RU2699523C2 - Рнк-направляемая инженерия генома человека - Google Patents

Рнк-направляемая инженерия генома человека Download PDF

Info

Publication number
RU2699523C2
RU2699523C2 RU2015129018A RU2015129018A RU2699523C2 RU 2699523 C2 RU2699523 C2 RU 2699523C2 RU 2015129018 A RU2015129018 A RU 2015129018A RU 2015129018 A RU2015129018 A RU 2015129018A RU 2699523 C2 RU2699523 C2 RU 2699523C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cas9 protein
cas9
cell
nucleic acid
sequence
Prior art date
Application number
RU2015129018A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015129018A (ru
Inventor
Джордж М. ЧЁРЧ
Прашант МАЛИ
Лухан ЯНГ
Original Assignee
Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50979072&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2699523(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж filed Critical Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж
Publication of RU2015129018A publication Critical patent/RU2015129018A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2699523C2 publication Critical patent/RU2699523C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/55—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ генетического изменения эукариотической клетки. Обеспечивают в эукариотической клетке последовательность направляющей РНК, комплементарную последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, причем последовательность направляющей РНК связывается с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты, и обеспечивают в эукариотической клетке белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9, который взаимодействует с последовательностью направляющей РНК, где клетка не является клеткой зародышевой линии человека. 24 з.п. ф-лы, 15 ил.

