CN102245766B

CN102245766B - 采用RNP基序构建蛋白应答shRNA/RNAi控制体系

Info

Publication number: CN102245766B
Application number: CN2009801495352A
Authority: CN
Inventors: 井上丹; 齐藤博英; 樫田俊一; 林香伦
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: EP2390324B1; US8871437B2; WO2010067811A1; CN102245766A; JP5405489B2; US20110263026A1; EP2390324A4; EP2390324A1; JPWO2010067811A1

Abstract

本发明的目的是采用RNA-蛋白相互作用基序提供RNAi控制体系。本发明提供shRNA，其包括：具有与靶序列互补的序列的引导链；过客链，所述过客链与所述引导链形成双链体；和连接链，所述连接链连接所述引导链与所述过客链，其中所述连接链包括RNP衍生的蛋白结合基序序列。本发明还提供RNAi控制体系，其包括：所述shRNA；和RNP衍生的蛋白，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列。

Description

采用RNP基序构建蛋白应答shRNA/RNAi控制体系

技术领域

本发明涉及采用RNP基序构建蛋白应答shRNA和RNAi控制体系。

背景技术

RNA干扰(下文中称为RNAi)是通过以序列特异性方式分裂mRNA来短暂地抑制翻译的现象。已在各种生物种中建立称为敲落(knockdown)的方法，其通过引入RNA双链体如短发夹RNA(下文中称为shRNA)来引起这种RNAi。从其作为短暂抑制基因表达的方便且有效的方法被发现以来，在短短10年的时间内，RNAi已普遍传播，包括其在医学治疗上的应用的研究。然而，其机制或引入技术仍有待发展。此外，现在RNAi的主题围绕使得敲落强有效的研究或开发用于将RNA输送到重要部位的输送技术。

Chung等人已制备人工RNA，其中已知为咖啡因样低分子量化合物的茶碱的结合部位已被引入shRNA的环部分并揭示了RNAi浓度依赖性地受到茶碱抑制(参见非专利文献1)。

非专利文献1：Chung-Il An，Vu B.Trinh和Yohei Yokobayashi，RNA，May 2006；12：710-716

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的是采用RNP提供RNAi控制体系以采用RNA或蛋白作为抑制剂来新设计和制备翻译控制机制并将这种人工翻译控制体系结合到活体内。

用于解决问题的方案

已完成本发明来达到所述目的。具体地讲，根据一个实施方案，本发明涉及shRNA，其包括：具有与靶序列互补的序列的引导链；过客链，所述过客链与所述引导链形成双链体；和连接链，所述连接链连接所述引导链与所述过客链，其中所述连接链包括RNP衍生的蛋白结合基序序列。在本说明书中，这种shRNA也称为传感shRNA。

优选所述RNP衍生的蛋白结合基序序列应为Box C/D序列。

根据一个供选方面，本发明涉及RNAi控制体系，其包括：所述传感shRNA；和RNP衍生的蛋白，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列。

根据一个供选方面，本发明涉及RNAi控制体系，其包括：用于表达所述传感shRNA的载体；和用于表达RNP衍生的蛋白的载体，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列。

根据另一供选方面，本发明涉及RNAi控制方法，其包括如下步骤：在溶液中使所述传感shRNA与RNP衍生的蛋白接触，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列；和将包含所述shRNA和所述蛋白的所述溶液引入细胞中。

根据另一供选方面，本发明涉及细胞内RNAi控制方法，其包括如下步骤：将用于表达所述传感shRNA的载体进入细胞中；将用于表达RNP衍生的蛋白的载体引入所述细胞中，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列；和从用于表达所述shRNA的所述载体和用于表达所述蛋白的所述载体引起它们的表达。

根据另一供选方面，本发明提供应答细胞中表达的蛋白的RNAi控制体系，所述体系包括：所述传感shRNA或用于表达所述shRNA的载体，所述传感shRNA中RNP衍生蛋白结合基序序列是特异性结合到所述细胞中表达的所述蛋白的序列，还提供应答细胞中表达的蛋白的RNAi控制方法，所述方法包括如下步骤：将所述传感shRNA或用于表达所述shRNA的载体引入细胞中，所述传感shRNA中RNP衍生的蛋白结合基序序列是特异性结合到所述细胞中表达的所述蛋白的序列。

根据另一供选方面，本发明提供所述RNAi控制体系，其控制凋亡调节蛋白的表达，其中所述shRNA的靶序列为Bcl-xL mRNA，还提供使用所述shRNA的人工蛋白信息转化体系，其中特异性结合到RNP衍生的蛋白结合基序序列的蛋白的信息被转化成由所述shRNA的靶序列的RNA编码的蛋白的信息。

发明的有益效果

作为本发明的有益效果，上述传感shRNA的使用能实现RNAi控制，使得RNAi以依赖于特异性结合到所述shRNA的蛋白的方式受到抑制。这意味着：在所述传感shRNA存在下，使用特定蛋白作为输入信号能抑制特定mRNA的RNAi并相对提高从所述特定mRNA表达的蛋白的量。与所述特定蛋白联合使用的本发明的传感shRNA可用于构建生物传感器，用于将细胞内标记蛋白的表达定量而不破坏响应标记蛋白的表达水平而激活目的蛋白的翻译的细胞或人工基因回路。例如，本发明产生了显著的有益效果，导致通过响应癌标记蛋白的表达而激活凋亡诱导蛋白来治疗疾病如癌或阿尔兹海默疾病。

附图说明

图1示意性地显示了第一实施方案的shRNA；

图2(A)示意性地显示了组成第二实施方案的RNAi控制体系的shRNA，图2(B)示意性地显示了组成第二实施方案的RNAi控制体系的RNP衍生的蛋白4，图2(C)示意性地显示了体系中所述shRNA和所述蛋白4的复合体，在所述体系中所述shRNA和所述蛋白4共存；

图3(A)显示了售自Invitrogen Corp.的pENTR(商标)/H1/TO载体，图3(B)示意性地显示了插入所述pENTR(商标)/H1/TO载体的DNA双链体；

图4显示蛋白表达载体的制备实施例；

图5(A)显示了用于EGFP敲落的shRNA-GFP的二级结构序列，图5(B)显示了用作不会引起EGFP敲落的阴性对照的shRNA-GFP-mut的二级结构序列，图5(C)显示了预期在Box C/D序列特异性结合到L7Ae蛋白的shRNA-Box C/D-GFP的二级结构序列，图5(D)显示了不会结合到L7Ae的shRNA-Box C/D-mut-GFP的二级结构序列。在图5(A)-5(D)中，楔形标记表示被Dicer切割的位置；

图6表明凝胶转移试验显示shRNA-GFP、shRNA-Box C/D-GFP和shRNA-Box C/D mut-GFP结合到L7Ae；

图7显示了采用体外重组Dicer体系由L7Ae抑制shRNA-BoxC/D-GFP的Dicer切割的结果；

图8是显示RT-PCR分析RNAi被L7Ae抑制的结果的图；

图9是显示FACS分析RNAi被L7Ae抑制的结果的图；

图10是实施例2中细胞内GFP的荧光图像和相衬图像的重叠图像；

图11是显示FACS分析实施例2中的荧光强度分布的结果的图；

图12是EGFP的荧光图像，显示了AsRed2-L7Ae对shRNA-BoxC/D-GFP的敲落功能的抑制效果；

图13(A)显示了用于BclxL敲落的shRNA-BclxL的二级结构序列，图13(B)显示了shRNA-Box C/D-BclxL的二级结构序列，其预期在所述Box C/D序列特异性结合到L7Ae蛋白，图13(C)显示了不结合到L7Ae的shRNA-Box C/D mut-BclxL的二级结构序列。在图13(A)-13(C)中，箭头指出Dicer切割部位；

图14显示了采用体外重组Dicer体系由L7Ae抑制shRNA-BoxC/D-Bcl-xL和shRNA-Box C/D mut-Bcl-xL的Dicer切割的结果；

图15显示了细胞内Bcl-xL表达；

图16显示检测的Bcl-xL带的强度加起来的结果；

图17显示了细胞内Bcl-xL表达；和

图18显示了检测的Bcl-xL带的强度加起来的结果。

符号说明

1 引导链

2 连接链

20 碱基序列

21 蛋白结合基序序列

3 过客链

4 蛋白

a Dicer切割位点

b Dicer切割位点

1d 引导链编码的DNA序列

2d 连接链编码的DNA序列

3d 过客链编码的DNA序列

最佳实施方式

下文中，将参考实施方案对本发明进行详细描述。然而，本发明不局限于下面的描述。

近年来，已经发现在体内起作用的各种非编码RNA且它们的作用受到关注。然而，这些RNA经常在体内与蛋白(RNP)形成复合体。因此，预期人工RNP是能控制细胞功能的新型纳米块。发现天然RNP利用由较短序列组成的RNA-蛋白相互作用基序(RNP基序)形成多种复合体。例如，HIV Rev蛋白与识别Rev的RNA基序高亲和性地相互作用。因此，预期RNP用作合成生物学(其中通过人工产生生物分子的步骤来构成生物分子或生命体系以导致新技术)的研究材料。

为了开发用于控制目的蛋白响应细胞中表达的蛋白的翻译的体系，本发明的发明人提出了这样的构想：采用这种RNA-蛋白相互作用基序控制RNA干扰，从而控制目的蛋白的翻译。以此构想为基础，完成本发明。

根据第一实施方案，本发明提供shRNA，其包括：具有与靶序列互补的序列的引导链；过客链，所述过客链与所述引导链形成双链体；和连接链，所述连接链连接所述引导链与所述过客链，其中所述连接链包括RNP衍生的蛋白结合基序序列。

