ES2741951T3 - Modificación por ingeniería genética del genoma humano guiada por ARN - Google Patents

Modificación por ingeniería genética del genoma humano guiada por ARN Download PDF

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Abstract

Procedimiento in vitro o ex vivo de alteración de una célula eucariota, que comprende proporcionar a la célula eucariota una secuencia de ARN guía GN19 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU, en el que la secuencia GN19 es complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana y se une a la secuencia de ácido nucleico diana, y proporcionar a la célula eucariota una proteína Cas 9 que interactúa con la secuencia de ARN guía, y en el que el procedimiento no comprende un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en el que la célula no es un embrión humano.

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación por ingeniería genética del genoma humano guiada por ARN
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los sistemas CRISPR bacterianos y arqueales se basan en ARNcr en complejos con proteínas Cas para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes dentro del ADN viral y plasmídico invasor (1-3). Una reciente reconstitución in vitro del sistema CRISPR de tipo II de S. pyogenes demostró que el ARNcr unido a un ARNtracr transcodificado normalmente es suficiente para dirigir la proteína Cas9 a las secuencias de ADN diana que escinden específicamente las secuencias que coinciden con el ARNcr (4).
CARACTERÍSTICAS
La presente divulgación hace referencia numéricamente a documentos que se enumeran al final de la presente divulgación.
Según un aspecto de la presente divulgación, una célula eucariota se transfecta con un sistema de dos componentes que incluye a Rn complementario al ADN genómico y una enzima que interactúa con el ARN. El ARN y la enzima son expresados por la célula. El ARN del complejo ARN/enzima se une luego al ADN genómico complementario. La enzima realiza luego una función, tal como la escisión del ADN genómico. El ARN incluye de entre aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 250 nucleótidos. El ARN incluye de entre aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Según determinados aspectos, la enzima puede realizar cualquier función deseada de una manera específica del sitio para el cual la enzima se ha diseñado. Según un aspecto, la célula eucariota es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero. Según un aspecto, la enzima escinde secuencias genómicas seleccionadas como diana por secuencias de ARN (ver las referencias (4-6)), creando así una célula eucariota alterada genómicamente.
Según un aspecto, la presente divulgación da a conocer un procedimiento de alteración genéticamente de una célula humana incluyendo un ácido nucleico que codifica un ARN complementario al ADN genómico en el genoma de la célula y un ácido nucleico que codifica una enzima que realiza una función deseada en el ADN genómico en el genoma de la célula. Según un aspecto, el ARN y la enzima se expresan. Según un aspecto, el ARN hibrida con el ADN genómico complementario. Según un aspecto, la enzima se activa para realizar una función deseada, tal como la escisión, de una manera específica del sitio cuando el ARN hibrida con el ADN genómico complementario. Según un aspecto, el ARN y la enzima son componentes de un sistema CRISPR de tipo II bacteriano.
Según un aspecto, se está dando a conocer un procedimiento de alteración de una célula eucariota que incluye transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que codifica ARN complementario al ADN genómico de la célula eucariota, transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que codifica una enzima que interactúa con el ARN y escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio, en el que la célula expresa el ARN y la enzima, el ARN se une al ADN genómico complementario y la enzima escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio. Según un aspecto, la enzima es Cas9 o Cas9 modificada o un homólogo de Cas9. Según un aspecto, la célula eucariota es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero. Según un aspecto, el ARN incluye de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nucleótidos. Según un aspecto, el ARN incluye de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos.
Según un aspecto, se da a conocer un procedimiento de alteración de una célula humana que incluye transfectar la célula humana con un ácido nucleico que codifica ARN complementario al ADN genómico de la célula eucariota, transfectar la célula humana con un ácido nucleico que codifica una enzima que interactúa con el ARN y escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio, en el que la célula humana expresa el ARN y la enzima, el ARN se une al ADN genómico complementario y la enzima escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio. Según un aspecto, la enzima es Cas9 o Cas9 modificada o un homólogo de Cas9. Según un aspecto, el ARN incluye de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nucleótidos. Según un aspecto, el ARN incluye de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos.
Según un aspecto, se da a conocer un procedimiento de alteración de una célula eucariota en una pluralidad de sitios de ADN genómico que incluye transfectar la célula eucariota con una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican ARN complementarios a diferentes sitios en el ADN genómico de la célula eucariota, transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que codifica una enzima que interactúa con el ARN y escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio, en el que la célula expresa los ARN y la enzima, los ARN se unen al ADN genómico complementario y la enzima escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio. Según un aspecto, la enzima es Cas9. Según un aspecto, la célula eucariota es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero. Según un aspecto, el ARN incluye de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nucleótidos. Según un aspecto, el ARn incluye de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Según un aspecto, se sintetiza una versión optimizada para codones humanos de la proteína Cas9 que alberga una señal de localización nuclear SV40 C-terminal y se clona en un sistema de expresión de mamífero (figura 1A y figura 3A). Por consiguiente, la figura 1 se refiere a la edición del genoma en células humanas utilizando un sistema CRISPR de tipo II modificado por ingeniería genética. Tal como se muestra en la figura 1A, el direccionamiento génico guiado por ARN en células humanas implica la coexpresión de la proteína Cas9 que alberga una señal de localización nuclear SV40 C-terminal con uno o más ARN guías (ARNg) expresados a partir del promotor de la polimerasa III U6 humana. La Cas9 desenrolla el dúplex de ADN y escinde ambas cadenas tras el reconocimiento de una secuencia diana por el ARNg, pero solo si el motivo adyacente protoespaciador (PAM) correcto está presente en el extremo 3’. Cualquier secuencia genómica de la forma GN20GG se puede en principio seleccionar como diana. Tal como se muestra en la figura 1B, se interrumpe una secuencia codificante de GFP integrada genómicamente mediante la inserción de un codón de terminación y un fragmento genómico de 68 pb del locus de AAVS1. La recuperación de la secuencia de GFP mediante recombinación homóloga (HR) con una secuencia donante apropiada da como resultado células GFP+ que se pueden cuantificar mediante FACS. ARNg de T1 y de T2 se dirigen a secuencias dentro del fragmento de AAVS1. Los sitios de unión para las dos mitades del heterodímero de la nucleasa efectora TAL (“Transcription Activator-Like, de tipo activador de la transcripción) (TALEN) están subrayados. Tal como se muestra en la figura 1C, el gráfico de barras representa las eficiencias de HR inducidas por la actividad de la nucleasa mediada por T1, T2 y TALEN en el locus diana, tal como se mide mediante FACS. Los gráficos representativos de FACS y las imágenes de microscopía de las células seleccionadas como diana se representan a continuación (la barra de escala es de 100 micrómetros). Los datos son media /- SEM (N=3).
Según un aspecto, para dirigir Cas9 a escindir secuencias de interés, se expresan los transcritos de fusión de ARNcr-ARNtracr, denominados en lo sucesivo ARN guías (ARNg), del promotor de la polimerasa III U6 humana. Según un aspecto, los ARNg se transcriben directamente mediante la célula. Este aspecto evita de manera ventajosa reconstituir la maquinaria de proceso del ARN empleada por los sistemas CRISPR bacterianos (figura 1A y figura 3B) (ver las referencias (4, 7-9)). Según un aspecto, se da a conocer un procedimiento para alterar el ADN genómico utilizando una transcripción de U6 que se inicia con G y una secuencia PAM (motivo adyacente protoespaciador)-NGG, seguido de la diana de ARNcr de 20 pb. Según este aspecto, el sitio genómico diana está en forma de GN20GG (ver la figura 3C).