Description

Данные родственных заявок
Эта заявка испрашивает приоритет по Предварительной заявки на патент США №61/779,169, поданной 13 марта 2013 года и Предварительной заявки на патент США №61/738,355, поданной 17 декабря 2012, каждая из которых включена тем самым здесь ссылкой в их полном виде для всех целей.
Заявление интересов правительства
Данное изобретение было произведено с поддержкой правительства под Р50 HG005550, решением Национальных Институтов Здоровья. Правительство имеет определенные права на это изобретение.
Уровень техники
Системы CRISPR бактерий и архебактерий основаны на сrРНК в комплексе с белками Cas для направленной деградации комплементарных последовательностей, присутствующих во вторгнувшейся вирусной и плазмидной ДНК (1-3). Недавнее in vitro воссоздание системы CRISPR типа II S. pyogenes продемонстрировало, что сrРНК, слитая с нормальной транс-кодируемой tracrPHK, является достаточной для направления белка Cas9 для последовательность-специфического расщепления ДНК-последовательностей-мишеней, соответствующих сrРНК (4).
Сущность изобретения
В настоящем описании содержаться ссылки в виде цифр на документы, которые перечислены в конце данного описания изобретения. Документ, соответствующий этой цифре, включен посредством отсылки в это описание изобретения также как если бы он был приведен полностью.
Согласно одному аспекту данного изобретения, эукариотическую клетку трансфицируют двухкомпонентной системой, включающей РНК, комплементарную геномной ДНК, и фермент, который взаимодействует с этой РНК. Эти РНК и фермент экспрессируются клеткой. Затем РНК из комплекса РНК/фермент связывается с комплементарной геномной ДНК. Затем фермент выполняет функцию, такую как расщепление этой геномной ДНК. Данная РНК содержит между приблизительно 10 нуклеотидов - приблизительно 250 нуклеотидов. Например РНК включает приблизительно 20 нуклеотидов - приблизительно 100 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, фермент может выполнять любую желаемую функцию, для которой он был сконструирован, сайт-специфическим образом. Согласно одному аспекту, этой эукариотической клеткой является клетка дрожжей, клетка растения или клетка млекопитающего. Согласно одному аспекту, фермент расщепляет геномные последовательности, на которые нацелены РНК-последовательности (см. ссылки (4-6)), создавая таким образом эукариотическую клетку с измененным геномом.
Согласно одному аспекту, данное изобретение обеспечивает способ генетического изменения клетки человека включением в геном этой клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК, комплементарную геномной ДНК, и нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который осуществляет желаемое воздействие на геномную ДНК. Согласно одному аспекту, РНК и фермент экспрессируются. Согласно одному аспекту, эта РНК гибридизируются с комплементарной геномной ДНК. Согласно одному аспекту, этот фермент активируется для осуществления желаемой функции, такой как расщепление сайт-специфическим образом, когда РНК гибридизируется с комплементарной геномной ДНК. Согласно одному аспекту, эта РНК и этот фермент являются компонентами бактериальной системы CRISPR Type II.
Согласно одному аспекту, предлагается способ изменения эукариотической клетки, включающий трансфекцию этой эукариотической клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей РНК, комплементарную геномной ДНК этой эукариотической клетки, трансфекцию этой эукариотической клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, который взаимодействует с этой РНК и расщепляет эту геномную ДНК сайт-специфическим образом, где эта клетка экспрессирует эти РНК и фермент, где эта РНК связывается с комплементарной геномной ДНК и указанный фермент расщепляет геномную ДНК сайт-специфическим образом. Согласно одному аспекту, ферментом является Cas9 или модифицированный Cas9 или гомолог Cas9. Согласно одному аспекту, эукариотической клеткой является клетка дрожжей, клетка растения или клетка млекопитающего. Согласно одному аспекту, РНК содержит между приблизительно 10 - приблизительно 250 нуклеотидов. Согласно следующему аспекту, РНК содержит между приблизительно 20 - приблизительно 250 нуклеотидов. Согласно еще одному аспекту, РНК содержит между приблизительно 20 до приблизительно 100 нуклеотидов.
Согласно дальнейшему аспекту, предлагается способ изменения клетки человека, включающий трансфекцию клетки человека нуклеиновой кислотой, кодирующей РНК, комплементарную геномной ДНК эукариотической клетки, трансфекцию клетки человека нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, который взаимодействует с РНК и расщепляет геномную ДНК сайт-специфическим образом, где эта клетка человека экспрессирует эти РНК и фермент, где РНК связывается с комплементарной геномной ДНК, а фермент расщепляет эту геномную ДНК сайт-специфическим образом. Согласно одному аспекту, этим ферментом является Cas9 или модифицированный Cas9 или гомолог Cas9. Согласно одному аспекту, РНК содержит между приблизительно 10 - приблизительно 250 нуклеотидов. Согласно следующему аспекту, РНК содержит между приблизительно 20 - приблизительно 250 нуклеотидов.
Согласно другому аспекту, предложен способ изменения эукариотической клетки во множестве сайтов геномной ДНК, включающий трансфекцию эукариотической клетки множеством нуклеиновых кислот, кодирующих РНК, комплементарные различным сайтам геномной ДНК этой эукариотической клетки, трансфекцию этой эукариотической клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, который взаимодействует с этими РНК и расщепляет геномную ДНК сайт-специфическим образом, где эта клетка экспрессирует эти РНК и фермент, где РНК связываются с комплементарными участками геномной ДНК а фермент расщепляет эти геномные ДНК сайт-специфическим образом. Согласно дополнительному аспекту, этим ферментом является Cas9. Согласно еще одному аспекту, этой эукариотической клеткой является клетка дрожжей, клетка растения или клетка млекопитающего. Согласно следующему аспекту, РНК содержит между приблизительно 10 - приблизительно 250 нуклеотидов. Согласно дальнейшему аспекту, эта РНК содержит между приблизительно 20 - приблизительно 250 нуклеотидов.
Подробное описание
Согласно одному аспекту, синтезировали кодон-оптимизированную с учетом использования кодонов у человека версию белка Cas9, содержащую с С-конца сигнал ядерной локализации SV40, и затем клонировали в систему экспрессии млекопитающих (фиг. 1А и фиг. 3А). Соответственно, на фиг. 1 изображено редактирование генома в клетках человека с использованием сконструированной системы CRISPR Type II. Как показано на фиг. 1А, РНК-направляемое нацеливание в клетках человека включает коэкспрессию белка Cas9, несущего с С-конца сигнал ядерной локализации SV40, с одной или несколькими направляющими РНК (гидРНК), которые экспрессировали с использованием промотора U6 полимеразы III. Cas9 раскручивает ДНК-дуплекс и расщепляет обе цепи после узнавания последовательности-мишени гидРНК, но только если на 3'-конце присутствует правильный смежный с протоспейсером мотив (РАМ). В принципе, можно нацелить систему на любую геномную последовательность формы GN20GG. Как показано на фиг. 1В, интегрировавшая в геном последовательность, кодирующая GFP, разрушается путем инсерции стоп-кодона и геномного фрагмента в 68 п. н. из локуса AAVS1. Реконструкция этой GFP-последовательности путем гомологичной рекомбинацией (HR) с помощью подходящей донорной последовательностью приводит к получению GFP+-клеток, которые могут быть количественно определены посредством FACS. Последовательности-мишени гидРНК Т1 и Т2 входят в состав фрагмента AAVS1. Сайты связывания двух половин гетеродимера нуклеазы TAL (TALEN) подчеркнуты. На фиг. 1С приведена столбчатая диаграмма эффективности HR, индуцированной T1, Т2 и TALEN-опосредованной нуклеазной активностью в локусе-мишени, что было измерено с использованием FACS. Репрезентативные графики FACS и микроскопические изображения этих клеток-мишеней изображены ниже (шкала столбчатой диаграммы равна 10 микрон). Приведенные данные являются средним +/- SEM (стандартная ошибка среднего (N=3).
Согласно одному аспекту, для направления Cas9 для расщепления представляющих интерес последовательностей, с помощью промотора U6 полимеразы III экспрессируют слитые транскрипты crPHK-tracrPHК, далее называемые как РНК-направляющие (гидРНК). Согласно дополнительному аспекту, гидРНК непосредственно транскрибируются клеткой. Этот аспект имеет то преимущество, что позволяет избежать реконструирование системы процессинга РНК, используемого бактериальными системами CRISPR (фиг. 1А и фиг. 3В) (см. ссылки (4, 7-9)). Согласно еще одному аспекту, предложен способ для изменения геномной ДНК, использующий инициацию транскрипции U6 с G и РАМ (смежный с протоспейсером мотив) последовательности-NGG, за которым следует мишень сrРНК из 20 п.н. Согласно этому аспекту, геномный сайт-мишень находится в форме GN20GG (см. фиг. 3С).
Согласно следующему аспекту, предложен репортерный анализ GFP (фиг. 1В) в клетках 293Т, который подобен описанному ранее анализу (см. ссылку (10)), для тестирования функциональности описанных здесь способов инженерии генома. Согласно этому аспекту, была получена стабильная клеточная линия, содержащая интегрированную в геном последовательность, кодирующую GFP, которая прервана инсерцией стоп-кодона и фрагмента в 68 п. н. из локуса AAVS1, что приводит к тому, что экспрессируемый белковый фрагмент не флуоресцентный. Гомологичная рекомбинация (HR), использующая подходящий репарирующий донор, может восстановить нормальную последовательность GFP, что позволяет специалисту определить количество полученных GFP+-клеток с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
Согласно следующему аспекту, предложен способ гомологичной рекомбинации (HR). Конструировали две гидРНК, Т1 и Т2, которые нацелены на промежуточный фрагмент AAVS1 (фиг. 1b). Сравнивали их активность с активностью ранее описанного гетеродимера TAL-эффекторной нуклеазы (TALEN), нацеленного на ту же самую область (см. ссылку (11)). Со всеми тремя нацеливающими реагентами наблюдались успешные события HR, где частота коррекции гена с использованием подхода с Т1 и Т2 гидРНК, достигала 3% и 8%, соответственно (фиг. 1С). Этот РНК-опосредованный процесс редактирования оказался примечательно быстрым, и первые детектируемые GFP+-клетки появились через ~20 часов после трансфекции, в сравнении с ~40 часами для AAVS1 TALEN. HR наблюдали только после одновременного введения донора репарации, белка Cas9, и гидРНК, что является подтверждением того, что все эти компоненты требуются для редактирования генома (фиг. 4). Хотя явной токсичности, ассоциированной с экспрессией с Cas9/crPHK не отмечали, работа с ZFN и TALEN ранее показала, что разрыв только одной цепи дополнительно уменьшает токсичность. Таким образом, тестировали мутант Cas9D10A, о котором известно, что он функционирует в качестве никазы in vitro, что давало сходную HR (гомологичную рекомбинацию), но более низкую частоту негомологичного соединения концов (NHEJ) (фиг. 5) (см. ссылки (4, 5)). В соответствии с (4), где было показано что белок родственный Cas9 разрезает обе цепи на расстоянии 6 п.н. слева по ходу транскрипции от РАМ, данные NHEJ подтвердили, что большинство делеций или инсерций происходит на 3'-конце последовательности-мишени (фиг. 5В). Было также подтверждено, что мутация геномного сайта-мишени предотвращает воздействие гидРНК на HR в этом локусе, демонстрируя, что CRISPR-опосредованное редактирование генома является последовательность-специфическим (фиг. 6). Было показано, что два сайта нацеливания гидРНК в гене GFP, а также три дополнительных фрагмента нацеливания гидРНК из гомологичных районов ДНКметилтрансферазы 3а (DNMT3a) и гена DNMT3b могут последовательность-специфическим образом индуцировать значимую гомологичную рекомбинацию (HR) в сконструированных линиях репортерных клеток (фиг. 7, 8). Вместе эти результаты подтверждают, что РНК-направляемое нацеливание на геном в клетках человека индуцирует сильную гомологичную рекомбинацию (HR) во множественных сайтах-мишенях.
Согласно некоторым аспектам, был модифицирован нативный локус. гидРНК использовали для нацеливания на локус AAVS1, локализованный в гене PPP1R12C на хромосоме 19, который повсеместно экспрессируется в большинстве тканей (фиг. 2А) и в клетках iPS человека 293Т, К562 и PGP1 (см. ссылку (12)), и анализировали результаты с помощью next-gen секвенирования локуса мишени. Соответственно фиг. 2 предложена для описания РНК-направляемого редактирование генома в нативном локусе AAVS1 во множестве типов клеток. Как показано на фиг. 2А, Т1 (красная) и Т2 (зеленая) последовательности-мишени гидРНК находятся в интроне гена PPP1R12C в локусе AAVS1 хромосомы 19. Как показано на фиг. 2В, определены общее количество и локализация делеций, вызываемых NHEJ в клетках iPS 293Т, K562 и PGP1 после экспрессии Cas9 и либо Т1, либо Т2 гидРНК, что было сделано с помощью next-gen секвенирования. Красные и зеленые штрихпунктирные линии обозначают границы сайтов таргетинга Т1 и Т2 гидРНК. Частота NHEJ для Т1 и Т2 гидРНК были 10% и 25% и 25% в 293Т, 13% и 38% в K562 и 2% и 4% в клетках PGP1 iPS, соответственно. На фиг. 2С изображена схема ДНК-донора для HR в локусе AAVS1, и показаны местоположения секвенирующих праймеров (стрелками) для детектирования успешных событий нацеливания. Как это видно из фиг. 2D, ПЦР-анализ спустя три дня после трансфекции выявил, что только клетки, экспрессирующие донор, Cas9 и Т2 гидРНК, показали успешные события HR. Как показано на фиг. 2Е, успешная HR (гомологичная рекомбинация) подтверждалась секвенированием ПЦР-ампликона методом Sanger, показавшем, что ожидаемые ДНК-основания присутствуют на обеих границах геном-донор и донор-вставка. Как показано на фиг. 2F в течение 2 недель с использованием пуромицина отбирали «успешно нацеленные» клоны клеток 293Т. Показаны изображения под микроскопом двух репрезентативных GFP+-клонов (масштабная линейка (метка) равна 100 микрон).
В соответствии с результатами для GFP-репортерного анализа, высокую частоту событий NHEJ наблюдали в эндогенном локусе для всех трех типов клеток. Для двух гидРНК Т1 и Т2 частота NHEJ достигала 10 и 25% в 293Т, 13 и 38% в K562 и 2 и 4% в клетках PGP1-iPS, соответственно (фиг. 2В). Явная токсичность не наблюдалась от экспрессии Cas9 и сrРНК, которая требуется для индукции NHEJ в любом из этих типов клеток (фиг. 9). Как и ожидалось, NHEJ-опосредованные делеции для Т1 и Т2 сосредоточивались около положений сайта-мишени, что дополнительно подтверждает специфичность к последовательности у этого процесса нацеливания (фиг. 9, 10, 11). Одновременное введение как Т1, так и Т2 гидРНК приводило к высокоэффективной делеции промежуточного фрагмента 19 п.н. (фиг. 10), демонстрируя, что мультиплексное редактирование геномных локусов выполнимо с использованием этого подхода.
Согласно одному аспекту, HR используют для интеграции либо конструкта дцДНК-донора (см. ссылку (13)), либо олиго-донора в нативный локус AAVS1 (фиг. 2С, фиг. 12). HR-опосредуемую интеграцию подтверждали с использованием как ПЦР (фиг. 2D, фиг. 12) и так и -секвенирования по Sanger (дидезоксисеквенирования) (фиг. 2Е). Клоны 293Т или iPS легко выделяли из пула модифицированных клеток с использованием селекции на пуромицине на протяжении двух недель (фиг. 2F, фиг. 12). Эти результаты демонстрируют, что Cas9 способен эффективно встраивать чужеродную ДНК в эндогенные локусы в клетках человека. Таким образом, один аспект данного изобретения включает в себя способ интеграции чужеродной ДНК в геном клетки с использованием гомологичной рекомбинации и Cas9.
Согласно одному аспекту, предлагается РНК-направляемая система редактирования генома, которая может быть легко адаптирована для модификации других геномных сайтов путем простой модификации последовательности гидРНК-экспрессирующего вектора, для того чтобы она совпала с совместимой последовательностью в представляющем интерес локусе. Согласно этому аспекту, создавали 190,000 специфически гидРНК-направляющих последовательностей, нацеленных на около 40,5% экзонов генов в геноме человека. Эти последовательности-мишени были включены в формат 200 п.н., совместимый с мультиплексным синтезом на ДНК-эрреях (ранжированных рядах ДНК) (см. ссылку (14)) (фиг. 13). Согласно этому аспекту, обеспечена готовая к использованию система направления на потенциальные сайты-мишени в полноразмерном геноме человека и методология для мультиплексного синтеза гидРНК.
Согласно одному аспекту, предлагаются способы для мультиплексных геномных изменений в клетке с использованием одной или более или множества систем РНК/фермент, описанных здесь, для изменения генома клетки во множестве местоположений. Согласно одному аспекту, сайты-мишени идеально совпадают с последовательностью РАМ NGG и с 8-12 п.о. затравочной последовательности на 3'-конце этой гидРНК. Согласно некоторым аспектам, не требуется абсолютное совпадение для оставшихся 8-12 оснований. Согласно ряду аспектов, Cas9 будет функционировать с отдельными ошибочными спариваниями на 5'-конце. Согласно некоторым определенным аспектам, структура хроматина в локуса-мишени и эпигенетическое состояние могут влиять на эффективность функционирования Cas9. Согласно некоторым аспектам, в качестве пригодных ферментов включены гомологи Cas9, имеющие высокую специфичность. Специалист в данной области будет способен идентифицировать или сконструировать подходящие гомологи Cas9. Согласно одному аспекту, CRISPR-таргетируемые последовательности включают те последовательности, имеющие другие требования РАМ (см. ссылку (9)) или направленную эволюцию. Согласно одному аспекту, инактивирование одного из доменов Саs9-нуклеазы увеличивает скорость HR относительно NHEJ и может уменьшать токсичность (фиг. 3А, фиг. 5) (4, 5), тогда как инактивирование обоих доменов может заставить Cas9 функционировать в качестве перенастраиваемого ДНК-связывающего белка. Варианты данного изобретения имеют широкое применения в синтетической биологии (см. ссылки (21, 22)), прямой и мультиплексной перестройке генных сетей (см. ссылки (13, 23)), и направленной ex vivo (см. ссылки (24-26)) и in vivo генотерапии (см. ссылку (27)).
В соответствии с некоторыми аспектами, предложен "переконструированный организм" в качестве модельной системы для биологического открытий и скрининга in vivo. Согласно одному аспекту, создана "переконструированная мышь", несущая индуцируемый трансген Cas9, и локализованную доставку (с использованием аденоассоциированных вирусов, например) библиотек гидРНК, направленных на множество генов или регуляторных элементов, что позволяет проводить скрининг на мутации, которые приводят к появлению опухолей в этом типе ткани-мишени. Применение гомологов Cas9 или вариантов нуклеаза-нуль, несущих эффекторные домены (такие как активаторы), позволяет активировать или подавлять один или многие гены in vivo. Согласно этому аспекту, специалист мог бы проводить скрининг на факторы, которые могут создавать фенотипы, такие как: регенерация ткани, транс-дифференциации и т.д. Согласно некоторым аспектам, (а) применение ДНК-эрреев позволяет выполнять мультиплексный синтез определенных библиотек гидРНК (ссылка на фиг. 13); и (b) поскольку гидРНК имеет малый размер (ссылка на фиг. 3b), их упаковывают и доставляют с использованием множества невирусных или вирусных способов доставки.
Согласно одному аспекту, наблюдались более низкие токсичности когда в геномной инженерии использовались "никазы", что достигалось инактивированием одного из доменов Саs9-нуклеазы, вырезающем либо цепь ДНК, спарившуюся с РНК, либо вырезающая ее комплемент. Инактивирование обоих доменов позволяет Cas9 функционировать в качестве перенацеливаемого ДНК-связывающего белка. Согласно одному аспекту, этот перенацеленный ДНК-связываюший белок Cas9 присоединяют (а) к доменам активации или репрессии транскрипции для модуляции экспрессии гена-мишени, включающей в том числе ремоделирование хроматина, модификацию гистонов, сайленсинг, инсуляции, прямых взаимодействий с аппаратом транскрипции;
(b) к доменам нуклеазы, таким как FokI, для возможности обеспечения «высоко специфического» контингента редактирования генома после димеризации смежных комплексов гидPHK-Cas9;
(c) к флуоресцентным белкам для визуализации геномных локусов и динамики хромосом; или
(d) к другим флуоресцентным молекулам, таким как связывающиеся с белками или нуклеиновыми кислотами органические флуорофоры, квантовые точки, молекулярные маяки и эхо-зонды или заменители молекулярных маяков;
(е) с мультивалентным лиганд-связывающим доменам белков, что делает возможной программируемую манипуляцию с 3D-архитектурой генома.
Согласно еще одному аспекту, компоненты транскрипционной активации и репрессии могут использовать системы CRISPR, которые природно или синтетически ортогональны, так что гидРНК связываются только с активатором или репрессором класса Cas. Это позволяет иметь большой набор гидРНК для настраивания множества мишеней.