第一实施方案的shRNA示意性地显示于图1中。根据第一实施方案的shRNA从3′末端开始按顺序依次包括引导链1、连接链2和过客链3。连接链2在链中具有RNP衍生的蛋白结合基序序列21。

引导链1可为具有大约21-26个碱基的RNA核苷酸序列且可位于所述shRNA的3′末端。引导链1具有与待控制的mRNA的特定序列(下文中称为靶序列)互补的序列。待控制的mRNA可由本领域技术人员根据目的合适地选择。待控制的mRNA的实例包括但不局限于凋亡诱导基因的mRNA、凋亡抑制基因的mRNA和癌标记基因的mRNA。待控制的mRNA的更具体实例包括GFP mRNA、BimEL mRNA和Bcl-xL mRNA。此外，在这些mRNA中，用作所述靶序列的序列可由本领域技术人员根据其一级基因序列的组成和类型信息、考虑抑制的脱靶效应和所述靶基因的更有效地受抑制表达通过采用设计软件合适地选择。所述引导链必须完全与所述靶序列互补。这将导致RNAi效应。所述引导链1的3′末端的至少2个碱基可形成突出末端，所述突出末端不会与所述过客链形成互补链。引导链1是由Dicer切割后变成siRNA的部分。

过客链3可为具有约21-26个碱基的RNA核苷酸序列且可位于所述shRNA的5′末端。当过客链3具有例如21个碱基时，从过客链3的3′末端的碱基3至21具有与引导链1的3′末端的碱基3至21形成互补链的序列。当过客链3由21个碱基组成时，通常所述引导链也由21个碱基组成。组成过客链3和引导链1的碱基数目可为22、23、24、25或26。在任何情况下，过客链3和引导链5的碱基数目通常相等。此外，如图1中所示，过客链3的3′末端的碱基3至5′末端的碱基具有与引导链1的5′末端的碱基至3′末端的碱基3形成互补链的序列。在这种情况下，可允许所述过客链包含与所述引导链不匹配的1-2个碱基。被Dicer切割后，过客链3在3′末端可具有包含至少2个碱基的突出端，所述突出端既不与引导链1的一部分也不与所述连接链的一部分形成互补链。过客链3也可是被Dicer切割后变成siRNA的部分。

连接链2担任引导链1与过客链3之间的连接体。连接链2可结合到引导链1的5′末端和过客链3的3′末端。换句话说，连接链2可为被Dicer切割后从引导链1和过客链3分裂的部分。连接链2可组成本发明传感shRNA中非杂交环部分(如图中所示)的主要部分。所述非杂交环部分的部分可衍生自过客链3的3′末端的部分。或者连接链2可组成整个非杂交环部分，连接链2的3′末端的几个碱基和连接链2的5′末端的几个碱基可通过其间的杂交形成所述发夹结构(尽管该结构没有显示于图中)的茎部分的部分。

连接链2可包括碱基序列20和RNP衍生的蛋白结合基序序列21。本文中，本发明中的碱基序列20是指组成连接链的序列的部分和不衍生自RNP衍生的蛋白结合基序序列21的部分。在另一实施方案中，连接链2可仅由RNP衍生的蛋白结合基序序列21组成。当连接链2包括碱基序列20和RNP衍生的蛋白结合基序序列21或当连接链2仅由RNP衍生的蛋白结合基序序列21组成时，连接链2的序列可具有不形成互补链的序列，且该序列可组成所述shRNA的环部分。不形成互补链的序列可具有4-20个碱基，优选4-11个碱基，且所述碱基的类型不受限定。不直接形成互补链的序列的优选实例包括但不局限于5′-AGCAUAG-3′和5′-GAAA-3′。

连接链2的3′末端的2个碱基可与过客链3的3′末端的2个碱基形成互补链。此外，连接链2的3′末端的碱基3-7可与连接链2的5′末端的碱基1-4形成互补链。这种情况下，形成互补链的碱基数目为4。然而，该数目不局限于4且可在1至8个碱基之间确定。

当将蛋白结合基序序列21引入碱基序列20时，蛋白结合基序序列21的引入位置不受限制且可为保持被后面描述的Dicer识别的范围。此外，当所述连接链不含该碱基序列时，蛋白结合基序序列21可直接结合到引导链1和过客链3。

本文中，蛋白结合基序序列21的实例包括衍生自RNA-蛋白复合体相互作用基序(RNP基序)的核苷酸序列和从这些核苷酸序列突变的核苷酸序列。在本发明中，衍生自RNA-蛋白复合体相互作用基序的核苷酸序列包括：已知为已知天然RNA-蛋白复合体中的RNA-蛋白相互作用基序的RNA序列的核苷酸序列；和作为通过体外进化方法获得的人工RNA-蛋白复合体相互作用基序的RNA序列的核苷酸序列。所述RNA-蛋白复合体是已在体内证实的蛋白和RNA的大量缔合体且是具有复杂结构的3D物体。衍生自天然RNA-蛋白复合体相互作用基序的核苷酸序列通常由约10-80个碱基组成且已知与特定蛋白的特定氨基酸序列以非共价方式形成(即通过氢键)形成特异性结合。衍生自天然RNA-蛋白复合体相互作用基序的这种核苷酸序列可选自下面表1和2及网上可获得的数据库http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/image/dna-protein/rna/rna.htm 1。作为优选用于本实施方案中的RNA-蛋白相互作用基序衍生的核苷酸序列的蛋白结合基序序列21是可被下面详细描述的Dicer识别以在结合到所述shRNA中时引起RNAi的序列。就构象条件而言，优选这种蛋白结合基序序列21应形成包含非天然碱基对的特征RNA三级结构且对结合到此位点的蛋白是高特异性地。此外，优选所述RNA-蛋白相互作用基序应具有不局限于约0.1nM-约1μM的Kd。

[表1]

[表2]

衍生自人工RNA-蛋白复合体相互作用基序的核苷酸序列是人工设计的RNA-蛋白复合体中RNA-蛋白相互作用基序的RNA核苷酸序列。这种核苷酸序列通常由约10-80碱基组成且设计来与特定蛋白的特定氨基酸序列以非共价方式(即通过氢键)形成特异性结合。衍生自人工RNA-蛋白复合体相互作用基序的这种核苷酸序列的实例包括但不局限于特异性结合到凋亡诱导的蛋白Bcl-2家族的RNA适配体和特异性识别癌细胞表面抗原的RNA适配体。此外，下表3中列出的核苷酸序列也是已知的，这些也可用作本发明的RNA-蛋白复合体相互作用基序衍生的核苷酸序列2。

[表3]

所述人工RNA-蛋白复合体可采用分子设计方法和体内进化方法组合制备。所述体内进化方法可通过从具有各种序列多样性的分子库选择功能RNA和重复其基因(DNA)的扩增和转录反应来产生适配体或核酶。因此，适合于具有目的功能结构的RNP的RNA-蛋白相互作用基序可通过分子设计提前从天然RNP分子提取或通过所述体外进化方法人工制备。在本实施方案中，就RNA-蛋白复合体相互作用基序衍生的核苷酸序列2而言，优选所述核苷酸序列衍生自其的RNA-蛋白复合体应具有约0.1nM-约1μM的解离常数Kd。蛋白结合基序序列21的具体实例包括Box CD序列：5′-GGGCGUGAUGCGAAAGCUGACCC-3′(SEQ ID NO：2)，其是结合到已知参与RNA修饰如RNA甲基化或假尿苷酸化的L7Ae(SEQID NO：1)的核苷酸序列(Moore T等人，Structure Vol.12，pp.807-818(2004))。

本实施方案的shRNA的组成可通过分子设计获得。本实施方案的传感shRNA可例如通过根据已知的天然或非天然shRNA的序列将蛋白结合基序序列引入形成所述连接链的序列部分或通过根据已知的天然或非天然shRNA的序列替代形成所述连接链的序列部分的蛋白结合基序序列。在此步骤中，所述蛋白结合基序序列的类型和引入位置可考虑目的RNP的合适布置而确定使得所述Dicer蛋白的功能受到抑制。

或者，所述引导链的核苷酸序列可根据所需靶序列确定以通过计算机辅助分子建模设计所述连接链和所述过客链。在此步骤中，可特别关注所述引导链和所述过客链正确形成双链体结构。

第一实施方案的shRNA可稳定地存在于在生理条件(包括pH6.5-8.0和4-42℃的温度，优选pH 7.3-7.5和4-37℃的温度)下形成图1中所示的发夹结构过程中。当第一实施方案的shRNA可以这种形式存在体内时，该shRNA被RNA双链体切割酶Dicer识别。接着所述shRNA可在图1中箭头a和b显示的位置被切割以形成具有2-碱基突出端、各链长度中有约19-24个碱基的RNA双链体。结果，与靶mRNA互补的引导RNA可从RLC转移到RISC以通过其切割抑制待控制的mRNA的翻译。

因此，第一实施方案的shRNA的特征在于图中所示形式(即其中蛋白结合基序序列21未结合到特定蛋白的形式)的shRNA以与已知的天然shRNA相同的方式起作用。

接着，根据第二实施方案，本发明提供RNAi控制体系，其包括：第一实施方案的shRNA；和RNP衍生的蛋白，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列。

组成本实施方案的RNAi控制体系的shRNA示意性地显示于图2(A)中，RNP衍生的蛋白4示意性地显示于图2(B)中。所述shRNA如第一实施方案中所述，在此省略其描述。相同参考数字将用于表示与图1中相同的组分。