Según un aspecto, se desarrolló un ensayo informador de GFP (figura 1B) en células 293T similar a uno descrito previamente (ver la referencia (10)) para someter a prueba la funcionalidad de los procedimientos de diseño del genoma descritos en el presente documento. Según un aspecto, se estableció una línea celular estable que albergaba una secuencia codificante de GFP integrada genómicamente interrumpida por la inserción de un codón de terminación y un fragmento genómico de 68 pb del locus de AAVS1 que hace que el fragmento de proteína expresado no sea fluorescente. La recombinación homóloga (HR) utilizando un donante de reparación apropiado puede recuperar la secuencia de GFP normal, lo que permite cuantificar las células GFP+ resultantes mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Según un aspecto, se da a conocer un procedimiento de recombinación homóloga (HR). Se construyen dos ARNg, T1 y T2, que seleccionan como diana el fragmento de AAVS1 intercalado (figura 1b). Se comparó su actividad con la de un heterodímero de la nucleasa efectora TAL (TALEN) previamente descrito que selecciona como diana la misma región (ver la referencia (11)). Se observaron eventos de HR ventajosos utilizando los tres reactivos de direccionamiento, con tasas de corrección génica utilizando el ARNg de T1 y de T2 aproximándose al 3 % y al 8 %, respectivamente (figura 1C). Este proceso de edición mediado por ARN fue notablemente rápido, con las primeras células GFP+ detectables apareciendo a ~20 horas después de la transfección en comparación con ~40 horas para las TALEN de AAVS1. La Hr se observa solo tras la introducción simultánea del donante de reparación, la proteína Cas9 y el ARNg, confirmando que se requieren todos los componentes para la edición del genoma (figura 4). Si bien no se observa toxicidad aparente asociada con la expresión de Cas9/ARNcr, el trabajo con ZFN y TALEN ha mostrado que cortar solo una cadena reduce aún más la toxicidad. Por consiguiente, se sometió a prueba un mutante de Cas9D10A que se sabe que funciona como una nickasa in vitro, lo que produjo una HR similar pero tasas de unión final no homóloga (NHEJ) más bajas (figura 5) (ver las referencias (4, 5)). Acorde con (4), donde se muestra que una proteína Cas9 relacionada corta ambas hebras de 6 pb en el sentido de 5’ del PAM, los datos de NHEJ confirmaron que la mayoría de deleciones o inserciones se producían en el extremo 3’ de la secuencia diana (figura 5B). También se confirmó que mutar el sitio genómico diana evita que el ARNg efectúe la HR en ese locus, demostrando que la edición del genoma mediada por CRISPR es específica de secuencia (figura 6). Se mostró que dos sitios diana de ARNg en el gen de GFP, y también tres fragmentos diana de ARNg adicionales de regiones homólogas de los genes de ADN metiltransferasa 3a (DNMT3a) y DNMT3b podrían inducir específicamente secuencias significativas de HR en las líneas celulares de informador diseñadas (figuras 7, 8). Juntos, estos resultados confirman que el direccionamiento del genoma guiado por ARN en células humanas induce HR robusta en múltiples sitios diana.
Según determinados aspectos, se modificó un locus nativo. Se utilizaron ARNg para seleccionar como diana el locus de AAVS1 ubicado en el gen PPP1R12C en el cromosoma 19, el cual se expresa ubicuamente en la mayoría de los tejidos (figura 2A) en células humanas 293T, K562 y PGP1 iPS (ver la referencia (12)), y se analizaron los resultados mediante secuenciación de próxima generación del locus seleccionado como diana. Por consiguiente, la figura 2 se refiere a la edición del genoma guiada por ARN del locus de AAVS1 nativo en múltiples tipos de células. Tal como se muestra en la figura 2A, ARNg de T1 (rojo) y de T2 (verde) se dirigen a secuencias en un intrón del gen PPP1R12C dentro del locus de AAVS1 del cromosoma 19. Tal como se muestra en la figura 2B, se proporciona el recuento total y la ubicación de las deleciones causadas por NHEJ en células 293T, K562 y PGP1 iPS después de la expresión de Cas9 y ARNg de T1 o de T2 tal como se cuantifica mediante secuenciación de próxima generación. Las líneas de trazos rojos y verdes delimitan los límites de los sitios diana de ARNg de T1 y de T2. Las frecuencias de NHEJ para ARNg de T1 y de T2 fueron del 10 % y del 25 % en 293T, del 13 % y del 38 % en K562 y del 2 % y del 4 % en células PGP1 iPS, respectivamente. Tal como se muestra en la figura 2c , se representa la arquitectura del donante de ADN para HR en el locus de AAVS1 y las ubicaciones de cebadores de secuenciación (flechas) para detectar con éxito eventos seleccionados como diana. Tal como se muestra en la figura 2D, el ensayo de PCR de tres días después de la transfección demuestra que solo las células que expresan el donante, la Cas9 y el ARNg de T2 muestran eventos de HR ventajosos. Tal como se muestra en la figura 2E, se confirmó la HR ventajosa mediante secuenciación Sanger del amplicón de PCR mostrando que están presentes las bases de ADN esperadas en los límites tanto del donante del genoma como del inserto del donante. Tal como se muestra en la figura 2F, se seleccionaron los clones seleccionados como diana de manera ventajosa de células 293T con puromicina durante 2 semanas. Se muestran imágenes de microscopía de dos clones de GFP+ representativos (la barra de escala es de 100 micrómetros).
Acorde con los resultados para el ensayo informador de GFP, se observaron altos números de eventos NHEJ en el locus endógeno para los tres tipos de células. Los dos ARNg de T1 y de T2 lograron tasas de NHEJ del 10 y del 25 % en 293T, del 13 y del 38 % en K562 y del 2 y del 4 % en células PGP1 iPS, respectivamente (figura 2B). No se observó toxicidad manifiesta de Cas9 y se requirió la expresión de ARNcr para inducir NHEJ en cualquiera de estos tipos de células (figura 9). Tal como se esperaba, las deleciones mediadas por NHEJ para T1 y t 2 se centraron alrededor de las posiciones de los sitios diana, validando además la especificidad de secuencia de este proceso de direccionamiento (figuras 9, 10, 11). La introducción simultánea de ambos ARNg de T1 y de T2 dio como resultado una deleción de alta eficiencia del fragmento de 19 pb intercalado (figura 10), demostrando que la edición multiplexada de loci genómicos es factible utilizando este enfoque.
Según un aspecto, la HR se utiliza para integrar una construcción donante de ADNbc (ver la referencia (13)) o un oligodonante en el locus de AAVS1 nativo (figura 2C, figura 12). Se confirmó la integración mediada por HR utilizando ambas aproximaciones mediante PCR (figura 2D, figura 12) y secuenciación Sanger (figura 2E). Los clones de 293T o de iPS se derivaron fácilmente de la agrupación de células modificadas utilizando la selección de puromicina durante dos semanas (figura 2F, figura 12). Estos resultados demuestran que la Cas9 puede integrar de manera eficiente ADN extraño en loci endógenos en células humanas. Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación incluye un procedimiento de integración de ADN extraño en el genoma de una célula utilizando recombinación homóloga y Cas9.
Según un aspecto, se da a conocer un sistema de edición del genoma guiado por ARN que puede adaptarse fácilmente para modificar otros sitios genómicos modificando simplemente la secuencia del vector de expresión de ARNg para que coincida con una secuencia compatible en el locus de interés. Según este aspecto, se generaron 190.000 secuencias dirigibles específicamente por ARNg que se dirigen a aproximadamente el 40,5 % de exones de genes en el genoma humano. Estas secuencias diana se incorporaron en un formato de 200 pb compatible con la síntesis múltiple en micromatrices de ADN (ver la referencia (14)) (figura 13). Según este aspecto, se dan a conocer una referencia preparada para todo el genoma de posibles sitios diana en el genoma humano y una metodología para la síntesis de ARNg múltiple.
