KR20230004456A - 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본원에는 대상체에게 자가포식을 억제하는 제제를 투여함으로써 (예를 들어, 암이 있는 대상체에서 종양을 표적화함으로써) 암의 치료 또는 예방과 관련된 방법 및 조성물이 제공된다. 특정 측면에서, 본원에는 세포를 접촉시키거나 또는 자가포식을 억제하는 제제를 투여함으로써 암 세포를 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법과 관련된 조성물의 방법이 제공된다.

Description

면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2020년 3월 4일 출원된 다음 미국 가출원 번호: 62/985,004의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.　 2021년 3월 3일 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 RPB-02025_SL.txt이고 크기는 14,383 바이트이다.

암은 미국에서 두번째로 가장 흔한 사망 원인이다. 면역요법은 암의 치료를 변형시켰지만, 이러한 치료에 대한 종양 세포 내성은 상당한 도전과제를 제기한다. 예를 들어, 종양 세포에서 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 또는 JAK1/JAK2의 기능 상실 돌연변이는 체크포인트 차단에 대한 임상 내성과 연관되어 있다. 중요하게는, T 세포 사멸에 대한 종양 세포 감수성을 제어하는 분자 메커니즘이 완전히 특징화되어야 한다. 따라서, T 세포 사멸에 대한 암 세포 감수성을 증가시키는 치료를 포함하여 암에 대한 새롭고 효과적인 치료의 필요성이 남아있다.

본원에는 자가포식 및/또는 NF-κB 경로의 억제를 통해 T 세포 사멸(예를 들어, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸)에 대한 암 세포 감수성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 또한 본원에는 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제함으로써 T 세포 사멸(예를 들어, TNF-α 매개 사멸)에 대한 대상체에서의 암 세포 감수성을 증가시킴으로써 대상체(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체)에서 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 암 요법(예를 들어, 암 면역요법)을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 측면에서, 본원에는 암 세포를 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 적어도 하나의 제제)와 접촉시킴으로써 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 본원에는 대상체에게 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 적어도 하나의 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체에서 암 세포의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 암 세포는 대상체에 있다. 일부 구현예에서, 암 세포는 종양(예를 들어, 대상체의 고형 종양)에 있다. 특정 구현예에서, 방법은 대상체에게 암 요법(예를 들어, 암 면역요법)을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 자가포식 유전자(즉, 억제될 때 세포에서 감소된 수준의 자가포식을 초래하는 생성물을 암호화하는 유전자)의 발현 또는 활성을 억제함으로써 자가포식을 억제하는 제제. 일부 구현예에서, 제제는 자가포식 유전자를 표적한다(예를 들어, 제제는 자가포식 유전자의 서열을 변형시킨다). 특정 구현예에서, 제제는 자가포식 유전자 산물(예를 들어, 자가포식 유전자에 의해 암호화된 RNA 또는 단백질)을 표적한다. 일부 구현예에서, 자가포식 유전자는 ATG12, WIPI2, RB1CC1, PIK3C3, ATG9A, ATG2A, ATG5, ATG14, EI24, NRBF2, ATG13, TAX1BP1, 및 ATG10으로부터 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 제제는 NF-κB 경로 유전자의 발현 또는 활성을 억제함으로써 NF-κB 경로를 억제한다. 일부 구현예에서, 제제는 NF-κB 경로 유전자 자체를 표적한다(예를 들어, 제제는 NF-κB 경로 유전자의 서열을 변형시킨다). 특정 구현예에서, 제제는 NF-κB 경로 유전자 산물(예를 들어, NF-κB 경로 유전자에 의해 암호화된 RNA 또는 단백질)을 표적한다. 특정 구현예에서, NF-κB 유전자는 CFLAR, UBE2L3, RNF31, IKBKB, MAP3K7, TAB1, RELA, IKKBKG, CHUK, TAB2, TBK1, MAPKAPK2, RBCK1, TRAF2, SHARPIN, 및 TNFAIP3으로부터 선택될 수 있다.

따라서, 특정 구현예에서, 제제는 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자를 변형시킬 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 자가포식 유전자 및/또는 NF-κB 유전자의 변형은 자가포식 유전자 산물 및/또는 NF-κB 유전자 산물의 발현 및/또는 활성의 감소를 초래한다. 특정 구현예에서, 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자의 변형은 결실, 삽입, 대체, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제제는 CRISPR/Cas 제제, TALEN 뉴클레아제 또는 아연-핑거 뉴클레아제일 수 있다.

특정 구현예에서, 제제는 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자에 의해 암호화된 RNA 또는 단백질의 활성을 억제하고/하거나 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제제는 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자에 의해 암호화된 RNA(예를 들어, mRNA)를 표적하는 간섭 핵산 예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드)일 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 자가포식 또는 NF-κB 경로의 소분자 억제제이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 추가의 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 항암 요법은 암 면역요법이다. 일부 구현예에서, 암 면역요법은 대상체에게 자가 또는 동종 T 세포 요법 투여, 자가 또는 동종 CAR T 세포 요법 투여, 대상체에게 암 백신 투여, 대상체에게 TNF-α 투여, 및/또는 대상체에게 면역 체크포인트 억제제 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 항암 요법은 대상체에게 Smac 모방체(예를 들어, LCL-161, APG-1387, TL32711, GDC-0917, HGS1029, AT-406) 투여를 포함한다.

특정 측면에서, 본원에는 대상체의 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 데 사용하기 위한 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제가 제공된다. 추가적으로, 일부 측면에서, 본원에는 대상체에서 암 세포의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키는 데 사용하기 위한 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제가 제공된다. 일부 측면에서, 본원에는 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 암 면역요법을 포함하는 조합 요법이 제공된다.

도 1은 a-g의 7개 파트로 구성되고, 게놈-전체 CRISPR KO 스크린이 세포독성 T 세포에 의한 사멸을 조절하는 종양 세포 유전자를 식별함을 보여준다. 파트 a는 풀링된 CRISPR 스크린의 개략도를 나타낸다. 마우스 GeCKO sgRNA 라이브러리로 변형된 MC38 암 세포를 Ova 또는 스크램블된 대조군 펩티드로 펄스한 다음 활성화된 Ova-특이적 세포독성 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포 사멸 후, 살아 남은 종양 세포에서 sgRNA 표상(representation)을 Illumina 서열분석에 의해 평가하였다. 생물학적 3회 수행하였다(파트 b, d, f). 종양 세포 사멸을 촉진하거나(풍부화된 sgRNA) 또는 제한하는(고갈된 sgRNA) 유전자를 보여주는 화산 플롯. 사멸을 촉진하는 관심 유전자는 파트 b에서 강조 표시된다(예를 들어, 항원 제시, TNFα 신호전달, mTOR 신호전달). 사멸을 제한하는 관심 유전자는 파트 d 및 f에서 강조 표시된다(예를 들어, NF-κB 경로, 자가포식). X-축은 Z 점수(스크램블된 펩티드-펄스된 세포와 비교하여 Ova-펄스된 세포에서 각 유전자를 표적화하는 6개 sgRNA에 대한 평균 log₂ 배수 변화로부터 계산됨)를 나타낸다. Y-축은 MAGeCK에 의해 계산된 P-값을 나타낸다(파트 c, e, g). 라이브러리의 모든 129,209개 sgRNA에 대한 log₂ 배수 변화의 분포(빈도 히스토그램). 관심 유전자를 표적화하는 개별 sgRNA는 패널 c에서 빗금으로 표시되고 파트 e 및 g에서 빗금으로 표시된다.
도 2는 a-g의 7개 파트로 구성되고, TNFα-매개 세포자멸사가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸의 중요한 구성요소임을 보여준다. 파트 a는 TNFα/NF-κB 신호전달의 단순화된 모델을 나타낸다. 파트 b는 대조군(MC38-mGeCKO) 또는 B2m KO 세포가 Ova 펩티드로 펄스되고 10 μg/ml TNFα 차단 항체 또는 이소형 대조군의 존재 하에 OT-1 마우스의 T 세포와 함께 인큐베이션되었음을 나타낸다. 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. **P < 0.005, ***P < 0.0005, ****P < 0.0001, MC38-mGeCKO + 대조군 Ab 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. +P < 0.05, MC38-B2m KO + 대조군 Ab 대비. 파트 c는 24 시간 동안 10 ng/ml TNFα로 처리된 MC38 세포의 생존력에 대한 카스파제 억제(25 μM z-VAD-FMK), Tnfrsf1a KO, Fadd KO 또는 Ripk1 KO의 효과를 나타낸다. 막대 그래프는 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 표적 단백질 고갈을 확인하는 웨스턴 블롯은 그래프 아래에 나타내었다. *는 검정에 사용된 Ripk1 KO를 표시한다. 파트 d는 표시된 농도의 TNFα를 종양 세포주에 첨가하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3. 파트 e는 각 세포주에 10 ng/ml TNFα를 첨가하고 24 시간 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f 및 g는 표시된 시간 동안 10 ng/ml TNFα로 처리 후 MC38 또는 B16F10 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 3은 a-g의 7개 파트로 구성되고, NF-κB 신호전달이 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한함을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Map3k7-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 Map3k7(Tak1로도 알려짐) 및 β-액틴 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다(sg5 및 sg3은 스크린에서 가장 유의하게 고갈되었고; sg1은 가장 덜 유의하게 고갈되었음). 파트 b는 대조군 또는 Map3k7 KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 표시된 E:T 비율로 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. **P < 0.005, ***P < 0.0005, ****P < 0.0001, 모 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. ++P < 0.005, ++++P < 0.0001, Map3k7 sg5 대비. 파트 c는 표시된 세포주의 T 세포 사멸이 20 μg/ml TNFα 차단 항체의 존재 하에 수행되었음을 나타낸다. 파트 d는 세포를 표시된 농도의 TNFα로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3. 파트 e는 10 ng/ml TNFα로 처리 2 시간 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f 및 g는 세포를 표시된 양의 독소루비신 또는 파클리탁셀로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3.
도 4는 a-f의 6개 파트로 구성되고, 자가포식이 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한함을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rb1cc1-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 Rb1cc1 및 β-액틴 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(sg4 및 sg5는 스크린에서 가장 유의하게 고갈되었고; sg3은 가장 덜 유의하게 고갈되었음). 파트 b는 대조군 또는 Rb1cc1 KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 표시된 E:T 비율로 OT-1 T 세포와 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. **P < 0.005, ****P < 0.0001, 모 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. ++++P < 0.0001, Rb1cc1 sg4 대비. 파트 c는 표시된 세포주의 T 세포 사멸이 20 μg/ml TNFα 차단 항체의 존재 하에 수행되었음을 나타낸다. *P < 0.05, ***P < 0.0005, 모 MC38 세포 대비. 파트 d는 세포를 표시된 농도의 TNFα로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다. 파트 e 및 f는 세포를 표시된 양의 독소루비신 또는 파클리탁셀로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3.
도 5는 a-i의 9개 파트로 구성되고, 자가포식의 억제가 NF-κB 신호전달에 대한 효과와 관계없이 TNFα-매개 카스파제-8 활성화를 향상시킴을 보여준다. 파트 a는 10 ng/ml TNFα로 처리 4 시간 후 대조군 또는 Rb1cc1 KO MC38 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 b는 10 ng/ml TNFα로 처리 30 분(Ik-Bα) 또는 4 시간(A20) 후 대조군 또는 Rb1cc1 KO 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 c는 대조군 또는 Map3k7(Tak1) KO 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 d는 용해성 TNFα가 24 시간 동안 25 μM z-VAD-FMK(카스파제 억제제)의 존재 또는 부재 하에 Rb1cc1 KO 세포에 첨가되었음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(TNFα 없음, 카스파제 억제제 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA에 의해 비교하였다. 파트 e는 MC38 세포를 16 시간 동안 5 μM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(TNFα 없음, 오토피닙 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 파트 f는 5 μM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 30 분(Ik-Bα) 또는 4 시간(카스파제-8, p62) 동안 10 ng/ml TNFα로 처리되거나 또는 처리되지 않은 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 g는 대조군, Tnfrsf1a KO, Fadd KO 또는 Ripk1 KO 세포를 24 시간 동안 5 μM 오토피닙 또는 1 μM LCL-161(Smac 모방체)의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(TNFα 또는 억제제가 없는 빈 벡터 세포)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. ****P < 0.0001, TNFα로 처리된 빈 벡터 세포 대비. 파트 h는 TNFα를 24 시간 동안 50 μM Nec-1(세포예정괴사 억제제)의 부재 또는 존재 하에 Rb1cc1 KO 세포에 첨가하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(TNFα 없음, 카스파제 억제제 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 파트 i는 L929 마우스 섬유아세포 세포주 및 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rb1cc1-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 포스포-MLKL, 총 MLKL 및 β-액틴 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 세포를 30 분 동안 10 ng/ml TNFα, 50 μM Nec-1s, 및 20 μM Z-VAD-FMK의 존재 또는 부재 하에 처리하였다.
도 6은 a-g의 7개 파트로 구성되고, 종양 세포에서 mTOR 신호전달이 최대 TNFα- 및 T 세포-매개 사멸에 필요함을 보여준다. 파트 a는 빈 벡터로 형질도입된 MC38 세포 또는 Mlst8-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(sg4 및 sg1은 스크린에서 가장 유의하게 풍부화되었고; sg3은 가장 덜 유의하게 풍부화되었음). 파트 b는 대조군 또는 Mlst8 KO 세포를 24 시간 동안 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(TNFα 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.005, TNFα로 처리된 빈 벡터 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. 파트 c는 대조군 또는 Mlst8 KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(T 세포 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.005, T 세포와 함께 인큐베이션된 빈 벡터 세포 대비. 파트 d는 표시된 시간 동안 200 nM 라파마이신으로 처리된 MC38 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 e는 비히클 또는 200 nM 라파마이신으로 전처리된 웰을 이어서 24 시간 동안 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(비히클, TNFα 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 파트 f는 비히클 또는 라파마이신으로 전처리된 세포를 스크램블된 대조군 펩티드 또는 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(T 세포 없음, 스크램블된 펩티드)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 파트 g는 T 세포에 의한 사멸을 조절하는 종양 세포 경로를 도시하는 다이어그램을 나타낸다.
도 7은 a-f의 6개 파트로 구성되고, 자가포식이 인간 암 세포의 CD3 이중특이적 항체-유도된 사멸을 제한함을 보여준다. 파트 a는 인간 ZR-75-1 유방암 세포를 24 시간 동안 5 μM 오토피닙 또는 SAR-405의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(비히클, TNFα 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA에 의해 비교하였다. 파트 b는 10 ng/ml TNF****의 부재 또는 존재 하에 ZR-75-1 세포를 5 μM 오토피닙 또는 SAR-405로 16 시간 처리 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 d는 ZR-75-1 세포를 5 μM SAR-405의 부재 또는 존재 하에 12 ng/ml 대조군 또는 유방 종양 항원 x CD3(TAAxCD3(파트 c에 예시됨) 이중특이적 항체의 존재 하에 표시된 E:T 비율로 활성화된 인간 T 세포와 24 시간 동안 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(T 세포 없음, 대조군 이중특이적 항체)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 파트 e는 ZR-75-1 대조군 또는 Rb1cc1 KO 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f는 ZR-75-1 대조군 또는 Rb1cc1 KO 세포를 T 세포 + 상기와 같은 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포 + 대조군 bsAb와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. **P < 0.005, 대조군 세포 대비. ****P < 0.0001, 대조군 세포 + CD3 bsAb 대비. ++++P < 0.0001, Rb1cc1 KO + CD3 bsAb 대비.
도 8은 a-g의 7개 파트로 구성되고, 자가포식의 불활성화가 종양을 면역요법에 대해 감작화함을 보여준다. 파트 a는 EMT6 대조군(비-표적화 sgRNA) 또는 Rb1cc1 KO 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 b는 EMT6 대조군 또는 Rb1cc1 KO 세포를 10 ng/ml TNFα로 처리하고 24 시간 후 생존력을 측정하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 대조군 세포(대조군, TNFα 없음)와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n = 3)를 나타낸다. 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA에 의해 비교하였다. 파트 c는 EMT-6 세포(대조군 또는 Rb1cc1 KO)를 Balb/c 마우스에 이식하였음을 나타낸다. 이식 3 일 후, 마우스를 방법에 기재된 바와 같이 이소형 대조군 또는 PD-1 + CTLA-4 차단 항체로 처리하였다(n=그룹당 10 마리 마우스). 선 그래프는 각 그룹에 대한 평균 종양 부피 ± SEM을 도시한다. 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 이원 ANOVA에 의해 비교하였다. 파트 d는 각 마우스에 대한 개별 종양 성장 곡선을 나타낸다. 파트 e는 MC38 대조군(비-표적화 sgRNA) 또는 Rb1cc1 KO 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f는 MC38 세포(대조군 또는 Rb1cc1 KO)를 C57/BL6 마우스에 이식하였음을 나타낸다. 종양이 ~70 mm³일 때(그룹당 7-12 마리 마우스) 마우스를 무작위화하고 이소형 대조군 또는 PD-1 + CTLA-4 차단 항체로 처리하였다. 선 그래프는 각 그룹에 대한 평균 종양 부피 ± SEM을 도시한다. 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 이원 ANOVA에 의해 비교하였다. 파트 g는 각 마우스에 대한 개별 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 9는 a-c의 3개 파트로 구성되고, CRISPR KO 스크리닝 조건을 최적화하는 데 사용되는 B2M 녹아웃(knockout) 세포의 사용과 관련된다. 파트 a는 B2M을 표적화하는 pLenti-Cas9-Blast 및 pLenti-guide-puro로 감염된 MC38 세포에서 B2M 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 b는 24 시간 동안 mGeCKO 라이브러리 또는 b2M KO 세포 +/- 10 ng/ml IFNg 처리를 발현하도록 변형된 MC38 세포에서 H2-Kb 세포 표면 발현의 FACS 분석을 나타낸다. 파트 c는 Ova 또는 스크램블된 펩티드로 펄스된 MC38-Cas9-mGeCKO 세포 및 Ova 펩티드로 펄스된 MC38-Cas9-B2M 녹아웃 세포의 T 세포 사멸 검정을 나타낸다. OT-1 마우스로부터 단리된 CD8⁺ T 세포를 표시된 E:T 비율로 세포와 함께 인큐베이션하였고, 24 시간 후 생존력을 측정하였다.
도 10은 라이브러리 표상이 CRISPR KO 스크린 전반에 걸쳐 충분히 유지되어, 고갈 뿐만 아니라 풍부화된 sgRNA의 검출을 허용함을 나타낸다. Log₂ 정규화된 sgRNA는 T 세포 사멸 후 스크램블 대 Ova 펄스된 종양 세포에서 계수한다, R² = 0.95.
도 11은 a-b의 2개 파트로 구성되고, MC38 세포에서 성장 변형자에 대한 CRISPR KO 스크린이 핵심 필수 유전자의 높은 비율을 식별함을 보여준다. Log2 정규화된 sgRNA를 참조 대조군 세포(라이브러리-감염된 세포의 선택 직후 수확됨)와 비교하여 12 배가 동안 계대된 MC38-mGeCKO 세포에서 계수한다. 파트 a는 비-표적화 sgRNA를 나타냄을 보여준다. 1000개 비-표적화 sgRNA 중 5개만이 참조 대조군과 비교하여 2-배 초과로 유의하게 풍부화 또는 고갈되었다. 파트 b는 핵심 필수 유전자를 표적하는 sgRNA가 적색으로 표시되어 있음을 나타낸다. 핵심 필수 유전자의 96%(102/106)가 히트(2배 초과로 고갈된 적어도 2개의 sgRNA로서 정의됨)로 식별되었다. 적어도 4개의 sgRNA가 핵심 필수 유전자의 85% 이상에 대해 고갈되었다.
도 12는 자가포식 유전자의 유전적 녹아웃이 MC38 세포의 성장을 억제하지 않음을 보여준다. MC38 모 세포, 빈 벡터를 발현하는 세포 또는 표시된 자가포식 유전자를 표적화하는 다중 sgRNA를 발현하는 세포에서 12 집단 배가 후 생존력 검정.
도 13은 사전 활성화된 T 세포의 세포독성 기능이 TNFα 차단에 의해 제한되지 않음을 보여준다. MC38(TNFα 감수성) 또는 B16F10(TNFα 내성) 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 20 μg/ml TNFα 차단 항체 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에, 표시된 E:T 비율로 OT-1 마우스의 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 막대 그래프는 T 세포 없이 인큐베이션된 종양 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. *P < 0.05, ***P < 0.0005, 대조군 항체가 있는 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA.
도 14는 NF-κB 신호전달 경로가 TNFα-매개 사멸에 대해 내성인 세포주에서 활성임을 보여준다. 표시된 시간 동안 10 ng/ml TNFα로 처리 후 EMT6 또는 4T1 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯.
도 15는 파트 a-g의 7개 파트로 구성되고, Rbck1 KO가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 증가시킴을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rbck1-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 Rbck1 및 β-액틴 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(sg5 및 sg1은 스크린에서 가장 유의하게 고갈되었고; sg3은 가장 덜 유의하게 고갈되었음). 파트 b는 대조군 또는 Rbck1 KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 표시된 E:T 비율로 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. ****P < 0.0001, 모 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. ++++P < 0.0001, Rbck1 sg5 대비. 파트 c는 표시된 세포주의 T 세포 사멸을 20 μg/ml TNFα 차단 항체의 존재 하에 수행하였음을 나타낸다. *P < 0.05, 모 MC38 세포 대비. 파트 d는 세포를 표시된 농도의 TNFα로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3. 파트 e는 10 ng/ml TNFα로 처리 2 시간 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f 및 g는 세포를 표시된 양의 독소루비신 또는 파클리탁셀로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3.
도 16은 a-g의 7개 파트로 구성되고, Rela KO가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 증가시킴을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rela-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 Rela 및 β-액틴 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(sg2 및 sg3은 스크린에서 가장 유의하게 고갈되었고; sg6은 가장 덜 유의하게 고갈되었음). 파트 b는 대조군 또는 Rela KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 표시된 E:T 비율로 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. **P < 0.005, ****P < 0.0001, 모 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. ++P < 0.005, +++P < 0.0005, Rela sg2 대비. 파트 c는 표시된 세포주의 T 세포 사멸을 20 μg/ml TNFα 차단 항체의 존재 하에 수행하였음을 나타낸다. 파트 d는 세포를 표시된 농도의 TNFα로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3. 파트 e는 10 ng/ml TNFα로 처리 2 시간 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f 및 g는 세포를 표시된 양의 독소루비신 또는 파클리탁셀로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3.
도 17은 a-g의 7개 파트로 구성되고, Atg9a KO가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 증가시킴을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Atg9a-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 Atg9a 및 β-액틴 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(sg2 및 sg1은 스크린에서 가장 유의하게 고갈되었고; sg4는 가장 덜 유의하게 고갈되었음). 파트 b는 대조군 또는 Atg9a KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 표시된 E:T 비율로 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. **P < 0.005, ***P < 0.0005, ****P < 0.0001, 모 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. +P < 0.05, ++++P < 0.0001, Atg9a sg2 대비. 파트 c는 표시된 세포주의 T 세포 사멸을 20 μg/ml TNFα 차단 항체의 존재 하에 수행하였음을 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.0005, 모 MC38 세포 대비. +P < 0.05, Atg9a sg2 대비. 파트 d는 세포를 표시된 농도의 TNFα로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3. 파트 e는 10 ng/ml TNFα로 처리 8 시간 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f는 세포를 표시된 양의 독소루비신 또는 파클리탁셀로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3.
도 18은 a-g의 7개 파트로 구성되고, Atg12 KO가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 증가시킴을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Atg12-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 Atg12 및 β-액틴 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(sg3 및 sg5는 스크린에서 가장 유의하게 고갈되었고; sg6은 가장 덜 유의하게 고갈되었음). 파트 b는 대조군 또는 Atg12 KO 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 24 시간 동안 표시된 E:T 비율로 OT-1 T 세포와 함께 인큐베이션하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 T 세포의 부재 하에 인큐베이션된 세포와 비교하여 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. ****P < 0.0001, 모 MC38 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA. 파트 c는 표시된 세포주의 T 세포 사멸을 20 μg/ml TNFα 차단 항체의 존재 하에 수행하였음을 나타낸다. **P < 0.005, ***P < 0.0005, 모 MC38 세포 대비. 파트 d는 세포를 표시된 농도의 TNFα로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3. 파트 e는 10 ng/ml TNFα로 처리 8 시간 후 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 f 및 g는 세포를 표시된 양의 독소루비신 또는 파클리탁셀로 처리하고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다, n=3.
도 19는 a-b의 2개 파트로 구성되고, Rb1cc1 및 Atg12 KO 세포가 손상된 자가포식 활성을 나타냄을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rb1cc1-표적화된 sgRNA를 발현하는 MC38-Cas9 세포에서 LC3B 및 β-액틴 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다(Rb1cc1 sg3은 sg4 또는 sg5보다 Rb1cc1 단백질을 고갈시키는 데 덜 효과적이었음 - 도 4 참조). 파트 b는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Atg12-표적화된 sgRNA를 발현하는 MC38-Cas9 세포에서 LC3B 및 β-액틴 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 세포를 4 시간 동안 10 μg/ml 펩스타틴 A 및 10 μg/ml E-64-D로 처리하여 리소좀 프로테아제를 억제하였으며, 이는 자가포식이 상류에서 억제되지 않는 한 LC3B-II 축적을 초래한다. LC3B-II는 단백질의 지질화된 형태(포스파티딜에탄올아민에 접합됨)를 나타낸다.
도 20은 자가포식의 불활성화가 NF-κB 표적 유전자의 TNFα-매개 유도를 손상시키지 않음을 보여준다. 대조군 또는 Rb1cc1 KO MC38 세포를 4 시간 동안 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 이어서 세포 용해물을 마우스 사이토카인 검정에서 검정하여 40개 마우스 사이토카인의 수준을 결정하였다. TNFα에 의해 상향조절된 사이토카인이 표지된다.
도 21은 a-c의 3개 파트로 구성되고, 자가포식의 약리학적 차단이 인간 암 세포를 TNFα- 및 TRAIL-매개 사멸에 대해 감작화함을 보여준다. 파트 a는 HCT-116 인간 결장암 세포를 5 μM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα 또는 10 ng/ml TRAIL로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 파트 b는 HeLa 인간 자궁경부암 세포를 5 μM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 50 ng/ml TRAIL로 처리하거나 또는 처리하지 않았음을 나타낸다. 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 막대 그래프는 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. 처리 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA에 의해 비교하였다. 파트 c는 5 mM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFa 또는 10 ng/m Trail로 처리 24 시간 후 HCT-116 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 d는 5 μM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 50 ng/ml TRAIL로 24 시간 처리 후 HeLa 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 파트 e는 5 μM SAR405 또는 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα 또는 10 ng/ml TRAIL로 처리하였거나 또는 처리하지 않은 MC38 세포에 대한 관찰된 결과를 요약하는 그래프이다. 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 파트 f는 5 μM SAR405 또는 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα 또는 10 ng/ml TRAIL로 처리하였거나 또는 처리하지 않은 EMT6 세포에 대한 결과를 요약하는 그래프이다. 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 막대 그래프는 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. ****P < 0.0001, 처리되지 않은 세포 대비, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA.
도 22는 a-b의 2개 파트로 구성되고, 자가포식의 약리학적 차단이 여러 마우스 및 인간 암 세포주를 TNFα-매개 사멸에 대해 감작화함을 보여준다. 파트 a는 마우스 종양 세포주(EMT6, LL/2, CT26, Colon26)를 5 μM 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다. 파트 b는 인간 종양 세포주(BT-20, Me-180, MDA-MB-361)를 5 μM 오토피닙 또는 5 μM SAR-405의 부재 또는 존재 하에 10 ng/ml TNFα로 처리하거나 또는 처리하지 않았고 24 시간 후 세포 생존력을 측정하였음을 나타낸다. 막대 그래프는 상대적 세포 생존력 ± SD(n=3)를 나타낸다. 처리 그룹을 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA에 의해 비교하였다.
도 23은 a-b의 2개 파트로 구성되고, MC38 세포에서 자가포식 유전자의 KO가 세포 표면 MHC-I 수준 또는 OVA 펩티드의 제시에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 파트 a는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rb1cc1-, Atg9a-, 또는 Atg12-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 MHC-1(H2-kb) 세포 표면 발현을 나타내는 유세포 분석 히스토그램을 나타낸다. 파트 b는 MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rb1cc1-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 MHC-1(H2-kb) - Ova(SIINFEKL) 발현을 나타내는 유세포 분석 히스토그램을 나타낸다. 염색 전에 세포를 나타낸 바와 같이 Ova(SIINFEKL) 펩티드 또는 스크램블된 펩티드로 펄스하였다.
도 24는 자가포식의 활성화방지(tiactivation)가 주요 TNFα 경로 구성요소의 수준을 증가시키지 않음을 보여준다. 10 ng/ml TNFα로 처리 30 분 후, MC38 모 세포(모의), 빈 벡터로 형질도입된 MC38-Cas9 세포 또는 Rb1cc1-표적화된 sgRNA를 발현하는 세포에서 표시된 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯.
도 25는 MC38 종양을 PD-1/CTLA-4 항체로 초기에 처리하면 완전 종양 관해를 초래함을 보여준다. MC38 세포를 C57/BL6 마우스에 이식하였다. 이식 3 일 후, 마우스를 이소형 대조군 또는 PD-1 + CTLA-4 차단 항체로 처리하였다. 각 마우스에 대한 개별 종양 성장 곡선이 제시된다, n=15.
도 26은 종양에서 자가포식의 유전적 불활성화가 백혈구 침윤에 영향을 미침을 보여준다. MC38 및 EMT6 모 또는 Rb1cc1 KO 종양에서 CD45+, CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 유세포 분석이 도시된다. 그래프는 중앙값이 표시된 개별 종양(n=4)을 나타낸다. 그래프를 Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA에 의해 비교하였다.

일반론

본원의 개시내용은 부분적으로 자가포식 개시, 막 물질의 전달, 또는 자가포식소체 확장의 억제를 포함하는 자가포식 경로의 억제가 암 세포를 (예를 들어, T 세포에 의해) TNFα-매개 사멸에 대해 감작화된다는 발견에 기반한다. 추가적으로, 출원인은 NF-κB 경로의 억제가 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화함을 본원에 나타내었다. 특히, 본원에 나타낸 바와 같이, 자가포식의 유전적 억제는 종양 세포를 생체내에서 T 세포-매개 사멸에 대해 감작화한다. 출원인은 자가포식 경로 및 NF-κB 경로가 면역요법 반응성의 중요한 조절인자고, 이러한 경로의 억제가 암 요법, 특히 T 세포-지시 요법의 효능을 향상시킴을 본원에 나타낸다.

따라서, 특정 측면에서, 본원에는 암 세포를 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)와 접촉시킴으로써 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본원에는 대상체에게 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체의 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법이 제공된다.

다른 측면에서, 본원에는 대상체에게 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 적어도 하나의 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체에서 암 세포의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키는 방법이 제공된다.

