さらに、この図1の例では第1プローブスポット列と第2プローブスポット列のそれぞれのスポットを縦方向(上から下)に配置しているが、横方向(右から左)に配置してもよい。
さらにまた、同一プローブ(同一配列、同一長のプローブ)からなるプローブスポット2〜5個程度を整列配置するようにしてもよい。例えば、図2は、第1プローブスポット列と第2プローブスポット列の各段には、同一プローブからなる3個のプローブスポットがそれぞれ並列配置されている。すなわち、同一プローブからなる複数個のプローブスポットの存在によって、個々のプローブスポットに含まれるプローブ数に若干の変動による影響を排除することができる。
第1発明のDNAアレイは、以上のとおりのプローブスポット群(好ましくはプローブスポット列)を配置することを除き、通常のDNAアレイと同様にして作製することができる。DNAアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接プローブを合成する方法(オン・チップ法)と、予め調製したプローブを固相基体表面に固定する方法とが知られているが、この発明のDNAアレイは後者の方法で作製することが好ましい。予め調製したプローブを固相基体表面に固定する場合には、官能基を導入したプローブを合成し、表面処理した固相基体表面にプローブを点着し、共有結合させる(例えば、Lamture,J.B.et al.Nucl.Acids Res.22:2121−2125,1994;Guo,Z.et al.Nucl.Acids Res.22:5456−5465,1994)。プローブは、一般的には、表面処理した固相基体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこにプローブを共有結合させる方法(Yershov,G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4913,1996)、あるいはポリL−リジンを被覆した固相基体にプローブを結合する方法(特開2001−186880号公報)も知られている。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化プローブを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている(Sosnowski,R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:1119−1123,1997)。この発明のDNAアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。また、プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式(例えば米国特許第5,807,5223号)によって行うこともできるが、特開2001−116750号公報や特開2001−186881号公報に開示されているインクジェット方式を採用することが、均一で一定形状のスポット形成のために好ましい。また、このインクジェット方式では、個々のプローブスポットに含まれるプローブ数を等しくすることができるため、プローブ長の違いによるハイブリダイゼーションの違いを正確に測定することができる。さらに、特開2001−186880号公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うこと、あるいはWO 03/038089 A1号パンフレットに開示された組成からなるプローブ溶液(保湿性物質を含む溶液)を使用することも、好ましいスポット形成のために推奨される。
スポッティングの後は、冷却、スポットに対する水分付加(湿度〜80%程度に一定時間保持)、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定するし、DNAアレイを完成することができる。
なお、DNAアレイの固相基体は、通常のDNAアレイに使用されるガラス(スライドガラス)の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用することもできる。
第2発明は、前記のDNAアレイを含むことを特徴とする一塩基多型検出用のキットである。このキットは、例えば、DNAアレイ、プライマー、PCR緩衝液、dNTP、MgCl2、Taq DNAポリメラーゼ等によって構成することができる。
第3発明の方法は、前記第1発明のDNAアレイを用いて遺伝子の一塩基多型を検出する方法であって、以下のステップを必須として含むことを特徴としている。
(a) 被験遺伝子から、標識ポリヌクレオチドを調製するステップ。
(b) 標識ポリヌクレオチドをプローブ付固相基体に接触させるステップ。