图2(B)中所示的蛋白4是从RNP衍生并特异性结合到所述shRNA上的蛋白结合基序序列21的蛋白。从而，该蛋白4可以专门针对选作蛋白结合基序序列21的序列的方式确定。具体地说，当Box C/D(SEQ ID NO：2)被选作蛋白结合基序序列21时，蛋白4为L7Ae(SEQ ID NO：1)。蛋白4也可为包含特异性结合到蛋白结合基序序列21的蛋白的融合蛋白或可为具有添加到特异性结合到蛋白结合基序序列21的蛋白的其它肽的蛋白。这是因为蛋白4仅需要能够抑制被下面描述的Dicer识别。

在图2(A)中所示的状态中，如第一实施方案中所述，本实施方案shRNA在蛋白4不存在下以与已知天然shRNA相同的方式起作用以导致RNAi，使得特定mRNA的翻译功能受到抑制。

接下来，将描述在其中本实施方案的shRNA和蛋白4分子共存的体系中所述shRNA和蛋白4的状态。图2(C)示意性地显示了其中所述shRNA和所述蛋白4共存的体系中的所述shRNA和所述蛋白4。所述shRNA和所述蛋白4可以在生理条件(包括pH 6.5-8.0和4-42℃的温度，优选pH 7.0-7.5和4-37℃的温度)下以通过特异性结合形成的RNP复合体的形式稳定地存在。

本实施方案的特征在于当所述shRNA上的蛋白结合基序序列21特异性结合蛋白4以通过特异性结合形成RNP时，Dicer不能识别这种RNP形式的shRNA。结果，该Dicer不能切割shRNA。接着，它不能进行RNAi的下一步骤从而使得待控制的mRNA不受切割影响。换句话说，本实施方案的shRNA与蛋白4的共存可抑制RNAi。此外，根据实施方案，作为输入信息的蛋白4被转化成作为输出信息的RNAi抑制。

本文中，其中所述shRNA和所述蛋白4共存的体系可为在培养基中分别制备的shRNA和蛋白4分子的混合物。或者，可设计用于表达所述shRNA分子的载体，且可设计用于表达所述蛋白4的分子的载体。可将这些载体引入相同细胞中，还可引起它们的表达以实现其中所述shRNA和所述蛋白4共存的体系。将在下面描述的实施例中详细描述该载体设计。

本发明第二实施方案的RNAi控制体系可实现以蛋白特异性方式抑制shRNA介导的RNAi。

接下，根据第三实施方案，本发明涉及RNAi控制方法，其包括如下步骤：在溶液中使第一实施方案的传感shRNA与RNP衍生的蛋白接触，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列；和将包含所述shRNA和所述蛋白的所述溶液引入细胞中。可根据第一和第二实施方案选择本实施方案中所用的传感shRNA和蛋白的组合以确定它们的序列。

[传感shRNA的体外合成]

本文中，所述传感shRNA可通过称为体外转录的体外合成方法获得。其中T7启动子序列的19-碱基反义序列(TATAGTGAGTCGTATTAGC；SEQ ID NO：3)可结合到用作shRNA模板的序列的3′末端的单链DNA是人工合成的(Hokkaido SystemScience Co.，Ltd.)，这可能与以相同方式人工合成的19-碱基T7启动子序列(GCTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO：4))缔合。如实施例中详细描述的，这种缔合体可与核糖核酸、盐和T7 RNA聚合酶混合并在37℃反应以获得所述传感shRNA。

[蛋白的制备]

另一方面，所述蛋白可通过制备用于表达所述蛋白的载体和采用大肠杆菌引起其表达，然后纯化来获得。例如，可参考NucleicAcid Research，2003，Vol.31，No.3 869-877制备用于表达L7Ae(SEQ ID NO：2)的载体(L7Ae是特异性结合到SEQ ID NO：1表示的Box-C/D基序的蛋白)。在大肠杆菌中用于表达L7Ae(SEQ ID NO：2)的载体的一个实例显示于SEQ ID NO：5中。

本实施方案中，所述接触步骤可通过在相同溶液体系中将如此制备的传感shRNA和蛋白混合来进行。所述shRNA和所述蛋白的混合可在生理条件(包括pH 6.5-8.0和4-42℃的温度，优选pH7.3-7.5和4-37℃的温度)下进行。结果，所述shRNA和所述蛋白可特异性地相互作用以形成RNP复合体。

除了以上描述的条件以外，RNAi可在Dicer、ATP和Mg离子存在下和在合适生理条件下受到抑制。从而，在接触步骤中，可将所述传感shRNA和所述蛋白混合以形成RNP复合体，然后，可进行引入细胞中的步骤。引入细胞中的RNP复合体的浓度为，例如1nM-40nM shRNA，优选1nM-20nM shRNA，蛋白浓度优选但不局限于shRNA浓度的1-10倍。将RNP复合体引入细胞可通过但不局限于采用脂质体转染来进行，可由本领域技术人员采用本领域中已知的将RNP引入细胞中的通用方法进行。

将所述RNP复合体引入细胞中后，在第一实施方案中参考图2描述的现象可在包含Dicer的细胞中发生。具体地说，Dicer既不识别所述传感shRNA和所述蛋白制备的复合体中的RNA切割位点也不切割所述shRNA。那么，与所述引导链互补的mRNA可能不进行RNAi。因此，由该mRNA编码的蛋白的表达可能受到抑制。

根据本发明的第三实施方案，RNAi可在体外受到抑制。

在第三实施方案的变形中，所述蛋白单独可直接给药至细胞。该变形包括在将所述蛋白引入细胞中之后，在所述细胞中形成所述传感shRNA和所述蛋白的RNP复合体，且在这点上不同于第三实施方案，第三实施方案包括形成RNP复合体，然后将其引入细胞中。在此变形中，可在将所述蛋白引入所述细胞中之前或之后将所述传感shRNA引入所述细胞中。当在所述蛋白引入之前将所述传感shRNA引入所述细胞时，可设计用于表达所述shRNA的载体使得所述shRNA在引入所述细胞中的该载体中的表达可采用小分子如四环素控制。在此方法中，所述shRNA可在所述蛋白引入后采用四环素表达。当在所述蛋白引入之后将所述传感shRNA引入所述细胞时，可将所述shRNA直接引入所述细胞中或可将用于表达所述shRNA的载体引入所述细胞中。引入所述细胞中的蛋白与所述传感shRNA形成RNP复合体并能够在所述细胞内使目的基因的表达受到RNAi控制。因此，本实施方案似乎在蛋白药物的开发或疾病如癌的治疗中有效。

根据第四实施方案，本发明涉及细胞内RNAi控制方法，其包括如下步骤：将用于表达第一实施方案的shRNA的载体引入细胞中；将用于表达RNP衍生的蛋白的载体引入所述细胞中，所述RNP衍生的蛋白特异性结合到所述shRNA中的蛋白结合基序序列；和从用于表达所述shRNA的载体和用于表达所述蛋白的载体引起它们的表达。

用于表达所述传感shRNA的载体可根据如第一实施方案中所述确定的传感shRNA的一级结构序列制备。载体制备方法的一个实例显示于图3中。图3(A)显示售自Invitrogen Corp.的pENTR(商标)/H1/TO载体(SEQ ID NO：8)。编码本发明的shRNA的DNA序列可插入图3(A)的箭头显示的位点。插入的DNA双链体示意性显示于图3(B)中。图3(B)中显示的上链从5′末端按顺序包括突出链CACC、引导链编码的DNA序列1d、连接链编码的DNA序列2d和过客链编码的DNA序列3d。此图中显示的下DNA链是与上链互补的链且具有位于5′端的突出链AAAA。本领域技术人员可通过将所述序列引入可商购的质粒以制备产生所需传感shRNA的质粒来获得所需传感shRNA。

所述蛋白表达载体可通过将编码待表达的蛋白的DNA序列结合到用于哺乳动物表达的载体中来制备。载体制备实例显示于图4中。此图中显示的载体是用于表达L7Ae(SEQ ID NO：2)的载体，L7Ae是特异性结合到SEQ ID NO：1表示的Box-C/D基序的蛋白。所述载体的序列显示于SEQ ID NO：6中。可参考Nucleic AcidResearch，2003，Vol.31，No.3 869-877制备这种载体，可从其中提取基因并重组到哺乳动物表达载体中。该载体可采用从InvitrogenCorp.商购到的pcDNA3.1(+)myc His A载体(SEQ ID NO：7)制备。

本实施方案的特征在于将用于表达shRNA的载体和用于表达所述蛋白的载体引入相同细胞中并引起它们的表达。所述引入步骤可通过转染来进行。所述转染的实例包括但不局限于：采用脂质体转染、直接注射、电穿孔和慢病毒转染方法。引入细胞中的所述shRNA表达载体和所述蛋白表达载体的量可根据目的而不同，且例如，所述L7Ae蛋白表达载体的量1/4-10倍，优选1-4倍于所述shRNA表达载体的量。

根据第四实施方案，可通过引起所述shRNA和所述蛋白的细胞内表达抑制RNAi。该实施方案的实际应用的实例包括癌的治疗。此外，RNAi控制体系还可通过将本实施方案中所用的用于表达所述传感shRNA的载体和所述蛋白表达载体结合来制备。