Según un aspecto, se dan a conocer procedimientos para multiplexar alteraciones genómicas en una célula utilizando uno o más o una pluralidad de sistemas ARN/enzima descritos en el presente documento para alterar el genoma de una célula en una pluralidad de ubicaciones. Según un aspecto, los sitios diana coinciden perfectamente con la secuencia PAM NGG y la “secuencia semilla” de 8-12 bases en el extremo 3’ del ARNg. Según determinados aspectos, no se requiere una coincidencia perfecta de las 8-12 bases restantes. Según determinados aspectos, la Cas9 funcionará con apareamientos erróneos individuales en el extremo 5’. Según determinados aspectos, la estructura de cromatina subyacente del locus diana y el estado epigenético puede afectar la eficiencia de la función de Cas9. Según determinados aspectos, los homólogos de Cas9 que tienen mayor especificidad se incluyen como enzimas útiles. Un experto en la materia será capaz de identificar o modificar por ingeniería genética homólogos de Cas9 adecuados. Según un aspecto, las secuencias que pueden dirigirse a CRISPR incluyen aquellas que tienen requisitos de PAM diferentes (ver la referencia (9)), o evolución dirigida. Según un aspecto, inactivar uno de los dominios de la Cas9 nucleasa aumenta la proporción de HR con respecto a NHEJ y puede reducir la toxicidad (figura 3A, figura 5) (4, 5), mientras que inactivar ambos dominios puede permitir a la Cas9 funcionar como una proteína de unión a ADN redirigible. Las realizaciones de la presente divulgación tienen amplia utilidad en biología sintética (ver las referencias (21, 22)), la perturbación directa y multiplexada de las redes de genes (ver las referencias (13, 23)), y terapias génicas dirigidas ex vivo (ver las referencias (24-26)) e in vivo (ver la referencia (27)).
Según determinados aspectos, se da a conocer un “organismo que puede volver a modificarse por ingeniería genética” como un sistema modelo para el descubrimiento biológico y la detección in vivo. Según un aspecto, se da a conocer un “ratón que puede volver a modificarse por ingeniería genética” que alberga un transgén de Cas9 inducible, y la administración localizada (utilizando virus adenoasociados, por ejemplo) de bibliotecas de ARNg que se dirigen a múltiples genes o elementos regulatorios permite detectar mutaciones que dan como resultado el comienzo de tumores en el tipo de tejido diana. La utilización de homólogos de Cas9 o variantes de nucleasa nula que albergan dominios efectores (tales como activadores) permiten activar o reprimir de manera múltiple genes in vivo. Según este aspecto, se podrían detectar factores que permiten fenotipos tales como: regeneración de tejidos, transdiferenciación, etc. Según determinados aspectos, (a) la utilización de micromatrices de ADN permite la síntesis múltiple de bibliotecas de ARNg definidas (consúltese la figura 13); y (b) los ARNg de pequeño tamaño (consúltese la figura 3b) se empaquetan y se administran utilizando una multitud de procedimientos de administración no virales o virales.
Según un aspecto, las toxicidades más bajas observadas con “nickasas” para aplicaciones de modificación por ingeniería genética del genoma se logran inactivando uno de los dominios de Cas9 nucleasa, cortando la cadena de ADN apareada con el ARN o cortando su complemento. La inactivación de ambos dominios permite a la Cas9 funcionar como una proteína de unión a ADN redirigible. Según un aspecto, la proteína de unión a ADN redirigible, Cas9, se une
(a) a dominios de activación o represión transcripcionales para modular la expresión de genes diana, que incluyen, pero no se limitan a, remodelado de cromatina, modificación de histonas, silenciamiento, aislamiento, interacciones directas con la maquinaria transcripcional;
(b) a dominios de nucleasa tales como FokI para permitir la edición del genoma “altamente específica” contingente tras la dimerización de complejos ARNg-Cas9 adyacentes;
(c) a proteínas fluorescentes para la visualización de loci genómicos y dinámica de cromosomas; o (d) a otras moléculas fluorescentes tales como fluoróforos orgánicos unidos a proteína o ácido nucleico, puntos cuánticos, balizas moleculares y sondas de eco o sustituciones de balizas moleculares;
(e) a dominios de proteína de unión a ligando multivalentes que permiten la manipulación programable de la arquitectura 3D de todo el genoma.
Según un aspecto, los componentes de activación y represión transcripcionales puede emplear sistemas CRISPR ortogonales de manera natural o de manera sintética, de manera que el ARNg solo se une a la clase activadora o represora de Cas. Esto permite que un gran conjunto de ARNg sintonice múltiples dianas.
Según determinados aspectos, la utilización de ARNg proporciona la capacidad de multiplexar que los ARNm, en parte debido al menor tamaño: -- longitudes de 100 frente a 2000 nucleótidos, respectivamente. Esto es particularmente valioso cuando la administración del ácido nucleico tiene un tamaño limitado, tal como en el empaquetamiento viral. Esto permite múltiples casos de escisión, corte, activación o represión, o combinaciones de los mismos. La capacidad para dirigirse fácilmente a múltiples dianas reguladoras permite la sintonía gruesa o fina o las redes reguladoras sin estar limitados a los circuitos reguladores naturales en el sentido de 3’ de factores reguladores específicos (por ejemplo, los 4 ARNm utilizados en la reprogramación de fibroblastos en IPSC). Los ejemplos de aplicaciones de multiplexación incluyen:
1. El establecimiento de alelos histocompatibles (mayores y menores), haplotipos y genotipos para el trasplante de tejido/órgano humano (o animal). Este aspecto da como resultado, por ejemplo, líneas celulares homocigóticas de HLA o razas animales humanizadas o un conjunto de ARNg que puede superponer tales alelos de HLA sobre líneas celulares o razas de otra manera deseables.
2. Las mutaciones de elementos cis-reguladores múltiples (CRE = señales para la transcripción, el corte y empalme, la traducción, el plegamiento del ARN y de proteínas, la degradación, etc.) en una única célula (o una colección de células) se pueden utilizar para estudiar de manera eficiente los conjuntos complejos de interacción reguladora que se pueden producir en el desarrollo normal o en escenarios patológicos, sintéticos o farmacéuticos. Según un aspecto, los CRE son (o se pueden hacer) de alguna manera ortogonales (es decir, baja interferencia) de manera que muchos se pueden someter a prueba en un solo entorno -- por ejemplo en una costosa serie temporal de embriones de animales. Una aplicación a modo de ejemplo es la secuenciación in situ con ARN fluorescente (FISSeq).
3. Las combinaciones múltiples de mutaciones de CRE y/o activación o represión epigenética de CRE se pueden utilizar para alterar o reprogramar iPSC o ESC u otras células madre o células no madre a cualquier tipo de célula o combinación de tipos de células para su utilización en órganos sobre chips u otros cultivos de células y órganos para fines de someter a prueba productos farmacéuticos (pequeñas moléculas, proteínas, ARN, células, células de animales, vegetales o microbianas, aerosoles y otros procedimientos de administración), estrategias de trasplante, estrategias de personalización, etc.
4. Producir células humanas mutantes múltiples para su utilización en pruebas de diagnóstico (y/o secuenciación de ADN) para genética médica. En la medida en que la ubicación de cromosomas y el contexto de un alelo humano genómico (o marca epigenética) puede influir en la precisión de un diagnóstico genético clínico, es importante tener alelos presentes en la ubicación correcta en un genoma de referencia - en lugar de en una ubicación ectópica (también conocida como transgénica) o en una pieza separada de ADN sintético. Una realización es una serie de líneas celulares independientes, una por cada SNP de diagnóstico humano, o variante estructural. Alternativamente, una realización incluye conjuntos de alelos múltiples en la misma célula. En algunos casos, los cambios múltiples en un gen (o múltiples genes) serán deseables bajo el supuesto de pruebas independientes. En otros casos, las combinaciones de alelos de haplotipo particulares permiten someter a prueba procedimientos de secuenciación (genotipado) que establecen de manera precisa la fase de haplotipo (es decir, si una o ambas copias de un gen resultan afectadas en una persona individual o en un tipo de célula somática).
5. Elementos repetitivos o elementos virales endógenos se pueden seleccionar como diana con sistemas Cas ARNg modificados por ingeniería genética en células microbianas, vegetales, animales o humanas para reducir la transposición perjudicial o para ayudar en la secuenciación u otras herramientas analíticas genómicas/transcriptómicas/proteómicas/de diagnóstico (en las que pueden ser problemáticas copias casi idénticas).