(c) DNAアレイ上のプローブにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドより得られるシグナルを測定するステップ。
ステップ(a)における被験遺伝子は、SNPの存在が知られている遺伝子であり、その標識ポリヌクレオチドは、例えば既存のSNPデータベース(例えばhttp://SNP.ims.u−tokyo.ac.jp/index_ja.html)等で公開されているプライマーセットを用いて、被験者から単離したゲノム遺伝子またはトータルRNAからのPCR産物(cDNA)として調製することができる。このPCR増幅の際に、標識プライマー(例えばシアニン系有機色素;Cy3、Cy5などを結合したプライマー)を取り込ませて標識ポリヌクレオチドとする。
ステップ(b)では、標的ヌクレオチド配列をDNAアレイに接触させ、DNAアレイのプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注した標識ポリヌクレオチド水性液を、DNAアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、1〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ポリヌクレオチドを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
そして、ステップ(c)において、プローブにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドより得られるシグナルを測定する。そして、得られたシグナルから、例えば、以下のとおりにSNPを検出する。
まず、得られたシグナルのカットオフ値を20,000とし、第1プローブスポット群と第2プローブスポット群の少なくともどちらか一方のシグナルが、20,000以上の部分の第1プローブスポット群と第2プローブスポット群のシグナル比(第1/第2)を算出し、
(1)シグナル比が>5の時は被験遺伝子をホモ接合性第1多型形態と判定する。
(2) シグナル比が<0.2の時は被験遺伝子をホモ接合性第2多型形態と判定する。
(3) さらに、シグナル比が0.2以上5以下の時は被験遺伝子をヘテロ接合性多型形態と判定する。
更に別の判定方法としては、図1に例示したDNAアレイを用いた場合に、第1プローブスポット列を構成する8個のスポット全てにシグナルが観察され、第2プローブスポット列を構成する4個のスポットにシグナルが観察された場合には、前記(1)に該当し、この被験遺伝子はホモ接合型第1多型形態と判定される。あるいはまた、第1プローブスポット列と第2プローブスポット列のそれぞれから同数のシグナルスポットが得られた場合であっても、第1プローブスポット列のシグナルスポットのシグナル強度の総和が第2プローブスポット列のそれより多い場合には、前記(1)に該当し、この被験遺伝子はホモ接合型第1多型形態と判定される。
また前記(3)の判定基準は、シグナルスポットの数が同一であり、それぞれのシグナル強度の総和が30%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下である場合とすることもできる。
すなわち、従来方法では、それぞれ単一の第1プローブスポットと第2プローブスポットのシグナル強度の多寡を比較するのに対し、この第3発明の方法では、それぞれ複数個のスポットからなるプローブスポット群からより多くのシグナルを発するスポット数を測定し、それを比較する。これによって、従来方法に比べてはるかに高精度でSNPを検出することが可能となる。
なお、第3発明における標識ポリヌクレオチドの調製や、ハイブリダイゼーション手続等は、例えば特開2001−095574号公報を初め、多くの特許文献、非特許文献に記載されており、それらの文献記載の方法を適宜に採用して行うことができる。
第4発明の方法は、前記第1発明のDNAアレイを用いて、各遺伝子の一塩基多型を検出するための適切なプローブ長を決定する方法である。具体的には、前記第3発明の方法でSNPを検出する際に最も適したプローブ長、すなわち、それぞれの1塩基多型形態を最も正確に反映することのできるプローブ長が、この第4発明において決定されるプローブ長となる。従って、被験者のSNP検出を目的とした第3発明の方法によって得られるデータから、適切なプローブ長を得ることができる。
そして、各遺伝子について適切なプローブ長からなるプローブスポットをそれぞれに備えた第5発明のDNAアレイが提供される。この第5発明のDNAアレイは、一つの被検遺伝子に対して、それぞれ「一つ」の第1プローブスポットと第2プローブスポットを備えている。それぞれのプローブスポットを構成するプローブは、その遺伝子のSNPを検出するための最適の長さである。従って、この第5発明のDNAアレイは、第1発明のDNAアレイと比較してはるかに多くの遺伝子のSNP検出を対象とするプローブスポットを備えることができ、しかもSNP検出制度は第1発明のDNAアレイと実質的に同一である。