Согласно некоторым аспектам, применение гидРНК дает больше возможность мультиплексирования по сравнению с мРНК, частично вследствие меньшего размера - 100 против. 2000 нуклеотидной длины, соответственно. Это является особенно ценным, с учетом того, что доставка нуклеиновой кислоты ограничена размером, например в случае упаковки в вирус. Это позволяет получить множественные случаи расщепления, никинга, активации или репрессии - или их комбинации. Эта способность легко нацеливаться на множественные регуляторные мишени позволяет грубо или тонкое настраивать систему или регуляторные сети не ограничиваясь природными регуляторными циклами, начинающимися с специфических регуляторных факторов (например, 4 мРНК, используемых в перепрограммировании фибробластов в IPSC). Примеры мультиплексированных применений включают в себя::
1. Установление (главной и минорной) аллелей гистосовместимости, гаплотипов и генотипов для трансплантации ткани/органа у человека (или животного). Этот аспект обеспечивает, например, гомозиготные линии клеток HLA или гуманизированные породы животных - или - набор гидРНК, способных перекладывать такие аллели HLA для других желаемых линий или пород.
2. Мультиплексные мутации цис-регуляторных элементов (CRE = сигналы для транскрипции, сплайсинга, трансляции, фолдинга, деградации РНК или белка, и т.д.) в одной клетке (или коллекции клеток), что может быть использовано для эффективного исследования сложной совокупности регуляторного взаимодействия, происходящих при нормальном развитии или патологических, синтетических или фармацевтических сценариях. Согласно этому аспекту, данные CRE являются (или могут быть сделаны) несколько ортогональными (т.е. с низкими взаимными помехами), так что многие могут тестироваться в одинаковой обстановке) - например, в дорогостоящей динамической модели эмбрионов животного. Одним вариантом применения является совместное использование с флуоресцентным секвенированием РНК in situ (FISSeq).
3. Мультиплексные комбинации мутаций СRE и/или эпигенетической активации или репрессии CRE могут быть использованы для изменения или репрограммирования iPSC или ESC или других стволовых клеток или нестволовых клеток в любой тип клеток или комбинацию клеточных типов для использования в органах-на-чипах или других культурах клеток или органов для целей тестирования фармацевтических препаратов (малых молекул, белков, РНК, клеток, клеток животного, растения или микробных клеток, аэрозолей и других способов доставки), стратегий трансплантации, стратегий персонализации и т.д.
4. Получение мультиплексных мутантных клеток человека для использования в диагностическом тестировании (и/или секвенировании ДНК) для медицинской генетики. До той степени, пока хромосомная локализация и окружение аллеля генома человека (или эпигенетической метки) могут влиять на точность клинико-генетического диагноза, скорее важно иметь аллели, присутствующие в правильном местоположении в эталонном геноме, чем в эктопическом (иначе трансгенном) местоположении или в отдельном куске синтетической ДНК. Одним вариантом воплощения является серия независимых клеточных линий по одной на каждый диагностический SNP (однонуклеотидный полиморфизм) человека, или структурный вариант. Альтернативно, один вариант включает в себя мультиплексные наборы аллелей в одной и той же клетке. В некоторых случаях будут желательными мультиплексные изменения в одном гене (или множестве генов), при условии независимого тестирования. В других случаях, конкретные комбинации аллелей-гаплотипы позволяют тестировать методы секвенирования (генотипирования), которые точно устанавливают фазу гаплотипа (т.е. затронута ли одна или обе копии гена в отдельном субъекте или типе соматических клеток).
5. Повторяющиеся элементы или эндогенные вирусные элементы могут быть мишенями сконструированных систем Cas+ гидРНК в клетках микробах, растений, животных или человека для уменьшения вредной транспозиции или способствования секвенированию или других аналитических геномных/транскриптомных/протеомных/диагностических инструментах (в которых почти идентичные копии могут быть проблематическими).
Следующие ссылки, идентифицированные цифрами в предыдущем разделе, включены здесь посредством ссылки в их полном виде.
1. В. Wiedenheft, S.H. Sternberg, J.A. Doudna, Nature 482, 331 (Feb 16, 2012).
2. D. Bhaya, M. Davison, R. Barrangou, Annual review of genetics 45, 273 (2011).
3. M.P. Terns, R.M. Terns, Current opinion in microbiology 14, 321 (Jun, 2011).
4. M. Jinek et al., Science 337, 816 (Aug 17, 2012).
5. G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579 (Sep 25, 2012).
6. R. Sapranauskas et al., Nucleic acids research 39, 9275 (Nov, 2011).
7. T.R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296, 550 (Apr 19, 2002).
8. M. Miyagishi, K. Taira, Nature biotechnology 20, 497 (May, 2002).
9. E. Deltcheva et al., Nature 471, 602 (Mar 31, 2011).
10. J. Zou, P. Mali, X. Huang, S.N. Dowey, L. Cheng, Blood 118, 4599 (Oct 27, 2011).
11. Ν.Ε. Sanjana et al., Nature protocols 7, 171 (Jan, 2012).
12. J.H. Lee et al, PLoS Genet 5, e1000718 (Nov, 2009).
13. D. Hockemeyer et al., Nature biotechnology 27, 851 (Sep, 2009).
14. S. Kosuri et al., Nature biotechnology 28, 1295 (Dec, 2010).
15. V. Pattanayak, C.L. Ramirez, J.K. Joung, D.R. Liu, Nature methods 8, 765 (Sep, 2011).
16. N.M. King, O. Cohen-Haguenauer, Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 16,432 (Mar, 2008).
17. Y.G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1156 (Feb 6, 1996).
18. E.J. Rebar, С.O. Pabo, Science 263, 671 (Feb 4, 1994).
19. J. Boch et al., Science 326, 1509 (Dec 11, 2009).
20. M.J. Moscou, A.J. Bogdanove, Science 326, 1501 (Dec 11, 2009).
21. A.S. Khalil, J.J. Collins, Nature reviews. Genetics 11, 367 (May, 2010).
22. P.E. Purnick, R. Weiss, Nature reviews. Molecular cell biology 10, 410 (Jun, 2009).
23. J. Zou et al., Cell stem cell 5, 97 (Jul 2, 2009).
24. N. Holt et al., Nature biotechnology 28, 839 (Aug, 2010).
25. F.D. Urnov et al., Nature 435, 646 (Jun 2, 2005).
26. A. Lombardo et al., Nature biotechnology 25, 1298 (Nov, 2007).
27. H. Li et al., Nature 475, 217 (Jul 14, 2011).
Следующие примеры представлены в качестве репрезентативных примеров воплощения данного изобретения. Эти примеры не должны пониматься как ограничивающие объем данного изобретения, так как эти и другие эквивалентные варианты воплощения будут очевидными в свете данного описания изобретения, фигур и сопутствующей формулы изобретения.
Пример I
Система CRISPR-Cas Типа II
Согласно одному аспекту, в вариантах воплощения этого изобретения используют короткую РНК для идентификации чужеродных нуклеиновых кислот для действия на них посредством нуклеазы в эукариотической клетке. Согласно некоторому аспекту данного изобретения, эукариотическую клетку изменяют для включения в ее геном нуклеиновых кислот, кодирующие одну или несколько коротких РНК и одну или несколько нуклеаз, которые активируются связыванием короткой РНК с последовательностью ДНК-мишени. Согласно некоторым аспектам, примерные системы короткая РНК / фермент могут быть идентифицированы в бактериях или архебактериях, такие как (CRISPR)/CRISPR-ассоциированные (Cas) системы, которые используют короткую РНК для направленной деградации чужеродных нуклеиновых кислот. Защита CRISPR ("Короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами") включает в себя приобретение и интеграцию новых нацеливающих "спейсеров" из внедряющихся вирусных и плазмидных ДНК в локус CRISPR, экспрессию и процессинг коротких направляющих CRISPR РНК (сrРНК), состоящих из единиц спейсер-повтор, и расщепление нуклеиновых кислот (наиболее часто ДНК) комплементарных этому спейсеру.
Известны три класса систем CRISPR и на них ссылаются как на Тип I, Тип II или Тип III. Согласно одному аспекту, особенно полезным ферментом используемым в соответствии с настоящим изобретением для расщепления дцДНК является одноэффекторный фермент, Cas9, характерный для Типа II. (См. ссылку (1)). В бактериях, эта эффекторная система Типа II состоит из длинной пре-сrРНК, транскрибируемой из спейсер-содержащего локуса CRISPR, мультифункционального белка Cas9 и tracrPHK, важной для процессинга гидРНК. Эти tracrPHK гибридизируются с областями повторов, разделяющими спейсеры prе-сrРНК, инициируя расщепление дцРНК эндогенной РНКазой III, за которым следует второе событие расщепления в пределах каждого спейсер посредством Cas9, что в результате дает зрелые сrРНК, которые остаются ассоциированными с tracrPHK и Cas9. Согласно одному аспекту, эукариотические клетки данного изобретения конструируют таким образом, чтобы избежать использования РНКазы III и процессинга сrРНК в целом. См. ссылку (2).
Согласно одному аспекту, фермент данного описания изобретения, такой как Cas9, раскручивает ДНК-дуплекс и ищет последовательности, соответствующие сrРНК, для расщепления. Узнавание мишени осуществляется после детектирования комплементарности между последовательностью "протоспейсера" в ДНК-мишени и сохранившейся спейсерной последовательностью в сrРНК. Важно, что Cas9 разрезает ДНК только в том случае, если на 3'-конце присутствует корректный смежный с протоспейсером мотив (РАМ). Согласно некоторым аспектам, может быть использован другой смежный с протоспейсером мотив. Например, система S. pyogenes требует последовательность NGG, где N может быть любым нуклеотидом. Системы S. thermophilus Type II требуют NGGNG (см. ссылку (3)) и NNAGAAW (см. ссылку (4)), соответственно, тогда как другие системы S. mutans допускают NGG или NAAR (см. ссылку (5)). Биоинформатические анализы создали обширные базы данных локусов CRISPR в различных бактериях, которые могут служить для идентификации дополнительных пригодных РАМ и расширить набор последовательностей, на которые нацеливается CRISPR (см. ссылки (6, 7)). В S. thermophilus, Cas9 генерирует двухцепочечный разрыв с тупыми концами на расстоянии 3 п.н. перед 3'-концом протоспейсера (см. ссылку (8)), процесс, опосредуемый двумя каталитическими доменами белка Cas9: HNH-доменом, который расщепляет комплементарную цепь ДНК, и RuvC-подобным доменом, который расщепляет некомплементарную цепь (см. фиг. 1А и фиг. 3). Хотя система S. pyogenes еще не была настолько точно охарактеризована, образование двуцепочечного разрыва также происходит в направлении 3'-конца протоспейсера. Если один из этих двух доменов нуклеазы инактивирован, Cas9 будет функционировать в качестве никазы in vitro (см. ссылку (2)) и в клетках человека (см. фиг. 5).
Согласно одному аспекту, специфичность гидРНК-направляемого расщепления Cas9 используют в качестве механизма геномной инженерии в эукариотической клетке. Согласно одному аспекту, гибридизация гидРНК не должна быть 100-процентной для того, чтобы фермент распознал гибрид гидРНК/ДНК и осуществил расщепление. Может наблюдаться некоторая внецелевая активность. Например, система S. pyogenes допускает нарушение комплементарности в первых 6 основаниях из 20 п.н. зрелой спейсерной последовательности in vitro. Согласно одному аспекту, большая жесткость может быть более выгодной in vivo, когда в эталонном геноме человека имеются потенциальные внецелевые сайты совпадения (последние 14 п.н.) NGG для гидРНК. Результат этого ошибочного спаривания и активность фермента в общем виде описаны в ссылках (9), (2), (10) и (4).
Согласно некоторым аспектам, может быть улучшена специфичность. Когда интерференция является чувствительной к точке плавления гибрида гидРНК-ДНК, АТ-обогащенные последовательности могут иметь меньше внецелевых сайтов. Осторожный выбор сайтов-мишеней во избежание псевдосайтов с. совпадающими последовательностями по меньшей мере в 14 п.н. в других местах генома может улучшить специфичность. Применение варианта Cas9, требующего более длинную последовательность РАМ, также может уменьшать частоту внецелевых сайтов. Направленная эволюция может улучшать Саз9-специфичность до уровня, достаточного для полного предотвращения внецелевой активности, в идеале требуя полного совпадения 20 п.н. гидРНК с минимальным РАМ. Таким образом, модификация белка Cas9 является репрезентативным вариантом данного изобретения. В связи с этим, предвидится разработка новых способов, обеспечивающих много раундов эволюции в коротком временном интервале (см. ссылку (11). Системы CRISPR, полезные в данном изобретении, описаны в ссылках (12, 13).
Пример II
Конструирование плазмиды
Последовательность гена Cas9 оптимизировали с учетом использования кодонов человека и собирали с использованием Hierarchical fusion PCR assembly из 9 500 п.н. gBlock, полученных от IDТ. На фиг. 3А, посвященной сконструированной системе типа Π CRISPR для клеток человека, показан формат экспрессии и полная последовательность вставки cas9. Мотивы RuvC-подобный и HNH, и С-конец SV40 NLS соответственно окрашенными синим, коричневым и оранжевым цветом. Подобным образом конструировали и Cas9_D10A. Полученные полноразмерные продукты клонировали в вектор pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen). Конструкты для экспрессии желаемой гидРНК - были заказаны в виде отдельных 455 п.н. gBlock в IDT и их либо клонировали в вектор pCR-BluntII-ΤΟΡΟ (Invitrogen), либо ПЦР-амплифицировали. На фиг. 3В приведена схема экспрессии на основе промотора U6 для направляющей РНК и предсказанной вторичной структуры РНК-транскрипта. Использование промотора U6 ведет к тому, что 1-ое положение в этом РНК-транскрипте будет 'G', и, следовательно, с использованием этого подхода можно нацелиться на все геномные сайты формы GN20GG. На фиг. 3С показаны используемые 7 гидРНК.
Векторы для репортерного анализа HR, включающего использование разорванного GFP, конструировали слиянием посредством ПЦР-сборки последовательности GFP, несущей стоп-кодон и 68 п.н. фрагмент AAVS1 (или их мутанты; см. фиг. 6), или 58 п.н. фрагменты из геномных локусов DNMT3a и DNMT3b (см. фиг. 8), собранные в лентивектор EGIP из Addgene (плазмида #26777). Затем эти лентивекторы использовали для получения стабильных линий репортера. TALEN, используемые в этом исследовании, конструировали с использованием протоколов, описанных в (14). Все ДНК-реагенты, используемые в этом исследовании, являются доступными в Addgene.
Пример III
Культура клеток
Клетки PGP1 iPS поддерживали на покрытых Matrigel (BD Biosciences)-чашках в mTeSR1 (Stemcell Technologies). Культуры пассировали каждые 5-7 дней с использованием TrypLE Express (Invitrogen). Клетки K562 выращивали и поддерживали в RPMI (Invitrogen), содержащей 15% FBS. Клетки HEK 293Т культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Invitrogen), дополненной высокой концентрацией глюкозы с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Invitrogen), пенициллином/стрептомицином (пен/стреп, Invitrogen) и не-незаменимыми аминокислотами (NEAA, Invitrogen). Все клетки поддерживали при 37°С и 5% СО2 в увлажняемом инкубаторе.
Пример IV
Таргетинг генов PGP1 iPS, K562 и 293Т
Клетки PGP1 iPS культивировали с ингибитором Rho-киназы (ROCK) (Calbiochem) 2 ч перед нуклеофекцией. Клетки собирали с использованием TrypLE Express (Invitrogen) и 2×106 клеток ресуспендировали в реагенте Р3 (Lonza) 1 мкг плазмиды Cas9, 1 мкг гидРНК и/или 1 мкг плазмиды с донором ДНК, и осуществляли нуклеофекцию в соответствии с инструкцией изготовителя (Lonza). Затем клетки высевали на mTeSR1-покрытую чашку, дополненную ингибитором ROCK, в течение первых 24 часов. Для клеток K562, 2×106 клеток ресуспендировали в реагенте SF (Lonza) 1 мкг плазмиды Cas9, 1 мкг гидРНК и/или 1 мкг плазмиды с донором ДНК, и осуществляли нуклеофекцию в соответствии с инструкцией изготовителя (Lonza). Для 293Т, 0,1×106 клеток трансфицировали 1 мкг плазмиды Cas9, 1 мкг гидРНК и/или 1 мкг плазмиды с донорной ДНК с использованием Липофектамина 2000 как в протоколах изготовителя. ДНК-доноры, используемые для таргетинга на эндогенный AAVS1 были либо дцДНК-донором (фиг. 2С), либо 90-мерным олигонуклеотидом. Первый имеет фланкирующие короткие гомологичные плечи и SA-2A-пуромицин-CaGGS-eGFP-кассету для обогащения успешно таргетированных клеток.
Эффективность нацеливания оценивали следующим образом. Клетки собирали через 3 дня после нуклеофикации и экстрагировали геномную ДНК ~1×106 клеток с использованием prepGEM (ZyGEM). Проводили ПЦР амплификацию района-мишени с геномной ДНК, полученной из этих клеток, и проводили глубокое секвенирование ампликонов с использованием MiSeq Personal Sequencer (Illumina) с покрытием >200000 прочтений. Данные секвенирования анализировали для оценивания эффективностей NHEJ. Этой анализированной эталонной последовательностью AAVS1 является:
Figure 00000001
ПЦР-праймерами для амплификации таргетирующих районов в геноме человека являются:
Figure 00000002
Для анализа событий гомологической рекомбинации HR с использованием ДНК-донора на фиг. 2С, этими праймерами были:
Figure 00000003
Пример V
Биоинформатический подход для вычисления экзона человека, которые являются мишенями CRISPR и методология для их мультиплексного синтеза.
Набор последовательностей гидРНК, которые в максимальной степени нацелены на специфические местоположения в экзонах человека, но в минимальной степени нацелены на другие местоположения в этом геноме, определяли следующим образом. Согласно одному аспекту, максимально эффективное нацеливание посредством гидРНК достигается использованием 23 нт последовательностей, из которых наиболее близкие к 5'-концу 20 нт являются точным комплементом желаемого местоположения, при этом три наиболее близких к 3'-концу основания должны быть в форме NGG. Дополнительно, наиболее близкий к 5'-концу нуклеотид должен быть G для установления сайта начала транскрипции pol-III. Однако, в соответствии с (2), ошибочное спаривание шести наиболее близких к 5' нуклеотидов из 20 п.н. гидРНК с ее геномной мишенью не отменяет Саs9-опосредуемое расщепление до тех пор, пока последние 14 нт спарены правильно, но ошибочное спаривание восьми наиболее близкими к 5'-концу нуклеотидов совмещенное со спариванием последних 12 нуклеотидов отменяет расщепления, в то время как случай с ошибочным спариванием семи наиболее близких к 5'-концу нт и 13 парами с 3'-конца не был тестирован. Для того чтобы занизить внецелевые эффекты, было поставлено условие, что этот случай с ошибочным спариванием семи нуклеотидов наиболее близких к 5'-концу, подобно случаю с ошибочным спариванием шести, допускает расщепление, так что спаривание наиболее близких к 3'-концу 13 нт является достаточным для расщепления. Для идентификации сайтов мишени CRISPR в экзонах человека, которые должны быть расщеплены без внецелевых расщеплений, испытывали все последовательности из 23 п.н. формы 5'-GBBBB ВВВВВ ВВВВВ ВВВВВ NGG-3' (формы 1), где В представляют основания в местоположении экзона, для которых не существует последовательность формы 5'-NNNNN NNBBB ВВВВВ ВВВВВ NGG-3' (формы 2) в любом другом местоположении в геноме человека. Конкретно, загрузили (i) BED-файл местоположений кодирующих районов всех генов RefSeq генома человека GRCh37/hg19 из UCSC Genome Browser (15-17). Местоположения кодирующих экзонов в этом BED-файле содержат набор 346089 номеров доступа RefSeq мРНК для генома hg19. Однако некоторые номера доступа RefSeq-мРНК картировались во множественных геномных местоположений (возможные дупликации генов) и многие номера доступа картировались на субпопуляций того же самого набора местоположений экзонов (множественные изоформы одних и тех же генов). Для различения случаев очевидно дуплицированных генов и объединения множества отсылок на один и тот же геномный экзон, возникших из за наличия множественных номеров доступа RefSeq на различные изоформы, (ii) добавляли уникальные цифровые суффиксы к 705 номерам доступа RefSeq, которые имели множественные геномные местоположения, и (iii) использовали функцию mergeBed в BEDTool (18) (v2.16.2-zip-87e3926) для объединения перекрывающихся местоположений экзонов в слитые района экзонов. Эти стадии уменьшали начальный набор из 346089 местоположений экзонов RefSeq до 192783 различных геномных районов. Последовательность hg19 для всех слитых районов экзонов загружали с использованием UCSC Table Browser, добавляя 20 п.н. материал для заполнения места на каждом конце, (iv) С использованием custom perl кода, идентифицировали 1657793 случаев form 1 в этой последовательности экзонов. (v) Затем эти последовательности фильтровали на присутствие случаев внецелевых form 2: для каждой мишени form 1 в слитом экзоне, экстрагировали наиболее близкие к 3' 13 п.н. специфические (В) "коровые последовательности и, для каждого кора генерировали четыре 16 п.н. последовательностей 5'-ВВВ ВВВВВ ВВВВВ NGG-3' (N=А, С, G и Т), и производили поиск по всему геному hg19 на точные совпадения с этими 6631172 последовательностями при помощи Bowtie version 0.12.8 (19) с использованием параметров. Каждый сайт экзона-мишени, для которого было более чем одно совпадение, отбрасывали. Следует обратить внимание на то, что поскольку любая специфическая 13 п.н. последовательность, за которой следует последовательность NGG, дает только 15 п.н. специфичность, должно быть в среднем ~5,6 совпадений с удлиненной коровой последовательностью в рандомизированной последовательности ~3Гб (обеих цепях). Таким образом, большинство из этих первоначально идентифицированных последовательностей отбрасывали; однако 189864 последовательности проходили через этот фильтр. Они содержат набор CRISPR-таргетируемых местоположений в экзонах генома человека. Местоположения мишеней 189864 последовательностей находятся в 78028 слитых районах экзонов (~40,5% из всех 192783 × слитных районов экзонов человека) при численности ~2,4 сайта на район-мишеньэкзона. Для оценивания таргетинга на генном уровне, картирования мРНК RefSeq кластеризовали таким образом, что любые два номера доступа RefSeq (включающие в себя дупликаты генов, различаемых в (ii)), которые перекрываются со слитым районом экзона, считают как один кластер генов, 189864 экзон-специфических сайтов CRISPR направлено на 17104 и мишеней из 18872 генных кластеров (~90,6% от всех генных кластеров) при численности ~11,1 на таргетированный генный кластер. (Обратите внимание, что хотя в этих кластерах генов в единый объект «схлестываются» номера доступа RefSeq мРНК, которые представляют собой множественные изоформы одного транскрибируемого гена, они будут также стягивать перекрывающиеся с ними другие гены, а также гены с антисмысловыми транскриптами. На уровне исходных RefSeq-номеров доступа, эти 189864 последовательности направлены на 30563 района-мишени из общих 43726 (~69,9%) картированных RefSeq-номеров доступа (включающих в себя различаемые дупликаты генов) при численности ~6,2 сайтов на таргетированный картированный номер доступа RefSeq.
