RU2402771C2 - Способ скрининга сердечно-сосудистых заболеваний и биочип для осуществления этого способа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биологии, а именно к способам молекулярной диагностики. Предложен способ обнаружения точечных нуклеотидных замен в генах человека, ответственных за предрасположенность и развитие сердечно-сосудистых заболеваний. В основу изобретения положена также задача создания биочипа, обеспечивающего оптимальное функционирование иммобилизованных в нем биологически значимых макромолекул. Путем амплификации и рестрикции фрагментов целевых генов получают одноцепочечные флюоресцентно меченые олигонуклеотиды и иммобилизуют их на биочипе, осуществляют гибридизацию меченого амплифицированного продукта на указанном биочипе, интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при гибридизации олигонуклеотидов мутантного и дикого типа с исследуемым геномом. Способ позволяет установить наличие мутаций в анализируемых положениях соответствующих генов. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 14 табл.

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине, в частности к способам выявления и идентификации известных полиморфизмов генов, ответственных за развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Изобретение также относится к технологии изготовления биочипов, находящих применение в молекулярной биологии при секвенировании и картировании ДНК, детектировании мутаций и целого ряда медицинских приложений.

Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время остаются наиболее частой причиной смерти населения развитых стран несмотря на достигнутые успехи в области диагностики, лечения данной патологии. Ведущее место в структуре смертности и инвалидности от заболеваний сердечно-сосудистой системы принадлежит ИБС. Острое нарушение коронарного кровообращения занимает ведущее место среди сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), смертность от которых в Российской Федерации составляет 56% в структуре общей смертности (Лупанов В.П. Вторичная профилактика ишемической болезни сердца / Русский медицинский журнал - 2005 - Т.13. - №11. - С.747-750).

Несмотря на проведенные обширные исследования по проблеме инфаркта миокарда и его последствий все еще возникают затруднения в выделении категории больных с высоким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений.

Точная диагностика в сочетании с детальным анализом типа наследования того или иного заболевания имеет определяющее значение для формирования групп риска, то есть отбора пациентов, у которых вероятность ССЗ повышена. Своевременное обнаружение предрасположенности к данным заболеваниям и соответствующая терапия позволяют резко повысить качество жизни пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

В настоящее время известно несколько методов, используемых для скрининга на сердечно-сосудистые заболевания. Например, можно выделить следующие.

Известен патент способ диагностики генетической предрасположенности к инфаркту миокарда у мужчин (RU №2182175, 2002.05.10), включающий выявление генотипов геномного локуса, содержащего аллель гена, отличающийся тем, что у исследуемых пациентов проводят генотипирование полиморфизма V64I гена CCR2 и при выявлении генотипа геномного локуса 3q21, содержащего аллель гена хемокинового рецептора CCR2 с заменой G на А в 190-й позиции кодирующей части, приводящей к замене V на I в 64-й позиции аминокислотной последовательности белка CCR2 641, диагностируют генетическую предрасположенность к инфаркту миокарда у мужчин.

Недостатки: данный способ оценивает всего лишь один фактор из множества влияющих на риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и поэтому не может дать полной информации о пациенте.

Известен анализ и применение полиморфных форм PARI для оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний (Заявка №2005136430, 2006.04.20), основанный на выявлении точечных мутаций в гене PARI. Изолированная полинуклеотидная последовательность гена PARI отличается тем, что в положении 3090 последовательности согласно NM_001992 имеется замена Т на С.

Недостаток данного способа в ограниченной информативности и невозможности предсказать риски развития различных патологий, сердечно-сосудистой системы независимых от гена PARI.

Известен способ определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям (патент RU №2304775, 2007.08.20), включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма генов, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза и заключительного синтеза, проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что проводят полимеразную цепную реакцию с использованием диагностического набора, при этом первичную денатурацию проводят в течение 7 мин при температуре 94°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий денатурацию при 94-96°С в течение от 1 мин до 1 мин 10 с, отжиг при температуре от 58 до 60°С в течение от 1 мин до 1 мин 10 с, синтез при температуре 72°С в течение от 1 мин до 1 мин 20 с, заключительный синтез в течение 5 мин при температуре 72°С, гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции проводят смесью эндонуклеаз рестрикции, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля, а затем определяют полиморфизм генов АСЕ, eNOS, MTHFR, GPIIIa.

Недостаток данного способа состоит в том, что он позволяет провести одновременный анализ лишь нескольких маркеров, что не позволяет перекрыть спектр даже наиболее частых мутаций, оказывающих влияние на предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям. К тому же данный способ требует до 3 суток на проведение анализа.

Общий недостаток вышеперечисленных методов: их нецелесообразно применять для массового скрининга, т.к. они трудоемки.

