WO2010067811A1 - ＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムの構築 - Google Patents

ＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムの構築 Download PDF

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protein
sequence
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rnp
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丹 井上
博英 齊藤
俊一 樫田
香倫 林
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独立行政法人科学技術振興機構
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Definitions

  • the present invention has been made to solve the above problems. That is, the present invention, according to one embodiment, is a shRNA that has a sequence complementary to a target sequence, a passenger strand that forms a double strand with the guide strand, and the guide
  • the present invention relates to an shRNA comprising a linker strand connecting the strand and a passenger strand, wherein the linker strand comprises an RNP-derived protein binding motif sequence.
  • such shRNA is also referred to as sensor shRNA.
  • the protein binding motif sequence derived from RNP is preferably a Box C / D sequence.
  • the present invention is an RNAi control system comprising the sensor shRNA and an RNP-derived protein that specifically binds to a protein binding motif sequence of the shRNA.
  • RNAi RNA-binding motif sequence of the shRNA in a solution.
  • a step of introducing a solution containing the shRNA and protein into a cell introducing a solution containing the shRNA and protein into a cell.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing shRNA according to the first embodiment.
  • FIG. 2 (A) is a figure which shows typically shRNA which comprises the RNAi control system by 2nd embodiment
  • (B) is the protein derived from RNP which comprises the RNAi control system by 2nd embodiment.
  • FIG. 4C is a diagram schematically showing a complex of shRNA and shRNA in a system in which protein 4 coexists, and protein 4.
  • FIG. 3 (A) is a diagram showing a pENTR TM / H1 / TO vector sold by invitrogen, and (B) is a diagram of DNA inserted into the pENTR TM / H1 / TO vector. It is a figure which shows this chain
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing shRNA according to the first embodiment.
  • FIG. 2nd embodiment (B) is the protein derived from RNP which comprises the RNAi control system by 2nd embodiment.
  • FIG. 4C is a diagram schematically showing a
  • FIG. 4 is a diagram showing a production example of a protein expression vector.
  • (A) is a diagram showing the secondary structure sequence of shRNA-GFP for EGFP knockdown, and (B) is shRNA-GFP-mut used as a negative control that does not cause EGFP knockdown.
  • (C) is a diagram showing the secondary structure sequence of shRNA-BoxC / D-GFP that is expected to specifically bind to the L7Ae protein through the BoxC / D sequence.
  • (D) shows the secondary structure sequence of shRNA-BoxC / D-mut-GFP that does not bind to L7Ae.
  • the wedge shape is a cutting position by Dicer.
  • FIG. 14 shows the results of Dicer cleavage inhibition by shRNA-BoxC / D-Bcl-xL and shRNA-BoxC / D mut-Bcl-xL using L7Ae using an in vitro reconstituted Dicer system.
  • FIG. 15 shows Bcl-xL expression in cells.
  • FIG. 16 is a diagram showing the result of integrating the intensity of the detected Bcl-xL band.
  • FIG. 17 shows Bcl-xL expression in cells.
  • FIG. 18 is a diagram showing the result of integrating the intensity of the detected Bcl-xL band.
  • RNA-protein interaction motifs composed of relatively short sequences.
  • the HIV Rev protein interacts with an RNA motif that recognizes Rev with high affinity. Therefore, RNP is expected to be used as a material for research in synthetic biology (a field in which biomolecules and life systems are reconstructed through the work of artificially creating biomolecules to induce new technologies).
  • the present inventors use this RNA-protein interaction motif to control RNA interference, thus, the present invention has been completed by considering the translation of the target protein.
  • the present invention provides a guide strand having a sequence complementary to a target sequence, a passenger strand that forms a double strand with the guide strand, and the guide strand according to the first embodiment.
  • An shRNA comprising a linker strand that connects the passenger strand, the linker strand comprising an RNP-derived protein binding motif sequence.
  • ShRNA according to the first embodiment is schematically shown in FIG.
  • the shRNA according to the first embodiment is composed of a guide strand 1, a linker strand 2, and a passenger strand 3 in this order from the 3 'side.
  • the linker chain 2 has a protein binding motif sequence 21 derived from RNP in its sequence.
  • Guide strand 1 is an RNA base sequence of about 21 to 26 bases located at the 3 'end in shRNA.
  • the guide strand 1 has a sequence complementary to a specific sequence of mRNA to be controlled (hereinafter referred to as target sequence), and the mRNA to be controlled can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the purpose. it can. Examples include, but are not limited to, mRNA for apoptosis-inducing genes, mRNA for apoptosis-inhibiting genes, mRNA for cancer marker genes, and the like. More specifically, GFP mRNA, BimEL mRNA, Bcl-xL mRNA and the like can be mentioned.
  • the guide strand needs to be completely complementary to the target sequence. This is to cause the action of RNAi. At least two bases at the 3 'end of the guide strand 1 have an overhang sequence that does not form a complementary strand with the passenger strand.
  • the guide strand 1 is a portion that becomes an siRNA after being cleaved by Dicer.
  • the linker chain 2 serves as a linker between the guide chain 1 and the passenger chain 3.
  • the linker chain 2 is bonded to the 5 ′ side of the guide chain 1 and the 3 ′ side of the passenger chain 3.
  • the linker chain 2 can be said to be a part that is cleaved from the guide chain 1 and the passenger chain 3 after being cleaved by Dicer.
  • the linker chain 2 constitutes the main part of the loop part that is not hybridized, as shown in the figure, but part of the loop part that is not hybridized is In some cases, it may be derived from a part of the 3 ′ end of the passenger strand 3.
  • the linker chain 2 constitutes all of the non-hybridized loop portions, and several bases at the 3 ′ end of the linker chain 2 and several bases at the 5 ′ end of the linker chain 2 May hybridize to form part of the stem portion of the hairpin structure.
  • the linker chain 2 is composed of a base sequence 20 and a protein binding motif sequence 21 derived from RNP.
  • the base sequence 20 refers to a part of the sequence constituting the linker chain and not derived from the RNP-derived protein binding motif sequence 21 in the present invention.
  • the linker chain 2 may be composed only of the protein binding motif sequence 21 derived from RNP. Whether the linker chain 2 is composed of the base sequence 20 and the RNP-derived protein binding motif sequence 21 or the linker chain 2 is composed of only the RNP-derived protein binding motif sequence 21, the linker Strand 2 has a sequence that does not form a complementary strand in the sequence, and that sequence constitutes the loop portion of the shRNA.
  • sequence that does not form a complementary strand is 4 to 20 bases, preferably 4 to 11 bases, and the type of base is not limited.
  • a preferred example of a sequence that does not directly form a complementary strand includes, but is not limited to, 5'-AGCAAUAG-3 ', 5'-GAAA-3'.
  • the protein binding motif sequence 21 includes a base sequence derived from an RNA-protein complex interaction motif (RNP motif), or a base sequence in which a mutation is inserted into the base sequence.
  • RNP motif RNA-protein complex interaction motif
  • the base sequence derived from the RNA-protein complex interaction motif is known as the sequence on the RNA side of the interaction motif between RNA and protein in a natural, known RNA-protein complex.
  • the base sequence and the base sequence that is the sequence on the RNA side in the artificial RNA-protein complex interaction motif obtained by the in vitro evolution method are included.
  • An RNA-protein complex is an association of protein and RNA that has been confirmed in large numbers in a living body, and is a 3D object having a complicated structure.
  • the base sequence derived from a natural RNA-protein complex interaction motif is usually composed of about 10 to 80 bases, and noncovalently, that is, by hydrogen bonding, with a specific amino acid sequence of a specific protein. It is known to form specific bonds.
  • the nucleotide sequences derived from such natural RNA-protein complex interaction motifs are shown in Tables 1 and 2 below, and a database available on the website: http: // gibk26. bse. kyutech. ac. jp / jouhou / image / dna-protein / rna / rna. It can be selected from html.
  • the protein binding motif sequence 21 which is a base sequence derived from an RNA-protein interaction motif preferably used in the present embodiment is a sequence that can be recognized by Dicer described below in detail and can generate RNAi when incorporated into shRNA. is there. In terms of the three-dimensional structure, it is preferable that the protein has a high specificity with a protein that forms a characteristic RNA tertiary structure including an unnatural base pair and further binds to the site.
  • the RNA-protein interaction motif Kd is preferably about 0.1 nM to about 1 ⁇ M, but is not limited to this Kd range.
  • the base sequence derived from an artificial RNA-protein complex interaction motif is a base sequence on the RNA side of an RNA-protein interaction motif in an artificially designed RNA-protein complex.
  • Such a base sequence is usually composed of about 10 to 80 bases, and forms a specific bond with a specific amino acid sequence of a specific protein non-covalently, that is, by hydrogen bonding. design.
  • Base sequences derived from such artificial RNA-protein complex interaction motifs include RNA aptamers that specifically bind to the apoptosis-inducing protein Bcl-2 family, and RNAs that specifically recognize cancer cell surface antigens. An aptamer etc. are mentioned, However, It is not limited to these.
  • the base sequences listed in Table 3 below are also provided, and these can also be used as the base sequence 2 derived from the RNA-protein complex interaction motif of the present invention.
  • RNA-protein complex can be prepared by using a molecular design method and an in vitro evolution method in combination.
  • aptamers and ribozymes can be obtained by repeating functional reactions such as selecting functional RNA from a molecular library with various sequence diversity and amplifying and transcribing the gene (DNA).
  • DNA gene
  • an RNA-protein interaction motif adapted to RNP having a target functional structure in advance in molecular design can be extracted from natural RNP molecules or artificially created by in vitro evolution.
  • the base sequence 2 derived from the RNA-protein complex interaction motif has a dissociation constant Kd of about 0.1 nM to about 1 ⁇ M of the RNA-protein complex from which the base sequence is derived.
  • L7Ae As a specific protein binding motif sequence 21, L7Ae (SEQ ID NO: 1), which is known to be involved in RNA modification such as RNA methylation and pseudouridine formation (Moore T et al., Structure Vol. 12, pp. 209). 807-818 (2004)) binds to the BoxCD sequence, 5′-GGGCGUGAUGCGAAAGCUGACCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 2).
  • the configuration of shRNA according to this embodiment can be obtained by molecular design. For example, based on the sequence of a natural or non-natural known shRNA, by introducing a protein-binding motif sequence into the sequence portion forming the linker chain, or the natural or non-natural known shRNA. Based on the sequence, the sensor shRNA of this embodiment can be obtained by substituting the protein binding motif sequence for the sequence portion forming the linker chain. At this time, it is possible to determine the type of protein-binding motif sequence and the introduction position in consideration of appropriately arranging the target RNP so that the function of the Dicer protein can be inhibited.
  • the shRNA according to the first embodiment is a hairpin shown in FIG. 1 under physiological conditions of pH 6.5 to 8.0, temperature 4 to 42 ° C., preferably pH 7.3 to 7.5, temperature 4 to 37 ° C. It forms a structure and exists stably.
  • the shRNA according to the first embodiment is recognized by Dicer, a double-stranded RNA cleaving enzyme.
  • the shRNA is cleaved at the wedge a position and the wedge b position in FIG. 1 to produce double-stranded RNA having a length of about 19 to 24 bases with each strand protruding from the terminal two bases.
  • the guide RNA complementary to the target mRNA is transferred from the RLC to the RISC, and the translation can be suppressed by cleaving the mRNA to be controlled.
  • the shRNA according to the first embodiment has the same function as the shRNA known in nature in the illustrated form, that is, in the form in which the specific protein is not bound to the protein binding motif sequence 21.
  • FIG. 2A schematically shows shRNA constituting the RNAi control system according to the present embodiment
  • FIG. 2B schematically shows protein 4 derived from RNP.
  • the shRNA is as described in the first embodiment, and a description thereof is omitted here.
  • the same reference numerals as those in FIG. 1 denote the same components.
  • Protein 4 shown in FIG. 2 (B) is a protein that is derived from RNP and specifically binds to protein binding motif sequence 21 on shRNA. Therefore, this protein 4 can be determined specifically for the sequence selected as the protein binding motif sequence 21. Specifically, when Box C / D (SEQ ID NO: 2) is selected as the protein binding motif sequence 21, protein 4 is L7Ae (SEQ ID NO: 1).
  • the protein 4 may also be a fusion protein including a protein that specifically binds to the protein binding motif sequence 21, and an additional peptide is added to the protein that specifically binds to the protein binding motif sequence 21. May be. This is because it is sufficient that the recognition by Dicer described below can be inhibited.
  • the shRNA according to the present embodiment functions in the same manner as shRNA known in nature, as described in the first embodiment, when the protein 4 is not present. Occurs and suppresses the translation function of specific mRNA.
  • FIG. 2 (C) schematically shows shRNA and protein 4 in a system in which shRNA and protein 4 coexist.
  • pH 6.5 to 8.0 temperature 4 to 42 ° C., preferably pH 7.0 to 7.5, temperature 4 to 37 ° C.
  • shRNA and protein 4 bind specifically, and RNP It forms a complex and exists stably.
  • the contacting step is performed by mixing the sensor shRNA prepared as described above and the protein in the same solution system.
  • the shRNA and protein are mixed under physiological conditions of pH 6.5 to 8.0, temperature 4 to 42 ° C., preferably pH 7.3 to 7.5, temperature 4 to 37 ° C. Thereby, shRNA and protein specifically interact to form an RNP complex.
  • the concentration of the RNP complex introduced into the cell is, for example, preferably 1 to 10 times the protein concentration when the shRNA is 1 nM to 40 nM, preferably 1 nM to 20 nM, but this concentration range is limited.
  • the introduction method into the cell can be performed by transfection using liposomes, but is not limited thereto, and can be carried out by a method known in the art for those skilled in the art.
  • shRNA can be expressed with tetracycline after protein introduction.
  • shRNA may be directly introduced into the cell, or a vector expressing shRNA may be introduced into the cell.
  • the protein introduced into the cell forms an RNP complex with the sensor shRNA, and the expression of the target gene in the cell can be controlled by RNAi, which is effective for the development of protein drugs and the treatment of diseases such as cancer. I think that the.
  • FIG. 3 shows an example of a method for producing a vector.