추가의 측면에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에게 종양에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체에서 종양의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키거나 또는 대상체에서의 종양을 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법을 포함한다. 또한 본원에는 대상체에게 대상체의 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여하고 대상체에게 암 면역요법과 같은 TNF-α 매개 사멸을 유도하는 제2 제제를 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.

정의

관사는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

용어 "제제"는 화학적 화합물, 소분자, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자(예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 핵산), 항체, 항체 단편, 단백질, 펩티드), 생물학적 거대분자의 혼합물, 및/또는 이의 조합을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제제는 CRISPR/Cas 시스템의 구성요소를 포함하는 조성물이다. 이러한 제제의 활성은 제제를 대상체에서 국부로 또는 전신으로 작용하는 생물학적, 생리학적, 또는 약리학적 활성 물질(또는 물질들)인 "치료제"로서 적합하게 만들 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "자가포식 유전자"는 억제될 때, 세포에서 감소된 수준의 자가포식을 초래하는 생성물을 암호화하는 유전자이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 고형 종양 및 혈액 매개 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어 암은 피부, 조직, 기관, 골, 연골, 혈액 및 혈관의 질환을 포함한다. 용어 "암"은 원발성 및 전이성 암을 추가로 포함한다.

"코돈 최적화"는 아미노산을 명시하는 3-염기 쌍 코돈 조합의 다양성에 의해 나타낸 바와 같이 코돈 축퇴성의 이점을 취하며, 일반적으로 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 특정 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형하는 과정을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 핵산 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하는 주어진 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스(Codon Usage Database)"에서 코돈 용법 표가 용이하게 이용가능하다. 이들 표는 다수의 방식으로 조정될 수 있다. Nakamura 등 (2000) Nucleic Acids Research 28:292를 참조하며, 그의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화용 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용가능하다(예를 들어, Gene Forge 참조).

핵산의 "상보성"은 핵산의 한 가닥에 있는 뉴클레오티드 서열이, 그의 핵염기 그룹의 배향으로 인해, 반대 핵산 가닥의 또 다른 서열과 수소 결합을 형성함을 의미한다. DNA의 상보적 염기는 전형적으로 A와 T 및 C와 G이다. RNA에서, 이들은 전형적으로 C와 G 및 U와 A이다. 상보성은 완벽하거나 실질적/충분할 수 있다. 두 핵산 사이의 완벽한 상보성은 두 핵산이 이중체(duplex)를 형성할 수 있음을 의미하며 여기서 이중체의 모든 염기는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍형성에 의해 상보적 염기에 결합된다. "실질적인" 또는 "충분한" 상보적은 한 가닥의 서열이 반대 가닥의 서열과 완전히 및/또는 완벽히 상보적이지만, 두 가닥의 염기 사이에 충분한 결합이 발생하여 혼성화 조건 세트(예를 들어, 염 농도 및 온도)에서 안정한 하이브리드 복합체를 형성함을 의미한다. 이러한 조건은 혼성화된 가닥의 Tm(용융 온도)을 예측하기 위한 순서 및 표준 수학적 계산을 사용하거나, 또는 일상적 방법을 사용한 Tm의 경험적 결정에 의해 예측될 수 있다. Tm은 두 핵산 가닥 사이에 형성된 혼성화 복합체 집단이 50% 변성되는(즉, 이중 가닥 핵산 분자의 집단이 단일 가닥으로 절반 해리됨) 온도를 포함한다. Tm 미만의 온도에서, 혼성화 복합체의 형성이 선호되는 반면, Tm 초과의 온도에서, 혼성화 복합체의 가닥의 용융 또는 분리가 선호된다. Tm은 예를 들어, Tm=81.5+0.41(% G+C)를 사용하여 수성 1 M NaCl 용액 중 알려진 G+C 함량을 갖는 핵산에 대해 추정될 수 있지만, 다른 알려진 Tm 계산은 핵산 구조적 특성을 고려한다.

본원에 사용된 바와 같이, 어구 "공동 투여"는 이전에 투여된 치료제가 체내에서 여전히 효과적이면서 제2 제제가 투여되도록 2개 이상의 상이한 치료제의 임의의 투여 형태를 지칭한다(예를 들어, 2개 제제는 대상체에서 동시에 효과적이며, 2개 제제의 상승 효과를 포함할 수 있음).

용어 "유전자"는 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩티드 생성물)을 코딩하고 코딩 영역, 코딩 영역을 중단하는 임의의 비-코딩 인트론, 및 유전자가 전장 mRNA(5' 및 3' 비번역 서열 포함)에 상응하도록 5' 및 3' 단부 둘 다의 코딩 영역에 인접하게 위치한 서열을 포함하는 염색체의 DNA 서열을 지칭한다. 용어 "유전자"는 또한 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위, 사일렌서(silencer), 절연 서열, 및 기질 부착 영역을 포함한 다른 비-코딩 서열을 포함한다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 가깝거나(예를 들어, 10 kb 이내) 또는 먼 부위에 있을 수 있고, 이들은 유전자의 전사 및 번역 수준 또는 속도에 영향을 미친다.

"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)에 결합하고 Cas 단백질을 표적 DNA 내의 특정 위치로 표적하는 RNA 분자이다. 가이드 RNA는 다음 2개 분절을 포함할 수 있다: "DNA-표적화 분절" 및 "단백질-결합 분절." "분절"은 RNA 내 뉴클레오티드의 인접 스트레치와 같은 분자의 섹션 또는 영역을 포함한다. Cas9에 대한 것과 같은 일부 gRNA는 다음 2개의 별개의 RNA 분자를 포함할 수 있다: "활성인자-RNA"(예를 들어, tracrRNA) 및 "표적인자-RNA"(예를 들어, CRISPR RNA 또는 crRNA). 다른 gRNA는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오티드)이며, "단일-분자 gRNA," "단일-가이드 RNA," 또는 "sgRNA"로도 명명될 수 있다. 예를 들어, WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578, 및 WO 2014/131833을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. Cas9의 경우, 예를 들어, 단일-가이드 RNA는 tracrRNA에 융합된 crRNA(예를 들어, 링커를 통해)를 포함할 수 있다. Cpf1의 경우, 예를 들어, crRNA만이 표적 서열에 대한 결합을 달성하기 위해 필요하다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중-분자(즉, 모듈식) gRNA 및 단일-분자 gRNA를 둘 다 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "가이드 RNA 표적 서열"은 구체적으로 가이드 RNA가 상보적 가닥에 혼성화하는 서열에 상응하는 비-상보적 가닥 상의(즉, 역 보체의) 서열을 지칭한다. 즉, 가이드 RNA 표적 서열은 PAM에 인접한 비-상보적 가닥(예를 들어, Cas9의 경우 PAM의 상류 또는 5') 상의 서열을 지칭한다. 가이드 RNA 표적 서열은 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 동등하지만, 우라실 대신에 티민이 있다. 일 예로서, SpCas9 효소에 대한 가이드 RNA 표적 서열은 비-상보적 가닥 상의 5'-NGG-3' PAM의 상류에 있는 서열을 지칭할 수 있다.

용어 "지질 입자"는 치료 핵산(예를 들어, gRNA)을 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다.

용어 "지질 접합체"는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 지칭한다. 이러한 지질 접합체는 예를 들어, 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 번호 5,885,613 참조), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이의 혼합물과 같은 PEG-지질 접합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는 PCT 공개 번호 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 포함하는, PEG 또는 POZ를 지질에 커플링하기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 아미드 또는 카바메이트와 같은, 비-에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "NF-κB 유전자"는 억제될 때, 세포에서 감소된 수준의 NF-κB 신호전달을 초래하는 생성물을 암호화하는 유전자이다.

본원에 사용된 바와 같이, "비-자연 발생" 시스템은 자연 발생 상태에서 변경 또는 돌연변이되거나, 자연에서 자연적으로 연관된 적어도 하나의 다른 구성요소가 적어도 실질적으로 없거나, 또는 자연적으로 연관되지 않은 적어도 하나의 다른 구성요소와 연관되어 있는 시스템의 하나 이상의 구성요소와 같은, 인간의 관여를 나타내는 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로 함께 발생하지 않는 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하는 비-자연 발생 CRISPR을 이용하거나, 자연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질을 이용하거나, 또는 자연적으로 발생하지 않는 gRNA를 이용한다.

본원에 사용된 바와 같은 어구 "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상 화합물을 하나의 기관, 또는 신체의 일부에서 다른 기관, 또는 신체의 일부로 전달 또는 수송하는 데 수반되는, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다.

용어 "폴리뉴클레오티드", 및 "핵산"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌(좌위), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 구성요소와의 접합에 의해서와 같이 추가로 변형될 수 있다. 용어 "재조합" 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발생하지 않거나 또는 비-자연 배열로 또 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

핵산은 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 가지고 있다고 하는 데, 하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 연결을 통해 한 방향으로 그의 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로 모노뉴클레오티드가 반응하여 올리고뉴클레오티드를 만들기 때문이다. 올리고뉴클레오티드의 단부는 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않은 경우 "5' 단부"로서 지칭된다. 올리고뉴클레오티드의 단부는 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않은 경우 "3' 단부"로서 지칭된다. 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오티드의 내부에 있을지라도, 또한 5' 및 3' 단부를 가지고 있다고 할 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소는 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'이라고 지칭된다.

용어 "예방하다," "예방하는," "예방" 등은 질환, 장애, 또는 병태가 없지만, 이의 발병 위험이 있거나 또는 이에 취약한 대상체에서 질환, 장애, 또는 병태의 발병 확률을 감소시키는 것을 지칭한다.

용어 "소분자"는 당업계의 용어이며 약 1000 분자량 미만 또는 약 500 분자량 미만인 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 소분자는 펩티드 결합을 배타적으로 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 소분자는 올리고머가 아니다. 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 예시적인 소분자 화합물은 펩티드, 펩티도모방체, 핵산, 탄수화물, 작은 유기 분자(예를 들어, 폴리케티드)(Cane 등 (1998) Science 282:63), 및 천연 생성물 추출 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

"작은 헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵시키는 데 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 회전을 만드는 짧은 RNA 서열을 포함한다. 본원에 제공된 shRNA는 화학적으로 합성되거나 또는 DNA 플라스미드에서 전사 카세트로부터 전사될 수 있다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 기계에 의해 siRNA로 절단된 다음, RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 결합된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 치료 또는 요법을 위해 선택되는 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다. 본원에 제공된 특정 구현예에서 대상체는 인간 대상체이다. 본원에 제공된 일부 구현예에서, 대상체는 암이 있는 대상체와 같이, 본원에 제공된 방법을 필요로 하는 대상체이다.

용어 "뉴클레아제 제제에 대한 표적 서열"은 닉(nick) 또는 이중-가닥 파괴가 뉴클레아제 제제에 의해 유도되는 DNA 서열을 포함한다. 마찬가지로, 용어 "DNA-결합 단백질에 대한 표적 서열"은 DNA-결합 단백질이 결합할 DNA 서열을 포함한다. 표적 서열은 세포에 대해 내인성(또는 천연)일 수 있거나 또는 표적 서열은 세포에 대해 외인성일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 어구 "치료 유효량" 및 "유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율로 대상체에서 세포의 적어도 하위집단에서 원하는 치료 효과를 생산하는 데 효과적인 제제의 양을 의미한다.

대상체에서 질환을 "치료하는" 또는 질환이 있는 대상체를 "치료하는"은 질환의 적어도 하나의 증상이 감소되거나 또는 악화되는 것을 방지하도록 대상체를 약제학적 치료에 적용하는 것, 예를 들어, 약물의 투여를 지칭한다.

자가포식 및 NF-κB 경로

상기 논의된 바와 같이, 본원의 개시내용은 부분적으로 자가포식 개시, 막 물질의 전달, 또는 자가포식소체 확장의 억제를 포함하는 자가포식 경로의 억제가 암 세포를 (예를 들어, T 세포에 의해) TNFα- 매개 사멸에 대해 감작화된다는 발견에 기반한다. 출원인은 자가포식 경로 및 NF-κB 경로가 면역요법 반응성의 중요한 조절인자고, 이들 경로의 억제가 암 요법, 특히 T 세포-지시 요법의 효능을 향상시킴을 본원에 나타낸다.

따라서, 본원에는 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 적어도 하나의 제제)를 대상체에게 투여하거나 또는 암 세포와 접촉시킴으로써 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 제제는 자가포식 유전자 및/또는 NF-κB 유전자의 발현 또는 활성을 억제한다. 본원에 사용된 바와 같이, 그리고 자가포식 유전자는, 억제될 때 세포에서 감소된 수준의 자가포식을 초래하는 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 자가포식 유전자는 예를 들어, ATG12, WIPI2, RB1CC1, PIK3C3, ATG9A, ATG2A, ATG5, ATG14, EI24, NRBF2, ATG13, TAX1BP1, 및 ATG10일 수 있다. 이들 예시적인 자가포식 유전자의 mRNA, 단백질 및 게놈(GRCh38.p13 1차 조립) 서열에 대한 예시적인 NCBI 서열 참조는 표 1에 제공된다.

표 1: 자가포식 경로의 예시적인 유전자 표적

일부 구현예에서, 제제는 NF-κB 유전자의 발현 또는 활성을 억제한다. 본원에 사용된 바와 같이, 그리고 NF-κB 유전자는, 억제될 때 세포에서 감소된 수준의 NF-κB 신호전달을 초래하는 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. NF-κB 유전자는 예를 들어, CFLAR, UBE2L3, RNF31, IKBKB, MAP3K7, TAB1, RELA, IKKBKG, CHUK, TAB2, TBK1, MAPKAPK2, RBCK1, TRAF2, SHARPIN, 또는 TNFAIP3일 수 있다. 이들 예시적인 NF-κB 유전자의 mRNA, 단백질 및 게놈(GRCh38.p13 1차 조립) 서열의 예시적인 NCBI 서열 참조는 표 1에 제공된다.

표 2: NF-κB 경로 내의 예시적인 유전자

다른 측면에서, 본원에는 대상체에게 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 적어도 하나의 제제(예를 들어, 표 1 또는 2의 유전자와 같은, 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 적어도 하나의 NF-κB 유전자를 변형시키는 제제와 같은, 본원에 개시된 적어도 하나의 제제)를 투여함으로써 대상체에서 암 세포의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키는 방법이 제공된다. 또한 본원에는 대상체에게 종양에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 표 1 또는 2의 유전자와 같은, 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 적어도 하나의 NF-κB 유전자를 변형시키는 제제와 같은, 본원에 개시된 적어도 하나의 제제)를 투여함으로써 대상체에서 종양의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키거나 또는 대상체에서 종양을 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법이 개시된다. 또한 본원에는 대상체에게 대상체의 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 표 1 또는 2의 유전자와 같은, 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 적어도 하나의 NF-κB 유전자를 변형시키는 제제와 같은 본원에 개시된 적어도 하나의 제제) 및 암 요법(예를 들어, 암 면역요법)을 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 자가포식 또는 NF-κB 유전자를 변형시키는 것은 유전자의 발현 및/또는 활성의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 자가포식 또는 NF-κB 유전자를 변형시키는 것은 유전자의 발현 및/또는 활성의 제거를 초래한다.

자가포식 및 NF-κB 경로의 조절인자

CRISPR/Cas 시스템

일부 구현예에서, 본원에는 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1의 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2의 NF-κB 유전자)의 발현 또는 활성을 억제하는 제제, 및 이의 사용 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 제제는 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자를 변형시키는 제제일 수 있다(예를 들어, 여기서 적어도 하나의 유전자를 변형시키는 것은 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및/또는 제거를 초래한다). 일부 구현예에서, 유전자의 변형은 결실, 삽입, 대체, 또는 이의 조합을 포함하다. 일부 구현예에서, 변형 과정은 유전자에 Cas 단백질의 결합을 포함한다.

특정 구현예에서, 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 가이드 RNA를 포함하는 조성물이다. 일부 구현예에서, 제제는 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이다. 가이드 RNA는 유전자의 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적일 수 있으며, 여기서 가이드 RNA는 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 유전자 내의 이중 가닥 파괴 및 단일 가닥 파괴로부터 선택된 절단 이벤트를 제공하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 표적 서열은 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접하다. 가이드 RNA 표적 서열은 개시 코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 표적 서열은 표적화된 유전자의 엑손 1에 존재한다. 일부 구현예에서, gRNA 표적 서열은 표적화된 유전자의 엑손 2에 존재한다. 일부 구현예에서, 자가포식 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 복수의 가이드 RNA를 포함하는 조성물이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 조성물은 (예를 들어, 붕괴를 유도하기 위해) 표적화된 유전자의 5' 단부를 표적화하는 제1 가이드 RNA 및 표적화된 유전자의 3' 단부를 표적화하는 제2 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서 조성물은 표적화된 유전자의 기능적 도메인을 변형 또는 결실시키도록 설계된 이중 gRNA를 포함한다.

특정 구현예에서, 가이드 RNA는 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)에 혼성화하는 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일 예로서, 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드는 각각 표 1 또는 표 2에 제공된 유전자 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 표 1에 나열된 자가포식 유전자 또는 표 2에 나열된 NF-κB 유전자의 분절에 혼성화할 수 있다. 임의적으로, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 2에 제공된 유전자 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다.

예를 들어, 특정 구현예에서 세포의 게놈에서 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)에 대한 표적화된 유전적 변형은 세포 또는 세포의 게놈을 Cas 단백질 및 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)의 표적 게놈 유전자좌 내의 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열에 혼성화하는 하나 이상의 가이드 RNA와 접촉시킴으로써 생성될 수 있다. 즉, 세포의 게놈에서 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)에 대한 표적화된 유전적 변형은 세포 또는 세포의 게놈을 Cas 단백질 및 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)의 표적 게놈 유전자좌 내의 하나 이상의 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 하나 이상의 가이드 RNA와 접촉시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 세포를 Cas 단백질 및 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자) 내의 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 가이드 RNA와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열은 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)의 개시 코돈 또는 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)의 종결 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열은 개시 코돈 또는 종결 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개 뉴클레오티드 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 표적 서열은 표적화된 유전자의 엑손 1에 있다. 일부 구현예에서, gRNA 표적 서열은 표적화된 유전자의 엑손 2에 존재한다. 일부 구현예에서, 자가포식 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 복수의 가이드 RNA를 포함하는 조성물이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 조성물은 (예를 들어, 붕괴를 유도하기 위해) 표적화된 유전자의 5' 단부를 표적화하는 제1 가이드 RNA 및 표적화된 유전자의 3' 단부를 표적화하는 제2 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서 조성물은 표적화된 유전자의 기능적 도메인을 변형 또는 결실시키도록 설계된 이중 gRNA를 포함한다.

일부 방법에서, 2개 이상의 뉴클레아제 제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 뉴클레아제 제제가 사용될 수 있으며, 각각은 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열을 표적화한다. 또 다른 예로서, 2개의 뉴클레아제 제제가 사용될 수 있으며, 하나는 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하고, 다른 하나는 종결 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하며, 여기서 뉴클레아제 제제에 의한 절단은 2개 뉴클레아제 표적 서열 사이의 코딩 영역의 결실을 초래할 수 있다. 또 다른 예로서, 3개 이상의 뉴클레아제 제제가 사용될 수 있으며, 하나 이상(예를 들어, 2개)은 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하고, 하나 이상(예를 들어, 2개)은 종결 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하며, 여기서 뉴클레아제 제제에 의한 절단은 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열과 종결 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 뉴클레아제 표적 서열 사이의 코딩 영역의 결실을 초래할 수 있다.

예시적인 자가포식 유전자를 표적화하는 데 유용한 예시적인 sgRNA 서열(유전자명, sgRNA ID, 적용가능한 경우 sgRNA 번호 및 서열)은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: Rb1cc1, MGLibA_44688, 1, AGAGTGTGTACTTACAGCGC(서열번호: 38); Rb1cc1, MGLibA_44689, 2, CTGAACGTGGCAAAGAACTT(서열번호: 39); Rb1cc1, MGLibA_44690, 3, TCAAGATAGACCCAATGATG(서열번호: 40); Rb1cc1, MGLibB_44675, 4, CTCCATTGACCACCAGAACC(서열번호: 41); Rb1cc1, MGLibB_44676, 5, ATTTGAACAGTCCTCCAGAT(서열번호: 42); Rb1cc1, MGLibB_44677, 6, CTTTAGGAATAGCAGGTGCA(서열번호: 43); Atg9a, MGLibA_05661, 1, CATAGTCCACACAGCTAACC(서열번호: 44); Atg9a, MGLibA_05662, 2, TTGGGATCCGAAGAGCATGT(서열번호: 45); Atg9a, MGLibA05663, 3, CTGCCCAAGTCTGTAGTGCC(서열번호: 46); Atg9a, MGLibB_05661, 4, TCTATAACATTTGCTGCTAT(서열번호: 47); Atg9a, MGLibB_05662, 5, TACATGTGAAGCCATTCTTC(서열번호: 48); Atg9a, MGLibB_05663, 6, AGGATATTCGAGAGAAGAAG(서열번호: 49); Atg12, MGLibA_05619, 1, TGCAGTTTCGCCCGGAACGG(서열번호: 50); Atg12, MGLibA_05620, 2, CTCTGGAAGGCTCTCGCCGC(서열번호: 51); Atg12, MGLibA_05621, 3, GAGCGAACCCGGACCATCCA(서열번호: 52); Atg12, MGLibB_05619, 4, TCATCATACCAACTGTTCCG(서열번호: 53); Atg12, MGLibB_05620, 5, CCTGCATTACTGCAAATCCC(서열번호: 54); 및 Atg12, MGLibB_05621, 6, TTCTGGCTCATCCCCATGCC(서열번호: 55).

예시적인 NF-κB 유전자를 표적화하는 데 유용한 예시적인 sgRNA 서열(유전자명, sgRNA ID, 적용가능한 경우 sgRNA 번호 및 서열)은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: Map3k7, MGLibA_30286, 1, GATGATCGAAGCGCCGTCGC(서열번호: 16); Map3k7, MGLibA_30287, 2, CGGCGCTTCGATCATCTCAC(서열번호: 17); Map3k7, MGLibA_30288, 3, GGGACTTACTGGATTCAGGC(서열번호: 18); Map3k7, MGLibB_30277, 4, GAGTAGTTTGCAAAGCTAAG(서열번호: 19); Map3k7, MGLibB_30278, 5, TTAACTCAGGTTGTCGGAAG(서열번호: 20); Map3k7, MGLibB_30279, 6, GAGGGGGGCTCATTGTATAA(서열번호: 21); Rbck1, MGLibA_44718, 1, AGTACGCCCGGATATGACAG(서열번호: 22); Rbck1, MGLibA_44719, 2, ACGTGTTGCGGGCTGACAGC(서열번호: 23); Rbck1, MGLibA_44720, 3, CAGCTTACCGGTGGTGACTC(서열번호: 24); Rbck1, MGLibB_44705, 4, AACCTGTCCTTCCGAAGCCC(서열번호: 25); Rbck1, MGLibB_44706, 5, CGGGCGTACTGTGAGCCAAA(서열번호: 26); Rbck1, MGLibB_44707, 6, CTGCTATCAAGTATGCCACC(서열번호: 27); Rela, MGLibA_45072, 1, GCGATTCCGCTATAAATGCG(서열번호: 28); Rela, MGLibA_45073, 2, TCATCGAACAGCCGAAGCAA(서열번호: 29); Rela, MGLibA_45074, 3, GCCCAGACCGCAGTATCCAT(서열번호: 30); Rela, MGLibB_45059, 4, CTGCCGGGATGGCTACTATG(서열번호: 31); Rela, MGLibB_45060, 5, ACCGTGAAAGGGGTTATTGT(서열번호: 32); 및 Rela, MGLibB_45061, 6, ACTTACCTGAGGGAAAGATG(서열번호: 33).

일부 구현예에서, 가이드 RNA는 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 모듈식 가이드 RNA일 수 있으며 여기서 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자이다.

일부 구현예에서, 조성물은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질)을 추가로 포함한다. Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다. Cas9 분자는 에스. 아우레우스(S. aureus) Cas9 단백질, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) Cas9 단백질일 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR)/CRISPR-연관(Cas) 시스템 또는 이러한 시스템의 구성요소를 활용하여 세포 내의 게놈을 변형시킬 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현, 또는 이의 활성을 지시하는 데 수반되는 전사체 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III 시스템, 또는 유형 V 시스템(예를 들어, 하위유형 V-A 또는 하위유형 V-B)일 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위-지정 결합 또는 절단을 위해 CRISPR 복합체(Cas 단백질과 복합체화된 가이드 RNA(gRNA) 포함)를 활용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CRISPR/Cas 시스템은 비-자연 발생일 수 있다.

A. Cas 단백질

일부 구현예에서, Cas 단백질은 일반적으로 가이드 RNA와 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인(예를 들어, DNase 도메인 또는 RNase 도메인), DNA-결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 및 다른 도메인을 포함할 수 있다. 일부 이러한 도메인(예를 들어, DNase 도메인)은 천연 Cas 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 이러한 도메인이 첨가되어 변형된 Cas 단백질을 만들 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 핵산 분자의 공유 결합의 파손을 포함하는 핵산 절단을 위한 촉매 활성을 보유한다. 절단은 뭉툭한 단부 또는 엇갈린 단부를 생산할 수 있고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 전형적으로 뭉툭한 절단 생성물을 생성할 것이다. 대안적으로, 야생형 Cpf1 단백질(예를 들어, FnCpf1)은 5-뉴클레오티드 5' 돌출부가 있는 절단 생성물을 초래할 수 있으며, 절단은 비-표적화된 가닥 상의 PAM 서열로부터 18번째 염기 쌍 다음 및 표적화된 가닥 상의 23번째 염기 다음에 발생한다. Cas 단백질은 표적 게놈 유전자좌에서 이중-가닥 파괴(예를 들어, 뭉툭한 단부가 있는 이중-가닥 파괴)를 생성하는 완전한 절단 활성을 가질 수 있거나, 또는 표적 게놈 유전자좌에서 단일-가닥 파괴를 생성하는 닉카제일 수 있다.

Cas 단백질의 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이의 동족체 또는 변형된 버전을 포함한다.

예시적인 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질로부터 유래된 단백질이다. Cas9 단백질은 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되고 전형적으로 보존된 아키텍처와 함께 4가지 주요 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2, 및 4는 RuvC-유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. 예시적인 Cas9 단백질은 다음으로부터 유래된다: 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스, 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루크기이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 왓소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 애루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹토르 벡스시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라내로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나배나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스토크 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비야 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 또는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni). Cas9 패밀리 구성원의 추가의 예는 WO 2014/131833에 기재되어 있으며, 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 에스. 피오게네스로부터의 Cas9(SpCas9)(SwissProt 수탁 번호 Q99ZW2로 지정됨)는 예시적인 Cas9 단백질이다. 에스. 아우레우스로부터의 Cas9(SaCas9)(UniProt 수탁 번호 J7RUA5로 지정됨)는 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 캄필로박터 제주니로부터의 Cas9(CjCas9)(UniProt 수탁 번호 Q0P897로 지정됨)는 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, Kim 등 (2017) Nat. Commun. 8:14500을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. SaCas9는 SpCas9보다 더 작고, CjCas9는 SaCas9 및 SpCas9 둘 다보다 더 작다.

Cas 단백질의 또 다른 예는 Cpf1(프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 1로부터의 CRISPR) 단백질이다. Cpf1은 Cas9의 특징적 알라닌-풍부 클러스터에 대한 대응물과 함께 Cas9의 상응하는 도메인에 상동인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 큰 단백질(약 1300개 아미노산)이다. 그러나, Cpf1은 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9와 달리, Cpf1 서열에 인접하다. 예를 들어, Zetsche 등 (2015) Cell 163(3):759-771을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 Cpf1 단백질은 다음으로부터 유래된다: 프란시셀라 툴라렌시스 1(Francisella tularensis 1), 프란시셀라 툴라렌시스 하위종 노비시다(Francisella tularensis subsp. novicida), 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 라크노스피라세애 박테리움 MC2017 1(Lachnospiraceae bacterium MC2017 1), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 GW2011_GWA2_33_10(Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10), 파르쿠박테리아 박테리움 GW2011_GWC2_44_17(Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17), 스미텔라 종 SCADC(Smithella sp. SCADC), 아시다미노코쿠스 종 BV3L6(Acidaminococcus sp. BV3L6), 라크노스피라세애 박테리움 MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 237(Moraxella bovoculi 237), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라크노스피라세애 박테리움 ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 3(Porphyromonas crevioricanis 3), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 및 포르피로모나스 마카캐(Porphyromonas macacae). 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) U112로부터의 Cpf1(FnCpf1; UniProt 수탁 번호 A0Q7Q2로 지정됨)은 예시적인 Cpf1 단백질이다.

Cas 단백질은 야생형 단백질(즉, 자연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질(즉, Cas 단백질 변이체), 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 촉매 활성과 관련한 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 촉매 활성과 관련한 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 일부에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하고 따라서 닉-유도 또는 이중-가닥-파괴-유도 활성을 유지한다. 닉-유도 또는 이중-가닥-파괴-유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고 일반적으로 절단 부위를 함유하는 DNA 기질 상의 Cas 단백질의 전반적인 활성 및 특이성을 측정한다.

변형된 Cas 단백질의 일 예는 변형된 SpCas9-HF1 단백질이며, 이는 비-특이적 DNA 접촉을 감소시키도록 설계된 변경(N497A/R661A/Q695A/Q926A)을 보유하는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 고충실도 변이체이다. 예를 들어, Kleinstiver 등 (2016) Nature 529(7587):490-495를 참조하며, 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 변형된 Cas 단백질의 또 다른 예는 표적외 효과를 감소시키도록 설계된 변형된 eSpCas9 변이체(K848A/K1003A/R1060A)이다. 예를 들어, Slaymaker 등 (2016) Science 351(6268):84-88을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 SpCas9 변이체는 K855A 및 K810A/K1003A/R1060A를 포함한다.

Cas 단백질은 핵산 결합 친화도, 핵산 결합 특이성, 및 효소 활성 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 안정성과 같은 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성을 바꾸도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형되거나, 결실되거나, 또는 불활성화될 수 있거나, Cas 단백질은 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하거나 또는 Cas 단백질의 활성 또는 특성을 최적화(예를 들어, 향상 또는 감소)하도록 절두될 수 있다.