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Los siguientes ejemplos se exponen como representativos de la presente divulgación. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitativos del alcance de la presente divulgación, ya que estas y otras realizaciones equivalentes serán evidentes a la vista de la presente divulgación, las figuras y las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO I
Sistema CRISPR-Cas de tipo II
Según un aspecto, las realizaciones de la presente divulgación utilizan ARN corto para identificar ácidos nucleicos extraños para la actividad de una nucleasa en una célula eucariota. Según un determinado aspecto de la presente divulgación, una célula eucariota se altera para incluir dentro de su genoma ácidos nucleicos que codifican uno o más ARN cortos y una o más nucleasas que se activan mediante la unión de un ARN corto a una secuencia de ADN diana. Según determinados aspectos, se pueden identificar sistemas de ARN corto / enzima a modo de ejemplo dentro de bacterias o arqueas, tales como sistemas (Cas) asociados a CRISPR/(CRISPR) que utilizan ARN corto para dirigir la degradación de ácidos nucleicos extraños. La defensa CRISPR (“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) implica la adquisición y la integración de nuevos “espaciadores” diana contra el virus invasivo o el ADN plasmídico en el locus CRISPR, la expresión y el proceso de ARN de CRISPR guías (ARNcr) cortos que consisten en unidades de espaciador-repetición, y la escisión de ácidos nucleicos (más comúnmente ADN) complementarios al espaciador. Se conocen, en general, tres clases de sistemas CRISPR y se denominan de tipo I, de tipo II o de tipo III. Según un aspecto, una enzima útil particular, según la presente divulgación, para escindir ADNbc es la enzima efectora única, Cas9, común al tipo II (ver la referencia (1)). Dentro de las bacterias, el sistema efector de tipo II consiste en un pre-ARNcr largo transcrito desde el locus de CRISPR que contiene espaciador, la proteína Cas9 multifuncional y un ARNtracr importante para el proceso de ARNg. Los ARNtracr hibridan con las regiones de repetición que separan los espaciadores del pre-ARNcr, iniciando la escisión de ARNbc mediante la ARNasa III endógena, a lo que sigue un segundo evento de escisión dentro de cada espaciador por Cas9, produciendo ARNcr maduros que permanecen asociados con el ARNtracr y la Cas9. Según un aspecto, las células eucariotas de la presente divulgación están diseñadas para evitar la utilización de ARNasa III y el proceso de ARNcr en general. Ver la referencia (2).
Según un aspecto, la enzima de la presente divulgación, tal como Cas9, desenrolla el dúplex de ADN y busca secuencias que coincidan con el ARNcr a escindir. El reconocimiento de la diana se produce tras la detección de complementariedad entre una secuencia “protoespaciadora” en el ADN diana y la secuencia espaciadora restante en el ARNcr. De manera importante, la Cas9 corta el ADN solo si está presente también un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) correcto en el extremo 3’. Según determinados aspectos, se puede utilizar un motivo adyacente al protoespaciador diferente. Por ejemplo, el sistema de S. pyogenes requiere una secuencia NGG, en la que N puede ser cualquier nucleótido. Los sistemas de S. thermophilus de tipo II requieren NGGNG (ver la referencia (3)) y NNAGAAW (ver la referencia (4)), respectivamente, mientras que sistemas de S. mutans diferentes toleran NGG o NAAR (ver la referencia (5)). Los análisis bioinformáticos han generado bases de datos extensas de loci de CRISPR en una variedad de bacterias que pueden servir para identificar PAM útiles adicionales y expandir el conjunto de secuencias dirigibles a CRISPR (ver las referencias (6, 7)). En S. thermophilus, la Cas9 genera una ruptura de doble cadena de extremos romos de 3 pb antes del extremo 3’ del protoespaciador (ver la referencia (8)), un proceso mediado por dos dominios catalíticos en la proteína Cas9: un dominio HNH que escinde la cadena complementaria del ADN y un dominio de tipo RuvC que escinde la cadena no complementaria (ver la figura 1A y la figura 3). Mientras que el sistema de S. pyogenes no se ha caracterizado al mismo nivel de precisión, la formación de DSB (“Double Strand Breaks”, rupturas de doble cadena) también se produce hacia el extremo 3’ del protoespaciador. Si uno de los dos dominios nucleasa se inactiva, la Cas9 funcionará como una nickasa in vitro (ver la referencia (2)) y en células humanas (ver la figura 5).
Según un aspecto, la especificidad de la escisión de Cas9 dirigida a ARNg se utiliza como un mecanismo para la modificación por ingeniería genética del genoma en una célula eucariota. Según un aspecto, la hibridación del ARNg no necesita ser del 100 por ciento para que la enzima reconozca el híbrido ARNg/ADN y afecte la escisión. Podría producirse alguna actividad fuera de la diana. Por ejemplo, el sistema de S. pyogenes tolera apareamientos erróneos en las primeras 6 bases de la secuencia espadadora madura de 20 pb in vitro. Según un aspecto, una mayor rigurosidad puede ser beneficiosa in vivo cuando existen posibles sitios fuera de la diana que coinciden con NGG (últimos 14 pb) dentro del genoma de referencia humano para los ARNg. El efecto de los apareamientos erróneos y la actividad enzimática, en general, se describen en las referencias (9), (2), (10) y (4).
Según determinados aspectos, se puede mejorar la especificidad. Cuando la interferencia es sensible a la temperatura de fusión del híbrido ARNg-ADN, las secuencias diana ricas en AT pueden tener menos sitios fuera de la diana. Elegir cuidadosamente los sitios diana para evitar pseudositios con secuencias concordantes de, como mínimo, 14 pb en otras partes del genoma puede mejorar la especificidad. La utilización de una variante de Cas9 que requiere una secuencia PAM más larga puede reducir la frecuencia de los sitios fuera de la diana. La evolución dirigida puede mejorar la especificidad de Cas9 a un nivel suficiente para imposibilitar completamente la actividad fuera de la diana, requiriendo idealmente una coincidencia perfecta del ARNg de 20 pb con un PAM mínimo. Por consiguiente, la modificación de la proteína Cas9 es una realización representativa de la presente divulgación. De este modo, se prevén procedimientos novedosos que permiten muchas rondas de evolución en un periodo de tiempo corto (ver la referencia (11)). Los sistemas CRISPR útiles en la presente divulgación se describen en las referencias (12, 13).
EJEMPLO II
Construcción de plásmidos
Se optimizó la secuencia génica de Cas9 para codón humano y se ensambló mediante ensamblaje por PCR de fusión jerárquica de gBlocks de 9.500 pb ordenados de IDT. La figura 3A para el sistema CRISPR de tipo II modificado por ingeniería genética para células humanas muestra el formato de expresión y la secuencia completa del inserto del gen cas9. Los motivos HNH y de tipo RuvC, y la NLS (“Nuclear Localization Sequence”, secuencia de localización nuclear) de SV40 del extremo C-terminal se destacan, respectivamente, en colores azul, marrón y naranja. Cas9_D10A se construyó de manera similar. Se clonaron los productos de longitud completa resultantes en el vector pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen). Se ordenaron las construcciones de expresión del ARNg diana directamente como gBlocks de 455 pb individuales de IDT, y se clonaron en el vector pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen) o se amplificaron por pcr. La figura 3B muestra el esquema de expresión basado en el promotor U6 para los ARN guías y la estructura secundaria de transcripción de ARN predicha. La utilización del promotor U6 limita la 1a posición en el transcrito de ARN para ser una “G” y, por tanto, todos los sitios genómicos de la forma GN20GG pueden seleccionarse como diana utilizando este enfoque. La figura 3C muestra los 7 ARNg utilizados.
