JP2006520206A - プローブ、バイオチップおよびそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)6〜30ヌクレオチドの長さの標的特異的配列;
(b)10ヌクレオチドより長さが短く、標的特異的配列の5’側にある第1腕;および
(c)10ヌクレオチドより長さが短く、標的特異的配列の3’側にある第2腕、
を含むヘアピンを形成することのできる核酸プローブに関する。ここで、標的特異的配列は前記プローブの他のどの部分とも相補的でなく;さらに第1腕と第2腕は互いに完全に相補的である。
(a)基板;および
(b)少なくとも2つの本発明のプローブ、
を含むバイオチップに関する。
好ましくは、固定されていないプローブはヘアピン型である。
(a)
(i)長さが6〜30ヌクレオチドの標的特異的配列;および
(ii)10〜50ヌクレオチドの長さで、前記標的特異的配列の5’端に結合されたタグ配列と呼ぶ配列、
を含む少なくとも2つの無ラベルの第1プローブを含み(ここで前記標的特異的配列は前記無ラベルプローブの他のどの部分とも相補的でない);
(b)本発明のバイオチップ、
を含むシステムに関する。
好ましくは、前記無ラベルの第1プローブは:
(i)6〜30ヌクレオチドの長さの標的特異的配列;
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の5’側にある第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の3’側にある第2腕;および
(iv)10〜50ヌクレオチドの長さで、第1腕または第2腕に結合されたいわゆるタグ配列、
を含み、ここで、標的特異的配列が前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的ではなく;さらに第1腕および第2腕は互いに完全に相補的である。
そうすると、同一の「レポーター」分子が第1および第2プローブの一方または他方とハイブリダイズできる。
(i)6〜30ヌクレオチドの長さの、第2標的に特異的な配列;
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の5’側にある前記第2プローブの第2第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の3’側にある前記第2プローブの第2第2腕;および
(iv)第1腕または第2腕を基板に結合するリンカー、
を含む。第2プローブの前記標的に特異的な前記配列は、前記第2プローブのどの他の部分とも相補的ではなく;前記第2プローブの前記第1腕および前記第2腕は互いに完全に相補的であり;そしてさらに、前記タグに結合した腕配列により完成された第1プローブのうちの1つの前記タグ配列は、第2プローブのうちの1つの前記第2の標的配列と相補的である。
(a)生体外で核酸試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること;および、
(b)工程(a)の接触の結果開構造を取っている、バイオチップの少なくとも1つの前記プローブからの信号を検出すること;
を含む方法に関する。
(a)核酸試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること(ここでバイオチップの少なくとも1つのプローブは、遺伝的変異体に特異的なプローブであり、前記遺伝的変異体と完全に相補的なループ領域を有する);および
(b)前記遺伝的変異体に特異的なプローブからの信号を検出すること(ここで工程(b)において検出される信号が核酸試料中に前記遺伝的変異体が存在することを示す)、
を含む方法に関する。
(a)核酸試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること(ここで、少なくとも1つのプローブは、有機体またはその残存物の核酸に特異的である);および
(b)前記プローブからの、核酸を含む有機体に特異的な信号を検出すること、
を含む方法に関する。なお工程(b)で検出される信号は、核酸を含む有機体またはその残存物の存在を示す。
(a)核酸試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること(ここで、バイオチップの少なくとも1つのプローブは、遺伝子のエクソンに特異的であるかまたは2つのエクソンの接続部に特異的なプローブである);および
(b)遺伝子のエクソンに特異的な、または2つのエクソンの接続部に特異的なプローブからの信号を検出すること、
を含む方法に関する。なお工程(b)で検出される信号が、核酸試料中に遺伝子の選択的スプライシング産物が存在することを示す。
(a)オリゴヌクレオチドを含む試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること;および
(b)バイオチップの少なくとも1つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法に関する。なお工程(b)で検出される信号を、オリゴヌクレオチドの配列の決定に使用する。
(a)生体液または組織からの少なくとも2つの核酸試料からの1対のプライマーを用いて、少なくとも1つのマイクロサテライト型の染色体DNA領域を増幅すること(ここで、細胞または組織から得た少なくとも1つの試料は対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失を有しておらず、さらにここで、各組織または流体が増幅中に区別してラベルされる。);
