JP2021048882A - Ｒｎａ誘導性ヒトゲノム改変 - Google Patents

Abstract

【課題】真核細胞を改変する方法の提供。【解決手段】真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることを含み、前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素がゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、真核細胞を改変する方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願データ
本願は、２０１３年３月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／７７９，１６９号および２０１２年１２月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／７３８，３５５号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府利益に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＰ５０ＨＧ００５５５０の下、政府の援助により成されたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。

細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｃｒＲＮＡに依存して、侵入するウイルスおよびプラスミドＤＮＡ中に存在する相補的配列を分解する（参照文献１〜３）。近年、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構築により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡが、Ｃａｓ９タンパク質に該ｃｒＲＮＡにマッチする標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された（参照文献４）。

本開示は文献を数字で参照し、それらは本開示の最後に列挙されている。数字に対応する文献は、完全に引用された場合と同様に、数字に対応する補足文献として参照により本明細書に組み込まれる。

本開示のある態様によれば、ゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡおよび該ＲＮＡと相互作用する酵素を含む二成分系が真核細胞にトランスフェクトされる。ＲＮＡおよび酵素は細胞によって発現される。次いで、ＲＮＡ／酵素複合体のＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合する。次いで、酵素が前記ゲノムＤＮＡの切断などの機能を果たす。ＲＮＡは、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む。ＲＮＡは、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、酵素は、部位特異的に任意の所望の機能を果たすことができ、そのために酵素が改変されている。ある態様によれば、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。ある態様によれば、酵素は、ＲＮＡ配列の標的とされたゲノム配列を切断し（参照文献（４〜６）参照）、これによりゲノム改変された真核細胞が作り出される。

ある態様によれば、本開示は、ゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を細胞のゲノム中に含めること、およびゲノムＤＮＡ上で所望の機能を果たす酵素をコードする核酸を細胞のゲノム中に含めることにより、ヒト細胞を遺伝子改変する方法を提供する。ある態様によれば、ＲＮＡおよび酵素が発現される。ある態様によれば、ＲＮＡは相補的ゲノムＤＮＡとハイブリダイズする。ある態様によれば、ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡとハイブリダイズすると、酵素が活性化されて、切断などの所望の機能を部位特異的が果たされる。ある態様によれば、ＲＮＡおよび酵素は、細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネントである。

ある態様によれば、真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることを含み、前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、真核細胞を改変する方法が提供される。ある態様によれば、酵素はＣａｓ９、改変Ｃａｓ９、またはＣａｓ９のホモログである。ある態様によれば、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。ある態様によれば、ＲＮＡは約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。

ある態様によれば、真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸をヒト細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記ヒト細胞にトランスフェクトすることを含み、前記ヒト細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、ヒト細胞を改変する方法が提供される。ある態様によれば、酵素はＣａｓ９、改変Ｃａｓ９、またはＣａｓ９のホモログである。ある態様によれば、ＲＮＡは約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。

ある態様によれば、真核細胞のゲノムＤＮＡ上の異なる部位に相補的なＲＮＡをコードする複数の核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることを含み、前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、複数のゲノムＤＮＡ部位で真核細胞を改変する方法が提供される。ある態様によれば、酵素はＣａｓ９である。ある態様によれば、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。ある態様によれば、ＲＮＡは約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。

改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。 改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。 図１Ｃは、改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。 図１Ｃは、改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。 複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 図２Ｂは、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 図２Ｂは、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 図２Ｂは、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。 図３Ａは、ｃａｓ９遺伝子挿入断片の発現フォーマットおよび完全配列を示す図である。 図３Ａは、ｃａｓ９遺伝子挿入断片の発現フォーマットおよび完全配列を示す図である。 ガイドＲＮＡのＵ６プロモーターに基づく発現スキーム、およびＲＮＡ転写産物の予想二次構造を示す図である。 使用した７種のｇＲＮＡを示す図である。 修復ＤＮＡドナー、Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡの全ての可能な組み合わせの、９３ＴにおいてＨＲを成功させる能力についての試験を示す図である。 ｇＲＮＡおよびＧａｓ９を介したゲノム編集の分析を示す図である。 ｇＲＮＡおよびＧａｓ９を介したゲノム編集の分析を示す図である。 別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する３種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。 別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する３種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。 ２９３Ｔにおいて図１Ｂに記載のレポーターの隣接ＧＦＰ配列を標的化する２種の新たなｇＲＮＡを示す図である。 別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する２種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。 別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する２種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。 ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 Ｋ５６２細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 Ｋ５６２細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 ２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 ２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。 ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲを示す図である。 ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲを示す図である。 ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲを示す図である。 図１３Ａは、ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法を示す図である。 図１３Ａは、ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法を示す図である。 ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法を示す図である。 ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。 ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。 ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。 ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。 ｇＲＮＡ配列の柔軟性を示す図である。 ｇＲＮＡ配列の柔軟性を示す図である。

ある態様では、Ｃ末端ＳＶ４０核局在化シグナルを有するヒトコドン最適化Ｃａｓ９タンパク質を合成し、哺乳動物発現システムにクローニングする（図１Ａおよび図３Ａ）。したがって、図１は、改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集に関する。図１Ａに示すように、ヒト細胞におけるＲＮＡ誘導性の遺伝子標的化には、Ｃ末端ＳＶ４０核局在化シグナルを有するＣａｓ９タンパク質を、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現される１または複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共発現させることを含む。ｇＲＮＡが標的配列を認識すると、３′末端に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が存在する場合にのみ、Ｃａｓ９がＤＮＡ二本鎖を巻き戻して両鎖を切断する。原理的に、ＧＮ_２０ＧＧの形態のいずれのゲノム配列も標的にすることができる。図１Ｂに示すように、終止コドンおよびＡＡＶＳ１遺伝子座に由来する６８ｂｐのゲノム断片の挿入により、ゲノムに組み込まれたＧＦＰコード配列が中断（ｄｉｓｒｕｐｔ）されている。適切なドナー配列との相同組換え（ＨＲ）によるＧＦＰ配列の回復により、ＦＡＣＳによる定量化が可能なＧＦＰ^＋細胞が生じる。Ｔ１ｇＲＮＡおよびＴ２ｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１断片中の配列を標的にする。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼヘテロダイマー（ＴＡＬＥＮ）のそれぞれに対する結合部位を下線で示す。図１Ｃに示すように、棒グラフは、ＦＡＣＳにより測定された、標的部位においてＴ１、Ｔ２、またはＴＡＬＥＮを介したヌクレアーゼ活性により誘導されるＨＲ効率を示している。代表的なＦＡＣＳプロットおよび標的細胞の顕微鏡画像を下に示す（スケールバーは１００ミクロンである）。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

ある態様によれば、Ｃａｓ９に目的配列を切断させるために、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターからｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合転写産物（以下、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）という）が発現される。ある態様によれば、ｇＲＮＡは細胞により直接転写される。この態様により、好ましくは、細菌ＣＲＩＳＰＲシステムが用いるＲＮＡプロセシング機構の再構築が回避される（図１Ａおよび図３Ｂ）（参照文献（４、７〜９）参照）。ある態様によれば、Ｇと２０ｂｐのｃｒＲＮＡ標的に続くＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列であるＮＧＧとで始まるＵ６転写を用いてゲノムＤＮＡを改変する方法が提供される。この態様によれば、標的ゲノム部位はＧＮ_２０ＧＧの形態である（図３Ｃ参照）。

ある態様によれば、本明細書に記載のゲノム改変方法の機能性を試験するため、以前に報告されているアッセイ（参照文献（１０）参照）と同様に、２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰレポーターアッセイ（図１Ｂ）が開発された。ある態様によれば、発現されたタンパク質断片を非蛍光性にする終止コドンおよびＡＡＶＳ１遺伝子座に由来する６８ｂｐのゲノム断片の挿入により破壊された、ゲノムに組み込まれたＧＦＰコード配列を有する安定発現細胞株が確立された。適切な修復ドナー（ｒｅｐａｉｒ ｄｏｎｏｒ）を用いた相同組換え（ＨＲ）により、正常なＧＦＰ配列が回復し、これにより、得られたＧＦＰ^＋細胞の流動標示式細胞分取（ｆｌｏｗ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）による定量化が可能になる。