Se construyeron los vectores para el ensayo del indicador de HR que implican una GFP rota mediante ensamblaje por PCR de fusión de la secuencia de GFP que alberga el codón de terminación y el fragmento AAVS1 de 68 pb (o mutantes del mismo; ver la figura 6), o fragmentos de 58 pb de los loci genómicos de DNMT3a y DNMT3b (ver la figura 8) ensamblados en el lentivector EGIP de Addgene (plásmido n.° 26777). Estos lentivectores se utilizaron luego para establecer las líneas estables del indicador GFP. Las TALEN utilizadas en este estudio se construyeron utilizando los protocolos descritos en (14). Todos los reactivos de ADN desarrollados en este estudio están disponibles en Addgene.
EJEMPLO III
Cultivo celular
Se mantuvieron células PGP1 iPS en placas recubiertas de Matrigel (BD Biosciences) en mTeSR1 (Stemcell Technologies). Se pasaron los cultivos cada 5-7 d con TrypLE Express (Invitrogen). Se hicieron crecer células K562 y se mantuvieron en RPMI (Invitrogen) que contenía FBS al 15 %. Se cultivaron células HEK 293T en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) con alto contenido de glucosa suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Invitrogen), penicilina/estreptomicina (pen/estrep, Invitrogen), y aminoácidos no esenciales (NEAA, Invitrogen). Se mantuvieron todas las células a 37 °C y el 5% de CO2 en una incubadora humidificada. EJEMPLO IV
Direccionamiento génico de PGP1 iPS, K562 y 293T
Se cultivaron células PGP1 iPS en inhibidor de la Rho cinasa (ROCK) (Calbiochem) 2 h antes de la nucleofección. Se recolectaron las células utilizando TrypLE Express (Invitrogen), y se resuspendieron 2x106 células en reactivo P3 (Lonza) con 1 |¿g de plásmido Cas9, 1 |¿g de ARNg y/o 1 |¿g de plásmido donante de ADN, y se nucleofectaron según las instrucciones del fabricante (Lonza). Posteriormente, se sembraron las células en una placa recubierta con mTeSR1 en un medio mTeSR1 suplementado con inhibidor ROCK durante las primeras 24 h. Para K562, se resuspendieron 2x106 células en reactivo SF (Lonza) con 1 |¿g de plásmido Cas9, 1 |¿g de ARNg y/o 1 |¿g de plásmido donante de ADN, y se nucleofectaron según las instrucciones del fabricante (Lonza). Para 293T, se transfectaron 0,1x106 células con 1 |¿g de plásmido Cas9, 1 |¿g de ARNg y/o 1 |¿g de plásmido donante de ADN utilizando Lipofectamine 2000 según los protocolos del fabricante. Los donantes de ADN utilizados para dirigir la AAVS1 endógena fueron un donante de ADNbc (figura 2C) o un oligonucleótido 90 meros. El primero tiene brazos de cortos de homología flanqueantes y un casete SA-2A-puromicina-CaGGS-eGFP para enriquecer las células seleccionadas como diana con éxito.
Se evaluó la eficiencia del direccionamiento tal como sigue. Se recolectaron las células 3 días después de la nucleofección y se extrajo el ADN genómico de ~1x106 células utilizando prepGEM (ZyGEM). Se realizó la PCR para amplificar la región de direccionamiento con ADN genómico derivado de las células y se secuenciaron los amplicones de manera profunda mediante el secuenciador personal MiSeq (Illumina) con una cobertura >200.000 lecturas. Se analizaron los datos de secuenciación para estimar las eficiencias de NHEJ. La secuencia AAVS1 de referencia analizada es:
CACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCA
ccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccc TCCACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTT AGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAG ATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGA
Los cebadores de PCR para amplificar las regiones de direccionamiento en el genoma humano son:
AAVS1 - R CT CGGCATTCCTGCT GAACCGCT CTTCCGAT CT acaggaggtgggggttagac
AAVS1-F.1 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CTCGTGATtatattcccagggccggtta
AAVS1-F.2 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CT ACATCGtatattcccagggccggtta
AAVS1-F.3 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CTGCCT AAtatattcccagggccggtta
AAVS 1-F.4 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CTT GGTCAtatattcccagggccggtta
AAVS1-F.5 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CT CACT GTtatattcccagggccggtta
AAVS1-F.6 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CT ATT GGCtatattcccagggccggtta
AAVS 1-F.7 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CT GAT CT Gtatattcccagggccggtta
AAVS 1-F.8 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CTT CAAGTtatattcccagggccggtta
AAVS 1-F.9 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGAT CT CT GAT Ctatattcccagggccggtta
AAVS1 -F.10 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCTAtatattcccagggccggtta
AAVS1 -F.11 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTAGCCtatattcccagggccggtta
AAVS1 -F.12 ACACT CTTTCCCT ACACGACGCT CTTCCGATCTT ACAAGtatattcccagggccggtta
Para analizar los eventos de HR utilizando el donante de ADN en la figura 2C, los cebadores utilizados fueron:
HR_AAVS1-F CTGCCGTCTCTCTCCTGAGT
HR_Puro-R GTGGGCTTGTACTCGGTCAT
EJEMPLO V
Enfoque bioinformático para computar dianas CRISPR de exón humano y metodología para su síntesis multiplexada Se determinó un conjunto de secuencias génicas de ARNg que se dirigen al máximo a ubicaciones específicas en exones humanos pero se dirigen al mínimo a otras ubicaciones en el genoma tal como sigue. Según un aspecto, el direccionamiento eficiente al máximo por un ARNg se consigue por secuencias de 23 nt, los 20 nt más 5’ de las cuales complementan exactamente una ubicación deseada, mientras que las tres bases más 3’ deben ser de forma NGG. Además, el nt más 5’ debe ser una G para establecer un sitio de inicio de la transcripción de pol-III. Sin embargo, según (2), el apareamiento erróneo de los seis nt más 5’ de un ARNg de 20 pb contra su diana genómica no anula la escisión mediada por Cas9, siempre que los últimos 14 nt se apareen de manera apropiada, pero el apareamiento erróneo de los ocho nt más 5’ junto con el apareamiento de los últimos 12 nt, mientras que el caso de los siete nt más 5’ se aparean erróneamente y los 13 pares en 3’ no se sometieron a prueba. Para ser conservadora con respecto a los efectos fuera de la diana, una condición era que el caso de los siete apareamientos erróneos más 5’ es, como en el caso de seis, permisivo de escisión, de forma que el apareamiento de los 13nt más 3’ es suficiente para la escisión. Para identificar los sitios diana CRISPR dentro de los exones humanos que deben ser escindibles sin cortes fuera de la diana, se examinaron todas las secuencias de 23 pb de la forma 5’-GBBBB BBBBB BBBBB BBBBB NGG-3’ (forma 1), en la que la B’ representa las bases en la ubicación del exón, para las que no hay secuencia de la forma 5’-NNNNN NNBBB b Bb BB BBBBB NGG-3’ (forma 2) en cualquier otra ubicación en el genoma humano. Específicamente, (i) se descargó un archivo BED de ubicaciones de regiones codificantes de todos los genes RefSeq, el genoma humano GRCh37/hg19 del navegador de genomas UCSC (15-17). Las ubicaciones de exones codificantes en este archivo BED comprendían un conjunto de 346.089 mapeos de los registros de ARNm RefSeq para el genoma hg19. Sin embargo, algunos registros de ARNm RefSeq se asignaron a múltiples ubicaciones genómicas (probables duplicaciones génicas), y muchos registros se mapearon a subconjuntos del mismo conjunto de ubicaciones de exones (múltiples isoformas de los mismos genes). Para distinguir casos de genes aparentemente duplicados y consolidar las múltiples referencias al mismo caso de exón genómico mediante múltiples registros de isoformas RefSeq, (ii) se añadieron sufijos numéricos únicos a 705 números de registro de RefSeq que tenían múltiples ubicaciones genómicas, y (iii) se utilizó la función mergeBed de BEDTools (18) (v2.16.2-zip-87e3926) para consolidar las ubicaciones de exones superpuestas en regiones de exón unidas. Estas