Предлагаемый способ позволит получить комплексную оценку генетических предрасположенностей пациента и достоверно оценить риски развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Знаменательным достижением биотехнологии последних лет стали биочипы. Точнее всего их описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе. Необычные устройства позволяют за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ и даже генетических дефектов. За короткое время биологические микрочипы выделились в самостоятельную область анализа с приложениями от исследования фундаментальных проблем молекулярной биологии и молекулярной эволюции до практических применений в медицине, фармакологии, экологии, судебно-медицинской экспертизе и др.

Технология биочипов, заменяющих целые иммунологические лаборатории, дает возможность в тысячи и десятки тысяч раз увеличить производительность большинства диагностических методов и резко снизить себестоимость анализов.

Известны способы изготовления биочипов на основе гидрогелей, в которых технологический цикл состоит из этапов: (1) подготовки подложки, (2) формирования на ней матрицы ячеек геля, (3) нанесения на ячейки растворов биологических макромолекул в соответствии с заранее составленной схемой биочипа, (4) химической обработки ячеек с целью иммобилизации молекул-зондов, (5) отмывки и просушки полученных биочипов.

Известен способ приготовления биочипа (Патент US №5574142, 1996.11. 12), согласно которому используют специальную тонкослойную (5 мкм) камеру с реакционным объемом, ограниченным с одной стороны подложкой будущего биочипа, а с другой - окном, прозрачным в УФ-области. Ячейки биочипа формируют одну за другой путем циклического выполнения следующих операций:

(1) заполнения камеры композицией с соответствующим зондом, (2) полимеризации композиции в месте нахождения будущей ячейки под действием УФ-излучения, сфокусированным в квадратное пятно необходимого размера, (3) промывки камеры перед заполнением ее очередным раствором.

Известен «Способ изготовления микрочипа на основе олигонуклеотидов» (Патент RU №2157385, 2000.10.10), согласно которому изготовляют микрочип на основе олигонуклеотидов, иммобилизованных в органическом геле, приготовленном путем сополимеризации непредельных производных олигонуклеотидов с ненасыщенными мономерами, причем водно-солевые растворы, содержащие ненасыщенные мономеры, модифицированные непредельными фрагментами олигонуклеотиды, и компонент каталитической системы, индуцирующей полимеризацию, растворимый только в воде, наносят на стеклянную подложку в виде микрокапель и проводят сополимеризацию мономеров погружением сформированной матрицы в не смешивающийся с водой органический растворитель, содержащий растворенный другой компонент каталитической системы.

Известно изобретение «Композиция (К) для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях методом сополимеризации, способ приготовления композиции и биочип» (Патент RU №2206575, 2003.06.20), которое относится к композициям (К) для полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях при формировании биочипов К=аА+bB+cC+dD+eE, включающим А - мономер на основе производных акриловой и метакриловой кислот; В - водорастворимый сшивающий агент; С - модифицированную биологическую макромолекулу, содержащую ненасыщенную группу, D - водорастворимое соединение как компонент среды проведения сополимеризации; Е - воду, где а, b, с, d, е - процентное содержание (X) каждого компонента в композиции (Х=m/v100% для твердых веществ и X=v/v100% для жидких веществ), в которой общее содержание мономера и сшивающего агента лежит в интервале 3-40% (3(a+b)(40), соотношение мономера и сшивающего агента находится в пределах 97: 3-60:40, а процентное содержание компонентов С, D и Е находится в пределах (с) от 0,0001% до 10%; (d) от 0% до 90%; (е) от 5% до 95%, способу их приготовления, к модифицированным биологически значимым соединениям ДНК и белкам, биочипу, в котором сформированный на подложке слой ила разделен пустыми промежутками на несколько ячеек, причем каждая из ячеек может содержать либо не содержать иммобилизованные макромолекулы, а макромолекулы, иммобилизованные в разных ячейках, могут различаться по своей природе и свойствам, и двум способам проведения полимеризационно-цепной реакции на биочипе.

Однако известные композиции для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях при формировании биочипов, биочипы и способы их изготовления имеют ряд недостатков.

1. Использование только акриламида как гелеобразующего компонента и N,N′-метиленбисакриламида как сшивающего агента при изготовлении гелей сильно ограничивает спектр получаемых гидрогелей по структуре и пористости.

2. Модифицированные олигонуклеотиды, используемые для изготовления биочипов, содержат только 5′-концевую метакриламидную группу, связанную с молекулой олигонуклеотида кислотолабильной фосфорамидной связью, или концевую аллильную группу, обладающую низким сродством к акриламиду и N,N′-метиленбисакриламиду - в реакции сополимеризации.

