JP2016528890A - ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用 - Google Patents

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に開示されているのは、遺伝性血液疾患の治療または予防を目的とする細胞の高効率、部位特異的ゲノム編集方法、組成物及びキットである。細胞中において標的重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。【選択図】図１６

Description

関連出願
本出願は、２０１３年７月９日出願の米国仮出願番号第６１／８４４，３３３号及び２０１３年８月２３日に出願の同第６１／８６９，３６９号の利益を主張する。上記出願の教示全体が参照することにより本明細書に援用される。
政府支援
本発明は、米国国立保健研究所によって与えられたＨＬ１１８７４４、ＨＬ０９８３６４、ＤＫ０９５３８４及びＨＬ１０７４４０のもとで、政府支援を得てなされた。米国政府は、本発明において一定の権利をする。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、哺乳類細胞における所望のゲノム部位を標的にするゲノム編集ツールの新規分類である。近年公表されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列及びＣａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前（このため、（Ｎ）２０ＮＧＧ標的ＤＮＡ配列）にハイブリッド形成させる合成ガイドＲＮＡにより複合体化することによってゲノム部位を標的にするＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する。これにより、二本鎖がＮＧＧモチーフの３つのヌクレオチド上流で切断される。二本鎖の切断は、非相同末端結合（誤りを生じがちであり、遺伝子対立遺伝子をノックアウトさせたフレームシフト突然変異をもたらす）または相同性指向性修復（外因性導入二本鎖または一本鎖ＤＮＡ修復テンプレートを用いてゲノム内で突然変異をノックインするかまたは修正して、利用できる）のいずれかを誘発する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、治療用用途に有用なツールとなり得るが、残念なことに、これまでに公開された報告では、対立遺伝子標的とする効率は、ヒト幹細胞においてわずかに２％〜４％であることを示している（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６（２０１３））。
Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６（２０１３）
本明細書に記載される研究は、最大８０％の効率で突然変異細胞をもたらす、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する対立遺伝子を標的とする方法を示す。これらの大きく改善された方法により、治療を目的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を初めて効果的に利用することができる。ヒト幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法が提供される。加えて、有用なＲＮＡガイド配列を特定的に識別する方法が、特定の遺伝子（例えば、ＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＺＡＰ７０及びＨＢＢ）を標的する上で有用な特定のガイド配列と共に提供される。さらに、本明細書に開示の組成物及び方法を使用する治療方法（例えば、重度の複合免疫不全、鎌状赤血球症（例えば、鎌状赤血球貧血）、βサラセミアなど）が提供される。いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含む、細胞中において標的のＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であり、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、該方法には、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において標的鎌状赤血球症（ＳＣＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、該方法は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、該方法には、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、該方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、該方法には、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分である。いくつかの実施形態では、官能性部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されるＣａｓ９タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む。いくつかの実施形態では、官能性ドメインは複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種またはそれらの官能性部分由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、官能性部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されるＣａｓ９タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む。いくつかの実施形態では、官能性ドメインは複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つから２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、複数のリボ核酸と複合体化される。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇから始まる２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Ｇから始まる２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。
いくつかの実施形態では、改変はインデルである。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が減少する。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列（複数）の好ましくない配列から所望の配列（複数）への修正をもたらす。いくつかの実施形態では、改変は、同型接合改変である。いくつかの実施形態では、各改変は、同型接合改変である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、二本鎖である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、二本鎖である。
いくつかの実施形態では、細胞は末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞または多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８−系譜−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＫ２である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ３Ｄである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図３のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図３のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＣＬＲＥ１Ｃである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図４のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図４のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ２ＲＧである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図６のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図６のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ７Ｒである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図７のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図７のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＪＡＫ３である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図８のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図８のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＬＩＧ４である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図９のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図９のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＨＥＪ１である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１０のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１０のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＮＰである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１１のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１１のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＲＫＤＣである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１２のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１２のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ１である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１３のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１３のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ２である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１４のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１４のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＺＡＰ７０である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１５のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１５のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＨＢＢである。