JPWO2015105179A1 - タンパク質と高次構造を含むrnaとの相互作用を検出するためのrnaマイクロアレイ - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の配列を含むRNAプローブ;
(i)DNAバーコード配列への相補鎖配列、
(ii)第一のステム部分の配列、
(iii)第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および
(iv)第一および第二の2つのステム部分を連結するループ部分の配列。
[2]前記ループ部分の配列が、Pre-miRNAに含有されるループ部分の配列である、[1]に記載のRNAプローブ。
[3]3’末端を蛍光標識された、[1]または[2]に記載のRNAプローブ。
[4]前記Pre-miRNAが、ヒトまたはマウスのPre-miRNAである、[2]または[3]に記載のRNAプローブ。
[5]DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび[1]から[4]のいずれか1項に記載のRNAプローブをハイブリダイズさせることを含む、RNAと結合するたんぱく質を検出するために用いられるRNAマイクロアレイの製造方法。
[6]DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび[1]から[4]のいずれか1項に記載のRNAプローブをハイブリダイズさせることによって製造される、RNAマイクロアレイ。
[7]前記(i)の配列が異なり、前記(ii)の配列、(iii)および(iv)の配列が同一である2種以上のRNAプローブを有する、[6]に記載のRNAマイクロアレイ。
[8]以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法;
(1)[6]または[7]に記載のRNAマイクロアレイおよびRNAプローブをハイブリダイズしていないDNAバーコード配列を付加されたスライドと蛍光標識された対象タンパク質と接触させる工程、
(2)当該対象タンパク質と結合したRNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、および
(3)工程(2)で特定されたDNAバーコード配列と対応する相補鎖を有するRNAプローブを工程(2)で特定されたRNAプローブから削除して得られたRNAプローブに含まれるループ部分の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
[9]前記RNAが、Pre-miRNAである、[8]に記載の方法。
[10]以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法;
(1)[1]から[4]のいずれか1項に記載のRNAプローブおよび対象タンパク質を接触させる工程、
(2)工程(1)で得られた対象タンパク質をRNAプローブとの結合を保持したまま単離する工程、
(3)工程(2)で得られた対象タンパク質からRNAプローブを抽出する工程、
(4)工程(3)で得られたRNAプローブとDNAバーコード配列を付加されたスライドを接触させる工程、
(5)前記DNAバーコード配列を付加されたスライドとハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および
(6)工程(5)で特定されたRNAプローブに含まれる(iv)の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
[11]前記RNAが、Pre-miRNAである、[10]に記載の方法。
(i)DNAバーコード配列への相補鎖配列、
(ii)第一のステム部分の配列、
(iii)第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および
(iv)2つのステム部分を連結するRNAに含有されるループ部分の配列。
(I)Pre-miRNAにmature miRNAが1つ含まれている場合
(1)mature miRNAがループの5’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの3’側から4塩基目を始点とし、当該始点の塩基と対合する塩基を終点とする(図1(a)下段参照のこと)。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、始点から3’側の次の塩基目に対合する塩基を終点とする。
(2)mature miRNAがループの3’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの5’側から4塩基目を終点とし、当該始点の塩基と対合する塩基を始点とする(図1(a)上段参照のこと)。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、終点から5’側の次の塩基に対合する塩基を始点とする。
(II)Pre-miRNAにmature miRNAが2以上含まれている場合
(1)ループ側からより離れたmature miRNAに着目し、当該mature miRNAループの5’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの3’側から4塩基目を始点とし、当該始点の塩基と対合する塩基を終点とする。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、始点から3’側の次の塩基目に対合する塩基を終点とする。