etapas redujeron el conjunto inicial de 346.089 ubicaciones de exones RefSeq a 192.783 regiones genómicas distintas. Se descargó la secuencia hg19 para todas las regiones de exones unidas utilizando el navegador de tablas UCSC, añadiendo 20 pb de relleno en cada extremo. (iv) Utilizando un código perl personalizado, se identificaron 1.657.793 casos de la forma 1 dentro de esta secuencia exónica, (v) se filtraron luego estas secuencias por la existencia de ocurrencias de fuera de la diana de la forma 2: para cada diana de la forma 1 de exón unido, se extrajeron las secuencias de “núcleo” (B) específicas de 13 pb más 3’ y, para cada núcleo generado las cuatro secuencias de 16 pb 5’-BBB BBBBB bBb BB NGG-3’ (N = A, C, G y T), y se buscó el genoma hg19 entero para extraer coincidencias con estas 6.631.172 secuencias utilizando Bowtie versión 0.12.8 (19) utilizando los parámetros -1 16 -v 0 -k 2. Se rechazó cualquier sitio diana de exón para el cual existiera más de una única coincidencia. Obsérvese que, debido a que cualquier secuencia de núcleo de 13 pb específica seguida por la secuencia NGG confiere solo 15 pb de especificidad, debe existir un promedio ~5,6 coincidencias con una secuencia de núcleo extendida en una secuencia aleatoria de ~3 Gb (ambas cadenas). Por tanto, se rechazó la mayoría de las 1.657.793 dianas identificadas inicialmente; sin embargo 189.864 secuencias pasaron este filtro. Estas comprenden el conjunto de ubicaciones exónicas dirigibles a CRISPR en el genoma humano. Las 189.864 secuencias se dirigen a ubicaciones en 78.028 regiones exónicas unidas (~40,5 % del total de 192.783 regiones de exones humanos unidas) a una multiplicidad de ~2,4 sitios por región exónica dirigida. Para evaluar el direccionamiento a nivel génico, se agruparon los mapeos de ARNm RefSeq de forma que dos registros RefSeq cualesquiera (incluyendo los duplicados génicos distinguidos en (ii)) que solapan una región de exón unida, se cuentan como una única agrupación génica, los 189.864 sitios CRISPR específicos exónicos se dirigen a 17.104 de las 18.872 agrupaciones génicas (~90,6 % de todas las agrupaciones génicas) a una multiplicidad de ~11,1 por agrupación génica seleccionada como diana (obsérvese que mientras estas agrupaciones génicas colapsan los registros de ARNm RefSeq que representan múltiples isoformas de un único gen transcrito en una única entidad, colapsarán también los distintos genes que solapan así como con genes antisentido transcritos). Al nivel de registros RefSeq originales, las 189.864 secuencias se dirigían a regiones exónicas en 30.563 de un total de 43.726 (~69,9 %) registros RefSeq mapeados (incluyendo duplicados génicos distinguidos) a una multiplicidad de ~6,2 sitios por registro RefSeq mapeado seleccionado como diana.
Según un aspecto, se puede refinar la base de datos correlacionando el rendimiento con factores, tales como la composición de la base y estructuras secundarias tanto de ARNg como de dianas genómicas (20, 21), y el estado epigenético de estas dianas en líneas celulares humanas para las que esta información está disponible (22).
EJEMPLO VI
Síntesis múltiple
Se incorporaron las secuencias diana en un formato de 200 pb que es compatible para síntesis múltiple en micromatrices de ADN (23, 24). Según un aspecto, el procedimiento permite la recuperación dirigida de un ARNg específico o conjunto de secuencias de ARNg del conjunto de oligonucleótidos basado en la micromatriz de ADN y su rápida clonación en un vector de expresión común (figura 13A). Específicamente, se sintetizó la agrupación de oligonucleótidos de 12k de CustomArray Inc. Además, se recuperaron con éxito los ARNg de elección de esta biblioteca (figura 13B). Se observó una tasa de error de ~4 mutaciones por 1000 pb de ADN sintetizado.
EJEMPLO VII
La edición del genoma guiada por ARN requiere tanto Cas9 como ARN guía para el direccionamiento con éxito Utilizando el ensayo informador de GFP descrito en la figura 1B, se sometieron a prueba todas las posibles combinaciones del donante de ADN de reparación, la proteína Cas9 y el ARNg para determinar su capacidad para lograr una HR ventajosa (en 293T). Tal como se muestra en la figura 4, se observaron células GFP+ solo cuando los 3 componentes estaban presentes, validando que estos componentes de CRISPR son esenciales para la edición del genoma guiada por ARN. Los datos son media /- SEM (N=3).
EJEMPLO VIII
Análisis de la edición del genoma mediada por ARNg y Cas9
Se examinó el proceso de edición del genoma mediada por CRISPR utilizando (A) un ensayo informador de GFP tal como describen los resultados previos los cuales se muestran en la figura 5A, y (B) la secuenciación profunda de los loci diana (en 293T), cuyos resultados se muestran en la figura 5B. Como comparación, se sometió a prueba un mutante D10A para Cas9 que ha mostrado en informes previos que funciona como una nickasa en ensayos in vitro. Tal como se muestra en la figura 5, tanto Cas9 como Cas9D10A pueden lograr una HR ventajosa a tasas casi similares. La secuenciación profunda, sin embargo, confirma que mientras Cas9 muestra una NHEJ robusta en los loci seleccionados como diana, el mutante D10A ha disminuido de manera significativa las tasas de NHEJ (tal como se esperaría a partir de su capacidad putativa para solo una muesca de ADN). Además, acorde con la bioquímica conocida de la proteína Cas9, los datos de NHEJ confirman que la mayoría de deleciones o inserciones de pares de bases se produjeron cerca del extremo 3’ de la secuencia diana: el pico es ~3-4 bases en el sentido de 5’ del sitio PAM, con una frecuencia de deleción media de ~9-10 pb. Los datos son media /- SEM (N=3).
EJEMPLO IX
La edición del genoma guiada por ARN es específica de secuencia diana
De manera similar al ensayo informador de GFP descrito en la figura 1B, se desarrollaron 3 líneas estables de 293T cada una albergando una construcción informadora GFP distinta. Estas se distinguen por la secuencia del inserto del fragmento AAVS1 (tal como se indica en la figura 6). Una línea albergaba el fragmento de tipo natural mientras las otras dos líneas se mutaron a 6 pb (destacadas en rojo). Luego, se seleccionó como diana cada una de las líneas por uno de los siguientes 4 reactivos: un par GFP-ZFN que puede seleccionar como diana todos los tipos celulares ya que su secuencia diana estaba presente en los fragmentos GFP flanqueantes y, por tanto, presente en las líneas celulares; una TALEN de AAVS1 que podría seleccionar como diana de manera potencial solo el fragmento wt-AAVS1 ya que las mutaciones en las otras dos líneas deben hacer que la TALEN sea incapaz de unirse a sus sitios; el ARNg de T1 que puede seleccionar como diana también de manera potencial solo el fragmento wt-AAVS1, ya que su sitio diana está interrumpido también en las dos líneas mutantes; y finalmente el ARNg de T2 que debe ser capaz de seleccionar como diana las 3 líneas celulares ya que, a diferencia del ARNg de T1, su sitio diana está inalterado entre las 3 líneas. ZFN modificó los 3 tipos celulares, los TALEN de AAVS1 y el ARNg de T1 seleccionaron como diana solo el tipo celular wt-AAVS1, y el ARNg de T2 selecciona como diana con éxito los 3 tipos celulares. Estos resultados juntos confirman que la edición mediada por ARN guía es específica de la secuencia diana. Los datos son media /- SEM (N=3).
EJEMPLO X
Los ARN guía dirigidos a la secuencia de GFP permiten una edición genómica robusta
Además de los 2 ARNg que seleccionan como diana el inserto AAVS1, se sometieron a prueba dos ARNg adicionales que seleccionan como diana las secuencias de GFP flanqueantes del informador descrito en la figura 1B (en 293T). Tal como se muestra en la figura 7, estos ARNg fueron capaces también de efectuar una HR robusta en este locus diseñado. Los datos son media /- SEM (N=3).