(b)前記プライマーを増幅後に除去すること;
(c)前記増幅産物を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること(ここで、バイオチップの少なくとも1つのプローブが前記染色体DNA領域の増幅に用いたプライマーと相補的である。);および、
(d)前記バイオチップの少なくとも1つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法に関する。なおなお工程(d)で検出する信号を、核酸試料の1つの中の対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失の存在を決定するために用いる。
本発明は、無ラベルのヘアピンを形成することができるプローブ、複数個の本発明のプローブを含むバイオチップ、および本発明のプローブとバイオチップを調製し使用する方法に関する。それを以下に詳しく記載し、また実施例を挙げる。
本発明は、ヘアピンを形成することができるプローブのバイオチップであって、
(a)基板;および
(b)(i)6〜30ヌクレオチドの長さの標的特異的配列;
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで、標的特異的配列の5’側にある第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで、標的特異的配列の3’側にある第2腕;および、
(iv)第1腕または第2腕を前記基板と連結するリンカー;
を含む、少なくとも2つのヘアピンを形成することができる無ラベルのプローブ、
を含むバイオチップに関する。ここで、標的特異的配列は前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的でない。さらに、各プローブの第1腕と第2腕とは互いに完全に相補的である。
ヘアピンプローブを、一定濃度の塩、一定の温度、および一定濃度の1以上の付加的な化学物質、例えばホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウムクロリドおよび界面活性剤など、と共に使用するように設計できる。ヘアピンプローブを用いるための一定の温度を、始めに標的特異的配列と標的分子の融解温度「Tm」を「最近傍」Tm計算方法によりMeltcalcソフトウエアを用いて計算して取得できる(Schutz, E. et al. 1999. Biotechniques 27:1218-1224.; Allawi H.T. et al. 1998. Biochemistry 37(8): 2170-9; Allawi H.T. et al. 1997. Biochemistry 36:10581-94; Peyret N. et al. 1999. Biochemistry 38:3468-77、参照)または(Oligo 6, Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO.; Meltcalc, www.meltcalc.de、参照)。Meltcalcはミスマッチのあるまたはミスマッチのないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの熱力学的融点を計算する表計算ソフトウエアである。Melcalcは様々な塩およびオリゴヌクレオチド濃度に基づいてオリゴヌクレオチドの融解温度を与える。標的と標的特異的配列の間に形成されるハイブリッドの好ましいTm(「標的特異的配列と標的分子の間に形成されるハイブリッドのTm」)が100nM標的特異的配列と100mM塩濃度において60±10℃であり、ナトリウム(NaCl)とマグネシウム(MgCl2)が好ましい塩である。
Dtm=Tms−Tml,ここで、Tm=ステムTm、およびTml=ループTm、であり、Tmは先に記載した通りに決定する。より詳細には、ステムのTmはプローブの第1および第2腕が会合して形成するハイブリッドの融解温度(Tm)である。ループのTmは標的分子と標的特異的配列の間に形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)である。
ヘアピンプローブを基板上に固定または包含させて、1以上の標的分子に対して配列特異性を有するヘアピンプローブのバイオチップなど(これに制限される訳ではないが)の製品を形成することができる。またヘアピンプローブをビーズまたはサブミクロンの粒子(これらに制限される訳ではないが)などの様々な基板に固定してもよい。各標的特異的ヘアピンプローブを、それを固定した後に、各ヘアピンプローブを他から区別している物理的、化学的、または光学的性質により特定することができる。プローブをまた、2次元システムまたは個別のアドレス指定システムを用いて、固体表面において直接合成できる。ヘアピンプローブの固定化が起こるために、ヘアピンプローブは、既に述べたように少なくとも1つの結合した部分、「リンカー」を含む。リンカーを有するヘアピンプローブはまた、リンカーに親和性を持ち基板に付着した部分によって固定されてもよい