  • FIG. 3 (A) is the pENTR TM / H1 / TO vector (SEQ ID NO: 8) sold by Invitrogen.
  • a DNA sequence encoding the shRNA of the present invention is inserted at the position indicated by the arrow in FIG.
  • FIG. 3B schematically shows a DNA double strand to be inserted.
  • the vector expressing the shRNA and the vector expressing the protein are introduced into the same cell and expressed.
  • the introducing step can be performed by transfection. Examples include, but are not limited to, transfection using liposomes, direct injection, electroporation, lentivirus introduction, and the like.
  • the amount of the shRNA expression vector and the protein expression vector to be introduced into the cells varies depending on the purpose.
  • the L7Ae protein expression vector is 1/4 to 10 times, preferably 1 time the amount of the shRNA expression vector. ⁇ 4 times the amount.
  • shRNA-BoxC / D-GFP [In vitro synthesis of shRNA]
  • shRNA template DNA L7Aer template (100 ⁇ M, 5′-CTGGCATCAAGGTGAACTTCAGCATCATCGCCCTTTTCGGGTCACGCTGAAGTTCCACTTGATGCTATAGTGAGTCGTATTTAGC-3 ′ 1 mg / mL pyrophosphatase (ROCHE) 5 ⁇ L, 20 mg / mL BSA 1.75 ⁇ L, 1 M Hepes-KOH 28 ⁇ L, 1 M MgCl 2 14 ⁇ L, 1 M DTT 3.5 ⁇ L, 0.1 M spermidine 14 ⁇ L, 0.1 M ATP 33.6 ⁇ L ( Same for CTP and UTP ), 0.1M GTP 8.96 ⁇ L, 0.1M GMP 89.6 ⁇ L, mixed ultrapure water 385MyuL, and reacted overnight at 37 ° C..
  • the supernatant was recovered by centrifugation (4 ° C., 6000 rpm, 20 minutes), and the protein with a histidine tag was purified by a batch method using a Ni-NTA column (Qiagen). Specifically, first, the supernatant and 1 mL of Ni-NTA were mixed and stirred at 4 ° C. for 1 hour. Thereafter, the column was packed and washed twice with 4 mL of wash buffer (50 mM Na phosphate, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0).
  • wash buffer 50 mM Na phosphate, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0.
  • FIG. 6 shows the binding of shRNA-GFP, shRNA-boxC / D-GFP, and shRNA-boxC / Dmut-GFP to L7Ae by gel shift assay. As a result, it was suggested that shRNA-BoxC / D-GFP and L7Ae were bound in a sequence-specific manner.
  • FIG. 7 shows the results of Dicer cleavage inhibition by L7Ae of shRNA-boxC / D-GFP and shRNA-boxC / Dmut-GFP using an in vitro reconstituted Dicer system.
  • L7Ae + indicates a sample prepared from 4 ⁇ M L7Ae
  • ++ indicates a sample prepared from 8 ⁇ M L7Ae
  • ⁇ indicates a case where L7Ae was not used.
  • Dicer + indicates that Dicer is used, and-indicates that Dicer is not used.
  • shRNA-BoxC / D-GFP and L7Ae were specifically bound to each other and were not cleaved by Dicer.
  • This double strand is a double strand shown in FIG.
  • the double-stranded DNA solution was diluted 100-fold with ultrapure water, and then mixed with 1 ⁇ L of diluted solution, 10 ⁇ Oligo Annealing Buffer 10 ⁇ L, and ultrapure water 89 ⁇ L, and diluted 100-fold. Thereafter, 4 ⁇ L of 5 ⁇ Ligation Buffer, 2 ⁇ L of 0.75 ng / ⁇ L pENTR / H1 / TO vector, 5 ⁇ L of 10,000-fold diluted DNA solution, 8 ⁇ L of ultrapure water, 1 U / ⁇ L T4 DNA Ligase, 1 ⁇ L were mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • the shRNA coding sequence was incorporated into the pENTR / H1 / TO vector. 4 ⁇ L of this reaction solution was added to TOP10 Competent E. coli for transformation. O. After adding C medium and shaking culture for 1 hour, it was seeded on an LB plate containing 50 ⁇ g / mL kanamycin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • H1 Forward Primer (10 ⁇ M, 5′-TGTTCTGGGAAATCACCATA-3 ′ SEQ ID NO: 20)
  • M13 Reverse Primer (10 ⁇ M, 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′ SEQ ID NO: 21)
  • colony PCR was performed using KOD-Plus-ver2 (TOYOBO). This colony was inoculated into 50 mL of LB medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours.
  • the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 6000 rpm, 15 minutes), purified according to the protocol of the Plasmid purification kit (Qiagen), and subjected to isopropanol precipitation. After discarding the supernatant and drying the pellet, 55 ⁇ L of ultrapure water was added and dissolved. The concentration of the plasmid vector was measured and used for subsequent experiments.
  • 160 ⁇ L of LB medium was added, seeded on an LB plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
  • the formed colonies were subjected to colony PCR using Extaq (TAKARA) and the above-described DNA primer, and an insert check was performed.
  • the colonies in which the insert was confirmed were transferred to 50 mL of LB medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and cultured overnight at 37 ° C. with shaking.
  • the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 6000 rpm, 15 minutes), purified according to the protocol of the Plasmid purification kit (Qiagen), and subjected to isopropanol precipitation. After discarding the supernatant and drying the pellet, 55 ⁇ L of ultrapure water was added and dissolved.
  • T7 promoter primer (5′-TAATACGACTCACTATAGGGG-3 ′ SEQ ID NO: 34) and BGHrev primer (5′-GCTGGCCAACTAAGGCACAG-3 ′ SEQ ID NO: 35). Used in the experiment.
  • pENTRshRNA-GFP pENTRshRNA-GFP mut, pENTRshRNA-BoxC / D-GFP, pENTRshRNA-BoxC / Dmut-GFP 0.3 ⁇ g
  • pcDNA3.1-AsRed2-L7Ae-myc-His6-cid3-Aid-myc-His6 0.3 ⁇ g of His6 (SEQ ID NO: 42) and 0.2 ⁇ g of pcDNA3.1-EGFP-myc-His6 were added, and 1.25 ⁇ l of Lipofectamine 2000 was added per sample.
  • FIG. 12 is an EGFP fluorescence image obtained by applying excitation light having a wavelength of around 488 nm and passing through a wavelength filter of 510 to 550 nm.
  • “+” below each panel indicates that the fluorescence intensity is high, and “ ⁇ ” indicates that the fluorescence intensity is low. From this image, the effect of AsRed2-L7Ae to suppress the knockdown function of shRNA-Box C / D-GFP was shown.
  • HeLa-GFP cells were seeded on 6- well plates at 0.5 ⁇ 10 6 cells / well and cultured in a 37 ° C. CO 2 incubation.
  • Co-transfection of pENTR / H1 / TO shRNA expression vector and pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6 was performed.
  • RNA 1.5 ⁇ g (or 0.5 ⁇ g) was extracted using a random primer and reverse transcriptase using High-Capacity cDNA Reverse Transfer Kits (Applied Biosystems (trademark)).
  • Real-time PCR was performed by using LightCycler 480 Taqman probe (Roche) (trademark) using cDNA diluted 1/20 as a template.
  • PCR reaction and real-time fluorescence detection were performed using a light cycler 480 (Roche) (trademark).
  • the reaction conditions were 95 ° C. for 5 minutes in the initial denaturation step, 45 cycles of denaturation at 95 ° C. for 10 seconds, annealing / extension 60 ° C.
  • the amplification efficiency was measured using Universal probe Library probe # 148 (ROCHE) for GFP mRNA and Universal probe Library # 60 (ROCHE) for GAPDH mRNA. It was confirmed by electrophoresis that the target product was a single amplified product, and the results were evaluated by relative quantification. The amount of EGFP was normalized by GAPDH, and the normalized value was used to compare the samples with the relative amount of GFP mRNA of the sample to which only pENTRshRNA-GFP mut was added as 1.
  • FIG. 8 shows the results of RNAi inhibition by L7Ae by RT-PCR analysis.
  • shRNA-BoxC / D-GFP and L7Ae protein were introduced into cells by transfection using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (trademark). 10 ⁇ M shRNA-BoxC / D-GFP 0.6 ⁇ l, 20 ⁇ M L7Ae protein 0 ⁇ l, 0.6 ⁇ l, 1.2 ⁇ l, 2.4 ⁇ l, 4.8 ⁇ l, 9.6 ⁇ l, 5 ⁇ binding buffer 2 ⁇ l, and mixed with ultrapure water In addition, the volume was 10 ⁇ l (for 9.6 ⁇ l of the L7Ae protein, 12.2 ⁇ l was added without adding ultrapure water).
  • shRNA-BoxC / D mut-Bcl-xL [shRNA-BoxC / D mut-Bcl-xL (FIG. 13 (C) (SEQ ID NO: 45))] shRNA template DNA, shRNA-BoxC / Dmut-BclxL template (100 ⁇ M, 5′-CTGCTTTGAACAGGTTAGGAATGATGGAGCCCCTTCTCGGCTCATCTCACTACCCTGTTCAAGCCTTAGTGGATCTG.46 4) Using 5.25 ⁇ L, transcription synthesis and purification were performed in the same manner as shRNA-BoxC / D-GFP, dissolved in 22 ⁇ L of ultrapure water, the concentration was measured, and used in the subsequent experiments.
  • HeLa cells derived from cervical cancer were seeded on a 24-well plate so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well and cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • transfection was performed twice with Lipofectamine 2000 (invitrogen) TM. 1 ⁇ l of Lipofectamine 2000 was added to 0.4 ⁇ g of pBcl-xL or pBimEL. These DNA-lipid complexes were incubated at room temperature for 20 minutes and added dropwise to a HeLa cell culture medium. The medium was changed after 4 and a half hours, and immediately after that, a second transfection was performed.
  • shRNA-BoxC / D-Bcl-xL or shRNA-BoxC / Dmut-Bcl-xL 2.5 pmol (concentration in medium, 5 nM) and purified L7Ae protein 0, 200 pmol (concentration in medium, 400 nM)
  • a complex was formed. 1 ⁇ l of Lipofectamine 2000 was added to this complex, incubated at room temperature for 20 minutes, and added dropwise to a HeLa cell culture medium. The medium was changed after 5 hours.
  • Bcl-xL and GAPDH were detected by Western blotting.
  • the protein extracted from the cells was developed by SDS-PAGE and Western blotting was performed.
  • Primary antibody Anti-Bcl-xL (SC-634) (santa cruz biotechnology, inc.) (1/500), secondary antibody Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP conjugate (BIORAD) (1/2000) It was.
  • the color was developed with ECL Plus (GE healthcare) (trademark) and detected using LAS3000 (Fuji Film).
  • FIG. 15 shows Bcl-xL expression in cells. It was also confirmed that the protein expression level of GAPDH used as a standard control did not change. The intensity of the detected Bcl-xL band was integrated. The result is shown in FIG. 15 and 16, sh is an abbreviation for “shRNA”.
  • cervical cancer-derived HeLa cells were seeded on a 12-well plate so as to be 3.0 ⁇ 10 5 cells / well and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C.
  • transfection was performed with Lipofectamine 2000 (invitrogen) TM.
  • 0.2 ⁇ g of pBcl-xL, 0.4 ⁇ g of pcDNA3.1-L7Ae, 0.6 ⁇ g of pENTR / H1 / TO-shRNA-BoxC / D-Bcl-xL were mixed, and 2.5 ⁇ l of Lipofectamine 2000 was added.
  • These DNA-lipid complexes were incubated at room temperature for 20 minutes and added dropwise to a HeLa cell culture medium.
  • the well medium was collected, and the cells were detached with 200 ⁇ l Trypsine-EDTA, and each medium collected in the previous step was added and suspended.
  • the cell suspension was spun down at 4 ° C., 500 ⁇ g for 5 minutes, washed with 500 ⁇ l of PBS, and then 100 ⁇ l RIPA buffer (1 ⁇ PBS, 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1%) on the pelleted cells.
  • SDS, 0.3 mg / ml PMSF + 2 ⁇ g / ml Aprotinin) was added and left on ice for 30 minutes, and the supernatant was collected by centrifugation (4 ° C., 15000 g, 20 minutes).
  • the protein concentration was determined by the Lowry method using a DC-protein assay (BIO-RAD).
  • Bcl-xL and GAPDH were detected by Western blotting.
  • the protein extracted from the cells was developed by SDS-PAGE and Western blotting was performed.
  • Primary antibody Anti-Bcl-xL (SC-634) (santa cruz biotechnology, inc.) (1/500), secondary antibody Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP conjugate (BIORAD) (1/2000) It was.
  • the color was developed with ECL Plus (GE healthcare) (trademark) and detected using LAS3000 (Fuji Film).
  • Bim-EL which is an apoptosis-promoting protein
  • Bcl-xL which is an apoptosis-inhibiting protein
  • the expression level of Bcl-xL is controlled using knockdown control of Bcl-xL by binding of L7Ae protein and shRNA-BoxC / D-Bcl-xL in human cancer cultured cells, and Bcl-xL against Bim-EL is controlled.
  • Experiments were conducted to control cell death by changing the relative amount of.
  • HeLa cells derived from cervical cancer were seeded on a 24-well plate so as to be 0.5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • transfection was performed with Lipofectamine 2000 (invitrogen) TM.
  • pENTR / H1 / TO-shRNA-BoxC / D-Bcl-xL 0.3 ⁇ g add pBcl-xL 0.2 ⁇ g, pBimEL 0.2 ⁇ g, pcDNA3.1-AsRed2-L7Ae 0.2 ⁇ g, and mix in the medium. 1.25 ⁇ l of Lipofectamine 2000 was added.
  • the well medium was collected, and the cells were detached with 200 ⁇ l Trypsine-EDTA, and each medium collected in the previous step was added and suspended.
  • the cell suspension was centrifuged at 4 ° C., 500 ⁇ g for 3 minutes, washed with 300 ⁇ l of PBS, and then pelleted cells were mixed with 3 ⁇ l Annexin V, Pacific Blue conjugation for flow cytometry (Invitrogen) and 50 ⁇ l nexin-binding.