(2)ループ側からより離れたmature miRNAに着目し、当該mature miRNAがループの3’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの5’側から4塩基目をループ部分の終点とし、当該始点の塩基と対合する塩基をループ部分の始点とする。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、終点から5’側の次の塩基に対合する塩基を始点とする。
1)前記RNAプローブを含むRNAマイクロアレイと、前記タンパク質とを接触させる工程、
2)工程1におけるRNAプローブと前記タンパク質の相互作用を、前記タンパク質に対する標識物質に基づく測定手段により測定する工程、および
3)工程2で得られる測定結果に基づき、前記RNAマイクロアレイ上の前記タンパク質の量を計算する工程。
1)RNAプローブを含むRNAマイクロアレイと前記対象タンパク質を含む試料を接触させる工程、
2)RNAプローブを含まないDNAバーコード配列を含むDNAマイクロアレイと前記対象タンパク質を含む試料を接触させる工程、
3)工程1におけるRNAプローブと前記タンパク質の相互作用を、前記タンパク質に対する標識物質に基づく測定手段により測定する工程、
4)工程3で得られる測定結果に基づき、前記RNAマイクロアレイ上の前記タンパク質の量を計算する工程。
5)工程2におけるDNAバーコード配列と前記タンパク質の相互作用を、前記タンパク質に対する標識物質に基づく測定手段により測定する工程、
6)工程5で得られる測定結果に基づき、対応するDNAバーコード配列を抽出する工程、および
7)工程4の計算によって前記対象タンパク質と相互作用すると検出されたRNAプローブから工程6で抽出されたDNAバーコード配列に対応するRNAプローブを削除する工程。
(1)RNAプローブを含むRNAマイクロアレイおよびRNAプローブをハイブリダイズしていないDNAバーコード配列を付加されたスライドと蛍光標識された対象タンパク質と接触させる工程、
(2)当該対象タンパク質と結合したRNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、および
(3)工程(2)で特定されたDNAバーコード配列と対応する相補鎖を有するRNAプローブを工程(2)で特定されたRNAプローブから削除して得られたRNAプローブに含まれる配列を含むPre-miRNAを当該対象タンパク質と結合するPre-miRNAとして検出する工程。
(1)前記RNAプローブおよび対象タンパク質を接触させる工程、
(2)工程(1)で得られた対象タンパク質をRNAプローブとの結合を保持したまま単離する工程、
(3)工程(2)で得られた対象タンパク質からRNAプローブを抽出する工程、
(4)工程(3)で得られたRNAプローブとDNAバーコード配列を付加されたスライドを接触させる工程、
(5)前記DNAバーコード配列を付加されたスライドとハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および
(6)工程(5)で特定されたRNAプローブに含まれる(iv)の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
RNAプローブの鋳型DNA配列は、5’末端から順に、(i) Adjuster Sequence、(ii) CC + T7 promoter + G(24塩基)、(iii) Complementary sequence of 25mer DNA Barcode(25塩基)、(iv) G + Stem forward sequence(18塩基)、(v) Designed RNA coding Sequenceおよび(vi) Stem reverse Sequence(17塩基)を有するように設計した(図1(a))。各配列は以下に示す。
(i) Adjuster Sequence
OLIGONUCLEOTIDE LIBRARY SYNTHESIS(OLS)(Agilent Technologies社)を用いて鋳型DNAの全長を180塩基にて合成するため、Adjuster Sequenceの塩基数は、96塩基からDesigned RNA coding Sequenceの塩基数を差し引いた長さとして設計した。配列は、5’-CAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATAGTTATTAATAGTAAT-3’(配列番号:1)の5’末端から必要な塩基数を用いた。
(ii) CC + T7 promoter + G(24塩基)
5’- CCGCGCTAATACGACTCACTATAG-3’(配列番号:2)
(iii) Complementary sequence of 25mer DNA Barcode(25塩基)
Xu, Q., Schlabach, M.R., Hannon, G.J. et al. (2009) PNAS 106, 2289-2294に開示されたされた240000種の25塩基長のDNA配列(bc25mer_1-240000)のうちbc25mer_1からbc25mer_6500までの相補鎖を用いた。
(iv) G + Stem forward sequence(18塩基)
5’- GGTGTACGAAGTTTCAGC-3’ (配列番号:3)
(v) Designed RNA coding Sequence
miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)に開示されたヒト1872種類およびマウス1186種類のAccession番号に対応する配列(Pre-miRNA配列)からStem loop構造、及びmature miRNAの配列を取得し、Designed RNA coding Sequence(ループ部位)を以下のように定義し、抽出した。ここで、hsa-mir-3652(MI0022909)、hsa-mir-6753(MI0016052)、hsa-mir-6892(MI0022598)、mmu-mir-7060(MI0022739)の4つのPre-miRNAのループ部位は96 塩基よりも鎖長が長く、180塩基の鋳型DNA配列鎖長を超えてしまうため、 この4つのループはライブラリから除いた。従って、ヒト1869種類, マウス1185種類のループ部位よりライブラリを作製した。
(1) Pre-miRNAのループ部位は5’末端側から始まり、3’末端側で終わる。
(2) Designed RNA coding Sequenceの始点と終点は塩基対を形成しているか否かに関わらず、miRBaseにて予想されたStem loop二次構造図上で同じ列の塩基とする。
(3) Pre-miRNAに1つmature miRNA配列が含まれている場合は (図2(a))、mature miRNA(実線のBox)のループ側から4塩基目の列をループ部位(点線のBox)の始点、終点の位置とし、Pre-miRNAに2つのmature miRNA配列が含まれている場合は(図2(b))、mature miRNAのループ部位側がよりループ部位から離れている方の配列を選択し、当該選択したmature miRNAのループ部位側から4塩基目の列をループ部位(点線のBox)の始点、終点の位置とする。
(vi) Stem reverse sequence(17塩基)
5’- GCTGAAGCTTCGTGCAC-3’ (配列番号:4)
このように設計した鋳型DNA配列は、相補鎖を一本鎖DNAとしてAgilent Technologies社にOLIGONUCLEOTIDE LIBRARY SYNTHESISを用いて合成するよう委託した(図1(b))。この一本鎖DNAをテンプレートとして、Forward primer (5’-CCGCGCTAATACGACTCACTATAGG-3’(配列番号:5))およびReverse primer (5’-GTGCACGAAGCTTCAGC-3’(配列番号:6))を用いて、PCRにより鋳型DNA二重鎖 (Template dsDNA)を増幅した。
RNP_xxxxx中のxxxxx は25mer barcode DNA番号を表記する。
第一のヒトPre-miRNAループライブラリ:RNP_00018からRNP_00028およびRNP_00030- RNP_01887、
第二のヒトPre-miRNAループライブラリ:RNP_01888- RNP_03756、および
第三のヒトPre-miRNAループライブラリ:RNP_03757- RNP_05315。
得られたTemplate dsDNAからin vitro転写系(MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit, Life Technologies)を用いて製造者のプロトコールに従ってRNAプローブを転写した(図1(c))。
得られたRNAプローブの3’末端にT4 RNA ligaseを用いてpCp-Cy5を修飾した。
Xu, Q., Schlabach, M.R., Hannon, G.J. et al. (2009) PNAS 106, 2289-2294に開示されたされた240,000種の25塩基長のDNA配列(bc25mer_1-240000)のうちbc25mer_1からbc25mer_10667をスポットしたスライドをAgilent Technologies社に作製委託した。このスライドへRNAプローブを加えてスライド製造者のプロトコール(8x15K, 8x60K Agilent Oligo microarray Protocol)に従って、ハイブリダイゼーションを行った。
Cy3蛍光標識されたNHS(N-Hydroxysuccinimide)エステルと目的タンパク質を反応させ、Cy3ラベルされた目的タンパク質を用意した。このタンパク質を適切なバッファーで希釈し、4で得たマイクロアレイスライドに添加・洗浄してRNAプローブに特異的に結合させた。
マイクロアレイスキャナーを用いてCy3及びCy5の蛍光強度を測定し、それぞれの蛍光強度からRNAタンパク質相互作用の有無、強度を概算した。
1. 鋳型DNA配列の設計
古細菌のリボソームタンパク質L7Ae(AAB90466)と結合するKt配列および結合ミュータント配列dKt、ヒトU1Aタンパク質(NP_004587)に結合する2種類の配列U1AまたはU1A2およびそれぞれの結合ミュータント配列dU1AまたはdU1A2、実施例1の手法でmiRBaseから取得したhsa-Pre-let7 ファミリー(hsa-Pre-let7 a-1(miRBase Accession番号:MI0000060)、a-2(miRBase Accession番号:MI0000061)、a-3(miRBase Accession番号:MI0000062)、b(miRBase Accession番号:MI0000063)、c(miRBase Accession番号:MI0000064)、d(miRBase Accession番号:MI0000065)、e(miRBase Accession番号:MI0000066)、f-1(miRBase Accession番号:MI0000067)、f-2(miRBase Accession番号:MI0000068)、g(miRBase Accession番号:MI0000433)i(miRBase Accession番号:MI0000434))のループ配列ならびにle7ファミリー共通配列(consensus)をDesigned RNA coding Sequenceとした鋳型DNA配列を設計した(表2)。なお本実施例では、hsa-Pre-let7ファミリーとle7共通配列の鋳型DNA配列配列のみ全長130塩基となるようAdjuster Sequenceを加えた。
