CN115485385A - 用于使肿瘤细胞对免疫疗法敏感的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本文提供了与通过向受试者施用抑制自噬的药剂来治疗或预防癌症(例如,通过靶向患有癌症的受试者的肿瘤)相关的方法和组合物。在某些方面,本文提供了使癌细胞对肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)介导的杀伤敏感的方法,及相关的组合物的方法,通过将所述癌细胞接触或施用抑制自噬的药剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月4日提交的以下美国临时申请第62/985,004号的权益,所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用整体并入的序列表。创建于2021年3月3日的所述ASCII副本命名为RPB-02025_SL.txt并且大小为14,383字节。
背景技术
癌症是美国第二大最常见的死亡原因。虽然免疫疗法已经改变了癌症的治疗,但肿瘤细胞对这些治疗方法的抗性提出了实质性挑战。例如,肿瘤细胞中的β-2-微球蛋白(B2M)或JAK1/JAK2的功能缺失突变与对检查点阻断的临床抗性相关。重要的是,控制肿瘤细胞对T细胞杀伤的敏感性的分子机制仍有待完全表征。因此,仍然需要用于新的且有效的癌症治疗,包括增加癌细胞对T细胞杀伤的敏感性的治疗。
发明内容
本文提供了用于通过自噬和/或NF-κB通路的抑制增加癌细胞对T细胞杀伤(例如,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤)的敏感性的方法和组合物。本文还提供了用于通过抑制癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路增加受试者(例如,有需要的受试者)的癌细胞对T细胞杀伤(例如,TNF-α介导的杀伤)的敏感性来治疗和/或预防受试者的癌症的方法和组合物。在一些实施例中,本文所提供的方法进一步包括向所述受试者施用癌症疗法(例如,癌症免疫疗法)。
在一些方面,本文提供了通过使所述癌细胞与抑制所述癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,至少一种本文所公开的药剂)接触来使癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感的方法。在某些方面,本文提供了通过向受试者施用抑制所述癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的至少一种药剂(例如,本文所公开的药剂)来增加对所述受试者的癌细胞的TNF-α介导的杀伤的方法。在一些实施例中,所述癌细胞在受试者体内。在一些实施例中,所述癌细胞在肿瘤内(例如,受试者的实体瘤)。在某些实施例中,所述方法进一步包括向所述受试者施用癌症疗法(例如,癌症免疫疗法)。
在一些实施例中,所述药剂通过抑制自噬基因(即,编码产物的基因,所述产物在被抑制时会使细胞中的自噬水平降低)的表达或活性来抑制自噬。在一些实施例中,所述药剂靶向所述自噬基因(例如,所述药剂修饰所述自噬基因的序列)。在某些实施例中,所述药剂靶向所述自噬基因的产物(例如,由所述自噬基因编码的RNA或蛋白质)。在一些实施例中,所述自噬基因可以选自ATG12、WIPI2、RB1CC1、PIK3C3、ATG9A、ATG2A、ATG5、ATG14、EI24、NRBF2、ATG13、TAX1BP1和ATG10。
在一些实施例中,所述药剂通过抑制NF-κB通路基因的表达或活性来抑制所述NF-κB通路。在一些实施例中,所述药剂靶向所述NF-κB通路基因本身(例如,所述药剂修饰所述NF-κB通路基因的序列)。在某些实施例中,所述药剂靶向所述NF-κB通路基因的产物(例如,由所述NF-κB通路基因编码的RNA或蛋白质)。在某些实施例中,所述NF-κB基因可以选自CFLAR、UBE2L3、RNF31、IKBKB、MAP3K7、TAB1、RELA、IKKBKG、CHUK、TAB2、TBK1、MAPKAPK2、RBCK1、TRAF2、SHARPIN和TNFAIP3。
因此,在某些实施例中,所述药剂可以修饰至少一个自噬基因或NF-κB基因,其中对所述至少一个自噬基因和/或NF-κB的修饰导致自噬基因产物和/或NF-κB基因产物的表达和/或活性降低。在某些实施例中,对所述自噬基因或NF-κB基因的修饰可以包括缺失、插入、置换或其组合。在某些实施例中,所述药剂可以是CRISPR/Cas药剂、TALEN核酸酶或锌指核酸酶。
在某些实施例中,所述药剂抑制由自噬基因或NF-κB基因编码的RNA或蛋白质的活性和/或降低其水平。在一些实施例中,所述药剂可以是靶向由自噬基因或NF-κB基因编码的RNA(例如,mRNA)的干扰核酸,例如,siRNA、shRNA、miRNA或反义寡核苷酸。在一些实施例中,所述药剂是自噬或所述NF-κB通路的小分子抑制剂。
在某些实施例中,本文所提供的方法进一步包括向所述受试者施用另外的抗癌疗法。在一些实施例中,所述另外的抗癌疗法是癌症免疫疗法。在一些实施例中,所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用自体或同种异体T细胞疗法;施用自体或同种异体CAR T细胞疗法;向所述受试者施用癌症疫苗;向所述受试者施用TNF-α和/或向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。在一些实施例中,所述另外的抗癌疗法包括向所述受试者施用Smac模拟物(例如,LCL-161、APG-1387、TL32711、GDC-0917、HGS1029、AT-406)。
在某些方面,本文提供了抑制癌细胞中的自噬的药剂,所述药剂用于使受试者的癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感。另外,在一些方面,本文提供了抑制癌细胞中的自噬的药剂,所述药剂用于增加对受试者中TNF-α介导的癌细胞的杀伤。在一些方面,本文提供了组合疗法,所述组合疗法包括抑制癌细胞中的自噬的药剂以及癌症免疫疗法,所述组合疗法用于治疗癌症。
附图说明
图1有A至G七个部分并且显示全基因组CRISPR KO筛选鉴定调节细胞毒性T细胞进行的杀伤的肿瘤细胞基因。A部分示出了混合的CRISPR筛选的示意图。将用小鼠GeCKOsgRNA文库修饰的MC38癌细胞用Ova或打乱的对照肽进行脉冲处理,并且然后与激活的Ova特异性细胞毒性T细胞一起培养。T细胞杀伤后,通过依诺米那测序(Illumina sequencing)来评估存活肿瘤细胞中的sgRNA代表性。进行三次生物学重复(B、D、F部分)。火山图示出了促进(富集的sgRNAs)或限制(耗尽的sgRNAs)肿瘤细胞杀伤的基因。B部分突出了促进杀伤的所关注基因(例如,抗原呈递、TNFα信号传导、mTOR信号传导)。D和F部分突出了限制杀伤的所关注基因(例如,NF-κB通路、自噬)。X轴示出了Z评分(由与用打乱的肽脉冲处理的细胞相比,在用Ova脉冲处理的细胞中靶向每个基因的6个sgRNA的平均log2变化倍数计算)。Y轴示出了由MAGeCK计算的P值(C、E、G部分)。文库中的所有129,209个sgRNA的log2变化倍数的分布(频率直方图)。靶向所关注基因的单独sgRNA由图C中的斜线以及E和G部分中的斜线表示。
图2有A至G七个部分并且显示TNFα介导的细胞凋亡是T细胞进行的肿瘤细胞杀伤的重要组成部分。A部分示出了TNFα/NF-κB信号传导的简化模型。B部分显示将对照(MC38-mGeCKO)或B2m KO细胞用Ova肽进行脉冲处理并且在存在10μg/ml TNFα阻断抗体或同种型对照的情况下与来自OT-1小鼠的T细胞一起孵育。24小时后测量细胞活力。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。**P<0.005,***P<0.0005,****P<0.0001,对MC38-mGeCKO+对照Ab,单向方差分析与图基多重比较检验(Tukey's multiple comparisons test)。+P<0.05,对MC38-B2m KO+对照Ab。C部分示出了胱天蛋白酶抑制(25μM z-VAD-FMK)、Tnfrsf1a KO、Fadd KO或Ripk1 KO对用10ng/ml TNFα处理24小时的MC38细胞的活力的影响。条形图示出了相对细胞活力±SD(n=3)。证实靶蛋白耗尽的蛋白质印迹如下图所示。*指示测定中使用的Ripk1 KO。D部分显示将所指示浓度的TNFα添加到肿瘤细胞系中并在24小时后测量细胞活力,n=3。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在向每个细胞系添加10ng/ml TNFα后24小时所指示蛋白质的水平。F和G部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在用10ng/ml TNFα处理所指示时间后MC38或B16F10细胞中所指示蛋白质的水平。
图3有A至G七个部分并且显示NF-κB信号传导限制T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Map3k7靶向的sgRNA的细胞(sg5和sg3在筛选中被最显著地耗尽;sg1被最不显著地耗尽)中的Map3k7(又名Tak1)和β-肌动蛋白水平。B部分显示将对照或Map3k7KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。**P<0.005,***P<0.0005,****P<0.0001,对亲本MC38细胞,单向方差分析(ANOVA)与图基多重比较检验(Tukey’s multiple comparisons test)。++P<0.005,++++P<0.0001,对Map3k7sg5。C部分显示在存在20μg/ml TNFα阻断抗体的情况下对所指示细胞系进行T细胞杀伤。D部分显示用所指示浓度的TNFα处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/ml TNFα处理后2小时所指示蛋白质的水平。F和G部分显示用所指示量的多柔比星或紫杉醇处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。
图4有A至F六个部分并且显示自噬限制T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rb1cc1靶向的sgRNA的细胞(sg4和sg5在筛选中被耗尽得最显著;sg3被耗尽得最不显著)中的Rb1cc1和β-肌动蛋白水平。B部分显示将对照或Rb1cc1 KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。**P<0.005,****P<0.0001,对亲本MC38细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。++++P<0.0001,对Rb1cc1 sg4。C部分显示在存在20μg/ml TNFα阻断抗体的情况下对所指示细胞系进行T细胞杀伤。*P<0.05,***P<0.0005,对亲本MC38细胞。D部分显示用所指示浓度的TNFα处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力。E和F部分显示用所指示量的多柔比星或紫杉醇处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。
图5有A至I九个部分并且显示对自噬的抑制增强TNFα介导的胱天蛋白酶-8激活,与NF-κB信号传导的影响无关。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/mlTNFα处理后4小时在对照或Rb1cc1 KO MC38细胞中所指示蛋白质的水平。B部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/ml TNFα处理后30分钟(Ik-Bα)或4小时(A20)在对照或Rb1cc1 KO细胞中所指示蛋白质的水平的。C部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在对照或Map3k7(Tak1)KO细胞中所指示蛋白质的水平。D部分显示在存在或不存在25μM z-VAD-FMK(胱天蛋白酶抑制剂)的情况下,将可溶性TNFα添加到Rb1cc1 KO细胞中24小时。条形图示出了与对照细胞(无TNFα,无胱天蛋白酶抑制剂)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。通过单向方差分析与图基多重比较检验对各组进行比较。E部分示出了在不存在或存在5μM奥托非尼的情况下,MC38细胞未处理或用10ng/ml TNFα处理16小时。条形图示出了与对照细胞(无TNFα,无奥托非尼)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。F部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在未处理或在不存在或存在5μM奥托非尼的情况下用10ng/mlTNFα处理30分钟(Ik-Bα)或4小时(胱天蛋白酶-8,p62)的细胞中所指示蛋白质的水平。G部分显示对照、Tnfrsf1a KO、Fadd KO或Ripk1 KO细胞未经处理或在不存在或存在5μM奥托非尼或1μM LCL-161(Smac模拟物)的情况下用10ng/ml TNFα处理24小时。条形图示出了与对照细胞(不具有TNFα或抑制剂的空载体细胞)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。****P<0.0001,对用TNFα处理的空载体细胞。H部分显示在不存在或存在50μM Nec-1(坏死性凋亡抑制剂)的情况下,将TNFα添加到Rb1cc1 KO细胞中24小时。条形图示出了与对照细胞(无TNFα,无胱天蛋白酶抑制剂)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。I部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了L929小鼠成纤维细胞系和MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rb1cc1靶向的sgRNA的细胞中的磷酸化-MLKL、总MLKL和β-肌动蛋白水平。在存在或不存在10ng/ml TNFα、50μM Nec-1和20μM Z-VAD-FMK的情况下,将细胞处理30分钟。
图6有A至G七个部分并且显示肿瘤细胞中的mTOR信号传导是TNFα和T细胞介导的最大杀伤所需的。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用空载体转导的MC38细胞或表达Mlst8靶向的sgRNA的细胞(sg4和sg1在筛选中被富集得最显著;sg3被富集得最不显著)中所指示蛋白质的水平。B部分显示对照或Mlst8 KO细胞未经处理或用10ng/ml TNFα处理24小时。条形图示出了与对照细胞(无TNFα)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。*P<0.05,**P<0.005,对用TNFα处理的空载体细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。C部分显示将对照或Mlst8 KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞孵育24小时。条形图示出了与对照细胞(无T细胞)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。*P<0.05,**P<0.005,对与T细胞一起孵育的空载体细胞。D部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在用200nM雷帕霉素处理所指示时间的MC38细胞中所指示蛋白质的水平。E部分显示用媒剂或200nM雷帕霉素预处理的孔然后未经处理或用10ng/ml TNFα处理24小时。条形图示出了与对照细胞(媒剂,无TNFα)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。F部分显示将用媒剂或雷帕霉素预处理的细胞用打乱的对照肽或Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞孵育24小时。条形图示出了与对照细胞(无T细胞,打乱的肽)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。G部分示出了描绘了调节T细胞杀伤的肿瘤细胞通路的图。
图7有A至F六个部分并且显示自噬限制了CD3双特异性抗体诱导的对人癌细胞的的杀伤。A部分显示人ZR-75-1乳腺癌细胞未经处理或在不存在或存在5μM奥托非尼或SAR-405的情况下用10ng/ml TNFα处理24小时。条形图示出了与对照细胞(媒剂,无TNFα)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。通过单向方差分析与图基多重比较检验对各组进行比较。B部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在不存在或存在10ng/ml TNF****的情况下,用5μM奥托非尼或SAR-405处理ZR-75-1细胞16小时后所指示蛋白质的水平。D部分显示在不存在或存在5μM SAR-405的情况下,将ZR-75-1细胞与激活的人T细胞在存在12ng/ml对照或乳腺肿瘤抗原x CD3(TAAxCD3(在C部分中展示)双特异性抗体的情况下以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与对照细胞(无T细胞,对照双特异性抗体)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了ZR-75-1对照或Rb1cc1 KO细胞中所指示蛋白质的水平。F部分显示将ZR-75-1对照或Rb1cc1 KO细胞与如上所述的T细胞加双特异性抗体一起孵育。条形图示出了与对照细胞+对照bsAb相比的相对细胞活力±SD(n=3)。**P<0.005,对对照细胞。****P<0.0001,对对照细胞+CD3 bsAb。++++P<0.0001,对Rb1cc1 KO+CD3 bsAb。
图8有A至G七个部分并且显示自噬的失活使肿瘤对免疫疗法敏感。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在EMT6对照(非靶向性sgRNA)或Rb1cc1 KO细胞中所指示蛋白质的水平。B部分显示用10ng/ml TNFα处理EMT6对照或Rb1cc1 KO细胞,并且在24小时后测量活力。条形图示出了与对照细胞(对照,无TNFα)相比的相对细胞活力±SD(n=3)。通过单向方差分析与图基多重比较检验对各组进行比较。C部分显示将EMT-6细胞(对照或Rb1cc1 KO)植入到Balb/c小鼠中。植入后三天,将小鼠用同种型对照或PD-1加CTLA-4阻断抗体进行处理,如所述方法中所描述(n=10只小鼠/组)。线形图描绘了每个组的平均肿瘤体积±SEM。通过双向方差分析与图基多重比较检验对各组进行比较。D部分示出了每只小鼠的单独的肿瘤生长曲线。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38对照(非靶向性sgRNA)或Rb1cc1 KO细胞中所指示蛋白质的水平。F部分显示将MC38细胞(对照或Rb1cc1 KO)植入到C57/BL6小鼠中。当肿瘤为约70mm3时,将小鼠随机分组(7-12只小鼠/组)并且用同种型对照或PD-1加CTLA-4阻断抗体进行处理。线形图描绘了每个组的平均肿瘤体积±SEM。通过双向方差分析与图基多重比较检验对各组进行比较。G部分示出了每只小鼠的单独的肿瘤生长曲线。
图9有A至C三个部分并且涉及用于优化CRISPR KO筛选条件的B2M敲除细胞的使用。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了感染靶向B2M的pLenti-Cas9-Blast和pLenti-guide-puro的MC38细胞中的B2M蛋白水平。B部分示出了被修饰以表达mGeCKO文库或b2M KO细胞+/-10ng/ml IFNg处理24小时的MC38细胞中H2-Kb细胞表面表达的FACS分析。C部分示出了用Ova或打乱的肽脉冲处理的MC38-Cas9-mGeCKO细胞和用Ova肽脉冲处理的MC38-Cas9-B2M敲除细胞的T细胞杀伤测定。将从OT-1小鼠中分离的CD8+T细胞以所指示的E:T比率与细胞一起孵育,24小时后测量活力。
图10显示在整个CRISPR KO筛选中,文库的代表性被充分维持,从而允许检测耗尽的以及富集的sgRNA。在T细胞杀伤后,在用打乱的和用Ova脉冲处理的肿瘤细胞中,Log2归一化的sgRNA计数,R2=0.95。
图11具有两个部分A至B并且显示针对MC38细胞中的生长调节剂的CRISPR KO筛选鉴定了高比例的核心必需基因。与参考对照细胞(在选择文库感染的细胞之后立即收获)相比,在传代12次倍增的MC38-mGeCKO细胞中Log2归一化的sgRNA计数。A部分示出了非靶向性sgRNA。与参考对照相比,仅5/1000个非靶向性sgRNA显著富集或耗尽超过2倍。B部分示出了靶向以红色显示的核心必需基因的sgRNA。将96%的核心必需基因(102/106)鉴定为命中(定义为至少2个sgRNA耗尽>2倍)。对于超过85%的核心必需基因,至少四个sgRNA被耗尽。
图12显示自噬基因的遗传敲除不抑制MC38细胞的生长。在MC38亲本细胞、表达空载体的细胞或表达靶向多个sgRNA的所指示的自噬基因的细胞中12次群体倍增之后的活力测定。
图13显示预激活的T细胞的细胞毒性功能不受TNFα阻断的限制。在存在20μg/mlTNFα阻断抗体或同种型对照抗体的情况下,将MC38(TNFα敏感)或B16F10(TNFα抗性)细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与来自OT-1小鼠的T细胞以所指示的E:T比率孵育。24小时后测量细胞活力。条形图示出了与没有T细胞孵育的肿瘤细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。*P<0.05,***P<0.0005,对具有对照抗体的MC38细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。
图14显示NF-κB信号传导通路在对TNFα介导的杀伤具有抗性的细胞系中是有活性的。蛋白质印迹示出了在用10ng/ml TNFα处理所指示时间后EMT6或4T1细胞中所指示蛋白质的水平。
图15具有A至G七个部分并且显示Rbck1 KO增加了T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rbck1靶向的sgRNA的细胞(sg5和sg1在筛选中被最显著地耗尽;sg3被最不显著地耗尽)中的Rbck1和β-肌动蛋白水平。B部分显示将对照或Rbck1KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。****P<0.0001,对亲本MC38细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。++++P<0.0001,对Rbck1 sg5。C部分显示在存在20μg/ml TNFα阻断抗体的情况下对所指示细胞系进行T细胞杀伤。*P<0.05,对亲本MC38细胞。D部分显示用所指示浓度的TNFα处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/ml TNFα处理后2小时所指示蛋白质的水平。F和G部分显示用所指示量的多柔比星或紫杉醇处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。
图16具有A至G七个部分并且显示Rela KO增加了T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rela靶向的sgRNA的细胞(sg2和sg3在筛选中被最显著地耗尽;sg6被最不显著地耗尽)中的Rela和β-肌动蛋白水平。B部分显示将对照或Rela KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。**P<0.005,****P<0.0001,对亲本MC38细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。++P<0.005,+++P<0.0005,对Rela sg2。C部分显示在存在20μg/ml TNFα阻断抗体的情况下对所指示细胞系进行T细胞杀伤。D部分显示用所指示浓度的TNFα处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/ml TNFα处理后2小时所指示蛋白质的水平。F和G部分显示用所指示量的多柔比星或紫杉醇处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。
图17具有A至G七个部分并且显示Atg9a KO增加了T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Atg9a靶向的sgRNA的细胞(sg2和sg1在筛选中被最显著地耗尽;sg4被最不显著地耗尽)中的Atg9a和β-肌动蛋白水平。B部分显示将对照或Atg9a KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。**P<0.005,***P<0.0005,****P<0.0001,对亲本MC38细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。+P<0.05,++++P<0.0001,对Atg9a sg2。C部分显示在存在20μg/ml TNFα阻断抗体的情况下对所指示细胞系进行T细胞杀伤。*P<0.05,**P<0.005,***P<0.0005,对亲本MC38细胞。+P<0.05,对Atg9asg2。D部分显示用所指示浓度的TNFα处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/ml TNFα处理后8小时所指示蛋白质的水平。F部分显示用所指示量的多柔比星或紫杉醇处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。
图18具有A至G七个部分并且显示Atg12 KO增加了T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Atg12靶向的sgRNA的细胞(sg3和sg5在筛选中被最显著地耗尽;sg6被最不显著地耗尽)中的Atg12和β-肌动蛋白水平。B部分显示将对照或Atg12KO细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且与OT-1T细胞以所指示的E:T比率孵育24小时。条形图示出了与在不存在T细胞的情况下孵育的细胞相比的相对细胞活力±SD(n=3)。****P<0.0001,对亲本MC38细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。C部分显示在存在20μg/ml TNFα阻断抗体的情况下对所指示细胞系进行T细胞杀伤。**P<0.005,***P<0.0005,对亲本MC38细胞。D部分显示用所指示浓度的TNFα处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。E部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了用10ng/ml TNFα处理后8小时所指示蛋白质的水平。F和G部分显示用所指示量的多柔比星或紫杉醇处理细胞,并且在24小时后测量细胞活力,n=3。
图19具有A至B两个部分并且显示Rb1cc1和Atg12 KO细胞展现出受损的自噬活性。A部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rb1cc1靶向的sgRNA的MC38-Cas9细胞中的LC3B和β-肌动蛋白水平(Rb1cc1 sg3在耗尽Rb1cc1蛋白方面不如sg4或sg5有效,参见图4)。B部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Atg12靶向的sgRNA的MC38-Cas9细胞中的LC3B和β-肌动蛋白水平。将细胞用10μg/ml胃酶抑素A和10μg/ml E-64-D处理4小时以抑制溶酶体蛋白酶,这导致LC3B-II积累,除非在上游抑制自噬。LC3B-II代表蛋白质的脂化形式(与磷脂酰乙醇胺缀合)。
图20显示自噬的失活不损害TNFα介导的NF-κB靶基因的诱导。对照或Rb1cc1 KOMC38细胞未经处理或用10ng/ml TNFα处理4小时。然后在小鼠细胞因子阵列上测定细胞裂解物,以确定40种小鼠细胞因子的水平。标记被TNFα上调的细胞因子。
图21具有A至C三个部分并且显示自噬的药理学阻断使人癌细胞对TNFα介导的杀伤和TRAIL介导的杀伤敏感。A部分显示HCT-116人结肠癌细胞未经处理或在不存在或存在5μM奥托非尼的情况下用10ng/ml TNFα或10ng/ml TRAIL处理。24小时后测量细胞活力。B部分显示HeLa人宫颈癌细胞未经处理或在不存在或存在5μM奥托非尼的情况下用50ng/mlTRAIL处理。24小时后测量细胞活力。条形图示出了相对细胞活力±SD(n=3)。通过单向方差分析与图基多重比较检验对处理组进行比较。C部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在不存在或存在5mM奥托非尼的情况下,用10ng/ml TNFa或10ng/m Trail处理后24小时HCT-116细胞中所指示蛋白质的水平。D部分示出了蛋白质印迹,所述蛋白质印迹示出了在不存在或存在5μM奥托非尼的情况下,用50ng/ml TRAIL处理后24小时HeLa细胞中所指示蛋白质的水平。E部分是总结了针对未经处理或在不存在或存在5μM SAR405或奥托非尼的情况下用10ng/ml TNFα或10ng/ml TRAIL处理的MC38细胞观察到的结果的图。24小时后测量细胞活力。F部分是总结了针对未经处理或在不存在或存在5μM SAR405或奥托非尼的情况下用10ng/ml TNFα或10ng/ml TRAIL处理的EMT6细胞的结果的图。24小时后测量细胞活力。条形图示出了相对细胞活力±SD(n=3)。****P<0.0001,对未经处理的细胞,单向方差分析与图基多重比较检验。
图22具有A至B两个部分并且显示自噬的药理学阻断使若干小鼠和人癌细胞系对TNFα介导的杀伤敏感。A部分显示小鼠肿瘤细胞系(EMT6、LL/2、CT26、Colon26)未经处理或在不存在或存在5μM奥托非尼的情况下用10ng/ml TNFα处理,并且在24小时后测量细胞活力。B部分显示人肿瘤细胞系(BT-20、Me-180、MDA-MB-361)未经处理或在不存在或存在5μM奥托非尼或5μM SAR-405的情况下用10ng/ml TNFα处理,并且在24小时后测量细胞活力。条形图示出了相对细胞活力±SD(n=3)。通过单向方差分析与图基多重比较检验对处理组进行比较。
图23具有A至B两个部分并且显示MC38细胞中的自噬基因的KO不影响细胞表面MHC-I水平或OVA肽的呈递。A部分示出了流式细胞术直方图,所述流式细胞术直方图示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rb1cc1、Atg9a或Atg12靶向的sgRNA的细胞中的MHC-1(H2-kb)细胞表面表达。B部分示出了流式细胞术直方图,所述流式细胞术直方图示出了MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rb1cc1靶向的sgRNA的细胞中的MHC-1(H2-kb)–Ova(SIINFEKL)表达。如所指示的,将细胞在染色之前用Ova(SIINFEKL)肽或打乱的肽进行脉冲处理。
图24显示自噬的激活不会增加关键TNFα通路组分的水平。蛋白质印迹示出了在用10ng/ml TNFα处理30分钟后MC38亲本细胞(模拟物)、用空载体转导的MC38-Cas9细胞或表达Rb1cc1靶向的sgRNA的细胞中所指示蛋白质的水平。
图25显示早期用PD-1/CTLA-4抗体处理MC38肿瘤导致完全肿瘤消退。将MC38细胞植入到C57/BL6小鼠中。植入后三天,将小鼠用同种型对照或PD-1加CTLA-4阻断抗体进行处理。示出了每只小鼠的单独的肿瘤生长曲线,n=15。
图26显示肿瘤中的自噬的遗传失活影响白细胞浸润。描绘了MC38和EMT6亲本或Rb1cc1 KO肿瘤中的CD45+、CD3+、CD4+和CD8+细胞的流式细胞术分析。图示出了具有所指示的中值的单独肿瘤(n=4)。通过单向方差分析与图基多重比较检验对各组进行比较。
具体实施方式
总述
本文中的公开内容部分地基于以下发现:抑制自噬通路,包括抑制自噬起始、转移膜材料或自噬体扩增,使癌细胞对TNFα介导的杀伤(例如,通过T细胞)敏感。另外,诸位申请人已经在本文中表明,抑制NF-κB通路使癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感。值得注意的是,如本文所示,对自噬的遗传抑制使肿瘤细胞在体内对T细胞介导的杀伤敏感。申请人在本文中表明,自噬通路和NF-κB通路是免疫疗法反应性的重要调节剂,并且抑制这些通路增强癌症疗法,尤其是T细胞定向疗法的功效。
因此,在某些方面,本文提供了通过使所述癌细胞与抑制所述癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)接触来使癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感的方法。在一些方面,本文提供了通过向受试者施用抑制癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)来使所述受试者的癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感的方法。
在其它方面,本文提供了通过向受试者施用抑制所述癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的至少一种药剂(例如,本文所公开的药剂)来增加对所述受试者的癌细胞的TNF-α介导的杀伤的方法。