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図５のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図５のリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＡＤＡ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＡＫ２部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図２のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図２のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＣＤ３Ｄ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図３のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図３のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＤＣＬＲＥ１Ｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図４のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図４のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＩＬ２ＲＧ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図６のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図６のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＩＬ７Ｒ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図７のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図７のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＪＡＫ３部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図８のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図８のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＬＩＧ４部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＮＨＥＪ１部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１０のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１０のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＰＮＰ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１１のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１１のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＰＲＫＤＣ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１２のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１２のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＲＡＧ１部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１３のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１３のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＲＡＧ２部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１４のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１４のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＺＡＰ７０部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１５のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１５のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＨＢＢ部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図５のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図５のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２及びＺＡＰ７０からなる群から選択される標的ポリヌクレオチド配列の任意の組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１〜１５のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１〜１５のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、疾患はＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球症である。いくつかの実施形態では、疾患はβサラセミアである。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸はそれぞれ、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているＣａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているＣａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように各標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及び１つから２つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及び１つから２つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及び複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及び複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、各遺伝子座での改変効率は約５０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、改変効率は少なくとも約５％である。いくつかの実施形態では、改変効率は少なくとも約１０％である。いくつかの実施形態では、改変効率は約５０％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、修飾リボ核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。
いくつかの実施形態では、任意のＣａｓタンパク質またはリボ核酸は、プラスミドから発現する。いくつかの実施形態では、任意のＣａｓタンパク質またはリボ核酸は、幹細胞内での発現を増加させるために最適化されたプロモーターを用いて発現する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することを更に含む。いくつかの実施形態では、細胞を選択することにはＦＡＣＳが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳを使用して、Ｃａｓ及び緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質を共発現する細胞を選択する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミポリヌクレオチド配列を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、細胞中において標的βサラセミポリヌクレオチド配列を改変する方法である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、図１〜１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物である。
いくつの態様では、本明細書に開示されているのは、図１〜１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。
いくつかの実施形態では、組成物はＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物はＣａｓ９タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ酸を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１〜１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物である。
いくつの態様では、本明細書に開示されているのは、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸を含むキメラ核酸及び図１〜１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含む組成物である。
