WO2008088236A1 - Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) - Google Patents

Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) Download PDF

Info

Publication number
WO2008088236A1
WO2008088236A1 PCT/RU2007/000016 RU2007000016W WO2008088236A1 WO 2008088236 A1 WO2008088236 A1 WO 2008088236A1 RU 2007000016 W RU2007000016 W RU 2007000016W WO 2008088236 A1 WO2008088236 A1 WO 2008088236A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biochip
hybridization
primers
pcr
results
Prior art date
Application number
PCT/RU2007/000016
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2008088236A8 (ru
Inventor
Tatyana Vasilievna Nasedkina
Denis Olegovich Fesenko
Olga Nikolaevna Mityaeva
Yury Petrovich Lysov
Viktor Evgenievich Barsky
Alexandr Sergeevich Zasedatelev
Original Assignee
Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Nauk Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta (Imb Ran )
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Nauk Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta (Imb Ran ) filed Critical Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Nauk Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta (Imb Ran )
Priority to EA200900873A priority Critical patent/EA015913B1/ru
Priority to PCT/RU2007/000016 priority patent/WO2008088236A1/ru
Publication of WO2008088236A1 publication Critical patent/WO2008088236A1/ru
Publication of WO2008088236A8 publication Critical patent/WO2008088236A8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • BIOLOGICAL MICROCHIP BIOLOGICAL MICROCHIP
  • the invention relates to the field of molecular biology, forensic science and forensics and relates to a method for genetic identification of a person and determination of its individualizing characters (gender, blood type, etc.) using the technology of hydrogel DNA microarrays.
  • a number of methods are known for genetic identification of individuals using the uniqueness of the nucleotide sequence of each person’s DNA.
  • STR loci containing tandem repeats Based on the determination of the length of polymorphic DNA loci containing tandem repeats. The number of repetitions within such a locus varies in different people. Analysis of 12-16 such loci allows one to obtain a genetic characteristic that is unique within the population of the planet.
  • the method requires amplification of DNA in a polymerase chain reaction, followed by gel electrophoresis.
  • the advantage of the method is the high discriminatory ability, and the disadvantages are the laboriousness, high requirements for personnel qualification, expensive equipment for capillary gel electrophoresis (DNA sequencers), due to the significant length of STR loci (STR - short parameters; loci containing short tandem repeats) the degree of genomic DNA degradation has a great influence on the result (highly degraded DNA is often found in forensic science work).
  • the most accurate and evidence-based method for analyzing individual genetic variations is the high accuracy and sensitivity of the method, and the disadvantage is the extremely high cost of equipment and analysis, which excludes the widespread introduction of the method into expert practice at least in the next decade.
  • Allelic variants differ due to the fact that the 3 'terminal nucleotide of one of the primers in the PCR process hybridizes directly with the SNP position (i.e. if this primer is complementary to the DNA sequence, then the product is produced).
  • the method is quite complicated, because to a large extent depends on the reaction conditions and the correctly selected primer sequence. A large number of false-positive results.
  • it is impossible with this method to analyze more than 3-5 mutations in one analysis.
  • SNP analysis takes only 3-4 hours.
  • This method involves preliminary multiplex amplification of the studied DNA fragments using fluorescently labeled primers.
  • the addition of excess labeled PCR primer results in the formation of a large amount of a predominantly labeled single chain product.
  • This product is hybridized with oligonucleotide probes immobilized at a specific location on a solid substrate, or in gel microdrops attached to a substrate (this matrix of DNA probes is called a biological microchip or biochip). If the sequence of the analyzed DNA is completely complementary to the probe sequence, then a stable duplex is formed (a fluorescent signal is recorded), if the desired fragment is not found, or if there is an incomplete base in it, then a stable duplex is not formed (signal is not observed).
  • the closest analogue of the present invention is the method 5 described above.
  • Significant disadvantages of the method include its low discriminatory power, due to the dialliness of the analyzed polymorphisms.
  • the essence of the invention is to provide a method for identifying a person in which, during one PCR, highly polymorphic DNA loci are amplified: ABO, HLA-DQAl, as well as the AMEL diallelic locus, which makes it possible to divide the human population into 1350 groups.
  • the method is based on carrying out an original variant of multiplex PCR in two stages, followed by hybridization of a fluorescently labeled DNA fragment on a biological microchip containing an original set of differentiating oligonucleotides, as well as registration and interpretation of the results.
  • the use of highly polymorphic ABO and HLA-DQAl loci alone allows amplification of DNA using three pairs of PCR primers and separation of the population into 675 groups, unlike the prior art method 5, which allows only 8 groups to be divided into three pairs of primers.
  • the use of the AMEL diallyl locus in analysis allows one to double the discriminatory force, however, this locus was used primarily because it allows one to determine the sex of the host of the DNA being studied, which is important in investigative practice.
  • the use of two-stage multiplex PCR and the hybridization method on biochips compares favorably with the prior art methods by the ability to determine many polymorphic variants with the least cost and the most specific way in a short time. The method is economical, does not require expensive equipment and can be introduced into widespread expert practice.
  • the data obtained using the method of the present invention can be used to narrow the circle of suspected individuals and as a preliminary step in verifying the ownership of the DNA under investigation to a suspected person.
  • An important feature of the invention is that the fluorescent labeling of a gene fragment is carried out simultaneously with amplification during the second PCR stage. Another feature of the invention is that the identification of amplified sequences is carried out by hybridization of the obtained fluorescently labeled amplification product with a set of original oligonucleotide probes immobilized on a biochip.
  • the present invention provides a method for analyzing genetic polymorphism for genetic identity purposes, comprising verifying polymorphic sequence variants in a DNA sample, comprising the following steps:
  • fluorescently labeled 5 ′ end primers are used to fluorescently label the PCR product.
  • the biochip is provided by photoinduced hydrogel copolymerization.
  • hybridization conditions are used to provide a high degree of differentiation between perfect and imperfect hybridization duplexes.
  • the registration of hybridization results is carried out using a device capable of recording and recording fluorescence signals.
  • hybridization results are recorded using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera.
  • the recording of hybridization results is carried out using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera.
  • the interpretation of the results is carried out visually.
  • the interpretation of the results is carried out using an automatic image analysis program.
  • the present invention provides a set of primers for amplification of polymorphic gene fragments in the method of the present invention, where the primer sequences are presented in SEQ W NO: 1-16.
  • the present invention provides a set of oligonucleotides for identifying polymorphic fragments of genes amplified using the set of primers of the present invention, with the sequences shown in SEQ ID NO: 17-37.
  • the present invention provides a biochip for identifying polymorphic fragments of genes amplified using the primer set of the present invention, which is a substrate with a set of oligonucleotides immobilized on it with the sequences shown in SEQ ID NO: 17-37.
  • the objective of the present invention is to provide a method for the rapid analysis of genetic polymorphism in DNA samples similar to expert (obtained from crime scenes, etc.) using an oligonucleotide biochip.
  • a DNA sample is used as a template in a multiplex “nested” two-stage PCR.
  • PCR produces a fluorescently labeled amplified fragment.