在另外的方面,本文所述的方法包括通过向受试者施用抑制所述受试者的肿瘤中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)来使所述肿瘤对TNF-α介导的杀伤敏感或增加所述肿瘤的TNF-α介导的杀伤的方法。本文还提供了通过向受试者施用抑制所述受试者的癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)并且向所述受试者施用诱导TNF-α介导的杀伤的第二药剂如癌症免疫疗法来治疗受试者的癌症的方法。
定义
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用于指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即,至少一个)。举例来说,“要素”意指一个要素或多于一个要素。
术语“药剂”在本文中用于表示化合物、小分子、化合物混合物、生物大分子(如核酸(例如,干扰核酸)、抗体、抗体片段、蛋白质、肽)、生物大分子混合物和/或其组合。在某些实施例中,本文中的药剂是包含CRISPR/Cas系统的组分的组合物。此类药剂的活性可以使其适合作为“治疗剂”,所述治疗剂是在受试者中局部或全身地起作用的一种或多种生物学上、生理学上或药理学上的活性物质。
如本文所使用的,“自噬基因”是编码产物的基因,所述产物在被抑制时使细胞中的自噬水平降低。
如本文所使用的,术语“癌症”包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语癌症包括皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步涵盖原发性和转移性癌症。
“密码子优化”利用密码子的简并性,如指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性所展示的,并且通常包括通过用宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子置换天然序列的至少一个密码子同时维持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以在特定宿主细胞中增强表达的过程。例如,与天然存在的核酸序列相比,可以修饰编码Cas9蛋白的多核苷酸以取代在给定的原核或真核细胞中具有较高使用频率的密码子,所述原核或真核细胞包括细菌细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或任何其它宿主细胞。密码子使用表例如在“密码子使用数据库”处很容易获得。这些表可以通过多种方式进行修改。参见Nakamura等人(2000)《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》28:292,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。也可获得用于在特定宿主中表达的特定序列的密码子优化的计算机算法(参见例如,《基因伪造(GeneForge)》)。
核酸的“互补性”意味着由于其核碱基团的取向,一条核酸链中的核苷酸序列与另一条相对核酸链上的序列形成氢键。DNA中的互补碱基通常是A与T和C与G。在RNA中,互补碱基通常是C与G和U与A。互补可以是完美的或者实质性的/足够的。两个核酸之间的完美互补意味着所述两个核酸可以形成双链体,其中双链体中的每个碱基都通过沃森-克里克配对(Watson-Crick pairing)与互补碱基键合。“实质性”或“足够”互补意味着一条链中的序列与相对链中的序列不完全和/或完全互补,但两条链上的碱基之间发生足够的键合以在一组杂交条件下形成稳定的杂合复合物(例如,盐浓度和温度)。此类条件可以通过使用序列和标准数学计算来预测杂交链的Tm(熔融温度),或通过使用常规方法的Tm经验确定来预测。Tm包括在两条核酸链之间形成的杂交复合物群体50%变性(即,双链核酸分子群体半解离成单链)时的温度。在低于Tm的温度下,有利于杂交复合物的形成,而在高于Tm的温度下,有利于杂交复合物中的链的熔融或分离。可以通过使用例如Tm=81.5+0.41(%G+C)来估计在1M NaCl水溶液中具有已知G+C含量的核酸的Tm,尽管其它已知的Tm计算考虑了核酸结构特性。
如本文所使用的,短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何施用形式,使得在先前施用的治疗剂在体内仍然有效时施用第二药剂(例如,两种药剂在受试者体内是同时有效的,这可能包括两种药剂的协同效应)。
术语“基因”是指染色体中编码产物(例如,RNA产物和/或多肽产物)并且包括编码区、中断编码区的任何非编码内含子和定位于5'末端和3'末端两者上与编码区相邻而使得基因与全长mRNA(包括5'和3'非翻译序列)相对应的序列的DNA序列。术语“基因”还包括其它非编码序列,包括调控序列(例如,启动子、增强子和转录因子结合位点)、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、沉默子、绝缘序列和基质附着区。这些序列可以靠近基因的编码区(例如,在10kb内)或处于远处的位点,并且所述序列影响基因的转录和翻译的水平或速率。
“向导RNA”或“gRNA”是与Cas蛋白(例如,Cas9蛋白)结合并将Cas蛋白靶向靶DNA内的特定位置的RNA分子。向导RNA可以包括两个区段:“DNA靶向区段”和“蛋白质结合区段”。“区段”包括分子的一部分或区域,如RNA中的核苷酸的连续段。一些gRNA,如用于Cas9的gRNA,可以包括两个单独的RNA分子:“激活子-RNA”(例如,tracrRNA)和“靶向子-RNA”(例如,CRISPR RNA或crRNA)。其它gRNA是单个RNA分子(单个RNA多核苷酸),所述单个RNA分子也可以被称为“单分子gRNA”、“单向导RNA”或“sgRNA”。参见例如WO 2013/176772、WO 2014/065596、WO 2014/089290、WO 2014/093622、WO 2014/099750、WO 2013/142578和WO 2014/131833,所述文献中的每个专利出于所有目的通过引用整体并入本文。例如,对于Cas9,单向导RNA可以包括(例如,通过连接子)与tracrRNA融合的crRNA。例如,对于Cpf1,只需要crRNA就可以实现与靶序列的结合。术语“向导RNA”和“gRNA”包括双分子(即,模块化)gRNA和单分子gRNA两者。
如本文所使用的,术语“向导RNA靶序列”具体指非互补链上的与向导RNA在互补链上与其杂交的序列相对应(即,其反向补体)的序列。也就是说,向导RNA靶序列是指非互补链上的与PAM相邻(例如,在Cas9的情况下,PAM的上游或5')的序列。向导RNA靶序列等同于向导RNA的DNA靶向区段,但具有胸腺嘧啶而不是尿嘧啶。举例来说,SpCas9酶的向导RNA靶序列可以指非互补链上的5'-NGG-3'PAM上游的序列。
术语“脂质颗粒”包括脂质调配物,所述脂质调配物可以用于将治疗性核酸(例如,gRNA)递送到所关注的靶位点(例如,细胞、组织、器官等)。
术语“脂质缀合物”是指抑制脂质颗粒聚集的缀合脂质。此类脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物,如例如,与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如,PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如,PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺偶联的PEG(参见例如,美国专利第5,885,613号)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如,POZ-DAA缀合物)、聚酰胺寡聚体(例如,ATTA脂质缀合物)和其混合物。在PCT公开号WO 2010/006282中描述了POZ-脂质缀合物的另外的实例。PEG或POZ可以直接与脂质缀合,或者可以通过连接子部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG或POZ与脂质偶联的任何连接子部分,包括例如不含酯的连接子部分和含酯的连接子部分。在某些实施例中,使用不含酯的连接子部分,如酰胺或氨基甲酸酯。
如本文所使用的,“NF-κB基因”是编码产物的基因,所述产物在被抑制时使细胞中的NF-κB信号传导水平降低。
如本文所使用的,“非天然存在的”系统包括表明涉及人工的任何事物,如系统的一种或多种组分从其自然存在的状态改变或突变,至少基本上不含所述组分在自然界中与其天然相关的至少一种其它组分或与所述组分不与其天然相关的至少一种其它组分相关。例如,一些CRISPR/Cas系统采用非天然存在的CRISPR复合物(包括非天然一起存在的gRNA和Cas蛋白),采用非天然存在的Cas蛋白,或者采用非天然存在的gRNA。
如本文所使用的,短语“药学上可接受的载体”是指涉及将目标化合物从身体的一个器官或部分承载或输送到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒剂,如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料等。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。所述术语是指任何长度的核苷酸(脱氧核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合物形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以进行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的多个(一个)基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)和核苷酸类似物。如果存在,则可以在组装聚合物之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以如通过与标记组分缀合来进一步修饰。术语“重组”多核苷酸是指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸,所述多核苷酸在自然界中不存在或以非天然排列方式与另一多核苷酸连接。
核酸被视为具有“5'末端”和“3'末端”,因为以使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键在一个方向上与其相邻的单核苷酸戊糖环的3'氧附着的方式使单核苷酸反应以形成寡核苷酸。如果寡核苷酸的5'磷酸不与单核苷酸戊糖环的3'氧连接,则将寡核苷酸的末端称为“5'末端”。如果寡核苷酸的3'氧不与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接,则将寡核苷酸的末端称为“3'末端”。即使核酸序列处于更大的寡核苷酸的内部,所述核酸序列也可以被视为具有5'末端和3'末端。在线性或环状DNA分子中,离散元件被称为“下游”或3'元件的“上游”或5'。
术语“防止(prevent)”、“防止(preventing)”、“防止(prevention)”等是指降低未患有疾病、病症或病状但有罹患疾病、病症或病状的风险或易于患疾病、病症或病状的受试者患疾病、病症或病状的可能性。
术语“小分子”是本领域的术语并且包括小于约1000分子量或小于约500分子量的分子。在一个实施例中,小分子不排他地包括肽键。在另一个实施例中,小分子不是寡聚的。可以筛选活性的示例性小分子化合物包括但不限于肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、有机小分子(例如,聚酮化合物)(Cane等人(1998)《科学(Science)》282:63)和天然产物提取物文库。
“小发夹RNA”或“短发夹RNA”或“shRNA”包括产生紧密发夹转角的短RNA序列,所述紧密发夹转角可以用于通过RNA干扰沉默基因表达。本文所提供的shRNA可以化学合成或从DNA质粒中的转录盒转录而来。shRNA发夹结构被细胞机制切割成siRNA,siRNA然后与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。
如本文所使用的,术语“受试者”是指被选择用于治疗或疗法的人或非人动物。在本文所提供的某些实施例中,受试者是人类受试者。在本文所提供的一些实施例中,受试者是需要本文所提供的方法的受试者,如患有癌症的受试者。
术语“核酸酶药剂的靶序列”包括由核酸酶药剂诱导切口或双链断裂的DNA序列。同样,术语“DNA结合蛋白的靶序列”包括DNA结合蛋白将结合的DNA序列。靶序列可以是细胞内源的(或自然的),或者靶序列可以是细胞外源的。
如本文所使用的短语“治疗有效量”和“有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比率在受试者的至少细胞亚群中有效地产生期望的治疗效果的药剂的量。
“治疗”受试者的疾病或“治疗”患有疾病的受试者是指使受试者经受药物治疗,例如施用药物,使得疾病的至少一种症状得到减轻或预防恶化。
自噬和NF-κB通路
如以上所讨论的,本文中的公开内容部分地基于以下发现:抑制自噬通路,包括抑制自噬起始、转移膜材料或自噬体扩增,使癌细胞对TNFα介导的杀伤(例如,通过T细胞)敏感。申请人在本文中表明,自噬通路和NF-κB通路是免疫疗法反应性的重要调节剂,并且抑制这些通路增强癌症疗法,尤其是T细胞定向疗法的功效。
因此,本文提供了通过向受试者施用抑制癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,至少一种本文所公开的药剂)或使癌细胞与所述药剂接触来使癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感的方法。在一些实施例中,药剂抑制自噬基因和/或NF-κB基因的表达或活性。如本文所使用的,自噬基因包括但不限于编码产物的基因,所述产物在被抑制时使细胞中的自噬水平降低。自噬基因可以是例如ATG12、WIPI2、RB1CC1、PIK3C3、ATG9A、ATG2A、ATG5、ATG14、EI24、NRBF2、ATG13、TAX1BP1和ATG10。表1提供了这些示例性自噬基因的mRNA、蛋白质和基因组(GRCh38.p13初级组装)序列的示例性NCBI序列参考。
表1:自噬通路的示例性基因靶标
在一些实施例中,药剂抑制NF-κB基因的表达或活性。如本文所使用的,NF-κB基因包括但不限于编码产物的基因,所述产物在被抑制时使细胞中的NF-κB信号传导水平降低。NF-κB基因可以是例如CFLAR、UBE2L3、RNF31、IKBKB、MAP3K7、TAB1、RELA、IKKBKG、CHUK、TAB2、TBK1、MAPKAPK2、RBCK1、TRAF2、SHARPIN或TNFAIP3。表1提供了这些示例性NF-κB基因的mRNA、蛋白质和基因组(GRCh38.p13初级组装)序列的示例性NCBI序列参考。
表2:NF-κB通路内的示例性基因
在其它方面,本文提供了增加对受试者体内的TNF-α介导的癌细胞杀伤的方法,所述方法通过向受试者施用至少一种抑制癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,至少一种本文所公开的药剂,如修饰至少一个自噬基因或至少一个NF-κB基因的药剂,如表1或2中的基因)。本文还公开了使受试者体内的肿瘤对TNF-α介导的杀伤敏感或增加受试者体内TNF-α介导的肿瘤杀伤的方法,所述方法通过向受试者施用抑制肿瘤中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,至少一种本文所公开的药剂,如修饰至少一个自噬基因或至少一个NF-κB基因的药剂,如表1或2中的基因)。本文还提供了治疗受试者的癌症的方法,所述方法通过向受试者施用抑制受试者的癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,至少一种本文所公开的药剂,如修饰至少一个自噬基因或至少一个NF-κB基因的药剂,如表1或2中的基因)以及癌症疗法(例如,癌症免疫疗法)。在一些实施例中,修饰所述至少一个自噬基因或NF-κB基因导致所述基因的表达和/或活性降低。在一些实施例中,修饰所述至少一个自噬基因或NF-κB基因导致所述基因的表达和/或活性消除。
自噬和NF-κB通路的调节剂
CRISPR/Cas系统
在一些实施例中,本文提供了抑制自噬基因(例如,表1的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2的NF-κB基因)的表达或活性的药剂以及其使用方法。在某些实施例中,药剂可以是修饰至少一个自噬基因或NF-κB基因(例如,其中修饰所述至少一个基因导致所述基因的表达或活性降低和/或消除)的药剂。在一些实施例中,对基因的修饰包括缺失、插入、置换或其组合。在一些实施例中,修饰过程包括Cas蛋白与基因的结合。
在某些实施例中,抑制自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)的表达或活性的药剂是包含向导RNA的组合物。在一些实施例中,药剂是包含核酸的组合物,所述核酸包括编码向导RNA的第一核苷酸序列。向导RNA可以有效引导Cas酶切割或结合基因中的序列,其中向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向基因内的向导RNA靶序列。在一些实施例中,向导RNA被配置成提供选自基因内的双链断裂和单链断裂的切割事件。在一些实施例中,向导RNA靶序列包括或接近基因的起始密码子。向导RNA靶序列可以位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。在一些实施例中,所述向导RNA靶序列存在于靶基因的外显子1中。在一些实施例中,所述向导RNA靶序列存在于靶基因的外显子2中。在一些实施例中,抑制自噬基因的表达或活性的药剂是包含多个向导RNA的组合物。例如,在一些实施例中,组合物包含靶向靶基因的5'末端的第一向导RNA和靶向靶基因的3'末端的第二向导RNA(例如,以诱导折叠)。在一些实施例中,组合物包含被设计成修饰或缺失靶基因的功能结构域的双gRNA。
在某些实施例中,向导RNA包含与自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)杂交的至少15个连续核苷酸。举例来说,所述至少15个连续核苷酸可以与表1中列出的自噬基因或表2中列出的NF-κB基因的区段杂交,所述区段分别与表1或表2中提供的基因序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。任选地,向导RNA包括可以与表1或表2中提供的基因序列的至少15个连续核苷酸杂交的序列。
例如,在某些实施例中,对细胞的基因组中的自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)的靶向遗传修饰可以通过使细胞或细胞的基因组与Cas蛋白和一个或多个向导RNA接触来产生,所述一个或多个向导RNA与自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)中的靶基因组基因座内的一个或多个向导RNA识别序列杂交。也就是说,对细胞的基因组中的自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)的靶向遗传修饰可以通过使细胞或细胞的基因组与Cas蛋白和一个或多个向导RNA接触来产生,所述一个或多个向导RNA靶向自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)中的靶基因组基因座内的一个或多个向导RNA靶序列。例如,此类方法可以包括使细胞与Cas蛋白和向导RNA接触,所述向导RNA靶向自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)内的向导RNA靶序列。例如,向导RNA靶序列可以包括或接近自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)的起始密码子或自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)的终止密码子。例如,向导RNA靶序列可以位于起始密码子或终止密码子的约10个、20个、30个、40个、50个、100个、200个、300个、400个、500个或1,000个核苷酸内。在一些实施例中,gRNA靶序列位于靶基因的外显子1中。在一些实施例中,gRNA靶序列存在于靶基因的外显子2中。在一些实施例中,抑制自噬基因的表达或活性的药剂是包含多个向导RNA的组合物。例如,在一些实施例中,组合物包含靶向靶基因的5'末端的第一向导RNA和靶向靶基因的3'末端的第二向导RNA(例如,以诱导折叠)。在一些实施例中,组合物包含被设计成修饰或缺失靶基因的功能结构域的双gRNA。
在一些方法中,可以使用两种或更多种核酸酶药剂。例如,可以使用两种或更多种核酸酶药剂,所述两种或更多种核酸酶药剂各自靶向包括或接近起始密码子的核酸酶靶序列。举例来说,可以使用两种核酸酶药剂,一种核酸酶药剂靶向包括或接近起始密码子的核酸酶靶序列,并且另一种核酸酶药剂靶向包括或接近终止密码子的核酸酶靶序列,其中由核酸酶药剂进行的切割可能导致两个核酸酶靶序列之间的编码区缺失。作为又另一个实例,可以使用三种或更多种核酸酶药剂,其中一种或多种(例如,两种)靶向核酸酶靶序列包括或接近起始密码子,并且一种或多种(例如,两种)靶向核酸酶靶序列包括或接近终止密码子,其中由核酸酶药剂进行的切割可能导致包括或接近起始密码子的核酸酶靶序列与包括或接近终止密码子的核酸酶靶序列之间的编码区缺失。
可用于靶向示例性自噬基因的示例性sgRNA序列(基因名称、sgRNA ID、在适用时的sgRNA编号和序列)包括但不限于:Rb1cc1,MGLibA_44688,1,AGAGTGTGTACTTACAGCGC(SEQID NO:38);Rb1cc1,MGLibA_44689,2,CTGAACGTGGCAAAGAACTT(SEQ ID NO:39);Rb1cc1,MGLibA_44690,3,TCAAGATAGACCCAATGATG(SEQ ID NO:40);Rb1cc1,MGLibB_44675,4,CTCCATTGACCACCAGAACC(SEQ ID NO:41);Rb1cc1,MGLibB_44676,5,ATTTGAACAGTCCTCCAGAT(SEQ ID NO:42);Rb1cc1,MGLibB_44677,6,CTTTAGGAATAGCAGGTGCA(SEQ ID NO:43);Atg9a,MGLibA_05661,1,CATAGTCCACACAGCTAACC(SEQ ID NO:44);Atg9a,MGLibA_05662,2,TTGGGATCCGAAGAGCATGT(SEQ ID NO:45);Atg9a,MGLibA05663,3,CTGCCCAAGTCTGTAGTGCC(SEQ ID NO:46);Atg9a,MGLibB_05661,4,TCTATAACATTTGCTGCTAT(SEQ ID NO:47);Atg9a,MGLibB_05662,5,TACATGTGAAGCCATTCTTC(SEQ ID NO:48);Atg9a,MGLibB_05663,6,AGGATATTCGAGAGAAGAAG(SEQ ID NO:49);Atg12,MGLibA_05619,1,TGCAGTTTCGCCCGGAACGG(SEQ ID NO:50);Atg12,MGLibA_05620,2,CTCTGGAAGGCTCTCGCCGC(SEQ ID NO:51);Atg12,MGLibA_05621,3,GAGCGAACCCGGACCATCCA(SEQ ID NO:52);Atg12,MGLibB_05619,4,TCATCATACCAACTGTTCCG(SEQ ID NO:53);Atg12,MGLibB_05620,5,CCTGCATTACTGCAAATCCC(SEQ ID NO:54);以及Atg12,MGLibB_05621,6,TTCTGGCTCATCCCCATGCC(SEQ ID NO:55)。
可用于靶向示例性NF-κB基因的示例性sgRNA序列(基因名称、sgRNA ID、在适用时的sgRNA编号和序列)包括但不限于:Map3k7,MGLibA_30286,1,GATGATCGAAGCGCCGTCGC(SEQID NO:16);Map3k7,MGLibA_30287,2,CGGCGCTTCGATCATCTCAC(SEQ ID NO:17);Map3k7,MGLibA_30288,3,GGGACTTACTGGATTCAGGC(SEQ ID NO:18);Map3k7,MGLibB_30277,4,GAGTAGTTTGCAAAGCTAAG(SEQ ID NO:19);Map3k7,MGLibB_30278,5,TTAACTCAGGTTGTCGGAAG(SEQ ID NO:20);Map3k7,MGLibB_30279,6,GAGGGGGGCTCATTGTATAA(SEQ ID NO:21);Rbck1,MGLibA_44718,1,AGTACGCCCGGATATGACAG(SEQ ID NO:22);Rbck1,MGLibA_44719,2,ACGTGTTGCGGGCTGACAGC(SEQ ID NO:23);Rbck1,MGLibA_44720,3,CAGCTTACCGGTGGTGACTC(SEQ ID NO:24);Rbck1,MGLibB_44705,4,AACCTGTCCTTCCGAAGCCC(SEQ ID NO:25);Rbck1,MGLibB_44706,5,CGGGCGTACTGTGAGCCAAA(SEQ ID NO:26);Rbck1,MGLibB_44707,6,CTGCTATCAAGTATGCCACC(SEQ ID NO:27);Rela,MGLibA_45072,1,GCGATTCCGCTATAAATGCG(SEQ ID NO:28);Rela,MGLibA_45073,2,TCATCGAACAGCCGAAGCAA(SEQ ID NO:29);Rela,MGLibA_45074,3,GCCCAGACCGCAGTATCCAT(SEQ ID NO:30);Rela,MGLibB_45059,4,CTGCCGGGATGGCTACTATG(SEQ ID NO:31);Rela,MGLibB_45060,5,ACCGTGAAAGGGGTTATTGT(SEQ ID NO:32);以及Rela,MGLibB_45061,6,ACTTACCTGAGGGAAAGATG(SEQ ID NO:33)。
在一些实施例中,向导RNA可以包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括DNA靶向区段。向导RNA可以是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
在一些实施例中,组合物进一步包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列(例如,核酸酶活性Cas蛋白或与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白)。Cas蛋白可以是Cas9蛋白。所述Cas9分子可以是金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9蛋白、酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)Cas9蛋白。
在某些实施例中,本文所公开的方法和组合物可以利用成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统或此类系统的组分来修饰细胞内的基因组。CRISPR/Cas系统包括转录物和涉及Cas基因的表达或引导其活性的其它元件。CRISPR/Cas系统可以是例如I型、II型、III型系统或V型系统(例如,V-A亚型或V-B亚型)。本文所公开的方法和组合物可以通过利用CRISPR复合物(包括与Cas蛋白复合的向导RNA(gRNA))用于核酸的定点结合或切割来采用CRISPR/Cas系统。在一些实施例中,在本文所公开的组合物和方法中使用的CRISPR/Cas系统可以是非天然存在的。
A.Cas蛋白
在一些实施例中,Cas蛋白通常包括可以与向导RNA相互作用的至少一个RNA识别或结合结构域。Cas蛋白还可以包括核酸酶结构域(例如,DNase结构域或RNase结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域和其它结构域。一些此类结构域(例如,DNase结构域)可以来自天然Cas蛋白。可以添加其它此类结构域以制备经修饰的Cas蛋白。核酸酶结构域对核酸切割具有催化活性,所述核酸切割包括核酸分子的共价键的断裂。切割可以产生钝端或交错末端,并且所述切割可以是单链或双链的。例如,野生型Cas9蛋白通常将产生钝性切割产物。可替代地,野生型Cpf1蛋白(例如,FnCpf1)可以产生具有5核苷酸5'突出端的切割产物,其中切割发生在来自非靶向链上的PAM序列的第18个碱基对之后和基于靶向链的第23个碱基对之后。Cas蛋白可以具有完整的切割活性以在靶基因组基因座处产生双链断裂(例如,具有钝端的双链断裂),或者其可以是在靶基因组基因座处产生单链断裂的切口酶。
Cas蛋白的实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966以及其同源物或经修饰的版本。
示例性Cas蛋白是Cas9蛋白或源自Cas9蛋白的蛋白质。Cas9蛋白来自II型CRISPR/Cas系统,并且通常共享具有保守架构的四个关键基序。基序1、2和4是RuvC样基序,并且基序3是HNH基序。示例性Cas9蛋白来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿产色链霉菌、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、硒化芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤蓝细菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻(Synechococcussp.)、阿拉伯糖醋酸杆菌(Acetohalobium arabaticum)、德根斯产氨菌(Ammonifexdegensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、候选金矿菌(CandidatusDesulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热厌氧钠杆菌(Natranaerobiusthermophilus)、丙酸降解菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、最大节螺藻(Arthrospira platensis)、节旋藻(Arthrospira sp.)、林氏藻(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、移动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、深海阿卡罗虎尾草(Acaryochloris marina)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。在WO 2014/131833中描述了Cas9家族成员的另外的实例,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。来自酿脓链球菌的Cas9(SpCas9)(指定SwissProt登录号为Q99ZW2)是示例性Cas9蛋白。来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)(指定UniProt登录号为J7RUA5)是另一示例性Cas9蛋白。来自空肠弯曲杆菌的Cas9(CjCas9)(指定UniProt登录号为Q0P897)是另一种示例性Cas9蛋白。参见例如,Kim等人(2017)《自然通讯(Nat.Commun.)》8:14500,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。SaCas9小于SpCas9,并且CjCas9小于SaCas9和SpCas9两者。
Cas蛋白的另一个实例是Cpf1(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella 1的CRISPR)蛋白。Cpf1是含有与Cas9的对应结构域同源的RuvC样核酸酶结构域以及与特征性富含精氨酸的Cas9簇的对应物的大蛋白质(约1300个氨基酸)。然而,Cpf1缺乏存在于Cas9蛋白中的HNH核酸酶结构域,并且RuvC样结构域在Cpf1序列中是连续的,与Cas9相比,其含有包括HNH结构域的长插入物。参见例如,Zetsche等人(2015)《细胞(Cell)》163(3):759-771,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。示例性Cpf1蛋白来自土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)1、土拉弗朗西丝菌新凶手亚种(Francisella tularensis subsp.novicida)、易北河普雷沃氏菌(Prevotellaalbensis)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)GW2011_GWA2_33_10、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)GW2011_GWC2_44_17、史密斯氏菌属(Smithella sp.)SCADC、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)BV3L6、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、候选白蚁甲烷支原体(CandidatusMethanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)237、稻田氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonascrevioricanis)3、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)和猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。来自新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)U112的Cpf1(FnCpf1;指定UniProt登录号为A0Q7Q2)是示例性Cpf1蛋白。