いくつかの実施形態では、組成物は、緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、該キットは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１〜１５のリボ核酸配列、図１〜１５のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される１種以上の細胞株、培養液または集団を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＡＤＡ ＤＮＡ修復テンプレート、ＡＫ２ ＤＮＡ修復テンプレート、ＣＤ３Ｄ ＤＮＡ修復テンプレート、ＤＣＬＲＥ１Ｃ ＤＮＡ修復テンプレート、ＩＬ２ＲＧ ＤＮＡ修復テンプレート、ＩＬ７Ｒ ＤＮＡ修復テンプレート、ＪＡＫ３ ＤＮＡ修復テンプレート、ＬＩＧ４ ＤＮＡ修復テンプレート、ＮＨＥＪ１ ＤＮＡ修復テンプレート、ＰＮＰ ＤＮＡ修復テンプレート、ＰＲＫＤＣ ＤＮＡ修復テンプレート、ＲＡＧ１ ＤＮＡ修復テンプレート、ＲＡＧ２ ＤＮＡ修復テンプレート、ＺＡＰ７０ ＤＮＡ修復テンプレート、及びＨＢＢ ＤＮＡ修復テンプレートからなる群から選択されるＤＮＡ修復テンプレートを更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ酸を含む。
いくつかの態様では、本開示は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸、及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分を含む。
いくつの態様では、本開示は、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列改変するためのキットを提供し、該キットは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧ、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される１種以上の細胞株、培養液または集団を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＨＢＢ ＤＮＡ修復テンプレートを含む。
図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＤＡであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＫ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＫ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＫ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＫ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＫ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＡＫ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＤ３Ｄであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＤ３Ｄであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＤ３Ｄであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＤ３Ｄであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＣＤ３Ｄであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＤＣＬＲＥ１Ｃであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＨＢＢであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＨＢＢであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＨＢＢであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＨＢＢであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図６は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ２ＲＧであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図７は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＩＬ７Ｒであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図８は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＪＡＫ３であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図９は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＬＩＧ４であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１０は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＮＨＥＪ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１０は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＮＨＥＪ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１０は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＮＨＥＪ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１０は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＮＨＥＪ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１０は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＮＨＥＪ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１０は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＮＨＥＪ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１１は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＮＰであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１２は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＰＲＫＤＣであるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１３は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ１であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１４は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＲＡＧ２であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１５は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトＺＡＰ７０であるときに有用な例示的ガイドＲＮＡ配列を示す。 図１６は、Ｃａｓタンパク質の例示的アミノ酸配列を示す。黄色の強調表示部分は、Ｒｕｖ−Ｃ−様ドメインを示す。下線部は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを示す。
本明細書に記載される研究は、８０％以下の効率を有する突然変異細胞をもたらす、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する対立遺伝子の標的方法を示す。これらの大きく改善された方法により、治療を目的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を初めて効果的に利用することができる。ヒト幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法が提供される。加えて、ＲＮＡガイド配列に有用な特異的に特定する方法が特定の遺伝子（例えば、ＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、及びＺＡＰ７０）を標的とするのに有用な特定のガイド配列と共に提供される。さらに、本明細書に開示の組成物及び方法を使用する治療方法（例えば、重度複合免疫不全、鎌状赤血球症及びβサラセミアの治療方法）が提供される。
一態様では、本発明は、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）関連ポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法は、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を含む。本明細書で使用するとき、「重度複合免疫不全関連ポリヌクレオチド配列」及び「ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列」は、同義的に使用され、１つ以上のＳＣＩＤに関連する突然変異体を示す遺伝子のポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、「重度複合免疫不全症」及び「ＳＣＩＤ」とは、Ｂリンパ球の直接的な関与または異常な非機能的Ｔヘルパー細胞により生じるＢリンパ球活性化が原因で、欠陥のある抗体応答を引き起こす機能異常Ｔリンパ球を特徴とする遺伝性疾患を指す。ＳＣＩＤは、限定されないが、ＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、及びＺＡＰ７０など、１つ以上の遺伝子における突然変異を原因とする適応免疫系のＢ細胞応答及びＴ細胞応答の機能異常を含む。したがって、「ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列」は、任意のこれらの遺伝子及びそのバリアント形態または突然変異形態のヌクレオチド配列を包含する。