  • annexin-binding buffer 200 ⁇ l annexin-binding buffer was added to each sample and suspended, and the cell suspension was transferred to a FACS tube and analyzed by FACS Aria (BD).
  • FACS Aria FACS Aria
  • 30000 cells were measured.
  • gating is performed on cells emitting red fluorescence by AsRed2-L7, and the blue fluorescence intensity of Pacific Blue is measured for cells in the gate using filters with excitation wavelengths of 405 nm and fluorescence wavelengths of 430 to 470 nm. Then, the ratio of the number of cells whose fluorescence intensity was larger than the standard was measured.
  • phosphatidylserine a lipid that exists specifically in the outer membrane of dead cells
  • annexin V Pacific Blue conjugation for flow cytometry (Invitrogen)
  • the blue Cells having a fluorescence intensity greater than the upper limit of the intensity of a sample obtained by similarly staining untreated cells were counted as dead cells.
  • the death cell rate of the sample to which the control vector (pcDNA3.1 (+) myc His A vector) was added was 8.3%
  • the death of the sample to which pENTR / H1 / TO-shRNA-GFP mut (negative control) was added Cell rate 10.1%
  • the dead cell rate of the sample was 34.5%
  • the dead cell rate of the sample to which pENTR / H1 / TO-shRNA-BoxC / D-mut Bcl-xL was added was 42.5%.
  • RNAi can be controlled by a sensor shRNA and a protein that specifically binds to it, without destroying cells, It is useful for the construction of biosensors that quantify the expression of intracellular marker proteins and artificial gene circuits that can activate translation of target proteins according to the expression level of marker proteins. For example, activation of an apoptosis-inducing protein in accordance with the expression of a cancer marker protein, or as a basic technology for developing protein drugs, has a great effect of leading to treatment of diseases such as cancer and Alzheimer.

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Abstract

ＲＮＡ-蛋白質相互作用モチーフを利用した利用したＲＮＡｉ制御システムを提供することを目的とする。標的配列に対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖とを備えるｓｈＲＮＡであって、該リンカー鎖が、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列を備えるｓｈＲＮＡ、及びかかるｓｈＲＮＡと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質とを含んでなるＲＮＡｉ制御システム。

Description

ＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムの構築
　本発明は、ＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムの構築に関する。
　ＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉと記載する）はｍＲＮＡを配列特異的に切断することで翻訳を一過的に抑制する現象で、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと記載する）などの二重鎖ＲＮＡを導入することでこのＲＮＡｉを引き起こす、ノックダウンという手法が様々な生物種で確立されている。ＲＮＡｉは、発見から１０年という短期間で、遺伝子発現を一過的に抑制する簡便、かつ強力な手法として、治療法への検討を含め、広く普及してきている。しかし、そのメカニズムや導入技術については、現在も発展途上である。また、現時点では、ノックダウンを強く効かせるための研究や、目的の部位へＲＮＡを運ぶデリバリー技術の開発が中心である。
　Ｃｈｕｎｇ等は、ｓｈＲＮＡのループ部分に、カフェイン様の低分子化合物として知られているｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅの結合部位を導入した人工ＲＮＡを作製し、ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅの濃度依存的にＲＮＡｉが阻害されることを示した（非特許文献１を参照。）。
Ｃｈｕｎｇ－Ｉｌ　Ａｎ，Ｖｕ　Ｂ．Ｔｒｉｎｈ，ａｎｄ　Ｙｏｈｅｉ　Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ，ＲＮＡ，Ｍａｙ　２００６；１２：７１０－７１６
　本発明は、阻害剤にＲＮＡやタンパク質を用いた翻訳制御機構を新たに設計、作製し、生体内にこのような人工翻訳制御システムを組み込むことを目的として、ＲＮＰを利用したＲＮＡｉ制御システムを提供することを目的とする。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、ｓｈＲＮＡであって、標的配列に対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖とを備えるｓｈＲＮＡであって、該リンカー鎖が、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列を備えるｓｈＲＮＡに関する。本明細書において、かかるｓｈＲＮＡを、センサーｓｈＲＮＡとも呼ぶ、
　前記ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列が、Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ配列であることが好ましい。
　本発明は、別の側面によれば、ＲＮＡｉ制御システムであって、上記センサーｓｈＲＮＡと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質とを含んでなる。
　本発明は、別の側面によれば、ＲＮＡｉ制御システムであって、上記センサーｓｈＲＮＡを発現するベクターと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質を発現するベクターとを含んでなる。
　本発明は、また別の側面によれば、ＲＮＡｉの制御方法であって、上記センサーｓｈＲＮＡと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質とを溶液中で接触させる工程と、該ｓｈＲＮＡと蛋白質とを含む溶液を、細胞内に導入する工程とを含む方法に関する。
　本発明のさらにまた別の側面によれば、ＲＮＡｉの細胞内制御方法であって、細胞内に、上記センサーｓｈＲＮＡを発現するベクターを導入する工程と、該細胞と同一の細胞内に、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質を発現するベクターを導入する工程と、該ｓｈＲＮＡを発現するベクターと、該蛋白質を発現するベクターとを発現させる工程とを含む。
　本発明のさらにまた別の側面によれば、細胞内で発現する蛋白質に応答するＲＮＡｉ制御システムであって、上記センサーｓｈＲＮＡであって、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列が該細胞内で発現する蛋白質に特異的に結合する配列であるｓｈＲＮＡ、または該ｓｈＲＮＡを発現するベクターを含むシステム、及び細胞内で発現する蛋白質に応答するＲＮＡｉ制御方法であって、細胞内に、上記センサーｓｈＲＮＡであって、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列が該細胞内で発現する蛋白質に特異的に結合する配列であるｓｈＲＮＡ、または該ｓｈＲＮＡを発現するベクターを導入する工程を含む方法を提供する。
　本発明のさらにまた別の側面によれば、アポトーシス制御蛋白質を発現制御するＲＮＡｉ制御システムであって、前記ｓｈＲＮＡの標的配列が、Ｂｃｌ－ｘＬのｍＲＮＡである、ＲＮＡｉ制御システム、及び、前記ｓｈＲＮＡを用いた人工蛋白質情報変換システムであって、前記ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合する蛋白質の情報を、前記ｓｈＲＮＡの標的配列となるＲＮＡによりコードされる蛋白質の情報に変換する人工蛋白質情報変換システムを提供する。
　本発明の効果として、上記センサーｓｈＲＮＡを用いれば、該ｓｈＲＮＡに特異的に結合する蛋白質に依存して、ＲＮＡｉを抑制するように制御することが可能になる。これは、上記センサーｓｈＲＮＡが存在すれば、特定の蛋白質を入力信号として用いることで、特定のｍＲＮＡにおけるＲＮＡｉを抑制し、その特定のｍＲＮＡが発現する蛋白質量を相対的に増加させることができることを意味する。本発明に係るセンサーｓｈＲＮＡと、特定の蛋白質との組み合わせを用いることで、細胞を破壊することなく、細胞内マーカー蛋白質の発現を定量するバイオセンサーや、マーカー蛋白質の発現量に応じて目的蛋白質の翻訳を活性化できる、人工遺伝子回路の構築に有用である。たとえば、癌マーカー蛋白質の発現に応じて、アポトーシス誘導蛋白質を活性化することで、癌やアルツハイマーなどの疾病治療につながるという大きな効果が得られる。
図１は、第一実施形態によるｓｈＲＮＡを模式的に示す図である。 図２中、（Ａ）は、第二実施形態によるＲＮＡｉ制御システムを構成するｓｈＲＮＡを模式的に示す図であり、（Ｂ）は、第二実施形態によるＲＮＡｉ制御システムを構成するＲＮＰ由来の蛋白質４を模式的に示す図であり、（Ｃ）はｓｈＲＮＡと、蛋白質４が共存する系におけるｓｈＲＮＡと、蛋白質４との複合体を、模式的に示す図である。 図３中、（Ａ）は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより販売されている、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｈ１／ＴＯベクターを示す図であり、（Ｂ）は、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｈ１／ＴＯベクターに挿入するＤＮＡ二本鎖を模式的に示す図である。 図４は、蛋白質発現ベクターの作製例を示す図である。 図５中、（Ａ）は、ＥＧＦＰノックダウン用のｓｈＲＮＡ－ＧＦＰの二次構造配列を示す図であり、（Ｂ）は、ＥＧＦＰのノックダウンを起こさないネガティブコントロールとして用いられるｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ－ｍｕｔの二次構造配列を示す図であり、（Ｃ）は、Ｌ７Ａｅ蛋白質とＢｏｘＣ/Ｄ配列で特異的に結合することが期待されるｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰの二次構造配列を示す図であり、（Ｄ）は、Ｌ７Ａｅと結合しないｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ－ＧＦＰの二次構造配列を示す図である。（Ａ）～（Ｄ）において、楔形は、Ｄｉｃｅｒによる切断位置である。 図６は、ゲルシフトアッセイによるｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ、ｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、及びｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰと、Ｌ７Ａｅとの結合を示す図である。 図７は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ再構成Ｄｉｃｅｒ系を用いたｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰのＬ７ＡｅによるＤｉｃｅｒ切断阻害の結果を示す図である。 図８は、ＲＴ－ＰＣＲ解析による、Ｌ７ＡｅによるＲＮＡｉ阻害の結果を示すグラフである。 図９は、ＦＡＣＳ解析による、Ｌ７ＡｅによるＲＮＡｉ阻害の結果を示すグラフである。 図１０は、実施例２において、細胞内のＧＦＰの蛍光画像と位相差画像を重ね合わせた画像である。 図１１は、実施例２におけるＦＡＣＳ解析による蛍光強度分布の結果を示すグラフである。 図１２は、ＡｓＲｅｄ２－Ｌ７ＡｅによるｓｈＲＮＡ－Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ－ＧＦＰのノックダウン機能抑制効果を示す、ＥＧＦＰの蛍光画像である。 （Ａ）は、ＢｃｌｘＬノックダウン用のｓｈＲＮＡ－ＢｃｌｘＬの二次構造配列を示す図であり、（Ｂ）は、Ｌ７Ａｅ蛋白質とＢｏｘＣ/Ｄ配列で特異的に結合することが期待されるｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＢｃｌｘＬの二次構造配列を示す図であり、（Ｃ）は、Ｌ７Ａｅと結合しないｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＢｃｌｘＬの二次構造配列を示す図である。（Ａ）～（Ｃ）において、楔形は、Ｄｉｃｅｒによる切断位置である。 図１４は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ再構成Ｄｉｃｅｒ系を用いたｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ、及びｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬのＬ７ＡｅによるＤｉｃｅｒ切断阻害の結果を示す図である。 図１５は、細胞内でのＢｃｌ－ｘＬ発現を示す図である。 図１６は、検出したＢｃｌ－ｘＬのバンドの強度を積算した結果を示す図である。 図１７は、細胞内でのＢｃｌ－ｘＬ発現を示す図である。 図１８は、検出したＢｃｌ－ｘＬのバンドの強度を積算した結果を示す図である。
　１　　ガイド鎖
　２　　リンカー鎖
　２０　ベース配列
　２１　蛋白質結合モチーフ配列
　３　　パッセンジャー鎖
　４　　蛋白質
　ａ　　Ｄｉｃｅｒ切断位置
　ｂ　　Ｄｉｃｅｒ切断位置
　１ｄ　ガイド鎖をコードするＤＮＡ配列
　２ｄ　リンカー鎖をコードするＤＮＡ配列
　３ｄ　パッセンジャー鎖をコードするＤＮＡ配列
　以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。しかし、以下の説明は本発明を限定するものではない。
　近年、生体内で機能する様々なノンコーディングＲＮＡが発見され、その役割に注目が集まっている。しかしながらこれらＲＮＡは生体内で多くの場合、蛋白質と複合体（ＲＮＰ）を形成している。このことから、人工ＲＮＰは、細胞機能を制御できる新しいナノブロックとして期待されている。天然に存在するＲＮＰは、比較的短い配列から構成されるＲＮＡ－蛋白質相互作用モチーフ（ＲＮＰ　ｍｏｔｉｆ）を利用して、多くの複合体を形成していることがわかる。例えばＨＩＶ　Ｒｅｖ蛋白質は、Ｒｅｖを認識するＲＮＡモチーフと、高い親和性で相互作用している。したがってＲＮＰは、シンセティックバイオロジー（生体分子を人工的に創り出す作業を通して生体分子や生命システムを再構築し、新しいテクノロジーを誘発する分野）研究の素材としての利用が期待されている。
　本願発明者らは、細胞内で発現する蛋白質に応答して、目的蛋白質の翻訳を制御するシステムを開発するために、このＲＮＡ－蛋白質相互作用モチーフを利用して、ＲＮＡ干渉を制御し、これにより目的蛋白質の翻訳を制御することを考え、本発明を完成するに至った。
　本発明は、第一実施形態によれば、ｓｈＲＮＡであって、標的配列に対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖とを備えるｓｈＲＮＡであって、該リンカー鎖が、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列を備える。
　第一実施形態によるｓｈＲＮＡを図１に模式的に示す。第一実施形態によるｓｈＲＮＡは、３’側から順に、ガイド鎖１と、リンカー鎖２と、パッセンジャー鎖３とから構成される。リンカー鎖２は、その配列中に、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列２１を有する。
　ガイド鎖１は、ｓｈＲＮＡにおいて、３’末端に位置する、約２１塩基～２６塩基のＲＮＡ塩基配列である。ガイド鎖１は、制御の対象とするｍＲＮＡの特定配列（以下、標的配列という）に相補的な配列を有し、制御の対象とするｍＲＮＡは、その目的によって、当業者が適宜選択することができる。例えば、アポトーシス誘導遺伝子のｍＲＮＡ、アポトーシス抑制遺伝子のｍＲＮＡ、癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡ等が挙げられるが、これらには限定されない。さらに具体的には、ＧＦＰのｍＲＮＡ、ＢｉｍＥＬのｍＲＮＡ、Ｂｃｌ－ｘＬのｍＲＮＡ等が挙げられる。また、これらのｍＲＮＡにおいて、どの配列を標的配列とするかは、オフターゲット効果を抑制し、標的遺伝子がより効率良く発現抑制されることに留意して、その一次遺伝子配列の構成と種類の情報に基づき設計ソフトを利用して、当業者が適宜選択することができる。なお、ガイド鎖は、標的配列に対し、完全に相補的である必要がある。ＲＮＡｉの作用を生じさせるためである。ガイド鎖１の３’末端の少なくとも２塩基は、パッセンジャー鎖と相補鎖を組まない、オーバーハング配列になっている。なお、ガイド鎖１は、Ｄｉｃｅｒにより切断された後に、ｓｉＲＮＡとなる部分である。
　パッセンジャー鎖３は、ｓｈＲＮＡの５’末端に位置する、約２１塩基～２６塩基のＲＮＡ塩基配列である。パッセンジャー鎖３が例えば２１塩基の場合、パッセンジャー鎖３のうち、３’側から３塩基目から２１塩基目までは、ガイド鎖１の３’側から３塩基目から２１塩基目までと相補鎖を形成する配列を有する。パッセンジャー鎖３が２１塩基からなる場合、通常、ガイド鎖も２１塩基から構成される。なお、パッセンジャー鎖３とガイド鎖１を構成する塩基数が、２２、２３、２４、２５、２６のいずれの場合であっても、パッセンジャー鎖３とガイド鎖５との塩基数は通常等しく、また、図１に示すように、パッセンジャー鎖３の３’末端３塩基目から５’末端の塩基までと、ガイド鎖１の５’末端の塩基から３’側末端手前３塩基目までとが相補鎖を形成する配列を有する。この場合、パッセンジャー鎖には、ガイド鎖とのあいだに、１塩基～２塩基のミスマッチが入ることも許容されうる。パッセンジャー鎖３は、Ｄｉｃｅｒにより切断された後に、３’端に少なくとも２塩基の、ガイド鎖１の一部とも、リンカー鎖の一部とも相補鎖を形成しないオーバーハング配列を有する。なお、パッセンジャー鎖３も、Ｄｉｃｅｒにより切断された後に、ｓｉＲＮＡとなる部分である。