Cas蛋白可以是野生型蛋白(即,自然界中存在的蛋白)、经修饰的Cas蛋白(即,Cas蛋白变体)或者野生型或经修饰的Cas蛋白的片段。就野生型或经修饰的Cas蛋白的催化活性而言,Cas蛋白也可以是活性变体或片段。就催化活性而言,活性变体或片段可以包括与野生型或经修饰的Cas蛋白或其部分具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性,其中活性变体保留在期望切割位点处切割的能力,并且因此保留切口诱导或双链断裂诱导活性。对切口诱导或双链断裂诱导活性的测定是已知的,并且通常测量Cas蛋白对含有切割位点的DNA底物的总体活性和特异性。
经修饰的Cas蛋白的一个实例是经修饰的SpCas9-HF1蛋白,其是具有被设计成减少非特异性DNA接触的改变(N497A/R661A/Q695A/Q926A)的酿脓链球菌Cas9的高保真变体。参见例如,Kleinstiver等人(2016)《自然(Nature)》529(7587):490-495,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。经修饰的Cas蛋白的另一个实例是被设计成减少脱靶效应的经修饰的eSpCas9变体(K848A/K1003A/R1060A)。参见例如,Slaymaker等人(2016)《科学》351(6268):84-88,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。其它SpCas9变体包括K855A和K810A/K1003A/R1060A。
可以修饰Cas蛋白以增加或减少核酸结合亲和力、核酸结合特异性和酶活性中的一者或多者。也可以修饰Cas蛋白以改变蛋白质的任何其它活性或性质,如稳定性。例如,Cas蛋白的一个或多个核酸酶结构域可以是经修饰的、缺失的或失活的,或者可以截短Cas蛋白以去除对蛋白质功能不必要的结构域或优化(例如,增强或降低)Cas蛋白的活性或性质。
Cas蛋白可以包括至少一个核酸酶结构域,如DNase结构域。例如,野生型Cpf1蛋白通常包括切割靶DNA的两条链的RuvC样结构域,其可能呈二聚体构型。Cas蛋白还可以包括至少两个核酸酶结构域,如DNase结构域。例如,野生型Cas9蛋白通常包括RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域可以各自切割不同的双链DNA链,以在DNA中形成双链断裂。参见例如,Jinek等人(2012)《科学》337(6096):816-821,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
核酸酶结构域中的一个或多个或所有核酸酶结构域可以缺失或突变,使得其不再具有功能或具有降低的核酸酶活性。例如,如果Cas9蛋白中的核酸酶结构域之一缺失或突变,则所得Cas9蛋白可以被称为切口酶,并且可以在双链靶DNA内产生单链断裂但不会产生双链断裂(即,其可以切割互补链或非互补链,但不能切割两者)。如果两个核酸酶结构域都缺失或突变,则所得Cas蛋白(例如,Cas9)切割双链DNA(例如,核酸酶无效或核酸酶失活的Cas蛋白,或催化死亡的Cas蛋白(dCas))的两条链的能力将降低。将Cas9转化为切口酶的突变的实例是来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC结构域中的D10A(在Cas9的位置10处天冬氨酸转化为丙氨酸)突变。同样,来自酿脓链球菌的Cas9的HNH结构域中的H939A(在氨基酸位置839处组氨酸转化为丙氨酸)、H840A(在氨基酸位置840处组氨酸转化为丙氨酸)或N863A(在氨基酸位置N863处天冬酰胺转化为丙氨酸)可以将Cas9转化为切口酶。将Cas9转化为切口酶的突变的其它实例包括来自嗜热链球菌的Cas9的对应突变。参见例如,Sapranauskas等人(2011)《核酸研究》39(21):9275-9282以及WO 2013/141680,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。可以使用如定点诱变、PCR介导的诱变或总基因合成等方法产生此类突变。产生切口酶的其它突变的实例可以例如在WO 2013/176772和WO 2013/142578中找到,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。如果Cas蛋白中的全部核酸酶结构域都进行缺失或突变(例如,Cas9蛋白中的两个核酸酶结构域都进行缺失或突变),则所得Cas蛋白(例如,Cas9)切割双链DNA的两条链的能力将降低(例如,核酸酶无效或核酸酶失活Cas蛋白)。一个具体实例是D10A/H840A酿脓链球菌Cas9双突变体或者当与酿脓链球菌Cas9最佳比对时来自另一物种的Cas9中的对应双突变体。另一个具体实例是D10A/N863A酿脓链球菌Cas9双突变体或当与酿脓链球菌Cas9最佳比对时来自另一物种的Cas9中的对应双突变体。
金黄色葡萄球菌Cas9蛋白的催化结构域中失活突变的实例也是已知的。例如,金黄色葡萄球菌Cas9酶(SaCas9)可以包括用于产生核酸酶失活Cas蛋白的位置N580处的取代(例如,N580A取代)和位置D10处的取代(例如,D10A取代)。参见例如,WO2016/106236,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
Cpf1蛋白的催化结构域中的失活突变的实例也是已知的。关于来自新凶手弗朗西丝氏菌U112(FnCpf1)的Cpf1蛋白、氨基酸球菌属BV3L6(AsCpf1)、毛螺菌科细菌ND2006(LbCpf1)和牛眼莫拉氏菌237(MbCpf1 Cpf1),此类突变可以包括在AsCpf1的位置908、993或1263或Cpf1直系同源物中的对应的位置,或LbCpf1的位置832、925、947或1180或Cpf1直系同源物中的对应位置处的突变。此类突变可以包括例如AsCpf1的突变D908A、E993A和D1263A或Cpf1直系同源物中的对应突变或LbCpf1的D832A、E925A、D947A和D1180A或Cpf1直系同源物中的对的突变中的一个或多个突变。参见例如,US2016/0208243,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
Cas蛋白也可以作为融合蛋白与异源多肽可操作地连接。例如,Cas蛋白可以与切割结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域融合。参见WO2014/089290,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。转录激活结构域的实例包括单纯疱疹病毒VP16激活结构域、VP64(其是VP16的四聚体衍生物)、NFκB p65激活结构域、p53激活结构域1和2、CREB(cAMP应答元件结合蛋白)激活结构域、E2A激活结构域和NFAT(激活T细胞的核因子)激活结构域。其它实例包括来自以下的激活结构域:Oct1、Oct-2A、SP1、AP-2、CTF1、P300、CBP、PCAF、SRC1、PvALF、ERF-2、OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、ARF-6、ARF-7、ARF-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP、TRAB1PC4和HSF1。参见例如,US 2016/0237456、EP3045537和WO 2011/146121,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入。在一些情况下,可以使用包括与MS2-p65-HSF1配对的dCas9-VP64融合蛋白的转录激活系统。此类系统中的向导RNA可以被设计成具有附加到sgRNA四环和茎环2的适配体序列,所述适配体序列被设计成与二聚化MS2噬菌体外壳蛋白结合。参见例如,Konermann等人(2015)《自然》517(7536):583-588,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。转录阻遏物结构域的实例包括诱导型cAMP早期阻遏物(ICER)结构域、克鲁贝尔相关盒(Kruppel-associated box)A(KRAB-A)阻遏物结构域、YY1富含甘氨酸的阻遏物结构域、Sp1样阻遏物、E(spl)阻遏物、ΙκB阻遏物和MeCP2。其它实例包括来自A/B、KOX、TGF-β诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、SID4X、MBD2、MBD3、DNMT1、DNMG3A、DNMT3B、Rb、ROM2的转录阻遏物结构域,参见例如,EP3045537和WO 2011/146121,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。Cas蛋白也可以与异源多肽融合,从而增加或降低稳定性。融合结构域或异源多肽可以定位于N端、C端或Cas蛋白内部。
举例来说,Cas蛋白可以与提供亚细胞定位的一种或多种异源多肽融合。此类异源多肽可以包括例如一种或多种核定位信号(NLS),如用于靶向细胞核的单分SV40 NLS和/或双分α-输入蛋白(α-importin)NLS、用于靶向线粒体的线粒体定位信号、ER保留信号等。参见例如,Lange等人(2007)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》282(8):5101-5105,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。此类亚细胞定位信号可以定位在N端、C端或Cas蛋白内的任何位置。NLS可以包括碱性氨基酸段,并且可以是单分序列或双分序列。任选地,Cas蛋白可以包括两个或更多个NLS,包含N端处的NLS(例如,α-输入蛋白NLS或单分NLS)和C端处的NLS(例如,SV40 NLS或双分NLS)。Cas蛋白还可以包括N端处的两个或更多个NLS和/或C端处的两个或更多个NLS。
Cas蛋白也可以与细胞穿透性结构域或蛋白质转导结构域可操作地连接。例如,细胞穿透性结构域可以源自HIV-1TAT蛋白、来自人乙型肝炎病毒的TLM细胞穿透基序、MPG、Pep-1、VP22、来自单纯疱疹病毒的细胞穿透性肽或聚精氨酸肽序列。参见例如,WO2014/089290和WO 2013/176772,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。细胞穿透性结构域可以定位于N端、C端或Cas蛋白内的任何位置。
Cas蛋白也可以与异源多肽可操作地连接以便于进行追踪或纯化,如荧光蛋白、纯化标签或表位标签。荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(例如,GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、祖母绿、Azami绿、单体Azami绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如,YFP、eYFP、柠檬黄、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如,eBFP、eBFP2、石青、mKalamal、GFPuv、天蓝色(Sapphire)、T-天蓝色)、青色荧光蛋白(例如,eCFP、蔚蓝色(Cerulean)、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-青色)、红色荧光蛋白(例如,mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-表达、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry、Jred)、橙色荧光蛋白(例如,mOrange、mKO、Kusabira-橙色、单体Kusabira-橙色、mTangerine、tdTomato)和任何其它合适的荧光蛋白。标签的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、血球凝集素(HA)、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、组氨酸(His)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和钙调蛋白。
Cas蛋白还可以与经标记的核酸栓系。这种栓系(即,物理连接)可以通过共价相互作用或非共价相互作用来实现,并且栓系可以是直接的(例如,通过直接融合或化学缀合,这可以通过蛋白质上的半胱氨酸或赖氨酸残基的修饰或内含子修饰来实现),或者可以通过如链霉亲和素或适配体等一个或多个中间连接子或衔接子分子来实现。参见例如,Pierce等人(2005)《药物化学短评(Mini Rev.Med.Chem.)》5(1):41-55;Duckworth等人(2007)《应用化学国际版-英语(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》46(46):8819-8822;Schaeffer和Dixon(2009)《澳大利亚化学杂志(Australian J.Chem.)》62(10):1328-1332;Goodman等人(2009)《生物化学(Chembiochem.)》10(9):1551-1557;和Khatwani等人(2012)《生物有机与药物化学(Bioorg.Med.Chem.)》20(14):4532-4539,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。用于合成蛋白质-核酸缀合物的非共价策略包括生物素-链霉亲和素和镍-组氨酸方法。可以通过使用多种化学反应连接适当功能化的核酸和蛋白质来合成共价蛋白质-核酸缀合物。这些化学反应中的一些化学反应涉及将寡核苷酸直接附着到蛋白质表面上的氨基酸残基(例如,赖氨酸胺或半胱氨酸硫醇),而其它更复杂的方案需要蛋白质的翻译后修饰或催化或反应蛋白结构域的参与。用于蛋白质与核酸共价附着的方法可以包括例如寡核苷酸与蛋白质赖氨酸或半胱氨酸残基的化学交联、表达的蛋白质连接、化学酶法和光适体的使用。经标记的核酸可以与Cas蛋白内的C端、N端或内部区域栓系。在一个实例中,经标记的核酸与Cas蛋白的C端或N端栓系。同样,Cas蛋白可以与经标记的核酸内的5'末端、3'末端或内部区域栓系。也就是说,经标记的核酸可以以任何取向和极性拴系。例如,Cas蛋白可以与经标记的核酸的5'末端或3'末端栓系。
Cas蛋白可以以任何形式提供。例如,Cas蛋白可以以蛋白质的形式提供,如与gRNA复合的Cas蛋白。可替代地,可以以编码Cas蛋白的核酸形式提供Cas蛋白,如RNA(例如,信使RNA(mRNA))或DNA。任选地,可以对编码Cas蛋白的核酸进行密码子优化以在特定细胞或生物体中有效翻译成蛋白质。例如,与天然存在的多核苷酸序列相比,可以修饰编码Cas蛋白的核酸以取代在细菌细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或任何其它所关注宿主细胞中具有更高使用频率的密码子。当编码Cas蛋白的核酸被引入到细胞中时,Cas蛋白可以在细胞中瞬时地、有条件地或组成性地表达。
可以对作为mRNA提供的Cas蛋白进行修饰以改善稳定性和/或免疫原性性质。可以对mRNA内的一种或多种核苷进行修饰。对mRNA核碱基进行化学修饰的实例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷和5-甲基-胞苷。例如,可以使用含有N1-甲基假尿苷的封端和聚腺苷酸化CasmRNA。同样,Cas mRNA可以通过使用同义密码子对尿苷进行缺失来修饰。
编码Cas蛋白的核酸可以稳定地整合在细胞的基因组中,并且与在细胞中具有活性的启动子可操作地连接。可替代地,编码Cas蛋白的核酸可以与表达构建体中的启动子可操作地连接。表达构建体包括能够引导基因或其它所关注核酸序列(例如,Cas基因)的表达并且可以将此类所关注核酸序列转移到靶细胞的任何核酸构建体。例如,编码Cas蛋白的核酸可以在包括编码gRNA的DNA的载体中。可替代地,所述核酸可以在与包括编码gRNA的DNA的载体分离的载体或质粒中。可以用于表达构建体的启动子包括在例如真核细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、多能性细胞、胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、发育受限的祖细胞、诱导多能干(iPS)细胞或单细胞期胚胎中的一种或多种细胞中具有活性的启动子。此类启动子可以是,例如条件型启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。任选地,启动子可以是在一个方向上驱动Cas蛋白的表达并且在另一个方向上驱动向导RNA的表达的双向启动子。此类双向启动子可以由以下组成:(1)含有3个外部控制元件:远侧序列元件(DSE)、近侧端序列元件(PSE)和TATA框的完整的、常规的、单向的Pol III启动子;(2)包括在相反取向上与DSE的5'端融合PSE和TATA框的第二基本Pol III启动子。例如,在H1启动子中,DSE与PSE和TATA框相邻,并且可以通过产生杂合启动子使启动子双向化,其中通过源自U6启动子的附加PSE和TATA框来控制反向转录。参见例如,US 2016/0074535,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。使用双向启动子同时表达编码Cas蛋白和向导RNA的基因允许产生紧凑表达盒以促进递送。
B.向导RNA
向导RNA是与Cas蛋白(例如,Cas9蛋白)结合并将Cas蛋白靶向靶DNA内的具体位置的RNA分子。示例性双分子gRNA包括crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向子-RNA”或“crRNA”或“crRNA重复序列”)分子和对应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“激活子-RNA”或“tracrRNA”)分子。crRNA包括gRNA的DNA靶向区段(单链)和核苷酸段,所述核苷酸段形成gRNA的蛋白质结合区段的dsRNA双链体的一半。定位在DNA靶向区段下游(3')的crRNA尾部的实例包括以下、基本上由以下组成或由以下组成:GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:1)。本文所公开的DNA靶向区段中的任何区段可以与SEQ ID NO:2的5'末端连接以形成crRNA。
对应的tracrRNA(激活子RNA)包括形成gRNA的蛋白质结合片段的dsRNA双链体的另一半的核苷酸段。crRNA的核苷酸段与tracrRNA的核苷酸段互补并且与其杂交,以形成gRNA的蛋白质结合结构域的dsRNA双链体。因此,每个crRNA可以被视为具有对应的tracrRNA。tracrRNA序列的实例包括以下中的任一个、基本上由以下中的任一个组成或由以下中的任一个组成:
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:3)、
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:4)或
GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:5)。
在需要crRNA和tracrRNA两者的系统中,crRNA和对应的tracrRNA杂交以形成gRNA。在需要仅crRNA的系统中,crRNA可以是gRNA。crRNA另外提供与靶DNA的互补链杂交的单链DNA靶向区段。如果用于细胞内的修饰,则给定的crRNA或tracrRNA分子的确切序列可以被设计成对将使用RNA分子的物种具有特异性。参见例如,Mali等人(2013)《科学》339(6121):823-826;Jinek等人(2012)《科学》337(6096):816-821;Hwang等人(2013)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》31(3):227-229;Jiang等人(2013)《自然生物技术》31(3):233-239;和Cong等人(2013)《科学》339(6121):819-823,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
给定gRNA的DNA靶向区段(crRNA)包括与靶DNA的互补链上的序列互补的核苷酸序列,如下文更详细地描述的。gRNA的DNA靶向区段通过杂交(即,碱基配对)以序列特异性方式与靶DNA相互作用。因此,DNA靶向区段的核苷酸序列可以不同,并且确定gRNA和靶DNA将与其相互作用的靶DNA内的定位。可以修饰主题gRNA的DNA靶向区段以与靶DNA内的任何期望序列杂交。天然存在的crRNA因CRISPR/Cas系统和生物体而不同,但通常含有长度为21个至72个核苷酸的侧接长度为21个至46个核苷酸的两个直接重复序列(DR)的靶向区段(参见例如,WO 2014/131833,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。在酿脓链球菌的情况下,DR的长度为36个核苷酸,并且靶向区段的长度为30个核苷酸。定位于3'的DR与对应的tracrRNA互补并杂交,所述tracrRNA进而与Cas蛋白结合。
DNA靶向区段的长度可以例如为至少约12个、15个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个或40个核苷酸。此类DNA靶向区段的长度可以例如为约12个至约100个、约12个至约80个、约12个至约50个、约12个至约40个、约12个至约30个、约12个至约25个或约12个至约20个核苷酸。例如,DNA靶向区段可以为约15个至约25个核苷酸(例如,约17个至约20个核苷酸或约17个、18个、19个或20个核苷酸)。参见例如,US 2016/0024523,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。对于来自酿脓链球菌的Cas9,典型的DNA靶向区段的长度介于16个与20个核苷酸之间或17个与20个核苷酸之间。对于来自金黄色葡萄球菌的Cas9,典型的DNA靶向区段的长度介于21个与23个核苷酸之间。对于Cpf1,典型的DNA靶向区段的长度为至少16个核苷酸或长度为至少18个核苷酸。
TracrRNA可以呈任何形式(例如,全长tracrRNA或活性部分tracrRNA)并具有不同长度。TracrRNA可以包括初级转录物或经处理的形式。例如,tracrRNA(作为单向导RNA的一部分或作为双分子gRNA的一部分的单独分子)可以包括以下、基本上由以下组成或由以下组成:野生型tracrRNA序列的全部或一部分(例如,野生型tracrRNA序列的约或超过约20个、26个、32个、45个、48个、54个、63个、67个、85个或更多个核苷酸)。来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA序列的实例包括171-核苷酸、89-核苷酸、75-核苷酸和65-核苷酸版本。参见例如,Deltcheva等人(2011)《自然》471(7340):602-607;WO2014/093661,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。单向导RNA(sgRNA)内的tracrRNA的实例包括在+48、+54、+67和+85版本的sgRNA中发现的tracrRNA区段,其中“+n”表示在sgRNA中包括野生型tracrRNA的至多+n个核苷酸。参见US 8,697,359,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
向导RNA的DNA靶向区段与靶DNA的互补链之间的互补性百分比可以为至少60%(例如,至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)。DNA靶向区段与靶DNA的互补链之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上可以为至少60%。举例来说,DNA靶向区段与靶DNA的互补链之间的互补性百分比在靶DNA的互补链的5'末端处的14个连续核苷酸上可以为100%并且在其余部分上低至0%。在此类情况下,DNA靶向区段可以被视为长度为14个核苷酸。举例来说,DNA靶向区段与靶DNA的互补链之间的互补性百分比在靶DNA的互补链的5'末端处的七个连续核苷酸上可以为100%并且在其余部分上低至0%。在此类情况下,DNA靶向区段可以被视为长度为7个核苷酸。在一些向导RNA中,DNA靶向区段内的至少17个核苷酸与靶DNA的互补链互补。例如,DNA靶向区段的长度可以为20个核苷酸并且可以包括与靶DNA的互补链的1个、2个或3个错配。在一个实例中,失配不邻近与原间隔子相邻基序(PAM)序列相对应的互补链的区域(即,PAM序列的反向补体)(例如,错配位于向导RNA的DNA靶向区段的5'末端中,或错配距离与PAM序列相对应的互补链的区域至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个碱基对)。
gRNA的蛋白质结合区段可以包括彼此互补的两个核苷酸段。蛋白质结合区段的互补核苷酸杂交形成双链RNA双链体(dsRNA)。主题gRNA的蛋白质结合区段与Cas蛋白相互作用,并且gRNA通过DNA靶向区段将结合的Cas蛋白引导到靶DNA内的特异性核苷酸序列。
单向导RNA可以包括DNA靶向区段和支架序列(即,向导RNA的蛋白质结合或Cas结合序列)。例如,此类向导RNA可以具有与3'支架序列连接的5'DNA靶向区段。示例性支架序列包括以下、基本上由以下组成或由以下组成:GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(版本1;SEQ ID NO:6);GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(版本2;SEQID NO:7);GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(版本3;SEQ ID NO:8);以及GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(版本4;SEQ ID NO:9);GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(版本5;SEQ ID NO:10);GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(版本6;SEQ ID NO:11);或GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU(版本7;SEQ ID NO:12)。靶向本文所公开的向导RNA靶序列中的任何序列的向导RNA可以包括例如与向导RNA的3'末端上的示例性向导RNA支架序列中的任何序列融合的向导RNA的5'末端上的DNA靶向区段。即,本文所公开的DNA靶向区段中的任何DNA靶向区段可以与上述支架序列中的任何支架序列的5'末端连接以形成单向导RNA(嵌合向导RNA)。
向导RNA可以包括提供另外的期望特征的修饰或序列(例如,经修饰或经调节的稳定性;亚细胞靶向;用荧光标记机芯追踪;蛋白质或蛋白质复合物的结合位点;等等)。此类修饰的实例包括例如5'帽(例如,7-甲基鸟苷酸帽(m7G));3'聚腺苷酸化尾(即,3'poly(A)尾);核糖开关序列(例如,以允许通过蛋白质和/或蛋白质复合物来调节稳定性和/或调节可达性);稳定性控制序列;形成dsRNA双链体(即,发夹)的序列;将RNA靶向亚细胞位置(例如,细胞核、线粒体、叶绿体等)的修饰或序列;提供追踪(例如,与荧光分子直接缀合、与促进荧光检测的部分缀合、允许荧光检测的序列等)的修饰或序列;为蛋白质(例如,作用于DNA的蛋白质,包括转录激活子、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)提供结合位点的修饰或序列;以及其组合。修饰的其它实例包括工程化茎环双链体结构、工程化凸起区、茎环双链体结构的工程化发夹3'或其任何组合。参见例如,US 2015/0376586,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。凸起可以是由crRNA样区域和最小tracrRNA样区域组成的双链体内的核苷酸的未配对区域。凸起在双链体的一侧可以包括未配对的5'-XXXY-3',其中X是任何嘌呤,并且Y可以包括可以与相对链上的核苷酸形成摇摆对的核苷酸;并且在双链体的另一侧包括未配对核苷酸区。
在一些情况下,可以使用包括与MS2-p65-HSF1配对的dCas9-VP64融合蛋白的转录激活系统。此类系统中的向导RNA可以被设计成具有附加到sgRNA四环和茎环2的适配体序列,所述适配体序列被设计成与二聚化MS2噬菌体外壳蛋白结合。参见例如,Konermann等人(2015)《自然》517(7536):583-588,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
未经修饰的核酸可能易于降解。外源核酸也可以诱导先天免疫应答。修饰可以有助于引入稳定性并降低免疫原性。向导RNA可以包括经修饰的核苷和经修饰的核苷酸,包括例如以下中的一种或多种:(1)磷酸二酯骨架键中的非连接磷酸氧中的一个或两个和/或连接磷酸氧中的一个或多个的改变或替代;(2)核糖的成分的改变或替代,如核糖上的2'羟基的改变或替代;(3)用脱磷连接子替代磷酸部分;(4)天然存在的核碱基的修饰或替代;(5)磷酸核糖骨架的替代或修饰;(6)寡核苷酸3'末端或5'末端的修饰(例如,末端磷酸基团的去除、修饰或替代或部分的缀合);以及(7)糖的修饰。其它可能的向导RNA修饰包括尿嘧啶或聚尿嘧啶束的修饰或替代。参见例如,WO 2015/048577和US2016/0237455,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。可以对Cas编码核酸,如Cas mRNA进行类似的修饰。
举例来说,向导RNA的5'末端或3'末端的核苷酸可以包括硫代磷酸酯键(例如,碱基可以具有经修饰的磷酸酯基,所述经修饰的磷酸酯基是硫代磷酸酯基)。例如,向导RNA可以包括向导RNA的5'或3'末端处的2个、3个或4个末端核苷酸之间的硫代磷酸酯键。举例来说,向导RNA的5'和/或3'末端的核苷酸可以具有2'-O-甲基修饰。例如,向导RNA可以包括向导RNA的5'和/或3'末端(例如,5'末端)的2个、3个或4个末端核苷酸处的2'-O-甲基修饰。参见例如,WO 2017/173054 A1和Finn等人(2018)《细胞报告(Cell Rep.)》22(9):2227-2235,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
可以以任何形式提供向导RNA。例如,gRNA可以以RNA的形式提供,作为两个分子(单独的crRNA和tracrRNA)或作为一个分子(sgRNA),并且任选地以与Cas蛋白的复合物的形式提供。gRNA也可以以编码gRNA的DNA的形式提供。编码gRNA的DNA可以编码单个RNA分子(sgRNA)或单独的RNA分子(例如,单独的crRNA和tracrRNA)。在后一种情况下,编码gRNA的DNA可以作为一个DNA分子或作为分别编码crRNA和tracrRNA的单独DNA分子提供。
当gRNA以DNA的形式提供时,gRNA可以在细胞中瞬时地、有条件地或组成性地表达。编码gRNA的DNA可以稳定地整合到细胞的基因组中,并且与在细胞中具有活性的启动子可操作地连接。可替代地,编码gRNA的DNA可以与表达构建体中的启动子可操作地连接。例如,编码gRNA的DNA可以处于包括异源核酸如编码Cas蛋白的核酸的载体中。可替代地,编码gRNA的DNA可以处于与包括编码Cas蛋白的核酸的载体分开的载体或质粒中。可以用于此类表达构建体的启动子包括在例如真核细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、多能细胞、胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、发育受限的祖细胞、诱导性多能干(iPS)细胞或单细胞期胚胎中的一种或多种细胞中具有活性的启动子。此类启动子可以是例如条件型启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。此类启动子也可以是例如双向启动子。合适启动子的具体实例包括RNA聚合酶III启动子,如人U6启动子、大鼠U6聚合酶III启动子或小鼠U6聚合酶III启动子。
可替代地,可以通过各种其它方法制备gRNA。例如,可以使用例如T7 RNA聚合酶通过体外转录制备gRNA(参见例如,WO 2014/089290和WO 2014/065596,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。向导RNA也可以是通过化学合成制备的合成产生的分子。
向导RNA(或编码向导RNA的核酸)可以在包括一个或多个向导RNA(例如,1个、2个、3个、4个或更多个向导RNA)以及增加向导RNA的稳定性(例如,延长在给定储存条件(例如,-20℃、4℃或环境温度)下降解产物保持在阈值以下的时间,如低于起始核酸或蛋白质重量的0.5%;或增加体内稳定性)的载体的组合物中。此类载体的非限制性实例包括聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质螺旋体和脂质微管。此类组合物可以进一步包括Cas蛋白,如Cas9蛋白或编码Cas蛋白的核酸。
C.向导RNA靶序列
用于向导RNA的靶DNA包括存在于DNA中的核酸序列,gRNA的DNA靶向区段将与其结合,前提是存在足够的结合条件。合适的DNA/RNA结合条件包括细胞中通常存在的生理条件。其它合适的DNA/RNA结合条件(例如,无细胞系统中的条件)是本领域已知的(参见例如,《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版(Sambrook等人,海港实验室出版社(Harbor Laboratory Press)2001),所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。与gRNA互补并杂交的靶DNA的链可以被称为“互补链”,并且与“互补链”互补(并且因此不与Cas蛋白或gRNA互补)的靶DNA的链可以称为“非互补链”或“模板链”。