  • Labeled PCR product is used for further hybridization on a biochip containing immobilized oligonucleotides, which are portions of gene sequences that are complementary to both the wild-type sequence and the variable sequence.
  • the analyzed DNA fragment forms perfect hybridization duplexes only with the corresponding oligonucleotides fully complementary to it. With all other oligonucleotides, the analyzed DNA fragment will form imperfect duplexes, the stability of which is significantly lower than the stability of perfect duplexes.
  • Discrimination of perfect and imperfect duplexes is carried out after washing the biochip, comparing the fluorescence intensities of the corresponding cells of the biochip.
  • the signal intensity in the case of the formation of a perfect duplex is higher than in the case of an imperfect one.
  • DNA samples isolated from blood, saliva, hair follicle, a fingerprint containing particles of the epithelium, and other materials resembling real expert samples can be used.
  • the polymerase chain reaction can be carried out using any type of thermostable polymerase (Taq polymerase, Stoffel fragment, Tth polymerase, Tfl polymerase, Pfu polymerase, Vpt polymerase, DeVept polymerase and the like, without limitation, which are commercially available from a large number of manufacturers (Novagep, Sibenzyme, etc.) working in the appropriate buffer.
  • a mixture of dNTPs dATP, dGTP, dTCP, dTTP
  • PCR can ready to be used commercially available kits containing all necessary components except primers.
  • primers for conducting a multiplex "nesting" two-stage polymerase chain reaction primers with the sequences SEQ W NO: 1-16 shown in the List of sequences, as well as in Table 1, are used.
  • oligonucleotide primers for example, the phosphodiester method, the hydrophosphoryl method, etc. but the most common is currently the phosphoramidite method.
  • the synthesis of primers is carried out using automatic DNA / RNA synthesizers, for example, manufactured by Arrlied BIOSystems (USA).
  • Table 1 The sequence of the primers used in multiplex PCR.
  • the labeling of the PCR product in the second step of the PCR is carried out using primers carrying a fluorescent label at the 5 'end.
  • fluorochrome for example, without limitation, FITC, Texas Red, Cy-3, Cy-5, etc.
  • biotin can be used as a fluorescent label.
  • primers that are part of one pair can be used in equimolar amounts.
  • the resulting amplification product will be essentially double-stranded, and for its effective hybridization with oligonucleotides, immobilized on a biochip, conduct preliminary denaturation. Typically, denaturation is carried out immediately prior to hybridization by heating the finished hybridization mixture at 95 ° C for 5 minutes, followed by rapid cooling in ice.
  • the second step of the multiplex “nested” two-step PCR is carried out in an asymmetric format, i.e.
  • fluorescently labeled primer is used in molar excess relative to unlabeled primer, for example, at a molar ratio of about 10: 1, respectively.
  • amplification product resulting from this will be predominantly single stranded fluorescently labeled DNA.
  • preliminary denaturation is also carried out if necessary.
  • Hybridization When selecting hybridization conditions, conditions are created that ensure the highest fluorescence intensity of perfect duplexes, the specificity of the interaction, and the maximum difference in stability between perfect and imperfect duplexes.
  • Hybridization can be carried out in any hybridization buffer known to the person skilled in the art, optionally containing reagents that lower the melting point of the formed duplexes and ensure the specificity of the interaction between the oligonucleotide probe and the target DNA in a temperature range of about 37 ° C.
  • reagents include formamide, guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, etc.
  • Hybridization can be carried out in the absence of such reagents, but at higher temperatures corresponding to the melting points of the oligonucleotide probes in the buffer used.
  • Washing can be carried out in any buffer known in the art with the addition of salt (SSC, SSPE, etc.) or in deionized water, but in a shorter time (JF Sambgoock and DW Russell, Molecular sapipg: a CoId Spripp Nagbar Laborotu Res, 2001, vol. 2, pp. AlO.10-12,14, 10.47-10.48, 10.6.)
  • the hybridization pattern can be recorded using any detecting system that recognizes a fluorescent signal (fluorescence microscope with a CCD camera, a laser scanner or a portable a biochip analyzer available commercially from a large number of manufacturers, for example, a portable biochip analyzer, manufactured commercially by Biochip-IMB LLC), and equipped with a recording device (CCD camera, video camera, camera)).
  • a fluorescent signal fluorescence microscope with a CCD camera, a laser scanner or a portable a biochip analyzer available commercially from a large number of manufacturers, for example, a portable biochip analyzer, manufactured commercially by Biochip-IMB LLC
  • CCD camera video camera, camera
  • oligonucleotides that carry an active group providing immobilization at the 5'- or 3'-end can be used.
  • There are various chemical approaches to the synthesis of oligonucleotides for example, the phosphodiester method, the hydrophosphoryl method, etc. but the most common is currently the phosphoramidite method.
  • the synthesis of oligonucleotides is carried out using automatic DNA / RNA synthesizers, for example, manufactured by Arrlied BIOSystems (USA).
  • a wide range of groups can be used to modify immobilized oligonucleotides, such as an amino group, thiol, hydrazide, acrylamide group, benzaldehyde, thiophosphate, and the like.
  • groups such as an amino group, thiol, hydrazide, acrylamide group, benzaldehyde, thiophosphate, and the like.
  • Modification of the oligonucleotide with the aim of introducing an active group suitable for subsequent immobilization of the oligonucleotide on a biochip, can be carried out both automatically in the synthesis using a wide range of modifiers that are commercially available, for example, from Glep Research (USA), and postsynthetically in manual mode.
  • Biochips can be made by creating on the surface of the glass substrate a matrix of polyacrylamide gel cells, activating the cells and covalently immobilizing the modified oligonucleotides in the cells that carry active groups (MiGzabekov A. & Kolchinsky A. MAGI ⁇ hiinstallizie ⁇ assist ⁇ remind ⁇ concerning ⁇ nous ⁇ advisory ⁇ advisory ⁇ advisorygrade ⁇ vigilant ⁇ facilitate ⁇ labor ⁇ . ⁇ . & Kolchinsky A. MAGI ⁇ hiatsui141 ⁇ assist ⁇ assist ⁇ appris ⁇ nous ⁇ . ⁇ . & Kolchinsky A. MAGI ⁇ hiatsuizie ⁇ assist ⁇ assist ⁇ nous ⁇ nous ⁇ nous ⁇ for a matrix of polyacrylamide gel cells, activating the cells and covalently immobilizing the modified oligonucleotides in the cells that carry active groups (MiGzabekov A. & Kolchinsky A. MAGI ⁇ hiatsuizie ⁇ assist ⁇ diligent ⁇ nous ⁇ nous ⁇ . ⁇ . & Kolchinsky A. MAGI ⁇ hiatsuizie ⁇ assist ⁇ diligent ⁇ nous ⁇
  • Biochips can also be made by the method of chemically induced or photoinduced copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as described previously (Vasiliskov, V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobushev, A., Shisk, V. & Mirzabekobekov. of miarrir Ltd.
  • Mirzabekobekov. of miregisterr GmbH
  • Mirzabekov A.D. Rubina A.Yu., Pankov SV., Chernov B.
  • Biochips can also be made by any other methods known to a person skilled in the art (Heliger H., Hipz M., Narr E. and as a substrate, in addition to glass, another material can be used (plastic, metal, flexible membranes, etc.).
  • Activated substrates commercially available from various manufacturers can also be used for the manufacture of microchips (see, for example, Ramakrishpap R, Dorris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, Progohorova A, Gieser L, Touma E, Lockner R, Tata M , Zhu X, Patterson M, Shirru R, Sendera TJ, Mazumder A. 2002.
  • An essessmép of motorola sédelipk miqualityr Inc.
  • An essesmép of motorola sédelipk miqualityr Inc.
  • a set of oligonucleotides having the sequences of SEQ ID NOS: 17-37 shown in the Sequence List and Table 2 is used.
  • a control DNA sample is used in the present invention.
  • the location of specific oligonucleotide probes on the biochip can vary and is determined only by the convenience for interpreting the results of hybridization.
  • Table 2 List of oligonucleotides immobilized on a microchip.
  • group 101 combines the 0101XX, 0104XX, 0105, 0107 alleles; group 102-0102XX; group 103-0103; group 106-0106; group 02 - 0201; group 03 - 03XXX, group 04 - 04XXX; group 05 - 05XXXX; Group 06 - 06XXXX.
  • group 101, 102, 103, 106, 02, 03, 04, 05, 06 will be called simply alleles.
  • the biochip allows the analysis of four polymorphic regions in the second exon of the HLA-DQAl gene.
  • each polymorphic region is represented by a column of pairs of cells.