Согласно одному аспекту, эта база данных может быть усовершенствована внесением поправок с учетом таких факторов как состав оснований и вторичная структура обеих гидРНК и геномных мишеней (20, 21), и эпигенетическое состояние этих мишеней в линиях клеток человека, для которых эта информация является доступной.
Пример VI
Мультиплексный синтез
Последовательности-мишени включали в формат 200 п.н., который является совместимым с мультиплексным синтезом на ДНК-эрреях (23, 24). Согласно одному аспекту этот способ позволяет отыскивать специфические гидРНК или пул последовательностей гидРНК в олигонуклеотидном пуле ДНК-эррея и быстр клонировать их в одинаковый экспрессирующий вектор (фиг. 13А). Конкретно, синтезировали 12k олигонуклеотидный пул из CustomArray Inc. Кроме того, успешно извлекли выбранные из этой библиотеки гидРНК (фиг. 13В) Авторы наблюдали частоту ошибок ~4 мутаций на 1000 п.н. синтезированной ДНК.
Пример VII
РНК-направляемое редактирование генома требует как Cas9, так и направляющей РНК для успешного нацеливания.
С использованием анализа на основе GFP-репортера, описанного на фиг. 1В, тестировали все возможные комбинации донора для репарации ДНК, белка Cas9 и гидРНК на их способность осуществлять успешную HR (гомологичную рекомбинацию) (в 293Т). Как показано на фиг. 4, клетки GAP+ наблюдали только, когда присутствовали все 3 компонента, подтверждая, что эти CRISPR компоненты являются существенными для РНК-направляемого редактирования генома. Данные являются средним +/- стандартная ошибка среднего (SEM) (N=3).
Пример VIII
Анализ опосредованного гидРНК и Cas9 редактирования генома
Процесс CRISPR-опосредованного редактирования генома исследовали с использованием либо (А) описанного ранее анализа с GFP-репортером, результаты которого приведены на фиг. 5А, и (В) глубокого секвенирования локусов-мишенией (в 293Т), результаты которого показаны на фиг 5В). В качестве сравнения, тестировали мутант D10A Cas9, который, как было показано в ранних сообщениях, функционирует в качестве никазы в анализах in vitro. Как показано на фиг. 5, как Cas9, так и Cas9D10A могут успешно влиять на HR (гомологичную рекомбинацию) при почти одинаковой частоте. Однако секвенирование подтверждает, что, хотя Cas9 обнаруживает значимо повышенное NHEJ присоединение в локусах-мишенях, мутант D10A имеет значимо сниженную частоту NHEJ (как и могло ожидаться из его предполагаемой способности только разрывать ДНК). Также, в соответствии с известной биохимией белка Cas9, данные NHEJ подтверждают, что большинство делеций или инсерций пар оснований встречаются вблизи 3'-конца последовательности-мишени: этот пик находится на ~3-4 основания слева от сайта РАМ, с медианной частотой делеций ~9-10 п.н. Данные показаны как среднее +/- стандартная ошибка среднего SEM (N=3).
Пример IX
РНК-направляемое редактирование генома является специфическим к последовательности-мишени.
Подобно анализу с GFP-репортером, описанному на фиг. 1В, были получены 3 стабильные линии 293Т, каждая из которых несет разный конструкт GFP-репортера. Они различаются последовательностью встроенного фрагмента AAVS1 (как указано на фиг. 6). Одна линия содержит фрагмент дикого типа, тогда как две другие линии содержат мутацию в 6 п.н. (показанные красным цветом). Затем каждую из линий таргетировали одним из следующих 4 компонентов: пара GFP-ZFN, которая может нацеливаться на все типы клеток, так как ее последовательность-мишень находится во фрагментах фланкирующих GFP и, следовательно, присутствует у всех клеточных линий; AAVS1 TALEN, который может быть потенциально нацелен только wt-AAVS1-фрагмент, так как из мутаций в других двух линиях TALEN неспособен к связыванию этих сайтов в них; Т1 гидРНК, которая может также потенциально быть нацелена только на фрагмент wt-AAVS1, так как ее сайт-мишень также разрушен в этих двух мутантных линиях; и наконец Т2 гидРНК, которая должна быть способна нацеливаться на все 3 клеточные линии поскольку, в отличие от Т1 гидРНК, ее сайт-мишень является неизмененным среди этих 3 линий. ZFN модифицировал все 3 типа клеток, AAVS1 TALEN и Т1 гидРНК нацеливались только на тип клеток wt-AAVS1, и Т2 гидРНК успешно нацеливается на все 3 типа клеток. Эти результаты вместе подтверждают, что опосредуемое гид-РНК редактирование, является специфичным в отношении последовательности-мишени. Данные показаны в виде среднего +/- стандартная ошибка среднего (SEM) (N=3).
Пример X
Гид-РНК, нацеленная на последовательность GFP, пригодна для надежного редактирования.
В дополнение к 2 гидРНК, нацеленным на вставку AAVS1, тестировали две дополнительных гидРНК, нацеленные на фланкирующие GFP последовательности репортера, описанного на фиг. 1В (в 293Т) Как показано на фиг. 7, эти гидРНК были также воздействовать на частоту HR в этом сконструированном локусе. Данные показаны в виде среднего +/- стандартной ошибки среднего (SEM) (N=3).
Пример XI
РНК-направляемое редактирование генома является специфическим в отношении последовательности-мишени и демонстрирует сходные с ZFNs или TALEN эффективности нацеливания
Сходно с анализом с репортером GFP, описанным на фиг. 1В, создали две стабильные клеточные линии 293Т, каждая из которых несет отличающийся конструкт репортера GFP. Они различаются по последовательности фрагмента-вставки (как указано на фиг. 8). Одна линия несет фрагмент в 58 п.н. из гена DNMT3a, тогда как другая линия несет гомологичный ему фрагмент в 58 п.н. из гена DNMT3b. Эти различия последовательности выделены красным цветом. Затем каждую из этих линий таргетировали одним из следующих шести реагентов: GFP-ZFN-пары, которая может нацеливаться на все типы клеток, так как ее последовательность-мишень находится во фланкирующих GFP фрагментах и, следовательно, присутствует у всех линий клеток; пары TALEN, которая потенциально нацелена либо на DNMT3a-, либо на DNMT3b-фрагменты; пары гидРНК, которая может быть потенциально нацелена только на DNMT3а-фрагмент; и, наконец, гидРНК, которая должна потенциально нацеливаться только на DNМТ3b-фрагмент. Как показано на фиг. 8, эти ZFN модифицировали все 3 типа клеток, a TALEN и гидРНК только соответствующие им мишени. Кроме того, эффективности нацеливания оказались сравнимыми у 6 нацеливающих реагентов. Эти результаты вместе подтверждают, что РНК-направляемое редактирование является специфическим в отношении последовательности-мишени и демонстрирует сходные с ZFN или TALEN эффективности нацеливания. Данные показаны в виде среднего +/- стандартная ошибка среднего (SEM) (N=3).
Пример XII
РНК-направляемое соединение негомологичных концов (NHEJ) в клетках iPS человека.
В клетки iPS человека (PGP1) посредством нуклеофекции вводили конструкты, указанные на левой панели фиг. 9. Через 4 дня после нуклеофекции частоту NHEJ измеряли путем оценки частоты делеций и инсерций при разрывах двойной цепи (DSB) глубоким секвенированием. Панель 1: Частота делеции, детектируемая в районе-мишени. Красные штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т1; зеленые штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т2. Частоту случаев делеции в каждом положении нуклеотида откладывали на графике в виде черных линий и рассчитывали частоту делеции как процент прочтений, несущих делецию. Панель 2: Частота инсерции детектируемая в районе-мишени. Красные штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т1; зеленые штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т2. Частоту случаев инсерции в геномном местоположении, где детектировалось первое встроенное сочленение откладывали на графике в виде черных линий и частоту инсерции рассчитывали как процент прочтений несущих инсерцию. Панель 3: Распределение по размерам делеций. Частоты делений различных размеров среди всей популяции NHEJ строили в виде графиков. Панель 4: Распределение размеров инсерций. Частоты различных размеров инсерций всей популяции NHEJ строили в виде графиков. Таргетинг iPS обеими гидРНК является эффективным (2-4%), последовательность-специфическим (как показано смещением в положении распределений делеции NHEJ), и подтверждение результатов фиг. 4, анализ на основе NGS также показывает, что как белок Cas9, так и гидРНК являются существенными для событий NHEJ в локусе-мишени.
Пример XIII
РНК-направляемое NHEJ в клетках K562.
В клетки K562 посредством нуклеофекции вводили конструкты, указанными на левой панели фиг. 10. Через 4 дня после нуклеофекции, частоту NHEJ измеряли оцениванием частоты геномных делеций и инсерций при двуцепочечном разрыве глубоким секвенированием. Панель 1: Частота делеции, детектируемая в районе-мишени. Красные штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени Т1 РНК; зеленые штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени Т2 РНК. Частоту случаев делеции в каждом положении нуклеотида откладывали на графике в виде в черных линий и рассчитывали частоту делеции как процент прочтений, несущих делецию. Панель 2: Частота инсерции детектируемая в районе-мишени. Красные штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т1; зеленые штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т2. Частоту случаев инсерции в геномном местоположении, где обнаруживалось первое встроенное сочленение откладывали на графике в виде в черных линиях и частоту инсерции рассчитывали как процент прочтений, несущих инсерцию. Панель 3: Распределение по размерам делеций. Частоту делеций различных размеров среди всей популяции NHEJ строили в виде графиков. Панель 4: Распределение по размерам инсерций. Частоту инсерций различных размеров по всей популяции строили в виде графиков. Таргетинг на K562 обеими гидРНК является эффективным (13-38%) и последовательность-специфическими (как показано смещением в положении распределений делеции NHEJ). Важно, о чем свидетельствуют пики на гистограмме наблюдаемых частот размеров делений, одновременное введение как Т1, так и Т2 гидРНК приводило к высокой эффективности делении промежуточного фрагмента 19 п.н., демонстрируя, что мультиплексное редактирование геномных локусов также является осуществимым с использованием этого подхода.
Пример XIV
РНК-направляемое NHEJ в клетках 293Т.
Клетки 293Т трансфицировали конструктами, показанными в левой панели фиг. 11. Через 4 дня после нуклеофекции, частота NHEJ измеряли оценивая частоту геномных делеций и инсерций при DSB глубоким секвенированием. Панель 1: Частота делеции, детектируемая в районе-мишени. Красные штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени Т1 РНК; зеленые штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени Т2 РНК. Частоту случаев делеции в каждом положении нуклеотида откладывали на графике в виде черных линий и рассчитывали частоту делеции как процент прочтений, несущих делеции. Панель 2: Частота инсерций, детектируемая в районе-мишени. Красные штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т1; зеленые штрихпунктирные линии: граница сайта-мишени РНК Т2. Частоту случаев инсерций в геномном местоположении, где обнаруживалось первое встроенное сочленение откладывали на графике в виде в черных линий и частоту инсерций рассчитывали как процент прочтений, несущих инсерцию. Панель 3: Распределение размеров делеций. Частоты делеций различных размеров среди всей популяции NHEJ строили в виде графиков. Панель 4: Распределение размеров инсерций. Частоты различных размеров инсерций всей популяции строили в виде графиков. Таргетинг 293Т обеими гидРНК является эффективным (10-24%) и последовательность-специфическим (как показано смещением в положении распределений NHEJ делеций).
Пример XV
HR в эндогенном локусе AAVS1 с использованием либо донора дцДНК либо короткого олигонуклеотидного донора.
Как показано на фиг. 12А, ПЦР-скрининг (со ссылкой на фиг. 2С) подтвердил, что 21/24 случайно выбранные клоны 293Τ были успешно таргетированы. Как показано на фиг. 12В, сходный ПЦР-скрининг подтвердил, что 3/7 случайно выбранных клонов PGP1-iPS, были также успешно таргетированными. Как показано на фиг. 12С, короткие 90-мерные олигонуклеотиды могли бы осуществлять эффективное нацеливание в эндогенном локусе AAVS1 (показанное здесь для клеток K562).
Пример XVI
Методология для мультиплексного синтеза, извлечения и клонирования в U6-экспрессирующем векторе направляющих РНК, нацеленных на гены в геноме человека
Создавали источник приблизительно 190k биоинформатически вычисленных уникальных сайтов гидРНК, таргетирующих ~40,5% всех экзонов генов в геноме человека. Как показано на фиг. 13А, эти сайты-мишени гидРНК были включены в формат 200 п.н., который является совместимым с мультиплексным синтезом на ДНК-эрреях. Конкретно, эта конструкция позволяет выполнять (i) нацеленный поиск и выделение определенной мишени или пула мишеней гидРНК из олигонуклеотидного пула ДНК-эррея (посредством 3 последовательных раундов гнездовой ПЦР, как указано на этой фигуре схематически), и (ii) высокую частоту клонирование в используемый экспрессирующий вектор, который после линеаризации с использованием AflII служит в качестве реципиента для опосредуемого сборкой Гибсона включения вставкой фрагмента гидРНК. Как показано на фиг. 13В, этот способ был использован для выполнения нацеленного поиска и выделения 10 уникальных гидРНКs из 12к олигонуклеотидного пула, синтезированного CustomArray Inc.
Пример XVII
CRISPR-опосредованная РНК-направляемая активация транскрипции.
Система CRISPR-Cas является адаптивной иммунозащитной системой в бактериях и функционирует для 'расщепления' вторгающихся нуклеиновых кислот. Согласно одному аспекту, эта система CRISPR-CAS сконструирована для функционирования в клетках человека и для 'расщепления' геномной ДНК. Это достигается короткой гидРНК, направляющей белок Cas9 (который имеет нуклеазную функцию) на последовательность-мишень, комплементарную спейсеру в этой гидРНК. Способность 'расщеплять' ДНК позволяет использовать это во множестве приложений, относящихся к редактированию генома, а также направленной регуляции генома. Для этого, белок Cas9 изменяли чтобы сделать его нуклеаза-нуль введением мутаций, которые, как предсказывалось, аннулируют связывание с Mg2+ (который, как известно, является важным для функций доменов RuvC-подобный и HNH-подобный): Конкретно, вводили комбинации мутаций D10A, D839A, Н840А и N863A. Затем генерированный таким образом нуклеаза-нуль- белок (как подтверждалось его способностью не разрезать ДНК с использованием анализа секвенирования) и здесь далее называемый Cas9R-H-, связывали с доменом активирования транскрипции, здесь это Р64, позволяющий системе CRISPR-cas функционировать в качестве РНК-направляемого фактора транскрипции (см. фиг. 14). Это слияние Cas9R-H-+VP64 делает возможной РНК-направляемую транскрипционную активацию двух показанных репортеров. Конкретно, как FACS-анализ, так и иммунофлуоресцентный анализ демонстрирует, что этот белок позволяет гидРНК- специфическое нацеливание на соответствующие репортеры, и, кроме того, в результате происходит активация транскрипции, что оценивалось анализом экспрессии флуоресцентного белка dTomato, было при уровнях, сходных с уровнями, индуцируемыми стандартным слитым белком TALE-VP64.
Пример XVIII
Гибкость последовательностей гидРНК и ее применения.
Гибкость последовательности каркаса гидРНК для инсерций в целях конструирования последовательностей определяли систематическим анализом для ряда случайных инсерций последовательностей на 5'-, середине и 3'-концах гидРНК: конкретно, ставки 1 п.н., 5 п.н., 10 п.н., 20 п.н. и 40 п.н. выполняли в последовательности гидРНК на 5'-, середине и 3'-концах гидРНК (точные положения инсерций изображены 'красным цветом' на фиг. 15. Затем эту гидРНК тестируют на функциональность по ее способности индуцировать HR (гомологичную рекомбинацию) в анализе с репортером GFP (как описано здесь). Очевидно, что гидРНК являются гибкими относительно встраивания последовательностей на 5'- и 3'-концах (как измерено по поддерживаемой индуцирующей HR активности). Таким образом, аспекты данного раскрытия изобретения направлены прикрепление небольших последовательностей, соответствующих РНК-аптамерам, которые могут запускать появление активности гидРНК, или опосредовать визуализацию гидРНК. Дополнительно, аспекты данного изобретения направлены на прикрепление оцДНК-доноров к гидРНК посредством гибридизации, делая таким образом возможными разрезание и немедленную физическую локализацию матрицы репарации, которая может стимулировать частоту гомологичной рекомбинации в сравнении с допускающим ошибки негомологичным соединением концов.
Следующие ссылки, идентифицированные в разделе Примеров цифрами, включены здесь посредством ссылок в их полном объеме для всех целей.
Ссылки
1. К.S. Makarova et al., Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology 9, 467 (Jun, 2011).
2. M. Jinek et al., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816 (Aug 17, 2012).
3. P. Horvath, R. Barrangou, CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327, 167 (Jan 8, 2010).
4. H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008).
5. J.R. van der Ploeg, Analysis of CRISPR in Streptococcus mutans suggests frequent occurrence of acquired immunity against infection by M102-like bacteriophages. Microbiology 155, 1966 (Jun, 2009).
6. M. Rho, Y.W. Wu, H. Tang, T.G. Doak, Y. Ye, Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes. PLoS genetics 8, el002441 (2012).
7. D.T. Pride et al, Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time. Genome research 21, 126 (Jan, 2011).
8. G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys, Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579 (Sep 25, 2012).
9. R. Sapranauskas et al., The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275 (Nov, 2011).
10. J.E. Garneau et al., The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature 468, 67 (Nov 4, 2010).
11. K.M. Esvelt, J.C. Carlson, D.R. Liu, A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature 472, 499 (Apr 28, 2011).
12. R. Barrangou, P. Horvath, CRISPR: new horizons in phage resistance and strain identification. Annual review of food science and technology 3, 143 (2012).
13. B. Wiedenheft, S.H. Sternberg, J.A. Doudna, RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331 (Feb 16, 2012).
14. N.E. Sanjana et al., A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols 7, 171 (Jan, 2012).
15. W.J. Kent et al., The human genome browser at UCSC. Genome Res 12, 996 (Jun, 2002).
16. T.R. Dreszer et al., The UCSC Genome Browser database: extensions and updates 2011. Nucleic Acids Res 40, D918 (Jan, 2012).
17. D. Karolchik et al., The UCSC Table Browser data retrieval tool. Nucleic Acids Res 32, D493 (Jan 1, 2004).
18. A.R. Quinlan, I.M. Hall, BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics 26, 841 (Mar 15, 2010).
19. B. Langmead, C. Trapnell, M. Pop, S.L. Salzberg, Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10, R25 (2009).
20. R. Lorenz et al., ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for molecular biology: AMB6, 26 (2011).
21. D.H. Mathews, J. Sabina, M. Zuker, D.H. Turner, Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. Journal of molecular biology 288, 911 (May 21, 1999).
22. R.E. Thurman et al., The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature 489, 75 (Sep 6, 2012).
23. S. Kosuri et al., Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nature biotechnology 28, 1295 (Dec, 2010).
24. Q. Xu, M.R. Schlabach, G.J. Hannon, S.J. Elledge, Design of 240,000 orthogonal 25mer DNA barcode probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 2289 (Feb 17, 2009).