靶DNA包括与向导RNA杂交的互补链上的序列和非互补链上的对应序列(例如,与前间区序列邻近基序(PAM)邻近)。向导RNA被设计成与靶DNA的互补链互补,其中向导RNA的DNA靶向区段与向导DNA的互补链之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补,条件是存在足够的互补性来引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。如果向导RNA在本文中被称为靶向向导RNA靶序列,则意味着向导RNA与靶DNA的互补链序列杂交,所述互补链序列是非互补链上的向导RNA靶序列的反向补体。
靶DNA或向导RNA靶序列可以包括任何多核苷酸,并且可以定位在例如细胞的细胞核或细胞质中或者细胞的细胞器如线粒体或叶绿体内。靶DNA或向导RNA靶序列可以是细胞内源性或外源性的任何核酸序列。向导RNA靶序列可以是编码基因产物(例如,蛋白质)的序列或非编码序列(例如,调控序列)或者可以包括两者。
用于DNA结合蛋白的靶序列(例如,向导RNA靶序列)可以是适于改变靶基因的表达的自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)内的任何地方。举例来说,靶序列可以位于如增强子或启动子等调控元件内或者可以接近调控元件。例如,靶序列可以包括或接近自噬基因(例如,表1中列出的自噬基因)或NF-κB基因(例如,表2中列出的NF-κB基因)的起始密码子。例如,靶序列可以位于起始密码子的约10个、20个、30个、40个、50个、100个、200个、300个、400个、500个或1,000个核苷酸内。
Cas蛋白对靶DNA的位点特异性结合和切割可以发生在由(i)向导RNA与靶DNA的互补链之间的碱基配对互补性和(ii)靶DNA的非互补链中的短基序(被称为原型间隔子相邻基序(PAM))两者确定的定位处。PAM可以侧接向导RNA靶序列。任选地,向导RNA靶序列可以在3'末端上侧接有PAM(例如,对于Cas9)。可替代地,向导RNA靶序列可以在5'末端上侧接有PAM(例如,对于Cpf1)。例如,Cas蛋白的切割位点可以在PAM序列上游或下游(例如,在向导RNA靶序列内)约1个至约10个或约2个至约5个碱基对(例如,3个碱基对)处。在SpCas9的情况下,PAM序列(即,非互补链上)可以是5'-N1GG-3',其中N1是任何DNA核苷酸,并且PAM紧接着靶DNA的非互补链上的向导RNA靶序列的3'。因此,与互补链上的PAM相对应的序列(即,反向补体)将是5'-CCN2-3',其中N2是任何DNA核苷酸并且紧接着向导RNA的DNA靶向区段在靶DNA的互补链上与其杂交的序列的5'。在一些此类情况下,N1和N2可以是互补的,并且N1-N2碱基对可以是任何碱基对(例如,N1=C并且N2=G;N1=G并且N2=C;N1=A并且N2=T;或N1=T并且N2=A)。在来自金黄色葡萄球菌的Cas9的情况下,PAM可以是NNGRRT或NNGRR,其中N可以是A、G、C或T,并且R可以是G或A。在来自空肠弯曲杆菌的Cas9的情况下,PAM可以是例如NNNNACAC或NNNNRYAC,其中N可以是A、G、C或T,并且R可以是G或A。在一些情况下(例如,对于FnCpf1),PAM序列可以位于5'末端上游并且具有序列5'-TTN-3'。
向导RNA靶序列的实例是紧接在由SpCas9蛋白识别的NGG基序之前的20个核苷酸的DNA序列。例如,向导RNA靶序列加PAM的两个实例是GN19NGG(SEQ ID NO:13)或N20NGG(SEQID NO:14)。参见例如,WO 2014/165825,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。5'末端处的鸟嘌呤可以促进细胞中RNA聚合酶的转录。向导RNA靶序列加PAM的其它实例可以包括5'末端处的两个鸟嘌呤核苷酸(例如,GGN20NGG;SEQ ID NO:15)以促进体外T7聚合酶的高效转录。参见例如,WO 2014/065596,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。其它向导RNA靶序列加PAM的长度可以介于4-22个核苷酸之间,包括5'G或GG和3'GG或NGG。又其它向导RNA靶序列加PAM的长度可以介于14个与20个核苷酸之间。示例性sgRNA序列包括但不限于SEQ ID NO:17-38、40-41、43、48和50-55。
与靶DNA杂交的CRISPR复合物的形成可以导致在与向导RNA靶序列(即,靶DNA的非互补链上的向导RNA靶序列和互补链上的向导RNA与其杂交的反向补体)相对应的区域内或附近的靶DNA的一条或两条链的切割。例如,切割位点可以位于向导RNA靶序列内(例如,在相对于PAM序列的限定位置处)。“切割位点”包括Cas蛋白产生单链断裂或双链断裂的靶DNA的位置。切割位点可以仅在双链DNA的一条链上(例如,当使用切口酶时)或在两条链上。切割位点可以在两条链上的同一位置处(产生钝端;例如,Cas9))或者可以在每条链上的不同位点处(产生交错末端(即,突出端);例如,Cpf1)。可以例如通过使用两种Cas蛋白产生交错末端,所述两种蛋白中的每种蛋白在不同链的不同切割位点处产生单链断裂,由此产生双链断裂。例如,第一切口酶可以在双链DNA(dsDNA)的第一链上产生单链断裂,并且第二切口酶可以在dsDNA的第二链上产生单链断裂,使得产生突出序列。在一些情况下,第一链上的切口酶的向导RNA靶序列或切割位点与第二链上的切口酶的向导RNA靶序列或切割位点相隔至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、250个、500个或1,000个碱基对。
另外的基因修饰药剂
在一些实施例中,本文所公开的药剂是除了CRISPR/Cas系统之外的用于基因组编辑的药剂。可以使用基因疗法进行DNA的缺失以敲除或破坏靶基因。敲除可以是基因敲低,或者可以通过本领域已知的技术(包括但不限于逆转录病毒基因转移)通过突变(如点突变、插入、缺失、移码或错义突变)将基因敲除。在一些实施例中,药剂是可有效结合和修饰本文所公开的基因中的至少一个基因(例如,自噬基因,本文所公开的自噬基因,或NF-κB基因,本文所公开的NF-κB基因)的核酸酶(例如,锌指核酸酶或TALEN)。
将切口或双链断裂诱导成期望靶序列的任何核酸酶药剂或与期望靶序列结合的任何DNA结合蛋白可以用于本文所公开的方法和组合物中。可以采用天然存在的或天然的核酸酶药剂,只要所述核酸酶药剂在期望靶序列中诱导切口或双链断裂即可。同样,可以使用天然存在的或天然的DNA结合蛋白,只要DNA结合蛋白与期望靶序列结合。可替代地,可以采用经修饰的或工程化核酸酶药剂或DNA结合蛋白。“工程化核酸酶药剂或DNA结合蛋白”包括从其天然形式工程化(修饰或源自)以特异性识别期望靶序列的核酸酶药剂或DNA结合蛋白。因此,工程化核酸酶药剂或DNA结合蛋白可以源自天然的、天然存在的核酸酶药剂或DNA结合蛋白,或者可以人工产生或合成。工程化核酸酶剂或DNA结合蛋白可以识别靶序列,例如,其中靶序列不是已经被天然的(非工程化的或非修饰的)核酸酶药剂或DNA结合蛋白识别的序列。核酸酶药剂或DNA结合蛋白的修饰可以少至蛋白质切割剂中的一个氨基酸或核酸切割剂中的一个核苷酸。在靶序列或其它DNA中产生切口或双链断裂在本文中可以被称为“切割(cutting)”或“切割(cleaving)”靶序列或其它DNA。
还提供了核酸酶药剂或DNA结合蛋白(即,工程化核酸酶药剂或DNA结合蛋白)的活性变体和片段。此类活性变体可以包括与天然核酸酶药剂或DNA结合蛋白具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性,其中活性变体保留在期望靶序列处切割的能力并且因此保留切口或双链断裂诱导活性或保留结合期望靶序列的能力。例如,本文所述的核酸酶药剂中的任何核酸酶药剂都可以从天然核酸内切酶序列进行修饰,并且被设计成在未被天然核酸酶药剂识别的靶序列处识别和诱导切口或双链断裂。因此,一些工程化核酸酶具有特异性以在不同于对应的天然核酸酶药剂靶序列的靶序列处诱导切口或双链断裂。对切口或双链断裂诱导活性的测定是已知的,并且通常测量核酸内切酶对含有靶序列的DNA底物的总体活性和特异性。靶序列可以是细胞内源的(或天然的),或者靶序列可以是细胞外源的。细胞外源性靶序列并非天然存在于细胞的基因组中。靶序列还可以对于期望定位在靶基因座处的所关注多核苷酸是外源的。在一些情况下,靶序列在宿主细胞的基因组中仅存在一次。
还提供了例示性靶序列的活性变体和片段。此类活性变体可以包括与给定靶序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性,其中活性变体保留生物活性并且因此能够以序列特异性方式被核酸酶药剂识别和切割。通过核酸酶药剂测量靶序列的双链断裂的测定是已知的(例如,qPCR测定,Frendewey等人(2010)《酶学方法(Methods in Enzymology)》476:295-307,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。
靶序列的长度可以变化,并且包括例如对于锌指蛋白或锌指核酸酶(ZFN)对为约30-36bp(即,对于每个ZFN为约15-18bp)、对于转录激活子样效应子(TALE)蛋白或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)为约36bp、或对于CRISPR/Cas9向导RNA为约20bp的靶序列。
DNA结合蛋白或核酸酶药剂的靶序列可以定位在靶基因组基因座中或附近的任何地方。靶序列可以定位在基因的编码区内,或者在影响基因表达的调控区内。DNA结合蛋白或核酸酶药剂的靶序列可以定位在内含子、外显子、启动子、增强子、调控区或任何非蛋白质编码区中。
可以用于本文所公开的各种方法和组合物中的一种类型的DNA结合蛋白是转录激活子样效应子(TALE)。TALE可以与例如表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域融合或连接。此类结构域的实例在下文中关于Cas蛋白进行描述,并且也可以在例如WO 2011/145121中找到,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。相应地,可以用于本文所公开的各种方法和组合物的一种类型的核酸酶药剂是转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)。TAL效应子核酸酶是一类序列特异性核酸酶,其可以用于在原核或真核生物基因组中的特异性靶序列处产生双链断裂。TAL效应子核酸酶通过将天然或工程化转录激活子样(TAL)效应子或其功能部分与如FokI等核酸内切酶的催化结构域融合来产生。独特的模块化TAL效应子DNA结合结构域允许设计具有潜在任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此,TAL效应子核酸酶的DNA结合结构域可以被工程化以识别特异性DNA靶位点,并且因此用于在期望靶序列处产生双链断裂。参见WO 2010/079430;Morbitzer等人(2010)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》107(50:21617-21622;Scholze和Boch(2010)《毒力(Virulence)》1:428-432;Christian等人(2010)《遗传学(Genetics)》186:757-761;Li等人(2011)《核酸研究》39(1):359-372;以及Miller等人(2011)《自然生物技术》29:143-148,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
来自FokI核酸内切酶末端的非特异性DNA切割结构域可以用于构建在酵母测定中具有活性的杂交核酸酶。这些试剂在植物细胞和动物细胞中也具有活性。FokI结构域充当二聚体,从而使靶基因组中具有适当取向和间隔的位点需要具有独特的DNA结合结构域的两种构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数量和两个单独的TALEN结合位点之间的碱基的数量两者是用于实现高活性水平的参数。TALEN DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数量可以通过在多个TAL效应子重复序列与FokI核酸内切酶结构域之间引入间隔子(不同于间隔子序列)来修饰。间隔子序列可以为12个至30个核苷酸。
氨基酸序列与TALEN结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。在这种情况下,人工基因合成是有问题的,因为在TALE结合结构域中发现的重复序列的退火不正确。对此的一个解决方案是使用可公开获得的软件程序(DNAWorks)来计算适于在两步PCR中组装的寡核苷酸;寡核苷酸组装,随后是全基因扩增。还报告了用于产生工程化TALE构建体的多种模块化组装方案。两种方法都提供了在概念上类似于用于产生锌指DNA识别结构域的模块化组装方法的工程化DNA结合结构域的系统性方法。
一旦TALEN基因被组装,则将所述基因插入质粒中;然后使用质粒来转染靶细胞,在所述靶细胞中基因产物被表达并进入细胞核以接近基因组。TALEN可以用于通过诱导双链断裂(DSB)来编辑基因组,所述细胞通过修复机制作出响应。
合适的TAL核酸酶的实例和用于制备合适的TAL核酸酶的方法公开于例如,US2011/0239315A1、US 2011/0269234 A1、US 2011/0145940 A1、US 2003/0232410 A1、US2005/0208489A1、US 2005/0026157 A1、US 2005/0064474 A1、US 2006/0188987 A1和US2006/0063231A1中,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。在各个实施例中,TAL效应子核酸酶被工程化,其在例如所关注基因组基因座中的靶核酸序列中或附近切割,其中靶核酸序列在待修饰的序列处或附近。
在一些TALEN中,TALEN的每个单体包括通过两个高变残基识别单个碱基对的33-35个TAL重复序列。在一些TALEN中,核酸酶药剂是包括与如FokI核酸内切酶等独立核酸酶可操作地连接的基于TAL重复序列的DNA结合结构域的嵌合蛋白。例如,核酸酶药剂可以包括第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域,其中第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域中的每个结合结构域与FokI核酸酶可操作地连接,其中第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域识别由不同长度(12-20bp)的间隔子序列分开的靶DNA序列的每条链中的两个连续靶DNA序列,并且其中FokI核酸酶亚基二聚化以产生在靶序列处使双链断裂的活性核酸酶。
转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制酶。这些试剂能够实现高效、可编程和特异性DNA切割,并且代表用于原位基因组编辑的强大工具。转录激活子样效应子(TALE)可以快速工程化以结合实际上任何DNA序列。如本文所使用的,术语TALEN是广泛的并且包括单体TALEN,其可以在没有另一个TALEN辅助的情况下切割双链DNA。术语“TALEN”还用于指代被工程化成一起工作以在同一位点处切割DNA的一对TALEN中的一个或两个成员。一起工作的TALEN可以被称为左TALEN和右TALEN,其参考DNA的偏手性(handedness)。参见美国序列第12/965,590号;美国序列第13/426,991号(美国专利第8,450,471号);美国序列第13/427,040号(美国专利第8,440,431号);美国序列第13/427,137号(美国专利第8,440,432号);以及美国序列第13/738,381号,以上文献全部通过引用整体并入本文。
DNA结合蛋白的另一个实例是锌指蛋白。此类锌指蛋白可以与例如表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域连接或融合。此类结构域的实例在下文中关于Cas蛋白进行描述,并且也可以在例如WO 2011/145121中找到,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。相应地,可以用于本文所公开的各种方法和组合物的核酸酶药剂的另一个实例是锌指核酸酶(ZFN)。在一些ZFN中,ZFN的每个单体包括三个或更多个基于锌指的DNA结合结构域,其中每个基于锌指的DNA结合结构域与3bp亚位点结合。在其它ZFN中,ZFN是包括基于锌指的DNA结合结构域的嵌合蛋白,所述结合结构域与如FokI核酸内切酶等独立的核酸酶可操作地连接。例如,核酸酶药剂可以包括第一ZFN和第二ZFN,其中第一ZFN和第二ZFN中的每个ZFN与FokI核酸酶亚基可操作地连接,其中第一ZFN和第二ZFN识别由约5-7bp间隔子分开的靶DNA序列中的每条链中的两个连续靶DNA序列,并且其中FokI核酸酶亚基二聚化以产生使双链断裂的活性核酸酶。参见例如,US 2006/0246567;US 2008/0182332;US 2002/0081614;US 2003/0021776;WO 2002/057308A2;US 2013/0123484;US2010/0291048;WO 2011/017293A2;以及Gaj等人(2013)《生物技术趋势(Trends inBiotechnology)》31(7):397-405,所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
干扰核酸药剂
在某些实施例中,本文提供了选择性靶向和抑制自噬或NF-κB基因(例如,表1或表2中列出的基因)的产物(例如,mRNA产物)的活性或表达的干扰核酸分子,和/或在本文所述的方法中使用所述干扰核酸分子。在一些实施例中,干扰核酸在表达至少一个自噬基因或至少一个NF-κB基因(例如,表1或表2中列出的基因)的产物的细胞中诱导细胞毒性。药剂可以抑制至少一个自噬基因或至少一个NF-κB基因的产物(例如,mRNA产物)的表达或活性至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。本文所公开的药剂可以包括与至少一个自噬基因或至少一个NF-κB基因的产物(例如,mRNA产物)至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%互补性。
在一些实施例,抑制核酸是siRNA、shRNA、PNA或miRNA分子。干扰核酸通常包括环状亚基的序列,每个环状亚基携带碱基配对部分,通过亚基间键连接,所述亚基间键允许碱基配对部分通过沃森-克里克碱基配对与核酸(通常为RNA)中的靶序列杂交,以在靶序列内形成核酸:寡聚体异源双链体。干扰RNA分子包括但不限于反义分子、siRNA分子、单链siRNA分子、miRNA分子和shRNA分子。
通常,靶mRNA序列的补体的至少17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸足以介导对靶转录物的抑制。完美的互补性不是必需的。在一些实施例中,干扰核酸分子是双链RNA。双链RNA分子可以具有2核苷酸3'突出端。在一些实施例中,两条RNA链通过发夹结构连接,从而形成shRNA分子。shRNA分子可以含有源自微小RNA分子的发夹。例如,可以通过将干扰RNA序列克隆到含有来自miR30 miRNA的发夹的pCAG-miR30构建体中来构建RNAi载体。RNA干扰分子可以包括DNA残基以及RNA残基。
本文所提供的干扰核酸分子可以含有RNA碱基、非RNA碱基或RNA碱基和非RNA碱基的混合物。例如,本文所提供的干扰核酸分子可以主要由RNA碱基构成,但也含有DNA碱基或非天然存在的核苷酸。
干扰核酸可以采用多种寡核苷酸化学。寡核苷酸化学的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、连接核酸(LNA)、硫代磷酸酯、2'O-Me-修饰的寡核苷酸和吗啉代化学,包括任何前述的组合。通常,PNA和LNA化学可以利用较短的靶向序列,因为其相对于2'O-Me寡核苷酸而言具有相对高的靶结合强度。通常将硫代磷酸酯和2'O-Me-修饰的化学组合以产生具有硫代磷酸酯骨架的2'O-Me修饰的寡核苷酸。参见例如,PCT公开第WO/2013/112053号和第WO/2009/008725号,所述文献通过引用整体并入。
肽核酸(PNA)是DNA的类似物,其中骨架在结构上与脱氧核糖骨架同态,由与嘧啶或嘌呤碱基连接的N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA与遵循沃森-克里克碱基配对规则的互补寡核苷酸杂交,并在碱基对识别方面模拟DNA(Egholm,Buchardt等人1993)。PNA的骨架由肽键而不是磷酸二酯键形成,使得所述骨架非常适合于反义应用(参见以下结构)。骨架不带电,从而产生表现出高于正常热稳定性的PNA/DNA或PNA/RNA双链体。PNA不被核酸酶或蛋白酶识别。
尽管天然结构发生了根本性结构变化,但PNA能够以螺旋形式与DNA或RNA进行序列特异性结合。PNA的特性包括对互补DNA或RNA的高结合亲和力;由单碱基错配引起的去稳定化作用;对核酸酶和蛋白酶的抗性;与独立于盐浓度的DNA或RNA的杂交;以及与同型嘌呤DNA的三链体形成。PANAGENE.TM.已开发出其专有的Bts PNA单体(Bts;苯并噻唑-2-磺酰基)和专有的低聚工艺。使用Bts PNA单体进行的PNA低聚由脱保护、偶联和封端的重复循环构成。PNA可以使用本领域已知的任何技术合成产生。参见例如,美国专利第6,969,766号、第7,211,668号、第7,022,851号、第7,125,994号、第7,145,006号和第7,179,896号。对于PNA的制备还参见美国专利第5,539,082号、第5,714,331号和第5,719,262号。可以在Nielsen等人,《科学》,254:1497-1500,1991中找到PNA化合物的另外教导。前述文献中的每个文献通过引用整体并入。
干扰核酸还可以含有“锁核酸”亚基(LNA)。“LNA”是称为桥接核酸(BNA)的一类修饰的成员。BNA的特征在于在C30-内(北)糖褶中锁定核糖环构象的共价键。对于LNA,桥是由2'-O与4'-C位置之间的亚甲基构成。LNA增强骨架预组织和碱基堆积,以增加杂交和热稳定性。
可以在以下文献中找到LNA的结构:例如,Wengel等人,《化学通讯(ChemicalCommunications)》(1998)455;《四面体(Tetrahedron)》(1998)54:3607;以及《化学研究述评(Accounts of Chem.Research)》(1999)32:301);Obika等人,《四面体快报(TetrahedronLetters)》(1997)38:8735;(1998)39:5401;以及《生物有机和药物化学(BioorganicMedicinal Chemistry)》(2008)16:9230。本文所提供的化合物可以掺入一个或多个LNA;在一些情况下,化合物可以完全由LNA构成。用于合成单个LNA核苷亚基及其掺入寡核苷酸中的方法描述于例如美国专利第7,572,582号、第7,569,575号、第7,084,125号、第7,060,809号、第7,053,207号、第7,034,133号、第6,794,499号和第6,670,461号,所述文献中的每个文献通过引用整体并入。典型的亚基间连接子包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分;可替代地,可以采用不含磷的连接子。一个实施例是含LNA的化合物,其中每个LNA亚基由DNA亚基分离。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基构成,其中亚基间连接子是硫代磷酸酯。
“硫代磷酸酯”(或S-寡核苷酸)是正常DNA的变体,其中非桥接氧之一被硫置换。核苷酸间键的硫化减少了核酸内切酶和核酸外切酶的作用,包括5'至3'和3'至5'DNA POL1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、RNase、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯通过两个主要途径制备:通过元素硫于二硫化碳中的溶液对氢膦酸酯的作用,或通过用二硫化四乙基秋兰姆(tetraethylthiuram disulfide,TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)来硫化亚磷酸三酯的方法(参见例如,Iyer等人,《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》55,4693-4699,1990)。后一种方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中的不溶性和二硫化碳的毒性的问题。TETD和BDTD方法也产生更高纯度的硫代磷酸酯。
“2'O-Me寡核苷酸”分子在核糖分子的2'-OH残基处携带甲基。2'-O-Me-RNA显示出与DNA相同(或类似)的行为,但被保护免于核酸酶降解。2'-O-Me-RNA还可以与硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)组合以用于进一步稳定化。2'O-Me寡核苷酸(磷酸二酯或硫代磷酸酯)可以根据本领域的常规技术合成(参见例如,Yoo等人,《核酸研究》32:2008-16,2004)。
本文所述的干扰核酸可以与细胞接触或施用于生物体(例如,人)。可替代地,编码干扰RNA分子的构建体和/或载体可以与细胞或生物体接触或引入细胞或生物体中。在某些实施例中,使用病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。在一些实施例中,载体对心脏组织具有向性。在一些实施例中,载体是腺相关病毒。
在一些实施例中,干扰核酸分子是siRNA分子。此类siRNA分子应当包括与靶区域具有足够同源性的区域,并且在核苷酸方面具有足够的长度,使得siRNA分子下调靶RNA。在经修饰的RNA或核苷酸替代物的情况下,术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指代在一个或多个位置处的经修饰的核苷酸或替代物置换部分。siRNA分子与靶标之间不必存在完美的互补性,但对应性必须足以使siRNA分子能够引导序列特异性沉默,如通过靶RNA的RNAi切割。在一些实施例中,有义链仅需要与反义链充分互补,以维持分子的总体双链特征。
另外,siRNA分子可以被修饰或包括核苷替代物。siRNA分子的单链区域可以被修饰或包括核苷替代物,例如,发夹结构的一个或多个未配对区域,例如,连接两个互补区域的区域,可以具有修饰或核苷替代物。修饰以稳定siRNA分子的一个或多个3'端或5'端,例如针对核酸外切酶,或以有利于反义siRNA药剂进入RISC也是有用的。修饰可以包括C3(或C6、C7、C12)氨基连接子、硫醇连接子、羧基连接子、非核苷酸间隔子(C3、C6、C9、C12、脱碱基、三甘醇、六甘醇)、特殊的生物素或荧光素试剂,其作为亚磷酰胺出现并且具有另一个DMT保护的羟基,从而允许RNA合成期间的多重偶联。
shRNA的非限制性实例包括由单链分子组装的双链多核苷酸分子,其中有义区和反义区通过基于核酸的连接子或基于非核酸的连接子连接;以及具有发夹二级结构的双链多核苷酸分子,所述发夹二级结构具有自身互补的有义区和反义区。在一些实施例中,shRNA的有义链和反义链通过环结构连接,所述环结构包括约1个至约25个核苷酸、约2个至约20个核苷酸、约4个至约15个核苷酸、约5个至约12个核苷酸或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸。
在美国专利申请公开第2011/0071208号中描述了与shRNA以及设计和合成此类shRNA的方法相关的另外的实施例,所述美国专利申请的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
在一些实施例中,本文提供了微小RNA(miRNA)。miRNA表示生物体中天然产生的很大的一组的小RNA,所述小RNA中的一些小RNA调节靶基因的表达。miRNA通过Dicer由大约70个核苷酸单链发夹前体转录物形成。miRNA不被翻译成蛋白质,而是与特异性信使RNA结合,由此阻断翻译。在一些情况下,miRNA与其靶标碱基配对不精确,从而抑制翻译。
在某些实施例中,反义寡核苷酸可以与靶序列100%互补,或可以包括错配,例如,以改进含有疾病相关突变的等位基因的选择性靶向,只要在寡核苷酸与靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受可以在体内发生的细胞核酸酶的作用和其它降解模式。因此,某些寡核苷酸在寡核苷酸与靶序列之间可以具有约或至少约70%序列互补性,例如,70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列互补性。本文讨论了不易被核酸酶切割的寡核苷酸骨架。错配(如果存在的话)通常比在中间朝向杂交双链体的末端区域去稳定化更少。根据充分理解的双链体稳定性的原理,所允许的错配的数量将取决于寡核苷酸的长度、双链体中的G:C碱基对的百分比以及双链体中的错配的位置。
干扰核酸分子可以例如通过化学合成、体外转录或通过Rnase III或Dicer消化长dsRNA来制备。这些可以通过转染、电穿孔或本领域已知的其它方法引入到细胞中。参见Hannon,GJ,2002,RNA干扰(RNA Interference),《自然》418:244-251;Bernstein E等人,2002,其余部分是沉默(The rest is silence.)《核糖核酸(RNA)》7:1509-1521;HutvagnerG等人,RNAi:自然不喜欢双链(RNAi:Nature abhors a double-strand.)《当代遗传学与发育观点(Curr.Opin.Genetics&Development)》12:225-232;Brummelkamp,2002,用于在哺乳动物细胞中稳定表达短干扰RNA的系统(Asystem for stable expression of shortinterfering RNAs in mammalian cells.)《科学》296:550-553;Lee NS,Dohjima T,BauerG,Li H,Li M-J,Ehsani A,Salvaterra P和Rossi J.(2002).靶向HIV-1rev转录物的小干扰RNA在人类细胞中的表达(Expression of small interfering RNAs targeted againstHIV-1rev transcripts in human cells.)《自然生物技术》20:500-505;Miyagishi M和Taira K.(2002).具有四个尿苷3'突出端的U6启动子驱动的siRNA有效抑制哺乳动物细胞中的靶基因表达(U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3'overhangsefficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.)《自然生物技术》20:497-500;Paddison PJ,Caudy AA,Bernstein E,Hannon GJ和Conklin DS.(2002).短发夹RNA(shRNA)在哺乳动物细胞中诱导序列特异性沉默(Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells.)《基因与发育(Genes&Dev.)》16:948-958;Paul CP,Good PD,Winer I和Engelke DR.(2002).小干扰RNA在人类细胞中的有效表达(Effective expression of small interfering RNA in human cells.)《自然生物技术》20:505-508;Sui G,Soohoo C,Affar E-B,Gay F,Shi Y,Forrester WC和Shi Y.(2002).抑制哺乳动物细胞中的基因表达的基于DNA载体的RNAi技术(ADNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.)《美国国家科学院院刊》99(6):5515-5520;Yu J-Y,DeRuiter SL和Turner DL.(2002).通过在哺乳动物细胞中表达短干扰RNA和发夹RNA进行RNA干扰(RNA interference by expression ofshort-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.)《美国国家科学院院刊》99(9):6047-6052。
在本发明的方法中,干扰核酸分子或编码多核苷酸的干扰核酸可以施用于受试者,例如,作为裸核酸与递送试剂的组合和/或作为包括表达干扰核酸分子的序列的核酸。在一些实施例中,干扰核酸直接施用于受试者的肿瘤。在一些实施例中,包括表达干扰核酸分子的序列的核酸在载体,例如质粒、病毒和细菌载体内递送。本领域已知的任何核酸递送方法可以用于本文所述的方法中。合适的递送试剂包括但不限于例如Mirus Transit TKO亲脂性试剂;lipofectin;lipofectamine;cellfectin;聚阳离子(例如,聚赖氨酸)、去端肽胶原、纳米复合物和脂质体。在以下文献中描述了去端肽胶原作为核酸分子的递送媒剂的用途:Minakuchi等人《核酸研究》,32(13):e109(2004);Hanai等人《纽约科学院年鉴(AnnNY Acad Sci.)》,1082:9-17(2006);以及Kawata等人《分子癌症治疗学(Mol CancerTher.)》7(9):2904-12(2008);所述文献中的每个文献以其整体并入本文。示例性干扰核酸递送系统提供于美国专利第8,283,461号、第8,313,772号、第8,501,930号、第8,426,554号、第8,268,798号和第8,324,366号中,所述文献中的每个文献在此通过引用整体并入本文。
在本文所述的方法的一些实施例中,脂质体用于向受试者递送抑制性寡核苷酸。适用于本文所述的方法的脂质体可以由标准囊泡形成脂质形成,所述囊泡形成脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂和甾醇,如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑如期望脂质体大小和血流中的脂质体的半衰期等因素来引导。用于制备脂质体的各种方法是已知的,例如,如在Szoka等人(1980),《生物物理学与生物工程年度评论(Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)》9:467;以及美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号中所描述的方法,所述文献的全部公开内容通过引用并入本文。