  • the first column has 4 rows
  • the second column has 2 rows
  • the third column has 3 rows
  • the fourth column has 2 rows.
  • the first polymorphic region is located between positions 203 and 234.
  • the first variant of the first region (the first row of the first column) is responsible for 101, 102, 103, 106 alleles
  • the second variant of the first polymorphic region (the second row of the first column) is responsible for 02 allele
  • the third variant of the first the polymorphic region is responsible for the 03 allele
  • the fourth variant of the first polymorphic region is responsible for 04, 05, 06 alleles.
  • the second polymorphic region is located between 134 and 152 positions.
  • the first variant of the second polymorphic region (the first row of the second column) is responsible for 101, 102, 106, 04, 05 alleles
  • the second variant of the second polymorphic region (the second row of the second column) is responsible for 103, 02, 06 alleles.
  • the third polymorphic region is located between 161 and 188 positions.
  • the first variant of the third polymorphic region (the first row of the third column) is responsible for 101 alleles
  • the second variant of the third polymorphic region (the second row of the third column) is responsible for 102, 103, 106, 04, 05 alleles
  • the third variant of the third polymorphic region (the third row of the third column ) is responsible for 04 and 06 alleles.
  • the fourth polymorphic region is located between positions 191 and 207.
  • the first variant of the fourth polymorphic region (the first row of the fourth column) is responsible for 101, 102, 103 alleles
  • the second variant of the fourth polymorphic region (the second row of the fourth column) is responsible for 106 alleles.
  • ABO gene 5 polymorphic variants of the ABO gene can be detected, the combination of which gives 15 groups.
  • the ABO locus is highly polymorphic, and to date, according to our estimates, about one and a half hundred of its alleles have been published. The vast majority of them are extremely rare. Therefore, when choosing alleles, we were guided primarily by the frequency of their occurrence in white Europeans, genetically closest to the Russian population. The following groups of alleles were selected for analysis: A, B, O 1 , O lv and O 2 , which determine the serological blood group in the vast majority of white Europeans.
  • the combination of the analyzed SNPs allows us to determine the alleles of the ABO gene present in the sample (Table 3). In each of the selected groups of alleles, alleles that differ in other SNPs can be isolated, but these variants are rare and in the vast majority of cases are serologically equivalent.
  • AMELX is characterized by a three-letter deletion (positions 5878 - 5880).
  • Two oligonucleotides are immobilized on a biochip, which allow the analysis of the presence or absence of a deletion.
  • the developed biochip allows us to analyze a total of 16 groups of alleles in three genes.
  • Example 1 Amplification of ABO gene fragments by the method of two-stage “nested” multiplex PCR in order to produce a fluorescently labeled gene fragment specific for each polymorphic variant
  • Filter cigarette butts were taken from subjects. 5-6 mm were cut from the filter side with a sterile instrument and paper was removed. To obtain sweat-soaked paper, the test subject was asked to slightly wrinkle a Kimbrl-Clark laboratory paper towel in his hand. The subject was also asked to drink water from a disposable glass, rinsing from the edge of the glass was performed with a napkin dipped in sterile water. Each of the samples was placed in a 1.5-ml tube with 200 ⁇ l of sterile water, incubated for 1-3 hours at a temperature of 23–25 ° C, after which DNA was isolated with Qiagep kit.
  • PCR primers SEQ ⁇ D NO: 1-8 were used. Multiplex PCR was performed on a Mipususer instrument (MJ Resecarch, Ips, USA) in a volume of 25 ⁇ l of the reaction mixture, composition: for the 1st stage: I x buffer (67 mM Tris-Hcl, pH 8.6, 166 mm (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.01% Triton X-100), 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM each of dNTP (Sileks, Russia), 5 pM each of 4 primers (SEQ ID NO: 1-4 ), 1 ⁇ l of genomic DNA and 1.5 units. Act.
  • I x buffer 67 mM Tris-Hcl, pH 8.6, 166 mm (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.01% Triton X-100
  • 1.5 mM MgCl 2 0.2 mM each of dNTP (Sileks, Russia)
  • 5 pM each of 4 primers
  • Taq polymerases ("Sileks", Russia). DNA was denatured for 5 min at 94 ° C and 35 amplification cycles were performed at the first stage (94 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C for 1 min), then for 7 min at 72 ° C.
  • the mixture of the second PCR step differed in the composition and concentration of primers: the upper primers (SEQ ID NO: 5, 7) were taken at a concentration of 5 pM, and the lower ones (SEQ ID NO: 4, 6) were taken at 50 pM.
  • Oligonucleotides for immobilization on a microchip are synthesized on an automatic synthesizer 394 DNA / RNA Supthesizer (Arrlied BIOSystems, USA) using a standard phosphoamidite procedure.
  • the 5 ′ or 3 ′ end of the oligonucleotides contains a free amino group spacer, which is introduced into the oligonucleotide by synthesis using the Z'-Amipo-Modifier C7 CPG 500 (Glep Research, USA).
  • the addition of a fluorescent label to the free amino group oligonucleotides is carried out in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • Oligonucleotides labeled with Cy-3 cyanine dye purify by HPLC of oligonucleotides that did not include a fluorescent dye on a Hypersil ODS 5 ⁇ m, 4.6 x 250 mm column (Sypelco Int, USA).
  • the biochip is prepared by copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as previously described (Patent for invention N 2175972 “Method for immobilizing oligonucleotides containing unsaturated groups in polymer hydrogels during microchip formation” Mirzabekov A.D., Rubina A.Yu., Pankov SV, Chernov B.K. Priority dated 12/28/1999).
  • the biochip contains 21 types of immobilized oligonucleotides (SEQ ID NO: 17-37), a list of which is also presented in Table 2.
  • FIG. 1. presents a biochip diagram for personal identification.
  • the first polymorphic region a positive signal is observed in the first and fourth lines, therefore, an allele from group 101, 102 is present 103, 106 and the allele from group 401, 501, 601.
  • the second polymorphic region a positive signal is observed in the first line, therefore, the presence of 103 and 601 alleles is excluded.
  • Third polymorphic region a positive signal is observed in the second line, therefore, we exclude the presence of 101 and 401 alleles.
  • Fourth polymorphic region a positive signal is observed in the first line, therefore, we exclude 106 allele.
  • the amelogenin gene is represented by one allele (Fig. 2): AMELX, from which we can conclude that the sample belongs to a woman.
  • the contents of all the tubes obtained in stage 2 of Example 1 are used for hybridization on a biochip in a buffer of the following composition: 25% formamide (Gibco BRL), 5xSSPE.
  • the prepared hybridization mixture was denatured at 95 ° C for 5 min, cooled in ice for 2 min, and applied onto a biochip in a 20 ⁇ l hybridization chamber (Sigma, USA). Hybridization is carried out for 10-14 hours at a temperature of 37 ° C. Washing is carried out in Ix SSPE buffer at room temperature for 10 minutes.
  • the hybridization pattern is recorded using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera manufactured by Biochip-IMB LLC.
  • a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera manufactured by Biochip-IMB LLC.
  • the interpretation of the results is carried out as in example 2.
  • the description of the algorithm for automatic image analysis using the ImageWage TM program is beyond the scope of the present invention. All patents, publications, scientific articles, and other documents and materials cited or referenced herein are hereby incorporated by reference to the extent that each of these documents was individually incorporated by reference or is presented in its entirety.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики и касается способа генетической идентификации личности и определения его индивидуализирующих признаков (пол, группа крови и пр.) с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов. Изобретение обеспечивает возможность по ряду генетических признаков определять вероятность происхождения биологического материала от того или иного подозреваемого, жертвы, участника преступного инцидента. Оно обладает тем преимуществом, что позволяет провести экспертизу в короткий срок и с небольшими (в сравнении с другими методами) материальными затратами. Другим преимуществом изобретения является возможность расширения спектра анализируемых локусов и, соответственно, повышения дискриминирующей силы экспертизы.