在一个变形中，可设计shRNA使得特异性结合到显示于图1和2中的蛋白结合基序序列的蛋白为例如仅在癌细胞中表达的生物分子，且所述引导链的靶序列为凋亡促进基因。在这种情况下，可直接或可通过载体将所述shRNA引入癌细胞中以在所述癌细胞中与仅在癌中表达的生物分子形成RNP复合体。结果，可使所述shRNA不易被Dicer识别。接着，在所述癌细胞中，所述凋亡促进基因的RNAi可受到抑制，导致所述凋亡促进基因的选择性表达，以促进所述癌细胞的凋亡。另一方面，在可能不含仅在癌中表达的生物分子的正常细胞中，RNAi可能不受抑制，即使相同的shRNA被直接或通过载体引入其中。因此，可能通过RNAi抑制所述凋亡促进基因的表达。

此外，在本实施方案的另一变形中，可设计shRNA，使得特异性结合到图1和2中所示的蛋白结合基序的蛋白为例如变得不再被致癌作用表达的生物分子，且所述引导链的靶序列可为凋亡抑制基因。在这种情况下，可直接或通过载体将所述shRNA引入正常细胞中以在所述正常细胞中与变得不再被致癌作用表达的生物分子形成RNP复合体。结果，可使所述shRNA不易被Dicer识别。接着，在所述正常细胞中，所述凋亡抑制基因的RNAi可受到抑制，导致所述凋亡抑制基因的选择性表达，以抑制所述正常细胞的凋亡。另一方面，在可能不含变得不再被致癌作用识别的生物分子的癌细胞中，RNAi可能不受抑制，即使相同的shRNA被直接或通过载体引入其中。因此，可能通过RNAi抑制所述凋亡抑制基因的表达。

此外，可构建使用L7Ae的癌症控制体系。将与表达这种癌相关蛋白相同的启动子结合到所述L7Ae蛋白表达载体的上游中。结果，可通过应答所述癌相关蛋白表达调节L7的表达来调节所述连接链中包含结合到的Box C/D的凋亡控制传感shRNA的RNAi功能。

实施例1

[蛋白分子应答shRNA的设计]

用于EGFP敲落的shRNA-GFP序列(shRNA-GFP(59mer)GGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCAGCAUAGGGAUCUUGAAGUUCACCUUGAUGCCAG；图5A(SEQ ID NO：10))由东京大学的Tsutomu Suzuki博士Takayuki Kato博士友好提供。就shRNA-GFP-mut(shRNA-GFP-mut(59mer)GCACUAGCGUAUGAAUGAAAGAUCCAGCAUAGGGAUCUUUCAUUCAUACGCUAGUGCAG；图5B(SEQ ID NO：12))而言，首先，设计其中与终止密码子互补的3个序列被一对一插入三个密码子阅读框的引导链，用其代替shRNA-GFP的引导链以设计shRNA-GFP-mut序列。该shRNA-GFP-mut被用作没有导致EGFP敲落的阴性对照物。接下来，从RNP基序L7Ae-Box C/D的结构获得Box C/D的RNA序列并将其插入使得其尽可能靠近shRNA中的Dicer蛋白切割位点且保持引导链和过客链的双链体结构以设计预计在Box C/D序列特异性结合到L7Ae蛋白的shRNA-BoxC/D-GFP(shRNA-Box C/D-GFP(63mer)GGCAUCAAGGUGAACUUCAGCUGACCCGAAAGGGCGUGAUGCUGAAGUUCACCUUGAUGCCAG；图5C(SEQ ID NO：9))。在其引导链，采用shRNA-GFP的引导链的3′末端的21个碱基。此外，将其中在shRNA-Box C/D-GFP的5′末端的碱基24处的腺嘌呤缺失且碱基38处的鸟嘌呤被胞嘧啶替代的shRNA设计成不结合到L7Ae的shRNA-Box C/D-mut-GFP(shRNA-Box C/D-mut-GFP(62mer)GGCAUCAAGGUGAACUUCAGCUGCCCGAAAGGGCGUCAUGCUGAAGUUCACCUUGAUGCCAG；图5(D)(SEQ ID NO：11))。

[shRNA的体外合成]

[shRNA-Box C/D-GFP]

将5.25μL作为shRNA的模板DNA的L7Aer模板(100μM，5′-CTGGCATCAAGGTGAACTTCAGCATCACGCCCTTTCGGGTCAGCTGAAGTTCACCTTGATGCCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′；SEQ ID NO：13)、5.25μL T7正义引物(100μM，5′-GCTAATACGACTCACTATA-3′；SEQ ID NO：4)、30μL T7 RNA聚合酶、5μL 1mg/mL焦磷酸酶(ROCHE)、1.75μL 20mg/mL BSA、28μL 1M Hepes-KOH、14μL 1M MgCl₂、3.5μL 1M DTT、14μL0.1M亚精胺、33.6μL 0.1M ATP(对CTP和UTP同样适用)、8.96μL 0.1M GTP、89.6μL 0.1M GMP和385μL超纯水混合并在37℃反应过夜。此反应后，向其中加入10μL TURBO DNase并在37℃反应30分钟以使所述模板DNA降解。此反应后，进行苯酚萃取和氯仿萃取，并将所得上清液装入用PD-10缓冲液(0.3M乙酸钾，15％(v/v)乙醇，pH 6.0)平衡的PD-10柱(GE Healthcare)并用3mL PD-10缓冲液洗涤，然后用500μL of PD-10缓冲液洗脱两次。接着，向所得洗脱液中加入等量的乙醇以进行乙醇沉淀。扔掉所得上清液，将所得沉淀干燥并接着溶解于20μL 5×染料溶液(0.25％BPB，30％甘油)中。使所得溶液在非变性15％聚丙烯酰胺(1/30双丙烯酸胺)凝胶上分层并在室温电泳50分钟以进行分离。切除具有目的尺寸的带，向其中加入500μL洗脱缓冲液(0.5M NaCl，0.1％SDS，1mMEDTA)，然后在37℃洗脱过夜。接着，将微量过滤器(22μm MillexGP)连接到5-mL注射器(TERUMO CORP.)，将所得洗脱液加入所述注射器并通过所述过滤器过滤。向该滤出液中加入2.5倍体积的乙醇以进行乙醇沉淀。扔掉所得上清液，将所得沉淀干燥并接着溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[shRNA-Box C/D mut-GFP]

将5.25μL作为shRNA的模板DNA的L7AerN模板(100μM，5′-CTGGCATCAAGGTGAACTTCAGCATGACGCCCTTTCGGGCAGCTGAAGTTCACCTTGATGCCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′；SEQID NO：15)和5.25μL T7正义引物(100μM，SEQ ID NO：4)以与shRNA-Box C/D-GFP中相同的方式用于进行转录/合成和纯化。将所得纯化产物溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，该溶液用于后续试验。

[shRNA-GFP]

将5.25μL作为shRNA的模板DNA的481P模板(100μM，5′-CTGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCCTATGCTGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′；SEQ IDNO：16)和5.25μL T7正义引物(100μM，SEQ ID NO：4)以与shRNA-Box C/D-GFP中相同的方式用于进行转录/合成和纯化。将所得纯化产物溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，该溶液用于后续试验。

[L7Ae蛋白的表达和纯化]

将包含结合到pET-28b+中的L7Ae蛋白的基因的质粒(由Huttenhofer博士友好提供)扩增。从用pET-28b+L7Ae质粒(SEQ IDNO：5)转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS的-80℃甘油细菌原液将所述细菌细胞接种到5mL培养基中并在37℃振荡培育过夜。随后，将整个量的培养液接种到500mL包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氯霉素的LB培养基中。将细菌细胞在37℃振荡培养直到O.D.₆₀₀变成0.6-0.7。接着，将500μL 1M IPTG(最终浓度：1mM)加入其中来诱导表达，将所述细胞在30℃振荡培育过夜。通过离心收集细菌细胞(4℃，6000rpm，20分钟)。加入5mL超声处理缓冲液(50mM磷酸钠，0.3M NaCl，2.5mM咪唑，pH 8.0)后，进行超声处理以分裂所述细菌细胞。在此超声处理中，重复在冰上冷却接着用超声波辐射15秒的步骤6次。接着，使杂质蛋白在80℃变性15分钟。通过离心作用(4℃，6000rpm，20分钟)收集上清液，采用Ni-NTA柱(Qiagen)通过间歇法将组胺酸标签蛋白纯化。具体地讲，首先，在4℃将所得上清液和1mL Ni-NTA混合并搅拌1小时。接着，将所得混合物装入所述柱中并用4mL洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，0.3M NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗涤两次。进行两轮阶梯式洗脱，每轮用50mM、100mM、200mM和300mM咪唑洗脱缓冲液各1mL(通过将咪唑加入50mM磷酸钠、0.3M NaCl制备，pH8.0)。通过15％SDS-PAGE确认目的蛋白。随后，采用Microcon YM-3(Millipore Corp.)将所述蛋白浓缩，随后缓冲液被透析缓冲液(20mM Hepes-KOH，1.5mM MgCl₂，150mM KCl，5％甘油，pH 7.5)替代。此外，采用蛋白测定(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过Bradford法确定所述蛋白的浓度。

[通过凝胶转移测定确认RNP复合体]

按照如下确认各shRNA和所述蛋白之间的结合：用透析缓冲液稀释以使所述蛋白浓度达到80-640nM最终浓度的25倍后，将具有各浓度的2μL所述蛋白溶液、2μL 1μM shRNA-Box C/D-GFP、6μL超纯水和40μL Opti-MEM I(商标，Invitrogen Corp.)混合并在室温静置30分钟以将shRNA(40nM)结合到L7Ae(80nM、160nM、320nM或640nM)。以相同方式将shRNA-GFP和shRNA-Box C/Dmut-GFP结合到L7Ae上。向各溶液中加入13μL 5×染料溶液(0.25％BPB，30％甘油)并混合，使15μL这种混合溶液在非变性15％聚丙烯酰胺(1/30双丙烯酰胺)凝胶上分层并在250V、4℃电泳50分钟。电泳后，用SYBR Green将所述凝胶染色15分钟，采用FLA-7000(FUJI FILM)确认谱带。图6显示通过凝胶转移测定显示shRNA-GFP、shRNA-Box C/D-GFP和shRNA-Box C/D mut-GFP结合到L7Ae。结果表明shRNA-Box C/D-GFP以序列特异性方式结合到L7Ae。