EJEMPLO XI
La edición del genoma guiada por ARN es específica de la secuencia diana, y demuestra eficiencias de direccionamiento similares a las ZFN o TALEN
De manera similar al ensayo informador de GFP descrito en la figura 1B, se desarrollaron dos líneas estables de 293T cada una albergando una construcción informadora GFP distinta. Estas se distinguen por la secuencia del inserto del fragmento (tal como se indica en la figura 8). Una línea albergaba un fragmento de 58 pb del gen DNMT3a mientras que la otra línea albergaba un homólogo del fragmento de 58 pb del gen DNMT3b. Las diferencias de secuencia se destacan en rojo. Luego, se seleccionó como diana cada una de las líneas por uno de los siguientes 6 reactivos: un par GFP-ZFN que puede seleccionar como diana todos los tipos celulares ya que su secuencia diana estaba presente en los fragmentos GFP flanqueantes y, por tanto, presente en las líneas celulares; un par de TALEN que seleccionan como diana de manera potencial fragmentos DNMT3a o DNMT3b; un par de ARNg que pueden seleccionar como diana también de manera potencial solo el fragmento DNMT3a; y finalmente un ARNg que debe seleccionar como diana solo de manera potencial el fragmento DNMT3b. Tal como se indica en la figura 8, el ZFN modificó los 3 tipos celulares, y las TALEN y los ARNg solo sus respectivas dianas. Además, las eficiencias de direccionamiento fueron comparables entre los 6 reactivos de direccionamiento. Estos resultados juntos confirman que la edición mediada por ARN guía es específica de la secuencia diana y demuestra eficiencias de direccionamiento similares a ZFN o TALEN. Los datos son media /- SEM (N=3).
EJEMPLO XII NHEJ guiada por ARN en células iPS humanas
Se nucleofectaron células iPS humanas (PGP1) con las construcciones indicadas en el panel izquierdo de la figura 9. Se midió la tasa de NHEJ 4 días después de la nucleofección mediante la evaluación de las tasas de deleción e inserción genómicas en las rupturas de doble cadena (DSB) mediante secuenciación profunda. Panel 1: tasa de deleción detectada en la región de direccionamiento. Líneas de trazos rojos: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T1; líneas de trazos verdes: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T2. Se trazó la frecuencia de deleción en cada posición de nucleótido en líneas negras y se calculó la tasa de deleción como el porcentaje de lecturas que llevaban deleciones. Panel 2: tasa de inserción detectada en la región de direccionamiento. Líneas de trazos rojos: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T1; líneas de trazos verdes: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T2. Se trazó la frecuencia de inserción en la ubicación genómica donde se detectó la primera unión de inserción en líneas negras y se calculó la tasa de inserción como el porcentaje de lecturas que llevaban inserciones. Panel 3: distribución del tamaño de deleción. Se trazaron las frecuencias de deleciones de tamaño diferente entre toda la población de NHEJ. Panel 4: distribución del tamaño de inserción. Se trazaron las frecuencias de inserciones de tamaño diferente entre toda la población de NHEJ. El direccionamiento de iPS mediante ambos ARNg es eficiente (2-4 %), específico de secuencia (tal como se muestra mediante el desplazamiento en posición de las distribuciones de deleción de NHEJ), y reafirmando los resultados de la figura 4, el análisis basado en NGS muestra también que tanto la proteína Cas9 como el ARNg son esenciales para los eventos de NHEJ en el locus diana.
EJEMPLO XIII NHEJ guiada por ARN en células K562
Se nuclearon células K562 con las construcciones indicadas en el panel izquierdo de la figura 10. Se midió la tasa de NHEJ 4 días después de la nucleofección mediante la evaluación de las tasas de deleción e inserción genómicas en las DSB mediante secuenciación profunda. Panel 1: tasa de deleción detectada en la región de direccionamiento. Líneas de trazos rojos: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T1; líneas de trazos verdes: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T2. Se trazó la frecuencia de deleción en cada posición de nucleótido en líneas negras y se calculó la tasa de deleción como el porcentaje de lecturas que llevaban deleciones. Panel 2: tasa de inserción detectada en la región de direccionamiento. Líneas de trazos rojos: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T1; líneas de trazos verdes: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T2. Se trazó la frecuencia de inserción en la ubicación genómica donde se detectó la primera unión de inserción en líneas negras y se calculó la tasa de inserción como el porcentaje de lecturas que llevaban inserciones. Panel 3: distribución del tamaño de deleción. Se trazaron las frecuencias de deleciones de tamaño diferente entre toda la población de NHEJ. Panel 4: distribución del tamaño de inserción. Se trazaron las frecuencias de inserciones de tamaño diferente entre toda la población de NHEJ. El direccionamiento de K562 mediante ambos ARNg es eficiente (13-38 %) y específico de secuencia (tal como se muestra mediante el desplazamiento en la posición de las distribuciones de deleción de NHEJ). De manera importante, tal como se evidencia mediante los picos en el histograma de frecuencias observadas de tamaños de deleción, la introducción simultánea de ARN guía tanto de T1 como de T2 dio como resultado una deleción de alta eficiencia del fragmento de 19 pb intercalado, demostrando que la edición multiplexada de loci genómicos es también factible utilizando este enfoque.
EJEMPLO XIV NHEJ guiada por ARN en células 293T
Se transfectaron células 293T con las construcciones indicadas en el panel izquierdo de la figura 11. Se midió la tasa de NHEJ 4 días después de la nucleofección mediante la evaluación de las tasas de deleción e inserción genómicas en las DSB mediante secuenciación profunda. Panel 1: tasa de deleción detectada en la región de direccionamiento. Líneas de trazos rojos: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T1; líneas de trazos verdes: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T2. Se trazó la frecuencia de deleción en cada posición de nucleótido en líneas negras y se calculó la tasa de deleción como el porcentaje de lecturas que llevaban deleciones. Panel 2: tasa de inserción detectada en la región de direccionamiento. Líneas de trazos rojos: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T1; líneas de trazos verdes: límites del sitio de direccionamiento de ARN de T2. Se trazó la frecuencia de inserción en la ubicación genómica donde se detectó la primera unión de inserción en líneas negras y se calculó la tasa de inserción como el porcentaje de lecturas que llevaban inserciones. Panel 3: distribución del tamaño de deleción. Se trazaron las frecuencias de deleciones de tamaño diferente entre toda la población de NHEJ. Panel 4: distribución del tamaño de inserción. Se trazaron las frecuencias de inserciones de tamaño diferente entre toda la población de NHEJ. El direccionamiento de 293T mediante ambos ARNg es eficiente (10-24 %) y específico de secuencia (tal como se muestra mediante el desplazamiento en posición de las distribuciones de deleción de NHEJ).
EJEMPLO XV HR en el locus AAVS1 endógeno utilizando un donante de ADNbc o un donante de oligonucleótidos corto
Tal como se muestra en la figura 12A, la detección por PCR (con referencia a la figura 2C) confirmó que 21/24 clones de 293T elegidos al azar se seleccionaron como diana con éxito. Tal como se muestra en la figura 12B, una detección por PCR similar confirmó que 3/7 clones de PGP1-iPS elegidos al azar se seleccionaron como diana también con éxito. Tal como se muestra en la figura 12C, oligómeros cortos de 90 meros podrían también afectar el direccionamiento robusto en el locus AAVS1 endógeno (mostrado aquí para las células K562).