　リンカー鎖２は、ガイド鎖１とパッセンジャー鎖３とのリンカーの役割を果たす。リンカー鎖２は、ガイド鎖１の５’側であって、パッセンジャー鎖３の３’側に結合している。別の表現でいえば、リンカー鎖２は、Ｄｉｃｅｒによる切断後に、ガイド鎖１およびパッセンジャー鎖３から切り離される部分であるともいえる。なお、リンカー鎖２は、本願発明にかかるセンサーｓｈＲＮＡにおいて、図示するように、ハイブリダーゼーションしていないループ部分の主要部を構成しているが、ハイブリダーゼーションしていないループ部分の一部は、パッセンジャー鎖３の３’末端の一部に由来する場合もある。あるいは、図示はしないが、リンカー鎖２は、ハイブリダーゼーションしていないループ部分のすべてを構成し、かつリンカー鎖２の３’末端の数塩基と、リンカー鎖２の５’末端の数塩基とがハイブリダーゼーションして、ヘアピン構造のステム部分の一部を形成している場合もある。
　リンカー鎖２は、ベース配列２０と、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列２１とから構成される。ここで、ベース配列２０とは、本願発明において、リンカー鎖を構成する配列の一部であって、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列２１由来ではない部分をいう。リンカー鎖２は、別の形態としては、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列２１のみから構成されてもよい。リンカー鎖２が、ベース配列２０と、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列２１とから構成される場合にも、リンカー鎖２が、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列２１のみから構成される場合にも、リンカー鎖２は、その配列内に相補鎖を形成しない配列を有し、その配列がｓｈＲＮＡのループ部分を構成する。相補鎖を形成しない配列は、４～２０塩基、好ましくは、４～１１塩基で、塩基の種類は問わない。直接相補鎖を形成しない配列の好ましい一例としては、５’－ＡＧＣＡＵＡＧ－３’、５’－ＧＡＡＡ－３’が挙げられるが、これらには限定されない。
　リンカー鎖２の３’末端の２塩基は、パッセンジャー鎖３の３’末端の２塩基と相補鎖を形成する。さらに、リンカー鎖２の３’末端の３～７塩基目と、リンカー鎖２の５’末端の１～４塩基とが相補鎖を形成してもよい。この場合、相補鎖を形成する塩基数は４塩基となるが、４塩基には限定されず、１～８塩基の間で決定することができる。
　ベース配列２０に、蛋白質結合モチーフ配列２１が導入される場合、蛋白質結合モチーフ配列２１の導入位置としては、限定されるものではないが、後に述べるＤｉｃｅｒによる認識が保持される範囲であればよい。また、ベース配列を含まない場合には、蛋白質結合モチーフ配列２１を直接、ガイド鎖１及びパッセンジャー鎖３に結合することができる。
　ここで、蛋白質結合モチーフ配列２１とは、ＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ（ＲＮＰモチーフ）由来の塩基配列、あるいは当該塩基配列に変異を挿入した塩基配列が挙げられる。本発明において、ＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、天然の、既知のＲＮＡ－蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の配列として知られている塩基配列と、試験管内進化法により得られた人工的なＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフにおけるＲＮＡ側の配列である塩基配列とが含まれる。ＲＮＡ－蛋白質複合体とは、生体において多数確認されている蛋白質とＲＮＡとの会合体であり、複雑な構造を持つ３Ｄオブジェクトである。天然のＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、通常、約１０～８０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｒｎａ／ｒｎａ．ｈｔｍｌから選択することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ－蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列である蛋白質結合モチーフ配列２１は、ｓｈＲＮＡに組み込まれたときに、以下に詳述するＤｉｃｅｒに認識され、ＲＮＡｉが生じうる配列である。立体構造条件的には、非天然塩基対を含む特徴的なＲＮＡ３次構造を形成し、さらにその箇所に結合する蛋白質との特異性が高いことが好ましい。また、ＲＮＡ－蛋白質相互作用モチーフのＫｄが、約０．１ｎＭ～約１μＭ程度のものが好ましいが、かかるＫｄの範囲には限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　人工のＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、人工的に設計したＲＮＡ－蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の塩基配列である。このような塩基配列は、通常、約１０～８０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するように設計する。このような人工的なＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列としては、アポトーシス誘導蛋白質Ｂｃｌ－２ファミリーに特異的に結合するＲＮＡアプタマーや、がん細胞表面抗原を特異的に認識するＲＮＡアプタマーなどが挙げられるが、これらには限定されない。また、以下の表３に挙げる塩基配列もしられており、これらもまた本発明のＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２として用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　人工のＲＮＡ－蛋白質複合体は、分子デザイン方法と試験管内進化法を併用することで、作成することができる。試験管内進化法では、様々な配列多様性をもつ分子ライブラリーから、機能性ＲＮＡを選別し、その遺伝子（ＤＮＡ）を増幅、転写するといった反応を繰り返すことで、アプタマーやリボザイムを得ることができる。従って、分子デザインであらかじめ目的の機能構造をもったＲＮＰに適応したＲＮＡ－蛋白質相互作用モチーフを天然ＲＮＰ分子から抽出、または試験管内進化法により人工的に作成することが可能となる。本実施形態において、ＲＮＡ－蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２は、その塩基配列の由来となるＲＮＡ－蛋白質複合体の解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ～約１μＭ程度であるものが好ましい。具体的な蛋白質結合モチーフ配列２１としては、ＲＮＡのメチル化やシュードウリジン化といったＲＮＡ修飾に関わることが知られているＬ７Ａｅ（配列番号１）（Ｍｏｏｒｅ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｖｏｌ．　１２，　ｐｐ．　８０７－８１８　（２００４））が結合する塩基配列であるＢｏｘＣＤ配列、５’－ＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＧＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣ－３’（配列番号２）が挙げられる。
　本実施形態によるｓｈＲＮＡの構成は、分子設計により得ることができる。例えば、天然の、または非天然の既知のｓｈＲＮＡの配列に基づいて、リンカー鎖を形成する配列部分に、蛋白質結合モチーフ配列を導入することにより、あるいは、天然の、または非天然の既知のｓｈＲＮＡの配列に基づいて、リンカー鎖を形成する配列部分を蛋白質結合モチーフ配列で置換することにより、本実施形態のセンサーｓｈＲＮＡを得ることができる。この際、Ｄｉｃｅｒ蛋白質の機能を阻害できるように、目的のＲＮＰを適切に配置させることに留意して、蛋白質結合モチーフ配列の種類、導入位置を決定することができる。
　あるいは、所望の標的配列に合わせてガイド鎖の塩基配列を決定し、コンピュータ分子モデリングにより、リンカー鎖、パッセンジャー鎖をデザインすることができる。この際、ガイド鎖とパッセンジャー鎖が正しく二重鎖構造を形成することに留意する。
　第一実施形態によるｓｈＲＮＡは、ｐＨ６．５～８．０、温度が４～４２℃、好ましくは、ｐＨ７．３～７．５、温度４～３７℃の生理条件において、図１に示す、ヘアピン構造を形成して安定に存在する。第一実施形態によるｓｈＲＮＡがこの形態で生体内に存在するとき、ｓｈＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ切断酵素であるＤｉｃｅｒによって認識される。そして、ｓｈＲＮＡは、図１中の楔ａ位置及び楔ｂ位置で切断されて、末端２塩基が突出した、各ストランドの長さが約１９～２４塩基程度の二本鎖ＲＮＡを生じる。その結果、ＲＬＣからＲＩＳＣへと、標的ｍＲＮＡに相補的なガイドＲＮＡの受け渡しがされて、制御の対象とするｍＲＮＡの切断による翻訳抑制をすることができる。
　このように、第一実施形態によるｓｈＲＮＡは、図示する形態、すなわち、蛋白質結合モチーフ配列２１に特定の蛋白質が結合していない形態においては、天然において知られているｓｈＲＮＡと同じ機能をすることを特徴とする。
　次に、本発明は、第二実施形態によれば、ＲＮＡｉ制御システムであって、第一実施形態に記載したｓｈＲＮＡと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質とを含んでなる。
　図２の（Ａ）に、本実施形態によるＲＮＡｉ制御システムを構成するｓｈＲＮＡを、（Ｂ）に、ＲＮＰ由来の蛋白質４を模式的に示す。ｓｈＲＮＡは、第一実施形態において説明したとおりであり、ここでは説明を省略する。図１と同一の符号は、同一の構成を指称するものとする。
　図２（Ｂ）に示す蛋白質４は、ＲＮＰ由来であって、ｓｈＲＮＡ上の蛋白質結合モチーフ配列２１に特異的に結合する蛋白質である。よって、この蛋白質４は、蛋白質結合モチーフ配列２１として選択される配列特異的に決定することができる。具体的には、蛋白質結合モチーフ配列２１として、Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ（配列番号２）が選択される場合に、蛋白質４は、Ｌ７Ａｅ（配列番号１）である。蛋白質４は、また、蛋白質結合モチーフ配列２１に特異的に結合する蛋白質を含む融合蛋白質であってもよく、蛋白質結合モチーフ配列２１に特異的に結合する蛋白質に追加のペプチドが加わったものであってもよい。以下に述べるＤｉｃｅｒによる認識を阻害することができればよいからである。
　本実施形態によるｓｈＲＮＡは、図２（Ａ）に示す状態で、蛋白質４が存在しないときには、第一実施形態で説明したように、天然において知られているｓｈＲＮＡと同じように機能し、ＲＮＡｉを生じて、特定のｍＲＮＡの翻訳機能を抑制する。
　次に、本実施形態によるｓｈＲＮＡと、蛋白質４が共存する系における、これらの分子の状態について説明する。ｓｈＲＮＡと、蛋白質４が共存する系におけるｓｈＲＮＡと、蛋白質４を、図２（Ｃ）に模式的に示す。ｐＨ６．５～８．０、温度が４～４２℃、好ましくは、ｐＨ７．0～７．５、温度４～３７℃の生理条件において、ｓｈＲＮＡと、蛋白質４とは特異的に結合し、ＲＮＰ複合体を形成して安定に存在している。
　本実施形態においては、ｓｈＲＮＡ上の蛋白質結合モチーフ配列２１と蛋白質４とが特異的に結合し、ＲＮＰを形成するときに、Ｄｉｃｅｒが、ＲＮＰを形成したｓｈＲＮＡを認識することができないことを特徴とする。その結果として、Ｄｉｃｅｒは、ｓｈＲＮＡを切断することができない。すると、ＲＮＡｉの次のステップに進むことができず、制御の対象とするｍＲＮＡの切断もできなくなる。言い換えると、本実施形態によるｓｈＲＮＡに、蛋白質４を共存させると、ＲＮＡｉを抑制することができる。また、この形態は、蛋白質４を入力情報として、ＲＮＡｉの抑制という出力が得られるともいうことができる。
　ここで、ｓｈＲＮＡと、蛋白質４が共存する系とは、ｓｈＲＮＡの分子と、蛋白質４の分子とをそれぞれ別個に調製して培地中で混合する場合であってもよい。あるいは、ｓｈＲＮＡ分子を発現するベクターをデザインし、蛋白質４の分子を発現するベクターをデザインし、これらのベクターを同一の細胞中で導入し、発現させることにより、ｓｈＲＮＡと、蛋白質４が共存する系を実現することもできる。ベクターのデザインについては、後述する実施例において詳述する。
　本発明の第二実施形態によるＲＮＡｉ制御システムによれば、蛋白質特異的にｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの抑制を実施することができる。
　次に、本発明は、第三実施形態によれば、ＲＮＡｉの制御方法であって、第一実施形態に記載のセンサーｓｈＲＮＡと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質とを溶液中で接触させる工程と、該ｓｈＲＮＡと蛋白質とを含む溶液を、細胞内に導入する工程とを含む方法に関する。本実施形態において用いるセンサーｓｈＲＮＡと、蛋白質との組み合わせは、第一実施形態及び第二実施形態に基づいて選択し、それぞれの配列を決定することが出来る。
［センサーｓｈＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成］
　ここで、センサーｓｈＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写と呼ばれる、試験管内合成法により、得ることが出来る。ｓｈＲＮＡの鋳型となる配列の３’末端に、１９塩基のＴ７プロモーター配列のアンチセンス配列（ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ配列番号３）を結合した一本鎖ＤＮＡを人工合成し（北海道システムサイエンス）、これと同様に人工合成した１９塩基のＴ７プロモーター配列（ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号４））を会合させる。これに、具体的には実施例に詳述するの通りに、リボ核酸や塩類とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを混合して３７℃で反応させることにより、得られる。
［蛋白質の製造］
　いっぽう、蛋白質は、当該蛋白質を発現するベクターを作成し、大腸菌を用いて発現させた後に精製して得ることができる。例えば、配列番号１で表されるｂｏｘ－Ｃ／Ｄモチーフに特異的に結合する蛋白質であるＬ７Ａｅ（配列番号２）を発現するベクターを、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．３　８６９－８７７を参照して作成することができる。大腸菌でＬ７Ａｅ（配列番号２）を発現するベクターの一例を、配列番号５に示す。
　本実施形態において、接触させる工程は、上記のようにして調製したセンサーｓｈＲＮＡと、蛋白質とを同一の溶液系にて混合することによる。ｓｈＲＮＡと、蛋白質との混合は、ｐＨ６．５～８．０、温度が４～４２℃、好ましくは、ｐＨ７．３～７．５、温度４～３７℃の生理条件において行う。これにより、ｓｈＲＮＡと蛋白質とが特異的に相互作用し、ＲＮＰ複合体を形成する。
　この条件に加えて、Ｄｉｃｅｒ、ＡＴＰ、Ｍｇイオンが存在し、かつ適切生理条件下において、ＲＮＡｉの抑制が生じる。よって、接触させる工程により、混合して、センサーｓｈＲＮＡと、蛋白質とのＲＮＰ複合体を形成させた後、細胞内に導入する工程を実施することができる。細胞内へ導入するＲＮＰ複合体の濃度は、例えば、ｓｈＲＮＡが１ｎＭ～４０ｎＭ、好ましくは１ｎＭ～２０ｎＭとする場合、その際の蛋白質濃度は１～１０倍程度が好ましいが、この濃度範囲には限定されない。細胞内への導入方法は、リポソームを用いたトランスフェクションにより行うことができるが、これに限定されず、当業者には公知の細胞内導入方法によることができる。
　ＲＮＰ複合体が細胞内に導入された後、Ｄｉｃｅｒが存在する細胞内では、第一実施形態において図２を用いて説明した現象が生ずる。すなわち、調製したセンサーｓｈＲＮＡと、蛋白質との複合体では、ＤｉｃｅｒによりＲＮＡ切断箇所が認識されず、ｓｈＲＮＡの切断が生じない。そして、ガイド鎖に相補的なｍＲＮＡにおいて、ＲＮＡｉが生じず、かかるｍＲＮＡがコードする蛋白質の発現が阻害されることとなる。
　本発明の第三実施形態によれば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、ＲＮＡｉの抑制を実施することが出来る。
　第三実施形態の応用形態として、蛋白質を単独で細胞に直接投与することができる。この応用形態は、蛋白質を細胞に導入した後に、細胞内でセンサーｓｈＲＮＡと、蛋白質とのＲＮＰ複合体を形成させる点で、ＲＮＰ複合体を形成させてから細胞に導入する第三実施形態と異なる。この場合、センサーｓｈＲＮＡは、蛋白質を細胞に導入する前に、あるいは蛋白質を細胞に導入した後に、細胞に導入することができる。蛋白質導入前の場合は、ｓｈＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入し、このベクター内のｓｈＲＮＡの発現がテトラサイクリンなどの低分子で制御できるようにデザインする。この方法では、蛋白質導入後に、テトラサイクリンでｓｈＲＮＡを発現させることができる。蛋白質導入後の場合は、細胞にダイレクトにｓｈＲＮＡを導入してもいいし、細胞にｓｈＲＮＡを発現するベクターを導入してもよい。細胞に導入された蛋白質は、センサーｓｈＲＮＡと、ＲＮＰ複合体を形成し、細胞内で目的遺伝子の発現をＲＮＡｉで制御することが可能になり、蛋白質医薬の開発や、癌などの疾病治療に有効と思われる。
　本発明は、第四実施形態によれば、ＲＮＡｉの細胞内制御方法であって、細胞内に、第一実施形態に記載のｓｈＲＮＡを発現するベクターを導入する工程と、該細胞と同一の細胞内に、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質を発現するベクターを導入する工程と、該ｓｈＲＮＡを発現するベクターと、該蛋白質を発現するベクターとを発現させる工程とを含む方法に関する。
　センサーｓｈＲＮＡを発現するベクターは、第一実施形態で説明したように決定されたセンサーｓｈＲＮＡの一次構造配列に基づいて、作成することができる。図３に、ベクターの作製法の一例を示す。図３（Ａ）は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより販売されている、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｈ１／ＴＯベクター（配列番号８）である。図３（Ａ）の矢印で示す箇所に、本発明のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を挿入する。図３（Ｂ）に挿入するＤＮＡ二本鎖を模式的に示す。図３（Ｂ）中、上に表示してある鎖においては、５’側から順にオーバーハング配列ＣＡＣＣ、ガイド鎖をコードするＤＮＡ配列１ｄ、リンカー鎖をコードするＤＮＡ配列２ｄ、パッセンジャー鎖をコードするＤＮＡ配列３ｄが位置する。下に表示してあるＤＮＡ鎖は、上に表示してある鎖の相補鎖で、５’側にオーバーハング配列ＡＡＡＡが位置する。このように、市販のプラスミドに所望の配列を挿入することにより、当業者であれば、所望のセンサーｓｈＲＮＡを産生するプラスミドを作製し、所望のセンサーｓｈＲＮＡを得ることができる。
　蛋白質発現ベクターの作製は、哺乳類発現用のベクターに、発現させたい蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み込むことにより作成することができる。図４に、ベクターの作製例を示す。ここで図示するベクターは、配列番号１で表されるｂｏｘ－Ｃ／Ｄモチーフに特異的に結合する蛋白質であるＬ７Ａｅ（配列番号２）を発現するベクターである。配列を配列番号６に示す。このようなベクターは、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．３　８６９－８７７を参照し、ここから遺伝子を抽出して、哺乳類発現ベクターに組み換えることができる。このベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｍｙｃ　Ｈｉｓ　Ａベクター（配列番号７）を用いて作製することができる。