ある態様によれば、相同組換え（ＨＲ）の方法が提供される。その間に位置する（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）ＡＡＶＳ１断片を標的とする２つのｇＲＮＡであるＴ１およびＴ２を構築する（図１ｂ）。それらの活性を、以前に報告されている同じ領域を標的とするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼヘテロダイマー（ＴＡＬＥＮ）（参照文献（１１）参照）の活性と比較した。３種の標的化試薬を用いた場合の全てにおいてＨＲ現象の成功が観察され、Ｔ１ｇＲＮＡおよびＴ２ｇＲＮＡを用いた遺伝子補正率はそれぞれ３％および８％に近かった（図１Ｃ）。ＲＮＡを介したこの編集プロセスは顕著に速く、最初の検出可能なＧＦＰ^＋細胞が出現したのは、ＡＡＶＳ１ ＴＡＬＥＮではトランスフェクションの約４０時間後であったのに比べて、約２０時間後であった。ＨＲは、修復ドナー、Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡを同時に導入した場合にのみ観察されたことから、ゲノム編集には全てのコンポーネントが必要であることが確認された（図４）。Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡの発現と関連する明らかな毒性は認められなかったが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを用いた研究では、一方の鎖にのみニックを入れることでさらに毒性が低くなることが示されている。そこで、インビトロでニッカーゼとして機能することが知られているＣａｓ９Ｄ１０Ａ変異体を試験した結果、ＨＲは同様であったが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の比率はより低かった（図５）（参照文献（４、５）参照）。関連するＣａｓ９タンパク質がＰＡＭの６ｂｐ上流で両鎖を切断することを示す場合（参照文献４）と一致して、ＮＨＥＪデータから、ほとんどの欠失または挿入が標的配列の３′末端で起こったことが確認された（図５Ｂ）。さらに、標的ゲノム部位の変異が、この部位におけるｇＲＮＡによるＨＲを妨げることが確認され、ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集が配列特異的であることが実証された（図６）。ＧＦＰ遺伝子における２種のｇＲＮＡ標的部位、ならびにＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）遺伝子およびＤＮＭＴ３ｂ遺伝子の相同領域に由来するさらに３種のｇＲＮＡ標的断片が、改変レポーター細胞株において有意なＨＲを配列特異的に誘導可能であることが示された（図７、図８）。全体として、これらの結果は、ヒト細胞におけるＲＮＡ誘導性のゲノム標的化により、複数の標的部位で強固（ｒｏｂｕｓｔ）なＨＲが誘導されることを裏付けている。

ある態様によれば、もともと存在する遺伝子座（ｎａｔｉｖｅ ｌｏｃｕｓ）が改変された。ｇＲＮＡを用いて、ほとんどの組織で広範に発現している１９番染色体上のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子中に位置するＡＡＶＳ１遺伝子座（図２Ａ）を、２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、およびＰＧＰヒトｉＰＳ細胞（参照文献（１２）参照）において標的化し、標的遺伝子座の次世代シークエンシングにより結果を分析した。したがって、図２は、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集に関する。図２Ａに示すように、Ｔ１ｇＲＮＡ（赤）およびＴ２ｇＲＮＡ（緑色）は、１９番染色体のＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン中の配列を標的とする。図２Ｂに示すように、次世代シークエンシングにより定量化された、Ｃａｓ９およびＴ１ｇＲＮＡまたはＴ２ｇＲＮＡの発現後の２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、およびＰＧＰ１ ｉＰＳ細胞における、ＮＨＥＪにより生じる欠失の総カウントおよび位置が示される。赤色および緑色の破線は、Ｔ１ｇＲＮＡ標的部位およびＴ２ｇＲＮＡ標的部位の境界を示している。Ｔ１ｇＲＮＡおよびＴ２ｇＲＮＡのＮＨＥＪ頻度は、それぞれ、２９３Ｔ細胞で１０％および２５％、Ｋ５６２細胞で１３％および３８％、ＰＧＰ１ ｉＰＳ細胞で２％および４％であった。図２Ｃに示すように、ＡＡＶＳ１遺伝子座でのＨＲに対するＤＮＡドナーの構造、および標的化現象の成功を検出するためのシークエンシングプライマーの位置（矢印）が示される。図２Ｄに示すように、トランスフェクション３日後のＰＣＲアッセイにより、ドナー、Ｃａｓ９、およびＴ２ｇＲＮＡを発現する細胞にみがＨＲ現象の成功を示すことが実証されている。図２Ｅに示すように、ゲノム−ドナー境界およびドナー−インサート境界の両方で予想されるＤＮＡ塩基が存在することを示す、ＰＣＲ増幅産物のサンガーシークエンシングによりＨＲの成功が確認された。図２Ｆに示すように、標的化に成功した２９３Ｔ細胞のクローンをピューロマイシンで２週間選択した。２つの代表的ＧＦＰ＋クローンの顕微鏡画像を示す（スケールバーは１００ミクロンである）。

ＧＦＰレポーターアッセイの結果と一致し、３種の細胞型の全てについて、内在性の遺伝子座において多くのＮＨＥＪ現象が観察された。２種のｇＲＮＡであるＴ１およびＴ２はそれぞれ、２９３Ｔ細胞で１０％および２５％、Ｋ５６２細胞で１３％および３８％、ＰＧＰ１−ｉＰＳ細胞で２％および４％のＮＨＥＪ比率を達成した（図２Ｂ）。これらの細胞型のいずれにおいても、ＮＨＥＪの誘導に必要なＣａｓ９およびｃｒＲＮＡの発現に由来する明白な毒性は観察されなかった（図９）。予想された通り、Ｔ１およびＴ２に対するＮＨＥＪによる欠失は、標的部位の位置を中心としており、この標的化プロセスの配列特異性がさらに検証された（図９、１０、１１）。Ｔ１ｇＲＮＡおよびＴ２ｇＲＮＡの両方を同時に導入することにより、その間に位置する１９ｂｐの断片が高効率で欠失し（図１０）、このアプローチを用いてゲノム座位の多重編集（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ）が実現可能であることが実証された。

ある態様では、ＨＲを用いて、ｄｓＤＮＡドナーコンストラクト（参照文献（１３）参照）またはオリゴドナーを、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込む（図２Ｃ、図１２）。ＨＲを介した組み込みは、ＰＣＲ（図２Ｄ、図１２）およびサンガーシークエンシング（図２Ｅ）による両方のアプローチを用いて確認した。２９３ＴクローンまたはｉＰＳクローンは、２週間にわたるピューロマイシン選択を用いて改変細胞集団から容易に派生した（図２Ｆ、図１２）。これらの結果は、Ｃａｓ９がヒト細胞において内在性座位で外来ＤＮＡを効率的に組み込むことができることを示している。したがって、本開示のある態様には、相同組換えおよびＣａｓ９を用いて細胞のゲノム中に外来ＤＮＡを組み込む方法が含まれる。

ある態様によれば、単にｇＲＮＡ発現ベクターの配列を目的の部位中の適合配列にマッチするように改変するだけで他のゲノム部位の改変に容易に適用可能な、ＲＮＡ誘導性ゲノム編集システムが提供される。この態様では、ヒトゲノム中の遺伝子の約４０．５％のエキソンを標的化する、１９０，０００種のｇＲＮＡで特異的に標的化可能な配列が作成された。これらの標的配列を、ＤＮＡアレイ上での多重合成（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に適合する２００ｂｐフォーマットに組み込んだ（参照文献（１４）参照）（図１３）。この態様によれば、ヒトゲノムにおける潜在的標的部位のすぐに使えるゲノムワイドなリファレンスおよび多重ｇＲＮＡ合成の方法が提供される。