[通过体外Dicer切割测定确认Dicer切割抑制]

如下采用GTS，Inc.的重组人Dicer酶试剂盒按照方案确认shRNA-Box C/D-GFP和shRNA-Box C/D mut-GFP的Dicer切割受到L7Ae抑制：首先，将0.4μL 1μM shRNA、2μL 4μM或8μML7Ae、1μL 10mM ATP、0.5μL 50mM MgCl₂、4μL Dicer反应缓冲液(GTS，Inc.)、2μL 0.5单位/μL重组Dicer酶和0.1μL超纯水混合并在37℃反应15小时。接着，向其中加入2μL Dicer终止液并混合。向8μL这种混合溶液中加入2μL 5×染料溶液，使所得混合物在非变性15％聚丙烯酰胺(1/30双丙烯酰胺)凝胶上分层并在4℃电泳50分钟。电泳后，用SYBR Green将所述凝胶染色，采用FLA-7000(FUJI FILM)确认谱带。图7显示了shRNA-Box C/D-GFP和shRNA-Box C/D mut-GFP采用体外重构Dicer体系的Dicer切割被L7Ae的抑制结果。图7中，L7Ae中的标记+表示由4μM L7Ae制备的样品，标记++表示由8μM L7Ae制备的样品，标记-表示没有使用L7Ae。同样，Dicer中的标记+表示使用Dicer，标记-表示没有使用Dicer。结果表明：在序列特异性结合到L7Ae后，使得shRNA-Box C/D-GFP不易被Dicer切割。

[shRNA表达质粒的构建/合成]

[pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-GFP(SEQ ID NO：17)的合成]

将5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、作为包含shRNA编码序列的单链DNA的pENTR L7Aer上游链(200μM，5′-CACCGGCATCAAGGTGAACTTCAGCTGACCCGAAAGGGCGTGATGCTGAAGTTCACCTTGATGCC-3′；SEQ ID NO：18)、5μL作为包含其互补链的单链DNA的pENTR L7Aer下游链(200μM，5′-AAAAGGCATCAAGGTGAACTTCAGCATCACGCCCTTTCGGGTCAGCTGAAGTTCACCTTGATGCC-3′；SEQ ID NO：19)、2μL 10×寡核苷酸退火缓冲液(Invitrogen Corp.)和2μL超纯水混合并95℃培育4分钟，接着在室温静置5分钟以形成DNA双链体。该双链体是图3(B)中显示的双链体。用超纯水将该DNA双链体溶液稀释100倍，接着，通过与10μL 10×寡核苷酸退火缓冲液和89μL超纯水混合将1μL所得稀释溶液稀释100倍。接着，将4μL 5×连接缓冲液、2μL 0.75ng/μL pENTR/H1/TO载体、5μL 10,000倍稀释的DNA溶液、8μL超纯水和1μL 1U/μL T4 DNA连接酶混合并在室温静置5分钟以将所述shRNA编码的序列结合到所述pENTR/H1/TO载体中。将4μL这种反应溶液加入TOP10感受态大肠杆菌中以进行转化。在加入250μL S.O.C培养基后，将所述细菌细胞振荡培育1小时，接着在包含50μg/mL卡那霉素的LB板接种并在37℃培育过夜。确认形成的菌落，采用H1正向引物(10μM，5′-TGTTCTGGGAAATCACCATA-3′；SEQ ID NO：20)、M13反向引物(10μM，5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′；SEQ ID NO：21)和KOD-Plus-ver.2(TOYOBO CO.，LTD.)通过菌落PCR确认所述质粒载体中的插入。将此菌落接种到50mL包含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中并在37℃振荡培育16小时。通过离心分离(4℃，6000rpm，15分钟)收集所述细菌细胞并按照质粒纯化试剂盒(Qiagen)的方案纯化，然后进行异丙醇沉淀。扔掉所得上清液，将所得沉淀干燥并接着通过加入55μL超纯水溶解。在质粒载体浓度测定后，将其用于后续实验。

[pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-mut-GFP(SEQ ID NO：22)的合成]

以与上述相同的方式采用5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、包含shRNA编码的序列的单链DNA的pENTRL7AerN上游链(200μM，

5′-CACCGGCATCAAGGTGAACTTCAGCTGCCCGAAAGGGCGTCATGCTGAAGTTCACCTTGATGCC-3′；SEQ ID NO：23)和作为包含其互补链的单链DNA的pENTR L7AerN下游链(200μM，5′-AAAAGGCATCAAGGTGAACTTCAGCATGACGCCCTTTCGGGCAGCTGAAGTTCACCTTGATGCC-3′；SEQ ID NO：24)合成pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-mut-GFP并将其纯化，且通过加入55μL超纯水溶解。质粒载体浓度测试后，将其用于后续实验。

[pENTR/H1/TO-shRNA-GFP(SEQ ID NO：25)的合成]

以与上述相同的方式采用5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、包含shRNA编码的序列的单链DNA的pENTR481P上游链(200μM，

5′-CACCGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCAGCATAGGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCC-3′；SEQ ID NO：26)和作为包含其互补链的单链DNA的pENTR 481P下游链(200μM，5′-AAAAGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCCTATGCTGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCC-3′；SEQ ID NO：27)合成pENTR/H1/TO-shRNA-GFP并将其纯化，且通过加入55μL超纯水溶解。质粒载体浓度测试后，将其用于后续实验。

[pENTR/H1/TO-shRNA-GFP-mut(SEQ ID NO：28)的合成]

以与上述相同的方式采用5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、作为包含shRNA编码的序列的单链DNA的pENTR Sk-7N上游链(200μM，

5′-CACCGCACTAGCGTATGAATGAAAGATCCAGCATAGGGATCTTTCATTCATACGCTAGTGC-3′；SEQ ID NO：29)和作为包含其互补链的单链DNA的pENTR Sk-7N下游链(200μM，5′-AAAAGCACTAGCGTATGAATGAAAGATCCCTATGCTGGATCTTTCATTCATACGCTAGTGC-3′；SEQ ID NO：30)合成pENTR/H1/TO-shRNA-GFP-mut并将其纯化，且通过加入55μL超纯水将其溶解。质粒载体浓度测试后，将其用于后续实验。

[pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6(SEQ ID NO：6)的合成]

采用pET-28b+L7Ae(SEQ ID NO：5)作为模板DNA和BamHI-NdeI-NotI-L7Ae引物(5′-AAGGATCCATCATATGCGGCCGCTTATGTACGTGAGATTTGAGG-3′)(SEQ ID NO：32)和L7Ae-EcoRI-XhoI引物(5′-CACTCGAGTTGAATTCTCTTCTGAAGGCCTTTAATC-3′)(SEQID NO：33)作为引物进行PCR。50μL这种反应溶液包含2.5μL 10ng/μL模板DNA、1.5μL各10μM DNA引物、5μL 2mM dNTP、5μL 10×KOD-PLUS-buffer ver.2、2μL 25mM MgSO₄、1μLKOD-PLUS-DNA聚合酶和31.5μL超纯水的混合物。通过在94℃初始培育2分钟，然后36个循环(98℃，10秒；55℃，30秒和68℃，1分钟)进行反应。从所得PCR产物，采用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)将DNA纯化。然而，用30μL超纯水进行洗脱，接着在限制性酶处理中采用这种DNA作为模板。将27μL所述模板、5μL B缓冲液(ROCHE)、1μL 10U/μL BamH1(ROCHE)、1μL 10U/μL XhoI(ROCHE)和16μL超纯水混合并在37℃反应2小时以进行限制性酶处理。同样对于pcDNA3.1(+)myc His A载体(Invitrogen Corp.)，将1.88μL 1.6μg/μL pcDNA载体、5μL B缓冲液、1μL 10U/μLBamH1、1μL 10U/μL XhoI和41.12μL超纯水混合，以相同方式进行限制性酶处理。采用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)将这些处理产物纯化。然而，就洗脱而言，将DNA洗脱到10μL超纯水中。

将1.75μL如此经过限制性酶处理的PCR产物、0.25μL如此经过限制性酶处理的载体和2μL Ligation High混合并在16℃培育30分钟。向整个量的这种连接反应溶液中加入20μL Top10化学感受态细胞(Invitrogen Corp.)。将所述细胞在冰上静置45分钟，接着放入42℃的水浴中1分钟，并再在冰上静置2分钟以进行转化。再加入160μL LB培养基后，将所述细胞接种在包含50μg/mL氨比西林的LB板上并在37℃上培育过夜。采用Extaq(TAKARA BIOINC.)和上述DNA引物对形成的菌落进行菌落PCR以检查所述插入。将其中插入被确认的菌落接种到包含50μg/mL氨比西林的50mL LB培养基并在37℃振荡培养过夜。通过离心分离(4℃，6000rpm，15分钟)收集所述细菌细胞并按照质粒纯化试剂盒(Qiagen)的方案纯化，然后进行异丙醇沉淀。扔掉所得上清液，干燥所得沉淀并接着通过加入55μL超纯水溶解。在质粒载体浓度测试后，采用T7启动子引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；SEQ ID NO：34)和BGH反向引物(5′-GCTGGCAACTAGAAGGCACAG-3′；SEQ IDNO：35)对这种质粒载体测序并用于后续实验。