Cas 단백질은 DNase 도메인과 같은 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cpf1 단백질은 일반적으로 표적 DNA의 두 가닥을 절단하는 RuvC-유사 도메인을 포함하며, 아마 이량체 구성일 수 있다. Cas 단백질은 또한 DNase 도메인과 같은 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 일반적으로 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 및 HNH 도메인은 각각 이중-가닥 DNA의 상이한 가닥을 절단하여 DNA에서 이중-가닥 파괴를 만들 수 있다. 예를 들어, Jinek 등 (2012) Science 337(6096):816-821을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

뉴클레아제 도메인 중 하나 이상 또는 전부는 결실되거나 또는 돌연변이되어 더 이상 기능적이지 않거나 또는 감소된 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 도메인 중 하나가 Cas9 단백질에서 결실되거나 또는 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas9 단백질은 닉카제로 지칭될 수 있고 이중-가닥 파괴가 아니라 이중-가닥 표적 DNA 내에 단일-가닥 파괴를 생성할 수 있다(즉, 상보적 가닥 또는 비-상보적 가닥을 절단할 수 있지만 둘 다를 절단할 수 없다). 두 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 또는 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 이중-가닥 DNA의 두 가닥을 절단하는 능력이 감소될 것이다(예를 들어, 뉴클레아제-null 또는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질, 또는 촉매적으로 사멸된 Cas 단백질(dCas)). Cas9를 닉카제로 전환하는 돌연변이의 예는 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC 도메인에서 D10A(Cas9의 위치 10에서 아스파르테이트에서 알라닌으로) 돌연변이이다. 마찬가지로, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 HNH 도메인에서 H939A(아미노산 위치 839에서 히스티딘에서 알라닌으로), H840A(아미노산 위치 840에서 히스티딘에서 알라닌으로), 또는 N863A(아미노산 위치 N863에서 아스파라긴에서 알라닌으로)는 Cas9를 닉카제로 전환할 수 있다. Cas9를 닉카제로 전환하는 돌연변이의 다른 예는 에스. 써모필루스(S. thermophilus)로부터의 Cas9에 대한 상응하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, Sapranauskas 등 (2011) Nucleic Acids Res. 39(21):9275-9282 및 WO 2013/141680을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 돌연변이는 부위 지정 돌연변이유발, PCR-매개 돌연변이유발, 또는 총 유전자 합성과 같은 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 닉카제를 생성하는 다른 돌연변이의 예는 예를 들어, WO 2013/176772 및 WO 2013/142578에서 찾을 수 있으며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 모든 뉴클레아제 도메인이 Cas 단백질에서 결실되거나 또는 돌연변이되는 경우(예를 들어, 두 뉴클레아제 도메인이 Cas9 단백질에서 결실되거나 또는 돌연변이됨), 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 이중-가닥 DNA의 두 가닥을 절단하는 능력이 감소될 것이다(예를 들어, 뉴클레아제-null 또는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질). 하나의 구체적 예는 D10A/H840A 에스. 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이체 또는 에스. 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 또 다른 종으로부터의 Cas9에서 상응하는 이중 돌연변이체이다. 또 다른 구체적 예는 D10A/N863A 에스. 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이체 또는 에스. 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 또 다른 종으로부터의 Cas9에서 상응하는 이중 돌연변이체이다.

스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 단백질의 촉매 도메인에서 돌연변이를 불활성화시키는 예가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphyloccocus aureus) Cas9 효소(SaCas9)는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질을 생성하기 위해 위치 N580에서 치환(예를 들어, N580A 치환) 및 위치 D10에서 치환(예를 들어, D10A 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 2016/106236을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Cpf1 단백질의 촉매 도메인에서 돌연변이를 불활성화시키는 예가 또한 알려려 있다. 프란시셀라 노비시다 U112(FnCpf1), 아시다미노코쿠스 종 BV3L6(AsCpf1), 라크노스피라세애 박테리움 ND2006(LbCpf1), 및 모락셀라 보보쿨리 237(MbCpf1 Cpf1)로부터의 Cpf1 단백질을 참조하여, 이러한 돌연변이는 AsCpf1의 위치 908, 993, 또는 1263 또는 Cpf1 오솔로그(orthologs)의 상응하는 위치, 또는 LbCpf1의 위치 832, 925, 947, 또는 1180 또는 Cpf1 오솔로그의 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 AsCpf1의 돌연변이 D908A, E993A, 및 D1263A 또는 Cpf1 오솔로그의 상응하는 돌연변이, 또는 LbCpf1의 D832A, E925A, D947A, 및 D1180A 또는 Cpf1 오솔로그의 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, US 2016/0208243을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Cas 단백질은 또한 융합 단백질로서 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후생유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. WO 2014/089290을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 전사 활성화 도메인의 예는 단순 포진 바이러스 VP16 활성화 도메인, VP64(이는 VP16의 사량체성 유도체임), NFκB p65 활성화 도메인, p53 활성화 도메인 1 및 2, CREB(cAMP 반응 요소 결합 단백질) 활성화 도메인, E2A 활성화 도메인, 및 NFAT(활성화된 T-세포의 핵 인자) 활성화 도메인을 포함한다. 다른 예는 Oct1, Oct-2A, SP1, AP-2, CTF1, P300, CBP, PCAF, SRC1, PvALF, ERF-2, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, ARF-6, ARF-7, ARF-8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, TRAB1PC4, 및 HSF1로부터의 활성화 도메인을 포함한다. 예를 들어, US 2016/0237456, EP3045537, 및 WO 2011/146121을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 경우에, MS2-p65-HSF1과 쌍을 이룬 dCas9-VP64 융합 단백질을 포함하는 전사 활성화 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서 가이드 RNA는 이량체화된 MS2 박테리오파지 코트 단백질에 결합하도록 설계된 sgRNA 테트라루프 및 줄기-루프 2에 첨부된 압타머 서열로 설계될 수 있다. 예를 들어, Konermann 등 (2015) Nature 517(7536):583-588을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 전사 억제인자 도메인의 예는 유도성 cAMP 초기 억제인자(ICER) 도메인, Kruppel-연관 박스 A(KRAB-A) 억제인자 도메인, YY1 글리신 풍부 억제인자 도메인, Sp1 -유사 억제인자, E(spl) 억제인자, IκB 억제인자, 및 MeCP2를 포함한다. 다른 예는 A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 유전자(TIEG), v-erbA, SID, SID4X, MBD2, MBD3, DNMT1, DNMG3A, DNMT3B, Rb, ROM2로부터의 전사 억제인자 도메인을 포함하고, 예를 들어, EP3045537 및 WO 2011/146121을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. Cas 단백질은 또한 증가 또는 감소된 안정성을 제공하는 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종 폴리펩티드는 N-말단, C-말단, 또는 Cas 단백질 내의 내부에 위치할 수 있다.

일 예로서, Cas 단백질은 세포하 국부화를 제공하는 하나 이상의 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이러한 이종 폴리펩티드는 예를 들어, 핵으로 표적화하기 위한 단분 SV40 NLS 및/또는 이분 알파-임포틴 NLS와 같은 하나 이상의 핵 국부화 신호(NLS), 미토콘드리아로 표적화하기 위한 미토콘드리아 국부화 신호, ER 체류 신호 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, Lange 등 (2007) J. Biol. Chem. 282(8):5101-5105를 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 세포하 국부화 신호는 N-말단, C-말단, 또는 Cas 단백질 내의 어디든 위치할 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 스트레치를 포함할 수 있고, 단분 서열 또는 이분 서열일 수 있다. 임의적으로, Cas 단백질은 N-말단에서 NLS(예를 들어, 알파-임포틴 NLS 또는 단분 NLS) 및 C-말단에서 NLS(예를 들어, SV40 NLS 또는 이분 NLS)를 포함하여, 2개 이상의 NLS를 포함할 수 있다. Cas 단백질은 또한 N-말단에서 2개 이상의 NLS 및/또는 C-말단에서 2개 이상의 NLS를 포함할 수 있다.

Cas 단백질은 또한 세포-투과 도메인 또는 단백질 형질도입 도메인에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포-투과 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스의 TLM 세포-투과 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 포진 바이러스의 세포 투과 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, WO 2014/089290 및 WO 2013/176772를 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 세포-투과 도메인은 N-말단, C-말단, 또는 Cas 단백질 내의 어디든 위치할 수 있다.

Cas 단백질은 또한 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그와 같은 추적 또는 정제의 용이성을 위해 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, 단량체성 Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질(예를 들어, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질(예를 들어, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-탠덤, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 주황색 형광 단백질(예를 들어, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체성 Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 태그의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신(TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌(HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘(His), 비오틴 카복실 운반 단백질(BCCP), 및 칼모듈린을 포함한다.

Cas 단백질은 또한 표지된 핵산으로 테더링될 수 있다. 이러한 테더링(즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 달성될 수 있고, 테더링은 직접적일 수 있거나(예를 들어, 단백질 상의 시스테인 또는 리신 잔기의 변형 또는 인테인 변형을 통해 달성될 수 있는 직접 융합 또는 화학적 접합을 통해), 또는 스트렙타비딘 또는 압타머와 같은 하나 이상의 개재 링커 또는 어댑터 분자를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, Pierce 등 (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55; Duckworth 등 (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822; Schaeffer 및 Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332; Goodman 등 (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557; 및 Khatwani 등 (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539를 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 단백질-핵산 접합체를 합성하기 위한 비공유 전략은 비오틴-스트렙타비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 포함한다. 공유 단백질-핵산 접합체는 매우 다양한 화학물을 사용하여 적절하게 기능화된 핵산 및 단백질을 연결함으로써 합성될 수 있다. 이러한 화학물 중 일부는 올리고뉴클레오티드를 단백질 표면 상의 아미노산 잔기(예를 들어, 리신 아민 또는 시스테인 티올)에 직접 부착하는 것을 수반하는 반면, 다른 더 복잡한 체계는 단백질의 번역후 변형 또는 촉매 또는 반응성 단백질 도메인의 관여를 필요로 한다. 단백질을 핵산에 공유 부착하는 방법은 예를 들어, 단백질 리신 또는 시스테인 잔기에 올리고뉴클레오티드의 화학적 가교, 발현된 단백질-결찰, 화학효소 방법, 및 광압타머의 사용을 포함할 수 있다. 표지된 핵산은 C-말단, N-말단, 또는 Cas 단백질 내의 내부 영역으로 테더링될 수 있다. 일 예에서, 표지된 핵산은 Cas 단백질의 C-말단 또는 N-말단으로 테더링된다. 마찬가지로, Cas 단백질은 5' 단부, 3' 단부, 또는 표지된 핵산 내의 내부 영역으로 테더링될 수 있다. 즉, 표지된 핵산은 임의의 방향 및 극성으로 테더링될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 표지된 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부로 테더링될 수 있다.

Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 gRNA와 복합체화된 Cas 단백질과 같은 단백질 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA와 같은, Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다. 임의적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. Cas 단백질을 암호화하는 핵산이 세포 내에 도입될 때, Cas 단백질은 세포에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.

mRNA로서 제공되는 Cas 단백질은 개선된 안정성 및/또는 면역원성 특성을 위해 변형될 수 있다. 변형은 mRNA 내의 하나 이상의 뉴클레오시드에 이루어질 수 있다. mRNA 핵염기에 대한 화학적 변형의 예는 슈도우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 및 5-메틸-시티딘을 포함한다. 예를 들어, N1-메틸 슈도우리딘을 함유하는 캡핑 및 폴리아데닐화 Cas mRNA가 사용될 수 있다. 마찬가지로, Cas mRNA는 동의어 코돈을 사용하여 우리딘의 고갈에 의해 변형될 수 있다.

Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에서 안정하게 통합되고 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 작제물에서 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 작제물은 유전자 또는 다른 관심 핵산 서열(예를 들어, Cas 유전자)의 발현을 지시할 수 있고 표적 세포에 이러한 관심 핵산 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터에 있을 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터와 별개인 벡터 또는 플라스미드에 있을 수 있다. 발현 작제물에 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, 진핵생물 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유동물 세포, 비-인간 포유동물 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 만능 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기 세포, 발달적으로 제한된 전구체 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포, 또는 단세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 임의적으로, 프로모터는 한 방향으로 Cas 단백질 및 다른 방향으로 가이드 RNA 둘 다의 발현을 구동하는 양방향성 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 원위 서열 요소(DSE), 근위 서열 요소(PSE), 및 TATA 박스의 3가지 외부 제어 요소를 함유하는 완전한 통상적인 단방향성 Pol III 프로모터; 및 (2) 역 방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 PSE 및 TATA 박스를 포함하는 제2 기본 Pol III 프로모터로 이루어질 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 U6 프로모터로부터 유래된 PSE 및 TATA 박스를 첨부함으로써 역 방향으로의 전사가 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향으로 만들 수 있다. 예를 들어, US 2016/0074535를 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. Cas 단백질 및 가이드 RNA를 암호화하는 유전자를 동시에 발현하기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 전달을 용이하게 하는 소형 발현 카세트의 생성을 허용한다.

B. 가이드 RNA

가이드 RNA는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)에 결합하고 Cas 단백질을 표적 DNA 내의 특정 위치에 표적하는 RNA 분자이다. 예시적인 2-분자 gRNA는 crRNA-유사("CRISPR RNA" 또는 "표적인자-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사("트랜스-작용 CRISPR RNA" 또는 "활성인자-RNA" 또는 "tracrRNA") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 분절(단일-가닥) 및 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 이중체의 한쪽 절반을 형성하는 뉴클레오티드의 스트레치를 둘 다 포함한다. DNA-표적화 분절의 하류(3')에 위치한 crRNA 꼬리의 예는 GUUUUAGAGCUAUGCU (서열번호: 1)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 서열번호: 2의 5' 단부에 연결되어 crRNA를 형성할 수 있다.

상응하는 tracrRNA(활성인자-RNA)는 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 이중체의 다른쪽 절반을 형성하는 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. crRNA의 뉴클레오티드의 스트레치는 tracrRNA의 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적이고 이와 혼성화하여 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 이중체를 형성한다. 이와 같이, 각 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 갖는다고 할 수 있다. tracrRNA 서열의 예는 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (서열번호: 3), AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (서열번호: 4), 또는 GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열번호: 5) 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.

crRNA 및 tracrRNA가 둘 다 필요한 시스템에서, crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 혼성화하여 gRNA를 형성한다. crRNA만이 필요한 시스템에서, crRNA는 gRNA일 수 있다. crRNA는 추가적으로 표적 DNA의 상보적 가닥에 혼성화하는 단일-가닥 DNA-표적화 분절을 제공한다. 세포 내에서 변형을 위해 사용되는 경우, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열은 RNA 분자가 사용될 종에 특이적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, Mali 등 (2013) Science 339(6121):823-826; Jinek 등 (2012) Science 337(6096):816-821; Hwang 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):227-229; Jiang 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):233-239; 및 Cong 등 (2013) Science 339(6121):819-823을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

주어진 gRNA의 DNA-표적화 분절(crRNA)은 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 표적 DNA의 상보적 가닥 상의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 분절은 혼성화(즉, 염기 쌍형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 이와 같이, DNA-표적화 분절의 뉴클레오티드 서열은 달라지고 gRNA 및 표적 DNA가 상호작용할 표적 DNA 내에서 위치를 결정할 수 있다. 대상체 gRNA의 DNA-표적화 분절은 표적 DNA 내의 임의의 원하는 서열에 혼성화하도록 변형될 수 있다. 자연 발생 crRNA는 CRISPR/Cas 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만 종종 21 내지 46개 뉴클레오티드 길이의 2개의 직접 반복부(DR)에 의해 플랭킹된, 21 내지 72개 뉴클레오티드 길이의 표적화 분절을 함유한다(예를 들어, WO 2014/131833을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 에스. 피오게네스의 경우, DR은 36개 뉴클레오티드 길이이고 표적화 분절은 30개 뉴클레오티드 길이이다. 3'에 위치한 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보적이고 이와 혼성화하며, 차례로 Cas 단백질에 결합한다.

DNA-표적화 분절은 예를 들어, 적어도 약 12, 15, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 이러한 DNA-표적화 분절은 예를 들어, 약 12 내지 약 100개, 약 12 내지 약 80개, 약 12 내지 약 50개, 약 12 내지 약 40개, 약 12 내지 약 30개, 약 12 내지 약 25개, 또는 약 12 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, DNA 표적화 분절은 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드(예를 들어, 약 17 내지 약 20개 뉴클레오티드, 또는 약 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드)일 수 있다. 예를 들어, US 2016/0024523을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 16 내지 20개 뉴클레오티드 길이 또는 17 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다. 에스. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 21 내지 23개 뉴클레오티드 길이이다. Cpf1의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 적어도 16개 뉴클레오티드 길이 또는 적어도 18개 뉴클레오티드 길이이다.

TracrRNA는 임의의 형태(예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이의 것일 수 있다. 이들은 1차 전사체 또는 처리된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA(단일-가이드 RNA의 일부로서 또는 2-분자 gRNA의 일부와 같은 별개의 분자로서)는 야생형 tracrRNA 서열의 전부 또는 일부(예를 들어, 야생형 tracrRNA 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개, 또는 그 이상, 또는 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 초과의 뉴클레오티드)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 에스. 피오게네스로부터의 야생형 tracrRNA 서열의 예는 171-뉴클레오티드, 89-뉴클레오티드, 75-뉴클레오티드, 및 65-뉴클레오티드 버전을 포함한다. 예를 들어, Deltcheva 등 (2011) Nature 471(7340):602-607; WO 2014/093661을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 단일-가이드 RNA(sgRNA) 내의 tracrRNA의 예는 sgRNA의 +48, +54, +67, 및 +85 버전 내에서 발견되는 tracrRNA 분절을 포함하며, 여기서 "+n"은 야생형 tracrRNA의 최대 +n 뉴클레오티드가 sgRNA에 포함됨을 나타낸다. US 8,697,359를 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다. DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 약 20개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 적어도 60%일 수 있다. 예로서, DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보적 가닥의 5' 단부에서 14개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 100%일 수 있고 나머지에 걸쳐 0%만큼 낮을 수 있다. 이러한 경우에, DNA-표적화 분절은 14개 뉴클레오티드 길이인 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 예로서, DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보적 가닥의 5' 단부에서 7개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 100%일 수 있고 나머지에 걸쳐 0%만큼 낮을 수 있다. 이러한 경우에, DNA-표적화 분절은 7개 뉴클레오티드 길이인 것으로 간주될 수 있다. 일부 가이드 RNA에서, DNA-표적화 분절 내의 적어도 17개 뉴클레오티드는 표적 DNA의 상보적 가닥에 상보적이다. 예를 들어, DNA-표적화 분절은 20개 뉴클레오티드 길이일 수 있고 표적 DNA의 상보적 가닥과 1, 2, 또는 3개의 불일치를 포함할 수 있다. 일 예에서, 불일치는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열(즉, PAM 서열의 역보체)에 상응하는 상보적 가닥의 영역에 인접하지 않다(예를 들어, 불일치는 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절의 5' 단부에 있거나, 또는 불일치는 PAM 서열에 상응하는 상보적 가닥의 영역으로부터 떨어진 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개 염기 쌍이다).

gRNA의 단백질-결합 분절은 서로 상보적인 뉴클레오티드의 2개 스트레치를 포함할 수 있다. 단백질-결합 분절의 상보적 뉴클레오티드는 혼성화하여 이중-가닥 RNA 이중체(dsRNA)를 형성한다. 대상 gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 결합된 Cas 단백질을 DNA-표적화 분절을 통해 표적 DNA 내의 특정 뉴클레오티드 서열로 지시한다.

단일-가이드 RNA는 DNA-표적화 분절 및 스캐폴드 서열(즉, 가이드 RNA의 단백질-결합 또는 Cas-결합 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 가이드 RNA는 3' 스캐폴드 서열에 연결된 5' DNA-표적화 분절을 가질 수 있다. 예시적인 스캐폴드 서열은 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (버전 1; 서열번호: 6); GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 2; 서열번호: 7); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 3; 서열번호: 8); 및 GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 4; 서열번호: 9); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (버전 5; 서열번호: 10); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (버전 6; 서열번호: 11); 또는 GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (버전 7; 서열번호: 12)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 본원에 개시된 임의의 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 가이드 RNA는 예를 들어, 가이드 RNA의 3' 단부 상의 임의의 예시적인 가이드 RNA 스캐폴드 서열에 융합된 가이드 RNA의 5' 단부 상의 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 즉, 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 상기 스캐폴드 서열 중 임의의 하나의 5' 단부에 연결되어 단일 가이드 RNA(키메라 가이드 RNA)를 형성할 수 있다.

가이드 RNA는 추가의 바람직한 특징(예를 들어, 변형되거나 조절된 안정성; 세포하 표적화; 형광 표지로 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 예를 들어, 5' 캡(cap)(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화 꼬리(즉, 3' 폴리(A) 꼬리); 리보스위치 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 허용하기 위함); 안정성 제어 서열; dsRNA 이중체(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열; RNA를 세포하 위치(예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 엽록체 등)로 표적하는 변형 또는 서열; 추적을 제공하는 변형 또는 서열(예를 들어, 형광 분자에 직접 접합, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 접합, 형광 검출을 허용하는 서열 등); 단백질(예를 들어, 전사 활성인자, 전사 억제인자, DNA 메틸트랜스퍼라제, DNA 데메틸라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제 등을 포함하는, DNA 상에서 작용하는 단백질)에 대한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열; 및 이의 조합을 포함한다. 변형의 다른 예는 조작된 줄기 루프 이중체 구조, 조작된 벌지(bulge) 영역, 줄기 루프 이중체 구조의 조작된 헤어핀 3', 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, US 2015/0376586을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 벌지는 crRNA-유사 영역 및 최소 tracrRNA-유사 영역으로 구성된 이중체 내에서 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않는 영역일 수 있다. 벌지는 이중체의 한 면에 쌍을 이루지 않는 5'-XXXY-3'을 포함할 수 있으며 여기서 X는 임의의 퓨린이고 Y는 반대 가닥 상의 뉴클레오티드와 워블 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드일 수 있고, 이중체의 다른 면에 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다.

일부 경우에, MS2-p65-HSF1과 쌍을 이루는 dCas9-VP64 융합 단백질을 포함하는 전사 활성화 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서 가이드 RNA는 이량체화된 MS2 박테리오파지 코트 단백질에 결합하도록 설계된 sgRNA 테트라루프 및 줄기-루프 2에 첨부된 압타머 서열로 설계될 수 있다. 예를 들어, Konermann 등 (2015) Nature 517(7536):583-588을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

변형되지 않은 핵산은 분해하기 쉬울 수 있다. 외인성 핵산은 또한 타고난 면역 반응을 유도할 수 있다. 변형은 안정성을 도입하고 면역원성을 줄이는 것을 도울 수 있다. 가이드 RNA는 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함하는 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다: (1) 포스포디에스테르 백본 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경 또는 대체; (2) 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경 또는 교체와 같은 리보스 당의 구성성분의 변경 또는 대체; (3) 포스페이트 모이어티를 데포스포 링커로 대체; (4) 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체; (5) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형; (6) 올리고뉴클레오티드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형(예를 들어, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형, 또는 대체 또는 모이어티의 접합); 및 (7) 당의 변형. 다른 가능한 가이드 RNA 변형은 우라실 또는 폴리-우라실 트랙으로의 변형 또는 대체를 포함한다. 예를 들어, WO 2015/048577 및 US 2016/0237455를 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 유사한 변형이 Cas mRNA와 같은 Cas-암호화 핵산에 이루어질 수 있다.

일 예로서, 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 있는 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다(예를 들어, 염기는 포스포로티오에이트 기인 변형된 포스페이트 기를 가질 수 있다). 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에서 2, 3, 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부(예를 들어, 5' 단부)에서 2, 3, 또는 4개의 말단 뉴클레오티드에 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 2017/173054 A1 및 Finn 등 (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235를 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자(별개의 crRNA 및 tracrRNA)로서 또는 1개의 분자(sgRNA)로서 RNA의 형태, 및 임의적으로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 gRNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자(sgRNA) 또는 별개의 RNA 분자(예를 들어, 별개의 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다. 후자의 경우, gRNA를 암호화하는 DNA는 1개의 DNA 분자로서 또는 각각 crRNA 및 tracrRNA를 암호화하는 별개의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.

gRNA가 DNA의 형태로 제공되는 경우, gRNA는 세포에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈 내에 안정하게 통합되고 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 작제물에서 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 암호화하는 DNA는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산과 같은, 이종 핵산을 포함하는 벡터에 있을 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터와 별개인 벡터 또는 플라스미드에 있을 수 있다. 이러한 발현 작제물에서 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, 진핵생물 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유동물 세포, 비-인간 포유동물 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 만능 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기 세포, 발달적으로 제한된 전구체 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포, 또는 단세포 단계 배아 중 하나 이상에 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 또한 예를 들어, 양방향성 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터의 구체적 예는 인간 U6 프로모터, 래트 U6 폴리머라제 III 프로모터, 또는 마우스 U6 폴리머라제 III 프로모터와 같은 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 포함한다.

대안적으로, gRNA는 다양한 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, WO 2014/089290 및 WO 2014/065596을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 가이드 RNA는 또한 화학적 합성에 의해 제조된 합성적으로 생산된 분자일 수 있다.

가이드 RNA(또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)는 하나 이상의 가이드 RNA(예를 들어, 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 가이드 RNA) 및 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는 담체(예를 들어, 분해 산물이 개시 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 미만과 같은 임계치 미만을 유지하는 동안 주어진 저장 조건(예를 들어, -20℃, 4℃, 또는 주변 온도) 하에 기간 연장; 또는 생체내에서 안정성 증가)를 포함하는 조성물에 있을 수 있다. 이러한 담체의 비-제한적인 예는 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락트-코글리콜-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 미셸, 역 미셸, 지질 코킬레이트(cochleate), 및 지질 미세관을 포함한다. 이러한 조성물은 Cas9 단백질과 같은 Cas 단백질, 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.

C. 가이드 RNA 표적 서열

가이드 RNA에 대한 표적 DNA는 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합할 DNA에 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 세포에 정상적으로 존재하는 생리학적 조건을 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건(예를 들어, 무세포 시스템의 조건)은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, Harbor Laboratory Press 2001)를 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). gRNA에 상보적이고 이와 혼성화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보적 가닥"으로 명명될 수 있고, "상보적 가닥"에 상보적인(따라서 Cas 단백질 또는 gRNA에 상보적이지 않은) 표적 DNA의 가닥은 "비상보적 가닥" 또는 "주형 가닥"으로 명명될 수 있다.

표적 DNA는 가이드 RNA가 혼성화하는 상보적 가닥 상의 서열 및 비-상보적 가닥 상의 상응하는 서열(예를 들어, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접함)을 둘 다 포함한다. 가이드 RNA는 표적 DNA의 상보적 가닥에 대해 상보성을 갖도록 설계되며, 이때 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 가이드 RNA가 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 것으로 본원에서 언급되는 경우, 가이드 RNA가 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 역 보체인 표적 DNA의 상보적 가닥 서열에 혼성화한다는 것을 의미한다.

표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 세포의 핵 또는 세포질에 또는 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 세포의 소기관 내에 위치할 수 있다. 표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 임의의 핵산 서열일 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열은 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 서열)일 수 있거나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.

DNA-결합 단백질에 대한 표적 서열(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열)은 표적화된 유전자의 발현을 변경하는데 적합한 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자) 내의 어디든 있을 수 있다. 일 예로서, 표적 서열은 인핸서 또는 프로모터와 같은 조절 요소 내에 있을 수 있거나, 또는 조절 요소에 근접할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 자가포식 유전자(예를 들어, 표 1에 나열된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 2에 나열된 NF-κB 유전자)의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개 뉴클레오티드 내에 있을 수 있다.

Cas 단백질에 의한 표적 DNA의 부위-특이적 결합 및 절단은 (i) 가이드 RNA와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 염기-쌍형성 상보성 및 (ii) 표적 DNA의 비-상보적 가닥에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)라고 불리는 짧은 모티프 둘 다에 의해 결정된 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 가이드 RNA 표적 서열을 플랭킹할 수 있다. 임의적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 PAM에 의해 3' 단부 상에 플랭킹될 수 있다(예를 들어, Cas9의 경우). 대안적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 PAM에 의해 5' 단부 상에 플랭킹될 수 있다(예를 들어, Cpf1의 경우). 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열의 상류 또는 하류(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 내)에 있는 약 1 내지 약 10개 또는 약 2 내지 약 5개 염기 쌍(예를 들어, 3개 염기 쌍)일 수 있다. SpCas9의 경우, PAM 서열(즉, 비-상보적 가닥 상)은 5'-N₁GG-3'일 수 있으며, 여기서 N₁은 임의의 DNA 뉴클레오티드이고, 여기서 PAM은 표적 DNA의 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 바로 3'이다. 이와 같이, 상보적 가닥 상의 PAM에 상응하는 서열(즉, 역 보체)은 5'-CCN₂-3'일 것이며, 여기서 N₂는 임의의 DNA 뉴클레오티드이고 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절이 표적 DNA의 상보적 가닥 상에 혼성화하는 서열의 바로 5'이다. 일부 이러한 경우에, N₁ 및 N₂는 상보적일 수 있고 N₁- N₂ 염기 쌍은 임의의 염기 쌍일 수 있다(예를 들어, N₁=C 및 N₂=G; N₁=G 및 N₂=C; N₁=A 및 N₂=T; 또는 N₁=T, 및 N₂=A). 에스. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, PAM은 NNGRRT 또는 NNGRR일 수 있으며, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 씨. 제주니(C. jejuni)로부터의 Cas9의 경우, PAM은 예를 들어 NNNNACAC 또는 NNNNRYAC일 수 있으며, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 일부 경우(예를 들어, FnCpf1의 경우), PAM 서열은 5' 단부의 상류에 있을 수 있고 서열 5'-TTN-3'을 갖는다.

가이드 RNA 표적 서열의 예는 SpCas9 단백질에 의해 인식된 NGG 모티프 바로 앞의 20-뉴클레오티드 DNA 서열이다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 + PAM의 2가지 예는 GN₁₉NGG (서열번호: 13) 또는 N₂₀NGG (서열번호: 14)이다. 예를 들어, WO 2014/165825를 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 5' 단부에 있는 구아닌은 세포에서 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 용이하게 할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열 + PAM의 다른 예는 시험관내에서 T7 폴리머라제에 의한 효율적인 전사를 용이하게 하게 위해 5' 단부에 2개의 구아닌 뉴클레오티드(예를 들어, GGN₂₀NGG; 서열번호: 15)를 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 2014/065596을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 가이드 RNA 표적 서열 + PAM은 5' G 또는 GG 및 3' GG 또는 NGG를 포함하여, 4 내지 22개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 또한 다른 가이드 RNA 표적 서열 + PAM은 14 내지 20개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 예시적인 sgRNA 서열은 서열번호: 17-38, 40-41, 43, 48 및 50-55를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

표적 DNA에 혼성화된 CRISPR 복합체의 형성은 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 영역 내 또는 근처의 표적 DNA의 하나 또는 두 가닥(즉, 표적 DNA의 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 및 가이드 RNA가 혼성화하는 상보적 가닥 상의 역 보체)의 절단을 초래할 수 있다. 예를 들어, 절단 부위는 가이드 RNA 표적 서열 내에(예를 들어, PAM 서열과 관련하여 정의된 위치에) 있을 수 있다. "절단 부위"는 Cas 단백질이 단일-가닥 파괴 또는 이중-가닥 파괴를 생산하는 표적 DNA의 위치를 포함한다. 절단 부위는 하나의 가닥 상에만(예를 들어, 닉카제가 사용될 때) 또는 이중-가닥 DNA의 두 가닥 상에 있을 수 있다. 절단 부위는 두 가닥 상의 동일한 위치에 있을 수 있거나(뭉툭한 단부 생산; 예를 들어 Cas9)) 또는 각 가닥 상의 상이한 위치에 있을 수 있다(엇갈린 단부(즉, 돌출부) 생산; 예를 들어, Cpf1). 엇갈린 단부는 예를 들어, 2개의 Cas 단백질을 사용함으로써 생산될 수 있으며, 각각은 상이한 가닥 상의 상이한 절단 부위에 단일-가닥 파괴를 생산하여, 이중-가닥 파괴를 생산한다. 예를 들어, 제1 닉카제는 이중-가닥 DNA(dsDNA)의 제1 가닥 상에 단일-가닥 파괴를 생성할 수 있고, 제2 닉카제는 돌출된 서열이 생성되도록 dsDNA의 제2 가닥 상에 단일-가닥 파괴를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 제1 가닥 상의 닉카제의 가이드 RNA 표적 서열 또는 절단 부위는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 또는 1,000개 염기 쌍에 의해 제2 가닥 상의 닉카제의 가이드 RNA 표적 서열 또는 절단 부위로부터 분리된다.