本発明の方法と組成物により解析される標的分子には、核酸分子、特にメッセンジャーRNA(mRNA)分子、リボソームRNA(rRNA)分子、cRNA分子(即ち試験管内で転写してcDNA分子から調製するRNA分子)およびその断片などの(それらに限られないが)RNA分子が含まれる。本発明の方法と組成物によってさらに解析される標的分子には、ゲノムDNA分子、cDNA分子、およびオリゴヌクレオチド、EST、STS、マイクロサテライト配列などを含むそれらの断片などのDNA分子も含まれる。しかしそれらに限られない。本発明の方法と組成物によって解析される他の標的分子には、タンパク質、タンパク質を含む複合体、他の分子、およびDNAに親和性を有するそのような他の分子の複合体、例えば転写因子、DNA修復系のタンパク質、および抗−DNA抗体(それらに限られないが)、もまた含まれる(Fang, W. et al. 2000. Anal. Chem. 72:3280-5; Bar-Ziv, R. et al 2001.P.N.A.S. U.S.A. 98:9068-73; Hamaguchi, N. et al. 2001. Anal. Biochem. 294:126-31)。転写因子に対しては、ヘアピンプローブを、転写因子に対するどの推定上の親和性配列をヘアピンプローブのループ中に設計できるか、またどの配列が転写因子に対してより高い親和性を有するか、を決定するために使用することができた。
本発明のヘアピンプローブは、標的分子をスクリーニングするために使用するときに、2つの二者択一の立体構造を取るように設計されている。これらの2つの立体構造、「閉」構造と「開」構造を図2に示す。図2Aおよび図2Bの両方が基板に連結されたヘアピンプローブを示す。
図2Aが閉構造のヘアピンプローブを示す。ヘアピンプローブの特定の標的が存在しないとき、プローブの腕が互いにハイブリダイズして「ステム」201を形成し、また標的特異的配列が「ループ」202を形成する。ヘアピンプローブの他の立体構造は可能でない。何故ならヘアピンプローブの腕は互いにのみハイブリダイズするように設計されているからである。ヘアピンプローブによってスクリーニングするための好ましい一定温度は、ループの標的特異的配列とその標的分子の会合により形成されるハイブリッドのTmより5〜10℃低い。この温度はプローブの長さ、およびループ構造中に付加的な突然変異が存在するかしないかに依存して変化する。より長いまたはより短い標的特異的配列またはステム配列を用いて、最適のハイブリダイゼーション温度を修正する。標的分子と会合したときヘアピンプローブが構造変化を受ける。ループ配列の一部が標的分子と会合(即ち、核酸の標的特異的配列とその標的核酸とのアニーリング)するとヘアピン構造を強制的に開に変える。
本発明はまた、プローブの腕の長さに等しい長さを含む核酸配列などの、1以上の付着しておらず、ラベルされたまたは無ラベルの「レポーター」分子を含む。本発明はこのように、「レポーター」分子がヘアピンプローブのいずれかとハイブリダイズできる本発明のプローブのバイオチップを目的とする。本発明のヘアピンプローブを「レポーター」分子と共に用いることができる。レポーター分子はプローブの開構造とのみハイブリダイズでき、それにより開構造と閉構造を区別して、標的分子がヘアピンプローブの標的特異的配列と会合するときにのみ信号を生成する。
本発明は、固定されていないヘアピンプローブを固定されたヘアピンプローブと組み合わせて用いるシステムもまた目的としている。汎用アドレス指定システム(universal addressing system "UAS")と呼ばれるこの生体外スクリーニングシステムは、使用者作製の固定されていないヘアピンプローブと共に使用するのに適した、予め作製された固定されたヘアピンプローブまたは直鎖状プローブのアレイの利点を提供し、したがって最終使用者がバイオチップを作製する手間を省く。例えば、UASは、固定されたヘアピンプローブの標的特異的配列が、特異的配列タグを有する固定されていないヘアピン状または直鎖状プローブと会合するように設計された、ヘアピンプローブの予め特定された一組を含む汎用のバイオチップを提供することができる。これが任意の検査条件で使用できる単一のバイオチップの構築を可能にする。検出対象の標的ヌクレオチドは、最初に固定されていないヘアピンまたは直鎖プローブの標的特異的配列により捕獲され、そのプローブは次に特異的配列のタグを介して固定されたヘアピンプローブと会合するように設計されている。
(a)(i)6〜30ヌクレオチドの長さの標的特異的配列;および
(ii)標的特異的配列の5’端に結合した10〜50ヌクレオチドの長さの「タグ」配列、
を含む少なくとも2つの無ラベルで直鎖状の第1プローブと、
(ここで標的特異的配列は前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的でない)
(b)ヘアピンを形成できる少なくとも2つの第2プローブであって、
(i)6〜30ヌクレオチドの長さの第2標的に特異的な配列;
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで前記標的特異的配列の5’側にある前記第2プローブの第2第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで前記標的特異的配列の3’側にある前記第2プローブの第2第2腕;および、
(iv)第1または第2腕を基板に結合するリンカー、
を含む第2プローブ、
(ここで、第2プローブの前記標的に特異的な前記配列は前記第2プローブの他のどの部分とも相補的ではなく;前記第2プローブの前記第1腕および前記第2腕は互いに完全に相補的であり;またさらにここで、第1プローブの1つの前記タグ配列は第2プローブの1つの前記第2標的配列と相補的である。)
とを含むシステムを目的としている。
(a)(i)6〜30ヌクレオチドの長さの標的特異的配列;および
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の5’側にある第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の3’側にある第2腕;