用于本发明方法的脂质体还可以被修饰,以便避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面上具有调理作用-抑制部分或掺入脂质体结构中。
小分子药剂
本文所公开的方法和组合物的某些实施例涉及小分子药剂的使用,例如,抑制癌细胞中的自噬基因(例如,本文所公开的自噬基因)或NF-κB基因(例如,本文所公开的NF-κB基因)的产物的表达或活性的小分子药剂。在一些实施例中,小分子在表达自噬基因(例如,本文所公开的自噬基因)或NF-κB基因(例如,本文所公开的NF-κB基因)的产物的细胞中诱导细胞毒性。此类药剂包括本领域已知的药剂和使用本文所述的筛选测定鉴定的药剂。本文所提供的小分子可以对自噬基因(例如,本文所公开的自噬基因)或NF-κB基因(例如,本文所公开的NF-κB基因)的产物具有至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%特异性。
在某些实施例中,药剂可以是小分子自噬抑制剂,如PI3-激酶抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Unc-51样激酶1(ULK1)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白18(Vps18)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白34(Vps34)抑制剂、泛素特异性肽酶(USP10或USP13)抑制剂、基于噻吨酮的自噬抑制剂、ATG4抑制剂、奥托非尼、3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、氯化铵、巴弗洛霉素A1、依洛尼塞、亮抑酶肽、桦木酸、CA074、秋水仙碱、毒胡萝卜素、液泡蛋白-1、长春花碱、去甲基氯米帕明、LY294002、PT210、GSK-2126458、Spautin-1、SAR405、化合物31、VPS34-IN1、PIK-III、化合物6、MRT68921、SBI-0206965、胃酶抑素A、E64d、氯米帕明、硫蒽酮、氯喹、羟基氯喹、莫能菌素、Lys05、ARN5187、化合物30、MPT0L145、ROC325、维替泊芬、NSC185058和NSC377071。另外的自噬抑制剂和关于自噬抑制剂的细节可以在Waleska K.Martins和Mauricio S.Baptista(2016年11月10日)中找到。用于器官靶向疗法的自噬调节、细胞生理学和病理学的当前趋势的自噬(Autophagy Modulation for Organelle-TargetingTherapy,Autophagy in Current Trends in Cellular Physiology and Pathology),Nikolai V.Gorbunov和Marion Schneider,IntechOpen,DOI:10.5772/63976(可从以下网址获得:https://www.intechopen.com/books/autophagy-in-current-trends-in-cellular-physiology-and-pathology/autophagy-modulation-for-organelle-targeting-therapy);Pasquier,Benoit.“自噬抑制剂(Autophagy inhibitors)”《细胞和分子生命科学(Cellular and Molecular Life Sciences)》73(2015):985-1001;美国专利第8524762号和第9926326号;以及WIPO公开WO2011011522,所述文献中的每个文献特此通过引用整体并入。
在一些实施例中,药剂可以是NF-κB通路的抑制剂。小分子自噬抑制剂包括IKK和IκB磷酸化抑制剂、IκB降解抑制剂、蛋白酶体和蛋白酶抑制剂、IκBα上调、NF-κB核易位和NF-κB表达抑制剂、NF-κB DNA结合抑制剂、NF-κB反式激活抑制剂、抗氧化剂或上游靶标抑制剂。NF-κB抑制剂的列表可以在Gilmore,T.,Herscovitch,M.,“NF-κB信号传导的抑制剂:785和计数(Inhibitors of NF-κB signaling:785and counting.)”,《癌基因(Oncogene)》25,6887–6899(2006),所述文献特此通过引用整体并入。
可用于本文所公开的方法的药剂可以从任何可用来源获得,所述来源包括天然和/或合成化合物的系统性文库。药剂也可以通过本领域已知的组合文库方法中的多种方法中的任何方法来获得,所述文库方法包括:生物文库;类肽文库(具有肽功能但具有对酶降解具有抗性但仍保持生物活性的新型非肽骨架的分子文库;参见例如,Zuckermann等人,1994,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》37:2678-85);空间可寻址并行固相或溶液相文库;需要去卷积的合成文库方法;‘一珠一化合物’文库方法;以及使用亲和色谱法选择的合成文库方法。生物文库和类肽文库方法仅限于肽文库,而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Lam,1997,《抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)》12:145)。
用于合成分子文库的方法的实例可以在本领域中,例如在以下文献中找到:DeWitt等人(1993)《美国国家科学院院刊》90:6909;Erb等人(1994)《美国国家科学院院刊》91:11422;Zuckermann等人(1994).《药物化学杂志》37:2678;Cho等人(1993)《科学》261:1303;Carrell等人(1994)《应用化学国际版英语》33:2059;Carell等人(1994)《应用化学国际版英语》33:2061;以及Gallop等人(1994)《药物化学杂志》37:1233。
药剂的文库可以存在于溶液中(例如,Houghten,1992,《生物技术(Biotechniques)》13:412-421)或珠上(Lam,1991,《自然》354:82-84)、细碎物(Fodor,1993,《自然》364:555-556)、细菌和/或孢子(Ladner,《美国药典(USP)》5,223,409)、质粒(Cull等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:1865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith,1990,《科学》249:386-390;Devlin,1990,《科学》249:404-406;Cwirla等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:6378-6382;Felici,1991,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》222:301-310;Ladner,同上)。
可用于本文所公开的方法中的药剂可以例如使用用于筛选候选物或测试药剂(例如,降低自噬基因(例如,本文所公开的自噬基因)或NF-κB基因(例如,本文所公开的NF-κB基因)的产物的活性或表达的药剂)的测定来鉴定。
药剂递送
本文所公开的核酸和蛋白质药剂(例如,CRISPR/Cas药剂、TALEN药剂、ZFN药剂、干扰核酸药剂)可以通过任何可用方式引入到细胞(例如,癌细胞)中。“引入”包括以使得序列进入细胞内部的方式向细胞呈递核酸或蛋白质。引入可以通过任何方式完成,并且可以以任何组合同时或顺序地将组分中的一种或多种组分(例如,组分中的两种组分,或组分中的全部组分)引入到细胞中。使细胞的基因组与核酸酶药剂接触可以包括将一种或多种核酸酶药剂或编码核酸酶药剂的核酸(例如,一种或多种Cas蛋白质或编码一种或多种Cas蛋白的核酸,以及一个或多个向导RNA或编码一个或多个向导RNA的核酸(即,一个或多个CRISPRRNA和一个或多个tracrRNA))引入到细胞中。接触细胞的基因组(即,接触细胞)可以包括将上述组分中的仅一种组分、组分中的一种或多种组分或组分中的全部组分引入到细胞中。
在一些实施例中,用于本文所提供的核酸和蛋白质药剂的合适的递送方法包括但不限于电穿孔、iTOP、脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、CPP递送、DNA纳米结构或金纳米颗粒。
用于本文所公开的核酸药剂(例如,基于质粒的gRNA-Cas、Ca9 mRNA、sgRNA、干扰核酸药剂)的合适的递送方法包括但不限于电穿孔、流体动力学注射、显微注射、机械细胞变形、脂质纳米颗粒、AAV或慢病毒。
核酸酶药剂可以以蛋白质的形式或以编码核酸酶药剂的核酸的形式(如RNA(例如,信使RNA(mRNA))或DNA)引入到细胞中。当以DNA的形式引入时,DNA可以与细胞中具有活性的启动子可操作地连接。此类DNA可以位于一种或多种表达构建体中。
例如,Cas蛋白可以以蛋白质的形式(如与gRNA复合的Cas蛋白)或以编码Cas蛋白的核酸的形式(如RNA(例如,信使RNA(mRNA))或DNA)引入到细胞中。向导RNA可以以RNA的形式或以编码向导RNA的DNA的形式引入到细胞中。当以DNA的形式引入时,编码Cas蛋白的DNA和/或向导RNA可以与细胞中具有活性的启动子可操作地连接。此类DNA可以位于一种或多种表达构建体中。例如,此类表达构建体可以是单个核酸分子的组分。可替代地,所述表达构建体可以在两个或更多个核酸分子之间以任何组合分离(即,编码一个或多个CRISPRRNA的DNA、编码一个或多个tracrRNA的DNA和编码Cas蛋白的DNA可以是单独核酸分子的组分)。
本文的公开内容还提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括靶向自噬或NF-kB基因表达的gRNA分子之一或其混合物以及药学上可接受的载体。例如,本发明提供了药物组合物,所述药物组合物各自包括一种、两种、三种或更多种靶向自噬或NF-kB基因的gRNA分子。
本文所提供的药剂可以包括包封在脂质颗粒内的gRNA。关于包括包封在脂质颗粒内的gRNA的混合物的调配物,不同的gRNA分子可以共包封在同一脂质颗粒中,或者存在于混合物中的每种类型的gRNA物种可以包封在单独颗粒中,或者一些gRNA物种可以共包封在同一颗粒中,而其它gRNA物种包封在调配物内的不同颗粒中。在某些实施例中,脂质颗粒包括gRNA和编码Cas蛋白的mRNA两者。在某些实施例中,一个群体脂质颗粒包括gRNA,并且另一个群体脂质颗粒包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的mRNA,所述脂质颗粒可以位于同一组合物或不同的组合物中,并且可以同时或顺序施用。
在一些实施例中,脂质颗粒由阳离子脂质、非阳离子脂质和任选地防止颗粒聚集的缀合脂质形成。包括核酸分子(例如,gRNA分子)的脂质颗粒被称为核酸-脂质颗粒。核酸可以完全包封在脂质颗粒内,由此保护核酸免于酶降解。在一些实施例中,核酸-脂质颗粒的总脂质:gRNA质量比为约5:1至约15:1。在某些实施例中,核酸-脂质颗粒的总脂质:gRNA质量比为约5:1至约15:1或为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分数或范围。在某些实施例中,核酸-脂质颗粒的总脂质:gRNA质量比为约9:1(例如,脂质:药物比为8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1,包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1和9.8:1)。核酸-脂质颗粒的施用可以通过本领域已知的任何通路,例如,口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、病灶内、气管内、皮下或皮内。在特定实施例中,核酸-脂质颗粒全身施用,例如通过肠内或肠胃外施用通路。核酸可以与缩合剂复合,并包封在脂质颗粒内,如PCT公开第WO 00/03683号中所阐述的脂质颗粒,所述文献的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
本文所提供的脂质颗粒的平均直径可以为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或为约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于例如,美国专利公开第20040142025号和第20070042031号中,所述美国专利的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
核酸-脂质颗粒可以包括脂质缀合物。此类脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物,如例如,与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如,PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如,PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺偶联的PEG(参见例如,美国专利第5,885,613号)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如,POZ-DAA缀合物)、聚酰胺寡聚体(例如,ATTA脂质缀合物)和其混合物。在PCT公开号WO 2010/006282中描述了POZ-脂质缀合物的另外的实例。PEG或POZ可以直接与脂质缀合,或者可以通过连接子部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG或POZ与脂质偶联的任何连接子部分,包括例如不含酯的连接子部分和含酯的连接子部分。在某些实施例中,使用不含酯的连接子部分,如酰胺或氨基甲酸酯。
在一些实施例中,核酸-脂质颗粒中的脂质缀合物抑制颗粒的聚集,并且可以包括例如本文所述的脂质缀合物中的一种或多种脂质缀合物。在一个特定实施例中,脂质缀合物包括PEG-脂质缀合物。PEG-脂质缀合物的实例包括但不限于PEG-DAG缀合物、PEG-DAA缀合物和其混合物。在某些实施例中,PEG-脂质缀合物选自由以下组成的组:PEG-二酰基甘油(PEG-DAG)缀合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物、PEG-磷脂缀合物、PEG-神经酰胺(PEG-Cer)缀合物和其混合物。在某些实施例中,PEG-脂质缀合物是PEG-DAA缀合物。在某些实施例中,脂质颗粒中的PEG-DAA缀合物可以包括PEG-二癸氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)缀合物、PEG-二棕榈氧基丙基(C16)缀合物、PEG-二硬脂氧基丙基(C18)缀合物或其混合物。在某些实施例中,其中PEG-DAA缀合物是PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)缀合物。在另一个实施例中,PEG-DAA缀合物是化合物(66)(PEG-C-DMA)缀合物。在另一个实施例中,脂质缀合物包括POZ-脂质缀合体,如POZ-DAA缀合物。
在某些实施例中,抑制颗粒聚集的缀合脂质占存在于颗粒中的总脂质的约0.5mol%至约3mol%。
公布的美国专利申请公开第US 2011/0076335 A1号和第US 2018/0245074 A1号中描述了有用的调配物的另外的实施例,所述美国专利申请的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
在某些实施例中,本文所提供的核酸药剂(例如,编码Cas蛋白的DNA和/或编码gRNA的DNA)通过载体(例如,病毒载体/病毒或质粒)递送。
载体可以包括编码Cas蛋白和/或gRNA分子的序列,和/或与被靶向的区域(如靶序列)具有高度同源性的供体模板。在某些实施例中,供体模板包括靶序列的全部或部分。示例性供体模板是修复模板,例如,基因校正模板,或基因突变模板,例如,点突变(例如,单核苷酸(nt)取代)模板)。载体还可以包括编码与例如Cas分子序列融合的信号肽(例如,用于核定位、核仁定位或线粒体定位)的序列。例如,载体可以包括与编码Cas分子的序列融合的核定位序列(例如,来自SV40)。
一个或多个调控/控制元件,例如启动子、增强子、内含子、聚腺苷酸化信号、Kozak共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列以及剪接受体或供体可以包括在载体中。在某些实施例中,启动子被RNA聚合酶II识别。在其它实施例中,启动子被RNA聚合酶III(例如,U6启动子)识别。在某些实施例中,启动子是经调节启动子(例如,诱导型启动子)。在某些实施例中,启动子是组成型启动子。在某些实施例中,启动子是组织特异性启动子。在某些实施例中,启动子是病毒启动子。在某些实施例中,启动子是非病毒启动子。
在某些实施例中,载体或递送媒剂是病毒载体(例如,用于产生重组病毒)。在某些实施例中,病毒是DNA病毒(例如,dsDNA或ssDNA病毒)。在某些实施例中,病毒是RNA病毒(例如,ssRNA病毒)。在某些实施例中,病毒感染分裂细胞。在其它实施例中,病毒感染非分裂细胞。示例性病毒载体/病毒包括例如,逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒。
在某些实施例中,病毒感染分裂细胞。在其它实施例中,病毒感染非分裂细胞。在某些实施例中,病毒感染分裂细胞和非分裂细胞。在某些实施例中,病毒可以整合到宿主基因组中。在某些实施例中,病毒被工程化以具有降低的免疫力,例如在人类中。在某些实施例中,病毒是有复制能力的。在其它实施例中,病毒是具有复制缺陷,例如,另外轮次的病毒粒子复制和/或包装所需的基因的一个或多个编码区被其它基因替代或缺失。在某些实施例中,病毒引起一种或多种Cas分子和/或一种或多种gRNA分子的瞬时表达。在其它实施例中,病毒引起一种或多种Cas分子和/或一种或多种gRNA分子的长期(例如,至少1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、1年、2年)或永久表达。病毒的包装能力可以变化,例如至少约4kb至至少约30kb,例如至少约5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或50kb。
在某些实施例中,病毒载体识别特定的细胞类型或组织。例如,病毒载体可以用不同的/替代性病毒包膜糖蛋白进行假型化;用细胞类型特异性受体(例如,一种或多种病毒包膜糖蛋白的遗传修饰以掺入靶向配体,如肽配体、单链抗体或生长因子)进行工程化;和/或被工程化以具有双特异性的分子桥,其中一端识别病毒糖蛋白并且另一端识别靶细胞表面的一部分(例如,配体-受体、单克隆抗体、亲和素-生物素和化学缀合)。
示例性病毒载体/病毒包括例如,逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒。
在某些实施例中,编码Cas的序列和/或编码gRNA的序列由重组逆转录病毒递送。在某些实施例中,逆转录病毒(例如,莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemiavirus))包括逆转录酶,例如,允许整合到宿主基因组中的逆转录酶。在某些实施例中,逆转录病毒是有复制能力的。
在某些实施例中,逆转录病毒是具有复制缺陷,例如,另外轮次的病毒粒子复制和包装所需的基因的一个或多个编码区被其它基因替代或缺失。
在某些实施例中,编码Cas的核酸序列和/或编码gRNA的核酸序列(任选地供体模板核酸)由重组慢病毒递送。例如,慢病毒具有复制缺陷,例如,不包括病毒复制所需的一个或多个基因。
在某些实施例中,编码Cas的核酸序列和/或编码gRNA的核酸序列(任选地供体模板核酸)由重组腺病毒递送。
在某些实施例中,腺病毒被工程化以在人类中具有降低的免疫力。在某些实施例中,编码Cas的核酸序列和/或编码gRNA的核酸序列(任选地供体模板核酸)由重组AAV递送。在某些实施例中,AAV不将其基因组掺入宿主细胞(例如,如本文所述的靶细胞)的基因组中。在某些实施例中,AAV可以将其基因组的至少一部分掺入宿主细胞(例如,如本文所述的靶细胞)的基因组的至少一部分中。在某些实施例中,AAV是自身互补型腺相关病毒(scAAV),例如,包装退火在一起以形成双链DNA的两条链的scAAV。可以在所公开的方法中使用的AAV血清型包括AAV1、AAV2、经修饰的AAV2(例如,在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、AAV3、经修饰的AAV3(例如,在Y705F、Y73 IF和/或T492V处的修饰)、AAV4、AAV5、AAV6、经修饰的AAV6(例如,在S663 V和/或T492V处的修饰)、AAV8、AAV 8.2、AAV9、AAV rhlO和假型AAV,如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6也可以用于所公开的方法中。在某些实施例中,可以在本文所述的方法中使用的AAV衣壳是来自以下的衣壳序列:血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rhlO、AAV.rh32/33、AAV.rh43、AAV.rh64Rl或AAV7m8。
在某些实施例中,编码Cas的核酸序列和/或编码gRNA的核酸序列(任选地供体模板核酸)在经重新工程化的AAV衣壳中递送,例如,与来自以下的衣壳序列具有约50%或更高,例如约60%或更高、约70%或更高、约80%或更高、约90%或更高或约95%或更高的序列同源性:血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rhlO、AAV.rh32/33、AAV.rh43或AAV.rh64Rl。
在某些实施例中,编码Cas的核酸序列和/或编码gRNA的核酸序列(任选地供体模板核酸)由嵌合AAV衣壳递送。示例性嵌合AAV衣壳包括但不限于AAV9il、AAV2i8、AAV-DJ、AAV2G9、AAV2i8G9或AAV8G9。
在某些实施例中,AAV是自身互补型腺相关病毒(scAAV),例如,包装退火在一起以形成双链DNA的两条链的scAAV。
在某些实施例中,编码Cas9的DNA和/或编码gRNA的DNA(任选地供体模板核酸)是通过杂交病毒递送的,例如,本文所述的病毒中的一种或多种病毒的杂交。在某些实施例中,杂交病毒是AAV(例如,任何AAV血清型)与博卡病毒(Bocavirus)、B 19病毒、猪AAV、鹅AAV、猫AAV、犬AAV或MVM的杂交。可以在WIPO公开WO2018081504A1中找到关于药剂的病毒载体递送的另外的信息,所述文献通过引用整体并入。
在某些实施例中,递送媒剂是非病毒载体。在某些实施例中,非病毒载体是无机纳米颗粒。示例性无机纳米颗粒包括例如磁性纳米颗粒(例如,Fe3Mn02)和二氧化硅。纳米颗粒的外表面可以与带正电荷的聚合物(例如,聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丝氨酸)缀合,所述聚合物允许有效载荷的连接(例如,缀合或截留)。
在一些方法中,编码核酸酶药剂的DNA(例如,Cas蛋白和向导RNA)可以通过DNA微环引入到细胞中。参见例如,WO 2014/182700,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。DNA微环是可以用于非病毒基因转移的既不具有复制起点也不具有抗生素选择标志物的超螺旋DNA分子。因此,DNA微环的大小通常小于质粒载体。这些DNA不含细菌DNA,并且因此缺乏细菌DNA中发现的未甲基化的CpG基序。
本文所提供的方法不依赖于用于将核酸或蛋白质引入到细胞中的特定方法,仅依赖于核酸或蛋白质进入至少一个细胞的内部。用于将核酸和蛋白质引入到各种细胞类型中的方法是已知的,并且包括例如稳定转染方法、瞬时转染方法和病毒介导的方法。
转染方案以及用于将核酸或蛋白质引入到细胞中的方案可以不同。非限制性转染方法包括使用以下的基于化学的转染方法:脂质体;纳米颗粒;磷酸钙(Graham等人(1973)《病毒学(Virology)》52(2):456–67;Bacchetti等人(1977)《美国国家科学院院刊》74(4):1590–4;以及Kriegler,M(1991).《转移和表达:实验室手册(Transfer and Expression:ALaboratory Manual.)》纽约:弗里曼公司(W.H.Freeman and Company.)第96-97页);树枝状聚合物;或阳离子聚合物,如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺。非化学方法包括电穿孔、声波穿孔和光转染。基于颗粒的转染包括使用基因枪或磁体辅助转染(Bertram(2006)《当前制药生物技术(Current Pharmaceutical Biotechnology)》7,277–28)。病毒方法也可以用于转染。
也可以通过电穿孔、胞质内注射、病毒感染、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、转染、脂质介导的转染或通过核转染来介导将核酸或蛋白质引入到细胞中。核转染是使核酸底物不仅能够被递送到细胞质而且能够通过核膜进入到细胞核中的改善的电穿孔技术。另外,在本文所公开的方法中使用核转染通常需要比常规电穿孔少得多的细胞(例如,与常规电穿孔需要700万细胞相比,仅需要约200万细胞)。在一个实例中,使用NUCLEOFECTORTM系统进行核转染。
也可以通过显微注射将核酸或蛋白质引入到细胞中。优选地将mRNA显微注射到细胞质中(例如,以将mRNA直接递送到翻译机器中),而优选地将蛋白质或编码编码Cas蛋白的DNA的DNA显微注射到细胞核中。可替代地,可以通过注射到细胞核和细胞质两者中来进行显微注射:可以首先将针头引入到细胞核中,并且注射第一量,并且从细胞中取出针头时,可以将第二量注射到细胞质中。如果将核酸酶药剂蛋白注射到细胞质中,则所述蛋白质优选地包括核定位信号以确保递送到细胞核/原核中。用于进行显微注射的方法是众所周知的。参见例如,Nagy等人(Nagy A,Gertsenstein M,Vintersten K,Behringer R.,2003,《操纵小鼠胚胎(Manipulating the Mouse Embryo.)》纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,NewYork):冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press));Meyer等人(2010)《美国国家科学院院刊》107:15022-15026;以及Meyer等人(2012)《美国国家科学院院刊》109:9354-9359。
用于将核酸或蛋白质引入到细胞中的其它方法可以包括例如载体递送、颗粒介导的递送、外泌体介导的递送、脂质纳米颗粒介导的递送、细胞穿透肽介导的递送或可植入装置介导的递送。向受试者施用核酸或蛋白质以在体内修饰细胞的方法在本文别处公开。
将核酸和蛋白质引入到细胞中也可以通过流体动力学递送(HDD)来完成。流体动力学递送已成为用于体内胞内DNA递送的方法。对于到实质细胞的基因递送,只需要通过所选血管注射必需的DNA序列,从而消除与当前病毒和合成载体相关的安全问题。当注入到血流中时,DNA能够到达血液可及的不同组织中的细胞。流体动力学递送采用将大量溶液快速注射到循环中的不可压缩的血液中所产生的力来克服阻止大的且膜不可渗透的化合物进入实质细胞的内皮和细胞膜的物理屏障。除了递送DNA之外,这种方法还可用于RNA、蛋白质和其它小化合物在体内的高效胞内递送。参见例如,Bonamassa等人(2011)《药学研究(Pharm.Res.)》28(4):694-701,所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
用于将核酸或蛋白质引入到细胞中的其它方法可以包括例如载体递送、颗粒介导的递送、外泌体介导的递送、脂质纳米颗粒介导的递送、细胞穿透肽介导的递送或可植入装置介导的递送。作为具体实例,可以将核酸或蛋白质以如聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质螺旋体或脂质微管等载体引入到细胞。
在一些情况下,所述方法和组合物中使用的细胞具有稳定掺入其基因组中的DNA构建体。在这种情况下,接触可以包括提供具有已经稳定掺入其基因组中的构建体的细胞。例如,在本文所公开的方法中使用的细胞可以具有稳定掺入其基因组中的预先存在的编码Cas的基因(即,Cas就绪细胞)。“稳定掺入”或“稳定引入”或“稳定整合”包括将多核苷酸引入到细胞中,使得核苷酸序列整合到细胞的基因组中并且能够由其后代遗传。任何方案可以用于靶向基因组整合系统的DNA构建体或各种组分的稳定掺入。
可以通过任何已知的方式将DNA结合蛋白或核酸酶药剂引入到细胞中。可以将编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多肽直接引入到细胞中。可替代地,可以将编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸引入到细胞中。当将编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸引入到细胞中时,DNA结合蛋白或核酸酶药剂可以在细胞内瞬时地、有条件地或组成性地表达。例如,编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸可以包含在表达盒中并且与条件型启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子可操作地连接。此类启动子在本文别处进一步详细讨论。可替代地,DNA结合蛋白或核酸酶药剂可以作为编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的mRNA被引入到细胞中。
编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸可以稳定整合到细胞的基因组中,并且与在细胞中具有活性的启动子可操作地连接。可替代地,编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸可以在靶向载体中或在与包括插入多核苷酸的靶向载体分离的载体或质粒中。
当通过引入编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸向细胞提供DNA结合蛋白或核酸酶药剂时,与编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的天然存在的多核苷酸序列相比,可以修饰这种编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸以取代在所关注细胞中具有更高使用频率的密码子。例如,与天然存在的多核苷酸序列相比,可以修饰编码DNA结合蛋白或核酸酶药剂的多核苷酸以取代在给定的所关注原核或真核细胞中具有更高使用频率的密码子,所述所关注原核或真核细胞包括细菌细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或任何其它所关注宿主细胞。
治疗方法
在一些方面,本文提供了通过向受试者施用抑制癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)来使所述受试者的癌细胞对TNF-α介导的杀伤敏感的方法。在其它方面,本文提供了通过向受试者施用抑制所述癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的至少一种药剂(例如,本文所公开的药剂)来增加对所述受试者的TNF-α介导的癌细胞杀伤的方法。在另外的方面,本文所述的方法包括通过向受试者施用抑制所述受试者的肿瘤中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)来使所述肿瘤对TNF-α介导的杀伤敏感或增加所述TNF-α介导的肿瘤杀伤的方法。
本文还提供了通过向受试者施用抑制受试者的癌细胞中的自噬和/或NF-κB通路的药剂(例如,本文所公开的药剂)和另外的癌症疗法来治疗受试者的癌症的方法。在一些实施例中,另外的癌症疗法是癌症免疫疗法。在某些实施例中,另外的疗法是诱导对TNF-α介导的癌细胞杀伤的疗法。在一些实施例中,另外的疗法是诱导对癌细胞的T细胞杀伤(例如,癌细胞的细胞毒性T细胞杀伤)的疗法。在一些实施例中,另外的癌症疗法包括免疫检查点抑制、TNF-α施用、T细胞免疫疗法(例如,CAR-T细胞免疫疗法)和/或癌症疫苗。
因此,在某些实施例中,本发明的药剂可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合施用。例如,不同的治疗剂可以在同一调配物中或在分开的调配物中同时或顺序地施用。在某些实施例中,不同的治疗剂可以在彼此的约一小时内、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时或约一周内施用。因此,接受这种治疗的受试者可以受益于不同治疗剂的组合效果。
在某些实施例中,本文提供了一种组合物,例如,药物组合物,所述组合物含有至少一种本文所述的药剂连同药学上可接受的载体。在一个实施例中,组合物包含本文所述的多种(例如,两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种)药剂的组合。
在一些实施例中,药物组合物是局部或全身递送的。在一些实施例中,药物组合物可以局部施用于存在于受试者体内的肿瘤或肿瘤微环境。在一些实施例中,药剂或药物组合物与第二癌症治疗剂一起施用。