ある態様によれば、本明細書に記載される１もしくは複数のまたは多数のＲＮＡ／酵素システムを用いて複数の位置で細胞のゲノムを改変することによる、細胞においてゲノム改変を多重化する方法が提供される。ある態様によれば、標的部位は、ＰＡＭ配列であるＮＧＧおよびｇＲＮＡの３′末端の８〜１２塩基の「シード配列」と完全にマッチする。ある態様によれば、残りの８〜１２塩基の完全マッチは必要ではない。ある態様によれば、Ｃａｓ９は、５′末端に１個のミスマッチがあっても機能するであろう。ある態様によれば、標的部位に内在するクロマチン構造およびエピジェネティックな状態がＣａｓ９機能の効率に影響を与え得る。ある態様によれば、より高い特異性を有するＣａｓ９ホモログが有用な酵素として含まれる。当業者であれば、好適なＣａｓ９ホモログを同定および改変することができるであろう。ある態様によれば、ＣＲＩＳＰＲで標的化可能な配列には、異なるＰＡＭ条件（参照文献（９）参照）を有する配列または定向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を有する配列が含まれる。ある態様によれば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインの１つを不活性化することにより、ＮＨＥＪに対するＨＲの割合が増加し、毒性が低下する可能性があるが（図３Ａ、図５）（参照文献４、５）、両方のドメインを不活性化することにより、Ｃａｓ９が再標的化可能なＤＮＡ結合タンパク質として機能することが可能になり得る。本開示の実施形態は、合成生物学（参照文献（２１、２２）参照）、遺伝子ネットワークの直接的で多重化された撹乱（参照文献（１３、２３）参照）、ならびにエクスビボ標的遺伝子治療（参照文献（２４〜２６）参照）およびインビボ標的遺伝子治療（参照文献（２７）参照）において広く有用である。

ある態様によれば、生物学的発見およびインビボスクリーニングのためのモデルシステムとして「再改変可能な生物（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒａｂｌｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」が提供される。ある態様によれば、誘導性Ｃａｓ９導入遺伝子を有する「再改変可能なマウス」が提供され、複数の遺伝子または調節エレメントを標的とするｇＲＮＡのライブラリーの限局的送達（例えばアデノ随伴ウイルスを使用）により、標的組織型において腫瘍を発症させる変異をスクリーニングすることが可能になる。エフェクタードメイン（例えばアクチベーター）を有するＣａｓ９ホモログまたはヌクレアーゼ欠損（ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｎｕｌｌ）変異体の使用により、インビボで遺伝子を多重的に活性化または抑制することが可能になる。この態様によれば、組織再生、分化転換などの表現型を可能にする因子のスクリーニングが可能である。ある態様によれば、（ａ）ＤＮＡアレイの使用により、定義済みｇＲＮＡライブラリーの多重合成が可能になり（図１３参照）；（ｂ）サイズの小さいｇＲＮＡ（図３ｂ参照）がパッケージングされて多くの非ウイルス的送達法またはウイルス的送達法を用いて送達される。

ある態様によれば、ＲＮＡと塩基対形成したＤＮＡ鎖にニックを入れるかその相補鎖にニックを入れるＣａｓ９ヌクレアーゼドメインの１つを不活性化することにより、ゲノム工学への応用のための「ニッカーゼ」で観察された、より低い毒性が達成される。両方のドメインを不活性化することにより、Ｃａｓ９が再標的化可能なＤＮＡ結合タンパク質として機能することが可能になる。ある態様によれば、再標的化可能なＤＮＡ結合タンパク質であるＣａｓ９は、以下に結合する。

（ａ）例えば、限定されるものではないが、クロマチンリモデリング、ヒストン修飾、サイレンシング、遮断、転写機構との直接的相互作用を含む、標的遺伝子の発現調節のための転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメイン；
（ｂ）隣接するｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体の二量体化に伴う「高度に特異的な」ゲノム編集を可能にするためのＦｏｋＩなどのヌクレアーゼドメイン；
（ｃ）ゲノム座位および染色体動態を可視化するための蛍光タンパク質；または
（ｄ）タンパク質または核酸が結合した有機フルオロフォア、量子ドット、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）、およびエコープローブまたは分子ビーコン代替物などのその他の蛍光分子；
（ｅ）ゲノムワイドな３次元構造のプログラム可能な操作を可能にする多価リガンド結合タンパク質ドメイン。

ある態様によれば、転写活性化コンポーネントおよび転写抑制コンポーネントは、ｇＲＮＡがＣａｓのアクチベーター群またはリプレッサー群にのみ結合するように、天然または合成的に直交性の（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることができる。これにより、多くのセットのｇＲＮＡが複数の標的を調整することが可能になる。

ある態様によれば、一つにはＲＮＡのサイズがｍＲＮＡより小さいため（それぞれ１００ヌクレオチド長対２０００ヌクレオチド長）、ｇＲＮＡの使用により、ｍＲＮＡ以上に多重化する能力がもたらされる。これは、ウイルスパッケージングの場合のように、核酸送達がサイズで制限される場合に特に有用である。これにより、切断、ニッキング、活性化、または抑制、あるいはその組み合わせの複数の例が可能になる。複数の制御標的を容易に標的とする能力により、特定の制御因子の下流のもともと存在する制御回路に制限されない、粗調整もしくは微調整（ｃｏａｒｓｅ−ｏｒ−ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ）または制御ネットワークが可能になる（例えば、線維芽細胞からＩＰＳＣへのリプログラミングには４つのｍＲＮＡが用いられる）。多重化の応用の例としては、以下が含まれる。

１．ヒト（または動物）の組織／臓器移植のための、（主要または非主要）組織適合性アレル、ハプロタイプ、および遺伝子型の確立。この態様により、例えば、ＨＬＡホモ接合性の細胞株もしくはヒト化動物品種、またはそのようなＨＬＡアレルをその他の点では望ましい細胞株もしくは品種に付加することができるｇＲＮＡのセットが得られる。

２．単一細胞（または細胞のコレクション）における多重的なシス調節エレメント（ＣＲＥ＝転写、スプライシング、翻訳、ＲＮＡおよびタンパク質のフォールディング、分解などのためのシグナル）の変異を、正常な発達、または病理学的、合成的、もしくは薬学的シナリオで起こり得る制御的相互作用の複雑なセットの効率的な研究に用いることができる。ある態様によれば、ＣＲＥは、ある程度直交性である（すなわち、クロストークが少ない）（またはそのようにされ得る）ので、例えば費用のかかる動物胚の時系列など、１つの設定で多くを試験することができる。応用例の１つは、ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕシークエンシング（ＦＩＳＳｅｑ）を用いたものである。

３．ＣＲＥ変異および／またはＣＲＥのエピジェネティックな活性化もしくは抑制の多重的組み合わせを用いて、ｉＰＳＣもしくはＥＳＣまたは他の幹細胞もしくは非幹細胞を、医薬品（小分子、タンパク質、ＲＮＡ、細胞、動物細胞、植物細胞、または微生物細胞、エアロゾル、および他の送達方法）、移植戦略、パーソナル化戦略などを試験するための、ｏｒｇａｎｓ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓまたは他の細胞および臓器培養において使用するための、任意の細胞型または細胞型の組み合わせへと改変または再プログラムすることができる。