および
(iv)10〜50ヌクレオチドの長さで、第1腕または第2腕に結合した「タグ」配列、
を含む少なくとも2つの無ラベルのヘアピンを形成できる第1プローブと、
(ここで標的特異的配列は前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的ではなく;さらにここで、第1腕と第2腕は互いに完全に相補的であり);
(b)(i)6〜30ヌクレオチドの長さで、第2標的に特異的な配列;
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の5’側にある前記第2プローブの第2第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の3’側にある前記第2プローブの第2第2腕;および、
(iv)第1または第2腕を基板に結合するリンカー、
を含む少なくとも2つのヘアピンを形成できる第2プローブ、
(ここで、第2プローブの前記標的に特異的な前記配列は前記第2プローブの他のどの部分とも相補的ではなく;前記第2プローブの前記第1腕および前記第2腕は互いに完全に相補的であり;またさらにここで、このタグに結合した腕配列で終わる第1プローブの1つの前記タグ配列は、第2プローブの1つの前記第2標的配列と相補的である)を含むシステムを目的としている。
本発明はまた、
(a)体外で核酸試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること;および、
(b)工程(a)での接触に続いて開構造を取った、バイオチップの少なくとも1つのプローブからの信号を検出すること、
を含む核酸検出方法を目的としている。
本発明は、対立遺伝子変異を生じる可能性のある複数のDNA配列を解析するためのヘアピンプローブのバイオチップを設計し使用する方法を提供する。特に、本発明はDNAの1つの配列上に複数の単一ヌクレオチド変異を生じている短いDNA断片上のハプロタイプ決定のための手法を提供する。この方法で解析可能な突然変異には、大きな挿入および欠失はもちろん、単一ヌクレオチド転換(または置換)、単一ヌクレオチドの欠失または挿入、または短い配列によって隔てられた複数の変異が含まれる。そのような突然変異の解析には1より多くの対立遺伝子特異的プローブが必要である可能性がある。各遺伝子変異において観察される対立性および解析に必要な信頼度に応じて、4つ迄の対立遺伝子特異的プローブを、単一転換解析のために設計し固定することができる。例えば、表1が肝核因子1タンパク質(“HNF1a”)(Linder, T. et al. 1999. Hum. Molec. Genet. 8:2001-8)をコードするTCF1遺伝子のコドン142において見出される転換の解析に用いることのできるヘアピンプローブの配列を与える。142CC CY5はStrNCbヘアピンプローブに対するCy5−ラベルされた標的分子であり、142CT CY5はStrNTbヘアピンプローブに対するCy5−ラベルされた標的分子である。太字はループ配列を表し、下線を引いた文字は突然変異部位の位置を示す。自然に起こる突然変異はC/T転換または相補的な鎖のG/A転換である。この可能性がある突然変異の解析に使用するために必要なヘアピンプローブは、Cを有するプローブのStrNCbおよびTを有するプローブStrNCTである。他の2つのヘアピンプローブ、StrNGbおよびStrNAb、を使用することができるが必要ではない。
(a)試料を、少なくとも2つのプローブを含む本発明のプローブのバイオチップに接触させること(ここでバイオチップの少なくとも1つのプローブは遺伝的変異体と完全に相補的なループを有する遺伝的変異体特異的な本発明のプローブである);および
(b)遺伝的変異体のヘアピンプローブからの信号を検出すること、
を含む方法を目的としている。なお工程(b)で検出される信号は核酸試料中に遺伝的変異体が存在することを示している。
本発明は、化学的分解とジデオキシヌクレオチドによる鎖終止を用いる配列決定方法の手動の調製工程を回避して、生体外でオリゴヌクレオチド試料のDNA配列を決定する方法を提供する。本発明は、各プローブの標的特異的配列が、同じバイオチップ上に固定されたもう1つのプローブの別の標的特異的配列の少なくとも一部と同一な配列を含むような、ヘアピンプローブおよびヘアピンプローブのバイオチップの設計と使用を含む。解析する配列のサイズに応じて、固定されたヘアピンプローブの標的特異的配列をさらに、長さが少なくともヘアピンプローブの標的特異的配列の長さに等しいオリゴヌクレオチド配列のいずれともハイブリダイズするように設計する。この方法により、予め決められた長さの全てのオリゴヌクレオチドを配列決定するためのバイオチップを設計することができる。試料の一部とヘアピンプローブとの間で起こるハイブリダイゼーションの検出をモニターすることができ、また本発明の記載とUnited States Patent Nos. 6,270,961; 6,025,136; 5,871,928; and 5,695,940の記載に従って配列が決定される。
(a)オリゴヌクレオチドを含有する試料を少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること;および
(b)バイオチップの前記プローブの少なくとも1つからの信号を検出すること、
を含む方法を目的とする。なお工程(b)で検出する信号をオリゴヌクレオチドの配列決定に用いる。