本文所述的药剂可以与任何其它癌症疗法(包括免疫治疗)联合施用。另外的癌症疗法包括免疫检查点抑制。在一些实施例中,免疫检查点抑制剂抑制免疫检查点蛋白。免疫检查点抑制广义上是指抑制癌细胞可以产生的检查点以阻止或下调免疫应答。免疫检查点蛋白的实例是CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白、A2aR和其组合。免疫检查点抑制剂可以是西米普利单抗(cemiplimab)(REGN2810)、纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)、派姆单抗(pembrolizumab)(MK-3475、SCH 900475)、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A、RG7446、RO5541267)、度伐鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736、MEDI-4736)、阿维单抗(avelumab)(MSB0010718C)、伊匹单抗(ipilimumab)(BMS-734016、IBI310、MDX-010)、SHR1210、信迪利单抗(sintilimab)(IBI308)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)(PDR001)、替雷利珠单抗(tislelizumab)(BGB-A317)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、BCD-100、特瑞普利单抗(toripalimab)(JS001)、BAY 1905254、ASP 8374、PF-06801591、AMP-224、AB122、AK105、AMG 404、BCD-100、BI 754091、F520、HLX10、HX008、JTX-4014、LZM009、MEDI0680、MGA012、Sym021、TSR-042、PSB205、MGD019、MGD013、AK104、XmAb20717、RO7121661、CX-188、INCB086550、FS118、BCD-135、BGB-A333、CBT-502、CK-301、CS1001、FAZ053、HLX20、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、TG-1501、ZKAB001、INBRX-105、MCLA-145、KN046、M7824、LY3415244、INCB086550、CA-170、CX-072、ADU-1604、AGEN1181、AGEN1884、MK-1308、REGN4659、XmAb22841、ATOR-1015、PSB205、MGD019、AK104、XmAb20717、BMS-986249、曲美木单抗(tremelimumab)、BMS-986258、BGB-A425、INCAGN02390、Sym023、JNJ 61610588、BI 754111、LAG525、MK-4280、REGN3767、Sym022、TSR-033、瑞拉利单抗(relatlimab)、JTX-2011、MGD009、BMS-986207、OMP-313M32、MK-7684或TSR-022。
另外的癌症免疫疗法包括过继性免疫疗法,如自体或同种异体T细胞疗法或自体或同种异体CAR T细胞疗法。过继性免疫疗法是一种被设计成增强患者对肿瘤或癌细胞的免疫应答的治疗方法。所述方法涉及从个体中取出免疫细胞,离体形成效应细胞,将细胞扩增至临床相关数量,以及将细胞重新输注到患者体内。本文提供了包括联合施用本文所公开的药剂和表达T细胞受体的同种异体或自体CTL的方法,所述T细胞受体与呈递在I类MHC上的肽(例如,癌肽或受试者特异性肽)特异性结合。在一些实施例中,CTL来自细胞库或来自正在施用CTL的受试者。在一些实施例中,MHC是I类MHC。在一些实施例中,II类MHC具有为HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA或HLA-DRA的α链多肽。在一些实施例中,II类MHC具有为HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB的β链多肽。在一些实施例中,CTL在向受试者施用之前储存在细胞文库或细胞库中。
在一些实施例中,使T细胞与抗原呈递细胞(APC)接触,所述APC呈递对受试者的癌症或肿瘤具有特异性的肽。在一些实施例中,APC是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞或人工抗原呈递细胞(例如,aK562细胞)。用于所述方法的树突状细胞可以通过从患者样品中获取PBMC并将其粘附到塑料来制备。通常,单核细胞群体粘附,并且可以洗掉所有其它细胞。然后用IL-4和GM-CSF分化粘附群体以产生单核细胞衍生的树突状细胞。可以通过添加IL-1β、IL-6、PGE-1和TNF-α(其上调树突状细胞表面上的重要共刺激分子)而使这些细胞成熟,并且然后用本文所提供的肽中的一种或多种肽进行转导。在一些实施例中,APC是人工抗原呈递细胞,如aK562细胞。在一些实施例中,人工抗原呈递细胞被工程化以表达CD80、CD83、41BB-L和/或CD86。在美国专利公开第2003/0147869号中描述了示例性人工抗原呈递细胞,包括aK562细胞,所述美国专利特此通过引用并入。产生抗原呈递细胞的示例性方法可以在WO2013088114中找到,所述文献特此以其整体并入本文。
另一个示例性过继性免疫疗法方案涉及施用自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL细胞具有杀伤能力。TIL细胞是在实体瘤中体内分化的效应细胞(参见美国专利第5,126,1 32号,所述美国专利描述了用于产生用于癌症的过继性免疫疗法的TIL细胞的方法)。可以例如通过以下方式产生TIL细胞:从患者取出肿瘤样品;分离渗透到10肿瘤样品中的淋巴细胞;在存在IL-2的情况下离体生长这些TIL细胞;以及将所述细胞与IL-2一起再输注到患者体内。
另外的癌症疗法可以是CAR-T细胞疗法。嵌合抗原受体(CAR)是将针对肿瘤相关表面抗原的基于抗体的特异性与具有特异性抗肿瘤细胞免疫活性的T细胞受体激活胞内结构域组合的分子(Eshhar,1997,《癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)》45(3-4)131-136;Eshhar等人,1993,《美国国家科学院院刊》90(2):720-724;Brocker和Karjalainen,1998,《免疫学的进展(Adv Immunol)》68:257-269)。这些CAR允许T细胞通过与提供T细胞激活和共刺激信号的胞内结构域融合的单链Fv(scFv)抗原特异性胞外区实现MHC非依赖性初级激活。第二代和第三代CAR还通过CD28和/或CD137(4-1BB)胞内激活基序提供适当的共刺激信号,所述胞内激活基序在各种实体瘤和白血病模型中增强细胞因子分泌和抗肿瘤活性(Pinthus等人,2004,《临床研究杂志(J Clin Invest)》114(12):1774-1781;Milone等人,2009,《分子疗法(Mol Ther)》17(8):1453-1464;Sadelain等人,2009,《当代免疫学观点(Curr Opin Immunol)》21(2):215-223)。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法涉及对患者的自体T细胞进行遗传修饰以表达对肿瘤抗原具有特异性的CAR,随后进行离体细胞扩增并再输注到患者体内。CAR是从特异性单克隆抗体和一个或多个T细胞受体胞内信号传导结构域中选择的单链片段可变的融合蛋白。这种T细胞遗传修饰可以通过基于病毒的基因转移方法或非病毒方法进行,如基于DNA的转座子、CRISPR/Cas9技术或通过电穿孔直接转移体外转录的mRNA。
本文还提供了通过以下方式治疗受试者的癌症的方法:从受试者获得包括T细胞的样品,从样品中分离细胞毒性T淋巴细胞(CTL),离体扩增CTL,以及将经扩增CTL与至少一种药剂(例如,本文所公开的任何药剂)联合地施用于受试者。细胞毒性T细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞。扩增CTL可以包括使CTL与表达癌症特异性或肿瘤特异性抗原的抗原呈递细胞(APC)接触以产生抗原特异性CTL。在一些实施例中,包括T细胞或分离的CTL的样品在施用于受试者之前被刺激。所述方法可以进一步包括在施用于受试者之前使CTL与抗CD3单克隆抗体(OKT3)接触。在其它实施例中,所述方法进一步包括在施用于受试者之前使CTL与人白介素(IL)-2接触。
在一些实施例中,受试者在施用药剂之前已经接受化疗药物。受试者可能对化疗药物是难治性的。受试者可以与接受本文所公开的另外的癌症疗法的药剂顺序地或同时地接受化疗剂。化疗剂包括烷化剂,如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CytoxanTM);烷基磺酸酯,如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮杂环丙烷,如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa);emylerumines和memylamelamines,包括烯丙他明(alfretamine)、triemylenemelamine、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基密胺(trimemylolomelamine);番蒸枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);卡利他汀(callystatin);CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);念珠藻素(cryptophycin)(具体地是念珠藻素1和念珠藻素8);尾海兔素(dolastatin);多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI);艾榴塞洛素(eleutherobin);水鬼蕉碱(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海绵抑制素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustard),如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard);亚硝基脲(nitrosourea),如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(foremustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素,如烯二炔类抗生素(例如,卡奇霉素(calicheamicin),尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素θ1I);达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A;二膦酸盐类(bisphosphonate),如氯屈膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carrninomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(AdramycinTM)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin),如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟脲嘧啶(5-FU);叶酸类似物,如二甲叶酸(demopterin)、氨甲喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、美雄烷(testolactone);抗肾上腺类,如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,如亚叶酸(frolinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);hestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依落氟鸟氨酸(elformthine);依利醋铵(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓(gallium nitrate);羟基脲(hydroxyurea);羟基脲(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱,如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSKTM;雷佐生(razoxane);根瘤毒素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2',2”-三氯三乙胺;单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine));尿烷(urethane);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);盖克托辛(gacytosine);阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺;噻替派(thiopeta);紫杉烷,例如,紫杉醇(TaxolTM,新泽西州普林斯顿大学的百时美施贵宝肿瘤学(Bristol Meyers Squibb Oncology,Princeton,N.J.))和多西他赛(docetaxel)(TaxoteretTM,法国安东尼的罗纳普朗克制药公司(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France));苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine)(GemzarTM);6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤(mercaptopurine);氨甲蝶呤(methotrexate);铂类似物,如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin);长春花碱(vinblastine);铂(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitroxantrone);vancristine;长春瑞滨(vinorelbine)(NavelbineTM);米托蒽醌(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeoloda);伊班膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO);维甲酸,如视黄酸(retinoic acid);卡培他滨(capecitabine);以及上述药物中的任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括在“化疗剂”的定义中的是用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂,如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括例如,它莫西芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬(trioxifene)、酮昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FarestonTM);酶芳香酶抑制剂,其在肾上腺中调节雌激素的产生,例如,4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MegaceTM)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RivisorTM)、来曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿那曲唑(anastrozole)(ArimidexTM);以及抗雄激素,如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprorelin)和戈舍瑞林(goserelin);以及上述药物中的任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如下文详细描述的,本文所公开的药物组合物和/或药剂可以被特别调配成用于以固体或液体形式施用,包括适于以下的药物组合物和/或药剂:(1)口服施用,例如,灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液);片剂,例如,靶向用于口腔、舌下和全身吸收的片剂;丸剂;粉剂;颗粒;用于舌头的糊剂;或(2)肠胃外施用,例如通过皮下、肌内、静脉内、鞘内、大脑内或硬膜外注射,作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放调配物。制备药物调配物或组合物的方法包括使本文所述的药剂与载体和任选地一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常,通过使本文所述的药剂与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地缔合并且然后如果需要的话使产品成形来制备调配物。
适应症
在一些实施例中,本文所述的方法可以用于治疗任何癌症,包括任何癌性或癌前肿瘤。可以通过本文所提供的方法和组合物治疗的癌症包括但不限于膀胱癌、血癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃肠癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌。另外,癌症可以具体地具有以下组织学类型,尽管不限于这些癌症:恶性赘生物;癌;未分化的癌;巨细胞癌和纺锤细胞癌(giant and spindle cell carcinoma);小细胞癌;乳头状癌;鳞状细胞癌;淋巴上皮癌;基底细胞癌;毛母质癌(pilomatrix carcinoma);移行细胞癌;乳头状移行细胞癌;腺癌;恶性胃泌素瘤;胆管癌;肝细胞癌;组合的肝细胞癌和胆管癌;小梁腺癌;腺样囊性癌;腺瘤性息肉中的腺癌;腺癌,家族性结肠息肉病;实体癌;恶性类癌瘤;支气管肺泡腺癌;乳头状腺癌;嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma);嗜酸细胞癌;嗜氧腺癌;嗜碱细胞癌;透明细胞腺癌;颗粒细胞癌;滤泡腺癌;乳头状和滤泡腺癌;非包膜硬化性癌(nonencapsulatingsclerosing carcinoma);肾上腺皮质癌;子宫内膜样癌;皮肤附件癌(skin appendagecarcinoma);大汗腺癌(apocrine adenocarcinoma);皮脂腺癌;耵聍腺癌;粘液表皮样癌;囊腺癌;乳头状囊腺癌;乳头状浆液性囊腺癌;粘液性囊腺癌;粘液性腺癌;印戒细胞癌;浸润性导管癌;髓样癌;小叶癌;炎性癌;乳腺派杰氏病(mammary paget's disease);腺泡细胞癌;腺鳞状癌;腺癌伴鳞状化生(adenocarcinoma w/squamous metaplasia);恶性胸腺瘤;恶性卵巢间质瘤;恶性泡膜细胞瘤(malignant thecoma);恶性颗粒细胞瘤;和恶性神经母细胞瘤;塞尔托利氏细胞癌(sertoli cell carcinoma);恶性间质细胞瘤(malignantleydig cell tumor);恶性脂质细胞瘤;恶性副神经节瘤;恶性乳腺外副神经节瘤(malignant extra-mammary paraganglioma;);嗜铬细胞瘤;血管球肉瘤(glomangiosarcoma);恶性黑色素瘤;无黑素性黑色素瘤;浅表扩散黑色素瘤;巨大色素痣中的恶性黑色素瘤;上皮样细胞黑色素瘤;恶性蓝痣;肉瘤;纤维肉瘤;恶性纤维组织细胞瘤;粘液肉瘤;脂肪肉瘤;平滑肌肉瘤;横纹肌肉瘤;胚胎性横纹肌肉瘤;肺泡状横纹肌肉瘤;基质肉瘤;恶性混合瘤;米勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor);肾母细胞瘤;肝母细胞瘤;癌肉瘤;恶性间质瘤;恶性布伦纳瘤(malignant brenner tumor);恶性叶状瘤;滑膜肉瘤;恶性间皮瘤;无性细胞瘤;胚胎性癌;恶性畸胎瘤;恶性卵巢甲状腺瘤(malignantstruma ovarii);绒毛膜癌;恶性中肾瘤;血管肉瘤;恶性血管内皮瘤;卡波济氏肉瘤(kaposi's sarcoma);恶性血管外皮细胞瘤;淋巴管肉瘤;骨肉瘤;近皮质骨肉瘤;软骨肉瘤;恶性软骨母细胞瘤;间充质软骨肉瘤;骨巨细胞肿瘤;尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma);恶性牙源性肿瘤;成釉细胞性牙肉瘤;恶性成釉细胞瘤;成釉细胞性纤维肉瘤;恶性松果体瘤;脊索瘤;恶性胶质瘤;室管膜瘤;星形细胞瘤;原生质星形细胞瘤;纤维状星形细胞瘤;星形母细胞瘤;胶质母细胞瘤;少突胶质细胞瘤;少突胶质母细胞瘤;原始神经外胚层;小脑肉瘤;神经节神经母细胞瘤;成神经细胞瘤;视网膜母细胞瘤;嗅神经源性肿瘤;恶性脑膜瘤;神经纤维肉瘤;恶性神经鞘瘤;恶性颗粒细胞瘤;恶性淋巴瘤;霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease);霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's disease);副肉芽肿;小淋巴细胞性恶性淋巴瘤;弥漫性大细胞恶性淋巴瘤;滤泡性恶性淋巴瘤;蕈样真菌病(mycosis fungoide);其它指定的非霍奇氏金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas);恶性组织细胞增多症;多发性骨髓瘤;肥大细胞肉瘤;免疫增生性小肠病;白血病;淋巴性白血病;浆细胞白血病;红白血病;淋巴肉瘤细胞白血病;髓样白血病;嗜碱性粒细胞白血病;嗜酸性粒细胞白血病;单核细胞白血病;肥大细胞白血病;巨核细胞白血病;髓样肉瘤;以及毛细胞白血病。
在一些实施例中,癌症包括实体瘤。在一些实施例中,肿瘤是腺癌、肾上腺肿瘤、肛门肿瘤、胆管肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、血源性肿瘤(blood born tumor)、脑肿瘤/CNS肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、食管肿瘤、尤文肿瘤、眼部肿瘤、胆囊肿瘤、胃肠道、肾肿瘤、喉肿瘤或下咽肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、间皮瘤肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肌肉肿瘤、鼻咽肿瘤、成神经细胞瘤、口腔肿瘤、骨肉瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、阴茎肿瘤、垂体肿瘤、原发性肿瘤、前列腺肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺肿瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、转移性肿瘤、基底细胞癌、默克尔细胞肿瘤、睾丸肿瘤、胸腺肿瘤、甲状腺肿瘤、子宫肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤或威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)。
在某些实施例中,癌症是结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌或宫颈癌。
另外的方法
在某些方面,本文提供了确定药剂(例如,测试药剂)是否是抗癌治疗剂的方法,所述方法包括确定测试药剂是否抑制至少一个自噬基因或NF-κB基因(例如,表1或表2中列出的基因)的产物的表达或活性,其中如果测试药剂抑制至少一个自噬基因或NF-κB基因(例如,表1或表2中列出的基因)的产物的表达或活性,则确定测试药剂是抗癌治疗剂。本文还提供了确定向导RNA药剂是否是抗癌治疗剂的方法,所述方法包括确定向导RNA测试药剂是否有效引导Cas酶切割或结合自噬基因或NF-κB基因(例如,表1或表2中列出的基因)中的序列,其中向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向自噬基因或NF-κB基因内的向导RNA靶序列,其中如果测试药剂有效引导Cas酶切割或结合基因中的序列,则确定测试药剂是抗癌治疗剂。本文所公开的测试药剂可以使细胞群体中的本文所公开的至少一个基因的产物的表达降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。
在一些实施例中,测试药剂是测试药剂文库的成员。测试药剂可以是本文所公开的任何药剂,包括gRNA、TALEN或锌指核酸内切酶、干扰核酸或小分子。本文所公开的测试药剂可以抑制至少一个自噬基因或NF-κB基因的产物的表达或活性至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。本文所公开的测试药剂可以抑制表1或表2中的至少一个基因的产物的表达或活性至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。
本文还提供了确定患者是否是本文所提供的癌症疗法的候选者的方法。在一些方面,受试者的肿瘤中的细胞对表1或表2中列出的基因的产物的表达指示所述受试者是疗法的候选者。在一些实施例中,基因产物是mRNA产物。在一些实施例中,基因产物是蛋白质产物。可以使用对蛋白质产物具有特异性的抗体、通过IHC或通过流式细胞术(例如,FACS)来检测蛋白质产物。可以通过核酸扩增、核酸探针或通过测序来检测基因产物(例如,mRNA产物)。
在一些实施例中,本文提供了通过首先测量至少一个自噬基因或NF-κB基因(例如,表1或表2中列出的至少一个基因)的表达水平来靶向并杀伤癌症或肿瘤细胞的方法,并且如果表达水平高于所确定阈值,则通过施用本文所公开的药剂来靶向并杀伤癌症或肿瘤细胞。基因(例如,表1或表2中的基因)的阈值可以通过多种技术来确定,包括但不限于确定基因或基因产物在患病组织(例如,肿瘤或癌组织)对健康组织(例如,不与肿瘤或癌症相关的组织)中的表达。基因(例如,表1或表2中的基因)的阈值可以通过将基因的产物在一个时间点与稍后的时间点在癌细胞或肿瘤中的表达进行比较来确定。健康和患病组织可以取自受试者或不同的个体。在其它实施例中,基因或基因产物的表达阈值是通过检查来自组织库或第三方来源的组织中的基因或基因产物表达来确定的。例如,如果来自受试者或第三方的患病组织的肿瘤或癌细胞表现出基因产物的更高表达,则受试者是疗法的候选者。如果来自稍后的时间点的肿瘤或癌细胞表现出基因产物的更高表达,则受试者是疗法的候选者。
实施例
虽然免疫检查点抑制剂已经改变了癌症的治疗,但肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性的分子决定因素仍有待充分阐明。本文描述了用于鉴定调节T细胞杀伤的肿瘤细胞基因/通路的基因组规模的CRISPR敲除筛选。所述筛选将肿瘤细胞抗原呈递和TNFα信号传导鉴定为杀伤的必要条件,并且相反地,将NF-κB信号传导和自噬鉴定为主要保护机制。敲除单独的自噬基因或药物抑制自噬使各种谱系的肿瘤细胞对T细胞和/或TNFα的杀伤敏感。相反地,抑制mTOR信号传导(其导致自噬活性增加)保护肿瘤细胞免于T细胞杀伤。从机制上讲,在自噬受损的情况下,T细胞/TNFα介导的杀伤增强并不归因于有缺陷的NF-κB信号传导,而是与胱天蛋白酶-8(caspase-8)激活增加相关,这表明自噬在TNFα信号传导通路的相对早期步骤起作用。最后,肿瘤细胞自噬的遗传失活增强了T细胞检查点抑制剂在肿瘤模型中的功效,表明自噬是抗肿瘤免疫的重要调节剂。这些发现表明,靶向保护性NF-κB或自噬通路可以使肿瘤对T细胞定向免疫疗法敏感。
为了系统地揭示调节肿瘤细胞对T细胞杀伤的敏感性的基因/通路,若干组已经采用混合的CRISPR/Cas9筛选。这些筛选已经证实抗原呈递和IFNγ信号传导在肿瘤细胞杀伤中的至关重要作用。另外,这些筛选已经鉴定了新的杀伤调节剂,如酪氨酸磷酸酶Ptpn2、爱帕琳受体(apelin receptor)APLNR、Pbrm1和SWI/SNF染色质重塑复合物。有趣的是,这些筛选中的一些筛选还表明肿瘤细胞TNFα或TRAIL信号传导在T细胞杀伤过程中的重要作用。虽然是成功的,但对于大多数情况,这些筛选已经鉴定了T细胞杀伤所需的肿瘤细胞基因(即,在存活肿瘤细胞中富含的单向导RNA(sgRNA))。
在精细优化的条件下,进行了混合的基因组规模的CRISPR/Cas9敲除(KO)筛选,使得能够有效鉴定限制T细胞杀伤的肿瘤细胞基因。除了证明TNFα/NF-κB信号传导在调节T细胞介导的肿瘤细胞杀伤方面的重要作用之外,结果还揭示了先前未被重视的自噬在保护肿瘤细胞免于T细胞诱导的凋亡方面的作用。在本文中,显示了自噬在不调节NF-κB通路活性的情况下限制胱天蛋白酶8的TNFα依赖性激活,并且显示了自噬的遗传抑制使肿瘤对T细胞检查点抑制剂敏感。因此,自噬通路似乎是免疫疗法反应性的重要调节剂,表明抑制这种通路可以增强T细胞定向疗法的功效的可能性。
调节对T细胞杀伤的敏感性的肿瘤细胞基因的鉴定
为了鉴定调节肿瘤细胞对细胞毒性T细胞杀伤的敏感性的基因,在MC38结肠腺癌细胞中进行全基因组CRISPR/Cas9筛选。将用小鼠单向导RNA(sgRNA)KO文库转导的肿瘤细胞用MHC I类限制性Ova肽或打乱的对照肽进行脉冲处理,并且与从OT-1转基因小鼠(其表达识别Ova肽的T细胞受体)分离的激活的CD8+T细胞一起孵育(图1,A部分)。使用B2m KO细胞(其被保护免于T细胞杀伤)作为阳性对照优化并验证筛选条件;目标是在筛选中实现约90%的肿瘤细胞杀伤(图9)。在暴露于T细胞24小时之后,收集活的肿瘤细胞,并且通过NGS评估在Ova脉冲肿瘤细胞对对照肿瘤细胞中的sgRNA代表性。由于初始文库的高代表性(约2000x覆盖范围),sgRNA代表性甚至在杀伤后仍维持在肿瘤细胞中,从而允许能够有效检测耗尽的以及富集的sgRNA(R2=0.95,Ova脉冲处理的细胞对对照肽脉冲处理的细胞)(表3,图10)。在不添加T细胞的情况下,用传代12次群体倍增的文库修饰的肿瘤细胞进行平行筛选,以鉴定独立于T细胞杀伤而调节肿瘤细胞生长/存活的基因。在此平行生长筛选中,显著比例的靶向已知核心必需基因的sgRNA被耗尽,而非靶向性sgRNA的代表性在很大程度上不变(图11),从而证实了CRISPR/Cas9介导的基因修饰在MC38细胞中的功效和特异性。
对富集的sgRNA的分析鉴定了抗原呈递和TNFα诱导的细胞凋亡信号传导作为T细胞进行的肿瘤细胞杀伤所需的关键途径(图1,B部分)。正如预期的那样,靶向B2m和MHC I类分子H2-K1的多个sgRNA显著富集,从而证实了T细胞杀伤依赖于Ova肽的细胞表面呈递。靶向H2-K1和B2m的所有六种sgRNA的回收进一步突出了CRISPR/Cas9介导的基因修饰在细胞中的有效性。有趣的是,还富集了靶向Tnfrsf1a(TNF受体1;TNFR1)、胱天蛋白酶-8(TNFα诱导的凋亡所需要的)和Tradd(TNFα信号传导通路中的关键衔接子分子)的多个sgRNA(图1,B和C部分),表明T细胞衍生的TNFα在肿瘤细胞杀伤中起重要作用。最后,富集了靶向mTOR信号传导通路中的若干基因的sgRNA(例如,Mtor、Mlst8、Rictor、Mapkap1、Tti2、Telo2、Tti1)。如下所示,mTOR信号传导的失活通过引起自噬活性增加来保护肿瘤细胞免于T细胞杀伤。
对耗尽的sgRNA的分析将NF-κB信号传导和自噬鉴定为限制T细胞进行的肿瘤细胞杀伤的两个关键途径。参与NF-κB信号传导的靶向基因的多个sgRNA显著缺失,包括LUBAC(Sharpin、Rbck1和Rnf31)、TAK1(Map3k7/Tak1、Tab1、Tab2)和Nemo复合物(Chuk、Ikbkb和Ikbkg)的每个成员。此外,靶向另外的NF-κB通路或NF-κB靶基因(Traf2、Tbk1、Mapkapk2、Rela、Cflar和Tnfaip3)的sgRNA也被耗尽(图1,D和E部分)。这些发现与TNFα在T细胞介导的杀伤中的重要作用一致,因为NF-κB通路在通过存活基因如Cflar(c-Flip)的转录诱导来限制TNFα依赖性凋亡方面具有公认的作用。
有趣的是,靶向自噬通路(Rb1cc1、Pik3c3、Nrbf2、Atg13、Atg14)、膜材料转移(Atg9a、Atg2a、Tax1bp1)或自噬体扩增(Atg5、Atg12、Atg10)中的基因的多个sgRNA被显著耗尽(图1,F和G部分)。这些数据表明在肿瘤细胞中的自噬活性在T细胞杀伤的情况下具有保护作用。虽然已知自噬在其它环境(例如,营养缺乏)中限制细胞死亡,但这是首次表明自噬在T细胞诱导的肿瘤细胞凋亡的背景下发挥重要作用。重要的是,在平行细胞生长筛选中,靶向NF-κB通路基因或自噬基因的sgRNA没有被耗尽,并且后续实验证实,MC38细胞中的自噬基因的KO不损害细胞生长(图12),从而表明这些基因的KO在T细胞介导的杀伤的背景下特异性降低细胞适应性。自噬的保护作用与以下观察结果一致:靶向mTOR通路中的多个基因的sgRNA在筛选中富集(图1,B部分),因为mTOR信号传导在对自噬的抑制中具有公认的作用。
TNFα-诱导的细胞凋亡信号传导在T细胞进行的肿瘤细胞杀伤中具有重要作用:
CRISPR筛选表明T细胞衍生的TNFα在杀伤肿瘤细胞方面具有突出作用。虽然细胞毒性T细胞的杀伤被认为主要由T细胞颗粒释放穿孔素和颗粒酶引起,但先前已经提出TNFα(和其它死亡受体配体)在这一过程中的作用。虽然TNFα可以通过凋亡(胱天蛋白酶-8依赖性)或坏死性凋亡来促进细胞死亡,但若干分子检查点(包括NF-κB激活)用于抑制TNFα诱导的细胞死亡。因此,大多数细胞对TNFα的默认应答被认为是存活和诱导促炎症基因。TNFα/NF-κB信号传导的简化模型参见图2,A部分。
如图2B部分所示,向T细胞杀伤测定中添加TNFα阻断抗体显著降低MC38细胞死亡(达到与CRISPR/Cas9介导的B2m失活相同的程度),证实了TNFα信号传导的作用。值得注意的是,在测定(使用预激活的T细胞)中,TNFα阻断对肿瘤细胞杀伤的作用不归因于T细胞功能的抑制,这是由于TNFα阻断并不限制对TNFα不敏感的肿瘤细胞的杀伤(图13)。与TNFα对MC38细胞的T细胞杀伤的显著贡献一致,可溶性TNFα通过细胞凋亡机制促进MC38细胞死亡(即,杀伤被胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK阻断)(图2,C部分)。此外,使用CRISPR/Cas9产生的KO细胞系证实,TNFα介导的MC38细胞的杀伤完全依赖于TNFR1,并且部分依赖于FADD(对于胱天蛋白酶-8激活复合物的组装重要的衔接蛋白)和RIPK1(与胱天蛋白酶-8相互作用以促进凋亡的激酶)(图2,C部分)。
评估了TNFα在一组肿瘤细胞系中诱导胱天蛋白酶-8激活和细胞凋亡的能力,并且发现虽然这些细胞系(CT26、B16F10、4T1)中的大部分未被TNFα杀伤,但EMT6细胞(连同MC38)表现出TNFα诱导的胱天蛋白酶-8激活和细胞凋亡(图2,D和E部分)。(参见图22的实施例中对于TNFα杀伤敏感的人癌细胞系。)如上所述,NF-κB信号传导被认为在限制TNFα依赖性细胞凋亡中发挥着突出作用。然而,发现在TNFα敏感细胞系与对抗性细胞系中,NF-κB激活没有明显差异。TNFα敏感的MC38和EMT6细胞表现出Iκ-Bα(其通过将NF-κB螯合在细胞质中来抑制NF-κB)的有效降解和NF-κB亚基p65/Rela的磷酸化,类似于在TNFα抗性B16F10和4T1细胞中观察到的情况(图2,F部分;图14)。另外,MC38细胞表现出两种NF-κB靶基因A20和ICAM-1的强TNFα-诱导的表达(图2,G部分)。因此,虽然NF-κB通路明确限制TNFα依赖性,但对TNFα诱导的杀伤的敏感性显然可以由除了有缺陷的NF-κB激活之外的因素引起。