[通过荧光显微图像确认敲落功能控制]

在转染之前一天，将HeLa细胞以0.8×10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板上并在37℃的CO₂培养箱中培养。第二天，用pENTR/H1/TO shRNA表达载体、pcDNA3.1-AsRed2-L7Ae-myc-His6(SEQ ID NO：40)和pcDNA3.1-EGFP-myc-His6(SEQ ID NO：41)每种采用Lipofectamine2000(Invitrogen Corp.)(商标)将所述细胞共转染。向0.3μg各pENTR-shRNA-GFP、pENTR-shRNA-GFP mut、pENTR-shRNA-BoxC/D-GFP和pENTR-shRNA-Box C/D mut-GFP中加入0.3μgpcDNA3.1-AsRed2-L7Ae-myc-His6或pcDNA3.1-AsRed2-myc-His6(SEQ ID NO：42)和0.2μg pcDNA3.1-EGFP-myc-His6，每个样品加入1.25μl Lipofectamine 2000。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟且逐滴加入HeLa细胞培养基中。4小时后，更换培养基。24小时后，采用荧光显微镜(OLYMPUS IX-81)获得所述细胞的荧光显微图像以观察AsRed2-L7Ae表达对shRNA-Box C/D-GFP功能的抑制。

图12是用510-550nm波长过滤器通过用波长为约488nm的激发光照射获得的EGFP荧光图像。在图12中，各板下面的标记“+”表示高荧光强度，标记“-”表示低荧光强度。此图像展示了AsRed2-L7Ae对shRNA-Box C/D-GFP的敲落功能的抑制效应。

[通过RT-PCR分析确认RNAi控制]

通过实时PCR确定L7Ae的RNAi控制引起的GFP mRNA水平变化。

在前一天，将HeLa-GFP细胞以0.5x10⁶细胞/孔的浓度接种在6孔板上并在37℃的CO₂培养箱培育。接着，用pENTR/H1/TOshRNA表达载体和pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6将所述细胞共转染。向4μg各pENTR-shRNA-Box C/D-GFP和pENTR-shRNA-Box C/Dmut-GFP中加入0，2或4μg pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6且每个样品加入5μl Lipofectamine 2000。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟并逐滴加入所述细胞中。4小时后，更换培养基。转染24小时后，收集所述细胞，采用RNAqueous 4PCR试剂盒(Ambion，Inc.(商标))进行RNA提取并除去DNA。

采用1.5μg(或0.5μg)所提取的RNA作为模板，采用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems Inc.(商标))、随机引物和逆转录酶合成cDNA。采用1/20稀释的cDNA作为模板和LightCycler 480 Taqman探针(Roche)(商标)进行实时PCR。采用LightCycler 480(Roche)(商标)进行PCR反应和实时荧光检测。反应条件包括在95℃初始变性步骤5分钟和45个循环的扩增步骤，其包括在95℃变性10秒和在60℃退火/延伸25秒。最后，将反应溶液在50℃冷却15秒来终止测试。通过Abs Quant/拟合点法确定Ct值。采用481P Fwd(5′-CAAGGAGGACGGCAACA-3′)(SEQ ID NO：36)和Rev(5′-CCTTGATGCCGTTCTTCTGC-3′)(SEQ ID NO：37)将目的GFP基因扩增。采用GAPDH Fwd(5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′)(SEQ ID NO：38)和GAPDH Rev(5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′)(SEQ ID NO：39)将对照基因GAPDH扩增。分别采用通用探针库探针#148(ROCHE)和通用探针库探针#60(ROCHE)确定GFP mRNA和GAPDH mRNA的扩增效率。通过电泳确认所得扩增产物为单一目的产物，所得产物通过相对定量进行评价。用GAPDH将EGFP水平归一化，将该归一值用于样品比较中，仅补增pENTR-shRNA-GFP mut的样品的GFP mRNA相对水平为1。图8显示RT-PCR分析L7Ae对RNAi抑制的结果。样品中的表达水平不同表明在用pENTR-shRNA-Box C/D-GFP和pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6共转染的时候GFP mRNA水平恢复且在L7Ae存在下RNAi以Box C/D序列特异性方式受到抑制。

[通过FACS分析确认L7Ae的RNAi控制]

在转染之前一天，将HeLa-GFP细胞以0.5×10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板并在37℃的CO₂培养箱中培养。第二天，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)(商标)用pENTR/H1/TOshRNA表达载体和pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6各自将所述细胞共转染。向0.8μg各pENTR-shRNA-Box C/D-GFP和pENTR-shRNA-Box C/D mut-GFP中加入0、0.40或0.80μgpcDNA3.1-L7Ae-myc-His6，每个样品加入2μl Lipofectamine 2000。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟且逐滴加入所述细胞中。4小时后，更换培养基。

转染24小时后，除去各孔中的培养基，采用200μl胰蛋白酶-EDTA将所述细胞解离并通过加入200μl DMEM/F12使之悬浮。将所得细胞悬浮液转移到FACS管中并采用FACSAria(BD)分析。本文中，将活细胞门控并确定20000细胞的FITC。采用包括计算所有测定细胞的荧光强度的平均值的通用方法进行该分析。图9显示了FACS分析的结果(显示每个样品20000细胞的GFP强度的平均值的结果)。结果展示：观察到GFP表达以用pcDNA3.1-L7Ae-myc-His6和pENTR-shRNA-Box C/D-GFP共转染的细胞特异性方式的恢复。这表明：如RT-PCR分析结果所示，在L7Ae存在下RNAi以Box C/D序列特异性方式受到抑制。

实施例2

[蛋白分子应答shRNA的设计]

设计用于EGFP敲落(5′-GGCAUCAAGGUGAACUUCAGGGCGAAAGCCCUGAAGUUCACCUUGAUGCCAG-3′；SEQ ID NO：14)的shRNA-U1A-4。所述shRNA-U1A-4包括：5′末端24个碱基，所述碱基与实施例1中所用的图5(A)中所示的shRNA-GFP的过客链中那些相同；引导链，所述引导链与所述碱基形成双链体；和非杂交环结构GAAA。该shRNA-U1A-4功能上类似于shRNA-GFP并用作阴性对照。此外，采用实施例1中设计的图5(C)的shRNA-Box C/D-GFP(SEQ ID NO：9)。

[shRNA的体外合成]

[shRNA-U1A-4]

以与shRNA-Box C/D-GFP中相同的方式采用5.25μLshRNA-U1A-4(100μM，5′-CTGGCATCAAGGTGAACTTCAGGGCTTTCGCCCTGAAGTTCACCTTGATGCCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′SEQ ID NO：31)的模板单链DNA和5.25μL T7正义引物(SEQ ID NO：4)进行转录/合成并纯化。将纯化产物溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[shRNA-Box C/D-GFP]

按照实施例1中描述的体外合成法制备它。

[L7Ae蛋白的表达和纯化]

采用实施例1中描述的大肠杆菌按照L7Ae蛋白表达和纯化制备它。

[在培养的细胞体系和RNP中的评价]

[通过在荧光显微镜下观察确认L7Ae-shRNA复合体的RNAi抑制]

在转染之前一天，将HeLa-GFP细胞以0.5×10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板并在37℃的CO₂培养箱中培养。本文中，HeLa-GFP细胞株是其中GFP以潮霉素耐药性方式稳定表达的HeLa细胞且由T.Suzuki博士友好提供。第二天，用500μl Opti-MEM(InvitrogenCorp.)替代所述24孔中的培养基。同时，通过采用Lipofectamine2000(Invitrogen Corp.)(商标)进行转染将shRNA-Box C/D-GFP与L7Ae蛋白的复合体引入所述细胞。将0.6μl 10μM shRNA-BoxC/D-GFP，0μl、0.6μl、1.2μl、2.4μl、4.8μl或9.6μl 20μM L7Ae蛋白和2μl 5×结合缓冲液混合，并向其中加入超纯水以使整量达到10μl(就9.6μl L7Ae蛋白而言，使整量达到12.2μl而未加入超纯水)。将40μl(就9.6μl L7Ae蛋白而言，37.8μl)Opti-MEM进一步加入其中并混合，使所得混合物在4℃静置30分钟以形成RNA-蛋白复合体。将48μl Opti-MEM和2μl Lipofectamine 2000混合并使之在室温静置5分钟。向该混合物中加入50μl RNA-蛋白复合体溶液并混合，使所得混合物在室温静置20分钟以形成RNA-蛋白-脂质复合体，接着将其逐滴加入所述细胞中。4小时后，用500μlDMEM/F12替代所述培养基。将无shRNA分子(Mock)和shRNA-U1A-4与L7Ae蛋白以相同方式混合以形成RNA-蛋白复合体，接着通过转染将其引入所述细胞中。

转染45小时后，在荧光显微镜下观察所述细胞。在荧光显微镜上(OLYMPUS)采用20×放大倍数和488nM激发波长的设置对每个样品的细胞内GFP荧光进行拍照。同时，还采用透射光拍得所述细胞的相衬图像。图10显示了所述荧光和相衬图像的叠加图像。

[通过FACS分析确认L7Ae-shRNA复合体的RNAi抑制]