実施例1
(1)DNAアレイの作成
遺伝子GNB3、MTHFRのそれぞれのポリヌクレオチド(cDNA)にハイブリダイズする配列部分がそれぞれの遺伝子の第1多型形態に正確に相補的である第1プローブ、同じく配列部分が第2多型形態に正確に相補的である第2プローブを、それぞれ1塩基異なる長さで合成した。各プローブの塩基配列は、遺伝子GNB3用の第1プローブ(GNB3C−01〜08)はSEQ ID No.1−8、第2プローブ(GNB3T−01〜08)はSEQ ID No.9−16、遺伝子MTHFR用の第1プローブ(MTHFRC−01〜08)はSEQ ID No.17−24、第2プローブ(MTHFRT−01〜08)はSEQ ID No.25−32である。また、SEQ ID Nos.1−32の各塩基配列の5’側には塩基配列「TTTTT」が連結されている。
これらのプローブの5’をアミノ基で修飾し、オリゴDNA固定化用エポキシガラス基板に、1スポット当たり、50pmol/μLの溶液を200pLずつスポッティングした。また、第1プローブスポット列と第2プローブスポット列の構成は、図2に示したように、同一プローブからなるプローブスポットを3個づつ並列配置した。
スポッティング後、42℃、相対湿度50%の条件下で一晩インキュベートした。次に、0.2%SDS水溶液で室温にて2分間洗浄し、さらに滅菌水で室温にて1分間の洗浄を2回行った。最後に50℃の滅菌水中で20分間インキュベーした後、遠心器で1000rpm×5分間遠心し、乾燥した。
(2)標識ポリヌクレオチドの調製
遺伝子型が判明している被験者血液から抽出したDNAをテンプレートとし、以下のPCR条件で増幅を行い、標識ポリヌクレオチドを調整した。
・プライマー1: 5pmol(5’末端Cy3標識)
・プライマー2: 5pmol
・×10緩衝液: 2.5μl
・2mM dNTP: 2.5μl
・25mM MgCl2: 2.5μl
・Taq DNAポリメラーゼ:1U
・抽出DNA溶液: 20ng
・増幅条件
94℃/5分
94℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒(35サイクル)
72℃/2分
(3)ハイブリダイゼーション
前記(2)で調製した標識ポリヌクレオチドを0.3 N NaOH(終濃度)と混合し、一本鎖に変性した後、200mMクエン酸−リン酸緩衝液(pH6.0)、2%SDS、750mM NaCl、0.1%NaN3(全て終濃度)を添加、混合し、サンプルとした。
次に、前記(1)で作製したDNAアレイ上にハイブリダイゼーションサンプルを滴下し、カバーガラスをかけ、55℃、相対湿度100%のモイスチャーチャンバー内で一晩インキュベートを行った。反応後、カバーガラスをはずし、あらかじめ55℃に加温した2×SSC、1%SDS水溶液に、55℃で20分間浸漬した。次に50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.025% Tween20水溶液に15分間浸漬した後、遠心器で1000rpmで5分間遠心し、乾燥した。
(4)シグナル測定
Scan Array(Packard BioScience社製)にて、レーザーパワー100%、フォトマル100%で蛍光画像を測定した。得られた画像は図3、4に示したとおりである。また、得られた画像シグナルをGcnePix Pro(Axon社製)にて数値化した(表1−3)。
蛍光シグナルのカットオフ値を20,000とし、第1プローブと第2プローブの少なくともどちらか一方の蛍光シグナルが20,000以上の部分の第1プローブと第2プローブの蛍光シグナル比(第1/第2)を算出した。蛍光シグナル比が>5の時はホモ接合型第1多型形態、<0.2の時はホモ接合型第2多型形態、0.2以上5以下の時はヘテロ接合性多型形態と判定したところ、事実と一致したことが確認できた。
実施例1と同様にして、遺伝子CYP 2C19−2およびCYP 2C19−3のそれぞれの遺伝子多型を検出試験した。各プローブの塩基配列は、遺伝子CYP 2C19−2用の第1プローブ(CYP 2C19−2−G−01〜05)はSEQ ID No.33−37、第2プローブ(CYP 2C19−2−A−06〜010)はSEQ ID No.38−42、遺伝子CYP 2C19−3の第1プローブ(CYP 2C19−3−G−01〜05)はSEQ ID No.43−47、第2プローブ(CYP 2C19−3−A−06〜010)はSEQ ID No.48−52である。また、SEQ ID Nos.33−52の各塩基配列の5’側には塩基配列「TTTTT」が連結されている。