本発明は、遺伝子発現解析のための本発明のヘアピンプローブおよび本発明のヘアピンプローブバイオチップの設計と使用の方法を提供する。
本発明は、選択的スプライシング産物を解析する方法、あるいは各選択的スプライシング産物の同一の組織の異なる生理状態における相対量または各選択的スプライシング産物の同一遺伝子に対する異なる組織中での相対量を決定する方法を提供する。これの応用は、遺伝子産物が所定の経路中で相互作用すると考えられる多くの遺伝子の複数の変異体を解析するために有用である可能性がある。
(a)試料を、少なくとも2つの本発明のプローブを含み、少なくとも前記バイオチッププローブの1つが、遺伝子の1つのエクソンまたは2つのエクソンの接合部に特異的なプローブである本発明のバイオチップと接触させること;および
(b)エクソン特異的なプローブまたは2つのエクソンの接合部特異的なプローブからの信号を検出すること(ここで、工程(b)で検出される信号が、核酸試料中の遺伝子の選択的スプライシング産物の存在を示している)、
を含む方法を目的とする。
本発明を、病原体、微生物、ウイルス、寄生生物、または遺伝的に修飾された有機体(“GMO”)中に見出される遺伝子修飾などの任意のヌクレオチドを含有する有機体またはそれの残存物から得られる分子の検出に、DNA、RNA、または、ヘアピンプローブと会合する他の任意の分子の検出を通じて、用いることができる。しかしそのような分子に限られない。本発明によれば、「任意のヌクレオチドを含有する有機体の任意の残存物」とは、例えば感染細胞中のウイルスDNAまたはそのウイルスDNAから産生されたmRNAなど(これに限られないが)の、別の細胞に侵入したヌクレオチドを含有する有機体から得られる任意の分子、またはその分子に由来する任意の分子を意味する。この応用が、外来起源の種々の分子を同一の試料中で検出する必要のあるとき、または生物学的試料中で遺伝的変異体を解析するために特に有用である。
(a)核酸試料を少なくとも2つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること(ここで、少なくとも1つの前記プローブが核酸を含む有機体またはその残存物にたいして特異的である);および、
(b)有機体の核酸に特異的なプローブからの信号を検出すること(ここで、工程(b)で検出される信号が核酸を含む有機体またはその残存物の存在を示す)、
を含む方法をも目的とする。
本発明はさらに、染色体断片の欠失もしくは挿入によって引き起こされる対立遺伝子不均衡およびヘテロ接合性喪失を解析するための本発明のプローブと本発明のプローブのバイオチップの設計と使用のための方法を目的とする。
−前立腺癌、腎臓癌、および膀胱癌
−乳癌
−大腸癌
−肺癌
−デュシェンヌ筋障害のような遺伝病および後天性疾患における大きな欠失の存在の解析、
における対立遺伝子不均衡を解析するためのキットをを目的とする。
本発明はさらに、試料中の標的分子の存在を検出するために用いるキットを提供する。そのようなキットは一般にそのような測定を行うための2以上の構成要素を含む。そのような構成要素には、ヘアピンプローブのバイオチップおよび選ばれた標的分子を検出するために必要な試薬の供給品が含まれる。あるいは、キットはUASで用いるような固定されたおよび/または固定されていないプローブおよび試薬を含んでもよい。好ましいキットは、ヘアピンプローブのバイオチップ、一組の固定されていないヘアピンプローブ、および/または「レポーター」分子、および1以上の追加の試薬を含む。別の好ましいキットは、直鎖プローブのバイオチップ、1組の固定されていないヘアピンプローブおよび/または「レポーター」分子、および1以上の追加の試薬を含む。
以下の実施例は本発明の説明のために示すのであって、いかなる形であれ本発明の制限を意図したものではない。特に、ここで以下に示す実施例は、ヘアピンバイオチップの標的配列検出のための使用を記述する。
TCF2遺伝子のエクソン2中のコドン137の突然変異は、重症の腎不全を伴うII型糖尿病表現型をもたらす75塩基対の欠失である(Linder, T.et al.1999. Hum. Moles. Genet. 8:2001-8)。この実施例で用いる標的配列は、TCF2遺伝子のエクソン2中のコドン137の欠失した配列の266〜290位置に対応する。図7Aは、エクソン2中のコドン137の突然変異の位置を示す。太字括弧の部分、塩基276〜350が突然変異個体の欠失部位を表す。図7Bが、突然変異が起こるときのエクソン2の配列を示す。
5’端にアミノリンカーを持つように合成された全てのヘアピンプローブを、N−ヒドロキシ−スクシンイミド(“NHS”)で活性化されたガラススライド(NoAb Diagnostics, Mississauga, Ontario, Canada)上に、スライドと共に供給されるスポット用緩衝液を用い、45分間30℃下湿度室中でスポットした。残ったNHS基を、やはりスライドと共に供給されるブロック溶液を用い室温で30分間不活性化した。スライドを次に、0.1M塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液pH7で洗浄し、またミリQ水ですすいだ。
固定したヘアピンプローブの各バイオチップを、50%ホルムアミドを含む6XSSC中のCy5−ラベル標的配列Tg2X2C137M1 400nM溶液20μlで処理した。各スライドの上にカバーグラスを置き、標的配列溶液を室温で1時間置いてハイブリダイズさせた。各バイオチップを次に4×SSCで5分間すすぎ、その次に0.1×SSCで2分間すすいだ。最後に、各スライドを、バイオチップスキャナー(Axon Instrument, Inc.,Union City, California, USA)により、Cy5およびCy3の両方の励起および発光波長を用いて、撮像した。