　本実施形態においては、該ｓｈＲＮＡを発現するベクターと、該蛋白質を発現するベクターとを同一の細胞内に導入し、発現させることを特徴とする。導入する工程は、トランスフェクションにより実施することができる。例えば、リポソームを用いたトランスフェクション、ダイレクトインジェクション、エレクトロポレーション、レンチウィルス導入法等が挙げられるが、これらには限定されない。細胞内に導入するｓｈＲＮＡ発現ベクター及び蛋白質発現ベクターの量は、目的により異なるが、例えば、ｓｈＲＮＡ発現ベクターに対して、Ｌ７Ａｅ蛋白質発現ベクターが１/４倍量～１０倍量、好ましくは１倍量～４倍量である。
　第四実施形態によれば、細胞内において、ｓｈＲＮＡと蛋白質を発現させ、ＲＮＡｉを抑制することができる。この応用形態としては、例えば癌の治療が挙げられる。また、本実施形態で用いるセンサーｓｈＲＮＡを発現するベクターと、蛋白質発現ベクターとを組み合わせて、ＲＮＡｉ制御システムとすることもできる。
　応用形態として、図１、２に示される蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合する蛋白質が、例えば、癌のみで発現する生体分子であり、ガイド鎖の標的配列がアポトーシス促進遺伝子であるように、ｓｈＲＮＡを設計することができる。このとき、癌細胞にｓｈＲＮＡを直接、あるいはベクターで導入すれば、癌細胞内で、癌のみで発現する生体分子とｓｈＲＮＡとがＲＮＰ複合体を形成し、Ｄｉｃｅｒによって認識されなくなる。そして、癌細胞では、アポトーシス促進遺伝子のＲＮＡｉが抑制される結果、アポトーシス促進遺伝子が選択的に発現されて、癌細胞のアポトーシスが促進されることとなる。いっぽうで、正常細胞では、同じｓｈＲＮＡが直接、あるいはベクターで導入されても、癌のみ発現する生体分子が存在しないから、ＲＮＡｉは抑制されない。それゆえ、アポトーシス促進遺伝子の発現がＲＮＡｉにより抑制されることになる。
　また、この形態の変形として、図１、２に示される蛋白質結合モチーフに特異的に結合する蛋白質が、例えば、癌化すると発現しなくなる生体分子であり、ガイド鎖の標的配列がアポトーシス抑制遺伝子であるように、ｓｈＲＮＡを設計することができる。このとき、正常細胞にｓｈＲＮＡを直接、あるいはベクターで導入すれば、正常細胞内で、癌化すると発現しなくなる生体分子と、ｓｈＲＮＡとがＲＮＰ複合体を形成し、Ｄｉｃｅｒによって認識されなくなる。そして、正常細胞では、アポトーシス抑制遺伝子のＲＮＡｉが抑制される結果、アポトーシス抑制遺伝子が選択的に発現されて、正常細胞のアポトーシスが抑制されることになる。いっぽうで、癌細胞では、同じｓｈＲＮＡが直接、あるいはベクターで導入されても、癌化すると発現しなくなる生体分子が存在しないから、ＲＮＡｉは抑制されない。それゆえ、アポトーシス抑制遺伝子の発現がＲＮＡｉにより抑制されることになる。
　さらに、Ｌ７Ａｅを利用した癌制御システム系の構築も可能である。このような癌関連の蛋白質を発現するプロモーターと同じプロモータをＬ７Ａｅ蛋白質発現ベクターの上流に組み込むことで、癌関連蛋白質の発現に応答して、Ｌ７の発現を調節させ、Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄをリンカー鎖に組み込んだアポトーシス制御型センサーｓｈＲＮＡのＲＮＡｉ機能を自在に調節することが可能になる。
［蛋白質分子応答型ｓｈＲＮＡの設計］
　ＥＧＦＰノックダウン用のｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ（ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ　（５９ｍｅｒ）ＧＧＣＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＡＡＧＡＵＣＣＡＧＣＡＵＡＧＧＧＡＵＣＵＵＧＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＧ図５Ａ（配列番号１０））配列は東京大学の鈴木勉、加藤敬行両博士から譲り受けた。ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ－ｍｕｔ（ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ－ｍｕｔ　（５９ｍｅｒ）ＧＣＡＣＵＡＧＣＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＡＧＡＵＣＣＡＧＣＡＵＡＧＧＧＡＵＣＵＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＧＣＵＡＧＵＧＣＡＧ図５Ｂ（配列番号１２）については、まず、終止コドンの相補配列３つを、３つのコドンの読み枠に１つずつ挿入したガイド鎖を設計し、これをｓｈＲＮＡ－ＧＦＰのガイド鎖と置換して設計した。このｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ－ｍｕｔをＥＧＦＰのノックダウンを起こさないネガティブコントロールとして用いた。次に、ＲＮＰモチーフであるＬ７Ａｅ－ＢｏｘＣ／Ｄの構造より、ＢｏｘＣ／ＤのＲＮＡ配列を取得し、ｓｈＲＮＡのＤｉｃｅｒ蛋白質切断部位にできるだけ近く、かつガイド鎖、パッセンジャー鎖の二重鎖構造が保たれるように挿入して、Ｌ７Ａｅ蛋白質とＢｏｘＣ／Ｄ配列で特異的に結合することが期待されるｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ（ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ　（６３ｍｅｒ）ＧＧＣＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＣＵＧＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＧ図５Ｃ（配列番号９））を設計した。この際、ガイド鎖については、ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰのガイド鎖の３’末端から２１塩基を使用している。さらに、このｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰの５’末端から２４塩基目のアデニンを削除し、３８塩基目のグアニンをシトシンに置換したｓｈＲＮＡを、Ｌ７Ａｅと結合しないｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ－ＧＦＰ（ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ－ＧＦＰ　（６２ｍｅｒ）ＧＧＣＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＣＵＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＵＣＡＵＧＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＧ図５（Ｄ）（配列番号１１））として設計した。
［ｓｈＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成］
[ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ]
　ｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、Ｌ７Ａｅｒ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（１００μＭ、５’－ＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’配列番号１３）５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ、５’－ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ－３’配列番号４）５．２５μＬ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ　３０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ　ピロフォスファターゼ（ＲＯＣＨＥ）５μＬ、２０ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ　１．７５μＬ、１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ　２８μＬ、１Ｍ　ＭｇＣl２　１４μＬ、１Ｍ　ＤＴＴ　３．５μＬ、０．１Ｍ　スペルミジン　１４μＬ、０．１Ｍ　ＡＴＰ　３３．６μＬ（ＣＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、０．１Ｍ　ＧＴＰ　８．９６μＬ、０．１Ｍ　ＧＭＰ　８９．６μＬ、超純水３８５μＬを混合し、３７℃で一晩反応させた。反応後、ＴＵＲＢＯ　ＤＮａｓｅ　１０μＬを加えて３７℃で３０分間反応させ、鋳型ＤＮＡを分解させた。反応後にフェノール抽出、クロロホルム抽出を行い、上清をＰＤ－１０緩衝液（０．３Ｍ　酢酸カリウム、１５％（ｖ／ｖ）　エタノール、ｐＨ６．０）で平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア）に充填し、ＰＤ－１０緩衝液　３ｍＬで洗浄後、ＰＤ－１０緩衝液　５００μＬで２回溶出させた。その後、溶出液に等量のエタノールを加えて、エタノール沈澱を行った。上清を廃棄しペレットを乾燥した後に、２０μＬの５×色素液（０．２５％　ＢＰＢ、３０％　グリセロール）に溶かし、　非変性１５％ポリアクリルアミド（１／３０　ビスアクリルアミド）ゲルに重層し、室温で５０分間電気泳動して分離した。目的のサイズのバンドを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で一晩溶出した。その後、５ｍＬシリンジ（テルモ）にマイクロフィルター（２２μｍ　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＰ）を取り付け、シリンジに溶出液を加えてフィルター濾過した。このろ液に２．５倍量のエタノールを加えてエタノール沈澱を行った。上清を廃棄しペレットを乾燥した後に、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
[ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰ]
　ｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、Ｌ７ＡｅｒＮ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（１００μＭ、５’－ＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’配列番号１５）５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ、配列番号４）５．２５μＬ、を用いて、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰと同様に転写合成と精製を行い、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
[ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ]
　ｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、４８１Ｐ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（１００μＭ、５’－ＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’配列番号１６）５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ、配列番号４）５．２５μＬ、を用いて、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰと同様に転写合成と精製を行い、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
［Ｌ７Ａｅ蛋白質の発現精製］
　Ｈｕｔｔｅｎｈｏｆｅｒ博士に譲り受けた、ｐＥＴ－２８ｂ＋にＬ７Ａｅ蛋白質を組み込んだプラスミドを増幅した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにｐＥＴ－２８ｂ＋Ｌ７Ａｅプラスミド（配列番号５）が形質転換された、―８０℃グリセロール菌体ストックから、培地５ｍＬに植菌し３７℃で一晩振蕩培養した。続いて培養液全量を５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００ｍＬに植え継いだ。Ｏ．Ｄ．６００が０．６～０．７になるまで３７℃で振蕩培養し、その後、発現誘導をするため１Ｍ　ＩＰＴＧを５００μＬ加え（終濃度１ｍＭ）、３０℃で一晩振蕩培養した。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、２０分）で菌体を回収し、ソニケーションバッファー（５０ｍＭ　Ｎａ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、超音波処理を行い、菌体を破砕した。なお、超音波処理は、氷上で冷却後、１５秒間超音波を当てる、という操作を６回繰り返した。その後、８０℃　１５分で、不純蛋白質を変性させた。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ　、２０分）により、上清を回収し、ヒスチジンタグが付いた蛋白質をＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてバッチ法により精製した。具体的には、まず上清とＮｉ－ＮＴＡ　１ｍＬを混合し、４℃、１時間撹拌を行った。その後、カラムに充填し、ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭ　Ｎａ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）４ｍＬで２回洗浄した。５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶出バッファー（５０ｍＭ　Ｎａ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３　Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ８．０にｉｍｉｄａｚｏｌｅを加えて作製）を各１ｍＬ　２回で段階的に溶出させた。確認は１５％　ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより行った。続いて、マイクロコンＹＭ－３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、蛋白質の濃縮行い、透析バッファー（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、５％　グリセロール　ｐＨ７．５）に置換した。また、蛋白質の濃度はプロテインアッセイ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。
［ゲルシフトアッセイによるＲＮＰ複合体の確認］
　ｓｈＲＮＡと蛋白質の結合の確認は以下のように行った。蛋白質濃度が８０～６４０ｎＭの最終濃度の２５倍濃度になるように透析バッファーで希釈した後、各濃度の蛋白質溶液２μＬ、１μＭ　ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ　２μＬ、超純水６μＬ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩ（商標、インビトロジェン）４０μＬを混合し、室温で３０分間静置して、ｓｈＲＮＡ（４０ｎＭ）とＬ７Ａｅ（８０ｎＭ、１６０ｎＭ、３２０ｎＭ、６４０ｎＭ）を結合させた。ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ、ｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰについても、同様にしてＬ７Ａｅを結合させた。それぞれの溶液に５×色素液（０．２５％　ＢＰＢ、３０％　グリセロール）１３μＬを加えて混合し、この混合液１５μＬを非変性１５％ポリアクリルアミド（１／３０　ビスアクリルアミド）ゲルに重層し、４℃で５０分間、２５０Ｖで電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎで１５分間染色し、ＦＬＡ－７０００（ＦＵＪＩ　ＦＩＬＭ）でバンドを確認した。図６に、ゲルシフトアッセイによるｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ、ｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、及びｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰと、Ｌ７Ａｅとの結合を示す。その結果、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰとＬ７Ａｅが配列特異的に結合していることが示唆された。
［ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｄｉｃｅｒ切断アッセイによる、Ｄｉｃｅｒ切断阻害の確認］
　ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、及びｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰのＬ７ＡｅによるＤｉｃｅｒ切断阻害の確認は、ＧＴＳ．ｉｎｃ社のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｃｅｒ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｋｉｔを用い、プロトコルに従って以下のように行った。まず、１μＭ　ｓｈＲＮＡ　０．４μＬ、４μＭ、８μＭ　Ｌ７Ａｅ　２μＬ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　１μＬ、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　０．５μＬ、Ｄｉｃｅｒ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　（ＧＴＳ．ｉｎｃ）４μＬ、０．５ｕｎｉｔ／μＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄｉｃｅｒ　Ｅｎｚｙｍｅ　２μＬ、超純水０．１μＬを混合し、３７℃で１５時間反応させた。その後、２μＬ　Ｄｉｃｅｒ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて混合し、この混合液のうち８μＬに５×色素液　２μＬを加えて、非変性１５％ポリアクリルアミド（１／３０　ビスアクリルアミド）ゲルに重層し、４℃で５０分間電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎで染色し、ＦＬＡ－７０００（ＦＵＪＩ　ＦＩＬＭ）でバンドを確認した。図７に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ再構成Ｄｉｃｅｒ系を用いたｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、及びｓｈＲＮＡ－ｂｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰのＬ７ＡｅによるＤｉｃｅｒ切断阻害の結果を示す。図７において、Ｌ７Ａｅの＋は、４μＭのＬ７Ａｅから調製されたサンプルを、＋＋は、８μＭのＬ７Ａｅから調製されたサンプルを示し、－は、Ｌ７Ａｅを用いなかった場合を示す。同様に、Ｄｉｃｅｒの＋はＤｉｃｅｒを用いた場合、－は、Ｄｉｃｅｒを用いなかった場合を示す。その結果、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰとＬ７Ａｅが配列特異的に結合して、Ｄｉｃｅｒに切断されなくなることが示唆された。
　［ｓｈＲＮＡ発現プラスミドの構築・合成］
[ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ（配列番号１７）の合成]