Description

СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ НА ОСНОВЕ
АНАЛИЗА ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА
ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО
БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА (БИОЧИПА)
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики и касается способа генетической идентификации личности и определения его индивидуализирующих признаков (пол, группа крови и пр.) с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов.
Уровень техники
Известен ряд способов генетической идентификации личности, использующих уникальность нуклеотидной последовательности ДНК каждого человека.
1. Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ- анализ) {П.Л.Иванов. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе. Вестник РАН том 73, Nя 12, с. 1085-1097 (2003)].
Основан на определении длины полиморфных локусов ДНК, содержащих тандемные повторы. Количество повторов внутри такого локуса варьирует у разных людей. Анализ 12-16 подобных локусов позволяет получить генетическую характеристику, являющуюся уникальной в пределах популяции планеты. Метод требует амплификации ДНК в полимеразной цепной реакции, с последующим гель- электрофорезом. Преимуществом метода является высокая дискриминирующая способность, а недостатками - трудоемкость, высокие требования к квалификации персонала, дорогостоящее оборудование для капиллярного гель-электрофореза (ДНК- секвенаторы), в связи со значительной длиной STR- локусов (STR - shоrt tапdеm rереаts; локусы, содержащие короткие тандемные повторы) большое влияние на результат имеет степень деградации геномной ДНК (высокодеградированная ДНК нередко встречается в экспертно-криминалистической работе).
2. Анализ полиморфизма длины рестриктазных фрагментов ДНК (ПДРФ - анализ).
В результате мутаций в геномной ДНК возникают новые или утрачиваются ранее существовавшие сайты рестрикции - места воздействия рестриктаз, расщепляющих цепь ДНК. Это, в свою очередь, обусловливает изменение длины получающихся рестриктазных фрагментов ДНК. Распределение фрагментов по длинам выявляется с помощью блот-гибридизации. Однако большинство полиморфных локусов имеют только два варианта: дикий тип/мутация, т.е. являются диаллельными. Ценность диморфных маркеров невелика, т.к. у многих людей может оказаться один и тот же вариант. Эта особенность, наряду с высокой требовательностью к количеству и сохранности исследуемой ДНК, являются основными недостатками метода, приведшими к его исчезновению из криминалистической практики. [Jоsерh T, Киsитакитаrу P, Сhаско P, Аbrаhат А, Rаdhакrishпа Рillаi M. Gепеtiс роlутоrрhisт оf CYPlAl, CYP2D6, GSTMl апd GSTTl апd sиsсерtibilitу tо асиtе lутрhоblаstiс lеикаетiа iп Iпdiап сhildrеп. Реdiаtr Вlооd Сапсеr. 2004 Oct;43(5):539-4L]
3. Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК, т.е. определение индивидуального генетического кода в заданном фрагменте
ДНК.
Самый точный и доказательный метод анализа индивидуальных генетических вариаций. Преимуществом является высокая точность и чувствительность метода, а недостатком - чрезвычайно высокая стоимость оборудования и анализа, что исключает широкое внедрение метода в экспертную практику как минимум в ближайшее десятилетие.
4. Выявление однонуклеотидного полиморфизма методом аллель- специфичной ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Аллельные варианты различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров в процессе ПЦР гибридизуется непосредственно с позицией SNP (т.е. если этот праймер комплементарен последовательности ДНК, то происходит наработка продукта). Метод достаточно сложен, т.к. большой степени зависит от условий реакции и правильно выбранной последовательности праймера. Велико количество ложно-положительных результатов. Кроме того, невозможно данным методом анализировать более 3-5 мутаций в одном анализе. Несмотря на все приведенные недостатки, при грамотно подобранных условиях, анализ SNP занимает всего 3-4 часа. [Миrаtа M, Shirаishi T, Fикиtоте К, Wаtапаbе M, Nаgао M, Киbоtа Y, Itо H, Каwатиrа J Yаtапi R. Суtосhrоте P4501A1 апd glиtаthiопе S-trапsfеrаsе Ml gепоtуреs аs riskfасtоrs fоr рrоstаtе сапсеr iп Jарап. Jрп J CHn Опсоl. 1998 Nov;28(l 1):657-6O.] 5. Выявление однонуклеотидного полиморфизма методом гибридизации амплифицированного исследуемого образца с олигонуклеотидной матрицей.
Данный метод предполагает предварительную мультиплексную амплификацию исследуемых фрагментов ДНК с использованием флуоресцентно меченных праймеров. В результате добавления избытка меченного праймера ПЦР достигается образование большого количества преимущественно меченного одноцепочечного продукта. Этот продукт гибридизуют с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными в определенном месте твердой подложки, либо в гелевых микрокаплях, закрепленных на подложке (такая матрица ДНК-зондов носит название биологического микрочипа или биочипа). Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности зонда, то образуется стабильный дуплекс (регистрируется флуоресцентный сигнал), если искомого фрагмента нет, или же в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнал не наблюдается). Простота метода, низкая стоимость и возможность использования флуоресцентной метки позволяет легко автоматизировать процесс. Однако данный метод жестко связан с мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а ее возможности ограничены. А именно, в ходе одной реакции могут быть амплифицированы лишь 4-5 локусов ДНК. При таких ограничениях, используемые в данный момент для криминалистических нужд системы SNP в силу своей диаллельности не будут иметь достаточной дискриминационной силы при использовании их на платформе биочипов. [Wеп SY, Wапg H, Sип OJ, Wапg SQ. Rарid dеtесtiоп оf thе кпоwп SNPs оf CYP2C9 иsiпg оligописlеоtidе тiсrоаrrау. Wоrld J Gаstrоепtеrоl. 2003 Juп;9(6): 1342-6.}
Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ 5, описанный выше. К существенным недостаткам способа можно отнести его низкую дискриминационную силу, обусловленную диаллельностью анализируемых полиморфизмов .
Таким образом, все имеющиеся в настоящее время способы обладают теми или иными недостатками, и существует потребность в создании простого, недорогого, специфичного способа, позволяющего в ходе одной ПЦР-реакции амплифицировать несколько мультиаллельных локусов и выявлять полиморфизм в них, используя биочипы. Разработка способа, лишенного недостатков известных способов, позволит существенно расширить круг криминалистических лабораторий, которые смогут использовать данный способ в повседневной практике.
Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.
Раскрытие изобретения
Сущность изобретения заключается в обеспечении способа идентификации личности, в котором в ходе одной ПЦР амплифицируются высокополиморфные ДНК- локусы: ABO, HLA-DQAl, а также диаллельный локус AMEL, что позволяет разделить человеческую популяцию на 1350 групп. Способ основан на проведении оригинального варианта мультиплексной ПЦР в две стадии с последующей гибридизацией флуоресцентно меченного фрагмента ДНК на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов.
Одно лишь использование высокополиморфных локусов ABO и HLA-DQAl позволяет с помощью трех пар ПЦР-праймеров амплифицировать ДНК и получить разделение популяции на 675 групп, в отличие от способа 5 из уровня техники, позволяющего при трех парах праймеров получить разделение лишь на 8 групп. Использование в анализе диаллельного локуса AMEL позволяет удвоить дискриминационную силу, однако этот локус был применен в первую очередь в связи с тем, что он позволяет определить пол хозяина исследуемой ДНК, что немаловажно в следственной практике. Применение двухэтапной мультиплексной ПЦР и метода гибридизации на биочипах выгодно отличается от способов из уровня техники возможностью определения многих полиморфных вариантов с наименьшими затратами и наиболее специфичным способом за короткое время. Способ экономичен, не требует дорогостоящего оборудования и может быть введен в повсеместную экспертную практику. Данные, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы для сужения круга подозреваемых лиц и в качестве предварительного этапа верификации принадлежности исследуемой ДНК подозреваемому лицу.
Важной особенностью изобретения является то, что флуоресцентное мечение фрагмента гена осуществляют одновременно с амплификацией при проведении второго этапа ПЦР. Следующей особенностью изобретения является то, что идентификацию амплифицированных последовательностей осуществляют путем гибридизации полученного флуоресцентно меченного продукта амплификации с набором оригинальных олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биочипе.
Настоящее изобретение обеспечивает способ анализа генетического полиморфизма для целей генетической идентификации личности, включающий верификацию полиморфных вариантов последовательности в образце ДНК, предусматривающий следующие стадии:
(а) - амплификация полиморфных фрагментов генов методом мультиплексной «гнeздoвoй» двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой в качестве матрицы для амплификации используют образец ДНК, с использованием набора праймеров с последовательностями, представленными в SEQ Ш NO: 1-16, с получением на втором этапе ПЦР меченого ПЦР-продукта;
(б) - обеспечение биочипа для идентификации полиморфных фрагментов генов, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37;
(в) - гибридизация амплифицированного меченого ПЦР-продукта на биочипе;
(г) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации.
В одном из воплощений на втором этапе ПЦР для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта используют флуоресцентно меченные по 5 '-концу праймеры.
В следующем воплощении биочип обеспечивают методом фотоиндуцируемой сополимеризации в гидрогеле.