細胞中において標的重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する例示的方法は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させ、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）またはそのバリアントである。例示的なＡＤＡ配列は、ヒトＡＤＡ配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１００）である。当業者は、図１に示すガイド配列は、ヒトＡＤＡの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＡＤＡポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＡＤＡの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表１に、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（登録商標）（ＯＭＩＭ（登録商標））データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表１に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索語「ＡＤＡ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」の縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、アデニル酸キナーゼ２（ＡＫ２）またはそのバリアントである。例示的ＡＫ２配列は、ヒトＡＫ２配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２０４、ＡＤＫ２及びＡＫ２としても公知）である。いくつかの実施形態では、ヒトＡＫ２配列は、配列１をコードするＡＫ２のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＡＫ２配列は、配列２をコードするＡＫ２のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＡＫ２配列は、配列３をコードするＡＫ２のすべてまたは一部を含む。当業者は、図２、３及び４に示すガイド配列は、ヒトＡＫ２、特に配列１、２及び３をそれぞれコードするヒトＡＫ２の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＡＫ２ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＡＫ２の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表２に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表２に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＡＫ２」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ３抗原、δサブユニット（ＣＤ３Ｄ）またはそのバリアントである。例示的ＣＤ３Ｄ配列は、ヒトＣＤ３Ｄ配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９１５、Ｔ３Ｄ及びＣＤ３−δとしても公知）である。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３Ｄ配列は、配列１をコードするＣＤ３Ｄのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３Ｄ配列は、配列２をコードするＣＤ３Ｄのすべてまたは一部を含む。当業者は、図５及び図６に示すガイド配列は、ヒトＣＤ３Ｄ、特に配列１及び２をそれぞれコードするヒトＣＤ３Ｄの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＣＤ３Ｄの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表３に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表３に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＣＤ３Ｄ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ架橋修復タンパク質１Ｃ（ＤＣＬＲＥ１Ｃ）またはそのバリアントである。例示的ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列は、ヒトＤＣＬＲＥ１Ｃ配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６４４２１、ＳＣＩＤＡ、ＳＮＭ１Ｃ、Ａ−ＳＣＩＤ、ｈＳＮＭ１Ｃ、ＲＳ−ＳＣＩＤ、ＤＣＬＲＥ１Ｃとしても公知）である。いくつかの実施形態では、ヒトＤＣＬＲＥ１Ｃ配列は、配列１をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＤＣＬＲＥ１Ｃ配列は、配列２をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＤＣＬＲＥ１Ｃ配列は、配列３をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＤＣＬＲＥ１Ｃ配列は、配列４をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃのすべてまたは一部を含む。当業者は、図７、図８、図９及び図１０に示すガイド配列は、ヒトＤＣＬＲＥ１Ｃ、特に配列１、２、３及び４をそれぞれコードするヒトＤＣＬＲＥ１Ｃの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＤＣＬＲＥ１Ｃの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表４に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表４に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＤＣＬＲＥ１Ｃ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、インターロイキン２レセプターγ（ＩＬ２ＲＧ）またはそのバリアントである。例示的ＩＬ２ＲＧ配列は、ヒトＩＬ２ＲＧ配列である（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６１、Ｐ６４、ＣＩＤＸ、ＩＭＤ４、ＣＤ１３２、ＳＣＩＤＸ、ＩＬ−２ＲＧ及びＳＣＩＤＸ１としても公知である）。当業者は、図１２に示すガイド配列は、ヒトＩＬ２ＲＧの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＩＬ２ＲＧの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表５に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表５に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＩＬ２ＲＧ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、インターロイキン７レセプター（ＩＬ７Ｒ）またはそのバリアントである。例示的ＩＬ７Ｒ配列は、ヒトＩＬ７Ｒ配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５７５、ＩＬＲＡ、ＣＤ１２７、ＩＬ７ＲＡ、ＣＤＷ１２７、ＩＬ−７Ｒ−αとしても公知）である。当業者は、図１３に示すガイド配列は、ヒトＩＬ７Ｒの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＩＬ７Ｒの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表６に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表６に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＩＬ７Ｒ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ヤーヌスキナーゼ３（ＪＡＫ３）またはそのバリアントである。例示的ＪＡＫ３配列は、ヒトＪＡＫ３配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３７１８、ＪＡＫＬ、ＬＪＡＫ、ＪＡＫ−３、Ｌ−ＪＡＫ、ＪＡＫ３＿ＨＵＭＡＮとしても公知）である。当業者は、図１４に示すガイド配列は、ヒトＪＡＫ３の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＪＡＫ３の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表７に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表７に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＪＡＫ３」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、リガーゼＩＶ、ＤＮＡ、ＡＴＰ−依存性（ＬＩＧ４）またはそれらのバリアントである。例示的ＬＩＧ４配列は、ヒトＬＩＧ４配列である（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３９８１）。いくつかの実施形態では、ヒトＬＩＧ４配列は、配列１をコードするＬＩＧ４のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＬＩＧ４配列は、配列２をコードするＬＩＧ４のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＬＩＧ４配列は、配列３をコードするＬＩＧ４のすべてまたは一部を含む。当業者は、図１５、図１６及び図１７に示すガイド配列は、ヒトＬＩＧ４、特に配列１、２及び３をそれぞれコードするヒトＬＩＧ４の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＬＩＧ４の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表８に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表８に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＬＩＧ４」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、非相同末端結合因子１（ＮＨＥＪ１）またはそのバリアントである。例示的ＮＨＥＪ１配列は、ヒトＮＨＥＪ１配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７９８４０、ＸＬＦとしても公知）である。