Claims (33)

1. Способ генетического изменения эукариотической клетки, предусматривающий
обеспечение в эукариотической клетке последовательности направляющей РНК, комплементарной последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, причем последовательность направляющей РНК связывается с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты, и
обеспечение в эукариотической клетке белка Cas9, модифицированного белка Cas9 или гомолога белка Cas9, который взаимодействует с последовательностью направляющей РНК,
где клетка не является клеткой зародышевой линии человека.
2. Способ по п. 1, где белком является фермент Cas9 и последовательность-мишень нуклеиновой кислоты расщепляется.
3. Способ по п. 1, где эукариотическая клетка является клеткой дрожжей, клеткой растения или клеткой млекопитающего.
4. Способ по п. 1, где последовательность направляющей РНК содержит между приблизительно 100 и приблизительно 250 нуклеотидов.
5. Способ по п. 1, где эукариотическая клетка является клеткой человека.
6. Способ по п.1, в котором обеспечивают в эукариотической клетке две или более последовательностей направляющей РНК, комплементарных разным последовательностям-мишеням нуклеиновой кислоты, причем две или более последовательности направляющей РНК связываются с разными последовательностями-мишенями нуклеиновой кислоты,
и белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 взаимодействует с двумя или более последовательностями направляющей РНК.
7. Способ по п.1, в котором последовательность направляющей РНК обеспечивают в клетке, вводя в клетку первую нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность направляющей РНК,
где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 обеспечивают в клетке, вводя в клетку вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9, и
при этом клетка продуцирует направляющую РНК и белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9.
8. Способ по п. 7, в котором первую нуклеиновую кислоту вводят в клетку с использованием способа вирусной доставки.
9. Способ по п.7, в котором первую и/или вторую нуклеиновую кислоту вводят в клетку путем трансфекции.
10. Способ по п.7, в котором первую нуклеиновую кислоту вводят в клетку с использованием аденоассоциированного вируса.
11. Способ по п.1, где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой фермент Cas9, никазу Cas9 или нуклеазу-нуль Cas9.
12. Способ по п.1, в котором направляющая РНК представляет собой слитую crRNA-tracrRNA.
13. Способ по п.1, в котором белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 кодируется нуклеиновой кислотой, оптимизированной кодонами человека.
14. Способ по п.1, в котором белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 включает в себя сигнал ядерной локализации.
15. Способ по п.1, в котором в клетке обеспечиваются последовательности направляющей РНК, комплементарные последовательностям-мишенями нуклеиновой кислоты в локусе, причем последовательности направляющей РНК связываются с последовательностями-мишенями нуклеиновой кислоты, а белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой фермент Cas9, который расщепляет последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и находящаяся между последовательность нуклеиновой кислоты удаляется из локуса.
16. Способ по п.1, где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой фермент Cas9, который расщепляет последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, а донорная последовательность нуклеиновой кислоты, обеспечиваемая в эукариотической клетке, вводится в последовательность-мишень нуклеиновой кислоты.
17. Способ по п.16, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты гибридизуется с последовательностью направляющей РНК.
18. Способ по п.1, где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой белок нуклеазу-нуль Cas9 и взаимодействует с последовательностью направляющей РНК и связывается с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты,
где белок Cas9 имеет присоединенный к нему нуклеазный домен FokI,
где последовательность-мишень нуклеиновой кислоты расщепляется при димеризации домена нуклеазы FokI комплекса колокализации примыкающей последовательности направляющей РНК и белка Cas9.
19. Способ по п.1, где направляющая РНК включает в себя направляющую последовательность, комплементарную последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и каркасную последовательность, соединенную с направляющей последовательностью, и каркасная последовательность имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 45).
20. Способ по п.1, где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой белок нуклеазу-нуль Cas9 и включает в себя домен активации или подавления транскрипции и где экспрессия гена-мишени модулируется.
21. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой нуклеазу-нуль Cas9 и включает собой флуоресцентный белок, и в котором флуоресцентный белок визуализируют.
22. Способ по п.1, где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой белок нуклеазу-нуль Cas9 и включает белок, связанный с органическим флуорофором, нуклеиновую кислоту, связанную с органическим флуорофором, квантовую точку, молекулярный маяк, эхо-зонд или поливалентный лигандсвязывающий белковый домен.
23. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетка является стволовой клеткой.
24. Способ по п.1, где белок Cas9, модифицированный белок Cas9 или гомолог белка Cas9 представляет собой фермент Cas9, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, оптимизированной кодонами человека, содержащей SEQ ID NO: 22.
25. Способ по п.1, где клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку.
RU2015129018A 2012-12-17 2013-12-16 Рнк-направляемая инженерия генома человека RU2699523C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261738355P 2012-12-17 2012-12-17
US61/738,355 2012-12-17
US201361779169P 2013-03-13 2013-03-13
US61/779,169 2013-03-13
PCT/US2013/075317 WO2014099744A1 (en) 2012-12-17 2013-12-16 Rna-guided human genome engineering