В еще одном воплощении используют условия гибридизации, обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами.
В следующем воплощении регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции. В одном из предпочтительных воплощений регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой. В еще одном предпочтительном воплощении регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС- камерой. В еще одном воплощении интерпретацию результатов проводят визуально. В альтернативном воплощении интерпретацию результатов проводят с использованием программы автоматического анализа изображения.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор праймеров для амплификации полиморфных фрагментов генов в способе настоящего изобретения, где последовательности праймеров представлены в SEQ Ш NO: 1-16.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор олигонуклеотидов для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров настоящего изобретения, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает биочип для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров настоящего изобретения, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37.
Перечень фигур:
Фигура 1. Схема биологического микрочипа.
Фигура 2. Гибридизационная картина, полученная на биочипе для анализа полиморфизма по генам ABO, HLA-DQAl и AMEL.
Осуществление изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа экспресс-анализа генетического полиморфизма в образцах ДНК, аналогичных экспертным (полученным с мест преступлений, и т.д.), с использованием олигонуклеотидного биочипа.
Образец ДНК используют как матрицу в мультиплексной «гнeздoвoй» двухэтапной ПЦР. На втором этапе ПЦР получают флуоресцентно меченный амплифицированный фрагмент. Меченый ПЦР-продукт используют для дальнейшей гибридизации на биочипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, комплементарных как последовательности "дикого типа", так и вариабельной последовательности. Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими полностью комплементарными ему олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы, стабильность которых существенно ниже стабильности совершенных дуплексов. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют, какие варианты присутствуют в том или ином образце.
В качестве экспертного образца могут быть использованы образцы ДНК, выделенные из крови, слюны, волосяной луковицы, отпечатка пальца, содержащего частички эпителия, и других материалов, напоминающих реальные экспертные образцы.
Для выделения ДНК можно пользоваться различными методами, например: фенол-хлороформенной экстракцией [И.В.Корниенко с соавт. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. Под ред. П.Л.Иванова, 2001 г., Ростов-на-Дону], смолой Chelex-100 [Wаlsh P, Меtsgеr D, Нiguсhi R. Сhеlех 100 аs а mеdium fоr simрlе ехtrасtiоп оf DNA fоr РСR-bаsеd typing from fоrепsiс mаtеriаl. Вiоtесhпiquеs 1991; 10:506 —13.], готовыми наборами для выделения ДНК (фирм Qiаgеп, Strаtаgепе, Аrсturus Вiоsсiепсе и др.).
Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Таq-полимераза, фрагмент Стоффеля, Тth- полимераза, Тfl-полимераза, Рfu-полимераза, Vепt-полимераза, DеерVепt-полимераза и т.п. без ограничения, которые коммерчески доступны от большого числа производителей (Nоvаgеп, Сибэнзим, и проч.), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, но вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров. В качестве праймеров для проведения мультиплексной «гнeздoвoй» двухстадийной полимеразной цепной реакции используют праймеры с последовательностями SEQ Ш NO: 1-16, приведенными в Перечне последовательностей, а также в Таблице 1.
Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод, и т.д. но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например производства фирмы Аррliеd Вiоsуstеms (США).
Таблица 1. Последовательности праймеров, используемых в мультиплексной ПЦР.
Figure imgf000010_0001
В одном из воплощений мечение ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР проводят с помощью праймеров, несущих флуоресцентную метку на 5 '-конце.
В качестве флуоресцентной метки может быть использован любой флуорохром (например, без ограничения, FITC, Техаs rеd, Cy-3, Cy-5 и т.д.), а также биотин.
На второй стадии мультиплексной «гнeздoвoй» двухэтапной ПЦР праймеры, входящие в состав одной пары, могут использоваться в эквимолярных количествах. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет по существу двухцепочечным, и для его эффективной гибридизации с олиrонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, проводят предварительную денатурацию. Обычно денатурацию проводят непосредственно перед проведением гибридизации путем прогрева готовой гибридизационной смеси при 95 °C в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением во льду. В предпочтительном воплощении изобретения вторую стадию мультиплексной «гнeздoвoй» двухэтапной ПЦР проводят в асимметричном формате, т.е. флуоресцентно меченный праймер используют в молярном избытке по отношению к немеченому праймеру, например, при молярном соотношении около 10: 1, соответственно. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет представлен преимущественно одноцепочечной флуоресцентно меченной ДНК. С учетом возможности образования вторичных структур для эффективной гибридизации такого продукта с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, при необходимости также проводится его предварительная денатурация.
При подборе условий гибридизации создают условия, обеспечивающие наибольшую интенсивность флуоресценции совершенных дуплексов, специфичность взаимодействия и максимальную разницу в стабильности между совершенными и несовершенными дуплексами. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, при необходимости содержащем реагенты, понижающие температуру плавления образуемых дуплексов и обеспечивающие специфичность взаимодействия между олигонуклеотидным зондом и ДНК-мишенью в диапазоне температур около 37°C. К таким реагентам относятся формамид, гуанидин гидрохлорид, гуанидин изотиоцианат и др. Гибридизация может проводиться и в отсутствии таких реагентов, но при более высоких температурах, соответствующих температурам плавления олигонуклеотидных зондов в используемом буфере. При подборе условий гибридизации и отмывки основное внимание должно быть обращено на специфичность прохождения гибридизации. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время (J.F. Sаmbгооk and D. W. Russеll, "Моlесulаr сlопiпg: а lаbоrаtоrу mапuаl" CoId Sрriпg Нагbоr Lаbоrаtоrу Рrеss, 2001, vol.2, рр. AlO.10-12,14, 10.47-10.48, 10.6.)
Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер или портативный анализатор биочипов, доступные коммерчески от большого числа производителей, например портативный анализатор биочипов, производимый серийно ООО «Биoчип-ИMБ»), и снабженной регистрирующим устройством (ПЗС-камерой, видеокамерой, фотокамерой)). Анализ изображения может быть произведен как визуально, так и в автоматическом режиме с использованием специальной программы.
При изготовлении микрочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'- или 3' -концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидов, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод, и т.д. но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез олигонуклеотидов осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например производства фирмы Аррliеd Вiоsуstеms (США). Возможно использование широкого спектра групп для модификации иммобилизуемых олигонуклеотидов, таких как аминогруппа, тиол, гидразид, акриламидная группа, бензальдегид, тиофосфат и т.п. (Sеligеr H., Нiпz M., Нарр E. "Аrrауs оf immоbilizеd оligопuсlеоtidеs - сопtributiопs tо пuсlеiс асids tесhпоlоgу" Сurrепt Рhаrmасеutiсаl Вiоtесhпоlоgу, 2003, 4, 379-395). Модификация олигонуклеотида, имеющая целью введение активной группы, пригодной для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе, может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра модификаторов, которые коммерчески доступны, например, от Glеп Rеsеаrсh (USA), так и постсинтетически в ручном режиме.
Биочипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (Мiгzаbеkоv А. & Kolchinsky A. МАGIСhiр: Рrореrtiеs апd аррliсаtiопs iп gепоmiс studiеs. (2002) In Gепотiс Тесhпоlоgiеs : Рrеsепt апd Fиtиrе. Еds. Gаlаs D. J., S. J. МсСоrmасk. Саistеr Асаdеmiс Рrеss, рр.163-196). Также биочипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vаsiliskоv, V., Тimоfееv E., Surzhikоv S., Drоbуshеv, А., Shiсk, V. & Мirzаbеkоv, А. 1999. Fаbriсаtiоп оf miсrоаrrау оf gеl-immоbilizеd соmроuпds on а сhiр bу сороlуmеrizаtiоп. ВiоТесhпiquе, 27, 592-606; Мирзабеков A.Д., Рубина A.Ю., Паньков СВ., Чернов Б. К Патент на изобретение N 2175972 «Cпocoб иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микpoчипa». Приоритет от 28.12.1999). Также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Sеligеr H., Нiпz M., Нарр E. "Агrауs оf immоbilizеd оligопuсlеоtidеs - сопtributiопs tо пuсlеiс асids tесhпоlоgу" Сurrепt Рhагmасеutiсаl Вiоtесhпоlоgу, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки, помимо стекла может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.). Также для изготовления микрочипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителей (см., например, Rаmаkrishпап R, Dоrris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, Ргоkhоrоvа А, Giеsеr L, Тоumа E, Lockner R, Таtа M, Zhu X, Patterson M, Shiрру R, Sendera TJ, Маzumdеr А. 2002. An аssеssmепt оf Моtоrоlа СоdеLiпk miсrоагrау реrfоrmапсе fоr gепе ехрrеssiоп рrоfiliпg аррliсаtiопs. Nисlеiс Асids Rеs. 30: еЗО).