3. Известные биочипы отличаются низкой воспроизводимостью свойств гелевых ячеек и неоднородностью распределения в объеме ячейки иммобилизуемого соединения.

4. Известный способ проведения химической полимеризации компонентов композиции при изготовлении биочипа осуществляют в атмосфере влажного азота, что снижает эффективность полимеризации.

5. Известный способ фотоиндуцируемой полимеризации использует УФ-излучение с длиной волны 254 нм, что приводит к деструкции олигонуклеотидов.

6. Известные способы изготовления биочипов технически сложны и используют процедуры, не обеспечивающие необходимой однородности и воспроизводимости свойств гелевых ячеек и плохо поддающиеся автоматизации.

Вышеперечисленные недостатки методов диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и биочипов для их осуществления устраняются заявляемым изобретением.

Задача настоящего изобретения - создание нового ускоренного метода обнаружения точечных нуклеотидных замен в генах человека, ответственных за предрасположенность и развитие сердечно-сосудистых заболеваний. В основу изобретения положена также задача создания биочипа, обеспечивающего оптимальное функционирование иммобилизованных в нем биологически значимых макромолекул.

Поставленная задача решается новым способом обнаружения большого количества мутаций в ДНК обследуемого за один анализ биологической жидкости. В заявленном методе предложено использование получения одноцепочечных меченых фрагментов ДНК генома человека непосредственно из клинического образца (цельной крови, волос и т.п.). Присутствие или отсутствие мутаций ДНК определяют с помощью гибридизации полученных фрагментов на специализированном олигонуклеотидном биочипе. Метод включает также способы регистрации и интерпретации результатов анализа.

Существенные признаки метода:

(а) выделение геномной ДНК из клинического образца и амплификацию гена и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта; (б) - приготовление биочипа с иммобилизованными нуклеотидами; (в) - гибридизацию амплифицированного меченого продукта на биочипе; (г) - регистрацию и (д) - интерпретацию результатов гибридизации путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Новым в данной методике является то, что на стадии (а) используют амплификацию генов из списка SEQ ID 1-432 и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта методом ник-трансляции и рестрикции, при этом на стадии (а) применяется рестриктаза DPN2; на стадии (б) приготавливают биочип для скрининга предрасположенности к заболеваниям сердечно-сосудистой системы, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-432, на стадии (в) осуществляют гибридизацию меченого амплифицированного продукта на указанном биочипе; на стадии (г) регистрацию результатов проводят на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су5 и Су3 соответственно; на стадии (д) - интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации: если в ячейке первого ряда такого участка интенсивность сигнала выше, чем в остальных рядах, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, образец относят к дикому типу по данному нуклеотиду (не имеющему мутации в данном положении); если интенсивность сигнала в ячейке 2, 3 или 4 ряда отдельно или попарно (например, ячейки 2 и 3 ряда) выше, чем в остальных рядах, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, образец относят к мутантному типу по данному нуклеотиду; если интенсивность сигнала в ячейке первого ряда и одной из ячеек 2, 3 или 4 ряда выше, чем в остальных ячейках участка, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, то образец относят к гетерозиготному типу.

Размер амплифицированного одноцепочечного флюоресцентно меченого фрагмента составляет около 60 пар оснований (п.о.).

В качестве клинического образца используют цельную кровь, волосы, слюну, сперму, кусочки кожи.

Биочип для скрининга предрасположенности к заболеваниям сердечно-сосудистой системы содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-432 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, применение которого позволяет детектировать точечные мутации и делеции в генах, влияющих на предрасположенности к заболеваниям сердечно-сосудистой системы, с высокой специфичностью, а порядок размещения олигонуклеотидов обеспечивает возможность наиболее достоверно оценить наличие или отсутствие мутации и ее точную локализацию. При этом биочип содержит набор олигонуклеотидов SEQ ID 1-432 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, а также олигонуклеотиды, комплементарные олигонуклеотидам SEQ ID 1-432. А также он содержит от 1 до 4 копий набора олигонуклеотидов SEQ ID 1-432.

Биочип для скрининга сердечно-сосудистых заболеваний содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-432 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, применение которого позволяет детектировать точечные мутации и делеции в генах FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2 с высокой специфичностью, а порядок размещения олигонуклеотидов обеспечивает возможность наиболее достоверно оценить наличие или отсутствие мутации и ее точную локализацию. При этом биочип содержит набор олигонуклеотидов SEQ ID 1-432 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, а также олигонуклеотиды, комплементарные олигонуклеотидам SEQ ID 1-432. А также он содержит от 1 до 4 копий набора олигонуклеотидов SEQ ID 1-432.