４．遺伝医学のための診断試験（および／またはＤＮＡシークエンシング）に用いるための多重変異ヒト細胞の作製。染色体上の位置およびヒトゲノムアレル（またはエピジェネティックな標識）の構成が臨床的遺伝子診断の精度に影響を与え得る範囲で、アレルが、異所的（すなわちトランスジェニック）な位置または別々の合成ＤＮＡ断片中にではなく、参照ゲノム中の正確な位置に存在することが重要である。ある実施形態は、各診断用ヒトＳＮＰにつき１系統の一連の独立した細胞株、または構造的変異株である。あるいは、ある実施形態は、同一細胞におけるアレルの多重セットを含む。場合によっては、独立した試験という仮定のもとで、１つの遺伝子（または複数の遺伝子）における多重変化が望ましい。別の場合には、特定のハプロタイプのアレルの組み合わせにより、ハプロタイプ相（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｐｈａｓｅ）（すなわち、個人または個々の体細胞型において遺伝子の一方または両方のコピーが影響を受けるかどうか）を正確に確立するシークエンシング（ジェノタイピング）法の試験が可能になる。

５．微生物、植物、動物、またはヒト細胞において改変Ｃａｓ＋ｇＲＮＡシステムを用いて反復エレメントまたは内在性ウイルスエレメントを標的化して、有害な転位を低減すること、または（ほぼ同一のコピーが問題となり得る）シークエンシングもしくは他の分析的なゲノム／トランスクリプトーム／プロテオミクス／診断用のツールを補助することができる。

上記セクション中で数字により特定される以下の参照文献は、その全体が参照により組み込まれる。
1. B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna, Nature 482, 331 (Feb 16, 2012).
2. D. Bhaya, M. Davison, R. Barrangou, Annual review of genetics 45, 273 (2011).
3. M. P. Terns, R. M. Terns, Current opinion in microbiology 14, 321 (Jun, 2011).
4. M. Jinek et al, Science 337, 816 (Aug 17, 2012).
5. G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579 (Sep 25, 2012).
6. R. Sapranauskas et al, Nucleic acids research 39, 9275 (Nov, 2011).
7. T. R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296, 550 (Apr 19, 2002).
8. M. Miyagishi, K. Taira, Nature biotechnology 20, 497 (May, 2002).
9. E. Deltcheva et al, Nature 471, 602 (Mar 31, 2011).
10. J. Zou, P. Mali, X. Huang, S. N. Dowey, L. Cheng, Blood 118, 4599 (Oct 27, 2011).
11. N. E. Sanjana et al, Nature protocols 7, 171 (Jan, 2012).
12. J. H. Lee et al, PLoS Genet 5, el 000718 (Nov, 2009).
13. D. Hockemeyer et al, Nature biotechnology 27, 851 (Sep, 2009).
14. S. Kosuri et al, Nature biotechnology 28, 1295 (Dec, 2010).
15. V. Pattanayak, C. L. Ramirez, J. K. Joung, D. R. Liu, Nature methods 8, 765 (Sep, 2011).
16. N. M. King, O. Cohen-Haguenauer, Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 16, 432 (Mar, 2008).
17. Y. G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1156 (Feb 6, 1996).
18. E. J. Rebar, C. O. Pabo, Science 263, 671 (Feb 4, 1994).
19. J. Boch et al , Science 326, 1509 (Dec 11 , 2009).
20. M. J. Moscou, A. J. Bogdanove, Science 326, 1501 (Dec 11, 2009).
21. A. S. Khalil, J. J. Collins, Nature reviews. Genetics 11, 367 (May, 2010).
22. P. E. Purnick, R. Weiss, Nature reviews. Molecular cell biology 10, 410 (Jun, 2009).
23. J. Zou et al, Cell stem cell 5, 97 (Jul 2, 2009).
24. N. Holt et al, Nature biotechnology 28, 839 (Aug, 2010).
25. F. D. Urnov et al, Nature 435, 646 (Jun 2, 2005).
26. A. Lombardo et al, Nature biotechnology 25, 1298 (Nov, 2007).
27. H. Li et al, Nature 475, 217 (Jul 14, 2011).

以下の実施例は、本開示の代表的な例として記載するものである。これらの実施例は、本開示の範囲をこれらに限定するものと解釈されるべきではなく、本開示、図面、および添付の特許請求の範囲に鑑みて、他の同等な実施形態は明らかであろう。

実施例１
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
ある態様によれば、本開示の実施形態は、真核細胞におけるヌクレアーゼによる活性のため、外来核酸を同定するための短鎖ＲＮＡを用いる。本開示のある態様によれば、真核細胞は、１または複数の短鎖ＲＮＡと標的ＤＮＡ配列への短鎖ＲＮＡの結合により活性化される１または複数のヌクレアーゼとをコードする核酸をそのゲノム内に含むように改変される。ある態様によれば、例示的な短鎖ＲＮＡ／酵素システムは、例えば短鎖ＲＮＡを用いて外来核酸の分解を導く（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムなど、細菌または古細菌中に同定され得る。ＣＲＩＳＰＲ（「ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ」）防御には、侵入ウイルスまたはプラスミドＤＮＡ由来の新規標的化「スペーサー」のＣＲＩＳＰＲ座位への獲得および組み込み、スペーサー反復単位からなる短鎖ガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現およびプロセシング、ならびにスペーサーに相補的な核酸（最も一般的にはＤＮＡ）の切断が含まれる。

３つのクラスのＣＲＩＳＰＲシステムが一般に知られており、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型と呼ばれる。ある態様によれば、ｄｓＤＮＡを切断するための本開示に係る特に有用な酵素は、ＩＩ型に一般的な単一エフェクター酵素Ｃａｓ９である（参照文献（１）参照）。細菌中で、ＩＩ型エフェクターシステムは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ座位から転写される長鎖ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、多機能性Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡプロセシングに重要なｔｒａｃｒＲＮＡからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのスペーサーを隔てる反復領域にハイブリダイズすると、内在性ＲＮａｓｅＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断が開始し、続いて、Ｃａｓ９による各スペーサー内での第２の切断現象が起こり、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９に結合したままの成熟ｃｒＲＮＡが生成される。ある態様によれば、本開示の真核細胞は、ＲＮａｓｅＩＩＩの使用およびｃｒＲＮＡプロセシング全般が回避されるように改変される。参照文献（２）参照。

ある態様によれば、Ｃａｓ９などの本開示の酵素は、ＤＮＡ二本鎖を巻き戻し、ｃｒＲＮＡにマッチする配列を探索して切断する。標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサー配列との間の相補性を検出すると、標的認識が起こる。重要なことに、Ｃａｓ９は、正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が３′末端にさらに存在する場合にのみ、ＤＮＡを切断する。ある態様によれば、異なるプロトスペーサー隣接モチーフが用いられ得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓシステムは、ＮＧＧ配列（Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）を必要とする。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＩＩ型システムは、それぞれＮＧＧＮＧ（参照文献（３）参照）およびＮＮＡＧＡＡＷ（参照文献（４）参照）を必要とし、一方、種々のＳ．ｍｕｔａｎｓのシステムは、ＮＧＧまたはＮＡＡＲを許容する（参照文献（５）参照）。バイオインフォマティクス分析により、さらなる有用なＰＡＭの同定およびＣＲＩＳＰＲで標的化可能な配列のセットの拡張に役立ち得る、種々の細菌におけるＣＲＩＳＰＲ座位の大規模なデータベースが作成されている（参照文献（６、７）参照）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでは、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３′末端の３ｂｐ前に、平滑末端化された二本鎖切断部が生じ（参照文献（８）参照）、これはＣａｓ９タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわち、ＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインと非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインとにより媒介されるプロセスである（図１Ａおよび図３参照）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのシステムは同じ精密度で特徴付けられていないが、やはりＤＳＢがプロトスペーサーの３′末端の近くで起こる。２つのヌクレアーゼドメインの１つが不活性化された場合、Ｃａｓ９は、インビトロ（参照文献（２）参照）およびヒト細胞において（図５参照）ニッカーゼとして機能する。