標的分子とのハイブリダイゼーションに続いて、固定されたヘアピンプローブの各バイオチップを、50%ホルムアミドを含む6×SSC緩衝液中のCy3ラベル「レポーター」分子の1μM溶液20μlで処理した。各スライドの上にカバーグラスを置き、「レポーター」分子溶液を室温で1時間置いてハイブリダイズさせた。各バイオチップを次に4×SSCで5分間、2回すすぎ、その次に0.1×SSCで2分間すすいだ。各スライドを、バイオチップスキャナーによって、Cy5およびCy3の両方の励起および発光波長を用いて、撮像した。
ヘアピンプローブと標的分子の間の非特異的結合は、ハイブリダイゼーションの条件を変えることにより減少する可能性がある。図8において、Cy5ラベル標的と151M1プローブとの間の非特異的相互作用が明確に観察される。図9では、Cy3ラベル「レポーター」分子と全てのヘアピンプローブの間の明らかな相互作用が、2X2C137M1ヘアピンプローブを別にして観察される。非特異的相互作用を除く1つの方法は追加の洗浄によるものである。図9は、追加の洗浄によってCy5ラベル標的配列と151M1ヘアピンプローブ間の非特異的結合が減少することを示す。非特異的結合を減少させるもう1つの方法はより厳しい条件を用いることである。図10は、15〜30分間4×SSC緩衝液を用い、「レポーター」分子のTm +5℃である28℃下でのより厳しい洗浄が、どのようにレポーター分子と2X2C137M1ヘアピンプローブを除く全てのヘアピンプローブの間の大部分の非特異的結合を除去するかを示す。
表IIは、肝臓リパーゼ(“LIPC”)、コレステリルエステル転移酵素タンパク質(“CEPT”)、リポタンパク質リパーゼ(“LPL”)、およびTCF1に対する遺伝子中の突然変異を解析するために設計した16のヘアピンプローブの配列を示す。表IIにまとめたのは、各ヘアピンプローブの名前、遺伝子名と各ヘアピンプローブのコドン配列との対応、および標的配列とハイブリダイズしたときに各ヘアピンプローブが有するミスマッチの数と型である。ヘアピンプローブの標的特異的配列は、特定の標的分子に完全に適合する即ち相補的であるか、または完全には相補的ではなく1つまたは2つのミスマッチを有するか、または「−」で示したように標的分子に全く相補的でないか、のいずれかである。ヘアピンプローブを、単一ヌクレオチド多型を有する標的配列と相補的な18〜24ヌクレオチドのループ配列を選択することにより設計した。全てのSNP変異体はループの中心に、多型部位の両側に9〜11のヌクレオチドを有するように置かれた。その特異的標的配列とハイブリダイズした各野生型および突然変異型SNP変異体のループのTmを、Meltcalcソフトウエアにより、100mMナトリウムおよび100mMオリゴヌクレオチド濃度でパラメーターを設定して、62±2℃となるように設計した。ヘアピンの配列を1以上のヌクレオチドをループの各の端に加えるおよび/または取り除くことにより調整して、60℃のTmに達し、ヘテロ二重鎖とホモ二重鎖の間の融解温度の変化が少なくとも5℃であるようにした。
表IIIに示したプローブをシャルコー−マリー−ツース病に冒された個体中で起こっている突然変異を解析するために設計した。
1− 突然変異型および野生型プローブのループとステム配列を設計し、また完全なお
よび不完全なハイブリッドのTmをMeltcalcで計算すること
2− プローブに腕(ステム)を加え、構造をチェックし、またヘアピンプローブのTmをMfoldで計算すること
3− プローブとそのそれぞれの標的のアラインメントを行い、またヘアピンプローブと非相補的な標的との間の相同性の欠如を確かめること、
である。
Rd=完全なハイブリッドの蛍光強度/不完全なハイブリッドの蛍光強度
と定義する。
この実施例は、具体的には、シャルコー−マリー−ツース病の原因となる突然変異の1つである遺伝子PMP22のエクソン3のW140突然変異の野生型対立遺伝子の解析を目的とする。
ここでの文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術であることの承認であると解してはならない。
Claims (45)
- (a)長さが6〜30ヌクレオチドの標的特異的配列;
(b)長さが10ヌクレオチドより短く、標的特異的配列の5’側にある第1腕;および
(c)長さが10ヌクレオチドより短く、標的特異的配列の3’側にある第2腕、
を含む無ラベルのプローブ(ここで、標的特異的配列は無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的でなく;また第1腕と第2腕とは互いに完全に相補的である)。 - 標的特異的配列が10〜25ヌクレオチドの長さである、請求項1のプローブ。
- 標的特異的配列が15〜20ヌクレオチドの長さである、請求項2のプローブ。
- 標的分子が標的特異的配列とハイブリダイズするときは、前記プローブが「開」コンホメーションをとり、また「レポーター」分子が第1腕または第2腕とハイブリダイズすることができる請求項1〜3のいずれか1項のプローブ。
- 「レポーター」分子が、第1腕または第2腕の核酸配列と完全に相補的である10より少ないヌクレオチドを含む、請求項4のプローブ。
- 「レポーター」分子が検出可能なマーカーを含む、請求項4の無ラベルのプローブ。
- 検出可能なマーカーが、ヌクレオチド類似物質、蛍光ラベル、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、ポリペプチド、電子豊富分子、酵素、または放射性同位元素である、請求項6のプローブ。