Новый технический результат изобретения состоит в том, что разработанные новые приемы изобретения позволяют быстро и с высокой точностью провести анализ ДНК на наличие предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, при этом для анализа достаточно одной пробы крови /слюны, волос и т.п./.

Достижение нового технического результата обусловлено следующими положениями.

Применение рестрикции и ник-трансляции позволяет получать меченые фрагменты небольшого размера - около 60 п.о. - геномной ДНК. Получаемые одноцепочечные меченые фрагменты ДНК способны вступать в специфическое гибридизационное взаимодействие с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе. Известный порядок расположения олигонуклеотидов на биочипе дает возможность установить наличие или отсутствие мутаций генов, ответственных за развитие сердечно-сосудистых заболеваний в образце ДНК. Разработанные условия подготовки образца и гибридизации обеспечивают высокую степень дифференциации между теми ячейками биочипа, где прошла гибридизация, и теми, где не возникло специфических гибридизационных комплексов. Дизайн олигонуклеотидов обеспечивает абсолютную специфичность их взаимодействия с участками генов, ответственных за развитие сердечно-сосудистых заболеваний, содержащими исследуемую мутацию. При этом разработанный уникальный алгоритм формирования олигонуклеотидов биочипа позволяет создавать индивидуальные биочипы с заданными группами генов, мутаций в них и температурой плавления ДНК. Регистрация и обработка результатов осуществляется специализированной программой, позволяющей достоверно определить наличие сигнала по отношению к фоновому уровню.

К выделенной из образца ДНК добавляют рестриктазу DPN2 для разделения геномной ДНК на более мелкие фрагменты. Затем осуществляют ник-трансляцию с помощью ДНК-полимеразы (Klenow Fragment), в результате которой накапливаются флуоресцентно меченые одноцепочечные продукты. Полученные продукты гибридизуют на биочипе с иммобилизованными зондами, комплементарными последовательностям фрагментов исследуемых участков генов.

Подробное описание способа и клинические примеры его выполнения.

Обработка клинического образца

Целевая нуклеиновая кислота, в которой хотят определить интересующие полиморфизмы, обычно изолируется от образца ткани. Если цель - геномная ДНК, образец может быть получен из любой ткани (за исключением эритроцитов). Например, цельная кровь, лимфоциты периферической крови, кожа, волосы или сперма подходят для получения клинических образцов. Данные источники также подходят, если для анализа используется РНК. Если для анализа используется иРНК, образец должен выделяться из тканей, в которых экспрессируется иРНК. Если нуклеиновая кислота в образце - РНК, она обычно подвергается обратной транскрипции в ДНК. Если необходимо, ДНК образца или кДНК, полученная в результате обратной транскрипции, амплифицируется, например, с помощью ПЦР.

Набор олигонуклеотидов (ячейки биочипа), приведенных в SEQ ID 1-432, наносят на стеклянную подложку в виде капель с максимальной аккуратностью и воспроизводимостью с помощью роботов (например, BioOdyssey, Bio-Rad, США). Каждая сформированная ячейка представляет собой полусферу диаметром 1 мкм и периодом около 8 мкм и содержит иммобилизованный олигонуклеотид - зонд, комплементарный последовательности участка гена, связанного с наличием или отсутствием предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе синтезированы на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer. Applied Biosystems, США) и содержат спейсер со свободной аминогруппой 3′-Ammo-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research) для последующей иммобилизации на подложку биочипа.

Из образца выделяют геномную ДНК с помощью коммерческого набора DNA Box 500 (Protrans).

Полученную геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктазы DPN2. После фрагментации ДНК проводят реакцию ник-трансляции с помощью Klenow Fragment (Sigma, 40 ед/мкл) в присутствии Cy5-dCTP или Су3-dCTP (Amersham, I мМ раствор). Затем очищают ДНК с помощью фильтра microcon 30 (Amicon/Millipore) и проводят гибридизацию на биочипе.

Гибридизацию меченого образца на биочипе проводят в буфере следующего состава: 1М GuSCN; 50 мМ HEPES, рН 7,5; 5 мМ ЭДТА, рН 7.0. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибиридизационной камере объемом 30 мкл (Sigma) в течение ночи (16-18 часов) при 65°С. Отмывку проводят трижды в следующих буферах:

Первая отмывка: 2Х SSC, 0.03% SDS, 5 мин 70°С (для точного отделения специфичного от неспецифичного гибридизационного сигнала).

Вторая отмывка: 1X SSC, 5 мин при комнатной температуре.

Третья отмывка: 0.2Х SSC, 5 мин при комнатной температуре.