추가의 유전자 변형제

일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제는 CRISPR/Cas 시스템 이외의 게놈 편집을 위한 제제이다. DNA의 결실은 표적 유전자를 녹아웃하거나 파괴하기 위해 유전자 요법을 사용하여 수행될 수 있다. 녹아웃은 유전자 녹다운(knock-down)일 수 있거나 또는 유전자는 레트로바이러스 유전자 전달을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 기술에 의한 점 돌연변이, 삽입, 결실, 프레임시프트, 또는 미스센스 돌연변이와 같은 돌연변이에 의해 녹아웃될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 본원에 개시된 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 자가포식 유전자와 같은 자가포식 유전자, 또는 본원에 개시된 NF-κB 유전자와 같은 NF-κB 유전자) 중 적어도 하나에 결합하고 변형시키는 데 효과적인 뉴클레아제(예를 들어, 아연-핑거 뉴클레아제 또는 TALEN)이다.

원하는 표적 서열 또는 원하는 표적 서열에 결합하는 임의의 DNA-결합 단백질에 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하는 임의의 뉴클레아제 제제는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 뉴클레아제 제제가 원하는 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하는 한 자연 발생 또는 천연 뉴클레아제 제제가 이용될 수 있다. 마찬가지로, DNA-결합 단백질이 원하는 표적 서열에 결합하는 한 자연 발생 또는 천연 DNA-결합 단백질이 이용될 수 있다. 대안적으로, 변형되거나 또는 조작된 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질이 이용될 수 있다. "조작된 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질"은 원하는 표적 서열을 특이적으로 인식하도록 천연 형태로부터 조작된(변형되거나 또는 유래된) 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질을 포함한다. 따라서, 조작된 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질은 천연, 자연 발생 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질로부터 유래될 수 있거나 또는 인공적으로 생성되거나 또는 합성될 수 있다. 조작된 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질은 표적 서열을 인식할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 표적 서열은 천연(조작되지 않거나 또는 변형되지 않은) 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질에 의해 인식된 서열이 아니다. 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질의 변형은 단백질 절단제에서 하나의 아미노산 또는 핵산 절단제에서 하나의 뉴클레오티드만큼 작을 수 있다. 표적 서열 또는 다른 DNA에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 생산하는 것은 표적 서열 또는 다른 DNA를 "자르"거나 또는 "절단"하는 것으로 지칭될 수 있다.

뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질(즉, 조작된 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질)의 활성 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 천연 뉴클레아제 제제 또는 DNA-결합 단백질에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 표적 서열에서 절단하는 능력을 보유하고 따라서 닉 또는 이중-가닥-파괴-유도 활성을 보유하거나 또는 원하는 표적 서열에 결합하는 능력을 보유한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 뉴클레아제 제제는 천연 엔도뉴클레아제 서열로부터 변형되고 천연 뉴클레아제 제제에 의해 인식되지 않은 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 인식하고 유도하도록 설계될 수 있다. 따라서, 일부 조작된 뉴클레아제는 상응하는 천연 뉴클레아제 제제 표적 서열과 상이한 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하는 특이성을 갖는다. 닉 또는 이중-가닥-파괴-유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고 일반적으로 표적 서열을 함유하는 DNA 기질 상의 엔도뉴클레아제의 전반적인 활성 및 특이성을 측정한다. 표적 서열은 세포에 대해 내인성(또는 천연)일 수 있거나 또는 표적 서열은 세포에 대해 외인성일 수 있다. 세포에 대해 외인성인 표적 서열은 세포의 게놈에서 자연 발생하지 않는다. 표적 서열은 또한 표적 유전자좌에 위치하기를 원하는 관심 폴리뉴클레오티드에 대해 외인성일 수 있다. 일부 경우에, 표적 서열은 숙주 세포의 게놈에서 한번만 존재한다.

예시된 표적 서열의 활성 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 주어진 표적 서열에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유하고 따라서 서열-특이적 방식으로 뉴클레아제 제제의 의해 인식되고 절단될 수 있다. 뉴클레아제 제제에 의한 표적 서열의 이중-가닥 파괴를 측정하는 검정은 알려져 있다(예를 들어, TAQMAN^® qPCR 검정, Frendewey 등 (2010) Methods in Enzymology 476:295-307, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).

표적 서열의 길이는 달라질 수 있고, 예를 들어, 아연 핑거 단백질 또는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 쌍에 대해 약 30-36 bp(즉, 각 ZFN에 대해 약 15-18 bp), 전사 활성인자-유사 효과기(TALE) 단백질 또는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)에 대해 약 36 bp, 또는 CRISPR/Cas9 가이드 RNA에 대해 약 20 bp인 표적 서열을 포함한다.

DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제의 표적 서열은 표적 게놈 유전자좌 내 또는 근처에 어디든 위치할 수 있다. 표적 서열은 유전자의 코딩 영역 내, 또는 유전자의 발현에 영향을 미치는 조절 영역 내에 위치할 수 있다. DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제의 표적 서열은 인트론, 엑손, 프로모터, 인핸서, 조절 영역, 또는 임의의 비-단백질 코딩 영역에 위치할 수 있다.

본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에 이용될 수 있는 DNA-결합 단백질의 한 가지 유형은 전사 활성인자-유사 효과기(TALE)이다. TALE는 예를 들어, 후생유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인에 융합되거나 또는 연결될 수 있다. 이러한 도메인의 예는 하기에 Cas 단백질과 관련하여 기재되고, 또한 예를 들어, WO 2011/145121에서 찾을 수 있으며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상응하게는, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에 이용될 수 있는 뉴클레아제 제제의 한 가지 유형은 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)이다. TAL 효과기 뉴클레아제는 원핵생물 또는 진핵생물 유기체의 게놈 내 특정 표적 서열에서 이중-가닥 파괴를 만드는 데 사용될 수 있는 서열-특이적 뉴클레아제 부류이다. TAL 효과기 뉴클레아제는 천연 또는 조작된 전사 활성인자-유사(TAL) 효과기, 또는 이의 기능적 부분을 FokI와 같은 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 융합함으로써 생성된다. 고유한 모듈식 TAL 효과기 DNA 결합 도메인은 잠재적으로 임의의 주어진 DNA 인식 특이성을 갖는 단백질의 설계를 허용한다. 따라서, TAL 효과기 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 특이적 DNA 표적 부위를 인식하도록 조작될 수 있고, 따라서 원하는 표적 서열에서 이중-가닥 파괴를 만드는 데 사용될 수 있다. WO 2010/079430; Morbitzer 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(50:21617-21622; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian 등 (2010) Genetics 186:757-761; Li 등 (2011) Nucleic Acids Res. 39(1):359-372; 및 Miller 등 (2011) Nature Biotechnology 29:143-148을 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

FokI 엔도뉴클레아제의 단부로부터의 비-특이적 DNA 절단 도메인은 효모 검정에서 활성인 하이브리드 뉴클레아제를 구축하는 데 사용될 수 있다. 이들 시약은 또한 식물 세포 및 동물 세포에서 활성이다. FokI 도메인은 이량체로서 기능하며, 적절한 방향 및 간격을 갖는 표적 게놈에서 부위에 대한 고유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 작제물을 필요로 한다. TALEN DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수는 둘 다 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 매개변수이다. TALEN DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수는 복수의 TAL 효과기 반복 서열과 FokI 엔도뉴클레아제 도메인 사이의 스페이서(스페이서 서열과 구별됨)의 도입에 의해 변형될 수 있다. 스페이서 서열은 12 내지 30개 뉴클레오티드일 수 있다.

TALEN 결합 도메인의 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 관계는 설계가능한 단백질을 허용한다. 이 경우 인공 유전자 합성이 TALE 결합 도메인에서 발견된 반복적인 서열의 부적절한 어닐링으로 인해 문제가 된다. 이에 대한 한 가지 해결책은 올리고뉴클레오티드 어셈블리 후 전체 유전자 증폭의 2-단계 PCR에서 조립에 적합한 올리고뉴클레오티드를 계산하기 위해 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램(DNAWorks)을 사용하는 것이다. 조작된 TALE 작제물을 생성하기 위한 다수의 모듈식 조립 체계가 또한 보고되었다. 두 방법은 아연 핑거 DNA 인식 도메인을 생성하기 위한 모듈식 조립 방법과 개념적으로 유사한 DNA 결합 도메인을 조작하는 체계적인 접근법을 제공한다.

일단 TALEN 유전자가 조립되면 그들은 플라스미드에 삽입되고; 이어서 플라스미드는 유전자 산물이 발현되고 게놈에 접근하기 위해 핵으로 들어가는 표적 세포를 형질감염시키는 데 사용된다. TALEN은 이중-가닥 파괴(DSB)를 유도하여, 세포를 복구 메커니즘에 반응시킴으로써 게놈을 편집하는 데 사용될 수 있다.

적합한 TAL 뉴클레아제의 예, 및 적합한 TAL 뉴클레아제를 제조하는 방법은 예를 들어, US 2011/0239315 A1, US 2011/0269234 A1, US 2011/0145940 A1, US 2003/0232410 A1, US 2005/0208489 A1, US 2005/0026157 A1, US 2005/0064474 A1, US 2006/0188987 A1, 및 US 2006/0063231 A1에 개시되어 있으며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다양한 구현예에서, TAL 효과기 뉴클레아제는 예를 들어, 관심 게놈 유전자좌에서 표적 핵산 서열 내 또는 근처를 절단하도록 조작되며, 여기서 표적 핵산 서열은 변형될 서열에 또는 근처에 있다.

일부 TALEN에서, TALEN의 각 단량체는 2개의 초가변 잔기를 통해 단일 염기 쌍을 인식하는 33-35개의 TAL 반복부를 포함한다. 일부 TALEN에서, 뉴클레아제 제제는 FokI 엔도뉴클레아제와 같은 독립적 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 TAL-반복부-기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 제1 TAL-반복부-기반 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL-반복부-기반 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 TAL-반복부-기반 DNA 결합 도메인은 각각 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제1 및 제2 TAL-반복부-기반 DNA 결합 도메인은 다양한 길이(12-20 bp)의 스페이서 서열에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하고, 여기서 FokI 뉴클레아제 서브유닛은 이량체화되어 표적 서열에서 이중 가닥 파괴를 만드는 활성 뉴클레아제를 생성한다.

전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. 이들 시약은 효율적이고, 프로그램가능하고, 특이적인 DNA 절단이 가능하고 제자리에서 게놈 편집을 위한 강력한 도구를 나타낸다. 전사 활성인자-유사 효과기(TALE)는 사실상 임의의 DNA 서열에 결합하도록 신속하게 조작될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 TALEN은 광범위하고 또 다른 TALEN으로부터의 도움 없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체성 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작동하도록 조작된 한 쌍의 TALEN의 하나 또는 두 구성원을 지칭하는 데 사용된다. 함께 작동하는 TALEN은 DNA의 손잡이(handedness)를 참조하여 왼쪽-TALEN 및 오른쪽-TALEN으로서 지칭될 수 있다. 미국 일련 번호 12/965,590; 미국 일련 번호 13/426,991(미국 특허 번호 8,450,471); 미국 일련 번호 13/427,040(미국 특허 번호 8,440,431); 미국 일련 번호 13/427,137(미국 특허 번호 8,440,432); 및 미국 일련 번호 13/738,381을 참조하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

DNA-결합 단백질의 또 다른 예는 아연 핑거 단백질이다. 이러한 아연 핑거 단백질은 예를 들어, 후생유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 이러한 도메인의 예는 하기에 Cas 단백질과 관련하여 기재되고, 또한 예를 들어, WO 2011/145121에서 찾을 수 있으며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상응하게는, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에 이용될 수 있는 뉴클레아제 제제의 또 다른 예는 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. 일부 ZFN에서, ZFN의 각 단량체는 3개 이상의 아연 핑거-기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각 아연 핑거-기반 DNA 결합 도메인은 3 bp 하위부위에 결합한다. 다른 ZFN에서, ZFN은 FokI 엔도뉴클레아제와 같은 독립적 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 아연 핑거-기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 ZFN 및 제2 ZFN은 각각 FokI 뉴클레아제 서브유닛에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제1 및 제2 ZFN은 약 5-7 bp 스페이서에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하고, 여기서 FokI 뉴클레아제 서브유닛은 이량체화되어 이중 가닥 파괴를 만드를 활성 뉴클레아제를 생성한다. 예를 들어, US 2006/0246567; US 2008/0182332; US 2002/0081614; US 2003/0021776; WO 2002/057308 A2; US 2013/0123484; US 2010/0291048; WO 2011/017293 A2; 및 Gaj 등 (2013) Trends in Biotechnology 31(7):397-405를 참조하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

간섭 핵산 제제

특정 구현예에서, 자가포식 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나열된 유전자)의 생성물(예를 들어, mRNA 생성물)의 활성 또는 발현을 선택적으로 표적하고 억제하는 간섭 핵산 분자가 본원에 제공되고/되거나 본원에 기재된 방법에 사용된다. 일부 구현예에서, 간섭 핵산은 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 적어도 하나의 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나열된 유전자)의 생성물을 발현하는 세포에서 세포독성을 유도한다. 제제는 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 적어도 하나의 NF-κB 유전자 산물(예를 들어, mRNA 생성물)의 발현 또는 활성을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 억제할 수 있다. 본원에 개시된 제제는 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 적어도 하나의 NF-κB 유전자 산물(예를 들어, mRNA 생성물)에 대해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 상보성을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 억제 핵산은 siRNA, shRNA, PNA, 또는 miRNA 분자이다. 간섭 핵산은 일반적으로 사이클릭 서브유닛의 서열을 포함하며, 각각은 염기쌍 모이어티가 왓슨-크릭 염기 쌍형성에 의해 핵산(전형적으로 RNA)에서 표적 서열에 혼성화하여, 표적 서열 내에 핵산:올리고머 이종이중체를 형성하게 하는 서브유닛간 연결에 의해 연결된 염기쌍 모이어티를 보유한다. 간섭 RNA 분자는 안티센스 분자, siRNA 분자, 단일-가닥 siRNA 분자, miRNA 분자 및 shRNA 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

전형적으로 표적 mRNA 서열의 보체의 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 뉴클레오티드가 표적 전사체의 억제를 매개하는 데 충분하다. 완벽한 상보성은 필요하지 않다. 일부 구현예에서, 간섭 핵산 분자는 이중-가닥 RNA이다. 이중-가닥 RNA 분자는 2개의 뉴클레오티드 3' 돌출부를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 RNA 가닥은 헤어핀 구조를 통해 연결되어, shRNA 분자를 형성한다. shRNA 분자는 마이크로RNA 분자로부터 유래된 헤어핀을 함유할 수 있다. 예를 들어, RNAi 벡터는 간섭 RNA 서열을 miR30 miRNA의 헤어핀을 함유하는 pCAG-miR30 작제물로 클로닝함으로써 구축될 수 있다. RNA 간섭 분자는 DNA 잔기, 뿐만 아니라 RNA 잔기를 포함할 수 있다.

본원에 제공된 간섭 핵산 분자는 RNA 염기, 비-RNA 염기 또는 RNA 염기 및 비-RNA 염기의 혼합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 간섭 핵산 분자는 주로 RNA 염기로 구성될 뿐만 아니라 DNA 염기 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

간섭 핵산은 다양한 올리고뉴클레오티드 화학물을 이용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 화학물의 예는 펩티드 핵산(PNA), 연결된 핵산(LNA), 포스포로티오에이트, 2'O-Me-변형된 올리고뉴클레오티드, 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 포함하는 모르폴리노 화학물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, PNA 및 LNA 화학물은 2'O-Me 올리고뉴클레오티드에 비해 상대적으로 높은 표적 결합 강도로 인해 더 ‹T은 표적화 서열을 활용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 2'O-Me-변형된 화학물은 종종 조합되어 포스포로티오에이트 백본을 갖는 2'O-Me-변형된 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO/2013/112053 및 WO/2009/008725를 참조하며, 그 전문이 참조로 포함된다.

펩티드 핵산(PNA)은 백본이 데옥시리보스 백본과 구조적으로 이체동형인 DNA의 유사체이며, 피리미딘 또는 퓨린 염기가 부착된 N-(2-아미노에틸) 글리신 유닛으로 이루어진다. 천연 피리미딘 및 퓨린 염기를 함유하는 PNA는 왓슨-크릭 염기쌍 규칙을 준수하는 상보적 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고, 염기쌍 인식의 측면에서 DNA를 모방한다(Egholm, Buchardt 등 1993). PNA의 백본은 포스포디에스테르 결합보다 펩티드 결합에 의해 형성되어, 안티센스 적용에 적절하게 만든다(하기 구조 참조). 백본은 하전되지 않아서, 정상적인 열 안정성보다 더 크게 나타나는 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중체를 초래한다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 인식되지 않는다.

천연 구조에 대한 라디칼 구조적 변화에도 불구하고, PNA는 DNA 또는 RNA에 나선 형태로 서열-특이적 결합이 가능하다. PNA의 특징은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 높은 결합 친화도, 단일-염기 불일치에 의해 야기된 불안정화 효과, 뉴클레아제 및 프로테아제에 대한 내성, 염 농도와 관계 없이 DNA 또는 RNA와 혼성화 및 호모퓨린 DNA와 삼중체 형성을 포함한다. PANAGENE.TM.은 전매 특허 Bts PNA 단량체(Bts; 벤조티아졸-2-설포닐 기) 및 전매 특허 올리고머화 공정을 개발하였다. Bts PNA 단량체를 사용한 PNA 올리고머화는 탈보호, 커플링 및 캡핑의 반복 주기로 구성된다. PNA는 당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여 합성적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,969,766, 7,211,668, 7,022,851, 7,125,994, 7,145,006 및 7,179,896을 참조한다. 또한 PNA의 제조에 대해 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 참조한다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen 등, Science, 254:1497-1500, 1991에서 찾을 수 있다. 전술한 가각은 그 전문이 참조로 포함된다.

간섭 핵산은 또한 "잠금 핵산" 서브유닛(LNA)을 함유할 수 있다. "LNA"는 가교 핵산(BNA)이라고 명명되는 변형 클래스의 구성원이다. BNA는 C30-엔도(노던) 당 푸커(pucker)에서 리보스 고리의 형태를 잠그는 공유 연결을 특징으로 한다. LNA의 경우, 가교는 2'-O와 4'-C 위치 사이에 메틸렌으로 구성된다. LNA는 백본 선조직화(preorganization) 및 염기 적층을 향상시켜 혼성화 및 열 안정성을 증가시킨다.

LNA의 구조는 예를 들어, Wengel, 등, Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54:3607, 및 Accounts of Chem. Research (1999) 32:301); Obika, 등, Tetrahedron Letters (1997) 38:8735; (1998) 39:5401, 및 Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230에서 찾을 수 있다. 본원에 제공된 화합물은 하나 이상의 LNA를 혼입할 수 있으며; 일부 경우에, 화합물은 완전히 LNA로 구성될 수 있다. 개별 LNA 뉴클레오시드 서브유닛의 합성 및 올리고뉴클레오티드로의 혼입 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 7,572,582, 7,569,575, 7,084,125, 7,060,809, 7,053,207, 7,034,133, 6,794,499, 및 6,670,461에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 전형적인 서브유닛간 링커는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 모이어티를 포함하며; 대안적으로, 비-인 함유 링커가 이용될 수 있다. 일 구현예는 각 LNA 서브유닛이 DNA 서브유닛에 의해 분리된 LNA 함유 화합물이다. 특정 화합물은 LNA 및 DNA 서브유닛이 교대로 구성되어 있으며 이때 서브유닛간 링커는 포스포로티오에이트이다.

"포스포로티오에이트"(또는 S-올리고)는 비가교 산소 중 하나가 황으로 대체된 정상 DNA의 변이체이다. 뉴클레오티드간 결합의 황화는 5'에서 3'으로 및 3'에서 5'으로 DNA POL 1 엑소뉴클레아제, 뉴클레아제 S1 및 P1, RNase, 혈청 뉴클레아제 및 뱀독 포스포디에스테라제를 포함하는 엔도- 및 엑소뉴클레아제의 작용을 감소시킨다. 포스포로티오에이트는 다음과 같은 2가지 주요 경로에 의해 제조된다: 수소 포스페이트 상의 이황화탄소 중 원소 황 용액의 작용, 또는 테트라에틸티우람 디설파이드(TETD) 또는 3H-1, 2-벤조디티올-3-온 1, 1-디옥사이드(BDTD)로 포스파이트 트리에스테르를 황화시키는 방법(예를 들어, Iyer 등, J. Org. Chem. 55, 4693-4699, 1990 참조). 후자의 방법은 대부분의 유기 용매에서 원소 황의 불용성 및 이황화탄소의 독성 문제를 피한다. TETD 및 BDTD 방법은 또한 더 높은 순도의 포스포로티오에이트를 산출한다.

"2'O-Me 올리고뉴클레오티드" 분자는 리보스 분자의 2'-OH 잔기에 메틸 기를 가지고 있다. 2'-O-Me-RNA는 DNA와 동일한(또는 유사한) 거동을 나타내지만, 뉴클레아제 분해로부터 보호된다. 2'-O-Me-RNA는 또한 추가 안정화를 위해 포스포티오에이트 올리고뉴클레오티드(PTO)와 조합될 수 있다. 2'O-Me 올리고뉴클레오티드(포스포디에스테르 또는 포스포티오에이트)는 당업계의 일상적인 기술에 따라 합성될 수 있다(예를 들어, Yoo 등, Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004 참조).

본원에 기재된 간섭 핵산은 세포와 접촉되거나 또는 유기체(예를 들어, 인간)에 투여될 수 있다. 대안적으로, 간섭 RNA 분자를 암호화하는 작제물 및/또는 벡터는 세포 또는 유기체와 접촉되거나 또는 이에 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 구현예에서, 벡터는 심장 조직에 대한 향성을 갖는다. 일부 구현예에서 벡터는 아데노-연관 바이러스이다.

일부 구현예에서, 간섭 핵산 분자는 siRNA 분자이다. 이러한 siRNA 분자는 표적 영역에 대해 충분히 상동성인 영역을 포함해야 하며, siRNA 분자가 표적 RNA를 하향 조절하도록 뉴클레오티드의 측면에서 충분한 길이의 것이어야 한다. 용어 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는, 변형된 RNA 또는 뉴클레오티드 대용물의 경우, 또한 하나 이상의 위치에서 변형된 뉴클레오티드, 또는 대용물 대체 모이어티를 지칭할 수 있다. siRNA 분자와 표적 사이에 완벽한 상보성이 있을 필요는 없지만, siRNA 분자가 표적 RNA의 RNAi 절단에 의해서와 같은, 서열-특이적 침묵을 지시하는 것을 가능하게 하도록 관련도가 충분해야 한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 분자의 전반적인 이중-가닥 특징을 유지하기 위해 안티센스 가닥과 충분히 상보적일 필요가 있다.

게다가, siRNA 분자는 변형되거나 또는 뉴클레오시드 대용물을 포함할 수 있다. siRNA 분자의 단일 가닥 영역은 변형되거나 또는 뉴클레오시드 대용물을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 헤어핀 구조의 쌍을 이루지 않는 영역 또는 영역들, 예를 들어, 2개의 상보적 영역을 연결하는 영역은 변형 또는 뉴클레오시드 대용물을 가질 수 있다. 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 대해 siRNA 분자의 하나 이상의 3'- 또는 5'-말단을 안정화하거나, 또는 안티센스 siRNA 제제가 RISC에 들어가는 것을 선호하는 변형이 또한 유용하다. 변형은 C3(또는 C6, C7, C12) 아미노 링커, 티올 링커, 카복실 링커, 비-뉴클레오티드 스페이서(C3, C6, C9, C12, 무염기성, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜), 포스포르아미데이트로서 제공되고 또 다른 DMT-보호된 하이드록실 기를 가지고 있어서, RNA 합성 동안 다중 커플링을 허용하는 특수 비오틴 또는 플루오레세인 시약을 포함할 수 있다.

shRNA의 비-제한적인 예는 센스 및 안티센스 영역이 핵산-기반 또는 비-핵산-기반 링커에 의해 연결된 단일-가닥 분자로부터 조립된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자; 및 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 2차 구조가 있는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 25개 뉴클레오티드, 약 2 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 4 내지 약 15개 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 12개 뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 루프 구조에 의해 연결된다.

shRNA와 관련한 추가의 구현예, 뿐만 아니라 이러한 shRNA를 설계하고 합성하는 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0071208에 기재되어 있으며, 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 본원에는 마이크로 RNA(miRNA)가 제공된다. miRNA는 유기체에서 자연적으로 생산된 작은 RNA의 큰 그룹을 나타내며, 이 중 일부는 표적 유전자의 발현을 조절한다. miRNA는 다이서(Dicer)에 의해 대략 70개 뉴클레오티드 단일-가닥 헤어핀 전구체 전사체로부터 형성된다. miRNA는 단백질로 번역되지 않지만, 대신 특정 메신저 RNA에 결합하여, 번역을 차단한다. 일부 경우에, miRNA는 번역을 억제하기 위해 그들의 표적과 부정확하게 염기쌍을 이룬다.

특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대해 100% 상보적일 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이에 형성된 이종이중체가 세포 뉴클레아제의 작용 및 생체내에서 발생할 수 있는 분해 모드를 견디기에 충분히 안정되는 한, 예를 들어, 질환-연관 돌연변이를 함유하는 대립유전자의 선택적 표적화를 개선하기 위해 불일치를 포함할 수 있다. 따라서, 특정 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이에, 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다. 뉴클레아제에 의한 절단에 덜 민감한 올리고뉴클레오티드 백본이 본원에서 논의된다. 불일치는, 존재하는 경우, 전형적으로 중간보다 하이브리드 이중체의 끝 영역을 향해 덜 불안정화한다. 허용되는 불일치의 수는 이중체 안정성의 잘 이해된 원칙에 따라, 올리고뉴클레오티드의 길이, 이중체에서 G:C 염기쌍의 백분율, 및 이중체에서 불일치(들)의 위치에 의존할 것이다.

간섭 핵산 분자는 예를 들어, 화학적 합성, 시험관내 전사, 또는 Rnase III 또는 다이서에 의한 긴 dsRNA의 소화에 의해 제조될 수 있다. 이들은 형질감염, 전기천공, 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 세포로 도입될 수 있다. 다음을 참조한다: Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251; Bernstein E 등, 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521; Hutvagner G 등, RNAi: Nature abhors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12: 225-232; Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, 및 Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M, 및 Taira K. (2002). U6- promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, 및 Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958; Paul CP, Good PD, Winer I, 및 Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, 및 Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, 및 Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052.

본 방법에서, 간섭 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 간섭 핵산은 예를 들어, 네이키드 핵산으로서, 전달 시약과 조합하여, 및/또는 간섭 핵산 분자를 발현하는 서열을 포함하는 핵산으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 간섭 핵산은 대상체의 종양에 직접 투여된다. 일부 구현예에서, 간섭 핵산 분자를 발현하는 서열을 포함하는 핵산은 벡터, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 및 박테리아 벡터 내에 전달된다. 당업계에 알려진 임의의 핵산 전달 방법은 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 적합한 전달 시약은 예를 들어, Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 폴리양이온(예를 들어, 폴리리신), 아텔로콜라겐, 나노플렉스 및 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 핵산 분자에 대한 전달 비히클로서 아텔로콜라겐의 사용은 Minakuchi 등 Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai 등 Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); 및 Kawata 등 Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)에 기재되어 있으며; 각각은 그 전문이 본원에 포함된다. 예시적인 간섭 핵산 전달 시스템은 미국 특허 번호 8,283,461, 8,313,772, 8,501,930. 8,426,554, 8,268,798 및 8,324,366에 제공되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 리포솜은 억제 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 전달하는 데 사용된다. 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 리포솜은 표준 소포체-형성 지질로부터 형성될 수 있으며, 이는 일반적으로 중성 또는 음으로 하전된 인지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함한다. 지질의 선택은 일반적으로 원하는 리포솜 크기 및 혈류 내 리포솜의 반감기와 같은 인자를 고려함으로써 가이드된다. 예를 들어, Szoka 등 (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; 및 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369에 기재된 바와 같은, 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법이 알려져 있으며, 이들의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

본 방법에 사용하기 위한 리포솜은 또한 단핵 대식세포 시스템("MMS") 및 세망내피계 시스템("RES")에 의한 제거를 피하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형된 리포솜은 표면 상에 옵소니화-억제 모이어티를 가지거나 또는 리포솜 구조에 혼입된다.