Для изготовления биочипа настоящего изобретения используют набор олигонуклеотидов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 17-37, приведенные в Перечне последовательностей, а также Таблице 2. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют образец контрольной ДНК. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьировать и определяется только удобством для интерпретации результатов гибридизации.
Таблица 2. Список олигонуклеотидов, иммобилизованных на микрочипе.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
С помощью биочипа можно анализировать 9 групп аллелей гена HLA-DQAl : группа 101 объединяет аллели 0101XX, 0104XX, 0105, 0107; группа 102 - 0102XX; группа 103- 0103; группа 106 - 0106; группа 02 - 0201; группа 03 - 03XXXX, группа 04 - 04XXXX; группа 05 - 05XXXX; группа 06 - 06XXXX. Для простоты в дальнейшем группы аллелей 101, 102, 103, 106, 02, 03, 04, 05, 06 будем называть просто аллелями. Биочип позволяет анализировать четыре полиморфных участка во втором экзоне гена HLA-DQAl. На чипе каждый полиморфный участок представлен столбцом пар ячеек. Первый столбец имеет 4 строки, второй столбец - 2 строки, третий столбец - 3 строки, четвертый столбец - 2 строки. Первый полиморфный участок расположен между позициями 203 и 234. Первый вариант первого участка (первая строка первого столбца) отвечает за 101, 102, 103, 106 аллели, второй вариант первого полиморфного участка (вторая строка первого столбца) отвечает за 02 аллель, третий вариант первого полиморфного участка (третья строка первого столбца) отвечает за 03 аллель, четвертый вариант первого полиморфного участка (четвертая строка первого столбца) отвечает за 04, 05, 06 аллели. Второй полиморфный участок расположен между 134 и 152 позициями. Первый вариант второго полиморфного участка (первая строка второго столбца) отвечает за 101, 102, 106, 04, 05 аллели, второй вариант второго полиморфного участка (вторая строка второго столбца) отвечает за 103, 02, 06 аллели. Третий полиморфный участок расположен между 161 и 188 позициями. Первый вариант третьего полиморфного участка (первая строка третьего столбца) отвечает за 101 аллель, второй вариант третьего полиморфного участка (вторая строка третьего столбца) отвечает за 102, 103, 106, 04, 05 аллели, третий вариант третьего полиморфного участка (третья строка третьего столбца) отвечает за 04 и 06 аллели. Четвертый полиморфный участок расположен между позициями 191 и 207. Первый вариант четвертого полиморфного участка (первая строка четвертого столбца) отвечает за 101, 102, 103 аллели, второй вариант четвертого полиморфного участка (вторая строка четвертого столбца) отвечает за 106 аллель. Анализируя совокупность четырех полиморфных участков можно определить генотип.
В гене ABO можно выявить 5 полиморфных вариантов гена ABO, сочетание которых дает 15 групп. Локус ABO является высокополиморфным, и к настоящему времени опубликованы по нашим подсчетам около полутора сотен его аллелей. Подавляющее большинство из них встречаются крайне редко. Поэтому при выборе аллелей мы руководствовались в первую очередь частотой их встречаемости у белых европейцев, генетически наиболее близких к российской популяции. Для анализа были выбраны следующие группы аллелей: А, В, О1, Olv и О2, детерминирующие серологическую группу крови у подавляющего большинства белых европейцев. Сочетание анализируемых SNP позволяет определить аллели гена ABO, присутствующие в образце (таб. 3) В каждой из выбранных групп аллелей могут быть выделены аллели, различающиеся по другим SNP, но эти варианты редки и в подавляющем большинстве случаев серологически равнозначны между собой.
Таблица 3. Однонуклеотидные вариации среди аллелей гена ABO. В качестве дикого типа принято считать аллель А.
6 экзон 7 экзон
Позиция SNP
261 297 646 657 681
Аллель
A (w) G А T С G
В G T
О1 dеl dеl G А А
О2 G Ген амелогенина расположен на половой хромосоме и позволяет определять пол индивидуума. AMELX характеризуется трехбуквенной делецией (позиции 5878 - 5880). На биочипе иммобилизованы два олигонуклеотида (AMELX и AMELY), позволяющие анализировать наличие или отсутствие делеции.
Таким образом, разработанный биочип позволяет анализировать в целом 16 групп аллелей в трех генах.
Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают применение способа экспресс-анализа генетического полиморфизма. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем настоящего изобретения.
Пример 1. Амплификация фрагментов гена ABO методом двухэтапной «гнeздoвoй» мультиплексной ПЦР с целью наработки флуоресцентно меченого фрагмента гена, специфичного для каждого полиморфного варианта
От испытуемых были взяты окурки сигарет с фильтром. Со стороны фильтра стерильным инструментом отрезали 5-6 мм и удаляли бумагу. Для получения пропитанной потом бумаги, испытуемому предлагали слегка помять в руке лабораторную бумажную салфетку Кimbеrlу-Сlаrk. Также испытуемому предлагалось выпить воды из одноразового стакана, смыв с края стакана выполняли смоченной в стерильной воде салфеткой. Каждый из образцов помещали в 1,5-мл пробирку с 200 мкл стерильной воды, инкубировали 1-3 ч при температуре 23-250C, после чего выделяли ДНК набором Qiаgеп.
Для наработки интересующих фрагментов 6 и 7 экзонов использовали ПЦР- праймеры SEQ ГD NO: 1-8. Мультиплексную ПЦР проводили на приборе МiпiСусlеr (MJ Rеsеаrсh, Iпс, USA) в объеме 25 мкл реакционной смеси, составом: для 1-го этапа: I x буфер (67 мМ Трис-НСl, рН 8,6, 166 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Тритон X-100), 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из dNТР («Cилeкc», Россия), 5 пМ каждого из 4 праймеров (SEQ ID NO: 1-4), 1 мкл геномной ДНК и 1,5 ед. акт. Таq-полимеразы («Cилeкc», Россия). ДНК денатурировали 5 мин при 940C и проводили на первом этапе 35 циклов амплификации (94°C - 30 с, 60°C - 30 с, 72°C - 1 мин), затем 7 мин при 72°C. Смесь второго этапа ПЦР отличалась составом и концентрацией праймеров: верхние праймеры (SEQ ID NO: 5, 7) брали в концентрации 5 пМ, а нижние (SEQ ID NO: 4, 6) - 50 пМ. В смесь добавляли 2 мкл продукта из первого этапа и амплифицировали по схеме: 3,5 мин 94°C, 34 цикла (94°C - 30 с, 62°C - 30 с, 720C - 1 мин), 7 мин при 72°C. Наличие и длину ПЦР-продукта выявляли электрофоретически в 2%-нoм агарозном геле. Нижние праймеры 2-го этапа были предварительно помечены по 5' концу флуоресцентным красителем Cy5 (возб./исп.: 640/657 нм).
Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для определения генетического полиморфизма в генах ABO, HLA-DQAl и AMEL
Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNА/RNА Sупthеsizеr (Аррliеd Вiоsуstеms, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5'- или 3' -конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования З'-Аmiпо-Моdifiеr C7 CPG 500 (Glеп Rеsеаrсh, USA). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя. Олигонуклеотиды, меченные цианиновым красителем Cy- 3, очищают ВЭЖХ от олигонуклеотидов, не включивших флуоресцентный краситель, на колонке «Hypersil ODS 5 мкм, 4,6x250 мм» («Sypelco Int», США).
Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Патент на изобретение N 2175972 «Cпocoб иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микpoчипa» Мирзабеков A.Д., Рубина A.Ю., Паньков СВ., Чернов Б. К. Приоритет от 28.12.1999). Биочип содержит 21 тип иммобилизованных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 17-37), список которых представлен также в Таблице 2. На Фиг. 1. представлена схема биочипа для идентификации личности.
Для примера определим генотип по гибридизационной картине, представленной на Фигуре 2. Первый полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается в первой и четвертой строках, следовательно, присутствует аллель из группы 101, 102, 103, 106 и аллель из группы 401, 501, 601. Далее второй полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается в первой строке, следовательно присутствие 103 и 601 аллелей исключаем. Третий полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается во второй строке, следовательно исключаем наличие 101 и 401 аллелей. Четвертый полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается в первой строке, следовательно исключаем 106 аллель. В результате для рассматриваемого образца получаем генотип HLA-DQAl : 102/501.
Рассмотрим область биочипа, ответственную за генотипирование гена ABO. Сопоставим результаты гибридизации с данными из Таблицы 3: Мутация по 261 позиции исключает все группы аллелей, кроме О1 и Olv. Т.к. образец является гетерозиготой по позиции 297, следовательно, в нем присутствуют обе аллели: О1 и Olv, в противном случае мы имели бы дикую либо мутантную гомозиготу по этой позиции. Гетерозиготность позиции 646 и дикий тип позиции 657 также подтверждают генотип O'/Olv.
Ген амелогенина представлен одной аллелью (Фиг. 2): AMELX, из чего можно заключить, что образец принадлежит женщине.
Пример 3. Гибридизация меченого продукта на биочипе
Содержимое всех пробирок, полученных на стадии 2 Примера 1, используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 25% формамид (Gibсо BRL), 5xSSPE. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95° С в течение 5 мин, охлаждают во льду 2 мин., и наносят на биочип в гибридизационную камеру объемом 20 мкл (Sigmа, USA). Гибридизацию проводят в течение 10-14 ч при температуре 37° С. Отмывку проводят в буфере Ix SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.
Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации
Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биoчип- ИMБ». При визуальном анализе изображения интерпретацию результатов проводят как в примере 2. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы ImаgеWаге™ выходит за рамки настоящего изобретения. Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.
Конкретные используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения изобретения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного выше изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Claims