- Dtm(標的特異的配列と標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)と、第1腕と第2腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)との差)が10より大きい、請求項1〜7のいずれか1項のプローブ。
- Dtmが15に等しい、請求項8のプローブ。
- Dtm(標的特異的配列と標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)と、第1腕と第2腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)との差)が10より低い、請求項1〜7のいずれか1項のプローブ。
- 基板、および少なくとも2つの請求項1〜7のいずれか1項のプローブを含むプローブバイオチップ。
- プローブが基板に付着している、請求項11のプローブ。
- 前記プローブがさらにリンカーを含み、前記リンカーにより基板に付着している、請求項12のバイオチップ。
- 基板が、機能性ガラス表面、機能性プラスチック表面、機能性金属、伝導性金属表面、伝導性プラスチック表面、多孔性基材、多孔性金属、光ファイバー、ガラス繊維由来の基材、二酸化ケイ素、機能的脂質膜、リポソーム、または濾過膜から成る、請求項13のバイオチップ。
- 機能性プラスチック表面がポリスチレンである、請求項14のプローブバイオチップ。
- 機能性金属が白金、金、またはニッケルである、請求項14のプローブバイオチップ。
- 伝導性プラスチック表面が炭素ベースの基材である、請求項14のプローブバイオチップ。
- 炭素ベースの基材がポリマーである、請求項14のプローブバイオチップ。
- 多孔性基材がガラスである、請求項14のプローブバイオチップ。
- 全ての第1腕が同一の配列を有する、請求項11のプローブバイオチップ。
- 1つのレポーター分子が各プローブとハイブリダイズすることができる、請求項20のプローブバイオチップ。
- 標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドが、4℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ、請求項11〜21のいずれか1項のプローブバイオチップ。
- 標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドが、1℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ、請求項22のプローブバイオチップ。
- 標的特異的配列と標的分子の会合により形成されるハイブリッドの融解温度と、標的特異的配列と標的特異的配列設計の対象でない分子との会合により形成されるハイブリッドの融解温度との差が、5℃以上である、請求項11〜23のいずれか1項のプローブバイオチップ。
- 前記融解温度間の差が8℃以上である、請求項24のプローブバイオチップ。
- 少なくとも2つのプローブのDtm(標的特異的配列と標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)と、第1腕と第2腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度(Tm)との差)が1℃の範囲以内で等しい、請求項11〜25のいずれか1項のプローブバイオチップ。
- 無ラベルの汎用アドレス指定システムであって:
(a)(i)長さが6〜30ヌクレオチドの標的特異的配列;および(ii)前記標的特異的配列の5’端または3’端に結合されたタグ配列;を含む少なくとも2つの無ラベルの固定されていない第1プローブ;および
(b)基板および少なくとも2つの固定された請求項11〜26のいずれか1項の第2プローブを含むバイオチップ、
を含むシステム(ここで、各第1プローブのタグ配列は、各プローブ毎に異なり、また第2プローブの1つの標的特異的配列と相補的である)。 - 請求項27の無ラベルの汎用アドレス指定システムであって、前記無ラベルの第1プローブが:
(i)6〜30ヌクレオチドの長さの標的特異的配列;
(ii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の5’側にある第1腕;
(iii)10ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の3’側にある第2腕;
(iv)10〜50ヌクレオチドの長さで、第1腕または第2腕に結合されたタグ配列、
を含むシステム(ここで、標的特異的配列が前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的ではなく;また第1腕および第2腕は互いに完全に相補的である)。 - 第1プローブ全ての第1腕が同一の配列を有する、請求項28の汎用アドレス指定システム。
- 第2プローブの全ての第1腕が同一の配列を有する、請求項27〜29のいずれか1項の汎用アドレス指定システム。
- 同じレポーター分子が第1プローブまたは第2プローブとハイブリダイズすることができる、請求項29〜30のいずれか1項の汎用アドレス指定システム。
- 請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップおよび1以上の試薬を含むキット。
- 1組の、請求項1〜10のいずれか1項の固定されていないプローブをさらに含む請求項32のキット。