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　Ｌ７Ａｅｒ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣ－３’配列番号１８）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　Ｌ７Ａｅｒ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣ－３’配列番号１９）５μＬ、１０×Ｏｌｉｇｏ　Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン）２μＬ、超純水２μＬを混合し、９５℃で４分間インキュベートした後に、室温で５分静置して、ＤＮＡの二重鎖を形成させた。なお、この二重鎖は、図３（Ｂ）に示す二本鎖である。この二重鎖ＤＮＡ溶液を超純水で１００倍希釈した後、１μＬの希釈液、１０×Ｏｌｉｇｏ　Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　１０μＬ、超純水８９μＬを混合して１００倍希釈した。その後、５×Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ、０．７５ｎｇ／μＬ　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター　２μＬ、１万倍希釈ＤＮＡ溶液　５μＬ、超純水８μＬ、１Ｕ／μＬ　Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　１μＬを混合し、室温で５分間静置して、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクターにｓｈＲＮＡコード配列を組み込んだ。この反応液４μＬを　ＴＯＰ１０　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ.ｃｏｌｉに加えて形質転換し、２５０μＬ　Ｓ．Ｏ．Ｃ培地を加えて１時間振盪培養した後に、５０μｇ／ｍＬカナマイシン入りのＬＢプレートに播き、３７℃で一晩培養した。形成されたコロニーを確認し、プラスミドベクターのインサートの確認には、Ｈ１　Ｆｏｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ、５’－ＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡ－３’　配列番号２０）、Ｍ１３　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ、５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ－３’　配列番号２１）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ）、を用いてコロニーＰＣＲを行った。このコロニーを　５０μｇ／ｍＬ　カナマイシン入りのＬＢ培地　５０ｍＬに植え継ぎ、３７℃で１６時間振盪培養した。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、１５分）で菌体を回収し、Ｐｌａｓｍｉｄ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って精製を行い、イソプロパノール沈澱を行った。上清を廃棄しペレットを乾燥した後に、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
　[ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ－ＧＦＰ（配列番号２２）の合成]
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　Ｌ７ＡｅｒＮ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣ－３’配列番号２３）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　Ｌ７ＡｅｒＮ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣ－３’配列番号２４）を用いて、上述のようにｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ－ＧＦＰを合成、精製し、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
　[ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ（配列番号２５）の合成]
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　４８１Ｐ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣ－３’配列番号２６）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　４８１Ｐ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣ－３’配列番号２７）を用いて、上述のようにｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰを合成、精製し、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
　[ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ－ｍｕｔ（配列番号２８）の合成]
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　Ｓｋ－７Ｎ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＣＡＣＴＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＣＧＣＴＡＧＴＧＣ－３’配列番号２９）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ　Ｓｋ－７Ｎ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＣＡＣＴＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＣＧＣＴＡＧＴＧＣ－３’配列番号３０）を用いて、上述のようにｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ－ｍｕｔを合成、精製し、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
　［ｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６（配列番号６）の合成］
　ｐＥＴ－２８ｂ＋Ｌ７Ａｅ（配列番号５）を鋳型ＤＮＡ、ＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ－ＮｏｔＩ－Ｌ７Ａｅ－ｐｒｉｍｅｒ（５’‐ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＧＧ‐３’）（配列番号３２）、Ｌ７Ａｅ－ＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ－ｐｒｉｍｅｒ（５’‐ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＣ‐３’）（配列番号３３）をプライマーとして用いて　ＰＣＲを行った。５０μＬ反応液には、１０ｎｇ／μＬ　鋳型ＤＮＡ　２．５μＬ、各１０μＭ　ＤＮＡプライマー　１．５μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　５μＬ、１０×ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐ｂｕｆｆｅｒ　ｖｅｒ．２　５μＬ、２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４　２μＬ、ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１μＬ、超純水３１．５μＬが混合してあり、反応は初めに９４℃　２分インキュベートした後、９８℃　１０秒、５５℃、３０秒、６８℃　１分を３６サイクルで行った。できたＰＣＲ産物はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＤＮＡを精製した。ただし溶出の際には３０μＬの超純水で溶出を行い、テンプレートとして制限酵素処理に用いた。テンプレート２７μＬ、Ｂ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＯＣＨＥ）５μＬ、１０Ｕ／μＬ　ＢａｍＨ１（ＲＯＣＨＥ）１μＬ、１０Ｕ／μＬ　ＸｈｏＩ（ＲＯＣＨＥ）１μＬ、超純水１６μＬ、を混合し、３７℃で２時間反応させて制限酵素処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｍｙｃ　Ｈｉｓ　Ａベクター（インビトロジェン）も１．６μｇ／μＬ　ｐｃＤＮＡベクター　１．８８μＬ、Ｂ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ、１０Ｕ／μＬ　ＢａｍＨ１　１μＬ、１０Ｕ／μＬ　ＸｈｏＩ１μＬ、超純水４１．１２μＬを混合して同様に制限酵素処理した。これらの処理産物はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ただし溶出の際にはＤＮＡを１０μＬの超純水に溶出した。
　制限酵素処理したＰＣＲ産物　１．７５μＬ、制限酵素処理したベクター０．２５μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ２μＬを混合し、１６℃で３０分間インキュベートした。このＬｉｇａｔｉｏｎ反応液全量に　Ｔｏｐ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（インビトロジェン）２０μＬを加えて、氷上に４５分間静置したのち、４２℃で１分間水浴し、再び氷上で２分間静置して、形質転換した。さらにＬＢ培地　１６０μＬを加えて　５０μｇ／ｍＬ　アンピシリン入りＬＢプレートに播き、３７℃で一晩インキュベートした。形成されたコロニーは、Ｅｘｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）と上述のＤＮＡプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートチェックを行った。インサートが確認できたコロニーを　５０μｇ／ｍＬ　アンピシリン入りＬＢ培地　５０ｍＬに植え継ぎ、３７℃で一晩、振盪培養した。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、１５分）で菌体を回収し、Ｐｌａｓｍｉｄ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って精製を行い、イソプロパノール沈澱を行った。上清を廃棄しペレットを乾燥した後に、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測した後に、このプラスミドベクターをＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒプライマー（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’配列番号３４）とＢＧＨｒｅｖプライマー（５’－ＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ－３’配列番号３５）を用いてシーケンス確認し、以降の実験に用いた。
　［蛍光顕微鏡画像によるノックダウン機能制御の確認］
　トランスフェクション前日にＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに、０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ　ｓｈＲＮＡ発現ベクターとｐｃＤＮＡ３．１‐ＡｓＲｅｄ２-Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６（配列番号４０）、ｐｃＤＮＡ３．１‐ＥＧＦＰ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６（配列番号４１）のコトランスフェクションを行った。ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ ｍｕｔ、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰ　０．３μｇに、ｐｃＤＮＡ３．１‐ＡｓＲｅｄ２-Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６またはｐｃＤＮＡ３．１‐ＡｓＲｅｄ２－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６（配列番号４２）を、０．３μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１‐ＥＧＦＰ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６を、０．２μｇ加え、１サンプルにつき１．２５μｌ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ－脂質複合体を室温で２０分インキュベーションし、ＨｅＬａ細胞用培地に滴下した。４時間後に培地交換を行った。２４時間後に細胞の蛍光顕微鏡画像を蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ　ＩＸ－８１）で取得し、ＡｓＲｅｄ２－Ｌ７Ａｅ発現によるｓｈＲＮＡ－Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ－ＧＦＰの機能抑制の観察を行った。
　図１２は、４８８ｎｍ付近の波長の励起光を当て、５１０－５５０ｎｍの波長フィルターを通して得られたＥＧＦＰの蛍光画像である。図１２において、各パネルの下の「＋」は、蛍光強度が高いことを、「－」は蛍光強度が低いことを示す。この画像からＡｓＲｅｄ２-Ｌ７ＡｅによるｓｈＲＮＡ－Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ－ＧＦＰのノックダウン機能抑制効果が示された。
［ＲＴ－ＰＣＲ解析によるＲＮＡｉ制御の確認］
　Ｌ７ＡｅによるＲＮＡｉ抑制によるＧＦＰのｍＲＮＡ量の変化をＲｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲにより測定した。
　前日にＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を６ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。そしてｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ　ｓｈＲＮＡ発現ベクターとｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６のコトランスフェクションを行った。ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰ　４μｇに、ｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６を、各０、２、４μｇを加え、１サンプルにつき５μｌ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ－脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ　４ＰＣＲ　Ｋｉｔ　（Ａｍｂｉｏｎ（商標））を用いてＲＮＡ抽出およびＤＮＡ除去を行った。
　抽出したＲＮＡ　１．５μｇ（または０．５μｇ）をテンプレートとしてＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を用いランダムプライマーと逆転写酵素によりｃＤＮＡ合成をした。リアルタイムＰＣＲは２０分の１希釈したｃＤＮＡを鋳型として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　Ｔａｑｍａｎ　ｐｒｏｂｅ　（Ｒｏｃｈｅ）（商標）を用いることにより行った。ＰＣＲ反応とリアルタイム蛍光検出は、ライトサイクラー４８０　（Ｒｏｃｈｅ）（商標）を用いて実施した。反応条件は、初期変性工程は９５℃、５分間、増幅工程は、変性９５℃、１０秒、アニーリング・伸長６０℃、２５秒、でこれを４５サイクル行った。最後に反応液を５０℃、１５秒間冷却して測定を終了した。Ｃｔ値をＡｂｓ　Ｑｕａｎｔ／ｆｉｔｐｏｉｎｔ法により決定した。４８１Ｐ　Ｆｗｄ（５’－ＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡ－３’）（配列番号３６）、Ｒｅｖ（５’－ＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣ－３’）（配列番号３７）を用いて、目的遺伝子であるＧＦＰの増幅を行った。ＧＡＰＤＨ　Ｆｗｄ（５’－ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ－３’）（配列番号３８）、ＧＡＰＤＨ　Ｒｅｖ（５’－ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ－３’）（配列番号３９）を用いて、リファレンス遺伝子であるＧＡＰＤＨの増幅を行った。ＧＦＰのｍＲＮＡには、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｐｒｏｂｅ ＃１４８（ＲＯＣＨＥ）、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡには、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｐｒｏｂｅ＃６０（ＲＯＣＨＥ）を用いて、増幅効率を測った。電気泳動により増幅産物が単一であること目的産物あることを確認し、結果を相対定量により評価した。ＧＡＰＤＨによりＥＧＦＰの量を規格化し、その規格化した値を用いてｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ　ｍｕｔのみを添加したサンプルのＧＦＰのｍＲＮＡ相対量を１としてサンプル間の比較を行った。図８に、ＲＴ－ＰＣＲ解析による、Ｌ７ＡｅによるＲＮＡｉ阻害の結果を示す。サンプル間の発現量の差から、ＧＦＰのｍＲＮＡ量が、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰとｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６のコトランスフェクション時に回復しており、Ｌ７Ａｅ存在下で、ＢｏｘＣ／Ｄの配列特異的にＲＮＡｉが阻害されていることを示唆している。
［ＦＡＣＳ解析によるＬ７ＡｅのＲＮＡｉ抑制確認］
　トランスフェクション前日にＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに、０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ　ｓｈＲＮＡ発現ベクターとｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６のコトランスフェクションを行った。ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰ　０．８μｇに、ｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６を、各０、０．４０、０．８０μｇを加え、１サンプルにつき２μｌ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ－脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。