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019127316A Division RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2013-12-16 Рнк-направляемая инженерия генома человека

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015129018A RU2015129018A (ru) 2017-01-23
RU2699523C2 true RU2699523C2 (ru) 2019-09-05

Family

ID=50979072

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019127316A RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2013-12-16 Рнк-направляемая инженерия генома человека
RU2015129018A RU2699523C2 (ru) 2012-12-17 2013-12-16 Рнк-направляемая инженерия генома человека

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019127316A RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2013-12-16 Рнк-направляемая инженерия генома человека

Country Status (17)

Country Link
US (17) US9970024B2 (ru)
EP (3) EP3553174A1 (ru)
JP (4) JP6700788B2 (ru)
KR (2) KR20220139433A (ru)
CN (1) CN105121641A (ru)
AU (5) AU2013363194B2 (ru)
CA (2) CA3081054A1 (ru)
DK (1) DK2931891T3 (ru)
ES (1) ES2741951T3 (ru)
HK (1) HK1212376A1 (ru)
IL (2) IL308158A (ru)
MX (3) MX2015007743A (ru)
MY (1) MY170059A (ru)
RU (2) RU2766685C2 (ru)
SG (3) SG10201912991WA (ru)
WO (2) WO2014099750A2 (ru)
ZA (1) ZA201504739B (ru)