소분자 제제

본원에 개시된 방법 및 조성물의 특정 구현예는 소분자 제제 예를 들어, 암 세포에서 자가포식 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 NF-κB 유전자)의 생성물의 발현 또는 활성을 억제하는 소분자 제제의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 소분자는 자가포식 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 NF-κB 유전자)의 생성물을 발현하는 세포에서 세포독성을 유도한다. 이러한 제제는 당업계에 알려진 것들 및 본원에 기재된 스크리닝 검정을 사용하여 식별된 것들을 포함한다. 본원에 제공된 소분자는 자가포식 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 NF-κB 유전자)의 생성물에 대해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 특이성을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 제제는 소분자 자가포식 억제제 예컨대 PI3-키나제 억제제, 포스포이노시티드3-키나제(PI3) 억제제, Unc-51-유사 키나제 1(ULK1) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 18(Vps18) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 34(Vps34) 억제제, 유비퀴틴-특이적 펩티다제(USP10 또는 USP13) 억제제, 티오크산톤-기반 자가포식 억제제, ATG4 억제제, 오토피닙, 3-메틸아데닌, 보르트만닌, 염화암모늄, 바필로마이신 A1, 에플로르니틴, 류펩틴, 베툴린산, CA074, 콜히친, 타프시가진, 바쿠올린-1, 빈블라스틴, 데스메틸 클로미프라민, LY294002, PT210, GSK-2126458, 스파우틴-1, SAR405, 화합물 31, VPS34-IN1, PIK-III, 화합물 6, MRT68921, SBI-0206965, 펩스타틴 A, E64d, 클로미프라민, 루칸톤, 클로로퀸, 하이드록시클로르퀸, 모넨신, Lys05, ARN5187, 화합물 30, MPT0L145, ROC325, 베르테포르핀, NSC185058, 및 NSC377071일 수 있다. 추가의 자가포식 억제제 및 자가포식 억제제에 관한 세부사항은 Waleska K. Martins 및 Mauricio S. Baptista (November 10th 2016). Autophagy Modulation for Organelle- Targeting Therapy, Autophagy in Current Trends in Cellular Physiology and Pathology, Nikolai V. Gorbunov 및 Marion Schneider, IntechOpen, DOI: 10.5772/63976 (다음으로부터 이용가능:https://www.intechopen.com/books/autophagy-in-current-trends-in-cellular-physiology-and-pathology/autophagy-modulation-for-organelle-targeting-therapy); Pasquier, Benoit. "Autophagy inhibitors." Cellular and Molecular Life Sciences 73 (2015): 985-1001; 미국 특허 번호 8524762 및 9926326; 및 WIPO 공개 WO2011011522에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 제제는 NF-κB 경로의 억제제일 수 있다. 소분자 자가포식 억제제는 IKK 및 IκB 인산화 억제제, IκB 분해 억제제, 프로테아좀 및 프로테아제 억제제, IκBα 상향조절, NF-κB 핵 전좌, 및 NF-κB 발현 억제제, NF-κB DNA-결합 억제제, NF-κB 트랜스활성화 억제제, 산화방지제, 또는 상류 표적 억제제를 포함한다. NF-κB 억제제의 목록은 Gilmore, T., Herscovitch, M. " Inhibitors of NF-κB signaling: 785 and counting." Oncogene 25, 6887-6899 (2006)에서 찾을 수 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 개시된 방법에 유용한 제제는 천연 및/또는 합성 화합물의 체계적 라이브러리를 포함하는, 임의의 이용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 제제는 또한 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(펩티드의 기능을 갖지만, 효소 분해에 대한 내성에도 불구하고 생체활성을 유지하는 신규, 비-펩티드 백본을 갖는 분자의 라이브러리; 예를 들어, Zuckermann 등, 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85 참조); 공간적으로 다룰 수 있는 병렬 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법; '1-비드 1-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용한 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당업계에 알려진 조합 라이브러리 방법 중 임의의 수많은 접근법에 의해 수득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 제한되는 반면, 다른 4가지 접근법은 화합물의 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 소분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).

분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당업계, 예를 들어: DeWitt 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann 등 (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho 등 (1993) Science 261:1303; Carrell 등 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell 등 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop 등 (1994) J. Med. Chem. 37:1233d에서 찾을 수 있다.

제제의 라이브러리는 용액 중에(예를 들어, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), 또는 비드 상에(Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 및/또는 포자, (Ladner, USP 5,223,409), 플라스미드(Cull 등, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파지 상에(Scott 및 Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, 상기) 제시될 수 있다.

본원에 개시된 방법에 유용한 제제는 예를 들어, 후보 또는 테스트 제제 예를 들어, 자가포식 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 자가포식 유전자) 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 본원에 개시된 NF-κB 유전자)의 생성물의 활성 또는 발현을 감소시키는 제제를 스크리닝하기 위한 검정을 사용하여 식별될 수 있다.

제제 전달

본원에 개시된 핵산 및 단백질 제제(예를 들어, CRISPR/Cas 제제, TALEN 제제, ZFN 제제, 간섭 핵산 제제)는 임의의 이용가능한 수단에 의해 세포(예를 들어, 암 세포) 내에 도입될 수 있다. "도입"은 서열이 세포 내부에 대한 접근을 얻는 방식으로 핵산 또는 단백질을 세포에 제시하는 것을 포함한다. 도입은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있고, 구성요소 중 하나 이상(예를 들어, 구성요소 중 2개, 또는 모든 구성요소)은 임의의 조합으로 동시에 또는 순차적으로 세포 내에 도입될 수 있다. 세포의 게놈을 뉴클레아제 제제와 접촉시키는 것은 하나 이상의 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 핵산(예를 들어, 하나 이상의 Cas 단백질 또는 하나 이상의 Cas 단백질을 암호화하는 핵산, 및 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산(즉, 하나 이상의 CRISPR RNA 및 하나 이상의 tracrRNA))을 세포 내에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 세포의 게놈을 접촉시키는 것(즉, 세포를 접촉시키는 것)은 상기 구성요소 중 단지 하나, 구성요소 중 하나 이상, 또는 모든 구성요소를 세포 내에 도입하는 것을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 및 단백질 제제에 대한 적합한 전달 방법은 전기천공, iTOP, 지질 나노입자, 중합체 나노입자, CPP 전달, DNA 나노구조, 또는 금 나노입자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에 개시된 핵산 제제(예를 들어, 플라스미드 기반 gRNA-Cas, Ca9 mRNA, sgRNA, 간섭 핵산 제제)에 대한 적합한 전달 방법은 전기천공, 유체역학적 주사, 미세주사, 기계적 세포 변형, 지질 나노입자, AAV, 또는 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

뉴클레아제 제제는 단백질 형태 또는 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA와 같은 뉴클레아제 제제를 암호화하는 핵산 형태로 세포 내에 도입될 수 있다. DNA 형태로 도입될 때, DNA는 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 작제물에 있을 수 있다.

예를 들어, Cas 단백질은 gRNA와 복합체화된 Cas 단백질과 같은 단백질 형태, 또는 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA와 같은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 형태로 세포 내에 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 RNA 형태 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 형태로 세포 내에 도입될 수 있다. DNA 형태로 도입될 때, Cas 단백질 및/또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 작제물에 있을 수 있다. 예를 들어, 이러한 발현 작제물은 단일 핵산 분자의 구성요소일 수 있다. 대안적으로, 이들은 2개 이상의 핵산 분자 중에서 임의의 조합으로 분리될 수 있다(즉, 하나 이상의 CRISPR RNA를 암호화하는 DNA, 하나 이상의 tracrRNA를 암호화하는 DNA, 및 Cas 단백질을 암호화하는 DNA는 별개의 핵산 분자의 구성요소일 수 있다).

본원의 개시내용은 또한 자가포식 또는 NF-kB 유전자 발현을 표적하는 gRNA 분자 중 하나 또는 칵테일, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 자가포식 또는 NF-kB 유전자를 표적하는 1, 2, 3개, 또는 그 이상의 gRNA 분자를 각각 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본원에 제공된 제제는 지질 입자 내에 캡슐화된 gRNA를 포함할 수 있다. 지질 입자 내에 캡슐화된 gRNA의 칵테일을 포함하는 제형과 관련하여, 상이한 gRNA 분자는 동일한 지질 입자에 공동-캡슐화될 수 있거나, 또는 칵테일에 존재하는 gRNA 종의 각 유형은 별개의 입자에 캡슐화될 수 있거나, 또는 일부 gRNA 종은 동일한 입자에 공동캡슐화될 수 있는 반면 다른 gRNA 종은 제형 내의 상이한 입자에 캡슐화된다. 특정 구현예에서, 지질 입자는 Cas 단백질을 암호화하는 gRNA 및 mRNA를 둘 다 포함한다. 특정 구현예에서, 하나의 집단의 지질 입자는 gRNA를 포함하고 지질 입자의 또 다른 집단은 Cas 단백질(들) 또는 Cas 단백질(들)을 암호화하는 mRNA를 포함하며, 지질 입자는 동일한 조성물 또는 상이한 조성물에 있을 수 있고, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 지질 입자는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 임의적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로부터 형성된다. 핵산 분자(예를 들어, gRNA 분자)를 포함하는 지질 입자는 핵산-지질 입자로 지칭된다. 핵산은 지질 입자 내에 완전히 캡슐화되어, 효소 분해로부터 핵산을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산-지질 입자는 약 5:1 내지 약 15:1의 총 지질:gRNA 질량 비를 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산-지질 입자는 약 5:1 내지 약 15:1, 또는 약 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 또는 15:1, 또는 이의 임의의 분율 또는 그 안의 범위의 총 지질:gRNA 질량 비를 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산-지질 입자는 약 9:1(예를 들어, 8.5:1 내지 10:1, 또는 8.9:1 내지 10:1, 또는 9.1:1, 9.2:1, 9.3:1, 9.4:1, 9.5:1, 9.6:1, 9.7:1, 및 9.8:1을 포함하는, 9:1 내지 9.9:1의 지질:약물 비)의 총 지질:gRNA 질량 비를 갖는다. 핵산-지질 입자의 투여는 예를 들어, 경구, 비강내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 병변내, 기관내, 피하, 또는 피내와 같이, 당업계에 알려진 임의의 경로에 의해 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산-지질 입자는 예를 들어, 장용 또는 비경구 투여 경로를 통해 전신으로 투여된다. 핵산은 축합체와 복합체화되고 PCT 공개 번호 WO 00/03683에 제시된 바와 같이 지질 입자 내에 캡슐화될 수 있으며, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 제공된 지질 입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 rim 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 rim 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 rim, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 rim, 또는 150 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20040142025 및 20070042031에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

핵산-지질 입자는 지질 접합체를 포함할 수 있다. 이러한 지질 접합체는 예를 들어, 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 번호 5,885,613 참조), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이의 혼합물과 같은 PEG-지질 접합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는 PCT 공개 번호 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르 함유 링커 모이어티를 포함하는, PEG 또는 POZ를 지질에 커플링하기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 아미드 또는 카바메이트와 같은 비-에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다.

일부 구현예에서, 핵산-지질 입자 내 지질 접합체는 입자의 응집을 억제하고, 예를 들어, 본원에 기재된 지질 접합체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 지질 접합체는 PEG-지질 접합체를 포함한다. PEG-지질 접합체의 예는 PEG-DAG 접합체, PEG-DAA 접합체, 및 이의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, PEG-지질 접합체는 PEG-디아실글리세롤(PEG-DAG) 접합체, PEG-디알킬옥시프로필(PEG-DAA) 접합체, PEG-인지질 접합체, PEG-세라마이드(PEG-Cer) 접합체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, PEG-지질 접합체는 PEG-DAA 접합체이다. 특정 구현예에서, 지질 입자 내 PEG-DAA 접합체는 PEG-디데실옥시프로필(C10) 접합체, PEG-디라우릴옥시프로필(C12) 접합체, PEG-디미리스틸옥시프로필(C14) 접합체, PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 접합체, PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 접합체, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 여기서 PEG-DAA 접합체는 PEG-디미리스틸옥시프로필(C14) 접합체이다. 또 다른 구현예에서, PEG-DAA 접합체는 화합물(66)(PEG-C-DMA) 접합체이다. 또 다른 구현예에서, 지질 접합체는 POZ-DAA 접합체와 같은 POZ-지질 접합체를 포함한다.

특정 구현예에서, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol % 내지 약 3 mol %를 포함한다.

유용한 제형의 추가의 구현예는 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0076335 A1 및 US 2018/0245074 A1에 기재되어 있으며, 이의 기재내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 제제(예를 들어, Cas 단백질-암호화 및/또는 gRNA-암호화 DNA)는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다.

벡터는 Cas 단백질 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 서열, 및/또는 표적화되는 영역(예를 들어, 표적 서열)에 대한 높은 상동성을 갖는 공여자 주형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 공여자 주형은 표적 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 예시적인 공여자 주형은 복구 주형, 예를 들어, 유전자 교정 주형, 또는 유전자 돌연변이 주형, 예를 들어, 점 돌연변이(예를 들어, 단일 뉴클레오티드(nt) 치환) 주형)이다. 벡터는 또한 예를 들어, Cas 분자 서열에 융합된 (예를 들어, 핵 국부화, 핵소체 국부화, 또는 미토콘드리아 국부화를 위한) 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas 분자를 암호화하는 서열에 융합된 핵 국부화 서열(예를 들어, SV40로부터)을 포함할 수 있다.

하나 이상의 조절/제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, Kozak 공통 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열, 및 스플라이스 수용자 또는 공여자가 벡터에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 II에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III(예를 들어, U6 프로모터)에 의해 인식된다. 특정 구현예에서, 프로모터는 조절된 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다.

특정 구현예에서, 벡터 또는 전달 비히클은 (예를 들어, 재조합 바이러스의 생성을 위한) 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 특정 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 특정 구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비-분열 세포를 감염시킨다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다.

특정 구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비-분열 세포를 감염시킨다. 특정 구현예에서, 바이러스는 분열 및 비-분열 세포를 둘 다 감염시킨다. 특정 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈 내에 통합될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스는 예를 들어, 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, 바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어, 추가 라운드의 비리온 복제 및/또는 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 또는 결실된다. 특정 구현예에서, 바이러스는 Cas 분자 또는 분자들 및/또는 gRNA 분자 또는 분자들의 일시적 발현을 유발한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas 분자 또는 분자들 및/또는 gRNA 분자 또는 분자들의 장기간, 예를 들어, 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 또는 영구적 발현을 유발한다. 바이러스의 패키징 용량은 예를 들어, 적어도 약 4 kb 내지 적어도 약 30 kb, 예를 들어, 적어도 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb, 또는 50 kb로 달라질 수 있다.

특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 특이적 세포 유형 또는 조직을 인식한다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대체 바이러스 외피 당단백질로 위형화되고/되거나; 세포 유형-특이적 수용체로 조작되고/되거나(예를 들어, 펩티드 리간드와 같은 표적화 리간드, 단일 쇄 항체, 또는 성장 인자를 혼입하기 위한 하나 이상의 바이러스 외피 당단백질의 유전적 변형(들)); 한쪽 끝은 바이러스 당단백질을 인식하고 다른쪽 끝은 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 이중 특이성을 갖는 분자 가교(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론 항체, 아비딘-비오틴 및 화학적 접합)를 갖도록 조작될 수 있다.

예시적인 바이러스 벡터/바이러스는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다.

특정 구현예에서, Cas- 및/또는 gRNA-암호화 서열은 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 특정 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는 예를 들어, 숙주 게놈으로의 통합을 허용하는 역전사효소를 포함한다. 특정 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-적격이다.

특정 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어, 추가 라운드의 비리온 복제 및 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나, 또는 결실된다.

특정 구현예에서, Cas- 및/또는 gRNA-암호화 핵산 서열(임의적으로 공여자 주형 핵산)은 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는다.

특정 구현예에서, Cas- 및/또는 gRNA-암호화 핵산 서열(임의적으로 공여자 주형 핵산)은 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다.

특정 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, Cas- 및/또는 gRNA-암호화 핵산 서열(임의적으로 공여자 주형 핵산)은 재조합 AAV에 의해 전달된다. 특정 구현예에서, AAV는 그의 게놈을 숙주 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포의 게놈 내로 혼입하지 않는다. 특정 구현예에서, AAV는 그의 게놈의 적어도 일부를 숙주 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포의 게놈 내로 혼입할 수 있다. 특정 구현예에서, AAV는 자기-상보적 아데노-연관 바이러스(scAAV), 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 함께 어닐링하는 두 가닥을 패키지하는 scAAV이다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 AAV 혈청형은 AAVl, AAV2, 변형된 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서의 변형), AAV3, 변형된 AAV3(예를 들어, Y705F, Y73 IF 및/또는 T492V에서의 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형된 AAV6(예를 들어, S663 V 및/또는 T492V에서의 변형), AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rhlO, 및 위형 AAV를 포함하며, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6이 또한 개시된 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 AAV 캡시드는 혈청형 AAVl, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rhlO, AAV.rh32/33, AAV.rh43, AAV.rh64Rl, 또는 AAV7m8로부터의 캡시드 서열이다.

특정 구현예에서, Cas- 및/또는 gRNA-암호화 핵산 서열(임의적으로 공여자 주형 핵산)은 혈청형 AAVl, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rhlO, AAV.rh32/33, AAV.rh43, 또는 AAV.rh64Rl로부터의 캡시드 서열과 예를 들어, 약 50% 이상, 예를 들어, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80%) 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 서열 상동성을 갖는 재조작된 AAV 캡시드에 전달된다.

특정 구현예에서, Cas- 및/또는 gRNA-암호화 핵산 서열(임의적으로 공여자 주형 핵산)은 키메라 AAV 캡시드에 의해 전달된다. 예시적인 키메라 AAV 캡시드는 AAV9il, AAV2i8, AAV-DJ, AAV2G9, AAV2i8G9, 또는 AAV8G9를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, AAV는 자기-상보적 아데노-연관 바이러스(scAAV), 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 함께 어닐링하는 두 가닥을 패키지하는 scAAV이다.

특정 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA(임의적으로 공여자 주형 핵산)는 하이브리드 바이러스, 예를 들어, 본원에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 하이브리드에 의해 전달된다. 특정 구현예에서, 하이브리드 바이러스는 AAV(예를 들어, 임의의 AAV 혈청형의 것)과 보카바이러스, B 19 바이러스, 돼지 AAV, 거위 AAV, 고양이 AAV, 개 AAV, 또는 MVM의 하이브리드이다. 제제의 바이러스 벡터 전달에 대한 추가 정보는 WIPO 공개 WO2018081504 A1에서 찾을 수 있으며, 그 전문이 참조로 포함된다.

특정 구현예에서, 전달 비히클은 비-바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노입자는 예를 들어, 자성 나노입자(예를 들어, Fe3Mn02) 및 실리카를 포함한다. 나노입자의 외부 표면은 페이로드의 부착(예를 들어, 접합 또는 포획)을 허용하는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)와 접합될 수 있다.

일부 방법에서, 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas 단백질 및 가이드 RNA)를 암호화하는 DNA는 DNA 미니서클을 통해 세포 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, WO 2014/182700을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. DNA 미니서클은 복제 기점도 항생제 선택 마커도 없는 비-바이러스 유전자 전달에 사용될 수 있는 초나선 DNA 분자이다. 따라서, DNA 미니서클은 전형적으로 플라스미드 벡터보다 크기가 더 작다. 이들 DNA는 박테리아 DNA가 없으며, 따라서 박테리아 DNA에서 발견된 메틸화되지 않은 CpG 모티프가 결여되어 있다.

본원에 제공된 방법은, 핵산 또는 단백질이 적어도 하나의 세포 내부에 접근할 수 있다는 점을 제외하고는, 핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하기 위한 특정 방법에 의존하지 않는다. 핵산 및 단백질을 다양한 세포 유형 내에 도입하기 위한 방법은 알려져 있고, 예를 들어, 안정한 형질감염 방법, 일시적 형질감염 방법, 및 바이러스-매개 방법을 포함한다.

형질감염 프로토콜 뿐만 아니라 핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하기 위한 프로토콜은 달라질 수 있다. 비-제한적인 형질감염 방법은 리포솜; 나노입자; 칼슘 포스페이트(Graham 등 (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti 등 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4, 및 Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체를 사용한 화학적-기반 형질감염 방법을 포함한다. 비-화학적 방법은 전기천공, 초음파천공, 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자-기반 형질감염은 유전자 총, 또는 자성-보조 형질감염의 사용을 포함한다(Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). 바이러스 방법은 또한 형질감염에 사용될 수 있다.

핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하는 것은 또한 전기천공, 세포질내 주사, 바이러스 감염, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 형질감염, 지질-매개 형질감염, 또는 뉴클레오펙션에 의해 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 핵산 기질을 세포질뿐만 아니라 핵 막을 통해 핵에 전달하는 것을 가능하게 하는 개선된 전기천공 기술이다. 게다가, 본원에 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 정규 전기천공보다 훨씬 더 적은 세포를 필요로 한다(예를 들어, 정규 전기천공에 의한 700만개와 비교하여 단지 약 200만개). 일 예에서, 뉴클레오펙션은 LONZA^® NUCLEOFECTOR™ 시스템을 사용하여 수행된다.

핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하는 것은 또한 미세주사에 의해 달성될 수 있다. mRNA의 미세주사는 바람직하게는 세포질 내로 수행되는 반면(예를 들어, 번역 기계에 mRNA를 직접 전달하기 위해), 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 DNA를 암호화하는 DNA의 미세주사는 바람직하게는 핵 내로 수행된다. 대안적으로, 미세주사는 핵 및 세포질 둘 다에 주사함으로써 수행될 수 있으며: 먼저 바늘을 핵 내에 도입할 수 있고 첫번째 양을 주사할 수 있고, 세포에서 바늘을 제거하는 동안 두번째 양을 세포질 내에 주사할 수 있다. 뉴클레아제 제제 단백질이 세포질 내에 주사되는 경우, 단백질은 바람직하게는 핵/전핵으로의 전달을 보장하는 핵 국부화 신호를 포함한다. 미세주사를 수행하는 방법이 잘 알려져 있다. 예를 들어, Nagy 등 (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Meyer 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026 및 Meyer 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359를 참조한다.

핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하기 위한 다른 방법은 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개 전달, 엑소좀-매개 전달, 지질-나노입자-매개 전달, 세포-투과-펩티드-매개 전달, 또는 이식가능한-장치-매개 전달을 포함할 수 있다. 생체내에서 세포를 변형시키기 위해 핵산 또는 단백질을 대상체에게 투여하는 방법은 본원의 다른 곳에 개시되어 있다.

핵산 및 단백질을 세포 내에 도입하는 것은 또한 유체역학적 전달(HDD)에 의해 달성될 수 있다. 유체역학적 전달은 생체내에서 세포내 DNA 전달을 위한 방법으로서 등장하였다. 실질 세포로의 유전자 전달을 위해, 필수 DNA 서열만이 선택된 혈관을 통해 주사될 필요가 있으며, 현재 바이러스 및 합성 벡터와 연관된 안전성 우려를 제거한다. 혈류 내에 주사되는 경우, DNA는 혈액에 접근가능한 상이한 조직의 세포에 도달할 수 있다. 유체역학적 전달은 순환시 비압축성 혈액 내에 다량의 용액을 빠르게 주사함으로써 생성된 힘을 이용하여 큰 막-불투과성 화합물이 실질 세포로 들어가는 것을 방지하는 내피 및 세포 막의 물리적 장벽을 극복한다. DNA의 전달 이외에, 이 방법은 생체내에서 RNA, 단백질, 및 다른 작은 화합물의 효율적인 세포내 전달에 유용하다. 예를 들어, Bonamassa 등 (2011) Pharm. Res. 28(4):694-701을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하기 위한 다른 방법은 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개 전달, 엑소좀-매개 전달, 지질-나노입자-매개 전달, 세포-투과-펩티드-매개 전달, 또는 이식가능한-장치-매개 전달을 포함할 수 있다. 구체적 예로서, 핵산 또는 단백질은 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락트-코글리콜-산)(PLGA) 미소구체, 리소좀, 미셸, 역미셸, 지질 코킬레이트, 또는 지질 미세관과 같은 담체로 세포 내로 도입될 수 있다.

일부 경우에, 방법 및 조성물에 이용되는 세포는 그들의 게놈 내에 안정하에 혼입된 DNA 작제물을 갖는다. 이러한 경우, 접촉은 이미 그의 게놈 내에 안정하게 혼입된 작제물과 함께 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 이용되는 세포는 그의 게놈 내에 안정하게 혼입된 기존 Cas-암호화 유전자를 가질 수 있다(즉, Cas-준비 세포). "안정하게 혼입된" 또는 "안정하게 도입된" 또는 "안정하게 통합된"은 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내에 통합되고 이의 자손에 의해 유전될 수 있도록 세포 내에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 임의의 프로토콜은 표적화된 게놈 통합 시스템의 다양한 구성요소 또는 DNA 작제물의 안정한 혼입을 위해 사용될 수 있다.

DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제는 임의의 알려진 수단에 의해 세포 내에 도입될 수 있다. DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리펩티드는 세포 내에 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내에 도입될 수 있다. DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 도입될 때, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제는 세포 내에서 일시적으로, 조건부로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 함유될 수 있고 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 프로모터는 본원의 다른 곳에 추가로 상세하게 논의되어 있다. 대안적으로, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제는 DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 mRNA로서 세포 내에 도입될 수 있다.

DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈에 안정하게 통합되고 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표적화 벡터 또는 삽입 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적화 벡터와 별개인 벡터 또는 플라스미드에 있을 수 있다.

DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제가 DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입을 통해 세포에 제공될 때, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오티드는, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 관심 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 단백질 또는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포를 포함하는, 주어진 관심 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다.

치료 방법

일부 측면에서, 본원에는 대상체에게 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체에서의 암 세포를 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 대상체에게 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 적어도 하나의 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체에서 암 세포의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키는 방법이 제공된다. 추가의 측면에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에게 종양에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제)를 투여함으로써 대상체에서의 종양을 TNF-α 매개 사멸에 대해 감작화하거나 또는 대상체에서 종양의 TNF-α 매개 사멸을 증가시키는 방법을 포함한다.

또한 본원에는 대상체에게 대상체의 암 세포에서 자가포식 및/또는 NF-κB 경로를 억제하는 제제(예를 들어, 본원에 개시된 제제) 및 추가의 암 요법을 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서 추가의 암 요법은 암 면역요법이다. 특정 구현예에서, 추가의 요법은 암 세포의 TNF-α 매개 사멸을 유도하는 요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 암 세포의 T 세포 사멸(예를 들어, 암 세포의 세포독성 T 세포 사멸)을 유도하는 요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 암 요법은 면역 체크포인트 억제, TNF-α 투여, T 세포 면역요법(예를 들어, CAR-T 세포 면역요법) 및/또는 암 백신을 포함한다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 제제는 단독으로 사용되거나 또는 또 다른 유형의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 상이한 치료제는 부수적으로 또는 순차적으로 동일한 제형으로 또는 별개의 제형으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상이한 치료제는 서로 약 1 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간, 약 72 시간, 또는 약 1주 이내에 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료를 받는 대상체는 상이한 치료제의 조합 효과로부터 이익을 얻을 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본원에 기재된 적어도 하나의 제제를 함유하는, 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 조성물은 본원에 기재된 다수(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상)의 제제의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국부로 또는 전신으로 전달된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체 또는 종양 미세환경에 존재하는 종양에 국부로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제 또는 약제학적 조성물은 제2 암 치료제와 함께 투여된다.

본원에 기재된 제제는 면역요법을 포함하는 임의의 다른 암 요법과 함께 투여될 수 있다. 추가의 암 요법은 면역 체크포인트 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질을 억제한다. 면역 체크포인트 억제는 광범위하게 암 세포가 면역 반응을 예방하거나 또는 하향조절하기 위해 생성할 수 있는 체크포인트를 억제하는 것을 지칭한다. 면역 체크포인트 단백질의 예는 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 부티로필린, A2aR, 및 이의 조합이다. 면역 체크포인트 억제제는 세미플리맙(REGN2810), 니볼루맙(BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), 펨브롤리주맙(MK-3475, SCH 900475), 아테졸리주맙(MPDL3280A, RG7446, RO5541267), 더발루맙(MEDI4736, MEDI-4736), 아벨루맙(MSB0010718C), 이필리무맙(BMS-734016, IBI310, MDX-010), SHR1210, 신틸리맙(IBI308), 아파르탈리주맙(PDR001), 티슬레리주맙(BGB-A317), 피딜리주맙, BCD-100, 토리팔리맙(JS001), BAY 1905254, ASP 8374, PF-06801591, AMP-224, AB122, AK105, AMG 404, BCD-100, BI 754091, F520, HLX10, HX008, JTX-4014, LZM009, MEDI0680, MGA012, Sym021, TSR-042, PSB205, MGD019, MGD013, AK104, XmAb20717, RO7121661, CX-188, INCB086550, FS118, BCD-135, BGB-A333, CBT-502, CK-301, CS1001, FAZ053, HLX20, KN035, MDX-1105, MSB2311, SHR-1316, TG-1501, ZKAB001, INBRX-105, MCLA-145, KN046, M7824, LY3415244, INCB086550, CA-170, CX-072, ADU-1604, AGEN1181, AGEN1884, MK-1308, REGN4659, XmAb22841, ATOR-1015, PSB205, MGD019, AK104, XmAb20717, BMS-986249, 트레멜리무맙, BMS-986258, BGB-A425, INCAGN02390, Sym023, JNJ 61610588, BI 754111, LAG525, MK-4280, REGN3767, Sym022, TSR-033, 렐라틀리맙, JTX-2011, MGD009, BMS-986207, OMP-313M32, MK-7684 또는 TSR-022일 수 있다.

추가의 암 면역요법은 자가 또는 동종 T 세포 요법 또는 자가 또는 동종 CAR T 세포 요법과 같은 입양 면역요법을 포함한다. 입양 면역요법은 종양 또는 암 세포에 대한 환자의 면역 반응을 부스팅하도록 설계된 치료 방법이다. 방법은 개체로부터 면역 세포의 제거, 생체외에서 효과기 세포의 형성, 임상적으로 관련된 수로 세포의 확장 및 환자에게 세포의 재주입을 수반한다. 본원에는 본원에 개시된 제제 및 클래스 I MHC 상에 제시된 펩티드(예를 들어, 암 펩티드 또는 대상체-특이적 펩티드)에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체를 발현하는 동종이계 또는 자가 CTL의 공동 투여를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, CTL은 세포 은행 또는 CTL이 투여되는 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, MHC는 클래스 I MHC이다. 일부 구현예에서, 클래스 II MHC는 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 또는 HLA-DRA인 α 쇄 폴리펩티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 클래스 II MHC는 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 또는 HLA-DRB인 β 쇄 폴리펩티드를 갖는다. 일부 구현예에서, CTL은 대상체에게 투여되기 전에 세포 라이브러리 또는 은행에 저장된다.

일부 구현예에서, T 세포는 대상체에서 암 또는 종양에 특이적인 펩티드를 제시하는 항원 제시 세포(APC)와 접촉된다. 일부 구현예에서 APC는 B 세포, 항원 제시 T-세포, 수지상 세포, 또는 인공 항원-제시 세포(예를 들어, aK562 세포)이다. 과정에 사용하기 위한 수지상 세포는 환자 샘플로부터 PBMC를 취하여 플라스틱에 부착함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 단핵구 집단은 달라붙고 모든 다른 세포는 씻겨 나갈 수 있다. 이어서 부착 집단은 IL-4 및 GM-CSF로 분화되어 단핵구 유래된 수지상 세포를 생산한다. 이들 세포는 IL-1β, IL-6, PGE-1 및 TNF-α를 첨가하여 성숙될 수 있고(이는 수지상 세포의 표면 상의 중요한 공동-자극 분자를 상향조절함) 이어서 본원에 제공된 펩티드 중 하나 이상으로 형질도입된다. 일부 구현예에서, APC는 aK562 세포와 같은 인공 항원-제시 세포이다. 일부 구현예에서, 인공 항원-제시 세포는 CD80, CD83, 41BB-L, 및/또는 CD86을 발현하도록 조작된다. aK562 세포를 포함한 예시적인 인공 항원-제시 세포는 미국 특허 공개 번호 2003/0147869에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 항원 제시 세포를 생산하는 예시적인 방법은 WO2013088114에서 찾을 수 있으며, 그 전문이 본원에 포함된다.

또 다른 예시적인 입양 면역요법 프로토콜은 자가 종양 침윤 림프구(TIL)의 투여를 수반한다. TIL 세포는 사멸시 강력하다. TIL 세포는 고형 종양의 생체내에서 분화된 효과기 세포이다(암의 입양 면역요법에 대한 TIL 세포를 생성하는 방법을 기재하고 있는 미국 특허 번호 5,126,1 32 참조). TIL 세포는 예를 들어, 환자로부터 종양 샘플을 제거하고, 10개의 종양 샘플 내에 침윤된 림프구를 단리하고, IL-2의 존재 하에 생체외에서 이들 TIL 세포를 성장시키고 IL-2와 함께 환자에게 세포를 재주입함으로써 생산될 수 있다.