RNAプローブ(PoP_00001_Kt)のTemplate ssDNA (配列は表1参照、Greinerによる受託合成)を鋳型として、PCR法を用いてTemplate dsDNAの増幅を行った。
PCRプライマーにはForward primerおよびReverse primerを用いた。50 μL 反応溶液の組成は1x KOD -Plus- Neo buffer (TOYOBO)、0.2 mM dNTPs、1.5 mM MgSO4、0.5 μM DNA primers、2 nM Template ssDNA、0.02 U/μL KOD -Plus- Neo polymerase (TOYOBO)とし、反応は初めに94℃ 2分間インキュベートした後、98℃ 10秒間、68℃ 20秒間のインキュベートを15サイクルで行った。生成したPCR産物はPCR Purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。ただし溶出の際には超純水15 μLを用いた。その他のRNAプローブについても同様の操作を行った。また、複数種類のRNAプローブを合成する際には各Template ssDNAの総和が終濃度2nMとなるように混合してPCRを行った。
in vitro転写系(MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit, Life Technologies)を用いてTemplate dsDNAからの転写反応を行った。10 μL反応溶液の組成は1x T7 Reaction Buffer(Life Technologies)、7.5 mM GTP Solution、7.5 mM ATP Solution、7.5 mM CTP Solution、7.5 mM UTP Solution、150 nM Template dsDNA、1x T7 Enzyme Mix(Life Technologies)として、37℃、4時間インキュベートした。その後、反応溶液にTURBO DNase(Life Technologies)1 μLを加えて混合し、37℃、30分間インキュベートした。生成した転写産物はRNeasy MinElute Cleanup Kit(QIAGEN)を用い、Kitプロトコルを改変して精製した。転写産物に超純水を加えて100 μLに調整し、Buffer RLTを350 μL(QIAGEN)加えて混合し、続いてエタノールを700 μL加えて混合した。混合物575 μL を2 mLコレクションチューブ(QIAGEN)にセットしたRNeasy MinElute Spin Column(QIAGEN)にアプライし、10,000 xg、15秒間遠心操作し、ろ液を棄てた。残りの混合物も同様にアプライし、遠心操作を繰り返した。続いて、Spin ColumnにBuffer RPE(QIAGEN) 500 μLを添加し、10,000 xg、15秒間遠心操作し、ろ液を棄てた。Spin Columnに80%エタノールを500 μL添加し、20,400 xg、2分間遠心操作し、ろ液を棄てた。このSpin Columnを新しいコレクションチューブにセットし、蓋を開けた状態で20,400 xg、5分間遠心操作した。Spin Columnを1.5 mLチューブにセットし、超純水20 μLを加えて20,400 xg、1分間遠心操作しRNAプローブを溶出した。RNA濃度は260 nmの吸光度をNanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)で計測して決定した。
転写合成したRNAプローブの3’末端にpCp-Cy5(Jena Bioscience)をT4 RNA ligase (cloned) 5 U/μL (Life Technologies)で修飾した。20 μL反応溶液の組成は1x T4 RNA Ligase Buffer(Life Technologies)、50 μM pCp-Cy5(Jena Bioscience)、6 μM RNAプローブ、0.5 U/μL T4 RNA Ligase(Life Technologies)とし、16℃、20時間インキュベートした。生成したCy5ラベルRNAプローブはRNeasy MinElute Cleanup Kit(QIAGEN)を用い、上記と同様の方法により精製した。ただし、溶出の際には超純水15 μLを加えて20,400 xg、1分間遠心する操作を2回繰り返し、RNAプローブを溶出した。RNA濃度は260 nmの吸光度を、ラベルされたCy5濃度は650 nmの吸光度を、それぞれNanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)で計測して決定した。この操作を用いることで、約90%のRNAプローブにCy5がラベル化された。
L7Ae、U1Aの大腸菌精製は、先の報告の通りに行った(L7Ae: Saito H, Fujita Y, Kashida S, et al. 2011. Nat. Commun. 2: 160.、U1A: Kashida S, Inoue T and Saito H. 2012. Nucleic Acids Res. 40: 9369-78.)。