Регистрацию и фиксирование гибридизационной картины проводят с помощью автоматического комплекса, состоящего из сканера биочипов типа Innoscan 700 (Inopsys) и компьютера, на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су5 и Су3 соответственно. Обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят с помощью программы MapixSoftware (Inopsys).

По наличию флуоресценции в ячейках биочипа делают выводы о наличии, либо отсутствии исследуемого полиморфизма в определенном гене.

Обработка клинического образца.

Выделение геномной ДНК.

Выделение геномной ДНК осуществляют с помощью коммерчески производимого набора DNA Box 500 (Protrans) согласно рекомендаций производителя.

Меченые ДНК флуоресцентными красителями.

Полученную геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктазы DPN2. После фрагментации ДНК проводят реакцию ник-трансляции с помощью Klenow Fragment (Sigma, 40 ед/мкл) в присутствии Cy5-dCTP или Су3-dCTP (Amersham, 1 мМ раствор). Затем очищают ДНК с помощью фильтра microcon 30 (Amicon/Millipore) и проводят гибридизацию на биочипе.

Гибридизация меченого образца на биочипе.

Гибридизацию меченного образца на биочипе проводят в буфере следующего состава: 1М GuSCN; 50 мМ HEPES, рН 7,5; 5 мМ ЭДТА, рН 7.0. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибиридизационной камере объемом 30 мкл (Sigma) в течение ночи (16-18 часов) при 65°С. Отмывку проводят трижды в следующих буферах:

Первая отмывка: 2Х SSC, 0.03% SDS, 5 мин 70°С (для точного отделения специфичного от неспецифичного гибридизационного сигнала).

Вторая отмывка: 1X SSC, 5 мин при комнатной температуре.

Третья отмывка: 0.2Х SSC, 5 мин при комнатной температуре.

Регистрация и интерпретация результатов гибридизации - стадия (д).

Регистрацию и фиксирование гибридизационной картины проводят с помощью автоматического комплекса, состоящего из сканера биочипов типа Innoscan 700 (Inopsys) и компьютера, на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су5 и Су3 соответственно. Обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят визуально или с помощью программы MapixSoftware (Inopsys).

Интерпретацию результатов проводят следующим образом.

Внутри каждого участка биочипа размером 1 на 4 ячейки визуально или с помощью программного обеспечения сравнивают интенсивности флуоресцентного сигнала. Если в ячейке первого ряда такого участка интенсивность сигнала выше, чем в остальных рядах, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, образец относят к дикому типу по данному нуклеотиду (не имеющему мутации в данном положении). Если интенсивность сигнала в ячейке 2-го, 3-го или 4-го ряда отдельно или попарно (например, ячейки 2-го и 3-го ряда) выше, чем в остальных рядах, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, образец относят к мутантному типу по данному нуклеотиду (тип и расположение мутации устанавливают путем сравнения со схемой расположения олигонуклеотидов на биочипе). Если интенсивность сигнала в ячейке первого ряда и одной из ячеек 2-го, 3-го или 4-го ряда выше, чем в остальных ячейках участка, и выше порогового уровня, определяемого отрицательным контролем, то образец относят к гетерозиготному типу (одна аллель - дикий тип, вторая аллель - мутантный тип). В результате выдается заключение о наличии или отсутствии мутаций в анализируемых положениях соответствующих генов.

Олигонуклеотидный биочип для скрининга на сердечно-сосудистые заболевания.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer. Applied Biosystems, США) и содержат спейсер со свободной аминогруппой 3'-Ammo-Modifier C7 CPG 500 (Glen Researh) для последующей иммобилизации на подложку биочипа или 5′-Amino-Modifier C6 (Glen Researh) для введения флуоресцентной метки. Введение флуоресцентной метки Су5 осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя (Amersham).

Синтезированный набор олигонуклеотидов (ячейки биочипа) наносят на стеклянную подложку в виде капель с максимальной аккуратностью и воспроизводимостью с помощью роботов (BioOdyssey, Bio-Rad, США). Каждая сформированная ячейка представляет собой полусферу диаметром 1 мкм и периодом около 8 мкм и содержит иммобилизованный олигонуклеотид - зонд, комплементарный последовательности участка гена, связанного с наличием или отсутствием предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям.

Структура биочипа.

Биочип представляет собой набор олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке. Данный набор олигонуклеотидов формируется согласно следующему алгоритму:

1. Формируют базу данных из последовательностей генов и их мутаций популяционных частотах (этих мутаций), связанных с развитием сердечно-сосудистых заболеваний.

2. Задают группу генов, выбранную по медицинским показаниям для отдельного пациента.

3. Выбирают для указанных выше генов мутации:

популяционная частота встречаемости которых при заболевании более 70%, популяционная частота встречаемости которых при заболевании более 25%, все встречающиеся мутации при заболевании.