これらのプローブを実施例(1)と同様にしてエポキシガラス基板に固定し、DNAマイクロアレイを作成した。なお、遺伝子CYP 2C19−2およびCYP2C19−3のそれぞれのマイクロアレイ構成は図5の左欄に示したとおりである。すなわち、CYP 2C19−2用アレイの場合には、▲1▼〜▲5▼が第1プローブスポット列、▲6▼〜▲10▼が第2プローブスポット列である。また、CYP 2C19−3用アレイの場合には、▲11▼〜▲15▼が第1プローブスポット列、▲16▼〜▲20▼が第2プローブスポット列である。
標識ポリヌクレオチドの調製、ハイブリダイゼーション、シグナル測定はそれぞれ実施例1と同様にして行った。
得られた蛍光画像は図5に示したとおりである。また、得られた画像シグナルを数値化した結果は表4(CYP 2019−2)および表5(CYP 2C19−3)に示したとおりである。実施例1と同様に蛍光シグナル比(第1/第2)を算出し、蛍光シグナル比が>5の時はホモ接合型第1多型形態、<0.2の時はホモ接合型第2多型形態、0.2以上5以下の時はヘテロ接合性多型形態と判定したところ、事実と一致したことが確認された。
Claims (8)
- 遺伝子の一塩基多型を検出するためのDNAアレイであって、遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が遺伝子の第1の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第1のプローブスポット群と、同配列部分が遺伝子の第2の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第2のプローブスポット群とを固相基体上に有し、第1プローブスポット群と第2プローブスポット群のそれぞれを構成するプローブスポットは、プローブスポット毎にプローブの長さが異なる、ことを特徴とするDNAアレイ。
- 第1プローブスポット群と第2プローブスポット群は、それぞれ、2〜10のプローブスポットからなる請求項1のDNAアレイ。
- 2〜10のプローブスポットが、そのプローブの長さの順に配置されている請求項2のDNAアレイ。
- 請求項1から3のいずれかのDNAアレイを少なくとも含む、遺伝子の一塩基多型を検出するためのキット。
- 請求項1から3のいずれかのDNAアレイを用いて遺伝子の一塩基多型を検出する方法であって、以下のステップ:
(a)被験遺伝子から、標識ポリヌクレオチドを調製するステップ;
(b)標識ポリヌクレオチドをプローブ付固相基体に接触させるステップ;
(c)DNAアレイ上のプローブにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドより得られるシグナルを測定するステップ;
を含むことを特徴とする一塩基多型の検出方法。 - 前記ステップ(c)において測定された、前記第1のプローブスポット群と前記第2のプローブスポット群のそれぞれのシグナルを比較する請求項5の一塩基多型の検出方法。
- 請求項1から3のいずれかのDNAアレイを用いて、遺伝子の一塩基多型を検出するための適切なプローブ長を決定する方法であって、以下のステップ:
(a)被験遺伝子から、標識ポリヌクレオチドを調製するステップ;
(b)標識ポリヌクレオチドをDNAアレイに接触させるステップ;
(c)DNAアレイ上の各プローブに結合した標識ポリヌクレオチドの標識シグナルを測定し、
以下の基準:
(i)験遺伝子がホモ接合性第1多型形態の場合に第1のプローブスポット群に標識シグナルが観察されること、
(ii)被験遺伝子がホモ接合性第2多型形態の場合に第2のプローブスポット群に標識シグナルが観察されること、
(iii)被験遺伝子がヘテロ接合性多型形態の場合に第1のプローブスポット群と第2のプローブスポット群とに同程度の標識シグナルが観察されること、
を満たすプローブスポットのプローブ長を、その遺伝子の一塩基多型を検出するための適切なプローブ長と決定することを特徴とする方法。 - 遺伝子の一塩基多型を検出するためのDNAアレイであって、遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が遺伝子の第1の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第1のプローブスポットと、同配列部分が遺伝子の第2の多型形態に正確に相補的である1以上のプローブからなる第2のプローブスポットとを固相基体上に有し、第1および第2のプローブスポットを構成するプローブ長が、請求項7の方法で決定された長さであるDNAアレイ。
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