DNA Barcode (bc25mer_00001)とCy5-RNAプローブ(PoP_00001)の結合、さらにこのDNA/RNA複合体とCy3-L7Aeとの結合をEMSA(Electro Mobility Shift Assay)で以下のように確認した。まず、bc25mer_00001とPoP_00001_Ktを混合し、アニーリングを行った。11 μL の反応溶液の組成は500 nM bc25mer _00001、500 nM PoP_00001_Kt、1x Annealing Buffer (50 mM HEPES-KOH(ph7.8)、100 mM KCl)とし、反応は98℃ 2分間、55℃ 1分間インキュベートした後、毎分1℃、30分間温度を低下させながらインキュベートした。次に、アニーリングしたDNA/RNA複合体とL7Aeを以下のように混合して結合させた。15 μL反応溶液の組成は0、100、200、500または1000 nM Cy3-L7Ae、50 nM DNA/RNA複合体、1x Annealing Bufferとして、氷上で30分間インキュベートした。この溶液に5x色素液(0.25%ブロモフェノールブルー、30%グリセロール)3.75 μLを加えて混合し、この混合液10 μLを非変性15%ポリアクリルアミド(1/30ビスアクリルアミド)ゲルに重層し、4℃、200Vで60分間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを室温で15分間、SYBR Green I及びIIで染色し、Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)のSYBR Greenモード(600 pmt)、Cy5モード(900 pmt)でスキャンし、バンドを確認した。結果を図4に示す。その結果、DNA BarcodeとCy5-RNAプローブがDNA/RNA複合体を形成し、さらにL7Aeと複合体も結合することが示された。
CGHカスタムアレイ8x15K (Agilent)に25 mer DNA Barcodeのスポットを配置してDNA Barcodeマイクロアレイをデザインした。bc25mer_00001からbc25mer_00500までのDNA Barcodeが結合するスポット、bc25mer_1からbc25mer_500は10スポットずつ配置し、bc25mer _501からbc25mer _10667までは1スポットずつ配置した。
DNA Barcodeマイクロアレイ上でCy5-RNAプローブ(PoP_00001および、PoP_000018-28)とCy3-L7AeのRNP相互作用が検出可能かを検証した。1.5 mLチューブに120 ng Cy5-RNAプローブPoP_00001_Kt、120 ng Cy5-RNAプローブPoP_00018-28及び超純水を混合して18 μLとし、10x Gene Expression Blocking Agent (Agilent)4.5μLと2x Hi-RPM Hybridization Buffer(Agilent)22.5 μLを加えて混合した。混合液を100℃、5分間インキュベートした後、氷上で 5分間インキュベートした。ハイブリチャンバー(Agilent)の下枠にガスケットスライド(Agilent)を載せ、ガスケットスライドの1つのウェル上に混合液45 μLを加えた後、DNA Barcodeマイクロアレイスライドを被せてハイブリチャンバーを組み立てた。ハイブリチャンバーを55℃のハイブリオーブンのローター(Agilent)にセットし、毎分20 回転で 20時間インキュベートした。オーブンから取り出したハイブリチャンバーを分解してマイクロアレイスライドを取り出し、Gene Expression Wash Buffer 1 (Agilent)内でガスケットと分離し、Gene Expression Wash Buffer 1 で室温5分間洗浄した。さらに Gene Expression Wash Buffer 2(Agilent)で37℃、5分間洗浄した。乾燥させたマイクロアレイスライドをマイクロアレイスキャナ(Agilent)の8x 15K, c scan, AglilentHD_miRNA, two color, XDR Hi and Lo (0.05)モードで スキャンし、目的のスポットにRNAプローブが結合していることをCy5シグナルで確認した。
DNA Barcode (bc25mer_00001)とCy5-RNAプローブ(PoP_00001_Kt)の特異的な結合、さらにCy5-RNAプローブ(PoP_00001_Kt、PoP_00024_hsa-let-7e)とL7Aeとの結合をEMSAで以下のように確認した。まず、bc25mer_00001とPoP_00001_KtまたはPoP_00024_hsa-let-7eを混合し、アニーリングを行った。11 μL の反応溶液の組成は500 nM bc25 mer_00001、500 nM Cy5-RNAプローブ、1x Annealing Buffer (50 mM HEPES-KOH(ph7.8)、100 mM KCl)とし、反応は95℃ 5分間、室温 10分間インキュベートした。次に、アニーリングしたDNA/RNA複合体とL7Aeを以下のように混合して結合させた。15 μL反応溶液の組成は0、100、200、500または1000 nM Cy3-L7Ae、50 nM DNA/RNA複合体、1x Annealing Bufferとして、氷上で1時間インキュベートした。この溶液に5x色素液(0.25%ブロモフェノールブルー、30%グリセロール)3.75 μLを加えて混合し、この混合液10 μLを非変性15%ポリアクリルアミド(1/30ビスアクリルアミド)ゲルに重層し、4℃、200Vで60分間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを室温で15分間、SYBR Green I及びIIで染色し、Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)のSYBR Greenモード(600 pmt)でスキャンし、バンドを確認した。結果を図6に示す。その結果、bc25mer_00001とPoP_00001_Ktは結合して複合体を作るが、PoP_00024_hsa-let-7eとは結合しないこと、 PoP_00001_Kt、PoP_00024_hsa-let-7eはL7Aeと結合するが、PoP_00024_hsa-let-7eはPoP_00001_Ktより10倍程度強く結合することが示された。以上より、hsa-let-7eの Pre-miRNAのループ配列がL7Aeと結合し、その親和性は既知のKtループよりも強いということが発見された。このことから、本申請技術のRNPマイクロアレイによって、特定のタンパク質に結合する新規のRNA配列を取得可能であることが示唆された。