4. Задают температуру плавления ДНК Т_пл и концентрацию ионов натрия [Na⁺], при которых планируется проводить диагностику, и запоминают.

5. Для каждой выбранной мутации запоминают номер позиции замены нуклеотида в цепи ДНК - n₁, n₂, n₃ … n_i и осуществляют следующий цикл обработки.

6. Задают номера нуклеотидов K=n-30, L=n+30 и запоминают.

7. Выбирают отрезок гена а, ограниченный нуклеотидами К и L, и запоминают.

8. Рассчитывают температуру плавления Тпл1 ДНК для отрезка ДНК а, ограниченного нуклеотидами К и L, по известной формуле (Good, N.Е., Biochemistry 5, 467-476, 1986):

T_пл1=81.5+Log[Na⁺]+0.41*(G+C)/N-600/N, где:

[Na⁺] - заданная концентрация ионов натрия,

G - количество оснований гуанина в отрезке а,

С - количество оснований цитозина в отрезке а,

N - количество всех оснований в отрезке а,

и запоминают.

9. Сравнивают запомненные значения Т_пл и Т_пл1.

10. При Т_пл<T_пл1-0,5 переходят к пункту 11, при Т_пл>Т_пл1+0,5 переходят к пункту 16, при Т_пл=T_пл1=0.5 переходят к пункту 21.

11. Определяют номер олигонуклеотида L1 в отрезке ДНК а по формуле L1=L-1 и присваивают номеру олигонуклеотида L значение L1, что соответствует уменьшению отрезка а на один нуклеотид справа, и запоминают.

12. Повторяют последовательность действий указанных выше пунктов 7-9 для этого отрезка ДНК а и при Т_пл<T_пл1-0,5 переходят к пункту 13, при Т_пл=Т_пл1±0.5 переходят к пункту 21.

13. Определяют номер олигонуклеотида К1 в отрезке ДНК а по формуле К1=К+1 и присваивают номеру олигонуклеотида К значение К1, что соответствует уменьшению отрезка а на один нуклеотид слева, и запоминают.

14. Повторяют последовательность действий указанных выше пунктов 7-9 для этого отрезка ДНК а и при Т_пл<T_пл1+0,5 переходят к пункту 11, при Т_пл=Т_пл1±0.5 переходят к пункту 21.

15. Продолжают цикл обработки, указанный в пунктах 7-14, поочередно с уменьшением отрезка ДНК а то справа, то слева, до тех пор, пока температура плавления отрезка ДНК Т_пл1 не станет равной заданной температуре плавления ДНК Т_пл. В результате получен отрезок ДНК, содержащий мутацию, характерную для одного заболевания.

16. Определяют номер олигонуклеотида L1 в отрезке ДНК а по формуле L1=L+1 и присваивают номеру олигонуклеотида L значение L1, что соответствует увеличению отрезка а на один нуклеотид справа.

17. Повторяют последовательность действий указанных выше пунктов 7-9 для этого отрезка ДНК а и при Т_пл>T_пл1+0,5 переходят к пункту 18, при Т_пл=T_пл1±0.5 переходят к пункту 21.

18. Определяют номер олигонуклеотида К1 в отрезке ДНК а по формуле К1=К-1 и присваивают номеру олигонуклеотида К значение К1, что соответствует увеличению отрезка а на один нуклеотид слева.

19. Повторяют последовательность действий указанных выше пунктов 7-9 для этого отрезка ДНК а и при Т_пл>T_пл1+0,5 переходят к пункту 18, при Т_пл=Т_пл1±0.5 переходят к пункту 21.

20. Продолжают цикл обработки, указанный в пунктах 7-9 и 16-19, поочередно с увеличением отрезка ДНК а то справа, то слева, до тех пор, пока температура плавления отрезка ДНК Т_пл1 не станет равной заданной температуре плавления ДНК Т_пл. В результате получен отрезок ДНК, содержащий мутацию, характерную для одного заболевания.

21. Получен отрезок ДНК а с заданной температурой плавления, содержащий мутацию, характерную для одного заболевания.

22. Формируют 3 отрезка a₁, a₂ и a₃, идентичных отрезку гена а, за исключением нуклеотида в положении n, таким образом, что все четыре отрезка а-а₃ имеют различные нуклеотиды (А, Т, G и С) в положении n.

23. Формируют 4 олигонуклеотида b, b₁, b₂, b₃, комплементарных соответствующим олигонуклеотидам а, а₁, а₂, а₃. В результате получают 8 олигонуклеотидов для одной мутации: 4 прямых и 4 обратных, содержащих все варианты точечных замен в позиции n.