NF-κB信号传导限制T细胞和TNFα进行的肿瘤细胞杀伤
为了证实指示NF-κB通路在限制T细胞对MC38细胞的杀伤中的作用的筛选数据,使用在筛选中耗尽的sgRNA使三个关键的NF-κB通路基因(Map3k7/Tak1、Rbck1和Rela)失活。通过多个sgRNA使Map3k7失活会使MC38细胞对T细胞杀伤敏感,并且不同sgRNA耗尽Map3k7蛋白的程度与敏化程度相关,从而表明这些效应是中靶的(图3,A和B部分)。Map3k7 KO显著抑制TNFα对NF-κB靶基因A20和ICAM-1的诱导,证实Map3k7 KO使NF-κB通路失效(图3,E部分)。在敲除Rbck1(图15)和NF-κB亚基p65(Rela)(图16)后观察到对T细胞杀伤的类似作用,进一步验证了NF-κB信号传导的保护作用。
重要的是,在存在饱和量的TNFα阻断抗体的情况下,Map3k7 KO(以及Rbck1和RelaKO)不再增强T细胞对MC38细胞的杀伤(图3,C部分,以及图15和16),从而表明NF-κB通路的保护作用反映了对TNFα介导的细胞凋亡的抑制(而不是穿孔素/颗粒酶介导的杀伤)。与此假设一致,Map3k7、Rbck1和Rela的KO显著增加TNFα诱导的胱天蛋白酶-8激活和细胞死亡(图3,D部分和E部分;图15和16)。与对TNFα依赖性细胞凋亡的作用相反,Map3k7 KO(以及Rbck1和Rela KO)对化学治疗剂多柔比星和紫杉醇对MC38细胞的杀伤没有影响,从而表明NF-κB通路并不广泛地保护这些细胞免于任何细胞凋亡诱导刺激(图3,F部分,以及图15和16)。
自噬限制T细胞和TNFα进行的肿瘤细胞杀伤
为了验证自噬在限制T细胞进行的肿瘤细胞杀伤中的作用,使用在筛选中耗尽的sgRNA使三个必需的自噬基因(Rb1cc1、Atg9a和Atg12)失活。用多个sgRNA使Rb1cc1(也称为FIP200)失活会使MC38细胞对T细胞杀伤敏感,并且Rb1cc1蛋白耗尽的程度与敏化程度相关,从而证实这些效应是中靶的(图4,部分A和B)。用Atg9a(图17)和Atg12(图18)的KO观察到类似的结果,进一步验证了自噬的保护作用。重要的是,这三种关键的自噬组分的敲除事实上确实损害了MC38细胞中的自噬活性,如通过自噬货物受体p62(也称为螯合体1;sqstm1)的水平的显著增加(图5,A部分以及图17和18)以及LC3-II(自噬体蛋白LC3的脂化形式)的水平的降低(图18)所证明的。由于p62将泛素化的蛋白连接到自噬体,并且自身通过自噬降解,因此当自噬被抑制时其水平得到增加。LC3-I通过与磷脂酰乙醇胺缀合转化为LC3-II,这引发自噬体的形成和延长。因此,抑制这种转化上游的自噬将抑制LC3-II形成(Deretic,2008)。
已经提出自噬通过多种机制抑制细胞凋亡,例如通过线粒体自噬-受损线粒体的去除,所述受损线粒体可能特别易受外膜通透性和触发细胞凋亡级联的影响。进行了旨在洞察自噬限制T细胞进行的肿瘤细胞杀伤的机制的一系列实验。自噬的遗传失活对MC38细胞中的细胞表面MHC-I表达或Ova肽的呈递几乎没有或没有影响(图23)。
如图4C部分所示,在存在TNFα阻断抗体的情况下,Rb1cc1 KO对MC38细胞杀伤的作用很小,从而表明在T细胞杀伤的背景下自噬的保护作用主要通过抑制TNFα依赖性细胞凋亡来介导。用Atg9a和Atg12 KO细胞观察到类似的结果(图17和18)。与这些观察结果一致,Rb1cc1、Atg9a或Atg12的KO显著增加TNFα依赖性胱天蛋白酶8激活和细胞凋亡(图4,D部分;图5,A部分;以及图17和18)。因此,自噬似乎在胱天蛋白酶8激活的水平上(任何线粒体参与的上游)调节TNFα信号传导级联的早期步骤。与这种环境下自噬的特异性信号传导功能一致,自噬基因的KO不会使MC38细胞对化学治疗剂多柔比星或紫杉醇的杀伤敏感(图4,E部分;图17和18)。
鉴于NF-κB和自噬通路两者均限制了T细胞对肿瘤细胞的杀伤,研究了在这些通路之间是否存在可能的机制连接。一种可能性是自噬的失活以某种方式导致NF-κB信号传导发生缺陷,由此使对TNFα介导的细胞凋亡敏感。然而,自噬基因Rb1cc1的KO不影响TNFα介导的Iκ-Bα的降解、NF-κB靶基因A20的诱导或需要NF-κB进行表达的若干趋化因子(例如,CXCL10和CCL2)的诱导(图5,B部分;图20)。因此,由于NF-κB激活所需的作用,自噬并不限制MC38细胞的TNFα介导的细胞凋亡。相反,自噬受体p62的水平不受Map3k7 KO的影响(图5,C部分),表明自噬活性不需要完整的NF-κB通路。
接下来,探索了当自噬被抑制时TNFα杀伤细胞的机制。Rb1cc1的失活增加TNFα诱导的胱天蛋白酶-8激活的观察结果表明,在自噬通路受损的情况下,TNFα通过细胞凋亡杀伤细胞而不是坏死性凋亡。为了支持这一论点,泛胱天蛋白酶抑制剂阻断Rb1cc1 KO细胞中的TNFα介导的杀伤(图5,D部分),而坏死性凋亡抑制剂则没有作用(图5,H部分)。根据这些观察结果,TNFα不诱导Rb1cc1 KO细胞中的混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)(坏死性凋亡的介质)的磷酸化(图5,I部分)。
TNFα诱导的细胞凋亡可以通过多个分子机制发生,通过激酶RIPK1的参与来区分。为了能够在自噬抑制的背景下遗传解剖TNFα信号传导,采用奥托非尼(autophinib),一种脂质激酶Vps34的选择性小分子抑制剂。这对于自噬体形成是必需的。用奥托非尼处理MC38细胞增加了TNFα介导的胱天蛋白酶-8激活和杀伤(并且显著增加了p62的水平,证实自噬阻断)(图5,E和F部分)。重要的是,奥托非尼不影响TNFα介导的Iκ-Bα的降解(图5,F部分),这表明受损的自噬不会导致NF-κB通路中的缺陷(与上述Rb1cc1 KO数据一致)。
众所周知,细胞限制TNFα诱导的杀伤的一种重要机制是抑制RIPK1的细胞凋亡活性。促成TNFR1信号传导通路中的这种“早期检查点”的分子事件是cIAP对RIPK1的泛素化。因此,用Smac模拟物抑制cIAP功能促进了FADD/RIPK1/胱天蛋白酶-8依赖性细胞凋亡(参见图2,A部分中的模型)。与这个模型一致,在存在Smac模拟物的情况下,CRISPR介导的Ripk1、Fadd或Tnfrsf1a的失活显著降低TNFα的杀伤(图5,G部分)。然而,虽然Ripk1、Tnfrsf1a或Fadd的失活也显著降低在存在奥托非尼的情况下TNFα的杀伤,但Ripk1的失活没有作用(图5,G部分)。因此,在具有受损自噬的细胞中,TNFα诱导的细胞凋亡是FADD/胱天蛋白酶-8依赖性的但是RIPK1非依赖的,这表明TNFR1信号传导通路中的早期检查点保持功能性。因此,自噬似乎通过限制FADD/胱天蛋白酶-8复合物的形成和/或活性来抑制TNFα诱导的细胞凋亡而不是通过限制RIPK1活性。自噬的失活不影响TNFR1、TRADD(TNFR1相关死亡结构域蛋白)或FADD的总蛋白水平,从而表明TNFα诱导的细胞凋亡的增强并非仅仅由这些关键通路组分的水平升高驱动的(图24)。
鉴于NF-κB和自噬通路两者均限制了T细胞进行的肿瘤细胞杀伤,研究了这些通路之间的可能的机制连接。一种可能性是自噬的失活导致NF-κB信号传导发生缺陷,由此使对TNFα介导的细胞凋亡敏感。然而,Rb1cc1的KO不影响TNFα介导的Iκ-Bα的降解、NF-κB靶基因A20的诱导或需要NF-κB进行表达的若干趋化因子(例如,CXCL10和CCL2)的诱导(图4G和图20)。因此,受损的自噬不会产生有缺陷的NF-κB激活。相反,自噬受体p62的水平不受Map3k7KO的影响(图4H),表明自噬活性不需要完整的NF-κB通路。
TRAIL通过激活两种TNFRSF家族受体TRAIL-R1和TRAIL-R2来促进细胞凋亡。为了确定自噬是否还可以限制TRAIL-R下游的细胞凋亡信号传导,在不存在或存在奥托非尼的情况下用TRAIL攻击癌细胞。如图21A-C部分所示,当自噬被阻断时,人癌细胞中的胱天蛋白酶-8的激活和TRAIL诱导的细胞凋亡增加,这表明自噬可以限制多种死亡受体的细胞凋亡信号传导(可能通过对FADD/胱天蛋白酶-8复合物的活性的影响,所述复合物对TNFα和TRAIL两者诱导的细胞凋亡是至关重要的)。尽管自噬抑制使MC38细胞对TRAIL敏感,但这些细胞被TNFα更有效地杀伤(图21,A-F部分)。
肿瘤细胞mTOR信号传导增加对T细胞/TNFα介导的杀伤的敏感性
在筛选中富集了靶向mTOR通路中的基因(例如,Mlst8、Mtor、Rictor、Mapkap1)的多个sgRNA,这表明mTOR信号传导是有效的肿瘤细胞杀伤所需的。mTOR通路是细胞代谢的重要调节剂,将营养物水平和生长因子与细胞生长和增殖联系起来。与其在促进细胞生长中的作用一致,mTOR信号传导通过多种机制抑制自噬活性。鉴于关于自噬的保护作用的发现,似乎mTOR可以通过对自噬的抑制来增加肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性。
为了证实筛选结果,使用在筛选中富集的sgRNA使Mlst8(两种mTOR信号传导复合物mTORC1和mTORC2的必要组分)。Mlst8的失活抑制mTORC1和mTORC2两者的活性,这通过降低的磷酸化-S6(mTORC1依赖性)和降低的磷酸化-Akt水平(mTORC2依赖性)所证明(图6A)。与mTOR信号传导对自噬的抑制一致,Mlst8 KO细胞表现出降低的p62水平,证实自噬活性增加(图6,A部分)。Mlst8 KO细胞中的自噬的增加与TNFα介导的杀伤和T细胞介导的杀伤两者的敏感性的降低相关(图6,B和C部分)。重要的是,每个Mlst8 sgRNA对肿瘤细胞杀伤的效应的大小与Mlst8蛋白耗尽的程度相关(图6,A部分),从而证实这些效应是中靶的。为了进一步说明mTOR通路对肿瘤细胞杀伤的影响,用雷帕霉素阻断mTORC1信号传导,这导致磷酸化-S6和p62水平降低(证实自噬活性升高)(图6,D部分)。类似于Mlst8 KO,用雷帕霉素抑制mTORC1显著降低了TNFα-介导的杀伤和T细胞介导的杀伤(图6,E和F部分)。
这些关于mTOR调节作用的发现进一步支持自噬作为肿瘤细胞中的保护机制的重要性。图6G部分呈现了描绘了T细胞介导的肿瘤细胞杀伤通过筛选中鉴定的各种信号传导通路的调节的图。
自噬保护各种谱系的癌细胞免于T细胞介导的杀伤和TNFα介导的杀伤
为了扩展关于自噬的保护作用的发现,使用奥托非尼和SAR405(另一种Vps34阻断剂)来评估一组癌细胞系中自噬抑制的作用。虽然奥托非尼和SAR405两者均靶向Vps34,但这些抑制剂在结构上有所不同,并且因此可能具有不同的脱靶效应。这两种自噬抑制剂显著增加了来自不同谱系(例如,结肠、乳腺、肺)的多个小鼠和人癌细胞系(包括在基线处不展现对TNFα的敏感性的细胞系(图7,A部分;图22))中的TNFα的杀伤。自噬抑制剂显著增加了p62水平(证实了自噬阻断),并且增强了TNFα诱导的人乳腺癌细胞中的胱天蛋白酶-8的激活(图7,B部分)。因此,在TNFα处理的背景下,自噬的保护作用似乎是广泛相关的。
到目前为止,已经显示,当T细胞通过靶细胞上的MHC I类/肽复合物与T细胞受体的啮合而被激活时,TNFα有助于肿瘤细胞杀伤。在这些条件下,已经显示,肿瘤细胞自噬起着实质性的保护作用。为了进一步支持这些发现的潜在临床相关性,询问在用CD3双特异性抗体刺激后,自噬是否还调节T细胞进行的肿瘤细胞杀伤。这些抗体(一种新型且有前景的治疗类别)用一个臂与肿瘤抗原结合并且用另一个臂与T细胞上的CD3结合,由此桥接肿瘤细胞和细胞毒性T细胞,以实现肿瘤细胞杀伤(图7,C部分)。使用乳腺肿瘤抗原x CD3双特异性抗体(再生元公司(Regeneron)产生的)来促进人T细胞对ZR-75-1人乳腺癌细胞的杀伤。如图7C部分所示,用SAR-405抑制自噬显著增加肿瘤细胞杀伤。与自噬的药理学阻断的作用一致,通过Rb1cc1 KO对自噬的遗传失活增强了CD3双特异性抗体诱导的杀伤(图7,D和E部分)。总之,这些发现证实了自噬在由CD3双特异性抗体诱导的T细胞杀伤的背景下的保护作用以及自噬在人乳腺癌细胞中的保护作用。
自噬的遗传失活使肿瘤对免疫疗法敏感
为了进一步评估这些发现的临床相关性,询问自噬的遗传失活是否增加肿瘤对T细胞检查点抑制剂的反应性。EMT6小鼠乳腺癌细胞中的Rb1cc1的KO引起p62蛋白水平显著增加,这证实了自噬活性的降低(图8,A部分),并且增加了EMT6细胞对TNFα诱导的细胞凋亡的敏感性(图8,B部分)。将对照或Rb1cc1 KO细胞植入到小鼠中,并且在植入后3天,将小鼠用对照抗体或PD-1加CTLA4阻断抗体的组合处理。如图8C部分所示,PD-1加CTLA4的组合阻断对对照EMT6肿瘤仅具有适度的生长抑制作用,同时促进Rb1cc1 KO肿瘤的完全消退。单独的肿瘤生长曲线显示,与对照肿瘤的0/10相比,10/10Rb1cc1 KO肿瘤完全消退(图8,D部分)。
接下来对MC38肿瘤进行类似的实验。如图8E部分所示,MC38细胞中的Rb1cc1的KO导致自噬受损,如通过p62蛋白水平的显著增加所证明的。虽然PD-1加CTLA4的组合阻断降低了对照MC38肿瘤的生长,但检查点阻断对Rb1cc1 KO肿瘤的影响显著更大(图8,F部分)。Rb1cc1 KO肿瘤和对照肿瘤响应于免疫疗法的延迟生长可从图8的G部分示出的单独的肿瘤生长曲线容易地看出。总之,这些发现显示,具有自噬受损的肿瘤展现出对临床相关的T细胞检查点抑制剂的增加的反应性。
测试了Tnfrsf1a(编码TNFR1)KO在Rb1cc1 KO肿瘤的背景下的作用。如本文所公开的,在Rb1cc1 KO细胞中观察到的TNFα介导的细胞凋亡增加在Rb1cc1/Tnfrsf1a双重KO的EMT6细胞中被逆转(图8,A和B)。Tnfrsf1a的体内遗传失活限制了在Rb1cc1 KO肿瘤中观察到的对免疫疗法的敏化(图8,C和D)。因此,在具有受损自噬的肿瘤的背景下,Tnfrsf1a KO具有保护性。在具有自噬功能完好的对照肿瘤中,Tnfrsf1a KO不保护肿瘤免于免疫检查点阻断,但实际上对处理敏感(图8C)。显然,Tnfrsf1a KO以背景依赖性方式影响肿瘤。尽管如此,数据显示,在肿瘤细胞自噬受损的环境中,TNFα诱导的细胞凋亡是抗肿瘤免疫的重要组成部分。
评估了白细胞浸润到Rb1cc1 KO肿瘤中。在EMT6和MC38模型两者中,与对照肿瘤相比,Rb1cc1 KO肿瘤的CD45+白细胞数量增加(图26)。然而,尽管总体白细胞浸润增加,但未观察到CD4+或CD8+T细胞的优先浸润。尽管如此,但仍然可能的是,白细胞浸润的增加和对T细胞介导的杀伤的敏感性的增加两者均有助于增强对在自噬受损型肿瘤模型中观察到的免疫疗法应答。
使用基因组规模的CRISPR筛选来鉴定作为T细胞介导杀伤的重要组成部分的肿瘤细胞TNFα信号传导,并且相反地鉴定NF-κB和自噬通路两者的保护作用。本文所呈现的数据表明,自噬通过抑制线粒体参与上游的胱天蛋白酶-8激活来限制TNFα进行的肿瘤细胞杀伤。更具体地,自噬似乎抑制FADD/胱天蛋白酶-8复合物的形成和/或活性,这与以下观察结果一致:自噬可以限制TRAIL进行的肿瘤细胞杀伤,所述TRAIL也通过FADD/胱天蛋白酶-8诱导细胞毒性。
这些体内研究显示,肿瘤细胞中的自噬的遗传失活增强T细胞检查点抑制剂的功效,这表明自噬的药理学抑制也可以增强此类处理的功效。尽管已经广泛研究了自噬在癌症中的作用,但仍不清楚这个过程对于肿瘤细胞的生长/存活有多重要。尽管如此,本文所呈现的数据表明,自噬抑制剂除了潜在调节肿瘤细胞生长之外,还可以使癌细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感。
总之,本文所呈现的分析揭示了自噬在限制肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的易感性中的作用。将自噬鉴定为肿瘤免疫逃逸的潜在机制表明自噬抑制剂可以增强T细胞接合免疫疗法的功效的可能性。此外,本文所提供的数据表明,自噬通过抑制线粒体参与上游的胱天蛋白酶-8激活来限制T细胞和TNFα进行的肿瘤细胞杀伤。此外,对自噬的抑制不会使肿瘤细胞对化疗诱导的细胞凋亡敏感,这表明自噬在TNFα信号传导的调节中具有相对特异性作用,而不是更普遍的抗细胞凋亡功能(例如,线粒体自噬)。因此,本文所提供的数据表明自噬抑制剂的新的治疗用途,即,使得癌细胞对T细胞杀伤更敏感,即使这些癌细胞的生长/存活并不依赖于自噬。
材料和方法
癌细胞系
MC38小鼠结肠癌细胞是从美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth,NIH)储存库获得的。4T1、B16F10、CT26、EMT6和L929小鼠癌细胞以及ZR75-1、HCT-116、HeLa、BT-20、Me-180和MDA-MB-361人癌细胞以及人胚胎肾(HEK)293T人细胞来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。Colon26小鼠癌细胞来自美国国家癌症研究所的癌症治疗和诊断科(Division of Cancer Treatment andDiagnosis,National Cancer Institute)(由查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories)经营)。所有细胞在制造商推荐的培养基中培养。在2016年,通过短串联重复序列分析验证所有细胞系(美国爱德士生物研究公司(IDEXX BioResearch))。
小鼠
OT-1C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J小鼠(003831)、C57BL/6小鼠(000664)和Balb/c小鼠(000651)来自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。
CRISPR敲除sgRNA文库和基因组规模筛选
小鼠sgRNA文库(GeCKO A和B;总共约130,000个sgRNA)和pLentiCas9-Blast质粒购自金思特科技公司(GenScript)。使用MC38细胞来进行全基因组CRISPR/Cas9筛选,所述MC38细胞通过慢病毒感染(pLentiCas9-Blast)和用杀稻瘟菌素(12μg/ml)进行的选择而被工程化以表达Cas9核酸酶。以0.3的感染复数用小鼠GeCKO文库(A和B组合)感染MC38-Cas9细胞,使得每个sgRNA被引入到约200个细胞中。用12μg/ml嘌呤霉素选择细胞3天,并且留出大约1.3亿个细胞作为参考对照样品。在感染后7天,一式三份地建立T细胞杀伤测定。将在约2000x文库表示下的文库工程化细胞用Ova肽进行脉冲处理,并且将在约200x文库表示下的细胞用对照肽进行脉冲处理。在肽脉冲之后,将细胞与激活的CD8+T细胞(从OT-1小鼠中分离)以1:3的E:T比率共培养。共培养24小时后,当约90%的肿瘤细胞被杀死时,用PBS洗去非贴壁细胞并且收获活的肿瘤细胞。随后使用DNeasy血液和组织试剂盒(凯杰公司(Qiagen))进行基因组DNA提取,并且如先前所述制备NGS文库。随后将NGS文库多重化并在NextSeq 500(依诺米那公司(Illumina))上运行,从而产生80个碱基对(bp)单端读段。在用bcl2fastq软件(依诺米那公司)解复用之后,针对与sgRNA相邻的16bp载体序列筛选读段,并且提取下游20bp的sgRNA读段以进行sgRNA计数。随后,使用MAGeCK来对读段进行计数并且进行基因/sgRNA富集和统计分析。在感染后一周收获在不添加T细胞的情况下生长的MC38细胞,用来比较sgRNA代表性与参考对照细胞中的sgRNA代表性。
用于验证实验的sgRNA序列(基因名称、sgRNA ID、sgRNA编号(如适用)和序列)如下(将单独的sgRNA克隆到pLenti-Guide-Puro或pLentiCRISPR v2质粒中):Map3k7,MGLibA_30286,1,GATGATCGAAGCGCCGTCGC(SEQ ID NO:16);Map3k7,MGLibA_30288,3,GGGACTTACTGGATTCAGGC(SEQ ID NO:18);Map3k7,MGLibB_30278,5,TTAACTCAGGTTGTCGGAAG(SEQ ID NO:20);Rbck1,MGLibA_44718,1,AGTACGCCCGGATATGACAG(SEQ ID NO:22);Rbck1,MGLibA_44720,3,CAGCTTACCGGTGGTGACTC(SEQ ID NO:24);Rbck1,MGLibB_44706,5,CGGGCGTACTGTGAGCCAAA(SEQ ID NO:26);Rela,MGLibA_45073,2,TCATCGAACAGCCGAAGCAA(SEQ ID NO:29);Rela,MGLibA_45074,3,GCCCAGACCGCAGTATCCAT(SEQ ID NO:30);Rela,MGLibB_45061,6,ACTTACCTGAGGGAAAGATG(SEQ ID NO:33);Rb1cc1,MGLibA_44690,3,TCAAGATAGACCCAATGATG(SEQ ID NO:36);Rb1cc1,MGLibB_44675,4,CTCCATTGACCACCAGAACC(SEQ ID NO:37);Rb1cc1,MGLibB_44676,5,ATTTGAACAGTCCTCCAGAT(SEQ ID NO:38);Atg9a,MGLibA_05661,1,CATAGTCCACACAGCTAACC(SEQ ID NO:40);Atg9a,MGLibA_05662,2,TTGGGATCCGAAGAGCATGT(SEQ ID NO:41);Atg9a,MGLibB_05661,4,TCTATAACATTTGCTGCTAT(SEQ ID NO:43);Atg12,MGLibA_05621,3,GAGCGAACCCGGACCATCCA(SEQ ID NO:48);Atg12,MGLibB_05620,5,CCTGCATTACTGCAAATCCC(SEQ ID NO:50);Atg12,MGLibB_05621,6,TTCTGGCTCATCCCCATGCC(SEQ ID NO:51);Tnfrsf1a,MGLibA_55116,GTGTCTCACTCAGGTAGCGT(SEQ ID NO:52);Ripk1,MGLibA_45635,3,GTACACGTCCGACTTCTCCG(SEQ ID NO:53);Fadd,MGLibA_16988,2,TAGATCGTGTCGGCGCAGCG(SEQ ID NO:54);B2M,MGLibA_06111,1,AGTATACTCACGCCACCCAC(SEQ ID NO:55);Rb1cc1,HGLibB_40366,6,GGCTGCAATCATGGCCAACC(SEQ ID NO:56);Mlst8,MGLibA_31480,1,GACTCCGTCATAACTGATGA(SEQ ID NO:57);Mlst8,MGLibA_31482,3,CGAAGCATGATTGCTGCTGC(SEQ ID NO:58);Mlst8,MGLibB_31471,4,AGCACTCACGGCACTATTGA(SEQ ID NO:59)。
慢病毒包装/转导和CRISPR介导的基因敲除
为了验证实验,将靶向所关注基因的sgRNA克隆到pLenti-Guide-Puro或pLentiCrispr v2(金思特科技公司)中。使用Lipofectamine 2000用pLenti-Cas9-Blast或pLenti-Guide-Puro或pLentiCrispr v2和包装质粒psPAX和pMD2.G转染HEK293T细胞。6小时后,用完全生长培养基替换培养基。72小时后,收获含有慢病毒的上清液,过滤,通过超速离心浓缩,并且在-80℃下储存。对于慢病毒转导,将肿瘤细胞接种在具有5ug/ml聚凝胺和MOI为0.3的慢病毒的完全培养基中。将小鼠GeCKO A和B质粒文库合并,并以相同方式包装到慢病毒中,使用足够数量的HEK293T细胞来维持文库表示。24小时后,用含有DNase的完全生长培养基替换培养基,并且如上所述将慢病毒浓缩。
CD8+T细胞的分离和激活
从6-8周龄雄性OT-1小鼠的脾脏和淋巴结中分离CD8+T细胞。这些小鼠含有小鼠Tcra-V2和Tcrb-V5基因的转基因插入物。转基因T细胞受体被设计成在H-2Kb MHC I类蛋白的背景下识别卵白蛋白肽残基257-264。在一些实验中,从PBMC中分离人CD8+T细胞。将T细胞用CD3/CD28珠以1:2珠:细胞比率在体外激活2-3天。在含有20ng/ml小鼠IL-2、10%热灭活的胎牛血清、20mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.05mM 2-巯基乙醇和50U/ml青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中激活T细胞。对于使用CD3双特异性抗体的人肿瘤细胞杀伤实验,使用Dynabeads Untouched人T细胞试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))从外周血单核细胞(PBMC)(ReachBio公司(ReachBio))中分离人T细胞。
体外细胞毒性测定
将MC38细胞以每24孔34,000个细胞接种,并且在接种后24小时用1ng/ml Ova或打乱的肽进行脉冲处理。将经过脉冲处理的细胞与激活的CD8+T细胞(从OT-1小鼠中分离)以所指示的E:T比率进行培养。24小时后,用PBS洗去非贴壁肿瘤细胞,并且评估细胞活力。在指示的情况下,以10或20μg/ml的浓度添加中和TNFα抗体或同种型对照抗体。
将人ZR-75-1细胞以每24孔100,000个细胞接种。24小时后,在不存在或存在5μM自噬抑制剂SAR-405的情况下,将细胞与激活的CD8+T细胞(从人PBMC中分离)在存在12ng/ml乳腺肿瘤抗原x CD3或对照(不与ZR-75-1细胞结合)双特异性抗体的情况下以所指示的E:T比率孵育24小时。
在所指示浓度下进行24小时孵育后,评估TNFα、TRAIL、多柔比星或紫杉醇对细胞活力的影响。除非另有说明,否则在24小时孵育后,评估5μM奥托非尼或SAR-405对TNFα(10ng/ml)或TRAIL(10ng/ml或50ng/ml)诱导的杀伤的影响。在所有情况下,使用CCK8细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂测量细胞活力,所述试剂通过细胞中的脱氢酶活性被还原,以得到黄色甲臜染料(同仁化学研究所(Dojindo))。使用SpectraMax M3酶标仪(美谷分子仪器有限公司(Molecular Devices))测量吸光度。
肿瘤异种移植物研究
对于EMT6异种移植物实验,将5×106个细胞皮下注射到6至8周龄雌性BALB/c小鼠的右胁腹中。植入后三天,将小鼠用CTLA-4加PD-1阻断抗体或同种型对照进行处理(n=10只小鼠/组)。在处理的第一天,通过腹膜内注射施用CTLA-4加PD-1阻断抗体(5mg/kg)。在处理的第3天和第6天,施用CTLA-4抗体(2.5mg/kg)。在第4天、第8天、第11天和第15天,施用5mg/kg的PD-1抗体。每周三次用卡尺监测肿瘤生长,并且使用以下公式估计肿瘤体积(mm3):1/2×长度×宽度2。
对于MC38异种移植物实验,将3×105个细胞皮下注射到6至8周龄雌性C57BL/6小鼠的右胁腹中。植入后十天,当肿瘤体积为约70mm3时,将小鼠随机分组并且用如以上所述的CTLA-4加PD-1阻断抗体或同种型对照进行处理(n=7至12只小鼠/组)。对于使用CRISPR工程化细胞的肿瘤实验,通过核糖核蛋白的瞬时转染将Cas9蛋白和sgRNA递送到细胞,以克服与慢病毒修饰相关的增加的免疫原性。sgRNA序列如下:对于Rb1cc1KO,CUCCAUUGACCACCAGAACC;对于Tnfrsf1a KO,UUCUCCCGGUCACCAAG;以及非靶向,AAAUGUGAGAUCAGAGUAAU。转染后,分离克隆并测试基因KO。对于MC38细胞,使用八个KO克隆库进行肿瘤研究,并且对于EMT6细胞,使用四个KO细胞库。
抗体和试剂
PD-1阻断抗体(克隆RMP1-14)和大鼠IgG2a同种型对照抗体来自BioXCell公司(BioXCell)。使用公布的一级序列产生具有同种型IgG2a的CTLA4阻断抗体(克隆9D9)的内部版本。在再生元公司使用先前描述的方法产生CD3双特异性抗体(Murphy等人,2014;Smith等人,2015)。小鼠反应性TNFα中和抗体(克隆MP6-XT22)和大鼠IgG1同种型对照抗体来自百进生物公司(Biolegend)。人反应性TNFα中和抗体(克隆MAB1)和小鼠IgG1同种型对照抗体来自百进生物公司。重组小鼠以及人TNFα和IFNγ来自派普泰克公司(PeproTech)。重组人TRAIL来自恩佐公司(Enzo)。Z-VAD-FMK泛胱天蛋白酶抑制剂来自InvivoGen公司(InvivoGen)。Ova SIINFEKL(257-264)肽和打乱的对照肽FILKSINE(257-264)来自AnaSpec公司(AnaSpec)。EasySep小鼠CD8+T细胞分离试剂盒来自干细胞公司(Stemcell)。Dynabeads小鼠T-激活剂CD3/CD28珠来自赛默飞世尔公司(ThermoFisher)。Dynabeadsuntouched人CD8 T细胞试剂盒来自赛默飞世尔公司。人PBMC购自ReachBio公司。小鼠细胞因子阵列面板A来自R&D系统公司(R&D systems)。蛋白酶/磷酸酶抑制剂和BCA试剂来自赛默飞世尔公司。奥托非尼来自生物视觉公司(Biovision),SAR-405来自MedChemExpress公司(MedChemExpress),并且LCL-161(Smac模拟物)来自赛力克化学公司(Selleckchem)。Nec-1来自生物视觉公司。Cas9蛋白和trueguide合成的gRNA来自赛默飞世尔公司。多柔比星和紫杉醇来自赛力克化学公司。
免疫印迹
在含有5%2-巯基乙醇的三甘氨酸SDS样品缓冲液(赛默飞世尔公司)中制备全细胞裂解物。使用三甘氨酸聚丙烯酰胺SDS凝胶(赛默飞世尔公司)和PVDF膜(伯乐公司(BioRad))通过常规技术进行蛋白质印迹。在含5%奶粉和0.5% Tween-20的TBS中阻断印迹,并且然后用一级抗体孵育过夜。添加二级抗体后,将膜与SuperSignal West Pico Plus或Femto底物(赛默飞世尔公司)一起孵育,并且用C300成像仪(Azure Biosystems公司(Azure Biosystems))捕获发光。使用抗TAK1、Rbck1、RelA p65、Rb1cc1、Atg12、经切割的胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶原-8、RIPK1、RIPK1磷酸化-Ser321、RIPK1磷酸化-Ser166、Iκ-Bα、A20、p62、磷酸化-p65、LC3B、TNFR1(CST)、Atg9a(诺伟思公司(Novus))、cIAP1(恩佐公司)、β2M(赛默飞世尔公司)、FADD和ICAM(艾博抗公司(Abcam))的一级抗体。辣根过氧化物酶缀合的β-肌动蛋白抗体和抗小鼠IgG、兔IgG和山羊IgG的二级抗体来自圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。
肿瘤异种移植物研究:为了克服与用慢病毒载体修饰细胞相关的增加的免疫原性,通过核糖核蛋白的瞬时转染将Cas9蛋白和sgRNA递送到细胞。用于Rb1cc1 KO的sgRNA序列为CUCCAUUGACCACCAGAACC,并且非靶向性sgRNA序列为AAAUGUGAGAUCAGAGUAAU。转染后,分离克隆并测试基因敲除。对于MC38细胞,使用8个KO克隆库进行肿瘤研究,并且对于EMT6细胞,使用4个KO细胞库。
小鼠细胞因子阵列
将表达Rb1cc1靶向sgRNA的对照或Rb1cc1 KO MC38细胞用10ng/ml小鼠TNFα处理4小时。处理后,将细胞用冰冷的PBS洗涤两次,并且将细胞用1mL 1% IGEPAL CA-630、20mMTris-HCL pH 8.0、137mM NaCL、10%甘油、2mM EDTA加1X Halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物裂解。在4℃下旋转30分钟后,通过在14,000g下在4℃下离心5分钟来使裂解物澄清,并且通过标准BCA测定来确定蛋白质浓度。为了评估细胞因子产生,使用蛋白质组剖析器小鼠细胞因子阵列面板A(R&D系统公司)。使用300μg细胞裂解物遵循标准试剂盒方案。
肿瘤免疫表型和流式细胞术分析
收获肿瘤,机械消化成碎片(>4mm),并且然后使用小鼠肿瘤解离试剂盒(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))在37℃下以酶促方式消化45分钟。制备单细胞悬浮液,并且将红细胞用ACK缓冲液(龙沙公司(Lonza))裂解。将细胞计数,在冰上用Fc块(百进生物公司)阻断30分钟,并且用活力染料和如所示的CD45、CD3、CD4和CD8抗体(百进生物公司)染色。将MC38亲本和自噬KO细胞用MHC-I(H2 kb)或同种型对照(英杰公司)抗体或MHC-I(H2-kb)–Ova(SIINFEKL)或同型对照(百进生物公司)的抗体染色。
定量和统计分析
对于混合的CRISPR筛选的分析,首先通过将比例因子乘以每个样品来对数据进行归一化,使得所有样品具有相同的总读段计数。为了将各组进行比较,将归一化的读段计数表用作MAGeCK(版本0.5.8)的输入,其中一组指定为处理并且另一组指定为对照(58)。为了将来自基于细胞的测定的数据与多个处理组进行比较,使用单向方差分析与图基多重比较检验。为了比较经受不同处理的肿瘤的生长,使用双向方差分析和图基多重比较检验。P值小于0.05被认为是显著的。使用GraphPad Prism进行统计比较。
通过引用并入
本文所提及的所有公开、专利以及专利申请特此通过引用整体并入,如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。在冲突的情况下,以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
还通过引用整体并入的是任何多核苷酸和多肽序列,其引用与公共数据库中的条目相关的登录号,如由万维网上的基因组研究所(The Institute for Genomic Research,TIGR)和/或万维网上的美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)维护的那些登录号。
等效物
仅使用常规实验,本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司(REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.)