Формула изобретения
1. Способ анализа генетического полиморфизма для целей генетической идентификации личности, включающий верификацию полиморфных вариантов последовательности в образце ДНК, предусматривающий следующие стадии:
(а) - амплификация полиморфных фрагментов генов методом мультиплексной «гнeздoвoй» двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой в качестве матрицы для амплификации используют образец ДНК, с использованием набора праймеров с последовательностями, представленными в SEQ Ш NO: 1-16, с получением на втором этапе ПЦР меченого ПЦР-продукта;
(б) - обеспечение биочипа для идентификации полиморфных фрагментов генов, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37;
(в) - гибридизация амплифицированного меченого ПЦР-продукта на биочипе;
(г) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации.
2. Способ по п. 1, в котором на втором этапе ПЦР для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта используют флуоресцентно меченные по 5 '-концу праймеры.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором биочип обеспечивают методом фотоиндуцируемой сополимеризации в гидрогеле.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором используют условия гибридизации, обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции.
6. Способ по п. 5, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой.
7. Способ по п. 5, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором интерпретацию результатов проводят визуально.
9. Способ по любому из пунктов 1-7, в котором интерпретацию результатов проводят с использованием программы автоматического анализа изображения.
10. Набор праймеров для амплификации полиморфных фрагментов генов в способе по любому из пп. 1-9, где последовательности праймеров представлены в SEQ ID NO: 1-16.
11. Набор олигонуклеотидов для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров по п. 10, с последовательностями, представленными в SEQ Ш NO: 17-37.
12. Биочип для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров по п. 10, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ Ш NO: 17-37.
PCT/RU2007/000016 2007-01-17 2007-01-17 Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) WO2008088236A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200900873A EA015913B1 (ru) 2007-01-17 2007-01-17 Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)
PCT/RU2007/000016 WO2008088236A1 (ru) 2007-01-17 2007-01-17 Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2007/000016 WO2008088236A1 (ru) 2007-01-17 2007-01-17 Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2008088236A1 true WO2008088236A1 (ru) 2008-07-24
WO2008088236A8 WO2008088236A8 (ru) 2009-07-16