　トランスフェクション２４時間後に、ｗｅｌｌの培地を除去し、２００μｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎｅ-ＥＤＴＡで細胞をはく離し、２００μｌ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えて懸濁した。細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤ）により解析を行った。ここでは、生細胞にゲーティングを行い２００００個についてＦＩＴＣを測定した。解析は、測定した全細胞の蛍光強度の平均値を算出する一般的な方法を用いて行った。図９に、ＦＡＣＳ解析による結果を示した。（各サンプルにつき２００００細胞の、ＧＦＰ強度の平均値結果）。この結果によりｐｃＤＮＡ３．１‐Ｌ７Ａｅ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６、ｐＥＮＴＲｓｈＲＮＡ－Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ－ＧＦＰをコトランスフェクションした細胞特異的に、ＧＦＰ発現に回復が見られることが示された。このことから、ＲＴ－ＰＣＲと同様に、Ｌ７Ａｅ存在下で、ＢｏｘＣ／Ｄの配列特異的にＲＮＡｉが阻害されていることを示唆している。
　［蛋白質分子応答型ｓｈＲＮＡの設計］
　ＥＧＦＰノックダウン用のｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４（５’－ＧＧＣＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＧ－３’配列番号１４）を設計した。ｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４は、５’末端から２４塩基までが、実施例１で用いた、図５（Ａ）に示すｓｈＲＮＡ－ＧＦＰのパッセンジャー鎖と同一であり、これと２重鎖を形成するガイド鎖と、ハイブリダイゼーションしないループ構造ＧＡＡＡを持つ。このｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４はｓｈＲＮＡ－ＧＦＰと同様の機能を持ち、ネガティブコントロールに用いた。また、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ（配列番号９）は、実施例１で設計した、図５（Ｃ）のものを用いた。
　［ｓｈＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成］
［ｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４］
　ｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４の鋳型一本鎖ＤＮＡ、（１００μＭ、５’－ＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’　配列番号３１）５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４）５．２５μＬ、を用いて、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰと同様に転写合成と精製を行い、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
［ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ］
　実施例１に記載したｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成法に従って製造した。
［Ｌ７Ａｅ蛋白質の発現精製］
　実施例１に記載した、大腸菌を用いたＬ７Ａｅ蛋白質の発現精製に従って、製造した。
［培養細胞系での評価、ＲＮＰ］
［蛍光顕微鏡観察によるＬ７Ａｅ－ｓｈＲＮＡ複合体のＲＮＡｉ抑制確認］
　トランスフェクション前日にＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに、０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養した。尚、ここでのＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞株は、ＧＦＰをハイグロマイシン耐性で安定発現させたＨｅＬａ細胞であり、鈴木勉博士より譲り受けたものである。翌日、２４ｗｅｌｌの培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５００μｌに交換した。同時に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ/Ｄ－ＧＦＰとＬ７Ａｅ蛋白質の複合体をトランスフェクションで細胞導入した。１０μＭ　ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ　０．６μｌ、２０μＭ　Ｌ７Ａｅ蛋白質　０μｌ、０．６μｌ、１．２μｌ、２．４μｌ、４．８μｌ、９．６μｌ、５×バインディングバッファ２μｌを混合し、超純水を加えて１０μｌとした（Ｌ７Ａｅ蛋白質９．６μｌに関しては超純水を加えず１２．２μｌとした）。さらにＯｐｔｉ－ＭＥＭ　４０μｌ（Ｌ７Ａｅ蛋白質９．６μｌに関しては３７．８μｌ）を加えて混合し、４℃で３０分間静置して、ＲＮＡ蛋白質複合体を形成させた。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ　４８μｌと２μｌ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を混合し５分間室温で静置したものに、ＲＮＡ蛋白質複合体溶液　５０μｌを加えて混合し、２０分間室温で静置してＲＮＡ蛋白質－脂質複合体を形成させて、細胞に滴下した。４時間後にＤＭＥＭ／Ｆ１２　５００μｌに培地を交換した。ｓｈＲＮＡを加えないもの（Ｍｏｃｋ）、及びｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４についても、同様にＬ７Ａｅ蛋白質と混合して、ＲＮＡ蛋白質複合体を形成させ複合体をトランスフェクションで細胞導入した。
　トランスフェクション４５時間後に細胞の蛍光顕微鏡観察を行った。各サンプルにつき蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）で、倍率２０倍、４８８ｎＭの励起波長のセッティングとし、細胞内のＧＦＰの蛍光を撮影した。同時に透過光でも細胞の位相差像を撮影した。蛍光画像と位相差画像を重ね合わせた画像を図１０に示す。
　［ＦＡＣＳ解析によるＬ７Ａｅ－ｓｈＲＮＡ複合体のＲＮＡｉ抑制確認］
トランスフェクション４７時間後に、ｗｅｌｌの培地を除去し、２００μｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎｅ-ＥＤＴＡで細胞をはく離し、２００μｌ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えて懸濁した。細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤ）により解析を行った。なおＦＡＣＳとは遊離した細胞を細い管に通過させる際、レーザー光線を当てて、その細胞から発生する蛍光の強弱を解析する方法である。ここでは、生細胞にゲーティングを行い１００００個についてＦＩＴＣを測定した。図１１に、ＦＡＣＳ解析による蛍光強度分布の結果を示す。結果よりＬ７Ａｅ、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰの複合体をトランスフェクションした細胞特異的に、ＧＦＰ発現に回復が見られることが示された。このことから、Ｌ７Ａｅ存在下で、ＢｏｘＣ／Ｄの配列特異的にＲＮＡｉが阻害されていることを示唆している。Ｍｏｃｋでは、ＲＮＡｉが生じないため、Ｌ７Ａｅ濃度に依存することなくＧＦＰ発現が見られ、いっぽうｓｈＲＮＡ－Ｕ１Ａ－４では、ＲＮＡｉが阻害されることがないため、Ｌ７Ａｅ濃度に依存することなくＧＦＰ発現が抑制されている。
　［蛋白質分子応答型ｓｈＲＮＡの設計］
　ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ（図１３（Ｂ））および、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬ（図１３（Ｃ））は、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰ、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－ＧＦＰの５’末端から２１塩基までの二重鎖部位をＢｃｌ－ｘＬ遺伝子の３６５塩基目から３８５塩基目までの配列の二重鎖に置換して設計した。
　［ｓｈＲＮＡの合成］
［ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ（図１３（Ｂ）（配列番号４３））］
　ｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ/Ｄ－ＢｃｌｘＬ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　（１００μＭ、５’－ＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’（配列番号４４））５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ、５’－ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ－３’（配列番号４）５．２５μＬ、を用いて、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰと同様に転写合成と精製を行い、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
[ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬ（図１３（Ｃ）（配列番号４５））]
ｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ/Ｄ　ｍｕｔ－ＢｃｌｘＬ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（１００μＭ、５’－ＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’（配列番号４６）５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ、５’－ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ－３’（配列番号４）５．２５μＬ、を用いて、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰと同様に転写合成と精製を行い、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
　[ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬ（図１３（Ａ）（配列番号４７]
　ｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（１００μＭ、５’－ＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ－３’（配列番号４８）５．２５μＬと、Ｔ７　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ、５’－ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ－３’（配列番号４）５．２５μＬ、を用いて、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ＧＦＰと同様に転写合成と精製を行い、２２μＬの超純水に溶解して濃度を測定し、以降の実験に用いた。
　[ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬによるＢｃｌ‐ｘＬのノックダウンの確認]
　トランスフェクション前日にＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに、０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＢｃｌ－ｘＬ、発現ベクターとｓｈＲＮＡのコトランスフェクションを行った。ｐＢｃｌ－ｘＬ　０、または ０．４μｇと１０μＭ　ｓｈＲＮＡ －Ｂｃｌ－ｘＬを混合し、 Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ 培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で５０μｌとした．その後1サンプルにつき１μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００に４９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地を加えて混合したものを加えた．これらのＤＮＡ－脂質複合体を、室温で２０分インキュベーションし、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地を４００μｌ加えて細胞に滴下した．４時間後に培地交換を行った。
　トランスフェクション２４時間後に、ｗｅｌｌの培地を採取した後、２００μｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎｅ－ＥＤＴＡで細胞を■離し、前段階で採取した各培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を４℃、５００ｘｇ、５分　遠心沈降し、ＰＢＳ　５００μｌで洗浄後、ペレット状の細胞に３０μｌ　ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ、０．３ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ　＋　２μｇ／ｍｌ　Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え３０分氷上に静置し、遠心分離（４℃、１５０００ｇ、２０分）により上清を回収した。蛋白質の濃度はＤＣ－プロテインアッセイ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いＬｏｗｒｙ法で決定した。
　ウエスタンブロッティングにより、Ｂｃｌ－ｘＬの検出を行った。細胞より抽出した蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより展開しウエスタンブロッティングを行った。一次抗体Ａｎｔｉ－Ｂｃｌ－ｘＬ（ＳＣ－６３４）（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｉｎｃ．）（１／５００）、二次抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いた。ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（商標）により発色させＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いて検出した。ｓｈＲＮＡ －Ｂｃｌ－ｘＬをｐＢｃｌ－ｘＬと共導入すると、Ｂｃｌ－ｘＬの発現を示すバンドが消失した。この結果より、ＨｅＬａ細胞内でｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬによるＢｃｌ－ｘＬのノックダウンを確認した。
［ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｄｉｃｅｒ切断アッセイによる、Ｄｉｃｅｒ切断阻害の確認］
　ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ及びｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬのＬ７ＡｅによるＤｉｃｅｒ切断阻害の確認は、ＧＴＳ．ｉｎｃ社のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｃｅｒ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｋｉｔを用い、プロトコルに従って以下のように行った。まず、１μＭ　ｓｈＲＮＡ、０．４μＬ、４μＭ、８μＭ　Ｌ７Ａｅ　２μＬ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　１μＬ、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　０．５μＬ、Ｄｉｃｅｒ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　（ＧＴＳ．ｉｎｃ）４μＬ、０．５　ｕｎｉｔ／μＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄｉｃｅｒ　Ｅｎｚｙｍｅ　２μＬ、超純水０．１μＬを混合し、３７℃で１４時間反応させた。その後、２μＬ　Ｄｉｃｅｒ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて混合し、この混合液のうち８μＬに、５×色素液　２μＬを加えて、非変性１５％ポリアクリルアミド（１／３０　ビスアクリルアミド）ゲルに重層し、４℃で５０分間電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎで染色し、ＦＬＡ－７０００（ＦＵＪＩ　ＦＩＬＭ）でバンドを確認した。図１４に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ再構成Ｄｉｃｅｒ系を用いたｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ、及びｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬのＬ７ＡｅによるＤｉｃｅｒ切断阻害の結果を示す。図１４において、Ｌ７Ａｅの「－」は、Ｌ７Ａｅを用いなかった場合を示す。同様に、Ｄｉｃｅｒの「＋」はＤｉｃｅｒを用いた場合、「－」は、Ｄｉｃｅｒを用いなかった場合を示す。その結果、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬとＬ７Ａｅが配列特異的に結合して、Ｄｉｃｅｒに切断されなくなることが示唆された。
ｓｈＲＮＡ発現プラスミドの構築・合成
［ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ（配列番号４９）の合成］
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、ＢｏｘＣ／Ｄ　Ｂｃｌ－ｘＬ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣ－３’（配列番号５０）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、ＢｏｘＣ／Ｄ　Ｂｃｌ－ｘＬ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣ－３’（配列番号５１）を用いて、上述のようにｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬを合成、精製し、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
［ｐＥＮＴＲ　Ｈ１　ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬ（配列番号５２）の合成］
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ　Ｂｃｌ－ｘＬ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＴＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣ－３’（配列番号５３）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ　Ｂｃｌ－ｘＬ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣ－３’（配列番号５４）を用いて、上述のようにｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬを合成、精製し、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
　［ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬ　（配列番号５５）の合成］