ある態様によれば、ｇＲＮＡ誘導性のＣａｓ９切断の特異性は、真核細胞におけるゲノム工学機構として用いられる。ある態様によれば、ｇＲＮＡのハイブリダイゼーションは、酵素がｇＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを認識して切断に影響を与えるためには、１００％である必要はない。多少のオフターゲット活性が生じ得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのシステムは、インビトロで２０ｂｐの成熟スペーサー配列のうち最初の６塩基におけるミスマッチを許容する。ある態様によれば、ｇＲＮＡに対するヒト参照ゲノム中に（最後の１４ｂｐの）ＮＧＧにマッチする潜在的オフターゲット部位が存在する場合、インビボでより高いストリンジェンシーが有益であり得る。ミスマッチおよび酵素活性の影響全般については、参照文献（９）、（２）、（１０）、および（４）に記載されている。

ある態様によれば、特異性が改善され得る。干渉がｇＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度の影響を受ける場合、ＡＴリッチな標的配列は、より少ないオフターゲット部位を有し得る。ゲノム中の他の場所の少なくとも１４ｂｐにマッチする配列を有する偽性部位が回避されるように慎重に標的部位を選択することにより、特異性が改善され得る。より長いＰＡＭ配列を必要とするＣａｓ９変異体を使用することで、オフターゲット部位の頻度を減少させ得る。定向進化によりオフターゲット活性を完全に防止するのに十分なレベルまでＣａｓ９特異性が改善され得るが、理想的には、最小限のＰＡＭを有する２０ｂｐのｇＲＮＡの完全なマッチを必要とする。したがって、Ｃａｓ９タンパク質の改変は本開示の代表的実施形態である。したがって、短い時間枠で多数ラウンドの進化を可能にする（参照文献（１１）参照）新規な方法が想定される。本開示において有用なＣＲＩＳＰＲシステムは、参照文献（１２、１３）に記載されている。

実施例２
プラスミド構築
Ｃａｓ９遺伝子配列をヒトコドン最適化し、ＩＤＴ社に注文した９種の５００ｂｐのｇＢｌｏｃｋの階層的融合ＰＣＲアセンブリ（ｈｉｅｒａｃｈｉｃａｌ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ ａｓｓｅｍｂｌｙ）により構築した。ヒト細胞のための改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを示す図３Ａは、ｃａｓ９遺伝子挿入断片の発現フォーマットおよび完全配列を示す。ＲｕｖＣ様モチーフおよびＨＮＨモチーフ、ならびにＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳはそれぞれ青色、茶色、および橙色で強調されている。Ｃａｓ９＿Ｄ１０Ａを同様に構築した。得られた全長産物をｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。標的ｇＲＮＡ発現コンストラクトは、個別の４５５ｂｐのｇＢｌｏｃｋとしてＩＤＴ社に直接注文し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングするかＰＣＲ増幅を行った。図３Ｂは、ガイドＲＮＡのＵ６プロモーターに基づく発現スキームおよびＲＮＡ転写産物の予想二次構造を示している。Ｕ６プロモーターの使用により、ＲＮＡ転写産物の１位が「Ｇ」に限定されるので、このアプローチを用いて、ＧＮ_２０ＧＧの形態の全ゲノム部位を標的とすることができる。図３Ｃは、使用した７種のｇＲＮＡを示している。

Ａｄｄｇｅｎｅ社製ＥＧＩＰレンチベクター（プラスミド＃２６７７７）中に構築された、終止コドンと６８ｂｐのＡＡＶＳ１断片（またはその変異体；図６参照）またはＤＮＭＴ３ａゲノム座位およびＤＮＭＴ３ｂゲノム座位に由来する５８ｂｐの断片（図８参照）とを有するＧＦＰ配列の融合ＰＣＲアセンブリにより、中断されたＧＦＰを含むＨＲレポーターアッセイ用ベクターを構築した。次いで、これらのレンチベクターを用いてＧＦＰレポーター安定発現細胞株を確立した。本研究に用いたＴＡＬＥＮは、参照文献（１４）に記載のプロトコールを用いて構築した。本研究で開発された全てのＤＮＡ試薬は、Ａｄｄｇｅｎｅ社から入手可能である。

実施例３
細胞培養
ＰＧＰ１ ｉＰＳ細胞は、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でコーティングされたプレート上、ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で維持した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５〜７日毎に継代培養した。Ｋ５６２細胞は、１５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養および維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）高グルコース中で培養した。全ての細胞は、加湿したインキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。

実施例４
ＰＧＰ１ ｉＰＳ、Ｋ５６２、および２９３Ｔの遺伝子標的化
ＰＧＰ１ ｉＰＳ細胞は、ヌクレオフェクションの２時間前にＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）中で培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞を回収し、２×１０^６個の細胞を、１μｇのＣａｓ９プラスミド、１μｇのｇＲＮＡ、および／または１μｇのＤＮＡドナープラスミドと共にＰ３試薬（Ｌｏｎｚａ社）に再懸濁し、製造業者の指示書（Ｌｏｎｚａ社）に従ってヌクレオフェクトした。続いて、細胞を、ｍＴｅＳＲｌでコーティングされたプレート上で、ＲＯＣＫ阻害剤を添加したｍＴｅＳＲｌ培地中に最初の２４時間プレーティングした。Ｋ５６２では、２×１０^６個の細胞を、１μｇのＣａｓ９プラスミド、１μｇのｇＲＮＡ、および／または１μｇのＤＮＡドナープラスミドと共にＳＦ試薬（Ｌｏｎｚａ社）に再懸濁し、製造業者の指示書（Ｌｏｎｚａ社）に従ってヌクレオフェクトした。２９３Ｔでは、製造業者のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて０．１×１０^６個の細胞に１μｇのＣａｓ９プラスミド、１μｇのｇＲＮＡ、および／または１μｇのＤＮＡドナープラスミドをトランスフェクトした。内在性ＡＡＶＳ１の標的化に用いたＤＮＡドナーは、ｄｓＤＮＡドナー（図２Ｃ）または９０塩基長のオリゴヌクレオチドであった。前者は、標的化に成功した細胞を濃縮するためのＳＡ−２Ａ−ピューロマイシン−ＣａＧＧＳ−ｅＧＦＰカセット、および隣接する短い相同性アームを有する。

標的化効率を以下のように評価した。細胞をヌクレオフェクションの３日後に回収し、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社）を用いて約１×１０^６個の細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲを行い細胞に由来するゲノムＤＮＡを用いて標的化領域を増幅し、ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）により、カバー度＞２００，０００リードで増幅産物のディープシークエンシングを行った。シークエンシングデータを分析してＮＨＥＪ効率を推定した。分析した参照ＡＡＶＳ１配列は、以下のようである。

ＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＴＧＧＧＴＣＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡ

ヒトゲノム中の標的化領域を増幅するためのＰＣＲプライマーは以下の通りである。
ＡＡＶＳ１−Ｒ：
ＣＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴａｃａｇｇａｇｇｔｇｇｇｇｇｔｔａｇａｃ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．１：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＧＡＴｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．２：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＴＣＧｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．３：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＴＡＡｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．４：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．５：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＣＴＧＴｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．６：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．７：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．８：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．９：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．１０：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＡｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ１−Ｆ．１１：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＣｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ
ＡＡＶＳ １−Ｆ．１２：
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＡＡＧｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａ

図２Ｃ中のＤＮＡドナーを用いたＨＲ現象を分析するために、以下のプライマーを用いた。
ＨＲ＿ＡＡＶＳ１−Ｆ
ＣＴＧＣＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴ
ＨＲ＿Ｐｕｒｏ−Ｒ
ＧＴＧＧＧＣＴＴＧＴＡＣＴＣＧＧＴＣＡＴ