DNA Barcodeマイクロアレイ上でCy5-RNAプローブ(PoP_00001、00008、00010、00011、00014、00016および、PoP_000018-28)とCy3-U1AのRNP相互作用が検出可能かを検証した。
OLSで受託合成したTemplate ssDNAライブラリを鋳型として、実施例2の2.と同様の操作でTemplate dsDNAのPCR増幅を行った。ただし、その際反応スケールは100 μLで行い、超純水15 μLを用いて2回溶出を行った。
実施例2の2.と同様の操作でTemplate dsDNAからの転写反応を行った。ただし、その際反応スケールは20 μLで行い、超純水15 μLを用いて2回溶出を行った。
実施例2の3.と同様の操作で転写合成したRNAプローブの3’末端にpCp-Cy5を修飾した。ただし、その際反応スケールは100 μL x2で行った。
DNA Barcodeマイクロアレイ上でCy5-RNAプローブ(RNP_00001-06500)とCy3-U1AのRNP相互作用が検出可能かを検証した。
L7Aeの結合量(2log値)=Cy3-Cy5+20
として、シグナルを補正した。さらに同じループを持つRNAプローブのCy3シグナルを平均化して、シグナルの高いRNA配列(RNAloop)を算出した(表3)。その結果、実施例2と同様にKt、hsa-let-7eの配列を含むRNA配列がL7Aeと相互作用することが確認された。
Claims (11)
- 以下の配列を含むRNAプローブ;
(i)DNAバーコード配列への相補鎖配列、
(ii)第一のステム部分の配列、
(iii)第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および
(iv)第一および第二の2つのステム部分を連結するループ部分の配列。 - 前記ループ部分の配列が、Pre-miRNAに含有されるループ部分の配列である、請求項1に記載のRNAプローブ。
- 3’末端を蛍光標識された、請求項1または2に記載のRNAプローブ。
- 前記Pre-miRNAが、ヒトまたはマウスのPre-miRNAである、請求項2または請求項3に記載のRNAプローブ。
- DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のRNAプローブをハイブリダイズさせることを含む、RNAと結合するタンパク質を検出するために用いられるRNAマイクロアレイの製造方法。
- DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のRNAプローブをハイブリダイズさせることによって製造される、RNAマイクロアレイ。
- 前記(i)の配列が異なり、前記(ii)の配列、(iii)および(iv)の配列が同一である2種以上のRNAプローブを有する、請求項6に記載のRNAマイクロアレイ。
- 以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法;
(1)請求項6または請求項7に記載のRNAマイクロアレイおよびRNAプローブをハイブリダイズしていないDNAバーコード配列を付加されたスライドと蛍光標識された対象タンパク質と接触させる工程、
(2)当該対象タンパク質と結合したRNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、および
(3)工程(2)で特定されたDNAバーコード配列と対応する相補鎖を有するRNAプローブを工程(2)で特定されたRNAプローブから削除して得られたRNAプローブに含まれるループ部分の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。 - 前記RNAが、Pre-miRNAである、請求項8に記載の方法。
- 以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法;
(1)請求項1から4のいずれか1項に記載のRNAプローブおよび対象タンパク質を接触させる工程、
(2)工程(1)で得られた対象タンパク質をRNAプローブとの結合を保持したまま単離する工程、
(3)工程(2)で得られた対象タンパク質からRNAプローブを抽出する工程、
(4)工程(3)で得られたRNAプローブとDNAバーコード配列を付加されたスライドを接触させる工程、
(5)前記DNAバーコード配列を付加されたスライドとハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および
(6)工程(5)で特定されたRNAプローブに含まれる(iv)の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。 - 前記RNAが、Pre-miRNAである、請求項10に記載の方法。
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