추가의 암 요법은 CAR-T 세포 요법일 수 있다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 종양-연관 표면 항원에 대한 항체-기반 특이성과 특이적 항-종양 세포 면역 활성을 갖는 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인을 조합한 분자이다(Eshhar, 1997, Cancer Immunol Immunother 45(3-4) 131-136; Eshhar 등, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90(2):720-724; Brocker 및 Karjalainen, 1998, Adv Immunol 68:257-269). 이들 CAR은 T 세포가 T 세포 활성화 및 공동-자극 신호를 제공하는 세포내 도메인에 융합된 단일 쇄 Fv(scFv) 항원-특이적 세포외 영역을 통해 MHC-독립적 1차 활성화를 달성하게 한다. 2세대 및 3세대 CAR은 또한 다양한 고형 종양 및 백혈병 모델에서 사이토카인 분비 및 항-종양 활성을 증대시키는, CD28 및/또는 CD137(4-1BB) 세포내 활성화 모티프를 통해 적절한 공동-자극 신호를 제공한다(Pinthus, 등, 2004, J Clin Invest 114(12):1774-1781; Milone, 등, 2009, Mol Ther 17(8):1453-1464; Sadelain, 등, 2009, Curr Opin Immunol 21(2):215-223). 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 종양 항원에 특이적인 CAR을 발현하기 위해 환자의 자가 T-세포의 유전적 변형을 수반한 후, 생체외 세포를 확장하고 환자에게 다시 재주입한다. CAR은 특이적 모노클로날 항체 및 하나 이상의 T 세포 수용체 세포내 신호전달 도메인으로부터 가변적인 선택된 단일-쇄 단편의 융합 단백질이다. 이 T 세포 유전적 변형은 DNA-기반 트랜스포존, CRISPR/Cas9 기술 또는 전기천공에 의한 시험관내 전사된-mRNA의 직접 전달과 같은, 바이러스-기반 유전자 전달 방법 또는 비-바이러스 방법을 통해 발생할 수 있다.

또한 본원에는 대상체로부터의 T-세포를 포함하는 샘플을 수득하고, 샘플로부터 세포독성 T 림프구(CTL)를 단리하고, 생체외에서 CTL을 확장하고, 적어도 하나의 제제(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 제제)와 함께 확장된 CTL을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 세포독성 T 세포는 종양-림윤 림프구일 수 있다. CTL을 확장하는 것은 CTL을 암-특이적 또는 종양-특이적 항원을 발현하는 항원 제시 세포(APC)와 접촉시켜 항원-특이적 CTL을 생성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T-세포 또는 단리된 CTL을 포함하는 샘플은 대상체에게 투여 전에 자극받는다. 방법은 대상체에게 투여 전에 CTL을 항-CD3 모노클로날 항체(OKT3)와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 대상체에게 투여 전에 CTL을 인간 인터류킨(IL)-2와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 대상체는 제제의 투여 전에 화학요법 약물을 받았다. 대상체는 화학요법 약물에 불응성일 수 있다. 대상체는 본원에 개시된 추가의 암 요법 제제를 받는 것과 동시에 또는 순차적으로 화학요법제를 받을 수 있다. 화학요법제는 다음을 포함한다: 알킬화제 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드(Cytoxan™); 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 에밀레루민 및 알프레타민, 트리에밀렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 및 트리메밀롤로멜라민을 포함한 메밀라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프로테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 메팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 질소우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포레무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제(예를 들어, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감말 및 칼리키아미신 필리); 다이네미신 A를 포함한 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔다이인 항생물질 크로모모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르니노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(Adramycin™)(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데모프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 헤스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포름틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK™; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리쿠오로트리에밀아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오페타; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(Taxol™, Bristol Meyers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스턴 소재) 및 도세탁셀(Taxoteret™, Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 엉또니 소재); 클로람부실; 젬시타빈(Gemzar™); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미트로크산트론; 반크리스틴; 비노렐빈(Navelbine™); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 제올로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체. 또한 "화학요법제"의 정의에는 다음이 포함된다: 예를 들어, 타목시펜(Nolvadex™ 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston™)을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)와 같은, 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 또는 억제하기 위해 작용하는 항-호르몬제; 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(Megace™), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸(Rivisor™), 레트로졸(Femara™), 및 아나스트로졸(Arimidex™)과 같은, 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제의 억제제; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프로데, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체.

하기에 상세히 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 약제학적 조성물 및/또는 제제는 다음을 위해 조정된 것들을 포함하는, 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(drench)(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어, 협측, 설하, 및 전신 흡수를 위해 표적화된 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 또는 (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출 제형과 같이, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 척수강내, 뇌내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여. 약제학적 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 본원에 기재된 제제를 담체 및, 임의적으로 하나 이상의 보조 구성요소와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본원에 기재된 제제를 액체 담체, 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 다와 회합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형시킴으로써 제조된다.

적응증

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 임의의 암성 또는 전암성 종양을 포함하는, 임의의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀, 또는 자궁의 암을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 게다가, 암은 구체적으로 다음과 같은 조직학적 유형의 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 지주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종 폴립의 선암종; 선암종, 가족성 선종성 폴립증; 고형 암종; 유암종 종양, 악성; 세기관지 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 산친화성 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피양 암종; 낭샘암종; 유두 낭샘암종; 유두 장액성 낭샘암종; 점액 낭샘암종; 점액 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 속질 암종; 소엽 암종; 염증형 암종; 유방의 파제트병; 샘꽈리 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평상피화생; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 포막종; 악성 과립막 세포 종양; 및 악성 신경모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구체종양; 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대 색소성 모반의 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 치조 횡문근육종; 간질성 육종; 악성 혼합 종양; 뮐러 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽세포종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화세포종; 태생성 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 악성 연골육종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉의 육종; 악성 치원성 종양; 사기질모세포 치아육종; 악성 법랑모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 청삭종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽; 소죄 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 파라육아종; 소림프구성 악성 림프종; 미만성 거대 세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상 식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거대모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발 세포 백혈병.

일부 구현예에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양은 선암종, 부신 종양, 항문 종양, 담관 종양, 방광 종양, 골 종양, 혈액 매개 종양, 뇌/CNS 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 자궁내막 종양, 식도 종양, 유잉 종양, 눈 종양, 담낭 종양, 위장관, 신장 종양, 후두 또는 하인두 종양, 간 종양, 폐 종양, 중피종 종양, 다발성 골수종 종양, 근육 종양, 비인두 종양, 신경모세포종, 경구 종양, 골육종, 난소 종양, 췌장 종양, 음경 종양, 뇌하수체 종양, 원발성 종양, 전립선 종양, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘 종양, 연조직 육종, 흑색종, 전이성 종양, 기저 세포 암종, 메르켈 세포 종양, 고환 종양, 흉선 종양, 갑상선 종양, 자궁 종양, 질 종양, 외음부 종양, 또는 빌름스 종양이다.

특정 구현예에서, 암은 결장암, 유방암, 폐암, 난소암, 방광암, 신암, 또는 자궁경부암이다.

추가의 방법

특정 측면에서, 본원에는 테스트 제제가 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나열된 유전자)의 생성물을 발현 또는 활성을 억제하는지를 결정하는 것을 포함하는 제제(예를 들어, 테스트 제제)가 항암 치료제인지를 결정하는 방법이 제공되며, 여기서 테스트 제제가 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나열된 유전자)의 생성물의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 테스트 제제는 항암 치료제인 것으로 결정된다. 또한 본원에는 가이드 RNA 테스트 제제가 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나열된 유전자)의 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인지를 결정하는 것을 포함하는 가이드 RNA 제제가 항암 치료제인지를 결정하는 방법이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하고, 여기서 테스트 제제가 유전자의 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 경우 테스트 제제는 항암 치료제인 것으로 결정된다. 본원에 개시된 테스트 제제는 본원에 개시된 적어도 하나의 유전자 산물을 발현을 세포 집단에서 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 테스트 제제는 테스트 제제의 라이브러리의 구성원이다. 테스트 제제는 gRNA, TALEN 또는 아연-핑거 엔도뉴클레아제, 간섭 핵산 또는 소분자를 포함하는, 본원에 개시된 임의의 제제일 수 있다. 본원에 개시된 테스트 제제는 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자 산물의 발현 또는 활성을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 억제할 수 있다. 본원에 개시된 테스트 제제는 표 1 또는 표 2의 적어도 하나의 유전자 산물의 발현 또는 활성을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 억제할 수 있다.

또한 본원에는 환자가 본원에 제공된 암 요법에 대한 후보인지를 결정하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 대상체의 종양에서 세포에 의한 표 1 또는 표 2에 나열된 유전자 산물의 발현은 대상체가 요법에 대한 후보임을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 mRNA 산물이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 단백질 산물이다. 단백질 산물은 단백질 산물에 특이적인 항체를 사용하여 IHC, 또는 유세포 분석(예를 들어, FACS)에 의해 검출될 수 있다. 유전자 산물(예를 들어, mRNA 산물)은 핵산 증폭, 핵산 프로브에 의해, 또는 서열분석을 통해 검출될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에는 먼저 적어도 하나의 자가포식 유전자 또는 NF-κB 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나열된 적어도 하나의 유전자)의 발현 수준을 측정함으로써 암 또는 종양 세포를 표적화 및 사멸시키는 방법이 제공되고, 발현 수준이 결정된 임계치를 초과하는 경우, 본원에 개시된 제제(들)를 투여함으로써 암 또는 종양 세포를 표적화 및 사멸시킨다. 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2의 유전자)에 대한 임계치는 건강한 조직(예를 들어, 종양 또는 암과 연관되지 않은 조직)에 비해 이환된 조직(예를 들어, 종양 또는 암성 조직)에서 유전자 또는 유전자 산물의 발현을 결정하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 기술에 의해 결정될 수 있다. 유전자(예를 들어, 표 1 또는 표 2의 유전자)에 대한 임계치는 한 시점에서 암 세포 또는 종양의 유전자 산물의 발현을 나중 시점과 비교함으로써 결정될 수 있다. 건강한 조직 및 이환된 조직은 대상체 또는 상이한 개체로부터 취할 수 있다. 다른 구현예에서, 유전자 또는 유전자 산물의 발현 임계치는 조직 은행 또는 제3자 공급원으로부터의 조직에서 유전자 또는 유전자 산물 발현을 조사함으로써 결정된다. 예를 들어, 대상체 또는 제3자의 이환된 조직으로부터의 종양 또는 암 세포가 유전자 산물의 더 높은 발현을 나타내는 경우, 대상체는 요법에 대한 후보이다. 나중 시점으로부터의 종양 또는 암 세포가 유전자 산물의 더 높은 발현을 나타내는 경우, 대상체는 요법에 대한 후보이다.

예시

면역 체크포인트 억제제가 암의 치료를 변형시켰지만, T 세포-매개 사멸에 대한 종양 세포 감수성의 분자 결정기는 완전히 설명되지 않은 채로 남아있다. T 세포에 의한 사멸을 조절하는 종양 세포 유전자/경로를 식별하기 위한 게놈-규모 CRISPR 녹아웃 스크린이 본원에 기재된다. 스크린은 사멸에 대한 요건으로서 종양 세포 항원 제시 및 TNFα 신호전달을 식별하였고 반대로, 주요 보호 메커니즘으로서 NF-κB 신호전달 및 자가포식을 식별하였다. 개별 자가포식 유전자의 녹아웃 또는 자가포식의 약리학적 억제는 다양한 계통의 종양 세포를 T 세포 및/또는 TNFα에 의한 사멸에 감작화하였다. 반대로, 증가된 자가포식 활성을 초래하는 mTOR 신호전달의 억제는 T 세포 사멸로부터 종양 세포를 보호하였다. 기계적으로, 손상된 자가포식의 맥락에서 향상된 T 세포/TNFα-매개 사멸은 결함이 있는 NF-κB 신호전달에 기인하지 않았지만 증가된 카스파제-8 활성화와 연관되었으며, 이는 TNFα 신호전달 경로의 비교적 초기 단계에서 자가포식에 대한 역할을 시사한다. 마지막으로, 종양 세포 자가포식의 유전적 불활성화는 종양 모델에서 T 세포 체크포인트 억제제의 효능을 향상시켰으며, 이는 자가포식이 항종양 면역의 중요한 조절인자임을 시사한다. 이러한 발견은 보호 NF-κB 또는 자가포식 경로를 표적화하는 것이 종양을 T 세포-지시 면역요법에 감작화할 수 있음을 시사한다.

T 세포 사멸에 대한 종양 세포 감수성을 조절하는 유전자/경로를 체계적으로 알아내기 위한 노력으로, 여러 그룹은 풀링된 CRISPR/Cas9 스크린을 이용하였다. 이들 스크린은 종양 세포 사멸에서 항원 제시 및 IFNγ 신호전달의 필수적인 역할을 확인하였다. 게다가, 이들 스크린은 티로신 포스파타제 Ptpn2, 아펠린 수용체 APLNR, Pbrm1, 및 SWI/SNF 염색질 리모델링 복합체와 같은, 신규한 사멸 조절인자를 식별하였다. 흥미롭게도, 이들 스크린 중 일부는 또한 T 세포 사멸 과정에서 종양 세포 TNFα 및 TRAIL 신호전달에 대한 중요한 역할을 시사하였다. 성공적이기는 하지만, 대부분의 경우 이들 스크린은 T 세포에 의한 사멸에 필요한 종양 세포 유전자(즉, 살아 남은 종양 세포에서 풍부화된 단일 가이드 RNA(sgRNA))를 식별하였다.

조심스럽게 최적화된 조건 하에 수행된 풀링된 게놈-규모 CRISPR/Cas9 녹아웃(KO) 스크린은 T 세포 사멸을 제한하는 종양 세포 유전자의 효율적인 식별을 가능하게 한다. T 세포-매개 종양 세포 사멸을 조절하는 데 있어서 TNFα/NF-κB 신호전달에 대한 중요한 역할을 입증하는 것 외에도, 결과는 T 세포-유도 세포자멸사로부터 종양 세포를 보호하는 데 있어서 자가포식에 대한 이전에 이해되지 않은 역할을 알아낸다. 여기에서, 자가포식은 NF-κB 경로 활성을 조절하지 않고 카스파제 8의 TNFα-의존적 활성화를 제한하고 자가포식의 유전적 억제는 종양을 T 세포 체크포인트 억제제에 감작화한다는 것을 나타내었다. 따라서, 자가포식 경로는 면역요법 반응성의 중요한 조절인자인 것으로 보이며, 이는 이 경로의 억제가 T 세포-지시 요법의 효능을 향상시킬 수 있는 가능성을 시사한다.

T 세포 사멸에 대한 감수성을 조절하는 종양 세포 유전자의 식별

세포독성 T 세포에 의한 사멸에 대해 종양 세포 감작성을 조절하는 유전자를 식별하기 위해, MC38 결장 선암종 세포에서 게놈-전체 CRISPR/Cas9 스크린을 수행하였다. 마우스 단일 가이드 RNA(sgRNA) KO 라이브러리로 형질도입된 종양 세포를 MHC 클래스 I-제한된 Ova 펩티드 또는 스크램블된 대조군 펩티드로 펄스하고 OT-1 유전자이식 마우스로부터 단리된 활성화된 CD8⁺ T 세포(이는 Ova 펩티드를 인식하는 T 세포 수용체를 발현함)와 함께 인큐베이션하였다(도 1, 파트 a). 스크린 조건을 최적화하고 양성 대조군으로서 B2m KO 세포(이는 T 세포 사멸로부터 보호됨)를 사용하여 검증하였으며; 목표는 스크린에서 ~90% 종양 세포 사멸을 달성하는 것이었다(도 9). T 세포에 24 시간 노출 후, 생존가능한 종양 세포를 수확하고 Ova-펄스 대 대조군 종양 세포에서 sgRNA 표상을 NGS에 의해 평가하였다. 높은 초기 라이브러리 표상(~2000x 적용범위)으로 인해, sgRNA 표상은 사멸 후에도 종양 세포에서 유지되어, 본 발명자들이 고갈된 sgRNA 뿐만 아니라 풍부화된 sgRNA를 효율적으로 검출할 수 있게 하였다(R² = 0.95, Ova- 대 대조군 펩티드-펄스된 세포) (표 3, 도 10). T 세포 첨가 없이, 12 집단 배가를 위해 계대된 라이브러리-변형된 종양 세포로 병렬 스크린을 수행하여, T 세포 사멸과 무관하게 종양 세포 성장/생존을 조절하는 유전자를 식별하였다. 알려진 핵심 필수 유전자를 표적화하는 sgRNA의 상당한 비율이 이 병렬 성장 스크린에서 고갈된 반면, 비-표적화 sgRNA의 표상은 크게 변하지 않았으며(도 11), MC38 세포에서 CRISPR/Cas9-매개 유전자 변형의 효능 및 특이성을 확인하였다.

풍부화된 sgRNA의 분석은 T 세포에 의한 종양 세포 사멸에 필요한 핵심 경로로서 항원 제시 및 TNFα-유도 세포자멸사 신호전달을 식별하였다(도 1, 파트 b). 예상된 바와 같이, B2m 및 MHC 클래스 I 분자 H2-K1을 표적화하는 다중 sgRNA는 상당히 풍부화되었으며, T 세포 사멸이 Ova 펩티드의 세포 표면 제시에 의존적임을 확인하였다. H2-K1 및 B2m을 표적화하는 6개 sgRNA 모두의 회수는 세포에서 CRISPR/Cas9-매개 유전자 변형의 효과를 추가로 강조한다. 흥미롭게도, Tnfrsf1a(TNF 수용체 1; TNFR1), 카스파제-8(TNFα-유도 세포자멸사에 필요함) 및 Tradd(TNFα 신호전달 경로에서 핵심 어댑터 분자)를 표적화하는 다중 sgRNA가 또한 풍부화되었으며(도 1, 파트 b 및 c), 이는 T 세포-유래 TNFα가 종양 세포 사멸에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 마지막으로, mTOR 신호전달 경로에서 여러 유전자를 표적화하는 sgRNA가 풍부화되었다(예를 들어, Mtor, Mlst8, Rictor, Mapkap1, Tti2, Telo2, Tti1). 하기에 제시된 바와 같이, mTOR 신호전달의 불활성화는 증가된 자가포식 활성을 유발함으로써 T 세포 사멸로부터 종양 세포를 보호한다.

고갈된 sgRNA의 분석은 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한하는 2가지 핵심 경로로서 NF-κB 신호전달 및 자가포식을 식별하였다. LUBAC(Sharpin, Rbck1 및 Rnf31), TAK1(Map3k7/Tak1, Tab1, Tab2) 및 Nemo 복합체(Chuk, Ikbkb 및 Ikbkg)의 각 구성원을 포함하는, NF-κB 신호전달에 수반되는 유전자를 표적화하는 다중 sgRNA가 상당히 고갈되었다. 또한, 추가의 NF-κB 경로 또는 NF-κB 표적 유전자(Traf2, Tbk1, Mapkapk2, Rela, Cflar 및 Tnfaip3)를 표적화하는 sgRNA가 또한 고갈되었다(도 1, 파트 d 및 e). 이러한 발견은 NF-κB 경로가 Cflar(c-Flip) )과 같은 생존 유전자의 전사 유도를 통해 TNFα-의존적 세포자멸사를 제한하는 데 있어서 잘-확립된 역할을 갖기 때문에, T 세포-매개 사멸에서 TNFα의 중요한 역할과 일치한다.

흥미롭게도, 자가포식 경로(Rb1cc1, Pik3c3, Nrbf2, Atg13, Atg14), 막 물질의 전달(Atg9a, Atg2a, Tax1bp1) 또는 자가포식소체 확장(Atg5, Atg12, Atg10)에서 유전자를 표적화하는 다중 sgRNA가 상당히 고갈되었다(도 1, 파트 f 및 g). 이들 데이터는 종양 세포에서 자가포식 활성이 T 세포 사멸의 맥락에서 보호 역할을 한다는 것을 나타낸다. 자가포식은 다른 설정(예를 들어, 영양소 박탈)에서 세포 사멸을 제한하는 것으로 알려져 있지만, 이는 T 세포-유도 종양 세포 세포자멸사의 맥락에서 중요한 역할을 한다는 첫번째 조짐이다. 중요하게는, NF-κB 경로 유전자 또는 자가포식 유전자를 표적화하는 sgRNA는 병렬 세포 성장 스크린에서 고갈되지 않았고 후속 실험으로 MC38 세포에서 자가포식 유전자의 KO가 세포 성장을 손상시키지 않는다는 것을 확인하였으며(도 12), 이는 이들 유전자의 KO가 구체적으로 T 세포-매개 사멸의 맥락에서 세포 적합성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 자가포식에 대한 보호 역할은 mTOR 신호전달이 자가포식의 억제에서 잘-확립된 역할을 하였기 때문에, mTOR 경로에서 다중 유전자를 표적화하는 sgRNA가 스크린에서 풍부화되었다는 관찰과 일치한다(도 1, 파트 b).

TNFα-유도된 세포자멸사 신호전달은 T 세포에 의한 종양 세포 사멸에서 중요한 역할을 한다.

CRISPR 스크린은 종양 세포의 사멸에서 T-세포 유래 TNFα에 대한 우세한 역할을 나타내었다. 세포독성 T 세포에 의한 사멸이 주로 T 세포 과립으로부터 퍼포린 및 그랜자임의 방출에서 비롯된 것으로 생각되었지만, 이 과정에서 TNFα(및 다른 사멸 수용체 리간드)의 역할은 이전에 제안되었다. TNFα는 세포자멸사(카스파제-8 의존적) 또는 세포예정괴사에 의한 세포 사멸을 촉진시킬 수 있지만, 여러 분자 체크포인트(NF-κB 활성화 포함)는 TNFα-유도 세포 사멸을 억제하는 기능을 한다. 따라서, TNFα에 대한 대부분의 세포의 기본 반응은 전염증성 유전자의 생존 및 유도인 것으로 생각된다. TNFα/NF-κB 신호전달의 단순화된 모델에 대해 도 2, 파트 a를 참조한다.

도 2, 파트 b에 나타낸 바와 같이, T 세포 사멸 검정에 TNFα 차단 항체의 첨가는 MC38 세포 사멸을 상당히 감소시켰으며(B2m의 CRISPR/Cas9-매개 불활성화와 동일한 정도로), TNFα 신호전달의 역할을 확인하였다. 검정(이는 미리-활성화된 T 세포 사용)에서 종양 세포 사멸에 대한 TNFα 차단의 효과는 TNFα 차단이 TNFα-비감수성 종양 세포의 사멸을 제한하지 않기 때문에, T 세포 기능의 억제에 기인하지 않는다는 점에 주목하는 것이 중요하다(도 13). MC38 세포의 T 세포 사멸에 대한 TNFα의 상당한 기여와 일치하게, 용해성 TNFα는 세포자멸사 메커니즘을 통해 MC38 세포 사멸을 촉진시켰다(즉, 사멸은 카스파제 억제제 z-VAD-FMK에 의해 차단됨) (도 2, 파트 c). 또한, CRISPR/Cas9를 사용한 KO 세포주의 생성은 MC38 세포의 TNFα-매개 사멸이 TNFR1에 완전히 의존적이고 FADD(카스파제-8 활성화 복합체의 조립에 중요한 어댑터 단백질) 및 RIPK1(카스파제-8과 상호작용하여 세포자멸사를 촉진하는 키나제에 부분적으로 의존적임을 확인하였다(도 2, 파트 c).

종양 세포주의 패널에서 카스파제-8 활성화 및 세포자멸사를 유도하는 TNFα의 능력을 평가하였고 이들 세포주(CT26, B16F10, 4T1)의 대부분이 TNFα에 의해 사멸되지 않지만, EMT6 세포(MC38과 함께)가 TNFα-유도 카스파제-8 활성화 및 세포자멸사를 나타낸다는 것이 밝혀졌다(도 2, 파트 d 및 e). (TNFα에 의한 사멸에 감수성인 인간 암 세포주의 예에 대해 도 22 참조.) 상기 나타낸 바와 같이, NF-κB 신호전달은 TNFα-의존적 세포자멸사를 제한하는 데 우세한 역할을 하는 것으로 생각된다. 그러나, TNFα-감수성 대 내성 세포주에서 NF-κB 활성화의 명백한 차이가 없다는 것이 밝혀졌다. TNFα-감수성 MC38 및 EMT6 세포는 TNFα-내성 B16F10 및 4T1 세포에서 관찰된 것과 유사하게, Iκ-Bα(이는 세포질에서 NF-κB를 격리시킴으로써 억제함)의 효율적 분해 및 NF-κB 서브유닛 p65/Rela의 인산화를 나타내었다(도 2, 파트 f, 도 14). 게다가, MC38 세포는 2개의 NF-κB 표적 유전자인 A20 및 ICAM-1의 강력한 TNFα-유도 발현을 나타내었다(도 2, 파트 g). 따라서, NF-κB 경로는 TNFα-의존성을 분명히 제한하는 반면, TNFα-유도 사멸에 대한 감수성은 결함이 있는 NF-κB 활성화 이외의 인자로부터 분명히 비롯될 수 있다.

NF-κB 신호전달은 T 세포 및 TNFα에 의한 종양 세포 사멸을 제한한다

T 세포에 의한 MC38 세포의 사멸을 제한하는 데 있어서 NF-κB 경로에 대한 역할을 나타내는 스크린 데이터를 확인하기 위해, 3개의 중요한 NF-κB 경로 유전자(Map3k7/Tak1, Rbck1 및 Rela)를 스크린에서 고갈된 sgRNA를 사용하여 불활성화시켰다. 다중 sgRNA에 의한 Map3k7의 불활성화는 MC38 세포를 T 세포 사멸에 감작화하였고 상이한 sgRNA에 의한 Map3k7 단백질 고갈 정도는 감작화 정도와 상관관계가 있었으며, 이는 이들 효과가 표적에 있다는 것을 나타낸다(도 3, 파트 a 및 b). Map3k7 KO는 TNFα에 의한 NF-κB 표적 유전자 A20 및 ICAM-1의 유도를 상당히 억제하였으며, Map3k7 KO가 NF-κB 경로를 비활성화한다는 것을 확인하였다(도 3, 파트 e). Rbck1(도 15) 및 NF-κB 서브유닛 p65(Rela)(도 16)의 녹아웃시 T 세포 사멸에 대한 유사한 효과가 관찰되었으며, NF-κB 신호전달의 보호 효과를 추가로 검증한다.

중요하게는, 포화량의 TNFα 차단 항체의 존재 하에, Map3k7 KO(뿐만 아니라 Rbck1 및 Rela KO)는 T 세포에 의한 MC38 세포의 사멸을 더 이상 향상시키지 않았으며(도 3, 파트 c, 및 도 15 및 16), 이는 NF-κB 경로의 보호 효과가 (퍼포린/그랜자임-매개 사멸보다) TNFα-매개 세포자멸사의 억제를 반영한다는 것을 나타낸다. 이 가설과 일치하게, Map3k7, Rbck1 및 Rela의 KO는 TNFα-유도 카스파제-8 활성화 및 세포 사멸을 상당히 증가시켰다(도 3, 파트 d 및 e, 도 15 및 16). TNFα-의존적 세포자멸사에 대한 효과와 대조적으로, Map3k7 KO(뿐만 아니라 Rbck1 및 Rela KO)는 화학요법제인 독소루비신 및 파클리탁셀에 의한 MC38 세포의 사멸에 ㅎ효과가 없었으며, 이는 NF-κB 경로가 임의의 세포자멸사-유도 자극으로부터 이들 세포를 광범위하게 보호하지 않는다는 것을 나타낸다(도 3, 파트 f, 및 도 15 및 16).

자가포식은 T 세포 및 TNFα에 의한 종양 세포 사멸을 제한한다

T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한하는 데 있어서 자가포식에 대한 역할을 검증하기 위해, 이들 필수 자가포식 유전자(Rb1cc1, Atg9a 및 Atg12)를 스크린에서 고갈된 sgRNA를 사용하여 불활성화시켰다. 다중 sgRNA를 사용한 Rb1cc1(FIP200으로도 알려짐)의 불활성화는 MC38 세포를 T 세포 사멸에 감작화하였고 Rb1cc1 단백질 고갈 정도는 감작화 정도와 상관관계가 있었으며, 이들 효과가 표적에 있다는 것을 확인하였다(도 4, 파트 a 및 b). 유사한 결과가 Atg9a(도 17) 및 Atg12(도 18)의 KO에서 보여졌으며, 자가포식의 보호 역할을 추가로 검증하였다. 중요하게는, 이들 3가지 핵심 자가포식 구성요소의 녹아웃은 자가포식 화물 수용체 p62(시퀘스토좀 1; sqstm1로도 알려짐) 수준의 상당한 증가(도 5, 파트 a 및 도 17 및 18) 및 자가포식소체 단백질 LC3의 지질화된 형태인 LC3-II 수준의 감소(도 18)에 의해 입증된 바와 같이, MC38 세포에서 자가포식 활성을 실제로 손상시킨다. p62는 유비퀴틴화 단백질을 자가포식소체에 연결하고, 그 자체가 자가포식에 의해 분해되기 때문에, 자가포식이 억제될 때 그 수준이 증가한다. LC3-I은 포스파티딜에탄올아민과의 접합을 통해 LC3-II로 전환되어, 자가포식소체의 형성 및 연장을 개시한다. 따라서, 이 전환의 상류에서 자가포식의 억제는 LC3-II 형성을 억제할 것이다(Deretic, 2008).

자가포식은 다중 메커니즘, 예를 들어 외부 막 투과화 및 세포자멸사 캐스케이드를 촉발하는 것에 특히 민감할 수 있는 손상된 미토콘드리아를 제거하는 미토파지를 통해, 세포자멸사를 억제하는 것으로 제안되었다. 자가포식이 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한하는 메커니즘에 대한 통찰력을 획득하려는 목적으로 일련의 실험을 수행하였다. 자가포식의 유전적 불활성화는 세포 표면 MHC-I 발현 또는 MC38 세포에서 Ova 펩티드의 제시에 거의 또는 전혀 효과가 없었다(도 23).

도 4, 파트 c에 나타낸 바와 같이, Rb1cc1 KO는 TNFα 차단 항체의 존재 하에 MC38 세포 사멸에 작은 효과만 있었으며, 이는 T 세포 사멸의 맥락에서 자가포식의 보호 효과가 주로 TNFα-의존적 세포자멸사의 억제를 통해 매개된다는 것을 나타낸다. 유사한 결과가 Atg9a 및 Atg12 KO 세포에서 나타났다(도 17 및 18). 이들 관찰과 일치하게, Rb1cc1, Atg9a 또는 Atg12의 KO는 TNFα-의존적 카스파제 8 활성화 및 세포자멸사를 상당히 증가시켰다(도 4, 파트 d, 도 5, 파트 a, 및 도 17 및 18). 따라서, 자가포식은 카스파제 8 활성화 수준에서(임의의 미토콘드리아 관여의 상류), TNFα 신호전달 캐스케이트의 초기 단계를 조절하는 것으로 보인다. 이 설정에서 자가포식의 특정 신호전달 기능과 일치하게, 자가포식 유전자의 KO는 MC38 세포를 화학요법제인 독소루비신 또는 파클리탁셀에 의한 사멸에 감작화하지 않았다(도 4, 파트 e, 도 17 및 18).