- レポーター分子をさらに含む、請求項32または33のキット。
- 核酸を検出する方法であって:
(a)核酸試料を、生体外で請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップまたは請求項27〜31のいずれか1項の汎用アドレス指定システムに接触させること;および、
(b)バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの、工程(a)における接触の後に開コンホメーションを取った少なくとも1つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法。 - 核酸試料中の遺伝的変異体を生体外で検出する方法であって:
(a)試料を請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップまたは請求項27〜31のいずれか1項の汎用アドレス指定システムに接触させること(ここで、バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの少なくとも1つのプローブが遺伝的変異体に特異的なプローブである);および、
(b)遺伝的変異体に特異的なプローブからの信号を検出すること(ここで、工程(b)において検出される信号は核酸試料中に遺伝的変異体が存在することを示す)、
を含む方法。 - 検出される遺伝的変異体が単一ヌクレオチド多型である、請求項36の方法。
- 生体外で、任意の核酸を含む有機体またはその残存物を検出する方法であって:
(a)核酸試料を、請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップまたは請求項27〜31のいずれか1項の汎用アドレス指定システムに接触させること(ここで、少なくとも1つの前記プローブが、有機体またはその残存物の核酸に特異的である);および
(b)有機体の核酸に特異的なプローブからの信号を検出すること、
を含む方法(ここで、工程(b)において検出される信号が核酸を含む有機体またはその残存物が存在することを示す)。 - 核酸を含む有機体がウイルスまたは細菌である、請求項38の方法。
- 生体外で核酸試料中の遺伝子の選択的スプライシング産物を検出する方法であって:
(a)試料を、請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップまたは請求項27〜31のいずれか1項の汎用アドレス指定システムに接触させること(ここで、バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの少なくとも1つのプローブは、遺伝子のエクソンに特異的または2つのエクソンの接続部に特異的なヘアピンプローブである);および
(b)遺伝子のエクソンに特異的または2つのエクソンの接続部に特異的なヘアピンプローブからの信号を検出すること(ここで、工程(b)で検出される信号は、核酸試料中に遺伝子の選択的スプライシング産物が存在することを示す)、
を含む方法に関する。 - 核酸試料がmRNAまたはcDNAを含む、請求項40の方法。
- 生体外でオリゴヌクレオチドの配列決定をする方法であって:
(a)オリゴヌクレオチドを含む試料を、請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップまたは請求項27〜31のいずれか1項の汎用アドレス指定システムに接触させること;および
(b)バイオチップの少なくとも1つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法(ここで、工程(b)で検出される信号は、オリゴヌクレオチドの配列の決定に使用される)。 - 工程(b)における検出が、検出可能なマーカーでラベルされたレポーター分子を用いて得られる、請求項35〜42のいずれか1項の方法。
- 工程(a)の試料が、既に検出可能なマーカーでラベルされている、請求項35〜42のいずれか1項の方法。
- 核酸試料中の対立遺伝子不均衡とヘテロ接合性喪失を生体外で検出する方法であって:
(a)生体液または組織からの少なくとも2つの核酸試料からの1対のプライマーを用いて、少なくとも1つのマイクロサテライト型の染色体DNA領域を増幅すること(ここで、生体液または組織からの試料の少なくとも1つが対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失を有さず、また、各組織または生体液が増幅中に異なってラベルされる);
(b)前記プライマーを増幅後に除去すること;
(c)前記増幅産物を、請求項11〜26のいずれか1項のバイオチップまたは請求項27〜31のいずれか1項の汎用アドレス指定システムと接触させること(ここで、バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの少なくとも1つのプローブが、前記染色体DNA領域の増幅に用いたプライマーと相補的である);および、
(d)前記バイオチップの少なくとも1つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法(ここで、工程(d)で検出される信号を、核酸試料の1つの中に対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失が存在することを決定するために用いる)。
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