　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯベクター（インビトロジェン）に挿入するｓｈＲＮＡコード配列を含む一本鎖ＤＮＡ、Ｂｃｌ－ｘＬ　Ｔｏｐ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＣＡＣＣＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＡＧＣＡＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣ－３’（配列番号５６）５μＬと、その相補鎖を含む一本鎖ＤＮＡ、Ｂｃｌ－ｘＬ　Ｂｏｔｔｏｍ　ｓｔｒａｎｄ（２００μＭ、５’－ＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣ－３’（配列番号５７）を用いて、上述のようにｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬを合成、精製し、超純水５５μＬを加えて溶解した。プラスミドベクターの濃度を計測し、以降の実験に用いた。
［ＲＮＡ蛋白質複合体導入実験］
　ヒト癌培養細胞内でＬ７Ａｅ蛋白質とｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬの結合によるＢｃｌ－ｘＬのノックダウン制御を確認するために、ＲＮＡ蛋白質複合体を細胞導入し、Ｂｃｌ－ｘＬの発現をウエスタンブロッティングで検出した。
　前日に子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを２度行った。ｐＢｃｌ－ｘＬまたはｐＢｉｍＥＬ　０．４μｇに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を１μｌ加えた。これらのＤＮＡ－脂質複合体を室温で２０分インキュベーションし、ＨｅＬａ細胞用培地に滴下した。４時間半後に培地交換を行い、直後に２度目のトランスフェクションを行った。ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬまたは、ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ　ｍｕｔ－Ｂｃｌ－ｘＬ　２．５ｐｍｏｌ（培地における濃度、５ｎＭ）と精製したＬ７Ａｅ蛋白質０、２００ｐｍｏｌ（培地における濃度、４００ｎＭ）を混合して複合体を形成させた。この複合体にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を１μｌ加え、室温で２０分インキュベーションし、ＨｅＬａ細胞用培地に滴下した。５時間後に培地交換を行った。
　二度目のトランスフェクションの２２時間後、ｗｅｌｌの培地を採取した後、２００μｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎｅ－ＥＤＴＡで細胞を■離し、前段階で採取した各培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を４℃、５００ｘｇ、５分　遠心沈降し、ＰＢＳ　５００μｌで洗浄後、ペレット状の細胞に３０μｌ　ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ、０．３ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ　＋　２μｇ／ｍｌ　Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え３０分氷上に静置し、遠心分離（４℃、１５０００ｘｇ、２０分）により上清を回収した。蛋白質の濃度はＤＣ－プロテインアッセイ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いＬｏｗｒｙ法で決定した。
　ウエスタンブロッティングにより、Ｂｃｌ－ｘＬ、ＧＡＰＤＨの検出を行った。細胞より抽出した蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより展開しウエスタンブロッティングを行った。一次抗体Ａｎｔｉ－Ｂｃｌ－ｘＬ（ＳＣ－６３４）（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｉｎｃ．）（１／５００）、二次抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いた。ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（商標）により発色させＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いて検出した。ＧＡＰＤＨについても、一次抗体Ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１／２０００）、二次抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いてウェスタンブロットを行った。これらの結果より、ＨｅＬａ細胞内でＬ７Ａｅ蛋白質とｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬの結合によるＢｃｌ－ｘＬのノックダウンの抑制（レーン３）を確認できた。以下細胞の蛋白質抽出およびＬ７Ａｅの検出には同様の方法で行った。図１５は、細胞内でのＢｃｌ－ｘＬ発現を示す図である。標準コントロールとして用いているＧＡＰＤＨのタンパク質発現量は、変化しないことも確認した。検出したＢｃｌ－ｘＬのバンドの強度を積算した。その結果を図１６に記す。図１５、１６において、ｓｈは、「ｓｈＲＮＡ」の略である。
［プラスミド導入実験］
　ヒト癌培養細胞内でＬ７Ａｅ蛋白質とｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬの結合によるＢｃｌ－ｘＬのノックダウン制御を確認するために、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｌ７Ａｅ、ｓｈＲＮＡ、を発現するプラスミドを細胞内に共導入し、Ｂｃｌ－ｘＬの発現をウエスタンブロッティングで検出した。
　前日に子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞を１２ｗｅｌｌプレートに３．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。ｐＢｃｌ－ｘＬ　０．２μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｌ７Ａｅ　０．４μｇ、　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ０．６μｇを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を２．５μｌ加えた。これらのＤＮＡ－脂質複合体を室温で２０分インキュベーションし、ＨｅＬａ細胞用培地に滴下した。ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ　Ｂｃｌ－ｘＬ、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬ、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ　ｍｕｔ（ネガティブコントロール）についても同様の操作を行った。コントロールプラスミドとしてｐｃＤＮＡ－ＡｍＣｙａｎ－ｍｙｃ－Ｈｉｓ６（（配列番号５８）０．２５μｇとｐＢｃｌ－ｘＬ　０．２μｇをそれぞれ単独で導入した。４時間後に培地交換を行った。
　トランスフェクション２４時間後、ｗｅｌｌの培地を採取した後、２００μｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎｅ－ＥＤＴＡで細胞を■離し、前段階で採取した各培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を４℃、５００ｘｇ、５分　遠心沈降し、ＰＢＳ　５００μｌで洗浄後、ペレット状の細胞に１００μｌ　ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ、０．３ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ　＋　２μｇ／ｍｌ　Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え３０分氷上に静置し、遠心分離（４℃、１５０００ｇ、２０分）により上清を回収した。蛋白質の濃度はＤＣ－プロテインアッセイ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いＬｏｗｒｙ法で決定した。
　ウエスタンブロッティングにより、Ｂｃｌ－ｘＬ、ＧＡＰＤＨの検出を行った。細胞より抽出した蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより展開しウエスタンブロッティングを行った。一次抗体Ａｎｔｉ－Ｂｃｌ－ｘＬ（ＳＣ－６３４）（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｉｎｃ．）（１／５００）、二次抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いた。ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（商標）により発色させＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いて検出した。ＧＡＰＤＨについても、一次抗体Ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１／２０００）、二次抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いてウェスタンブロットを行った。これらの結果より、ＨｅＬａ細胞内でＬ７Ａｅ蛋白質とｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬの結合によるＢｃｌ－ｘＬのノックダウンの抑制（レーン５）を確認できた。図１７は、細胞内でのＢｃｌ－ｘＬ発現を示す図である。標準コントロールとして用いているＧＡＰＤＨのタンパク質発現量は、変化しないことも確認した。検出したＢｃｌ－ｘＬのバンドの強度を積算した。その結果が図１８である。図１８において、レーン３～６のｓｈは、「ｓｈＲＮＡ」の略である。
　［Ｌ７Ａｅ蛋白質に応答したＢｃｌ－ｘＬ発現量制御による細胞死制御実験］
　アポトーシス促進蛋白質であるＢｉｍ－ＥＬと、アポトーシス抑制蛋白質であるＢｃｌ－ｘＬは互いに拮抗作用し、相対的に量が多い方の蛋白質が細胞の運命に作用する。そこで、ヒト癌培養細胞内でＬ７Ａｅ蛋白質とｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬの結合による、Ｂｃｌ－ｘＬのノックダウン制御を用いてＢｃｌ－ｘＬ発現量を制御し、Ｂｉｍ－ＥＬに対するＢｃｌ－ｘＬの相対量を変化させることで、細胞死を制御するという実験を行った。
　前日に子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬ　０．３μｇに、ｐＢｃｌ－ｘＬ　０．２μｇ、ｐＢｉｍＥＬ　０．２μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１－ＡｓＲｅｄ２－Ｌ７Ａｅ　０．２μｇを加え、培地に混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を１.２５μｌ加えた。これらのＤＮＡ－脂質複合体を室温、２０分でインキュベーションし、ＨｅＬａ細胞用培地に滴下した。約４時間後に培地交換を行った。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｍｙｃ　Ｈｉｓ　Ａベクター（インビトロジェン、コントロールベクター）、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ　Ｂｃｌ－ｘＬ、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬ、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ　ｍｕｔ（ネガティブコントロール）についても同様の操作を行った。
　トランスフェクション２４時間後、ｗｅｌｌの培地を採取した後、２００μｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎｅ－ＥＤＴＡで細胞を剥離し、前段階で採取した各培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を４℃、５００ｘｇ、３分　遠心沈降し、ＰＢＳ　３００μｌで洗浄後、ペレット状の細胞に、３μｌ　ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ,　Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、５０μｌ　ａｎｎｅｘｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を混合した溶液を加え、タッピングした後に室温で３０分静置して染色した。その後、各サンプルに２００μｌ　ａｎｎｅｘｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加えて懸濁し、細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤ）により解析を行った。ここでは細胞３００００個について計測した。解析はまず、ＡｓＲｅｄ２－Ｌ７による赤色蛍光を発している細胞でゲーティングを行い、ゲート内の細胞について、励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長４３０－４７０ｎｍのフィルターを用いて、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅの青色蛍光強度を測定し、この蛍光強度が基準より大きい細胞数の比率を測定した。細胞死を判定する基準には、死細胞の外膜特異的に存在する脂質である、フォスファチジルセリンを、ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ,　Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて染色し、その青色蛍光強度が、未処理の細胞を同様に染色したサンプルの強度の上限より大きい強度を持つ細胞を死細胞としてカウントした。
　その結果、コントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｍｙｃ　Ｈｉｓ　Ａベクター）を加えたサンプルの死細胞率　８．３％、　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＧＦＰ　ｍｕｔ（ネガティブコントロール）を加えたサンプルの死細胞率　１０．１％、　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬを加えたサンプルの死細胞率　１３．４％に対し、　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－Ｂｃｌ－ｘＬを加えたサンプルの死細胞率　３４．５％、　ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ　Ｂｃｌ－ｘＬを加えたサンプルの死細胞率　４２．５％、となった。この実験結果と図１７、１８で示したＢｃｌ－ｘＬの検出結果から、Ｂｃｌ－ｘＬの発現量がノックダウンによって抑制された細胞が、Ｂｃｌ－ｘＬの発現を維持している細胞の約３－４倍程度死んでいることが示された。さらに、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－Ｂｃｌ－ｘＬを加えたサンプルの死細胞率　１３．４％に対し、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯ－ｓｈＲＮＡ－ＢｏｘＣ／Ｄ－ｍｕｔ　Ｂｃｌ－ｘＬを加えたサンプルの死細胞率　４２．５％という結果から、Ｌ７ＡｅとＢｏｘＣ／Ｄの配列特異的にＢｃｌ-ｘＬ蛋白質のノックダウンを抑制することによって、細胞死を抑制制御できたことを確認した。
　本発明にかかるＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムによれば、センサーｓｈＲＮＡとこれに特異的に結合する蛋白質により、ＲＮＡｉを制御することができ、細胞を破壊することなく、細胞内マーカー蛋白質の発現を定量するバイオセンサーや、マーカー蛋白質の発現量に応じて目的蛋白質の翻訳を活性化できる、人工遺伝子回路の構築に有用である。たとえば、癌マーカー蛋白質の発現に応じて、アポトーシス誘導蛋白質を活性化することで、あるいは、蛋白質医薬の開発の基礎技術として、癌やアルツハイマーなどの疾病治療につながるという大きな効果が得られる。

Claims (10)

  1. 　標的配列に対して相補的な配列を有するガイド鎖と、
    　該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、
    　該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖と
    を備えるｓｈＲＮＡであって、
    　該リンカー鎖が、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列を備えるｓｈＲＮＡ。
  2. 　前記ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列が、Ｂｏｘ　Ｃ／Ｄ配列である、請求項１に記載のｓｈＲＮＡ。
  3. 　請求項１または２に記載のｓｈＲＮＡと、
    　該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質と
    を含んでなるＲＮＡｉ制御システム。
  4. 　請求項１または２に記載のｓｈＲＮＡを発現するベクターと、
    　該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質を発現するベクターと
    を含んでなるＲＮＡｉ制御システム。
  5. 　ＲＮＡｉの制御方法であって、
    　請求項１または２に記載のｓｈＲＮＡと、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質とを溶液中で接触させる工程と、
    　該ｓｈＲＮＡと蛋白質とを含む溶液を、細胞内に導入する工程と
    を含む方法。
  6. 　ＲＮＡｉの細胞内制御方法であって、
    　細胞内に、請求項１または２に記載のｓｈＲＮＡ、または該ｓｈＲＮＡを発現するベクターを導入する工程と、
    　該細胞と同一の細胞内に、該ｓｈＲＮＡの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するＲＮＰ由来の蛋白質、または該蛋白質を発現するベクターを導入する工程と
    を含む方法。
  7. 　細胞内で発現する蛋白質に応答するＲＮＡｉ制御システムであって、
    　請求項１に記載のｓｈＲＮＡであって、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列が該細胞内で発現する蛋白質に特異的に結合する配列であるｓｈＲＮＡ、または該ｓｈＲＮＡを発現するベクターを含むシステム。
  8. 　細胞内で発現する蛋白質に応答するＲＮＡｉ制御方法であって、
    　細胞内に、請求項１に記載のｓｈＲＮＡであって、ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列が該細胞内で発現する蛋白質に特異的に結合する配列であるｓｈＲＮＡ、または該ｓｈＲＮＡを発現するベクターを導入する工程を含む方法。
  9. 　前記ｓｈＲＮＡの標的配列が、Ｂｃｌ－ｘＬのｍＲＮＡである、請求項７に記載のＲＮＡｉ制御システムであって、アポトーシス制御蛋白質を発現制御するＲＮＡｉ制御システム。
  10. 　請求項１に記載のｓｈＲＮＡを用いた人工蛋白質情報変換システムであって、前記ＲＮＰ由来の蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合する蛋白質の情報を、前記ｓｈＲＮＡの標的配列となるＲＮＡによりコードされる蛋白質の情報に変換する、人工蛋白質情報変換システム。
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