NF-κB 및 자가포식 경로 둘 다가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한한다는 것을 고려하면, 이들 경로 사이의 가능한 기계적 연결 여부를 조사하였다. 한 가지 가능성은 자가포식의 불활성화가 어떻게든 NF-κB 신호전달의 결함을 초래하여, TNFα-매개 세포자멸사에 감작화한다는 것이다. 그러나, 자가포식 유전자 Rb1cc1의 KO는 Iκ-Bα의 TNFα-매개 분해, NF-κB 표적 유전자 A20의 유도 또는 발현을 위해 NF-κB를 필요로 하는 여러 케모카인(예를 들어, CXCL10 및 CCL2)의 유도에 영향을 미치지 않았다(도 5, 파트 b, 도 20). 따라서, 자가포식은 NF-κB 활성화에 필요한 역할의 결과로서 MC38 세포에서 TNFα-매개 세포자멸사를 제한하지 않는다. 반대로, 자가포식 수용체 p62의 수준은 Map3k7 KO에 의해 영향받지 않았으며(도 5, 파트 c), 이는 온전한 NF-κB 경로가 자가포식 활성에 필요하지 않다는 것을 시사한다.

다음으로, 자가포식이 억제될 때 TNFα가 세포를 사멸시키는 메커니즘을 탐구하였다. Rb1cc1의 불활성화가 TNFα-유도 카스파제-8 활성화를 증가시킨다는 관찰은 손상된 자가포식 경로의 맥락에서, TNFα가 세포예정괴사보다는 세포자멸사를 통해 세포를 사멸시킨다는 것을 시사한다. 이 주장을 뒷받침하기 위해, pan-카스파제 억제제는 Rb1cc1 KO 세포에서 TNFα-매개 사멸을 차단한 반면(도 5, 파트 d), 괴사 억제제는 효과가 없었다(도 5, 파트 h). 이들 관찰에 따르면, TNFα는 Rb1cc1 KO 세포에서 세포예정괴사의 매개자인 혼합 계통 키나제 도메인-유사 단백질(MLKL)의 인산화를 유도하지 않았다(도 5, 파트 i).

TNFα-유도 세포자멸사는 키나제 RIPK1의 관여에 의해 구별된 다중 분자 메커니즘을 통해 발생할 수 있다. 자가포식 억제의 맥락에서 TNFα 신호전달의 유전적 해부를 가능하게 하기 위해, 지질 키나제 Vps34의 선택적 소분자 억제제인 오토피닙을 이용하였다. 이는 자가포식소체 형성에 필수적이다. MC38 세포를 오토피닙으로 처리하는 것은 TNFα-매개 카스파제-8 활성화 및 사멸을 증가시켰다(그리고 p62의 수준이 상당히 증가하여, 자가포식 차단을 확인함) (도 5, 파트 e 및 f). 중요하게는, 오토피닙은 Iκ-Bα의 TNFα-매개 분해에 영향을 미치지 않았으며(도 5, 파트 f), 이는 손상된 자가포식이 NF-κB 경로에서 결함을 야기하지 않았다는 것을 나타낸다(상기 제시된 Rb1cc1 KO 데이터와 일치).

세포가 TNFα-유도 사멸을 제한하는 것을 통한 한 가지 중요한 메커니즘은 RIPK1의 세포자멸사 활성의 억제라는 것이 잘-확립되어 있다. TNFR1 신호전달 경로에서 이러한 "초기 체크포인트"에 기여하는 분자 이벤트 중에는 cIAP에 의한 RIPK1의 유비퀴틴화가 있다. 따라서, Smac 모방체를 사용한 cIAP 기능의 억제는 FADD/RIPK1/카스파제-8 의존적 세포자멸사를 촉진한다(도 2, 파트 a의 모델 참조). 이 모델과 일치하게, Ripk1, Fadd 또는 Tnfrsf1a의 CRISPR-매개 불활성화는 Smac 모방체의 존재 하에 TNFα에 의한 사멸을 상당히 감소시켰다(도 5, 파트 g). 그러나, Ripk1, Tnfrsf1a 또는 Fadd의 불활성화가 또한 오토피닙의 존재 하에 TNFα에 의한 사멸을 상당히 감소시켰지만, Ripk1의 불활성화는 효과가 없었다(도 5, 파트 g). 따라서, 자가포식이 손상된 세포에서, TNFα-유도 세포자멸사는 FADD/카스파제-8 의존적이지만 RIPK1 독립적이며, 이는 TNFR1 신호전달 경로에서 초기 체크포인트가 기능적으로 남아있다는 것을 시사한다. 따라서, 자가포식은 FADD/카스파제-8 복합체의 형성 및/또는 활성을 제한함으로써 TNFα-유도 세포자멸사를 억제하고 RIPK1 활성을 제한함으로써 억제하지 않는 것으로 보인다. 자가포식의 불활성화는 TNFR1, TRADD(TNFR1-연관 사멸 도메인 단백질), 또는 FADD의 총 단백질 수준에 영향을 미치지 않았으며, 이는 TNFα-유도 세포자멸사의 강화작용이 이들 핵심 경로 구성요소의 상향된 수준에 의해 단순히 구동되지 않는다는 것을 나타낸다(도 24).

NF-κB 및 자가포식 경로 둘 다가 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 제한한다는 것을 고려하면, 이들 경로 사이의 가능한 기계적 연결을 조사하였다. 한 가지 가능성은 자가포식의 불활성화가 NF-κB 신호전달에서 결함을 초래하여, TNFα-매개 세포자멸사에 감작화한다는 것이다. 그러나, Rb1cc1의 KO는 Ik-Bα의 TNFα-매개 분해, NF-κB 표적 유전자 A20의 유도, 또는 발현을 위해 NF-κB를 필요로 하는 여러 케모카인(예를 들어, CXCL10 및 CCL2)의 유도에 영향을 미치지 않았다(도 4g 및 도 20). 따라서, 손상된 자가포식은 결함이 있는 NF-κB 활성화를 초래하지 않는다. 반대로, 자가포식 수용체 p62의 수준은 Map3k7 KO에 의해 영향받지 않았으며(도 4h), 이는 온전한 NF-κB 경로가 자가포식 활성에 필요하지 않다는 것을 시사한다.

TRAIL은 2개의 TNFRSF 패밀리 수용체인 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2의 활성화를 통해 세포자멸사를 촉진한다. 자가포식이 또한 TRAIL-R의 하류에 있는 세포자멸사 신호전달을 제한할 수 있는지를 결정하기 위해, 암 세포를 오토피닙의 부재 또는 존재 하에 TRAIL로 시험 감염시켰다. 도 21, 파트 a-c에 나타낸 바와 같이, 인간 암 세포에서 카스파제-8의 활성화 및 TRAIL에 의한 세포자멸사 유도는 자가포식가 차단되었을 때 증가하였으며, 이는 자가포식이 다중 사멸 수용체에 의한 세포자멸사 신호전달을 제한할 수 있다는 것을 시사한다(아마도 TNFα 및 TRAIL 둘 다에 의한 세포자멸사의 유도에 필수적인 FADD/카스파제-8 복합체의 활성에 대한 효과를 통해). 자가포식 억제는 MC38 세포를 TRAIL에 감작화하였지만, 이들 세포는 TNFα에 의해 훨씬 더 효과적으로 사멸된다(도 21, 파트 a-f).

종양 세포 mTOR 신호전달은 T 세포/TNFα-매개된 사멸에 대한 감수성을 증가시킨다

mTOR 경로에서 유전자를 표적화하는 다중 sgRNA(예를 들어, Mlst8, Mtor, Rictor, Mapkap1)가 스크린에서 풍부화되었으며, 이는 mTOR 신호전달이 효율적인 종양 세포 사멸에 필요하다는 것을 시사한다. mTOR 경로는 영양소 수준 및 성장 인자를 세포 성장 및 증식에 연결하는, 세포 대사의 필수 조절자이다. 세포 성장을 촉진하는 역할과 일치하게, mTOR 신호전달은 다중 메커니즘을 통해 자가포식 활성을 억제한다. 자가포식의 보호 역할에 대한 발견을 고려하면, mTOR는 자가포식의 억제를 통해 T-세포 매개 사멸에 대한 종양 세포 감작성을 증가시킬 수 있다는 것으로 보인다.

스크린 결과를 확인하기 위해, Mlst8(mTOR 신호전달 복합체인 mTORC1 및 mTORC2 둘 다의 필수 구성요소)을 스크린에서 풍부화된 sgRNA를 사용하여 불활성화하였다. Mlst8의 불활성화는 감소된 포스포-S6(mTORC1-의존적) 및 감소된 포스포-Akt 수준(mTORC2-의존적)에 의해 입증된 바와 같이 mTORC1 및 mTORC2 활성을 둘 다 억제하였다(도 6a). mTOR 신호전달에 의한 자가포식의 억제와 일치하게, Mlst8 KO 세포는 감소된 p62 수준을 나타내었으며, 증가된 자가포식 활성을 확인하였다(도 6, 파트 a). Mlst8 KO 세포에서 상승된 자가포식은 TNFα- 및 T 세포-매개 사멸 둘 다에 대한 감수성 감소와 연관되었다(도 6, 파트 b 및 c). 중요하게는, 종양 세포 사멸에 대한 각 Mlst8 sgRNA 효과의 규모는 Mlst8 단백질 고갈 정도와 상관관계가 있으며(도 6, 파트 a), 이들 효과가 표적에 있다는 것을 확인하였다. 종양 세포 사멸에 대한 mTOR 경로의 영향을 추가로 예시하기 위해, mTORC1 신호전달을 라파마이신으로 차단하여, 감소된 포스포-S6 및 p62 수준을 초래하였다(상승된 자가포식 활성 확인함) (도 6, 파트 d). Mlst8 KO와 유사하게, 라파마이신으로 mTORC1의 억제는 TNFα- 및 T 세포-매개 사멸을 둘 다 상당히 감소시켰다(도 6, 파트 e 및 f).

mTOR 조절 효과에 대한 이러한 발견은 종양 세포에서 보호 메커니즘으로서 자가포식의 중요성을 추가로 뒷받침한다. 스크린에서 식별된 다양한 신호전달 경로에 의한 T 세포-매개 종양 세포 사멸의 조절을 도시하는 다이어그램은 도 6, 파트 g에 제시된다.

자가포식은 T 세포- 및 TNFα-매개된 사멸로부터 다양한 계통의 암 세포를 보호한다

자가포식의 보호 역할에 대한 발견을 확장하기 위해, 오토피닙 및 또 다른 Vps34 차단제인 SAR405를 사용하여, 암 세포주의 패널에서 자가포식 억제의 효과를 평가하였다. 오토피닙 및 SAR405는 둘 다 Vps34를 표적하지만, 이들 억제제는 구조적으로 구별되고 따라서 상이한 표적외 효과를 가질 가능성이 있다. 자가포식 억제제 둘 다는 기준선에서 TNFα에 대한 감수성을 나타내지 않는 세포주를 포함하여, 상이한 계통(예를 들어, 결장, 유방, 폐)의 다중 마우스 및 인간 암 세포주에서 TNFα에 의한 사멸을 상당히 증가시켰다(도 7, 파트 a, 도 22). 자가포식 억제제는 p62 수준을 상당히 증가시켰고(자가포식 차단 확인) 인간 유방암 세포에서 카스파제-8의 TNFα-유도 활성화를 향상시켰다(도 7, 파트 b). 따라서, TNFα 처리의 맥락에서 자가포식에 대한 보호 역할은 광범위하게 관련이 있는 것으로 보인다.

지금까지 T 세포가 활성화될 때 표적 세포 상의 MHC 클래스 I/펩티드 복합체에 의한 T 세포 수용체의 진입기전(engagement)을 통해 TNFα가 종양 세포 사멸에 기여하는 것으로 나타났다. 이러한 조건 하에, 종양 세포 자가포식은 상당한 보호 역할을 하는 것으로 나타났다. 발견의 잠재적인 임상적 관련성을 추가로 뒷받침하기 위해, 자가포식이 또한 CD3 이중특이적 항체로 자극 후 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 조절하는지를 요청하였다. 새롭고 유망한 치료 클래스인 이들 항체는 한쪽 아암으로 종양 항원에 결합하고 다른쪽 아암으로 T 세포 상의 CD3에 결합함으로써, 종양 세포 및 세포독성 T 세포를 가교하여 종양 세포 사멸을 가능하게 한다(도 7, 파트 c). 유방 종양 항원 x CD3 이중특이적 항체(Regeneron에서 생성됨)를 이용하여 인간 T 세포에 의한 ZR-75-1 인간 유방암 세포의 사멸을 촉진하였다. 도 7, 파트 c에 나타낸 바와 같이, SAR-405로 자가포식의 억제는 종양 세포 사멸을 상당히 증가시켰다. 자가포식의 약리학적 차단 효과와 일치하게, Rb1cc1 KO를 통한 자가포식의 유전적 불활성화는 CD3 이중특이적 항체-유도 사멸을 향상시켰다(도 7, 파트 d 및 e). 종합하면, 이러한 발견은 CD3 이중특이적 항체에 의해 유도된 T 세포 사멸의 맥락에서 자가포식의 보호 역할 및 인간 유방암 세포에서 자가포식의 보호 역할을 확인한다.

자가포식의 유전적 불활성화는 종양을 면역요법에 감작화한다

발견의 임상적 관련성을 추가로 평가하기 위해, 자가포식의 유전적 불활성화가 T 세포 체크포인트 억제제에 대한 종양의 반응성을 증가시키는지를 요청하였다. EMT6 마우스 유방암 세포에서 Rb1cc1의 KO는 p62 단백질 수준에서 실질적인 증가를 초래하였으며, 자가포식 활성의 감소(도 8, 파트 a), 및 TNFα-유도 세포자멸사에 대한 EMT6 세포의 감수성 증가(도 8, 파트 b)를 확인하였다. 대조군 또는 Rb1cc1 KO 세포를 마우스에 이식하고 이식 3일 후, 마우스를 대조군 항체 또는 PD-1 + CTLA4 차단 항체의 조합으로 처리하였다. 도 8, 파트 c에 나타낸 바와 같이, PD-1 + CTLA4의 조합된 차단은 대조군 EMT6 종양에 대한 약간의 성장 억제 효과만을 가지면서 Rb1cc1 KO 종양의 완전 관해를 촉진하였다. 개별 종양 성장 곡선은 10/10 Rb1cc1 KO 종양이 대조군 종양의 0/10과 비교하여 완전히 관해되었음을 나타낸다(도 8, 파트 d).

MC38 종양을 사용한 유사한 실험을 다음과 같이 수행하였다. 도 8, 파트 e에 나타낸 바와 같이, MC38 세포에서 Rb1cc1의 KO는 p62 단백질 수준의 상당한 증가에 의해 입증된 바와 같이, 손상된 자가포식을 초래하였다. PD-1 + CTLA4의 조합된 차단은 대조군 MC38 종양의 성장을 감소시켰지만, Rb1cc1 KO 종양에 대한 체크포인트 차단의 효과는 상당히 더 컸다(도 8, 파트 f). 면역요법에 대한 반응으로 대조군 종양에 비해 Rb1cc1 KO 종양의 지연된 성장은 개별 종양 성장 곡선이 도 8, 파트 g)에 나타낸 것으로부터 용이하게 명백하다. 종합하면, 이러한 발견은 자가포식이 손상된 종양이 임상적으로-관련된 T 세포 체크포인트 억제제에 대한 증가된 반응성을 나타낸다는 것을 보여준다.

Rb1cc1 KO 종양의 맥락에서 Tnfrsf1a(TNFR1 암호화) KO의 효과를 테스트하였다. 본원에 개시된 바와 같이, Rb1cc1 KO 세포에서 관찰된 증가된 TNFα-매개 세포자멸사는 Rb1cc1/Tnfrsf1a 이중 KO EMT6 세포에서 역전되었다(도 8, a 및 b). Tnfrsf1a의 생체내 유전적 불활성화는 Rb1cc1 KO 종양에서 관찰된 면역요법에 대한 감작화를 제한하였다(도 8, c 및 d). 따라서, 자가포식이 손상된 종양의 맥락에서, Tnfrsf1a KO는 보호적이다. 자가포식이 온전한 대조군 종양에서, Tnfrsf1a KO는 면역 체크포인트 차단으로부터 종양을 보호하지 않지만 실제로 치료에 감작화한다(도 8c). Tnfrsf1a KO는 맥락 의존적 방식으로 종양에 영향을 미치는 것이 자명하다. 그럼에도 불구하고, 데이터는 손상된 종양 세포 자가포식 설정에서, TNFα-유도 세포자멸사가 항종양 면역의 중요한 구성요소임을 나타낸다.

Rb1cc1 KO 종양 내로의 백혈구 침윤을 평가하였다. EMT6 및 MC38 모델 둘 다에서, Rb1cc1 KO 종양은 대조군 종양과 비교하여, 상승된 수의 CD45+ 백혈구를 가졌다(도 26). 그러나, 전반적인 백혈구 침윤이 증가되었지만, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 우선적 침윤은 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고, T 세포-매개 사멸에 대한 증가된 백혈구 침윤 및 증가된 감수성이 둘 다 자가포식-손상된 종양 모델에서 관찰된 면역요법에 대한 향상된 반응에 기여하는 것은 여전히 가능하다.

게놈-규모 CRISPR 스크린을 사용하여 T 세포-매개 사멸의 중요한 구성요소로서 종양 세포 TNFα 신호전달을 식별하고, 반대로, NF-κB 및 자가포식 경로 둘 다에 대한 보호 역할을 식별하였다. 본원에 제시된 데이터는 자가포식이 미토콘드리아 관여인, 카스파제-8 활성화의 억제를 통해 TNFα에 의한 종양 세포 사멸을 제한한다는 것을 나타낸다. 보다 구체적으로, 자가포식은 FADD/카스파제-8 복합체의 형성 및/또는 활성을 억제하는 것으로 보이며, 이는 자가포식이 TRAIL에 의한 종양 세포 사멸을 제한할 수 있으며, FADD/카스파제-8을 통해 세포독성을 유도한다는 관찰과 일치한다.

이러한 생체내 연구는 종양 세포에서 자가포식의 유전적 불활성화가 T 세포 체크포인트 억제제의 효능을 향상시킨다는 것을 나타내며, 이는 자가포식의 약리학적 억제가 또한 이러한 치료의 효능을 향상시킬 수 있다는 것을 시사한다. 암에서 자가포식의 역할은 광범위하게 연구되었지만, 종양 세포의 성장/생존에 있어서 과정이 얼마나 중요한지는 불분명하게 남아있다. 그럼에도 불구하고, 본원에 제시된 데이터는 종양 세포 성장의 잠재적 조절과는 별도로, 자가포식 억제제가 암 세포를 TNFα-유도 세포자멸사에 감작화할 수 있다는 것을 나타낸다.

요약하면, 본원에 제시된 분석은 T 세포-매개 사멸에 대한 종양 세포 감작성을 제한하는 자가포식의 역할을 알아내었다. 종양 면역 탈출의 잠재적 메커니즘으로서 자가포식의 식별은 자가포식 억제제가 T 세포-유인 면역요법의 효능을 향상시킬 수 있다는 가능성을 시사한다. 더욱이, 본원에 제공된 데이터는 자가포식이 미토콘드리아 관여의 상류인 카스파제-8 활성화의 억제를 통해 T 세포 및 TNFα에 의한 종양 세포 사멸을 제한한다는 것을 나타낸다. 또한, 자가포식의 억제는 종양 세포를 화학요법-유도 세포자멸사에 감작화하지 않았으며, 이는 보다 일반적인 항-세포자멸사 기능(예를 들어, 미토파지)보다 TNFα 신호전달의 조절에서 자가포식에 대한 상대적으로 특정한 역할을 시사한다. 따라서, 본원에 제공된 데이터는 자가포식 억제제의 신규한 치료 용도, 즉, 암 세포가 성장/생존을 위한 자가포식에 의존적이지 않은 경우에도, 암 세포를 T 세포 사멸에 더 민감하게 만드는 것을 시사한다.

재료 및 방법

암 세포주

MC38 마우스 결장암 세포는 미국 국립보건원(NIH) 저장소로부터 수득하였다. 4T1, B16F10, CT26, EMT6, 및 L929 마우스 암종 세포 및 ZR75-1, HCT-116, HeLa, BT- 20, Me-180, 및 MDA-MB-361 인간 암종 세포 뿐만 아니라 인간 배아 신장(HEK) 293T 인간 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 수득하였다. Colon26 마우스 암종 세포는 미국 국립암연구소 산하 암 치료 및 진단과(Charles River Laboratories에서 운영)로부터 수득하였다. 모든 세포는 제조업체의 권장 배지에서 배양하였다. 모든 세포주는 2016년에 짧은 탠덤 반복 프로파일링(IDEXX BioResearch)에 의해 인증되었다.

마우스

OT-1 C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J 마우스(003831), C57BL/6 마우스(000664) 및 Balb/c 마우스(000651)는 Jackson Laboratory로부터 수득하였다.

CRISPR 녹아웃 sgRNA 라이브러리 및 게놈-규모 스크린

마우스 sgRNA 라이브러리(GeCKO A 및 B; 총 ~130,000개 sgRNA) 및 pLentiCas9-Blast 플라스미드를 GenScript로부터 구입하였다. 게놈-전체 CRISPR/Cas9 스크린을 렌티바이러스 감염(pLentiCas9-Blast) 및 블라스티시딘(12 μg/ml)을 사용한 선택에 의해 Cas9 뉴클레아제를 발현하도록 조작된 MC38 세포를 사용하여 수행하였다. MC38-Cas9 세포를 각 sgRNA가 ~200개 세포 내에 도입되도록 0.3의 감염 다중도로 마우스 GeCKO 라이브러리(A 및 B 조합)로 형질감염시켰다. 세포를 12 μg/ml 퓨로마이신으로 3일 동안 선택하고 대략 1억 3000만개 세포를 참조 대조군 샘플로서 따로 설정하였다. 감염 7일 후, T 세포 사멸 검정을 삼중으로 설정하였다. ~2000x 라이브러리 표상에서 라이브러리 조작된 세포를 Ova 펩티드로 펄스하고 ~200x 라이브러리 표상에서 세포를 대조군 펩티드로 펄스하였다. 펩티드 펄싱 후, 세포를 활성화된 CD8⁺ T 세포(OT-1 마우스로부터 단리)와 1:3의 E:T 비율로 공배양하였다. 공배양 24 시간 후, 종양 세포의 ~90%가 사멸되었을 때, 비-부착 세포를 PBS로 세척 제거하고 살아있는 종양 세포를 수확하였다. 게놈 DNA 추출을 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 후속적으로 수행하고 NGS 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. NGS 라이브러리를 후속적으로 다중화하고 NextSeq 500(Illumina)에서 실행하여 80개 염기쌍(bp) 단일-단부 판독을 생성하였다. bcl2fastq 소프트웨어(Illumina)로 역다중화 후, 판독을 sgRNA에 인접한 16 bp 벡터 서열에 대해 스크리닝하고 하류 20 bp sgRNA 판독을 sgRNA 계수를 위해 추출하였다. 후속적으로, MAGeCK를 사용하여 판독을 계수하고 유전자/sgRNA 풍부화 및 통계 분석을 수행하였다. T 세포 첨가 없이 성장한 MC38 세포를 감염 1주 후에 수확하여 sgRNA 표상을 참조 대조군 세포의 것과 비교하였다.

검증 실험에 사용된 sgRNA 서열(유전자명, sgRNA ID, 적용가능한 경우 sgRNA 번호 및 서열)은 다음과 같았다(개별 sgRNA는 pLenti-Guide-Puro 또는 pLentiCRISPR v2 플라스미드 내에 클로닝됨): Map3k7, MGLibA_30286, 1, GATGATCGAAGCGCCGTCGC (서열번호: 16); Map3k7, MGLibA_30288, 3, GGGACTTACTGGATTCAGGC (서열번호: 18); Map3k7, MGLibB_30278, 5, TTAACTCAGGTTGTCGGAAG (서열번호: 20); Rbck1, MGLibA_44718, 1, AGTACGCCCGGATATGACAG (서열번호: 22); Rbck1, MGLibA_44720, 3, CAGCTTACCGGTGGTGACTC (서열번호: 24); Rbck1, MGLibB_44706, 5, CGGGCGTACTGTGAGCCAAA (서열번호: 26); Rela, MGLibA_45073, 2, TCATCGAACAGCCGAAGCAA (서열번호: 29); Rela, MGLibA_45074, 3, GCCCAGACCGCAGTATCCAT (서열번호: 30); Rela, MGLibB_45061, 6, ACTTACCTGAGGGAAAGATG (서열번호: 33); Rb1cc1, MGLibA_44690, 3, TCAAGATAGACCCAATGATG (서열번호: 36); Rb1cc1, MGLibB_44675, 4, CTCCATTGACCACCAGAACC (서열번호: 37); Rb1cc1, MGLibB_44676, 5, ATTTGAACAGTCCTCCAGAT (서열번호: 38); Atg9a, MGLibA_05661, 1, CATAGTCCACACAGCTAACC (서열번호: 40); Atg9a, MGLibA_05662, 2, TTGGGATCCGAAGAGCATGT (서열번호: 41); Atg9a, MGLibB_05661, 4, TCTATAACATTTGCTGCTAT (서열번호: 43); Atg12, MGLibA_05621, 3, GAGCGAACCCGGACCATCCA (서열번호: 48); Atg12, MGLibB_05620, 5, CCTGCATTACTGCAAATCCC (서열번호: 50); Atg12, MGLibB_05621, 6, TTCTGGCTCATCCCCATGCC (서열번호: 51); Tnfrsf1a, MGLibA_55116, GTGTCTCACTCAGGTAGCGT (서열번호: 52); Ripk1, MGLibA_45635, 3, GTACACGTCCGACTTCTCCG (서열번호: 53); Fadd, MGLibA_16988, 2, TAGATCGTGTCGGCGCAGCG (서열번호: 54); B2M, MGLibA_06111, 1, AGTATACTCACGCCACCCAC (서열번호: 55); Rb1cc1, HGLibB_40366, 6, GGCTGCAATCATGGCCAACC (서열번호: 56); Mlst8, MGLibA_31480, 1, GACTCCGTCATAACTGATGA (서열번호: 57); Mlst8, MGLibA_31482, 3, CGAAGCATGATTGCTGCTGC (서열번호: 58); Mlst8, MGLibB_31471, 4, AGCACTCACGGCACTATTGA (서열번호: 59).

렌티바이러스 패키징/형질도입 및 CRISPR-매개된 유전자 녹아웃

검증 실험을 위해, 관심 유전자를 표적화하는 sgRNA를 pLenti-Guide-Puro 또는 pLentiCrispr v2(GenScript) 내에 클로닝하였다. HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 pLenti-Cas9-Blast 또는 pLenti-Guide-Puro 또는 pLentiCrispr v2 및 패키징 플라스미드 psPAX 및 pMD2.G로 형질감염시켰다. 6 시간 후, 배지를 완전 성장 배지로 교체하였다. 72 시간 후, 렌티바이러스-함유 상청액을 수확하고, 여과하고, 초원심분리에 의해 농축하고 -80℃에서 저장하였다. 렌티바이러스 형질도입을 위해, 종양 세포를 0.3의 MOI에서 5 ug/ml 폴리브렌 및 렌티바이러스를 함유하는 완전 배지에 시딩하였다. 마우스 GeCKO A 및 B 플라스미드 라이브러리를 풀링하고 라이브러리 표상을 유지하기 위해 충분한 수의 HEK293T 세포를 사용하여, 동일한 방식으로 렌티바이러스 내에 패키징하였다. 24 시간 후, 배지를 Dnase를 함유하는 완전 성장 배지로 교체하고 렌티바이러스를 상기와 같이 농축하였다.

CD8+ T 세포의 단리 및 활성화

CD8⁺ T 세포를 6-8주령 암컷 OT-1 마우스의 비장 및 림프절로부터 단리하였다. 이들 마우스는 마우스 Tcra-V2 및 Tcrb-V5 유전자에 대한 유전자이식 삽입물을 함유한다. 유전자이식 T 세포 수용체를 H-2Kb MHC 클래스 I 단백질의 맥락에서 오브알부민 펩티드 잔기 257-264를 인식하도록 설계하였다. 일부 실험에서, 인간 CD8+ T 세포를 PBMC로부터 단리하였다. T 세포를 2-3일 동안 1:2 비드:세포 비율로 CD3/CD28 비드와 함께 시험관 내에서 활성화시켰다. T 세포를 20 ng/ml 마우스 IL-2, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청, 20 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.05 mM 2-메르캅토에탄올 및 50 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 활성화시켰다. CD3 이중특이적 항체를 사용한 인간 종양 세포 사멸 실험을 위해, 인간 T 세포를 Dynabeads 비접촉 인간 T 세포 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(ReachBio)로부터 단리하였다.

시험관내 세포독성 검정

MC38 세포를 24 웰당 34,000개 세포로 시딩하고 시딩 24 시간 후 1 ng/ml Ova 또는 스크램블된 펩티드로 펄스하였다. 펄스된 세포를 활성화된 CD8⁺ T 세포(OT-1 마우스로부터 단리)와 지시된 E:T 비율로 배양하였다. 24 시간 후, 비-부착 종양 세포를 PBS로 세척 제거하고 세포 생존력을 평가하였다. 지시된 경우, 중화 TNFα 항체 또는 이소형 대조군 항체를 10 또는 20 μg/ml의 농도로 첨가하였다.

인간 ZR-75-1 세포를 24 웰당 100,000개 세포로 시딩하였다. 24 시간 후, 세포를 5 μM 자가포식 억제제 SAR-405의 부재 또는 존재 하에 12 ng/ml 유방 종양 항원 x CD3 또는 대조군(ZR-75-1 세포에 결합하지 않음) 이중특이적 항체의 존재 하에 활성화된 CD8⁺ T 세포(인간 PBMC로부터 단리)와 24 시간 동안 지시된 E:T 비율로 배양하였다.

세포 생존력에 대한 TNFα, TRAIL, 독소루비신 또는 파클리탁셀의 효과를 지시된 농도로 24 시간 인큐베이션 후 평가하였다. TNFα(10 ng/ml) 또는 TRAIL(10 ng/ml 또는 50 ng/ml) 유도 사멸에 대한 5 μM 오토피닙 또는 SAR-405의 효과를 달리 지시되지 않는 한 24 시간 인큐베이션 후 평가하였다. 모든 경우에, 세포 생존력을 CCK8 세포 계수 키트-8(CCK-8) 시약을 사용하여 측정하였으며, 이는 세포에서 탈수소효소 활성에 의해 환원되어 황색 포르마잔 염료(Dojindo)를 제공한다. 흡광도는 SpectraMax M3 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다.