<120> 用于使肿瘤细胞对免疫疗法敏感的方法和组合物
<130> RPB-02025
<140>
<141> 2021-03-03
<160> 57
<170> PatentIn 3.5版
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<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 33
acttacctga gggaaagatg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 34
agagtgtgta cttacagcgc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 35
ctgaacgtgg caaagaactt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 36
tcaagataga cccaatgatg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 37
ctccattgac caccagaacc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 38
atttgaacag tcctccagat 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 39
ctttaggaat agcaggtgca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 40
catagtccac acagctaacc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 41
ttgggatccg aagagcatgt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 42
ctgcccaagt ctgtagtgcc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 43
tctataacat ttgctgctat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 44
tacatgtgaa gccattcttc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 45
aggatattcg agagaagaag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 46
tgcagtttcg cccggaacgg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 47
ctctggaagg ctctcgccgc 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 48
gagcgaaccc ggaccatcca 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 49
tcatcatacc aactgttccg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 50
cctgcattac tgcaaatccc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 51
ttctggctca tccccatgcc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 52
gtgtctcact caggtagcgt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 53
gtacacgtcc gacttctccg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 54
tagatcgtgt cggcgcagcg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成寡核苷酸
<400> 55
agtatactca cgccacccac 20
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 56
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 57
Phe Ile Leu Lys Ser Ile Asn Glu
1 5
Claims (182)
1.一种使癌细胞对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤敏感的方法,所述方法包括使所述癌细胞与抑制所述癌细胞中的自噬的药剂接触。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述药剂抑制自噬基因的表达或活性。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述自噬基因选自ATG12、WIPI2、RB1CC1、PIK3C3、ATG9A、ATG2A、ATG5、ATG14、EI24、NRBF2、ATG13、TAX1BP1和ATG10。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法,其中所述药剂修饰至少一个自噬基因,其中修饰所述至少一个自噬基因使所述自噬基因的表达或活性降低。
5.根据权利要求4所述的方法,其中对所述自噬基因的所述修饰包括缺失、插入、置换或其组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述向导RNA被配置成提供选自所述自噬基因内的双链断裂和单链断裂的切割事件。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其中所述向导RNA靶序列包括或接近所述自噬基因的起始密码子。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法,其中所述向导RNA包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括所述DNA靶向区段。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述向导RNA是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法,其中所述组合物进一步包含Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述Cas蛋白是与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
15.根据权利要求13或14所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
17.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含核酸,所述核酸包括第一核苷酸序列,所述第一核苷酸序列编码有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述向导RNA靶序列包括或接近所述自噬基因的起始密码子。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。
20.根据权利要求17所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述自噬基因的外显子1或外显子2中。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法,其中所述向导RNA包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括所述DNA靶向区段。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法,其中所述向导RNA是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述组合物进一步包含编码Cas蛋白的第二核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白或与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
27.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述药剂是TALEN核酸酶或锌指核酸酶。
28.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述药剂抑制RNA或蛋白质的活性。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述药剂是干扰核酸。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述干扰核酸是siRNA、shRNA、miRNA或反义寡核苷酸。
31.根据权利要求1所述的方法,其中所述药剂是选自以下的小分子自噬抑制剂:PI3-激酶抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Unc-51样激酶1(ULK1)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白18(Vps18)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白34(Vps34)抑制剂、泛素特异性肽酶(USP10或USP13)抑制剂、基于噻吨酮的自噬抑制剂、ATG4抑制剂、奥托非尼、3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、氯化铵、巴弗洛霉素A1、依洛尼塞、亮抑酶肽、桦木酸、CA074、秋水仙碱、毒胡萝卜素、液泡蛋白-1、长春花碱、去甲基氯米帕明、LY294002、PT210、GSK-2126458、Spautin-1、SAR405、化合物31、VPS34-IN1、PIK-III、化合物6、MRT68921、SBI-0206965、胃酶抑素A、E64d、氯米帕明、硫蒽酮、氯喹、羟基氯喹、莫能菌素、Lys05、ARN5187、化合物30、MPT0L145、ROC325、维替泊芬、NSC185058和NSC377071。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法,其中所述癌细胞是肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、GI癌细胞、肝癌细胞、骨癌细胞、血液系统癌细胞、神经组织癌细胞、黑色素瘤细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、宫颈癌细胞、阴道癌细胞或膀胱癌细胞。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
34.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是结肠癌细胞。
35.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是肺癌细胞。
36.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。
37.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是宫颈癌细胞。
38.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是膀胱癌细胞。
39.根据权利要求32所述的方法,其中所述癌细胞是肾癌细胞。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法,其中所述癌细胞在受试者体内,并且向所述受试者施用抑制所述癌细胞中的自噬的所述药剂。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述受试者是人类受试者。
42.一种使受试者的癌细胞对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤敏感的方法,所述方法包括向所述受试者施用抑制所述癌细胞中的自噬的药剂。
43.一种增加对受试者的癌细胞的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤的方法,所述方法包括向所述受试者施用至少一种抑制所述癌细胞中的自噬的药剂。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法,其中所述药剂抑制自噬基因的表达或活性。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述自噬基因选自ATG12、WIPI2、RB1CC1、PIK3C3、ATG9A、ATG2A、ATG5、ATG14、EI24、NRBF2、ATG13、TAX1BP1和ATG10。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的方法,其中所述药剂修饰至少一个自噬基因,其中修饰所述至少一个自噬基因使所述自噬基因的表达或活性降低。
47.根据权利要求46所述的方法,其中对所述自噬基因的所述修饰包括缺失、插入、置换、其组合或与Cas蛋白的结合。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA(gRNA),其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述向导RNA被配置成提供选自所述自噬基因内的双链断裂和单链断裂的切割事件。
50.根据权利要求48或49所述的方法,其中所述向导RNA靶序列包括或接近所述自噬基因的起始密码子。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。
52.根据权利要求48或49所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述自噬基因的外显子1或外显子2中。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的方法,其中所述向导RNA包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括所述DNA靶向区段。
54.根据权利要求53所述的方法,其中所述向导RNA是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
55.根据权利要求48至54中任一项所述的方法,其中所述组合物进一步包含Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白或与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
59.根据权利要求42至47中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含核酸,所述核酸包括第一核苷酸序列,所述第一核苷酸序列编码有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述向导RNA靶序列包括或接近所述自噬基因的起始密码子。
61.根据权利要求60所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。
62.根据权利要求59所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述自噬基因的外显子1或外显子2中。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法,其中所述向导RNA包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括所述DNA靶向区段。
64.根据权利要求3所述的方法,其中所述向导RNA是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
65.根据权利要求63或64所述的方法,其中所述组合物进一步包含编码Cas蛋白的第二核苷酸序列。
66.根据权利要求65所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白或与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
69.根据权利要求42至46中任一项所述的方法,其中所述药剂是TALEN核酸酶或锌指核酸酶。
70.根据权利要求42至45中任一项所述的方法,其中所述药剂抑制RNA或蛋白质的活性。
71.根据权利要求70所述的方法,其中所述药剂是干扰核酸。
72.根据权利要求71所述的方法,其中所述干扰核酸是siRNA、shRNA、miRNA或反义寡核苷酸。
73.根据权利要求42或权利要求43所述的方法,其中所述药剂是选自以下的小分子自噬抑制剂:PI3-激酶抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Unc-51样激酶1(ULK1)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白18(Vps18)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白34(Vps34)抑制剂、泛素特异性肽酶(USP10或USP13)抑制剂、基于噻吨酮的自噬抑制剂、ATG4抑制剂、奥托非尼、3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、氯化铵、巴弗洛霉素A1、依洛尼塞、亮抑酶肽、桦木酸、CA074、秋水仙碱、毒胡萝卜素、液泡蛋白-1、长春花碱、去甲基氯米帕明、LY294002、PT210、GSK-2126458、Spautin-1、SAR405、化合物31、VPS34-IN1、PIK-III、化合物6、MRT68921、SBI-0206965、胃酶抑素A、E64d、氯米帕明、硫蒽酮、氯喹、羟基氯喹、莫能菌素、Lys05、ARN5187、化合物30、MPT0L145、ROC325、维替泊芬、NSC185058和NSC377071。
74.根据权利要求42至73中任一项所述的方法,其中所述癌细胞是肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、GI癌细胞、肝癌细胞、骨癌细胞、血液系统癌细胞、神经组织癌细胞、黑色素瘤细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、宫颈癌细胞、阴道癌细胞或膀胱癌细胞。
75.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
76.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是结肠癌细胞。
77.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是肺癌细胞。
78.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。
79.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是宫颈癌细胞。
80.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是膀胱癌细胞。
81.根据权利要求74所述的方法,其中所述癌细胞是肾癌细胞。
82.一种使受试者的肿瘤对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤敏感的方法,所述方法包括向所述受试者施用抑制所述肿瘤中的自噬的药剂。
83.一种增加对受试者的肿瘤的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤的方法,所述方法包括向所述受试者施用至少一种抑制所述肿瘤中的自噬的药剂。
84.根据权利要求82或权利要求83所述的方法,其中所述药剂抑制自噬基因的表达或活性。
85.根据权利要求84所述的方法,其中所述自噬基因选自ATG12、WIPI2、RB1CC1、PIK3C3、ATG9A、ATG2A、ATG5、ATG14、EI24、NRBF2、ATG13、TAX1BP1和ATG10。
86.根据权利要求84或权利要求85所述的方法,其中所述药剂修饰至少一个自噬基因,其中修饰所述至少一个自噬基因使所述自噬基因的表达或活性降低。
87.根据权利要求86所述的方法,其中对所述自噬基因的所述修饰包括缺失、插入、置换、其组合或与Cas蛋白的结合。
88.根据权利要求82至87中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
89.根据权利要求88所述的方法,其中所述向导RNA被配置成提供选自所述自噬基因内的双链断裂和单链断裂的切割事件。
90.根据权利要求88或89所述的方法,其中所述向导RNA靶序列包括或接近所述自噬基因的起始密码子。
91.根据权利要求90所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。
92.根据权利要求88或89所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述自噬基因的外显子1或外显子2中。
93.根据权利要求88至92中任一项所述的方法,其中所述向导RNA包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括所述DNA靶向区段。
94.根据权利要求93所述的方法,其中所述向导RNA是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
95.根据权利要求88至94中任一项所述的方法,其中所述组合物进一步包含Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列。
96.根据权利要求95所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白或与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
98.根据权利要求97所述的方法,其中所述Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
99.根据权利要求98所述的方法,其中所述Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白。
100.根据权利要求82至87中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含核酸,所述核酸包括第一核苷酸序列,所述第一核苷酸序列编码有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
101.根据权利要求100所述的方法,其中所述向导RNA靶序列包括或接近所述自噬基因的起始密码子。
102.根据权利要求100或101所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述起始密码子的约1000个、500个、400个、300个、200个、100个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个核苷酸内。
103.根据权利要求100所述的方法,其中所述向导RNA靶序列位于所述自噬基因的外显子1或外显子2中。
104.根据权利要求100至103中任一项所述的方法,其中所述向导RNA包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),所述crRNA包括所述DNA靶向区段。
105.根据权利要求104所述的方法,其中所述向导RNA是模块化向导RNA,所述模块化向导RNA中的所述crRNA和所述tracrRNA是彼此杂交的单独分子。
106.根据权利要求100至105中任一项所述的方法,其中所述组合物进一步包含编码Cas蛋白的第二核苷酸序列。
107.根据权利要求106所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白或与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
109.根据权利要求108所述的方法,其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
110.根据权利要求82至86中任一项所述的方法,其中所述药剂是TALEN核酸酶或锌指核酸酶。
111.根据权利要求82至85中任一项所述的方法,其中所述药剂抑制RNA或蛋白质的活性。
112.根据权利要求111所述的方法,其中所述药剂是干扰核酸。
113.根据权利要求112所述的方法,其中所述干扰核酸是siRNA、shRNA、miRNA或反义寡核苷酸。
114.根据权利要求82或权利要求83所述的方法,其中所述药剂是选自以下的小分子自噬抑制剂:PI3-激酶抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Unc-51样激酶1(ULK1)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白18(Vps18)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白34(Vps34)抑制剂、泛素特异性肽酶(USP10或USP13)抑制剂、基于噻吨酮的自噬抑制剂、ATG4抑制剂、奥托非尼、3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、氯化铵、巴弗洛霉素A1、依洛尼塞、亮抑酶肽、桦木酸、CA074、秋水仙碱、毒胡萝卜素、液泡蛋白-1、长春花碱、去甲基氯米帕明、LY294002、PT210、GSK-2126458、Spautin-1、SAR405、化合物31、VPS34-IN1、PIK-III、化合物6、MRT68921、SBI-0206965、胃酶抑素A、E64d、氯米帕明、硫蒽酮、氯喹、羟基氯喹、莫能菌素、Lys05、ARN5187、化合物30、MPT0L145、ROC325、维替泊芬、NSC185058和NSC377071。
115.根据权利要求82至114中任一项所述的方法,其中所述肿瘤是腺癌、肾上腺肿瘤、肛门肿瘤、胆管肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、脑肿瘤/CNS肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、食管肿瘤、尤文肿瘤、眼部肿瘤、胆囊肿瘤、胃肠道、肾肿瘤、喉肿瘤或下咽肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、间皮瘤肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肌肉肿瘤、鼻咽肿瘤、成神经细胞瘤、口腔肿瘤、骨肉瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、阴茎肿瘤、垂体肿瘤、原发性肿瘤、前列腺肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺肿瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、转移性肿瘤、基底细胞癌、默克尔细胞肿瘤、睾丸肿瘤、胸腺肿瘤、甲状腺肿瘤、子宫肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤或威尔姆斯肿瘤。
116.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
117.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是结直肠肿瘤。
118.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是肺肿瘤。
119.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
120.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是宫颈肿瘤。
121.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是膀胱肿瘤。
122.根据权利要求115所述的方法,其中所述肿瘤是肾肿瘤。
123.根据权利要求115至122中任一项所述的方法,其中所述肿瘤是原发性肿瘤。
124.根据权利要求115至122中任一项所述的方法,其中所述肿瘤是转移性肿瘤。
125.根据权利要求42至124中任一项所述的方法,其中所述受试者在施用所述药剂之前已经接受化疗药物。
126.根据权利要求125所述的方法,其中所述受试者对所述化疗药物是难治性的。
127.根据权利要求42至126中任一项所述的方法,其中所述药剂是全身性施用的。
128.根据权利要求127所述的方法,其中所述药剂是静脉内施用的。
129.根据权利要求42至126中任一项所述的方法,其中所述药剂是皮下施用的。
130.根据权利要求42至126中任一项所述的方法,其中所述药剂是肌内施用的。
131.根据权利要求42至126中任一项所述的方法,其中所述药剂是口服施用的。
132.根据权利要求42至126中任一项所述的方法,其中所述药剂是局部施用的。
133.根据权利要求132所述的方法,其中所述受试者患有肿瘤,并且所述至少一种药剂局部施用于所述肿瘤或肿瘤微环境。
134.根据权利要求42至133中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括向所述受试者施用另外的抗癌疗法。
135.根据权利要求134所述的方法,其中所述另外的抗癌疗法是癌症免疫疗法。
136.根据权利要求134或权利要求135所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括自体或同种异体T细胞疗法或自体或同种异体CAR T细胞疗法。
137.根据权利要求135所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用TNF-α。
138.根据权利要求135所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。
139.根据权利要求138所述的方法,其中所述免疫检查点抑制剂包括对选自以下的免疫检查点蛋白具有特异性的抗体:CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR。
140.根据权利要求139所述的方法,其中所述免疫检查点抑制剂是西米普利单抗(REGN2810)、纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)、派姆单抗(MK-3475、SCH900475)、阿特珠单抗(MPDL3280A、RG7446、RO5541267)、度伐鲁单抗(MEDI4736、MEDI-4736)、阿维单抗(MSB0010718C)、伊匹单抗(BMS-734016、IBI310、MDX-010)、SHR1210、信迪利单抗(IBI308)、斯巴达珠单抗(PDR001)、替雷利珠单抗(BGB-A317)、皮地利珠单抗、BCD-100、特瑞普利单抗(JS001)、BAY 1905254、ASP 8374、PF-06801591、AMP-224、AB122、AK105、AMG 404、BCD-100、BI 754091、F520、HLX10、HX008、JTX-4014、LZM009、MEDI0680、MGA012、Sym021、TSR-042、PSB205、MGD019、MGD013、AK104、XmAb20717、RO7121661、CX-188、INCB086550、FS118、BCD-135、BGB-A333、CBT-502、CK-301、CS1001、FAZ053、HLX20、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、TG-1501、ZKAB001、INBRX-105、MCLA-145、KN046、M7824、LY3415244、INCB086550、CA-170、CX-072、ADU-1604、AGEN1181、AGEN1884、MK-1308、REGN4659、XmAb22841、ATOR-1015、PSB205、MGD019、AK104、XmAb20717、BMS-986249、曲美木单抗、BMS-986258、BGB-A425、INCAGN02390、Sym023、JNJ 61610588、BI 754111、LAG525、MK-4280、REGN3767、Sym022、TSR-033、瑞拉利单抗、JTX-2011、MGD009、BMS-986207、OMP-313M32、MK-7684或TSR-022。
141.根据权利要求135所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用癌症疫苗。
142.一种治疗受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用抑制所述受试者的癌细胞中的自噬的药剂以及癌症免疫疗法。
143.根据权利要求142所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括自体或同种异体T细胞疗法或自体或同种异体CAR T细胞疗法。
144.根据权利要求142所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用TNF-α。
145.根据权利要求142所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。
146.根据权利要求145所述的方法,其中所述免疫检查点抑制剂包括对选自以下的免疫检查点蛋白具有特异性的抗体:CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR。
147.根据权利要求145所述的方法,其中所述免疫检查点抑制剂是西米普利单抗(REGN2810)、纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)、派姆单抗(MK-3475、SCH900475)、阿特珠单抗(MPDL3280A、RG7446、RO5541267)、度伐鲁单抗(MEDI4736、MEDI-4736)、阿维单抗(MSB0010718C)、伊匹单抗(BMS-734016、IBI310、MDX-010)、SHR1210、信迪利单抗(IBI308)、斯巴达珠单抗(PDR001)、替雷利珠单抗(BGB-A317)、皮地利珠单抗、BCD-100、特瑞普利单抗(JS001)、BAY 1905254、ASP 8374、PF-06801591、AMP-224、AB122、AK105、AMG 404、BCD-100、BI 754091、F520、HLX10、HX008、JTX-4014、LZM009、MEDI0680、MGA012、Sym021、TSR-042、PSB205、MGD019、MGD013、AK104、XmAb20717、RO7121661、CX-188、INCB086550、FS118、BCD-135、BGB-A333、CBT-502、CK-301、CS1001、FAZ053、HLX20、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、TG-1501、ZKAB001、INBRX-105、MCLA-145、KN046、M7824、LY3415244、INCB086550、CA-170、CX-072、ADU-1604、AGEN1181、AGEN1884、MK-1308、REGN4659、XmAb22841、ATOR-1015、PSB205、MGD019、AK104、XmAb20717、BMS-986249、曲美木单抗、BMS-986258、BGB-A425、INCAGN02390、Sym023、JNJ 61610588、BI 754111、LAG525、MK-4280、REGN3767、Sym022、TSR-033、瑞拉利单抗、JTX-2011、MGD009、BMS-986207、OMP-313M32、MK-7684或TSR-022。
148.根据权利要求142所述的方法,其中所述癌症免疫疗法包括向所述受试者施用癌症疫苗。
149.根据权利要求142至148中任一项所述的方法,其中所述药剂抑制自噬基因的表达或活性。
150.根据权利要求149所述的方法,其中所述自噬基因选自ATG12、WIPI2、RB1CC1、PIK3C3、ATG9A、ATG2A、ATG5、ATG14、EI24、NRBF2、ATG13、TAX1BP1和ATG10。
151.根据权利要求149或权利要求150所述的方法,其中所述药剂修饰至少一个自噬基因,其中修饰所述至少一个自噬基因使所述自噬基因的表达或活性降低。
152.根据权利要求151所述的方法,其中对所述自噬基因的所述修饰包括缺失、插入、置换、其组合或与Cas蛋白的结合。
153.根据权利要求142至152中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
154.根据权利要求153所述的方法,其中所述向导RNA被配置成提供选自所述自噬基因内的双链断裂和单链断裂的切割事件。
155.根据权利要求153或154所述的方法,其中所述组合物进一步包含Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列。
156.根据权利要求155所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白。
157.根据权利要求155所述的方法,其中所述Cas蛋白是与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
158.根据权利要求155至157中任一项所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
159.根据权利要求158所述的方法,其中所述Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
160.根据权利要求142至152中任一项所述的方法,其中所述药剂是组合物,所述组合物包含核酸,所述核酸包括第一核苷酸序列,所述第一核苷酸序列编码有效引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA,其中所述向导RNA包括DNA靶向区段,所述DNA靶向区段靶向所述自噬基因内的向导RNA靶序列。
161.根据权利要求160所述的方法,其中所述组合物进一步包含编码Cas蛋白的第二核苷酸序列。
162.根据权利要求161所述的方法,其中所述Cas蛋白是核酸酶活性Cas蛋白。
163.根据权利要求162所述的方法,其中所述Cas蛋白是与转录阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas蛋白。
164.根据权利要求161至163中任一项所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
165.根据权利要求164所述的方法,其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9蛋白、酿脓链球菌Cas9蛋白或脑膜炎奈瑟菌Cas9蛋白。
166.根据权利要求142至152中任一项所述的方法,其中所述药剂是TALEN核酸酶或锌指核酸酶。
167.根据权利要求142至150中任一项所述的方法,其中所述药剂抑制RNA或蛋白质的活性。
168.根据权利要求167所述的方法,其中所述药剂是干扰核酸。
169.根据权利要求168所述的方法,其中所述干扰核酸是siRNA、shRNA、miRNA或反义寡核苷酸。
170.根据权利要求142至148中任一项所述的方法,其中所述药剂是选自以下的小分子自噬抑制剂:PI3-激酶抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Unc-51样激酶1(ULK1)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白18(Vps18)抑制剂、液泡蛋白分选蛋白34(Vps34)抑制剂、泛素特异性肽酶(USP10或USP13)抑制剂、基于噻吨酮的自噬抑制剂、ATG4抑制剂、奥托非尼、3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、氯化铵、巴弗洛霉素A1、依洛尼塞、亮抑酶肽、桦木酸、CA074、秋水仙碱、毒胡萝卜素、液泡蛋白-1、长春花碱、去甲基氯米帕明、LY294002、PT210、GSK-2126458、Spautin-1、SAR405、化合物31、VPS34-IN1、PIK-III、化合物6、MRT68921、SBI-0206965、胃酶抑素A、E64d、氯米帕明、硫蒽酮、氯喹、羟基氯喹、莫能菌素、Lys05、ARN5187、化合物30、MPT0L145、ROC325、维替泊芬、NSC185058和NSC377071。
171.根据权利要求142至170中任一项所述的方法,其中所述癌细胞是肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、GI癌细胞、肝癌细胞、骨癌细胞、血液系统癌细胞、神经组织癌细胞、黑色素瘤细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、宫颈癌细胞、阴道癌细胞或膀胱癌细胞。
172.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
173.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是结肠癌细胞。
174.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是肺癌细胞。
175.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。
176.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是宫颈癌细胞。
177.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是膀胱癌细胞。
178.根据权利要求171所述的方法,其中所述癌细胞是肾癌细胞。
179.根据权利要求42至178中任一项所述的方法,其中所述受试者是人。
180.一种用于使受试者的癌细胞对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤敏感的药剂,所述药剂抑制癌细胞中的自噬。
181.一种用于增加对受试者的癌细胞的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的杀伤的药剂,所述药剂抑制癌细胞中的自噬。
182.一种用于治疗癌症的组合疗法,所述组合疗法包括抑制癌细胞中的自噬的药剂以及癌症免疫疗法。
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