Families Citing this family (350)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
CN103502448B (zh) 2010-11-12 2017-03-29 Gen9股份有限公司 核酸合成的方法和设备
US10457935B2 (en) 2010-11-12 2019-10-29 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
WO2016100976A2 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Apprise Bio, Inc. Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells
US11560585B2 (en) 2011-01-31 2023-01-24 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
US10144950B2 (en) 2011-01-31 2018-12-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
LT2841601T (lt) 2012-04-24 2019-07-10 Gen9, Inc. Nukleorūgščių rūšiavimo būdai ir multipleksinis preparatyvinis in vitro klonavimas
WO2013163394A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
DK3401400T3 (da) 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
CA2877290A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Daniel F. Voytas Gene targeting in plants using dna viruses
EP3483311A1 (en) 2012-06-25 2019-05-15 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
CN110643600A (zh) 2012-10-23 2020-01-03 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的系统及其用途
JP6620018B2 (ja) 2012-12-06 2019-12-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｃｒｉｓｐｒに基づくゲノム修飾および制御
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
CN105658796B (zh) 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
PT2896697E (pt) 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP3553174A1 (en) 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
CN113005148A (zh) 2013-01-16 2021-06-22 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
CN109913495B (zh) 2013-02-20 2022-11-25 瑞泽恩制药公司 大鼠的遗传修饰
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CA2907198C (en) * 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CA2906747A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
CN105518146B (zh) 2013-04-04 2022-07-15 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
CN111500630A (zh) 2013-04-16 2020-08-07 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US20140356956A1 (en) * 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2021-07-28 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
AU2014281028B2 (en) 2013-06-17 2020-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Delivery and use of the CRISPR-Cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011029B1 (en) 2013-06-17 2019-12-11 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
JP6702858B2 (ja) 2013-06-17 2020-06-03 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ウイルス成分を使用して障害および疾患をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および組成物の送達、使用および治療上の適用
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US20150044772A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
WO2015026887A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company A soybean u6 polymerase iii promoter and methods of use
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
AU2014312123A1 (en) 2013-08-29 2016-03-17 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions for RNA-guided treatment of HIV infection
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
ES2681622T3 (es) 2013-09-18 2018-09-14 Kymab Limited Métodos, células y organismos
ES2881473T3 (es) * 2013-10-17 2021-11-29 Sangamo Therapeutics Inc Métodos de suministro y composiciones para la modificación por ingeniería genética del genoma mediada por nucleasas
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9546384B2 (en) 2013-12-11 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome
RS58159B1 (sr) 2013-12-11 2019-03-29 Regeneron Pharma Postupci i kompozicije za ciljanu modifikaciju genoma
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CN105899657A (zh) 2013-12-12 2016-08-24 布罗德研究所有限公司 用于改变基因产物表达的crispr-cas系统和方法、结构信息以及诱导型模块化cas酶
SG10201804973TA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
CN111206032A (zh) 2013-12-12 2020-05-29 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
MX2016010285A (es) 2014-02-11 2017-01-11 Univ Colorado Regents Ingenieria genetica multiplexada habilitada por crispr.
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
US11242525B2 (en) 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
BR112016028023A2 (pt) 2014-05-30 2017-08-22 Univ Leland Stanford Junior Composições e métodos de administração de tratamentos para infecções virais latentes
CN113215196A (zh) 2014-06-06 2021-08-06 瑞泽恩制药公司 用于修饰所靶向基因座的方法和组合物
SI3354732T1 (sl) 2014-06-23 2020-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Z nukleazo posredovan DNA sklop
HUE041584T2 (hu) 2014-06-26 2019-05-28 Regeneron Pharma Célzott genetikai módosítások és alkalmazási módszerek és készítmények
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
EP3169776A4 (en) * 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CA2958292A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
NZ728437A (en) * 2014-08-27 2018-02-23 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
WO2016036754A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
WO2016040594A1 (en) * 2014-09-10 2016-03-17 The Regents Of The University Of California Reconstruction of ancestral cells by enzymatic recording
CN108064129A (zh) 2014-09-12 2018-05-22 纳幕尔杜邦公司 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
EP3204513A2 (en) * 2014-10-09 2017-08-16 Life Technologies Corporation Crispr oligonucleotides and gene editing
WO2016061374A1 (en) 2014-10-15 2016-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells
WO2016065364A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for enhancing homologous recombination
CA2965509C (en) 2014-10-24 2023-03-14 Avectas Limited Delivery across cell plasma membranes
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
PT3221457T (pt) 2014-11-21 2019-06-27 Regeneron Pharma Métodos e composições para modificação genética visada através da utilização de arn guia emparelhados
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
CN105695485B (zh) * 2014-11-27 2020-02-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用
JP7068821B2 (ja) 2014-12-03 2022-05-17 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するガイドｒｎａ
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
EP3234111A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
RU2707137C2 (ru) 2014-12-19 2019-11-22 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для нацеленной генетической модификации посредством одноэтапного множественного нацеливания
US11208638B2 (en) 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
WO2016123243A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
AU2016211118B2 (en) * 2015-01-29 2022-03-31 Centre National De La Recherche Scientifique Method for inducing targeted meiotic recombinations
US11046952B2 (en) * 2015-03-16 2021-06-29 The Broad Institute, Inc. Encoding of DNA vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
CN107567499A (zh) 2015-03-27 2018-01-09 纳幕尔杜邦公司 大豆u6核小rna基因启动子及其在植物小rna基因的组成型表达中的用途
AU2016246450B2 (en) 2015-04-06 2022-03-17 Agilent Technologies, Inc. Chemically modified guide RNAs for CRISPR/Cas-mediated gene regulation
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
CN107614680A (zh) * 2015-05-14 2018-01-19 南加利福尼亚大学 利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑
JP2018516563A (ja) 2015-05-29 2018-06-28 ノース カロライナ ステート ユニバーシティＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ核酸を用いて、細菌、古細菌、藻類、および、酵母をスクリーニングする方法
GB2543873A (en) 2015-05-29 2017-05-03 Agenovir Corp Compositions and methods for cell targeted HPV treatment
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
EP3303634B1 (en) 2015-06-03 2023-08-30 The Regents of The University of California Cas9 variants and methods of use thereof
EP3302525A2 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Novartis AG Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
AU2016279062A1 (en) 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
JP7044373B2 (ja) 2015-07-15 2022-03-30 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュージャージー ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途
EP4339287A3 (en) 2015-07-31 2024-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
CA2995036A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tunable endogenous protein degradation
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN108350449B (zh) 2015-08-28 2022-05-31 通用医疗公司 工程化的CRISPR-Cas9核酸酶
US10526590B2 (en) 2015-08-31 2020-01-07 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for CRISPR/Cas-based genome editing by homologous recombination
US20180251789A1 (en) * 2015-09-04 2018-09-06 Massachusetts Institute Of Technology Multilayer genetic safety kill circuits based on single cas9 protein and multiple engineered grna in mammalian cells
US11261439B2 (en) 2015-09-18 2022-03-01 President And Fellows Of Harvard College Methods of making guide RNA
EP3352795B1 (en) * 2015-09-21 2020-08-12 The Regents of The University of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
AU2016326711B2 (en) 2015-09-24 2022-11-03 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing
WO2017058751A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
JP7059468B2 (ja) * 2015-10-08 2022-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 多重ゲノム編集
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
US11111508B2 (en) 2015-10-30 2021-09-07 Brandeis University Modified CAS9 compositions and methods of use
GB2559526B (en) 2015-11-03 2021-02-17 Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11718858B2 (en) 2015-11-11 2023-08-08 Regents Of The University Of Minnesota Biocontainment/biocontrol system and methods
US11905521B2 (en) 2015-11-17 2024-02-20 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for targeted gene manipulation
EP3377086B1 (en) 2015-11-19 2024-05-01 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
JP7449646B2 (ja) 2015-12-30 2024-03-14 アヴェクタス リミテッド 細胞および組織への遺伝子編集タンパク質および組成物の、ベクターなしでの送達
KR20180095719A (ko) 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법
US9856497B2 (en) 2016-01-11 2018-01-02 The Board Of Trustee Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of regulating gene expression
CN105624187A (zh) * 2016-02-17 2016-06-01 天津大学 酿酒酵母基因组定点突变的方法
US20190249172A1 (en) 2016-02-18 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
US10538750B2 (en) 2016-02-29 2020-01-21 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by CRISPR proteins
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物
EP3433362B1 (en) 2016-03-23 2021-05-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for enhancing the efficiency of gene editing
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
KR102670601B1 (ko) 2016-04-19 2024-05-29 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규한 crispr 효소 및 시스템
US11286478B2 (en) 2016-04-19 2022-03-29 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
EP3450570B1 (en) * 2016-04-28 2021-03-10 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Method for evaluating, in vivo, activity of rna-guided nuclease in high-throughput manner
RU2021106817A (ru) 2016-05-20 2021-04-06 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк
EP3604527B1 (en) 2016-06-02 2021-05-12 Sigma-Aldrich Co., LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
CN109963564B (zh) * 2016-07-27 2022-08-12 利兰斯坦福初级大学董事会 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物
CN109563505A (zh) * 2016-07-28 2019-04-02 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于真核细胞的组装系统
CN109803530A (zh) 2016-07-29 2019-05-24 瑞泽恩制药公司 包含引起c-截短的原纤维蛋白-1表达的突变的小鼠
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
WO2018049009A2 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
AU2017335890B2 (en) 2016-09-30 2024-05-09 The Regents Of The University Of California RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
KR20240064734A (ko) 2016-10-14 2024-05-13 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
EP3529359B1 (en) 2016-10-18 2023-12-13 Regents of the University of Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes for use in therapy
EP3541408A4 (en) 2016-11-15 2020-06-24 The Schepens Eye Research Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ABERRANT ANGIOGENESIS
AU2017378427A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery
EP4095228A1 (en) 2016-12-22 2022-11-30 Avectas Limited System for vector-free intracellular delivery by reversible permeabilisation
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3565608A4 (en) 2017-01-05 2020-12-16 Rutgers, The State University of New Jersey TARGETED GENEDITATION PLATFORM INDEPENDENT OF DNA DOUBLE STRAND BREAKAGE AND USES THEREOF
RU2021133626A (ru) 2017-01-23 2022-01-31 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты hsd17b13 и их применения
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP4119552A1 (en) 2017-02-08 2023-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Regulating chimeric antigen receptors
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US20210115407A1 (en) 2017-04-12 2021-04-22 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
WO2018195545A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
WO2018195486A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
WO2018209014A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Regents Of The University Of Minnesota Programmable transcription factors and methods
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN110997728A (zh) 2017-05-25 2020-04-10 通用医疗公司 二分型碱基编辑器(bbe)结构和ii-型-cas9锌指编辑
EP3635112A2 (en) 2017-06-06 2020-04-15 Zymergen, Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
US20200370058A1 (en) 2017-06-06 2020-11-26 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
US20200149041A1 (en) * 2017-06-07 2020-05-14 The University Of Tokyo Gene Therapy Drug for Granular Corneal Degeneration
WO2018227114A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
AU2018283405A1 (en) 2017-06-15 2020-01-16 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral DNA insertions
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US20190032156A1 (en) 2017-07-31 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
SG11201912235PA (en) 2017-07-31 2020-01-30 Regeneron Pharma Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
MX2020001177A (es) 2017-07-31 2020-09-25 Regeneron Pharma Animales no humanos reporteros de crispr y usos de los mismos.
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
IL311278A (en) 2017-09-29 2024-05-01 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, preparations, and methods for genome editing
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
PT3688162T (pt) 2017-09-29 2024-04-23 Intellia Therapeutics Inc Formulações
JP2021500864A (ja) 2017-09-29 2021-01-14 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔｔｒ遺伝子編集およびａｔｔｒアミロイドーシスの治療用の組成物および方法
JP2020537541A (ja) 2017-09-29 2020-12-24 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 脂質ナノ粒子を用いるインビトロでのｍｒｎａの送達方法
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
KR102503130B1 (ko) 2017-10-27 2023-02-24 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 내인성 t 세포 수용체의 표적화된 대체
AU2018369784B2 (en) 2017-11-14 2023-06-01 Massachusetts Eye And Ear Infirmary RUNX1 inhibition for treatment of proliferative vitreoretinopathy and conditions associated with epithelial to mesenchymal transition
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
US20190233816A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
CA3089331A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
BR112020021229A2 (pt) 2018-04-19 2021-02-02 The Regents Of The University Of California composições e métodos para edição de genes
EP3794130A4 (en) 2018-05-16 2022-07-27 Synthego Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DESIGN AND USE OF GUIDE RNA
US20210261901A1 (en) 2018-06-01 2021-08-26 Avectas Limited Cell engineering platform
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
SG11202102068TA (en) 2018-07-31 2021-03-30 Broad Inst Inc Novel crispr enzymes and systems
WO2020028327A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 ( hao1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (ph1)
WO2020037490A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Institute Of Hematology And Blood Diseases Hospital, Cams & Pumc Method of genome editing in mammalian stem cell
KR20210086621A (ko) 2018-09-28 2021-07-08 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 락테이트 데히드로게나제 (ldha) 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University RECOMBINANT TYPE I CRISPR-CAS SYSTEM
BR112021007025A2 (pt) 2018-10-16 2021-08-03 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para imunoterapia
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
WO2020092704A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Zymergen Inc. Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
WO2020089448A1 (en) * 2018-11-01 2020-05-07 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
EP3894550A4 (en) 2018-12-14 2023-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. NEW CRISPR-CAS SYSTEMS FOR GENOME EDITING
AU2019403015B2 (en) 2018-12-20 2024-01-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
US20220106584A1 (en) 2019-01-14 2022-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for generating and selecting a variant of a binding protein with increased binding affinity and/or specificity
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
US20220145330A1 (en) 2019-02-10 2022-05-12 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Modified mitochondrion and methods of use thereof
EP4219700A1 (en) 2019-03-07 2023-08-02 The Regents of the University of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
KR20210136997A (ko) 2019-03-08 2021-11-17 지머젠 인코포레이티드 미생물에서 반복적 게놈 편집
ES2970541T3 (es) 2019-03-18 2024-05-29 Regeneron Pharma Plataforma de cribado CRISPR/CAS para identificar modificadores genéticos de la siembra o agregación de tau
AU2020241856B2 (en) 2019-03-18 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR/Cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
CA3134544A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
EP3947670A2 (en) 2019-03-28 2022-02-09 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for polypeptide expression
MX2021011565A (es) 2019-03-28 2021-11-12 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos que comprenden un arn guía de ttr y un polinucleótido que codifica un agente de fijacion a adn guiado por arn.
KR20210148154A (ko) 2019-04-03 2021-12-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세이프 하버 좌위 내로의 항체 코딩 서열의 삽입을 위한 방법 및 조성물
WO2020206134A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
CA3133360A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289581A1 (en) 2019-06-07 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
JP2022536606A (ja) 2019-06-14 2022-08-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タウオパチーのモデル
AU2020337919A1 (en) 2019-08-27 2022-03-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive DNA
CN114616002A (zh) 2019-09-13 2022-06-10 瑞泽恩制药公司 使用由脂质纳米颗粒递送的crispr/cas系统在动物中进行的转录调控
US20230025039A1 (en) 2019-09-20 2023-01-26 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr enzymes and systems
IL292605A (en) 2019-11-08 2022-07-01 Regeneron Pharma CRISPR and AAV strategies for the treatment of x-linked childhood retinoschisis
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
EP4064830A1 (en) 2019-11-29 2022-10-05 Basf Se Increasing resistance against fungal infections in plants
KR20220116504A (ko) 2019-12-19 2022-08-23 바스프 에스이 정밀 화학물의 제조에서 공시 수율, 탄소-전환-효율 및 탄소 기질 적응성의 증가
CN115135762A (zh) 2019-12-20 2022-09-30 巴斯夫欧洲公司 降低萜烯的毒性和增加微生物的生产潜力
US11060141B1 (en) 2019-12-23 2021-07-13 Stilla Technologies Multiplex drop-off digital polymerase chain reaction methods
EP4100528A1 (en) * 2020-02-07 2022-12-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for kallikrein (klkb1) gene editing
EP4114946A1 (en) 2020-03-04 2023-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for sensitization of tumor cells to immune therapy
WO2021191678A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Avectas Limited Engineering of dendritic cells for generation of vaccines against sars-cov-2
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US20210319851A1 (en) 2020-04-03 2021-10-14 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
EP4133069A2 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Astrazeneca AB Compositions and methods for improved site-specific modification
AU2021263745A1 (en) 2020-04-28 2022-12-08 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of in vitro cell delivery
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2022008935A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
TW202218686A (zh) 2020-09-09 2022-05-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之組合物及方法
EP4222167A1 (en) 2020-09-30 2023-08-09 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
AU2021364781A1 (en) 2020-10-21 2023-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for site-specific genetic engineering using programmable addition via site-specific targeting elements (paste)
EP4240854A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
TW202235617A (zh) 2020-12-11 2022-09-16 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中ii類mhc之組合物及方法
CR20230320A (es) 2020-12-23 2023-10-23 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir los hla-a en una célula
MX2023007465A (es) 2020-12-23 2023-08-18 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y metodos para modificar geneticamente ciita en una celula.
WO2022148955A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
JP2024505084A (ja) 2021-02-01 2024-02-02 アヴェクタス リミテッド 送達プラットフォーム
JP2024505678A (ja) 2021-02-08 2024-02-07 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のためのリンパ球活性化遺伝子３（ｌａｇ３）組成物及び方法
WO2022170193A2 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 (tim3) compositions and methods for immunotherapy
WO2022170172A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Natural killer cell receptor 2b4 compositions and methods for immunotherapy
WO2022182959A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
EP4298222A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9
US20220331361A1 (en) * 2021-04-07 2022-10-20 Century Therapeutics, Inc. Gene transfer vectors and methods of engineering cells
WO2022214522A2 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Astrazeneca Ab Compositions and methods for site-specific modification
AU2022258733A1 (en) 2021-04-17 2023-11-30 Intellia Therapeutics, Inc. Inhibitors of dna-dependent protein kinase and compositions and uses thereof
BR112023021445A2 (pt) 2021-04-17 2024-01-23 Intellia Therapeutics Inc Composições de nanopartículas lipídicas
EP4322920A1 (en) 2021-04-17 2024-02-21 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
CA3218511A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
WO2022256437A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
WO2023028471A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Intellia Therapeutics, Inc. Programmed cell death protein 1 (pd1) compositions and methods for cell-based therapy
WO2023039444A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
CN118119707A (zh) 2021-09-30 2024-05-31 阿斯利康(瑞典)有限公司 抑制剂增加CRISPR/Cas插入效率的用途
CN118119702A (zh) 2021-10-14 2024-05-31 隆萨销售股份有限公司 用于细胞外囊泡产生的经修饰的生产者细胞
CN118251491A (zh) 2021-10-28 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物
IL312452A (en) 2021-11-01 2024-06-01 Tome Biosciences Inc A transformant has a single structure for the simultaneous transfer of a gene editing mechanism and a nucleic acid cargo
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
CA3237303A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
WO2023081200A2 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd38 compositions and methods for immunotherapy
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023172926A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
TW202345911A (zh) 2022-03-08 2023-12-01 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之部分外顯子44、50及53之精確切除
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024020352A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024031053A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aggregation-resistant variants of tdp-43
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
US20240182561A1 (en) 2022-11-04 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
US20240173426A1 (en) 2022-11-14 2024-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024137766A2 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) editing
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6039784A (en) 1997-03-12 2000-03-21 Hoeganaes Corporation Iron-based powder compositions containing green strength enhancing lubricants
WO1999045132A1 (en) * 1998-03-02 1999-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US7090976B2 (en) 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
US6203986B1 (en) * 1998-10-22 2001-03-20 Robert H. Singer Visualization of RNA in living cells
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
DK2927318T3 (da) 2003-08-08 2020-08-03 Sangamo Therapeutics Inc Fremgangsmåde og sammensætninger til målrettet spaltning og rekombination
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US20050233994A1 (en) * 2004-04-16 2005-10-20 Ajamete Kaykas Methods and vectors for expressing siRNA
EP2325332B1 (en) 2005-08-26 2012-10-31 DuPont Nutrition Biosciences ApS Use of CRISPR associated genes (CAS)
DK2126130T3 (en) 2007-03-02 2015-06-29 Dupont Nutrition Biosci Aps CULTURES WITH IMPROVED phage resistance
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
MX339535B (es) 2009-03-31 2016-05-27 Nippon Steel & Sumitomo Metal Corp Junta roscada para tubos.
US8586526B2 (en) * 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
EP2569425B1 (en) 2010-05-10 2016-07-06 The Regents of The University of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
EP2596011B1 (en) 2010-07-21 2018-10-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
DK2836226T3 (en) 2012-02-24 2017-09-18 Hutchinson Fred Cancer Res COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHY
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
DK3401400T3 (da) * 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
EP2880171B1 (en) 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
CN110643600A (zh) 2012-10-23 2020-01-03 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的系统及其用途
JP6620018B2 (ja) * 2012-12-06 2019-12-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｃｒｉｓｐｒに基づくゲノム修飾および制御
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093694A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
PT2896697E (pt) * 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
CN105658796B (zh) 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8993233B2 (en) * 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
EP3553174A1 (en) * 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
KR102282990B1 (ko) * 2013-06-04 2021-07-28 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
EP4245853A3 (en) * 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP4166669A1 (en) * 2013-07-09 2023-04-19 President and Fellows of Harvard College Multiplex rna-guided genome engineering
EP3019204B1 (en) * 2013-07-10 2020-01-01 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
SG11201605550QA (en) * 2014-01-08 2016-08-30 Harvard College Rna-guided gene drives
JP7059468B2 (ja) * 2015-10-08 2022-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 多重ゲノム編集
US11746349B2 (en) * 2016-02-09 2023-09-05 President And Fellows Of Harvard College DNA-guided gene editing and regulation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HATOUM-ASLAN A. et al., Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site, Proceedings National Academy of Sciences Vol. 108, No. 52, pp. 21218-21222, 2011. *
JINEK M. et al., A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity, Science Vol. 337, Issue 6096, pp. 816-821, 17 August 2012. *
JINEK M. et al., A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity, Science Vol. 337, Issue 6096, pp. 816-821, 17 August 2012. MINA RHO et al., Diverse CRISPRs Evolving in Human Microbiomes, PLoS Genetics Vol. 8, Issue 6, pp. 1-12, June 2012. HATOUM-ASLAN A. et al., Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site, Proceedings National Academy of Sciences Vol. 108, No. 52, pp. 21218-21222, 2011. КОНИЧЕВ А.С., СЕВАСТЬЯНОВА Г.А. Молекулярная биология, Академа, 2005, стр.135-146. *
MINA RHO et al., Diverse CRISPRs Evolving in Human Microbiomes, PLoS Genetics Vol. 8, Issue 6, pp. 1-12, June 2012. ма, 2005, стр.135-146. *
КОНИЧЕВ А.С., СЕВАСТЬЯНОВА Г.А. Молекулярная биология, Акаде *