実施例５
ヒトエキソンのＣＲＩＳＰＲ標的を計算するためのバイオインフォマティクスアプローチおよびそれらの多重合成の方法論
ヒトエキソンにおいて特異的部位を最大限に標的とするが、ゲノム中の他の部位は最小限に標的とするｇＲＮＡ遺伝子配列セットは、以下のように決定した。ある態様によれば、ｇＲＮＡによる最大効率の標的化は２３ヌクレオチド（ｎｔ）の配列により達成され、そのうちの最も５′側の２０ヌクレオチドは所望の部位に正確に相補的であり、最も３′側の３塩基はＮＧＧの形態でなければならない。さらに、ｐｏｌ−ＩＩＩ転写開始部位を確立するために、最も５′側のヌクレオチドはＧでなければならない。しかし、参照文献（２）によれば、ゲノム標的に対する２０ｂｐのｇＲＮＡの最も５′側の６個のヌクレオチドの不対合は、最後の１４ヌクレオチドが適切に対合する限りＣａｓ９を介した切断を抑制しないが、最も５′側の８個のヌクレオチドの不対合および最後の１２ヌクレオチドの対合は切断を抑制し、最も５′側の７個のヌクレオチドの不対合および１３個の３′側の対合の場合については試験されていない。オフターゲット効果に関して保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）であるための条件の１つは、６個の場合同様に、最も５′側の７個の不対合の場合に切断が許容されることであり、したがって最も３′側の１３ヌクレオチドの対合が切断には十分である。オフターゲット切断をせずに切断が可能であるヒトエキソン内のＣＲＩＳＰＲ標的部位を同定するために、５′−ＧＢＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＮＧＧ−３′の形態（第１の形態）の２３ｂｐの配列の全てを調べた。式中、Ｂは、エキソン部位の塩基を表し、この配列に対して、ヒトゲノム中の他のどの部位にも５′−ＮＮＮＮＮ ＮＮＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＮＧＧ−３′の形態（第２の形態）の配列は存在しない。具体的には、（ｉ）ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（参照文献１５〜１７）からＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ヒトゲノムの全てのＲｅｆＳｅｑ遺伝子のコード領域部位のＢＥＤファイルをダウンロードした。このＢＥＤファイル中のコードエキソンの部位は、ｈｇ１９ゲノムへのＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡアクセッションの３４６０８９個のマッピングのセットで構成されていた。しかし、いくつかのＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡアクセッションは複数のゲノム部位にマッピングされており（おそらく遺伝子重複）、多くのアクセッションが同一セットのエキソン部位のサブセットにマッピングされていた（同じ遺伝子の複数のアイソフォーム）。明らかに重複した遺伝子インスタンスを区別して、複数のＲｅｆＳｅｑアイソフォームアクセッションによる同一のゲノムエキソンインスタンスへの複数の参照を統合するために、（ｉｉ）複数のゲノム部位を有した７０５個のＲｅｆＳｅｑアクセッション番号に固有の数値サフィックス（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｓｕｆｆｉｘ）を付与し、（ｉｉｉ）ＢＥＤＴｏｏｌｓ（参照文献１８）（ｖ２．１６．２−ｚｉｐ−８７ｅ３９２６）のｍｅｒｇｅＢｅｄ機能を用いて、重複するエキソン部位を、マージされたエキソン領域に統合した。これらのステップにより、最初の３４６０８９個のＲｅｆＳｅｑエキソン部位セットは、１９２７８３個の別個のゲノム領域に減少した。ＵＣＳＣ Ｔａｂｌｅ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて、全てのマージされたエキソン領域のｈｇ１９配列をダウンロードし、各末端に２０ｂｐのパディング（ｐａｄｄｉｎｇ）を付加した。（ｉｖ）カスタムｐｅｒｌコードを用いて、このエキソン配列内に第１の形態の１６５７７９３個のインスタンスを同定した。（ｖ）次いで、これらの配列を、第２の形態のオフターゲットの存在についてフィルタリングした。すなわち、各々のマージされたエキソンの第１の形態の標的につき、最も３′側の１３ｂｐの特異的（Ｂ）「コア」配列を抽出し、各コアについて、１６ｂｐの配列である５′−ＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＢＢＢＢＢ ＮＧＧ−３′（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）を４種作成し、−ｌ １６ −ｖ ０ −ｋ ２のパラメーターを用いたＢｏｗｔｉｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．１２．８（参照文献１９）を用いて、これら６６３１１７２個の配列への正確なマッチについてｈｇ１９ゲノム全体をサーチした。２個以上のマッチがあった任意のエキソン標的部位は不採用とした。任意の特異的な１３ｂｐのコア配列およびそれに続く配列ＮＧＧにより１５ｂｐの特異性が付与されるのみであるため、ランダムな約３Ｇｂの配列（両鎖）中に、拡張コア配列に対して平均約５．６個のマッチがあるはずである。そのため、最初に同定された１６５７７９３個の標的のほとんどが不採用とされたが、１８９８６４個の配列がこのフィルターをパスした。これらは、ヒトゲノム中のＣＲＩＳＰＲで標的化可能なエキソン部位のセットを含む。この１８９８６４個の配列は、標的エキソン領域当たり約２．４部位の多重度で、７８０２８個のマージされたエキソン領域中の部位を標的とする（全１９２７８３個のマージされたヒトエキソン領域の約４０．５％）。遺伝子レベルで標的化を評価するために、マージされたエキソン領域と重複する任意の２つのＲｅｆＳｅｑアクセッション（（ｉｉ）で区別した遺伝子重複物を含む）が単一遺伝子クラスターとしてカウントされるようにＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡマッピングをクラスター化すると、１８９８６４個のエキソン特異的ＣＲＩＳＰＲ部位が、標的遺伝子クラスター当たり約１１．１の多重度で、１８８７２個の遺伝子クラスターのうちの１７１０４個（全遺伝子クラスターの約９０．６％）を標的とする。（これらの遺伝子クラスターは、単一の転写遺伝子の複数のアイソフォームを表すＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡアクセッションを単一のエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）へと折り畳んでいる（ｃｏｌｌａｐｓｅ）が、これらにはさらに、重複する別個の遺伝子およびアンチセンス転写産物を有する遺伝子も折り畳まれていることに留意されたい。）オリジナルのＲｅｆＳｅｑアクセッションレベルでは、１８９８６４個の配列が、マッピングされたＲｅｆＳｅｑアクセッション（区別される重複遺伝子を含む）の全４３７２６個のうちの３０５６３個（約６９．９％）において、標的とするマッピングされたＲｅｆＳｅｑアクセッション１個当たり約６．２部位の多重度で、エキソン領域を標的とした。

ある態様によれば、ｇＲＮＡおよびゲノム標的の両方の塩基組成および二次構造（参照文献２０、２１）、ならびにエピジェネティックな状態に関する情報が利用可能なヒト細胞株におけるこれら標的のエピジェネティックな状態（参照文献２２）などの要因と性能（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を関連付けることにより、データベースを洗練することができる。

実施例６
多重合成
標的配列を、ＤＮＡアレイ上での多重合成に適合する２００ｂｐフォーマットに組み込んだ（参照文献２３、２４）。ある態様によれば、この方法により、ＤＮＡアレイに基づくオリゴヌクレオチドプールからの特異的なｇＲＮＡ配列またはｇＲＮＡ配列プールの標的化された回収、および一般的な発現ベクターへの迅速なクローニングが可能になる（図１３Ａ）。具体的には、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ Ｉｎｃ．社の１２ｋのオリゴヌクレオチドプールを合成した。さらに、このライブラリーから、最適なｇＲＮＡの回収（図１３Ｂ）に成功した。合成ＤＮＡ１０００ｂｐ当たりの誤り率は約４変異であった。

実施例７
ＲＮＡ誘導性ゲノム編集は標的化の成功のためにＣａｓ９およびガイドＲＮＡの両方を必要とする
図１Ｂに記載のＧＦＰレポーターアッセイを用いて、修復ＤＮＡドナー、Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡの全ての可能な組み合わせの、（２９３Ｔにおいて）ＨＲを成功させる能力について試験した。図４に示すように、３つのコンポーネントの全てが存在する場合にのみＧＦＰ＋細胞が観察され、これにより、ＲＮＡ誘導性ゲノム編集にこれらのＣＲＩＳＰＲコンポーネントが必須であることが確認された。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