24. Повторяют весь цикл обработки, указанный в п.п.7-23 для каждой выбранной мутации. В результате получают сформированный набор последовательностей олигонуклеотидов, содержащих мутации генов, характерных для всех заданных групп сердечно-сосудистых заболеваний.

Для детекции мутаций типа SNP используют набор олигонуклеотидов, состоящий из двух частей. Первая часть представляет собой множество олигонуклеотидов, каждый олигонуклеотид точно комплементарен участку ДНК гена, содержащему исследуемую позицию. Вторая часть набора состоит из олигонуклеотидов, точно комплементарных участку ДНК гена, содержащему исследуемую позицию, за исключением нуклеотида в исследуемой позиции, таким образом, что на одну исследуемую позицию приходится 3 олигонуклеотида с разными нуклеотидами в исследуемом положении. В итоге на одно исследуемое положение для одной цепи ДНК приходится 4 олигонуклеотида, отличающихся нуклеотидом в исследуемом положении. Такой подход позволяет определить, какой из нуклеотидов А, С, G или Т находится в исследуемой позиции, и соответственно сделать заключение о наличии или отсутствии мутации в данном положении. В набор олигонуклеотидов биочипа входят олигонуклеотиды, комплементарные как прямой цепи ДНК гена, так и обратной. Кроме того, набор олигонуклеотидов может быть нанесен на биочип в нескольких копиях (от 1 до 4 копий). Это позволяет повысить чувствительность анализа.

Для детекции делеций используют набор олигонуклеотидов, состоящий из двух частей. Первая часть набора олигонуклеотидов такая же, как и для детекции мутаций типа SNP. Вторая часть состоит из множества олигонуклеотидов, точно комплементарных участку ДНК гена, за исключением того, что в данных олигонуклеотидах отсутствует нуклеотид(ы) в исследуемом положении. В результате для исследования одной делеции в одной цепи ДНК используется 2 олигонуклеотида. В набор олигонуклеотидов биочипа входят олигонуклеотиды, комплементарные как прямой цепи ДНК гена, так и обратной. Кроме того, набор олигонуклеотидов может быть нанесен на биочип в нескольких копиях (от 1 до 4 копий).

Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе ДНК и наносят на биочип таким образом, что олигонуклеотиды, комплементарные участку гена прямой цепи ДНК («прямые» олигонуклеотиды), содержащему 1 положение мутации, расположены в столбик один за другим, при этом верхнее положение занимает олигонуклеотид, комплементарный дикому типу гена (т.е. не содержащий мутации). Олигонуклеотиды, комплементарные участку гена обратной цепи ДНК, содержащему соответствующее положение мутации, располагают таким же образом, как и «прямые». Олигонуклеотиды располагают на биочипе случайным образом с учетом вышеуказанных условий. Для увеличения чувствительности метода биочип может содержать от 2-х до нескольких копий набора олигонуклеотидов. Кроме того, на биочипе расположены 10 ячеек, содержащих неспецифичные к исследуемому геному олигонуклеотиды, выполняющие роль отрицательного контроля.

При клинических испытаниях предлагаемого способа были изготовлены биочипы, содержащие наборы праймеров SEQ ID №1-432. Для выявления мутаций было обследовано 12 больных с клиническим диагнозом инфаркт миокарда, 39 больных с клиническим диагнозом гипертензия, 12 больных с диагнозом атеросклероз и 50 человек без каких-либо клинических проявлений со стороны сердечно-сосудистой системы. В результате испытаний предлагаемого способа были получены следующие результаты:

- среди больных с клиническим диагнозом инфаркт миокарда 4 оказались гетерозиготами по мутации в гене АСЕ Alu I/D и имели генотип ID, 1 - гетерозиготой с генотипом S49G по гену ADRB1, 3 - гетерозиготой с генотипом R176C по гену АРОE, у одного больного выявлена гетерозиготная мутация А387Р в гене THBS4;

- среди больных с диагнозом гипертензия 5 являлись гетерозиготами по мутации в гене АСЕ Alu I/D и имели генотип ID и один оказался гомозиготой с генотипом DD;

- среди больных атеросклерозом один являлся гомозиготой по замене R176C в гене АРОЕ и еще 1 являлся гетерозиготным носителем мутации АРОВ, DIP 51209:51210.

Клинический пример 1.

Женщина 55 лет. Легкая степень гипертензии. Артериальное давление находится в пределах 140-159/90-99 мм рт.ст. Семейный анамнез ранних проявлений сердечно- сосудистых заболеваний не зарегистрирован.

Было проведено молекулярно-генетическое типирование по заявляемому методу с помощью биочипа на наиболее частые мутации в генах FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2.