종양 이종이식편 연구

EMT6 이종이식편 실험을 위해, 5 x 10⁶개 세포를 6- 내지 8-주령 암컷 BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 이식 3일 후, 마우스를 CTLA-4 + PD-1 차단 항체 또는 이소형 대조군(n = 그룹당 10 마리 마우스)으로 처리하였다. 처리 첫날에, CTLA-4 + PD-1 차단 항체(5 mg/kg)를 복강내 주사에 의해 투여하였다. 처리 3 및 6일에, CTLA-4 항체(2.5 mg/ kg)를 투여하였다. 4, 8, 11, 및 15일에, 5 mg/kg의 PD-1 항체를 투여하였다. 종양 성장을 캘리퍼를 사용하여 주당 3회 모니터링하고, 종양 부피(mm3)를 다음 공식을 사용하여 추정하였다: 1/2 x 길이 x 너비².

MC38 이종이식편 실험을 위해, 3 x 10⁵개 세포를 6- 내지 8-주령 암컷 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 이식 10일 후, 종양 부피가 ~70 mm3였을 때, 마우스를 무작위화하고 상기 기재된 바와 같은 CTLA-4 + PD-1 차단 항체 또는 이소형 대조군으로 처리하였다(n = 그룹당 7 내지 12마리 마우스). CRISPR-조작된 세포를 사용한 종양 실험의 경우, Cas9 단백질 및 sgRNA를 리보핵단백질의 일시적 형질감염을 통해 세포에 전달하여 렌티바이러스 변형과 연관된 증가된 면역원성을 극복하였다. sgRNA 서열은 다음과 같았다: Rb1cc1 KO의 경우, CUCCAUUGACCACCAGAACC; Tnfrsf1a KO의 경우, UUCUCCCGGUCACCAAG; 및 비표적화의 경우, AAAUGUGAGAUCAGAGUAAU. 형질감염 후, 클론을 단리하고 유전자 KO에 대해 테스트하였다. MC38 세포의 경우, 8개 KO 클론의 풀을 종양 연구에 사용하였고, EMT6 세포의 경우, 4개 KO 클론의 풀을 사용하였다.

항체 및 시약

PD-1 차단 항체(클론 RMP1-14) 및 래트 IgG2a 이소형 대조군 항체는 BioXCell로부터 수득하였다. 이소형 IgG2a가 있는 CTLA4 차단 항체(클론 9D9)의 자체 제조 버전을 공개된 1차 서열을 사용하여 생성하였다. CD3 이중특이적 항체를 이전에 기재된 방법을 사용하여 Regeneron에서 생성하였다(Murphy 등, 2014; Smith 등, 2015). 마우스-반응성 TNFα 중화 항체(클론 MP6-XT22) 및 래트 IgG1 이소형 대조군 항체는 Biolegend로부터 수득하였다. 인간-반응성 TNFα 중화 항체(클론 MAB1) 및 마우스 IgG1 이소형 대조군 항체는 Biolegend로부터 수득하였다. 재조합 마우스 및 인간 TNFα 및 IFNγ는 PeproTech로부터 수득하였다. 재조합 인간 TRAIL은 Enzo로부터 수득하였다. Z-VAD-FMK pan-카스파제 억제제는 InvivoGen으로부터 수득하였다. Ova SIINFEKL(257-264) 펩티드 및 스크램블된 대조군 펩티드 FILKSINE(257-264)는 AnaSpec으로부터 수득하였다. EasySep 마우스 CD8⁺ T 세포 단리 키트는 Stemcell로부터 수득하였다. Dynabeads 마우스 T-활성인자 CD3/CD28 비드는 ThermoFisher로부터 수득하였다. Dynabeads 비접촉 인간 CD8 T 세포 키트는 ThermoFisher로부터 수득하였다. 인간 PBMC는 ReachBio로부터 구입하였다. 마우스 사이토카인 검정 패널 A는 R&D 시스템으로부터 수득하였다. 프로테아제/포스파타제 억제제 및 BCA 시약은 ThermoFisher로부터 수득하였다. 오토피닙은 Biovision으로부터 수득하였고, SAR-405는 MedChemExpress로부터 수득하였고 LCL-161(Smac 모방체)은 Selleckchem으로부터 수득하였다. Nec-1은 BioVision으로부터 수득하였다. Cas9 단백질 및 트루가이드(trueguide) 합성 gRNA는 ThermoFisher로부터 수득하였다. 독소루비신 및 파클리탁셀은 Selleckchem으로부터 수득하였다.

면역블롯팅

전체 세포 용해물을 5% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액(ThermoFisher)에서 제조하였다. 웨스턴 블롯팅을 트리스-글리신 폴리아크릴아미드 SDS 겔(ThermoFisher) 및 PVDF 막(BioRad)을 사용하여 통상적인 기술에 의해 수행하였다. 블롯을 TBS 중 5% 분유 및 0.5% Tween-20에서 차단한 다음 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 2차 항체를 첨가한 후, 막을 SuperSignal West Pico Plus 또는 Femto 기질(ThermoFisher)과 함께 인큐베이션하고 발광을 C300 이미저(Azure Biosystems)로 캡쳐하였다. TAK1, Rbck1, RelA p65, Rb1cc1, Atg12, 절단된 카스파제-8, 프로카스파제-8, RIPK1, RIPK1 포스포-Ser321, RIPK1 포스포-Ser166, Iκ-Bα, A20, p62, 포스포-p65, LC3B, TNFR1(CST), Atg9a(Novus), cIAP1(Enzo), β2M(ThermoFisher), FADD 및 ICAM(Abcam)에 대한 1차 항체를 사용하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 β-액틴 항체 및 마우스 IgG, 토끼 IgG 및 염소 IgG에 대한 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 수득하였다.

종양 이종이식편 연구. 렌티바이러스 벡터로 세포를 변형시키는 것과 연관된 증가된 면역원성을 극복하기 위해, Cas9 단백질 및 sgRNA를 리보핵단백질의 일시적 형질감염을 통해 세포에 전달하였다. Rb1cc1 KO에 사용된 sgRNA 서열은 CUCCAUUGACCACCAGAACC였고 비-표적화 sgRNA 서열은 AAAUGUGAGAUCAGAGUAAU였다. 형질감염 후, 클론을 단리하고 유전자 녹아웃에 대해 테스트하였다. MC38 세포의 경우, 8개 KO 클론의 풀을 종양 연구에 사용하였고 EMT6 세포의 경우 4개 KO 클론의 풀을 사용하였다.

마우스 사이토카인 검정

대조군 또는 Rb1cc1-표적화 sgRNA를 발현하는 Rb1cc1 KO MC38 세포를 4 시간 동안 10 ng/ml 마우스 TNFα로 처리하였다. 처리 후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 1 mL의 1% IGEPAL CA-630, 20 mM Tris-HCL pH 8.0, 137 mM NaCL, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA + 1X Halt 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일로 용해시켰다. 　4℃에서 30분 회전시킨 후, 용해물을 4℃에서 5분 동안 14,000g에서 원심분리에 의해 제거하고 단백질 농도를 표준 BCA 검정에 의해 결정하였다.　 사이토카인 생산을 평가하기 위해, 프로테옴 프로파일러 마우스 사이토카인 검정 패널 A(R&D Systems)를 사용하였다.　 300 μg의 세포 용해물을 사용하여 표준 키트 프로토콜을 따랐다.

종양 면역 표현형 및 유세포 분석 분석법

종양을 수확하고, 기계적으로 단편(>4 mm)으로 소화시킨 다음, 37°C에서 45분 동안 마우스 종양 해리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 효소적으로 소화시켰다. 단일-세포 현탁액을 제조하고, 적혈구를 ACK 완충액(Lonza)으로 용해시켰다. 세포를 계수하고, Fc 블록(BioLegend)으로 얼음에서 30분 동안 차단하고, 생존력 염료 및 표시된 바와 같은 CD45, CD3, CD4, 및 CD8 항체(BioLegend)로 염색하였다. MC38 모 및 자가포식 KO 세포를 MHC-I(H2-kb) 또는 이소형 대조군(Invitrogen) 항체 또는 MHC-I(H2-kb)-Ova(SIINFEKL) 또는 이소형 대조군(BioLegend) 항체로 염색하였다.

정량화 및 통계 분석

풀링된 CRISPR 스크린의 분석을 위해, 데이터를 먼저 모든 샘플이 동일한 총 판독 계수를 갖도록 스케일링 인자를 각 샘플에 곱하여 정규화하였다. 그룹을 비교하기 위해, 정규화된 판독 계수 표를 MAGeCK(버전 0.5.8)에 대한 입력으로 사용하였으며, 한 그룹은 처리군으로 지정하였고 다른 그룹은 대조군으로 지정하였다(58). 다중 처리 그룹과 세포-기반 검정의 데이터를 비교하기 위해, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 ANOVA를 사용하였다. 상이한 처리에 적용된 종양의 성장을 비교하기 위해, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 이원 ANOVA를 사용하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다. GraphPad Prism을 사용하여 통계적 비교를 수행하였다.

참조에 의한 포함

본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 것처럼 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다.

또한 미국 게놈연구소(TIGR)의 월드 와이드 웹 및/또는 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 월드 와이드 웹에서 유지되는 것들과 같은 공개 데이터베이스의 항목과 관련한 수탁 번호를 참조하는 임의의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 전체가 참조로 포함된다.

등가물

당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 일상적인 실험만을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR SENSITIZATION OF TUMOR CELLS TO IMMUNE THERAPY <130> RPB-02025 <140> PCT/US2021/020697 <141> 2021-03-03 <150> US 62/985,004 <151> 2020-03-04 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 guuuuagagc uaugcu 16 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60 gugcuuu 67 <210> 4 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60 gucggugcuu uu 72 <210> 5 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Claims (182)

1. 암 세포를 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법으로서, 상기 암 세포를 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 자가포식 유전자가 ATG12, WIPI2, RB1CC1, PIK3C3, ATG9A, ATG2A, ATG5, ATG14, EI24, NRBF2, ATG13, TAX1BP1, 및 ATG10으로부터 선택되는 것인, 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 제제가 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키고, 상기 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키는 것이 자가포식 유전자의 발현 또는 활성의 감소를 초래하는 것인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 자가포식 유전자의 변형이 결실, 삽입, 대체, 또는 이의 조합을 포함하는 것인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA를 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법
7. 제6항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내의 이중 가닥 파괴 및 단일 가닥 파괴로부터 선택된 절단 이벤트를 제공하도록 구성되는 것인, 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 것인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 개시코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 방법.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 것인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 모듈식 가이드 RNA이되, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자인, 방법.
12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질인, 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 Cas9 분자가 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 것인, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 개시 코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에 있는 것인, 방법.
21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 것인, 방법.
22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 모듈식 가이드 RNA인이되, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자인, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 Cas9 단백질이 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
27. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 TALEN 뉴클레아제 또는 아연-핑거 뉴클레아제인, 방법.
28. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 RNA 또는 단백질의 활성을 억제하는 것인, 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 제제가 간섭 핵산인, 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 간섭 핵산이 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
31. 제1항에 있어서, 상기 제제가 PI3-키나제 억제제, 포스포이노시티드3-키나제(PI3) 억제제, Unc-51-유사 키나제 1(ULK1) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 18(Vps18) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 34(Vps34) 억제제, 유비퀴틴-특이적 펩티다제(USP10 또는 USP13) 억제제, 티오크산톤-기반 자가포식 억제제, ATG4 억제제, 오토피닙, 3-메틸아데닌, 보르트만닌, 염화암모늄, 바필로마이신 A1, 에플로르니틴, 류펩틴, 베툴린산, CA074, 콜히친, 타프시가진, 바쿠올린-1, 빈블라스틴, 데스메틸 클로미프라민, LY294002, PT210, GSK-2126458, 스파우틴-1, SAR405, 화합물 31, VPS34-IN1, PIK-III, 화합물 6, MRT68921, SBI-0206965, 펩스타틴 A, E64d, 클로미프라민, 루칸톤, 클로로퀸, 하이드록시클로르퀸, 모넨신, Lys05, ARN5187, 화합물 30, MPT0L145, ROC325, 베르테포르핀, NSC185058, 및 NSC377071로부터 선택된 소분자 자가포식 억제제인, 방법.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 췌장암 세포, 신암 세포, 위암 세포, GI 암 세포, 간암 세포, 골암 세포, 혈액암 세포, 신경 조직암 세포, 흑색종 세포, 갑상선암 세포, 난소암 세포, 고환암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 질암 세포, 또는 방광암 세포인, 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암 세포인, 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포인, 방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포인, 방법.
36. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 난소암 세포인, 방법.
37. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 자궁경부암 세포인, 방법.
38. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 방광암 세포인, 방법.
39. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 신암 세포인, 방법.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 대상체에 있고 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제가 대상체에게 투여되는 것인, 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 대상체가 인간 대상체인, 방법.
42. 대상체에서 암 세포를 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법으로서, 대상체에게 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
43. 대상체에서 암 세포의 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 암 세포에서 자가포식을 억제하는 적어도 하나의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 자가포식 유전자가 ATG12, WIPI2, RB1CC1, PIK3C3, ATG9A, ATG2A, ATG5, ATG14, EI24, NRBF2, ATG13, TAX1BP1, 및 ATG10으로부터 선택되는 것인, 방법.
46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 제제가 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키고, 상기 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변경시키는 것이 자가포식 유전자의 발현 또는 활성의 감소를 초래하는 것인, 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 자가포식 유전자의 변형이 결실, 삽입, 대체, 이의 조합, 또는 Cas 단백질의 결합을 포함하는 것인, 방법.
48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내의 이중 가닥 파괴 및 단일 가닥 파괴로부터 선택된 절단 이벤트를 제공하도록 구성되는 것인, 방법.
50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 것인, 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 개시 코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 방법.
52. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에 있는 것인, 방법.
53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 것인, 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 모듈식 가이드 RNA이되, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자인, 방법.
55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 Cas9 분자가 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
59. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 것인, 방법.
61. 제60항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 개시 코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 방법.
62. 제59항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에 있는 것인, 방법.
63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 것인, 방법.
64. 제3항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 모듈식 가이드 RNA이되, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자인, 방법.
65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 Cas9 단백질이 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
69. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 TALEN 뉴클레아제 또는 아연-핑거 뉴클레아제인, 방법.
70. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 RNA 또는 단백질의 활성을 억제하는 것인, 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 제제가 간섭 핵산인, 방법.
72. 제71항에 있어서, 상기 간섭 핵산이 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
73. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 제제가 PI3-키나제 억제제, 포스포이노시티드3-키나제(PI3) 억제제, Unc-51-유사 키나제 1(ULK1) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 18(Vps18) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 34(Vps34) 억제제, 유비퀴틴-특이적 펩티다제(USP10 또는 USP13) 억제제, 티오크산톤-기반 자가포식 억제제, ATG4 억제제, 오토피닙, 3-메틸아데닌, 보르트만닌, 염화암모늄, 바필로마이신 A1, 에플로르니틴, 류펩틴, 베툴린산, CA074, 콜히친, 타프시가진, 바쿠올린-1, 빈블라스틴, 데스메틸 클로미프라민, LY294002, PT210, GSK-2126458, 스파우틴-1, SAR405, 화합물 31, VPS34-IN1, PIK-III, 화합물 6, MRT68921, SBI-0206965, 펩스타틴 A, E64d, 클로미프라민, 루칸톤, 클로로퀸, 하이드록시클로르퀸, 모넨신, Lys05, ARN5187, 화합물 30, MPT0L145, ROC325, 베르테포르핀, NSC185058, 및 NSC377071로부터 선택된 소분자 자가포식 억제제인, 방법.
74. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 췌장암 세포, 신암 세포, 위암 세포, GI 암 세포, 간암 세포, 골암 세포, 혈액암 세포, 신경 조직암 세포, 흑색종 세포, 갑상선암 세포, 난소암 세포, 고환암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 질암 세포, 또는 방광암 세포인, 방법.
75. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암 세포인, 방법.
76. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포인, 방법.
77. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포인, 방법.
78. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 난소암 세포인, 방법.
79. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 자궁경부암 세포인, 방법.
80. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 방광암 세포인, 방법.
81. 제74항에 있어서, 상기 암 세포가 신암 세포인, 방법.
82. 대상체에서 종양을 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸에 대해 감작화하는 방법으로서, 대상체에게 종양에서 자가포식을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
83. 대상체에서 종양의 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 종양에서 자가포식을 억제하는 적어도 하나의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 방법.
85. 제84항에 있어서, 상기 자가포식 유전자가 ATG12, WIPI2, RB1CC1, PIK3C3, ATG9A, ATG2A, ATG5, ATG14, EI24, NRBF2, ATG13, TAX1BP1, 및 ATG10으로부터 선택되는 것인, 방법.
86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 제제가 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키고, 상기 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키는 것이 자가포식 유전자의 발현 또는 활성의 감소를 초래하는 것인, 방법.
87. 제86항에 있어서, 상기 자가포식 유전자의 변형이 결실, 삽입, 대체, 이의 조합, 또는 Cas 단백질의 결합을 포함하는 것인, 방법.
88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA를 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
89. 제88항에 있어서, 상기 gRNA가 자가포식 유전자 내의 이중 가닥 파괴 및 단일 가닥 파괴로부터 선택된 절단 이벤트를 제공하도록 구성되는 것인, 방법.
90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 것인, 방법.
91. 제90항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 개시 코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 방법.
92. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에 있는 것인, 방법.
93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 것인, 방법.
94. 제93항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 모듈식 가이드 RNA이되, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자인, 방법.
95. 제88항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
96. 제95항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
98. 제97항에 있어서, 상기 Cas9 분자가 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
99. 제98항에 있어서, 상기 Cas9 분자가 에스. 아우레우스 Cas9 단백질인, 방법.
100. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 gRNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
101. 제100항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 개시 코돈을 포함하거나 또는 이에 근접한 것인, 방법.
102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 개시 코돈의 약 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 방법.
103. 제100항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열이 자가포식 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에 있는 것인, 방법.
104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 DNA-표적화 분절을 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 것인, 방법.
105. 제104항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 모듈식 가이드 RNA이되, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 서로 혼성화하는 별개의 분자인, 방법.
106. 제100항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
107. 제106항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질 또는 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
108. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
109. 제108항에 있어서, 상기 Cas9 단백질이 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
110. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 TALEN 뉴클레아제 또는 아연-핑거 뉴클레아제인, 방법.
111. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 RNA 또는 단백질의 활성을 억제하는 것인, 방법.
112. 제111항에 있어서, 상기 제제가 간섭 핵산인, 방법.
113. 제112항에 있어서, 상기 간섭 핵산이 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
114. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 제제가 PI3-키나제 억제제, 포스포이노시티드3-키나제(PI3) 억제제, Unc-51-유사 키나제 1(ULK1) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 18(Vps18) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 34(Vps34) 억제제, 유비퀴틴-특이적 펩티다제(USP10 또는 USP13) 억제제, 티오크산톤-기반 자가포식 억제제, ATG4 억제제, 오토피닙, 3-메틸아데닌, 보르트만닌, 염화암모늄, 바필로마이신 A1, 에플로르니틴, 류펩틴, 베툴린산, CA074, 콜히친, 타프시가진, 바쿠올린-1, 빈블라스틴, 데스메틸 클로미프라민, LY294002, PT210, GSK-2126458, 스파우틴-1, SAR405, 화합물 31, VPS34-IN1, PIK-III, 화합물 6, MRT68921, SBI-0206965, 펩스타틴 A, E64d, 클로미프라민, 루칸톤, 클로로퀸, 하이드록시클로르퀸, 모넨신, Lys05, ARN5187, 화합물 30, MPT0L145, ROC325, 베르테포르핀, NSC185058, 및 NSC377071로부터 선택되는 것인, 방법.
115. 제82항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 선암종, 부신 종양, 항문 종양, 담관 종양, 방광 종양, 골 종양, 뇌/CNS 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 자궁내막 종양, 식도 종양, 유잉 종양, 눈 종양, 담낭 종양, 위장관, 신장 종양, 후두 또는 하인두 종양, 간 종양, 폐 종양, 중피종 종양, 다발성 골수종 종양, 근육 종양, 비인두 종양, 신경모세포종, 경구 종양, 골육종, 난소 종양, 췌장 종양, 음경 종양, 뇌하수체 종양, 원발성 종양, 전립선 종양, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘 종양, 연조직 육종, 흑색종, 전이성 종양, 기저 세포 암종, 메르켈 세포 종양, 고환 종양, 흉선 종양, 갑상선 종양, 자궁 종양, 질 종양, 외음부 종양, 또는 빌름스 종양인, 방법.
116. 제115항에 있어서, 상기 종양이 유방 종양인, 방법.
117. 제115항에 있어서, 상기 종양이 결장직장 종양인, 방법.
118. 제115항에 있어서, 상기 종양이 폐 종양인, 방법.
119. 제115항에 있어서, 상기 종양이 난소 종양인, 방법.
120. 제115항에 있어서, 상기 종양이 자궁경부 종양인, 방법.
121. 제115항에 있어서, 상기 종양이 방광 종양인, 방법.
122. 제115항에 있어서, 상기 종양이 신 종양인, 방법.
123. 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 원발성 종양인, 방법.
124. 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 전이성 종양인, 방법.
125. 제42항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 제제의 투여 전에 화학요법 약물을 받은 것인, 방법.
126. 제125항에 있어서, 상기 대상체가 화학요법 약물에 대해 불응성인, 방법.
127. 제42항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 전신으로 투여되는 것인, 방법.
128. 제127항에 있어서, 상기 제제가 정맥내로 투여되는 것인, 방법.
129. 제42항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 피하로 투여되는 것인, 방법.
130. 제42항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 근육내로 투여되는 것인, 방법.
131. 제42항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 경구로 투여되는 것인, 방법.
132. 제42항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 국부로 투여되는 것인, 방법.
133. 제132항에 있어서, 상기 대상체가 종양을 가지고 있고, 적어도 하나의 제제가 종양 또는 종양 미세환경에 국부로 투여되는 것인, 방법.
134. 제42항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 대상체에게 추가의 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
135. 제134항에 있어서, 상기 추가의 항암 요법이 암 면역요법인, 방법.
136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 상기 암 면역요법이 자가 또는 동종 T 세포 요법 또는 자가 또는 동종 CAR T 세포 요법을 포함하는 것인, 방법.
137. 제135항에 있어서, 상기 암 면역요법이 대상체에게 TNF-α를 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
138. 제135항에 있어서, 상기 암 면역요법이 대상체에게 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
139. 제138항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 부티로필린, 및 A2aR로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인, 방법.
140. 제139항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 세미플리맙(REGN2810), 니볼루맙(BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), 펨브롤리주맙(MK-3475, SCH 900475), 아테졸리주맙(MPDL3280A, RG7446, RO5541267), 더발루맙(MEDI4736, MEDI-4736), 아벨루맙(MSB0010718C), 이필리무맙(BMS-734016, IBI310, MDX-010), SHR1210, 신틸리맙(IBI308), 아파르탈리주맙(PDR001), 티슬레리주맙(BGB-A317), 피딜리주맙, BCD-100, 토리팔리맙(JS001), BAY 1905254, ASP 8374, PF-06801591, AMP-224, AB122, AK105, AMG 404, BCD-100, BI 754091, F520, HLX10, HX008, JTX-4014, LZM009, MEDI0680, MGA012, Sym021, TSR-042, PSB205, MGD019, MGD013, AK104, XmAb20717, RO7121661, CX-188, INCB086550, FS118, BCD-135, BGB-A333, CBT-502, CK-301, CS1001, FAZ053, HLX20, KN035, MDX-1105, MSB2311, SHR-1316, TG-1501, ZKAB001, INBRX-105, MCLA-145, KN046, M7824, LY3415244, INCB086550, CA-170, CX-072, ADU-1604, AGEN1181, AGEN1884, MK-1308, REGN4659, XmAb22841, ATOR-1015, PSB205, MGD019, AK104, XmAb20717, BMS-986249, 트레멜리무맙, BMS-986258, BGB-A425, INCAGN02390, Sym023, JNJ 61610588, BI 754111, LAG525, MK-4280, REGN3767, Sym022, TSR-033, 렐라틀리맙, JTX-2011, MGD009, BMS-986207, OMP-313M32, MK-7684 또는 TSR-022인, 방법.
141. 제135항에 있어서, 상기 암 면역요법이 대상체에게 암 백신을 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
142. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 대상체의 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제 및 암 면역요법을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
143. 제142항에 있어서, 상기 암 면역요법이 자가 또는 동종 T 세포 요법 또는 자가 또는 동종 CAR T 세포 요법을 포함하는 것인, 방법.
144. 제142항에 있어서, 상기 암 면역요법이 대상체에게 TNF-α를 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
145. 제142항에 있어서, 상기 암 면역요법이 대상체에게 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
146. 제145항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 부티로필린, 및 A2aR로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인, 방법.
147. 제145항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 세미플리맙(REGN2810), 니볼루맙(BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), 펨브롤리주맙(MK-3475, SCH 900475), 아테졸리주맙(MPDL3280A, RG7446, RO5541267), 더발루맙(MEDI4736, MEDI-4736), 아벨루맙(MSB0010718C), 이필리무맙(BMS-734016, IBI310, MDX-010), SHR1210, 신틸리맙(IBI308), 아파르탈리주맙(PDR001), 티슬레리주맙(BGB-A317), 피딜리주맙, BCD-100, 토리팔리맙(JS001), BAY 1905254, ASP 8374, PF-06801591, AMP-224, AB122, AK105, AMG 404, BCD-100, BI 754091, F520, HLX10, HX008, JTX-4014, LZM009, MEDI0680, MGA012, Sym021, TSR-042, PSB205, MGD019, MGD013, AK104, XmAb20717, RO7121661, CX-188, INCB086550, FS118, BCD-135, BGB-A333, CBT-502, CK-301, CS1001, FAZ053, HLX20, KN035, MDX-1105, MSB2311, SHR-1316, TG-1501, ZKAB001, INBRX-105, MCLA-145, KN046, M7824, LY3415244, INCB086550, CA-170, CX-072, ADU-1604, AGEN1181, AGEN1884, MK-1308, REGN4659, XmAb22841, ATOR-1015, PSB205, MGD019, AK104, XmAb20717, BMS-986249, 트레멜리무맙, BMS-986258, BGB-A425, INCAGN02390, Sym023, JNJ 61610588, BI 754111, LAG525, MK-4280, REGN3767, Sym022, TSR-033, 렐라틀리맙, JTX-2011, MGD009, BMS-986207, OMP-313M32, MK-7684 또는 TSR-022인, 방법.
148. 제142항에 있어서, 상기 암 면역요법이 대상체에게 암 백신을 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
149. 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 방법.
150. 제149항에 있어서, 상기 자가포식 유전자가 ATG12, WIPI2, RB1CC1, PIK3C3, ATG9A, ATG2A, ATG5, ATG14, EI24, NRBF2, ATG13, TAX1BP1, 및 ATG10으로부터 선택되는 것인, 방법.
151. 제149항 또는 제150항에 있어서, 상기 제제가 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키고, 상기 적어도 하나의 자가포식 유전자를 변형시키는 것이 자가포식 유전자의 발현 또는 활성의 감소를 초래하는 것인, 방법.
152. 제151항에 있어서, 상기 자가포식 유전자의 변형이 결실, 삽입, 대체, 이의 조합, 또는 Cas 단백질의 결합을 포함하는 것인, 방법.
153. 제142항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA를 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
154. 제153항에 있어서, 상기 gRNA가 자가포식 유전자 내의 이중 가닥 파괴 및 단일 가닥 파괴로부터 선택된 절단 이벤트를 제공하도록 구성되는 것인, 방법.
155. 제153항 또는 제154항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
156. 제155항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질인, 방법.
157. 제155항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
158. 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
159. 제158항에 있어서, 상기 Cas9 분자가 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
160. 제142항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 자가포식 유전자에서 서열을 절단하거나 또는 결합하도록 Cas 효소를 지시하는 데 효과적인 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이고, 상기 가이드 RNA가 자가포식 유전자 내에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적하는 DNA-표적화 분절을 포함하는 것인, 방법.
161. 제160항에 있어서, 상기 조성물이 Cas 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
162. 제161항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 뉴클레아제-활성 Cas 단백질인, 방법.
163. 제162항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 전사 억제인자 도메인에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질인, 방법.
164. 제161항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인, 방법.
165. 제164항에 있어서, 상기 Cas9 단백질이 에스. 아우레우스 Cas9 단백질, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질, 또는 엔. 메닌기티디스 Cas9 단백질인, 방법.
166. 제142항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 TALEN 뉴클레아제 또는 아연-핑거 뉴클레아제인, 방법.
167. 제142항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 RNA 또는 단백질의 활성을 억제하는 것인, 방법.
168. 제167항에 있어서, 상기 제제가 간섭 핵산인, 방법.
169. 제168항에 있어서, 상기 간섭 핵산이 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
170. 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 PI3-키나제 억제제, 포스포이노시티드3-키나제(PI3) 억제제, Unc-51-유사 키나제 1(ULK1) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 18(Vps18) 억제제, 공포성 단백질 선별 단백질 34(Vps34) 억제제, 유비퀴틴-특이적 펩티다제(USP10 또는 USP13) 억제제, 티오크산톤-기반 자가포식 억제제, ATG4 억제제, 오토피닙, 3-메틸아데닌, 보르트만닌, 염화암모늄, 바필로마이신 A1, 에플로르니틴, 류펩틴, 베툴린산, CA074, 콜히친, 타프시가진, 바쿠올린-1, 빈블라스틴, 데스메틸 클로미프라민, LY294002, PT210, GSK-2126458, 스파우틴-1, SAR405, 화합물 31, VPS34-IN1, PIK-III, 화합물 6, MRT68921, SBI-0206965, 펩스타틴 A, E64d, 클로미프라민, 루칸톤, 클로로퀸, 하이드록시클로르퀸, 모넨신, Lys05, ARN5187, 화합물 30, MPT0L145, ROC325, 베르테포르핀, NSC185058, 및 NSC377071로부터 선택된 소분자 자가포식 억제제인, 방법.
171. 제142항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 췌장암 세포, 신암 세포, 위암 세포, GI 암 세포, 간암 세포, 골암 세포, 혈액암 세포, 신경 조직암 세포, 흑색종 세포, 갑상선암 세포, 난소암 세포, 고환암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 질암 세포, 또는 방광암 세포인, 방법.
172. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암 세포인, 방법.
173. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 결장암 세포인, 방법.
174. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포인, 방법.
175. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 난소암 세포인, 방법.
176. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 자궁경부암 세포인, 방법.
177. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 방광암 세포인, 방법.
178. 제171항에 있어서, 상기 암 세포가 신암 세포인, 방법.
179. 제42항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
180. 대상체에서 암 세포를 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸에 대해 감작화하는 데 사용하기 위한 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제.
181. 대상체에서 암 세포의 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 매개 사멸을 증가시키는 데 사용하기 위한 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제.
182. 암 세포에서 자가포식을 억제하는 제제 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 암 면역요법을 포함하는 조합 요법.

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