実施例８
ｇＲＮＡおよびＧａｓ９を介したゲノム編集の分析
（Ａ）図５Ａに結果が示される前述のＧＦＰレポーターアッセイおよび（Ｂ）図５Ｂに結果が示される（２９３Ｔにおける）標的部位のディープシークエンシングのいずれかを用いて、ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集プロセスを調べた。比較として、以前の報告でインビトロアッセイにおいてニッカーゼとして機能することが示されているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体を試験した。図５に示すように、Ｃａｓ９およびＣａｓ９Ｄ１０Ａはどちらもほぼ同じ率でＨＲを成功させることができた。しかし、ディープシークエンシングから、Ｃａｓ９は標的部位で強固なＮＨＥＪを示すが、（ＤＮＡにニックを入れるだけの推定能力から予想される通り）Ｄ１０Ａ変異体はＮＨＥＪ比率が有意に低減していることが確認される。さらに、Ｃａｓ９タンパク質の既知の生化学と一致して、ＮＨＥＪデータから、塩基対の欠失または挿入の大部分が標的配列の３′末端で起こっており、ピークはＰＡＭ部位の上流約３〜４塩基であり、欠失頻度の中央値は約９〜１０ｂｐであることが確認される。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

実施例９
ＲＮＡ誘導性ゲノム編集は標的配列特異的である
図１Ｂに記載のＧＦＰレポーターアッセイ同様、別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する３種の２９３Ｔ安定発現細胞株を開発した。これらは（図６に示されるように）ＡＡＶＳ１断片インサートの配列によって区別される。１種の細胞株は野生型断片を有し、他の２種の細胞株は６ｂｐが変異している（赤色で強調）。次いで、各細胞株を以下の４つの試薬、すなわち、標的配列が隣接ＧＦＰ断片中にあるために全ての細胞株中に存在するので、全ての細胞型を標的化可能であるＧＦＰ−ＺＦＮの組み合わせ；他の２種の細胞株における変異により左のＴＡＬＥＮがそれらの部位に結合できなくなっていると考えられるので、ｗｔ−ＡＡＶＳ１断片のみを潜在的に標的化し得るＡＡＶＳ１ ＴＡＬＥＮ；この標的部位も２種の変異細胞株中で中断されているので、やはりｗｔ−ＡＡＶＳ１断片のみを潜在的に標的化可能であるＴ１ｇＲＮＡ；およびＴ１ｇＲＮＡと異なり、標的部位が３種の細胞株で変化していないので、３種の細胞株の全てを標的化可能であると考えられるＴ２ｇＲＮＡのいずれかで標的化した。ＺＦＮは３種の細胞型全てを改変し、ＡＡＶＳ１ ＴＡＬＥＮおよびＴ１ｇＲＮＡはｗｔ−ＡＡＶＳ１細胞型のみを標的化し、Ｔ２ｇＲＮＡは３種の細胞型全ての標的化に成功した。総合して、これらの結果により、ガイドＲＮＡを介した編集が標的配列特異的であることが確認される。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

実施例１０
ＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡは強固なゲノム編集を可能にする
ＡＡＶＳ１インサートを標的化する２種のｇＲＮＡに加えて、（２９３Ｔにおいて）図１Ｂに記載のレポーターの隣接ＧＦＰ配列を標的化する２種の新たなｇＲＮＡを試験した。図７に示すように、これらのｇＲＮＡもまた、この改変された座位で強固なＨＲをもたらすことができた。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

実施例１１
ＲＮＡ誘導性ゲノム編集は標的配列特異的であり、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮと同様な標的化効率を示す
図１Ｂに記載のＧＦＰレポーターアッセイ同様、別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する２種の２９３Ｔ安定発現細胞株を開発した。（図８に示すように）これらは断片インサートの配列によって区別される。一方の細胞株はＤＮＭＴ３ａ遺伝子由来の５８ｂｐ断片を有し、もう一方の細胞株はＤＮＭＴ３ｂ遺伝子由来の相同な５８ｂｐ断片を有する。配列の差は赤色で強調される。次いで、各細胞株を以下の６つの試薬、すなわち、その標的配列が隣接ＧＦＰ断片中にあるために全ての細胞株中に存在するので、全ての細胞型を標的化可能であるＧＦＰ−ＺＦＮの組み合わせ；ＤＮＭＴ３ａ断片またはＤＮＭＴ３ｂ断片を潜在的に標的化するＴＡＬＥＮの組み合わせ；ＤＮＭＴ３ａ断片のみを潜在的に標的化可能なｇＲＮＡの組み合わせ；およびＤＮＭＴ３ｂ断片のみを潜在的に標的化すると考えられるｇＲＮＡのいずれかで標的化した。図８に示すように、ＺＦＮは３つの細胞型全てを改変し、ＴＡＬＥＮおよびｇＲＮＡはそれぞれの標的のみを改変した。さらに、標的化効率は６つの標的化試薬で同等であった。総合すると、これらの結果により、ＲＮＡ誘導性編集が標的配列特異的であり、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮと同様な標的化効率を示すことが確認される。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

実施例１２
ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪ
ヒトｉＰＳ細胞（ＰＧＰ１）に、図９の左パネルに示すコンストラクトをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの４日後、ＤＮＡ二本鎖切断部（ＤＳＢ）でのゲノムの欠失率および挿入率をディープシークエンシングにより評価することによってＮＨＥＪ比率を測定した。パネル１：標的領域で検出された欠失率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。各ヌクレオチド位置での欠失の発生率を黒線にプロットし、欠失を有するリードの割合として欠失率を計算した。パネル２：標的領域で検出された挿入率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。最初の挿入接合部が検出されたゲノム位置での挿入の発生率を黒線にプロットし、挿入を有するリードの割合として挿入率を計算した。パネル３：欠失サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの欠失の頻度をプロットした。パネル４：挿入サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの挿入の頻度をプロットした。両方のｇＲＮＡによるｉＰＳ標的化は効率的であり（２〜４％）、配列特異的であり（ＮＨＥＪ欠失分布の位置のシフトにより示される）、図４の結果を再確認するものであり、ＮＧＳに基づく分析もまた、標的座位におけるＮＨＥＪ現象にＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡの両方が必須であることを示している。

実施例１３
Ｋ５６２細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪ
図１０の左パネルに示すコンストラクトをＫ５６２細胞に核化（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）した。ヌクレオフェクションの４日後、ＤＳＢでのゲノムの欠失率および挿入率をディープシークエンシングにより評価することによってＮＨＥＪ比率を測定した。パネル１：標的領域で検出された欠失率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。各ヌクレオチド位置での欠失の発生率を黒線にプロットし、欠失を有するリードの割合として欠失率を計算した。パネル２：標的領域で検出された挿入率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。最初の挿入接合部が検出されたゲノム位置での挿入の発生率を黒線にプロットし、挿入を有するリードの割合として挿入率を計算した。パネル３：欠失サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの欠失の頻度をプロットした。パネル４：挿入サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの挿入の頻度をプロットした。両方のｇＲＮＡによるＫ５６２標的化は効率的であり（１３〜３８％）、配列特異的である（ＮＨＥＪ欠失分布の位置のシフトにより示される）。重要なことに、観察された欠失サイズ頻度のヒストグラムにおけるピークからも明らかなように、Ｔ１ガイドＲＮＡおよびＴ２ガイドＲＮＡの同時導入により、その間に位置する１９ｂｐ断片の高効率な欠失が生じており、このことは、このアプローチを用いてゲノム座位の多重編集も実現可能であることを示している。