Family

ID=39636169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000016 WO2008088236A1 (ru) 2007-01-17 2007-01-17 Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA015913B1 (ru)
WO (1) WO2008088236A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012129558A1 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 Zahalsky Michael P Use of genetic testing of patient biopsy specimens to confirm patient identification
RU2539733C2 (ru) * 2012-10-24 2015-01-27 Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ" Набор дифференцирующих нуклеотидов и биочип для применения в способе генотипирования маркеров гаплогрупп y-хромосомы человека: m130 (c), м145 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2650790C2 (ru) * 2012-07-24 2018-04-17 Натера, Инк. Способы и композиции для высокомультиплексной пцр

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5763184A (en) * 1996-01-30 1998-06-09 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleotide sequence variation in the ABO glycosyltransferase gene
US5851762A (en) * 1990-07-11 1998-12-22 Gene Type Ag Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis
US6449562B1 (en) * 1996-10-10 2002-09-10 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851762A (en) * 1990-07-11 1998-12-22 Gene Type Ag Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis
US5763184A (en) * 1996-01-30 1998-06-09 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleotide sequence variation in the ABO glycosyltransferase gene
US6449562B1 (en) * 1996-10-10 2002-09-10 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] 9 November 2005 (2005-11-09), accession no. EMBL Database accession no. (BD446271) *
HSU C.M. ET AL.: "Identification of victims of the 1998 Taoyuan Airbus crash accident using DNA analysis", INT. J. LEGAL MED., vol. 113, no. 1, 1999, pages 44, XP001145408, DOI: doi:10.1007/s004140050277 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012129558A1 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 Zahalsky Michael P Use of genetic testing of patient biopsy specimens to confirm patient identification
RU2539733C2 (ru) * 2012-10-24 2015-01-27 Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ" Набор дифференцирующих нуклеотидов и биочип для применения в способе генотипирования маркеров гаплогрупп y-хромосомы человека: m130 (c), м145 (de)

Also Published As

Publication number Publication date
EA200900873A1 (ru) 2009-12-30
WO2008088236A8 (ru) 2009-07-16
EA015913B1 (ru) 2011-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2182077B1 (en) A method for single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time polymerase chain reaction microarray
US7892731B2 (en) System and method for inhibiting the decryption of a nucleic acid probe sequence used for the detection of a specific nucleic acid
US6703228B1 (en) Methods and products related to genotyping and DNA analysis
JP2004166716A (ja) プローブアレイを使用して、遺伝子多型性を検出し、対立遺伝子発現をモニターする方法
CA2497740A1 (en) Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
EP1056889B1 (en) Methods related to genotyping and dna analysis
RU2303634C2 (ru) Способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к онкологическим заболеваниям и индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)
EP1947196A1 (en) Method of amplifying multiple nucleic acid sequences for differentiation
WO2008088236A1 (ru) Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)
US20070231803A1 (en) Multiplex pcr mixtures and kits containing the same
RU2609641C1 (ru) Способ анализа соматических мутаций в химерном гене BCR/ABL с использованием ОТ-ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
RU2539733C2 (ru) Набор дифференцирующих нуклеотидов и биочип для применения в способе генотипирования маркеров гаплогрупп y-хромосомы человека: m130 (c), м145 (de)
RU2674687C1 (ru) Способ анализа соматических мутаций в генах GNAQ и GNA11 с использованием LNA-блокирующей мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
CA2266750A1 (en) Cleaved amplified rflp detection methods
US20060078881A1 (en) Method and kit for detection of mutations in mitochondrial dna
US20060127932A1 (en) Method for the SNP analysis on biochips having oligonucleotide areas
RU2402771C2 (ru) Способ скрининга сердечно-сосудистых заболеваний и биочип для осуществления этого способа
AU2017289768B2 (en) Method for producing DNA probe and method for analyzing genomic DNA using the DNA probe
RU2453606C2 (ru) Способ расширенного скрининга предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям и биочип для осуществления этого способа
Lenstra The applications of the polymerase chain reaction in the life sciences
EP1207209A2 (en) Methods using arrays for detection of single nucleotide polymorphisms
RU2582216C2 (ru) Биологический микрочип с набором праймеров для анализа полиморфизма в генах ab0, hla-dqa1, amel, darc, nat2
JPWO2005090565A1 (ja) Ｄｎａアレイと一塩基多型の検出方法
RU2600874C2 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для генотипирования полиморфных локусов днк, ассоциированных с риском развития спорадической формы болезни альцгеймера в российских популяциях
RU2738752C1 (ru) Способ идентификации личности и установления родства с помощью InDel полиморфизмов и набор синтетических олигонуклеотидов для их генотипирования

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07793982

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200900873

Country of ref document: EA

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07793982

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1