转染47小时后，除去各孔中的培养基，采用200μl胰蛋白酶-EDTA将所述细胞解离并通过加入200μl DMEM/F12使之悬浮。将所得细胞悬浮液转移到FACS管并采用FACSAria(BD)分析。FACS是包括如下的方法：用激光照射，使游离细胞通过薄管并分析从所述细胞发出的荧光强度。本文中，将活细胞进行门控，确定10000细胞的FITC。图11显示了FACS-分析荧光强度分布的结果。所得结果展示：观察到GFP表达以对用L7Ae与shRNA-BoxC/D-GFP的复合体转染的细胞特异性的方式恢复。这表明在L7Ae存在下RNAi以Box C/D序列特异性方式受到抑制。就Mock而言，没有发生RNAi，因此，GFP表达被认为是L7Ae浓度依赖性的。另一方面，就shRNA-U1A-4而言，RNAi没有受到抑制，因此GFP表达以L7Ae浓度依赖性方式受到抑制。

实施例3

[蛋白分子应答shRNA的设计]

通过用包括Bcl-xL基因的碱基365-385的序列的双链体替代包括shRNA-Box C/D-GFP或shRNA-Box C/D mut-GFP的5′末端21个碱基的双链体位点设计shRNA-Box C/D-Bcl-xL(图13(B))和shRNA-Box C/D mut-Bcl-xL(图13(C))。

[shRNA的合成]

[shRNA-Box C/D-Bcl-xL(图13(B)(SEQ ID NO：43))]

以与shRNA-Box C/D-GFP中相同的方式采用5.25μL作为shRNA的模板DNA的shRNA-Box C/D-BclxL模板(100μM，5′-CTGCTTTGAACAGGTAGTGAATGATCACGCCCTTTCGGGTCACATTCACTACCTGTTCAAAGCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′(SEQ ID NO：44))和5.25μL T7正义引物(100μM，5′-GCTAATACGACTCACTATA-3′(SEQ ID NO：4))进行转录/合成和纯化。将纯化产物溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[shRNA-Box C/D mut-Bcl-xL(图13(C)(SEQ ID NO：45))]

以与shRNA-Box C/D-GFP中相同的方式采用5.25μL作为shRNA的模板DNA的shRNA-Box C/D mut-BclxL模板(100μM，5′-CTGCTTTGAACAGGTAGTGAATGATGACGCCCTTTCGGGCACATTCACTACCTGTTCAAAGCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′(SEQID NO：46))和5.25μL T7正义引物(100μM，5′-GCTAATACGACTCACTATA-3′(SEQ ID NO：4))进行转录/合成和纯化。将纯化产物溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[shRNA-Bcl-xL(图13(A)(SEQ ID NO：47))]

以与shRNA-Box C/D-GFP中相同的方式采用5.25μL作为shRNA的模板DNA的shRNA-Bcl-xL模板(100μM，5′-CTGCTTTGAACAGGTAGTGAATGAACTCTATGCTAGTTCATTCACTACCTGTTCAAAGCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3′(SEQ IDNO：48))和5.25μL T7正义引物(100μM，5′-GCTAATACGACTCACTATA-3′(SEQ ID NO：4))进行转录/合成和纯化。将纯化产物溶解于22μL超纯水中。在浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[通过shRNA-Bcl-xL确认Bcl-xL的敲落]

在转染之前一天，将HeLa-GFP细胞以0.5×10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板并在37℃的CO₂培养箱中培养。第二天，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)用Bcl-xL、表达载体和shRNA将细胞共转染。将0或0.4μg pBcl-xL和10μM shRNA-Bcl-xL混合并加Opti-MEM I培养基(Invitrogen Corp.)达到50μl。接着，每个样品中加入用49μl Opti-MEM I培养基补料的1μl Lipofectamine2000的混合物。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟。加入400μl Opti-MEM I培养基之后，将所得混合物逐滴加入所述细胞中。4小时后，更换培养基。

转染24小时后，收集各孔中的培养基。接着，采用200μl胰蛋白酶-EDTA将所述细胞解离并通过加入上步骤中收集的各培养基使之悬浮。使所得细胞悬浮液以500xg在4℃离心沉降5分钟并用500μl PBS洗涤。向所得细胞沉淀中加入30μl RIPA缓冲液(1×PBS、1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.3mg/ml PMSF+2μg/ml Aprotinin(牛胰蛋白酶抑制素))，将所得混合物在冰上静置30分钟。通过离心作用(4℃，15000g，20分钟)收集上清液。采用DC-蛋白测定(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过Lowry法测定蛋白浓度。

通过蛋白质印迹检测Bcl-xL。通过SDS-PAGE使从所述细胞中萃取的蛋白显影并进行蛋白印迹。采用第一抗体Anti-Bcl-xL(SC-634)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)(1/500)和第二抗体羊抗兔IgG(H+L)-HRP结合体(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(1/2000)。采用ECL Plus(GE Healthcare)(商标)显现颜色并采用LAS 3000(FUJIFILM)检测。由于用pBcl-xL将shRNA-Bcl-xL共转染，显示Bcl-xL的表达的谱带没有出现。结果展示了HeLa细胞中shRNA-Bcl-xL进行的Bcl-xL敲落。

[通过体外Dicer剪切测定确认Dicer切割抑制]

如下采用GTS，Inc.的重组人Dicer酶试剂盒按照方案确认shRNA-Box C/D-Bcl-xL和shRNA-Box C/D mut-Bcl-xL的Dicer切割受到L7Ae抑制：首先，将0.4μL 1μM shRNA、2μL 4μM或8μM L7Ae、1μL 10mM ATP、0.5μL 50mM MgCl₂、4μL Dicer反应缓冲液(GTS，Inc.)、2μL 0.5单位/μL重组Dicer酶和0.1μL超纯水混合并在37℃反应14小时。接着，向其中加入2μLDicer终止液并混合。向8μL这种混合溶液中加入2μL 5×染料溶液，使所得混合物在非变性15％聚丙烯酰胺(1/30双丙烯酰胺)凝胶上分层并在4℃电泳50分钟。电泳后，用SYBR Green将所述凝胶染色，采用FLA-7000(FUJI FILM)确认谱带。图14显示了通过采用体外重构Dicer体系显示shRNA-Box C/D-Bcl-xL和shRNA-Box C/Dmut-Bcl-xL的Dicer切割受到L7Ae抑制的结果。图14中，L7Ae中标记“-”表示没有使用L7Ae。同样，Dicer中的标记“+”表示使用Dicer，标记“-”表示没有使用Dicer。结果表明：在序列特异性结合到L7Ae后，使得shRNA-Box C/D-Bcl-xL不易被Dicer切割。

shRNA表达质粒的构建/合成

[pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-Bcl-xL(SEQ ID NO：49)的合成]

以与上相同的方式采用5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、作为包含shRNA编码序列的单链DNA的BoxC/D Bcl-xL上游链(200μM，5′-CACCGCTTTGAACAGGTAGTGAATGTGACCCGAAAGGGCGTGATCATTCACTACCTGTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：50))和作为包含其互补链的单链DNA的Box C/D Bcl-xL下游链(200μM，5′-AAAAGCTTTGAACAGGTAGTGAATGATCACGCCCTTTCGGGTCACATTCACTACCTGTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：51))合成pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-Bcl-xL并将其纯化，且通过加入55μL超纯水将其溶解。在质粒载体浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[pENTR H1 TO-shRNA-Box C/D mut-Bcl-xL(SEQ ID NO：52)的合成]

以与上相同的方式采用采用5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、作为包含shRNA编码序列的单链DNA的BoxC/D mut Bcl-xL上游链(200μM，5′-CACCGCTTTGAACAGGTAGTGAATGTGCCCGAAAGGGCGTCATCATTCACTACCTGTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：53))和作为包含其互补链的单链DNA的Box C/D mut Bcl-xL下游链(200μM，5′-AAAAGCTTTGAACAGGTAGTGAATGATGACGCCCTTTCGGGCACATTCACTACCTGTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：54))合成pENTR/H1/TO-Box C/D mut-Bcl-xL并将其纯化，且通过加入55μL超纯水将其溶解。在质粒载体浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[pENTR/H1/TO-shRNA-Bcl-xL(SEQ ID NO：55)的合成]

以与上相同的方式采用5μL用于插入pENTR/H1/TO载体(Invitrogen Corp.)、作为包含shRNA编码序列的单链DNA的Bcl-xL上游链(200μM，5′-CACCGCTTTGAACAGGTAGTGAATGAACTAGCATAGAGTTCATTCACTACCTGTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：56))和作为包含其互补链的单链DNA 的Bcl-xL下游链(200μM，5′-AAAAGCTTTGAACAGGTAGTGAATGAACTCTATGCTAGTTCATTCACTACCTGTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：57))合成pENTR/H1/TO-shRNA-Bcl-xL并将其纯化，且通过加入55μL超纯水将其溶解。在质粒载体浓度测定后，将该溶液用于后续实验。

[RNA-蛋白复合体引入实验]

为了确认通过培养的人癌细胞中L7Ae蛋白和shRNA-BoxC/D-Bcl-xL之间的结合对Bcl-xL敲落的控制，将RNA-蛋白复合体引入所述细胞中，并通过蛋白印迹检测Bcl-xL的表达。

在前一天，将子宫颈癌衍生的HeLa细胞以1.0x10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板上并在37℃的CO₂培养箱中培养。第二天，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)(商标)进行两次转染。向0.4μg pBcl-xL或pBimEL中加入1μl Lipofectamine 2000。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟并逐滴加入HeLa细胞的培养基中。4.5小时后，更换培养基。之后立即进行第二次转染。将2.5pmol(在培养基中的浓度：5nM)shRNA-Box C/D-Bcl-xL或shRNA-Box C/D mut-Bcl-xL和0或200pmol(在培养基中的浓度：400nM)纯化的L7Ae蛋白混合以形成复合体。向所述复合体中加入1μl Lipofectamine 2000，将所述复合体在室温培育20分钟并逐滴加入HeLa细胞的培养基中。5小时后，更换培养基。