実施例１４
２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪ
図１１の左パネルに示すコンストラクトを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ヌクレオフェクションの４日後、ＤＳＢでのゲノムの欠失率および挿入率をディープシークエンシングにより評価することによってＮＨＥＪ比率を測定した。パネル１：標的領域で検出された欠失率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。各ヌクレオチド位置での欠失の発生率を黒線にプロットし、欠失を有するリードの割合として欠失率を計算した。パネル２：標的領域で検出された挿入率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。最初の挿入接合部が検出されたゲノム位置での挿入の発生率を黒線にプロットし、挿入を有するリードの割合として挿入率を計算した。パネル３：欠失サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの欠失の頻度をプロットした。パネル４：挿入サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの挿入の頻度をプロットした。両方のｇＲＮＡによる２９３Ｔ標的化は効率的であり（１０〜２４％）、配列特異的である（ＮＨＥＪ欠失分布の位置のシフトにより示される）。

実施例１５
ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲ
図１２Ａに示すように、ＰＣＲスクリーニング（図２Ｃを参照）により、２１／２４のランダムに選んだ２９３Ｔクローンで標的化の成功が確認された。図１２Ｂに示すように、同様なＰＣＲスクリーニングにより、３／７のランダムに選んだＰＧＰ１−ｉＰＳクローンでも標的化の成功が確認された。図１２Ｃに示すように、９０塩基長の短鎖オリゴもまた、内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座での強固な標的化が可能であった（ここではＫ５６２細胞について示す）。

実施例１６
ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法
ヒトゲノム中の遺伝子の全エキソンの約４０．５％を標的とする約１９０ｋのバイオインフォマティクス的に計算されたユニークなｇＲＮＡ部位のリソースを作成した。図１３Ａに示すように、ｇＲＮＡ標的部位をＤＮＡアレイ上での多重合成に適合する２００ｂｐフォーマットに組み込んだ。具体的には、このデザインにより、（ｉ）ＤＮＡアレイオリゴヌクレオチドプールからの特異的ｇＲＮＡ標的またはｇＲＮＡ標的のプールの（模式図に示すように、連続３ラウンドのネステッドＰＣＲによる）標的化された回収；および（ｉｉ）ＡｆｌＩＩを用いた直線化後にギブソン・アセンブリを介したｇＲＮＡインサート断片の取込みのレシピエントとして機能する、一般的な発現ベクターへの迅速なクローニングが可能になる。図１３Ｂに示すように、この方法を用いて、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社により合成された１２ｋのオリゴヌクレオチドプールから１０種のユニークなｇＲＮＡの標的化された回収が達成された。

実施例１７
ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは細菌の適応免疫防御システムを有し、侵入核酸を「切断する」ように機能する。ある態様によれば、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムは、ヒト細胞において機能しゲノムＤＮＡを「切断する」ように改変される。これは、（ヌクレアーゼ機能を有する）Ｃａｓ９タンパク質をガイドＲＮＡ中のスペーサーに相補的な標的配列に導く短鎖ガイドＲＮＡによって達成される。ＤＮＡを「切断する」能力により、ゲノム編集および標的化されたゲノム制御に関連する多くの応用が可能になる。このために、Ｃａｓ９タンパク質を、（ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインのヌクレアーゼ機能に重要であることが知られている）Ｍｇ２＋へのカップリングを抑制すると予想される変異を導入することによりヌクレアーゼ欠損になるように変異させた。具体的には、Ｄ１０Ａ変異、Ｄ８３９Ａ変異、Ｈ８４０Ａ変異、およびＮ８６３Ａ変異の組み合わせを導入した。（シークエンシング解析によりＤＮＡを切断しない能力が確認された）このようにして作製されたＣａｓ９ヌクレアーゼ欠損タンパク質（以下、Ｃａｓ９Ｒ−Ｈ−という）をその後、転写活性化ドメイン（ここではＶＰ６４）にカップリングして、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムがＲＮＡ誘導性転写制御因子として機能できるようにした（図１４参照）。Ｃａｓ９Ｒ−Ｈ−＋ＶＰ６４融合体は、示されている２つのレポーターにおいてＲＮＡ誘導性転写活性化を可能にする。具体的には、ＦＡＣＳ分析および免疫蛍光イメージングの両方により、このタンパク質が対応するレポーターのｇＲＮＡ配列特異的標的化を可能にすること、およびさらに、結果として起こる転写活性化が、ｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質の発現によりアッセイされるように、従来のＴＡＬＥ−ＶＰ６４融合タンパク質により誘導される転写活性化と同様のレベルであったことが示される。

実施例１８
ｇＲＮＡ配列の柔軟性およびその応用
ｇＲＮＡの５′部分、中央部分、および３′部分における種々のランダムな配列挿入を体系的にアッセイすることにより、指定配列挿入（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）に対するｇＲＮＡ足場配列の柔軟性を決定した。具体的には、ｇＲＮＡ配列において、ｇＲＮＡの５′末端、中央、および３′末端に１ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、および４０ｂｐのインサートを作製した（挿入の正確な位置は図１５中で「赤色」で強調されている）。次いで、このｇＲＮＡの機能性を、（本明細書に記載されるように）ＧＦＰレポーターアッセイにおいてＨＲを誘導する能力により試験した。（保持されているＨＲ誘導活性により測定されるように）５′末端および３′末端の配列挿入に対してｇＲＮＡが柔軟であることは明らかである。したがって、本開示の態様は、ｇＲＮＡ活性開始の引き金を引き得る小分子応答性ＲＮＡアプタマーのタグ化またはｇＲＮＡの可視化に関する。さらに、本開示の態様は、ハイブリダイゼーションによってｓｓＤＮＡドナーをｇＲＮＡに繋ぎ止めることに関し、これにより、ゲノム標的の切断と修復鋳型の即時の物理的局在化とのカップリングが可能になり、これにより誤りがちな非相同末端結合と比較して相同組換え率が促進される。

実施例セクション中で数字により特定される以下の参照文献は、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる。

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本開示に係る態様は、以下の態様を含む。
＜１＞
真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および
前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすること、
を含み、
前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、真核細胞を改変する方法。
＜２＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記真核細胞が、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
前記ＲＮＡが、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
前記ＲＮＡが、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸をヒト細胞にトランスフェクトすること、および
前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記ヒト細胞にトランスフェクトすること
を含み、
前記ヒト細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、ヒト細胞を改変する方法。
＜７＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞
前記ＲＮＡが、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む、＜６＞に記載の方法。
＜９＞
前記ＲＮＡが、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、＜６＞に記載の方法。
＜１０＞
真核細胞のゲノムＤＮＡ上の異なる部位に相補的なＲＮＡをコードする複数の核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および
前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすること
を含み、
前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、複数のゲノムＤＮＡ部位で真核細胞を改変する方法。
＜１１＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
前記真核細胞が、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、＜１０＞に記載の方法。
＜１３＞
前記ＲＮＡが、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む、＜１０＞に記載の方法。
＜１４＞
前記ＲＮＡが、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、＜１０＞に記載の方法。

Claims (14)

1. 真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および
   前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすること、
   を含み、
   前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、真核細胞を改変する方法。
2. 前記酵素がＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
3. 前記真核細胞が、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＲＮＡが、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＲＮＡが、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
6. 真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸をヒト細胞にトランスフェクトすること、および
   前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記ヒト細胞にトランスフェクトすること
   を含み、
   前記ヒト細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、ヒト細胞を改変する方法。
7. 前記酵素がＣａｓ９である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＲＮＡが、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記ＲＮＡが、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
10. 真核細胞のゲノムＤＮＡ上の異なる部位に相補的なＲＮＡをコードする複数の核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および
    前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすること
    を含み、
    前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、複数のゲノムＤＮＡ部位で真核細胞を改変する方法。
11. 前記酵素がＣａｓ９である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記真核細胞が、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記ＲＮＡが、約１０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記ＲＮＡが、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。

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