EJEMPLO XVI
Metodología para síntesis múltiple, recuperación y clonación del vector de expresión U6 de ARN guías que seleccionan como diana genes en el genoma humano
Se generó un recurso de aproximadamente 190k sitios de ARNg únicos calculados de manera bioinformática que se seleccionan como diana el ~40,5 % de todos los exones de genes en el genoma humano. Tal como se muestra en la figura 13A, se incorporaron los sitios diana de ARNg en un formato de 200 pb que es compatible para la síntesis múltiple en micromatrices de ADN. Específicamente, el diseño permite (i) la recuperación dirigida de un ARNg específico o conjunto de ARNg diana del conjunto de oligonucleótidos de la micromatriz de ADN (a través de 3 rondas secuenciales de PCR anidada tal como se indica en el esquema de la figura); y (ii) clonación rápida a un vector de expresión común que tras la linealización utilizando un sitio AflII sirve como un receptor para la incorporación mediada por el ensamblaje de Gibson del fragmento del inserto de ARNg. Tal como se muestra en la figura 13B, se utilizó el procedimiento para lograr una recuperación dirigida de 10 ARNg unidos de un grupo de oligonucleótidos de 12k sintetizados por CustomArray Inc.
EJEMPLO XVII
Activación transcripcional guiada por ARN mediada por CRISPR
El sistema CRISPR-Cas tiene un sistema de defensa inmunitario adaptado en bacterias y funciona para “escindir” los ácidos nucleicos invasores. Según un aspecto, el sistema CRISPR-CAS se diseña para funcionar en células humanas, y para “escindir” ADN genómico. Esto se logra mediante un ARN guía corto que dirige una proteína Cas9 (que tiene función nucleasa) a una secuencia diana complementaria al espaciador en el ARN guía. La capacidad para “escindir” ADN permite una gran cantidad de aplicaciones relacionadas con la edición del genoma, y también la regulación del genoma dirigida. En relación a esto, se mutó la proteína Cas9 para hacerla nula a la nucleasa introduciendo mutaciones que se predice que anulan el acoplamiento a Mg2+ (que se sabe que es importante para las funciones de la nucleasa de los dominios tipo RuvC y tipo HNH): específicamente, se introdujeron combinaciones de mutaciones D10A, D839A, H840A y N863A. La proteína nula de nucleasa Cas9 así generada (tal como se confirma por su capacidad de no cortar ADN mediante el análisis de secuenciación) y denominada en lo sucesivo Cas9R-H-, se acopló luego a un dominio de activación transcripcional, aquí VP64, permitiendo al sistema CRISPR-Cas funcionar como un factor de transcripción guiado por ARN (ver la figura 14). La fusión Cas9R-H- VP64 permite la activación transcripcional guiada por ARN en los dos informadores mostrados. Específicamente, tanto el análisis FACS como las imágenes de inmunofluorescencia demuestran que la proteína permite el direccionamiento específico de la secuencia de ARNg de los informadores correspondientes, y además, que la activación de la transcripción resultante, tal como se sometió a ensayo mediante la expresión de una proteína fluorescente dTomato, estaba a niveles similares a aquellos inducidos por una proteína de fusión TALE-VP64 convencional.
EJEMPLO XVIII
Flexibilidad de la secuencia de ARNg y aplicaciones de la misma
Se determinó la flexibilidad de la secuencia del armazón de ARNg para las inserciones de secuencia de diseño mediante el análisis sistemático para un intervalo de las inserciones de secuencia aleatorias en las porciones 5’, central y 3’ del ARNg: específicamente, se realizaron insertos de 1 pb, 5 pb, 10 pb, 20 pb y 40 pb en la secuencia de ARNg en los extremos 5’, central y 3’ del ARNg (las posiciones exactas de la inserción se destacan en “rojo” en la figura 15). Luego, se sometió a prueba la funcionalidad de este ARNg por su capacidad para inducir HR en un ensayo informador de GFP (tal como se describe en el presente documento). Es evidente que los ARNg son flexibles para las inserciones de secuencia en los extremos 5’ y 3’ (medido mediante la actividad inductora de HR retenida). Por consiguiente, los aspectos de la presente divulgación se orientan al marcaje de aptámeros de ARN sensibles a moléculas pequeñas que pueden desencadenar el inicio de la actividad de ARNg, o la visualización de ARNg. Además, los aspectos de la presente divulgación se orientan para unir los donantes de ADNmc al ARNg mediante hibridación, permitiendo así el acoplamiento del corte diana genómico y la localización física inmediata del molde de reparación que puede promover tasas de recombinación homologa sobre la unión final no homologa propensa a errores.
Referencias
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Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro o ex vivo de alteración de una célula eucariota, que comprende
proporcionar a la célula eucariota una secuencia de ARN guía GN19 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU,
en el que la secuencia GN19 es complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana y se une a la secuencia de ácido nucleico diana, y
proporcionar a la célula eucariota una proteína Cas 9 que interactúa con la secuencia de ARN guía, y
en el que el procedimiento no comprende un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en el que la célula no es un embrión humano.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína Cas 9 es una enzima Cas9 y se escinde la secuencia de ácido nucleico diana.
3. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la secuencia de ARN guía se proporciona a la célula introduciendo en la célula un primer ácido nucleico que codifica la secuencia de ARN guía, en el que la proteína Cas 9 se proporciona a la célula introduciendo en la célula un segundo ácido nucleico que codifica la proteína Cas9, y
en el que la célula produce el ARN guía y la proteína Cas9.
4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que el primer ácido nucleico se introduce en la célula utilizando un procedimiento de administración viral.
5. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que el primer y/o el segundo ácido nucleico se introducen en la célula mediante transfección.
6. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que el primer ácido nucleico se introduce en la célula utilizando un virus adenoasociado.
7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína Cas9 es una enzima Cas9, una Cas9 nickasa, una nucleasa nula Cas9, una Cas9 modificada o un homólogo de Cas9.
8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la célula eucariota es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero.
9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula es una célula humana.
10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se proporciona una pluralidad de secuencias de ARN guía complementarias a diferentes secuencias de ácido nucleico diana a la célula eucariota, en el que la secuencia de ARN guía se une a la secuencia de ácido nucleico diana diferente,
y la proteína Cas 9 interactúa con la pluralidad de secuencias de ARN guía.
11. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ARN guía es una fusión ARNcr-ARNtracr.
12. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteína Cas9 está optimizada para codones humanos.
13. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que se proporcionan a la célula secuencias de ARN guía complementarias a las secuencias de ácido nucleico diana en un locus, en el que las secuencias de ARN guía se unen a las secuencias de ácido nucleico diana y la proteína Cas9 es una enzima Cas9 que escinde las secuencias de ácido nucleico diana y se deleciona una secuencia de ácido nucleico intercalada del locus.
14. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la proteína Cas9 es una enzima Cas9 que escinde la secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico donante proporcionada a la célula eucariota se inserta en la secuencia de ácido nucleico diana.
15. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína Cas9 es nucleasa nula e interactúa con la secuencia de ARN guía y se une a la secuencia de ácido nucleico diana,
en el que la proteína Cas 9 tiene un dominio nucleasa Fokl unido a la misma,
en el que una secuencia de ácido nucleico diana se escinde tras la dimerización del dominio nucleasa Fokl de la secuencia de ARN guía adyacente y los complejos de colocalización de proteína Cas9.
16. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína Cas9 es nucleasa nula e incluye un dominio de activación o represión transcripcional y en el que se modula la expresión de un gen diana.
17. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína Cas9 es nucleasa nula e incluye una proteína fluorescente y en el que se visualiza la proteína fluorescente.
18. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína Cas9 es nucleasa nula e incluye un fluoróforo orgánico unido a proteína, un fluoróforo orgánico unido un ácido nucleico, un punto cuántico, una baliza molecular, una sonda de eco o un dominio de proteína de unión a ligando multivalente.
19. Sistema de edición del genoma guiado por ARN, que comprende:
secuencia de ARN guía GN19 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU, en el que la secuencia GN19 es complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana y se une a la secuencia de ácido nucleico diana; o una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de ARN guía; y
una proteína Cas9 que interactúa con la secuencia de ARN guía, o una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Cas9, en el que la proteína Cas9 incluye una señal de localización nuclear SV40 C-terminal.
20. Sistema de edición del genoma guiado por ARN, según la reivindicación 19, para su utilización en terapia génica.
21. Célula eucariota que contiene el sistema de edición del genoma guiado por ARN, según la reivindicación 19, en la que la célula no es una célula germinal humana ni un embrión humano.
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