С помощью предлагаемого метода установлен генотип больной Ш-вой:

- АСЕ I/D. Гетерозиготная замена Е429А в гене MTHFR.

Клинический пример 2.

Мужчина 61 год. Вторая степень гипертензии, или умеренная. Артериальное давление в диапазоне 160-179/100-109 мм рт.ст. Сахарный диабет 2 типа. Ведет малоподвижный образ жизни, курит более 60 сигарет в день.

Было проведено молекулярно-генетическое типирование по заявляемому методу с помощью биочипа на наиболее частые мутации в генах FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2.

С помощью биочипа установлен генотип больного А-ина: - гетерозиготная замена А387Р в гене THBS4, гомозиготная делеция DIP 3152443:3152444 в гене EDN1, гетерозиготная замена R279K в гене АРОА4.

Клинический пример 3.

Женщина 48 лет. Вторая степень гипертензии, или умеренная. Артериальное давление в диапазоне 160-179/100-109 мм рт.ст. В семейном анамнезе есть случаи ранних сердечно-сосудистых заболеваний.

Было проведено молекулярно-генетическое типирование по заявляемому методу с помощью биочипа на наиболее частые мутации в генах FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2.

С помощью разработанного биочипа установлен генотип больно Ц-ко: гетерозигота DIP 1702589:1702594 в гене MEF2A, гетерозиготная замена P554L в гене АРОВ и гетерозиготная делеция DIP80056097:80056098 в гене FGA, гетерозиготная замена А387Р в гене THBS4.

Клинический пример 4.

Мужчина 65. лет Тяжелая, третьей степени, гипертония. Артериальное кровяное давление выше 180/110 мм рт.ст. Есть случаи смерти родственников от сердечно-сосудистых заболеваний.

Генотипирование проводилось на наиболее частые мутации в генах FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2.

Было установлено, что больной К-ов являлся гетерозиготой с генотипом D/I по гену АСЕ, гетерозиготой по локусу. DIP 80056097:80056098 в гене MEF2A и гетерозиготой по локусу G389R в гене ADRB1.

Преимущества для клинической практики заявляемого способа диагностики и биочипа для его осуществления состоят в следующем.

Продолжительность анализа составляет 24 ч. Точность метода составляет 98% и перекрывает 78% случаев обнаруженных моногенных заболеваний у детей.

Условия гибридизации и отмывка обеспечивают высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами и таким образом позволяют осуществлять процедуру в условиях ординарной диагностической лаборатории.

Метод выгодно отличается от существующих в настоящее время аналогов простотой выполнения и низкой себестоимостью и может быть широко рекомендован в клиническую практику.

Claims (6)

1. Способ обнаружения точечных нуклеотидных замен в генах человека, ответственных за предрасположенность к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, включающий: (а) выделение геномной ДНК из клинического образца и амплификацию гена и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта; (б) приготовление биочипа с иммобилизованными нуклеотидами; (в) гибридизацию амплифицированного меченого продукта на биочипе; (г) регистрацию и (д) интерпретацию результатов гибридизации путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации, отличающийся тем, что на стадии (а) используют амплификацию участков генов FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2, содержащих полиморфные локусы мутаций перечисленных в SEQ ID 1-432, и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта методом ник-трансляции и рестрикции, при этом на стадии (а) применяется рестриктаза DPN2;
на стадии (б) приготавливают биочип для скрининга предрасположенности к заболеваниям сердечно-сосудистой системы, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-432;
на стадии (в) осуществляют гибридизацию меченого амплифицированного продукта на указанном биочипе;
на стадии (г) - регистрацию результатов проводят на длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Су 5 и Су 3 соответственно;
на стадии (д) - интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при гибридизации олигонуклеотидов мутантного и дикого типа, с исследуемым геномом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клинический образец включает биологическую жидкость или ткань человека.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что размер амплифицированного одноцепочечного флюоресцентно меченого фрагмента составляет около 60 п.о.

4. Биочип для обнаружения точечных нуклеотидных замен в генах человека, ответственных за предрасположенность к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-432 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, применение которого позволяет детектировать точечные мутации и делеции в генах FGA, MEF2A, EDN1, АРОВ, АРОА5, АРОА4, АСЕ, AGXT, FBN1, MTHFR, TNBS4, ADRB1, АРОЕ, CCR2.

5. Биочип по п.4, отличающийся тем, что биочип содержит набор олигонуклеотидов SEQ ID 1-432 и 10 неспецифичных олигонуклеотидов в качестве контроля, а также олигонуклеотиды комплементарные олигонуклеотидам SEQ ID 1-432.

6. Биочип по п.4, отличающийся тем, что он содержит от 1 до 4 копий набора олигонуклеотидов SEQ ID 1-432.