第二次转染22小时后，收集各孔中的培养基。接着，采用200μl胰蛋白酶-EDTA将所述细胞解离并通过加入上一步骤中收集的各培养基进行悬浮。使所得细胞悬浮液以500xg在4℃离心沉降5分钟并用500μl PBS洗涤。接着，向所述细胞沉淀中加入30μlRIPA缓冲液(1×PBS、1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.3mg/ml PMSF+2μg/ml Aprotinin)，将所得混合物在冰上静置30分钟。通过离心作用(4℃，15000xg，20分钟)收集上清液。采用DC-蛋白测定(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过Lowry法测定蛋白浓度。

通过蛋白印迹检测Bcl-xL或GAPDH。通过SDS-PAGE使从所述细胞中萃取的蛋白显影并进行蛋白印迹。采用第一抗体Anti-Bcl-xL(SC-634)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)(1/500)和第二抗体羊抗兔IgG(H+L)-HRP结合体(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(1/2000)。采用ECL Plus(GE Healthcare)(商标)显现颜色并采用LAS3000(FUJI FILM)检测。同样，采用第一抗体Anti-GAPDH(MAB374)(Chemicon International，Inc.)(1/2000)和第二抗体羊抗鼠IgG(H+L)-HRP结合体(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(1/2000)对GAPDH进行蛋白印迹。这些结果展示Bcl-xL敲落受到所述HeLa细胞中L7Ae蛋白和shRNA-Box C/D-Bcl-xL之间的结合的抑制(泳道3)。以相同方式从细胞中萃取蛋白和进行L7Ae检测。图15显示了细胞内Bcl-xL表达。还确认了用作标准对照物的GAPDH的蛋白表达水平没有变化。将检测的Bcl-xL谱带的强度加起来。结果显示于图16中。在图15和16中，sh是“shRNA”的缩写。

[质粒引入实验]

为了确认培养的人癌细胞中L7Ae蛋白和shRNA-BoxC/D-Bcl-xL之间的结合对Bcl-xL敲落的控制，用表达Bcl-Xl、L7Ae和shRNA的质粒将细胞共转染并通过蛋白印迹检测Bcl-xL的表达。

在前一天，将子宫颈癌衍生的HeLa细胞以3.0x10⁵细胞/孔的浓度接种在12孔板上并在37℃的CO₂培养箱中培养。第二天，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)(商标)进行转染。将0.2μgpBcl-xL、0.4μg pcDNA3.1-L7Ae和0.6μgpENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-Bcl-xL混合并向其中加入2.5μlLipofectamine 2000。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟并逐滴加入HeLa细胞的培养基中。对pENTR/H1/TO-shRNA-BoxC/D-mut Bcl-xL、pENTR/H1/TO-shRNA-Bcl-xL和pENTR/H1/TO-shRNA-GFP mut(阴性对照)也进行相同步骤。将0.25μg pcDNA-AmCyan-myc-His6((SEQ ID NO：58)或0.2μg of pBcl-xL作为对照质粒单独引入所述细胞中。4小时后，更换培养基。

转染24小时后，收集各孔中的培养基。接着，采用200μl胰蛋白酶-EDTA将细胞解离并通过加入上一步骤中收集的各培养基使之悬浮。使所得细胞悬浮液以500xg在4℃离心沉淀5分钟并用500μl PBS洗涤。接着，向所述细胞沉淀中加入100μl RIPA缓冲液(1×PBS、1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.3mg/ml PMSF+2μg/ml Aprotinin)，将所得混合物在冰上静置30分钟。通过离心作用(4℃，15000g，20分钟)收集上清液。采用DC-蛋白测定(Bio-RadLaboratories，Inc.)通过Lowry法测定蛋白浓度。

通过蛋白印迹检测Bcl-xL或GAPDH。通过SDS-PAGE使从所述细胞中萃取的蛋白显影并进行蛋白印迹。采用第一抗体Anti-Bcl-xL(SC-634)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)(1/500)和第二抗体羊抗兔IgG(H+L)-HRP结合体(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(1/2000)。采用ECL Plus(GE Healthcare)(商标))显现颜色并采用LAS3000(FUJI FILM)检测。同样，采用第一抗体Anti-GAPDH(MAB374)(Chemicon International，Inc.)(1/2000)和第二抗体羊抗鼠IgG(H+L)-HRP结合体(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(1/2000)对GAPDH进行蛋白印迹。这些结果展示Bcl-xL敲落受到所述HeLa细胞中L7Ae蛋白和shRNA-Box C/D-Bcl-xL之间的结合的抑制(泳道5)。图17显示了细胞内Bcl-xL表达。还确认了用作标准对照物的GAPDH的蛋白表达水平没有变化。将检测的Bcl-xL谱带的强度加起来。结果显示于图18中。在图18中，泳道3-6中的sh是“shRNA”的缩写。

[通过应答L7Ae蛋白的Bcl-xL表达水平控制的细胞死亡控制的实验]

凋亡促进蛋白Bim-EL和凋亡抑制蛋白Bcl-xL相互具有对抗作用且相对较大量的蛋白影响细胞的命运。因此，进行实验，所述实验包括采用培养的人癌细胞中L7Ae蛋白和shRNA-BoxC/D-Bcl-xL之间的结合对Bcl-xL敲落的控制来控制Bcl-xL表达水平和通过改变Bcl-xL与Bim-EL的相对量来控制细胞死亡。

在前一天，将子宫颈癌衍生的HeLa细胞以0.5x10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板上并在37℃的CO₂培养箱中培养。第二天，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)(商标)进行转染。向0.3μgpENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-Bcl-xL中加入0.2μg pBcl-xL、0.2μg pBimEL和0.2μg pcDNA3.1-AsRed2-L7Ae并与培养基混合，向其中加入1.25μl Lipofectamine 2000。将这些DNA-脂质复合体在室温培育20分钟并逐滴加入HeLa细胞的培养基中。约4小时后，更换培养基。就pcDNA3.1(+)myc His A载体(Invitrogen Corp.，对照载体)、pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-mut Bcl-xL、pENTR/H1/TO-shRNA-Bcl-xL和pENTR/H1/TO-shRNA-GFP mut(阴性对照)而言，也进行相同步骤。

转染24小时后，收集各孔中的培养基。接着，采用200μl胰蛋白酶-EDTA将所述细胞解离并通过加入上一步骤中收集的各培养基使之悬浮。使所得细胞悬浮液以500xg在4℃离心沉淀3分钟并用300μl PBS洗涤。接着，向所述细胞沉淀中加入3μl膜联蛋白V、流式细胞术的Pacific Blue结合体(Invitrogen Corp.)和50μl膜联蛋白结合缓冲液(10mM HEPES，140mM NaCl，2.5mM CaCl₂，pH 7.4)的混合溶液。轻拍后，将所得混合物在室温静置30分钟进行染色。接着，通过加入200μl膜联蛋白结合缓冲液使各样品悬浮。将所得细胞悬浮液转移到FACS管中并采用FAC SAria(BD)分析。本文中，对30000细胞进行测定。为了进行分析，首先，对发出归因于AsRed2-L7的红色荧光的细胞进行门控，采用激发波长为405nm和荧光波长为430-470nm的过滤器测定所述门内细胞的衍生自Pacific Blue的蓝色荧光强度。测定这种荧光强度大于参照的细胞的数量之比。作为用于确定细胞死亡的参照，对磷脂酰丝氨酸(其为以死亡细胞的外膜特异性方式存在的脂质)用膜联蛋白V和流式细胞术的Pacific Blue结合体(Invitrogen Corp.)染色，将其中蓝色荧光强度大于以相同方式染色的未处理细胞样品的上限的细胞作为死亡细胞计数。

结果，包含对照载体(pcDNA3.1(+)myc His A载体)的样品的死亡细胞比为8.3％，包含pENTR/H1/TO-shRNA-GFP mut(阴性对照)的样品的死亡细胞比为10.1％，包含pENTR/H1/TO-shRNA-BoxC/D-Bcl-xL的样品的死亡细胞比为13.4％。而包含pENTR/H1/TO-shRNA-Bcl-xL的样品的死亡细胞比为34.5％，包含pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-mut Bcl-xL的样品的死亡细胞比为42.5％。图17和18中显示的此实验结果和Bcl-xL检测结果展示其中Bcl-xL表达水平受到敲落抑制的细胞比保持Bcl-xL表达的细胞多死亡约3-4倍。从显示包含pENTR/H1/TO-shRNA-BoxC/D-Bcl-xL的样品的死亡细胞比为13.4％而包含pENTR/H1/TO-shRNA-Box C/D-mut Bcl-xL的样品的死亡细胞比为42.5％的结果，还确认了可通过由L7Ae以Box C/D序列特异性方式抑制Bcl-xL蛋白敲落来抑制性控制细胞死亡。

工业实用性

根据本发明采用RNP基序的蛋白应答shRNA和RNAi控制体系，传感shRNA和特异性结合到其上的蛋白能控制RNAi并因此可用于构建生物传感器，用于将细胞内标记蛋白的表达定量而不破坏响应标记蛋白的表达水平而激活目的蛋白的翻译的细胞或人工基因回路。例如，本发明产生了显著的效果，导致通过响应癌细胞标记蛋白的表达而激活凋亡诱导蛋白来治疗疾病如癌或阿尔茨海默氏病或作为开发蛋白药物的基础技术。