Also Published As

Publication number Publication date
US11365429B2 (en) 2022-06-21
KR20220139433A (ko) 2022-10-14
AU2013363194B2 (en) 2019-05-16
US20190249194A1 (en) 2019-08-15
IL239326A0 (en) 2015-07-30
BR112015014425A2 (pt) 2017-10-10
JP6700788B2 (ja) 2020-05-27
WO2014099744A1 (en) 2014-06-26
RU2019127316A3 (ru) 2020-07-06
US10273501B2 (en) 2019-04-30
WO2014099750A3 (en) 2014-10-23
CA2895155A1 (en) 2014-06-26
EP4282970A3 (en) 2024-01-17
JP2021048882A (ja) 2021-04-01
AU2021204023B2 (en) 2023-03-16
SG11201504621RA (en) 2015-07-30
EP3553174A1 (en) 2019-10-16
US20140342456A1 (en) 2014-11-20
NZ709429A (en) 2021-01-29
JP2016501036A (ja) 2016-01-18
AU2019216665A1 (en) 2019-09-05
EP2931891A1 (en) 2015-10-21
CA3081054A1 (en) 2014-06-26
ZA201504739B (en) 2023-12-20
US20160002670A1 (en) 2016-01-07
US11512325B2 (en) 2022-11-29
CN105121641A (zh) 2015-12-02
AU2019216665B2 (en) 2021-03-25
US9260723B2 (en) 2016-02-16
US11236359B2 (en) 2022-02-01
US10717990B2 (en) 2020-07-21
RU2019127316A (ru) 2019-10-08
AU2024201441A1 (en) 2024-03-21
US20140342457A1 (en) 2014-11-20
KR20150095861A (ko) 2015-08-21
IL308158A (en) 2023-12-01
EP2931891A4 (en) 2016-07-13
AU2021204023A1 (en) 2021-07-08
US20200048656A1 (en) 2020-02-13
US11359211B2 (en) 2022-06-14
CA2895155C (en) 2021-07-06
MX2021006742A (es) 2021-07-15
MY170059A (en) 2019-07-02
US20160032274A1 (en) 2016-02-04
EP2931891B1 (en) 2019-05-15
JP2023168564A (ja) 2023-11-24
US9970024B2 (en) 2018-05-15
MX2021006741A (es) 2021-07-15
EP4282970A2 (en) 2023-11-29
US20200308599A1 (en) 2020-10-01
US20150232833A1 (en) 2015-08-20
MX2015007743A (es) 2015-12-07
AU2021204024B2 (en) 2023-12-14
US20160304907A1 (en) 2016-10-20
US20150259704A1 (en) 2015-09-17
US20140342458A1 (en) 2014-11-20
US20230295653A1 (en) 2023-09-21
US10435708B2 (en) 2019-10-08
US20140356958A1 (en) 2014-12-04
RU2766685C2 (ru) 2022-03-15
US20170044569A9 (en) 2017-02-16
US9023649B2 (en) 2015-05-05
SG10201704932UA (en) 2017-07-28
WO2014099750A2 (en) 2014-06-26
US11535863B2 (en) 2022-12-27
US12018272B2 (en) 2024-06-25
SG10201912991WA (en) 2020-03-30
US20160160210A1 (en) 2016-06-09
JP2019076097A (ja) 2019-05-23
DK2931891T3 (da) 2019-08-19
US20190249193A1 (en) 2019-08-15
AU2021204024A1 (en) 2021-07-08
AU2013363194A1 (en) 2015-07-16
ES2741951T3 (es) 2020-02-12
HK1212376A1 (en) 2016-06-10
US20220177913A1 (en) 2022-06-09
RU2015129018A (ru) 2017-01-23
US20210222193A1 (en) 2021-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021204024B2 (en) RNA-guided human genome engineering