当業者は、図１８に示すガイド配列は、ヒトＮＨＥＪ１の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＮＨＥＪ１の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表９に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表９に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＮＨＥＪ１」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型の「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ配列（ＰＮＰ）またはそのバリアントである。例示的ＰＮＰ配列はヒトＰＮＰ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４８６０、ＮＰ、ＰＵＮＰ及びＰＲＯ１８３７としても公知）である。当業者は、図１９に示すガイド配列は、ヒトＰＮＰの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＰＮＰポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＰＮＰの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表１０に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表１０に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＰＮＰ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、プロテインキナーゼＤＮＡ活性化触媒ポリペプチド配列（ＰＲＫＤＣ）またはそのバリアントである。例示的ＰＲＫＤＣ配列はヒトＰＲＫＤＣ配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５５９１、ＨＹＲＣ、ｐ３５０、ＤＮＡＰＫ、ＤＮＰＫ１、ＨＹＲＣ１、ＸＲＣＣ７及びＤＮＡ−ＰＫｃとしても公知）である。いくつかの実施形態では、ヒトＰＲＫＤＣ配列は、配列１をコードするＰＲＫＤＣのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＰＲＫＤＣ配列は、配列２をコードするＰＲＫＤＣのすべてまたは一部を含む。当業者は、図２０及び図２１に示すガイド配列は、ヒトＰＲＫＤＣ、特に配列１及び２をそれぞれコードするヒトＰＲＫＤＣの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＰＲＫＤＣの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。いくつかの実施形態では、改変ＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列に関連する表現型は、ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、改変ＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列に関連する表現型は、色素性乾皮症における放射線感受性である（Ａｂｂａｓｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ−ＰＫｃｓ ｇｅｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｘｅｒｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ」 Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ． ２０１０；４７（３）：１７６−８１）。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ １ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそのバリアントである。例示的ＲＡＧ１配列は、ヒトＲＡＧ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５８９６、ＲＡＧ−１及びＲＮＦ７４としても公知）である。当業者は、図２２に示すガイド配列は、ヒトＲＡＧ１の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＲＡＧ１の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表１１に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表１１に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＲＡＧ１」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそのバリアントである。例示的ＲＡＧ２配列は、ヒトＲＡＧ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５８９６、ＲＡＧ−２としても公知）である。いくつかの実施形態では、ヒトＲＡＧ２配列は、配列１をコードするヒトＲＡＧ２のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＲＡＧ２配列は、配列２をコードするＲＡＧ２のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＲＡＧ２配列は、配列３をコードするヒトＲＡＧ２のすべてまたは一部を含む。当業者は、図２３、図２４及び図２５に示すガイド配列は、ヒトＲＡＧ２、特に配列１、２及び３をそれぞれコードするヒトＲＡＧ２の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＲＡＧ２の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表１２に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表１２に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＲＡＧ２」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ζ鎖関連タンパク質キナーゼ配列（ＺＡＰ７０）またはそのバリアントである。例示的ＺＡＰ７０配列は、ヒトＺＡＰ７０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７５３５、ＳＲＫ、ＳＴＤ、ＴＺＫ、ＳＴＣＤ及びＺＡＰ−７０としても公知）である。いくつかの実施形態では、ヒトＺＡＰ７０配列は、配列１をコードするヒトＺＡＰ７０のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＺＡＰ７０配列は、配列２をコードするヒトＺＡＰ７０のすべてまたは一部を含む。当業者は、図２６及び図２７に示すガイド配列は、ヒトＺＡＰ７０、特に配列１及び２をそれぞれコードするヒトＺＡＰ７０の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＺＡＰ７０の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表１３に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表１３に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＺＡＰ７０」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型の「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヘモグロビンβ（「ＨＢＢ」）（例えば、ヒトヘモグロビンβ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３０４３）またはそのバリアントである。当業者は、図１１に示すガイド配列は、ヒトＨＢＢの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたＨＢＢポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にＨＢＢの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表１４に、ＯＭＩＭ（登録商標）データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表１４に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ＨＢＢ」でＯＭＩＭに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型ＭＩＭ番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
正常成人ヘモグロビンは、２つのα鎖及び２つのβ鎖から構成される四量体である。ＨＢＢにより、ヘモグロビンのβ鎖の構造が決定する。ＨＢＢの突然変異は、鎌状赤血球症及び／またはβサラセミアと関連している。例えば、鎌状赤血球貧血は、突然変異βグロビンによって引き起こされる。β鎖が不在の場合には、β−ゼロサラセミアとなる。検出可能なβグロビンの減少量によって、βプラスサラセミアとなる。鎌状赤血球症に伴うＨＢＢの例示的突然変異体は、ヘモグロビンＳ（Ｇｌｕ６Ｖａｌ）、ヘモグロビンＣ（Ｇｌｕ６Ｌｙｓ）、ヘモグロビンＤ（Ｇｌｕ１２１Ｇｌｎ）及びヘモグロビンＯ（Ｇｌｕ１２１Ｌｙｓ）である。
Ｌ１レトロトランスポゾン断片がＩＶＳ−ＩＩに挿入されると、β−サラセミアとなる。これは、βサラセミアの形態を表す。βグロビン遺伝子により、全β−グロビンｍＲＮＡの約１５％に等しいレベルで、全長β−グロビン転写物が発現する。
いくつかの実施形態では、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法は、標的鎌状赤血球症（ＳＣＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を含む。本明細書で使用するとき、「鎌状赤血球症関連ポリヌクレオチド配列」及び「ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列」は、同義的に使用され、ＳＣＤに関連づけられた１つ以上のＨＢＢ突然変異体を示すＨＢＢ遺伝子のポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、「鎌状赤血球症」とは、ＨＢＢ内の突然変異が関与し、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の存在によって定義される症候性障害の群を指す。正常ヘモグロビンは、２つのα−ヘモグロビン鎖及び２つのβ−ヘモグロビン鎖から成るヘテロ四量体である。ＨＢＢの点変異により、ヘモグロビンＳは、例えば、β−ヘモグロビン鎖において、六番目のアミノ酸がグルタミン酸からバリン（Ｇｌｕ６Ｖａｌ）に変わる点変異となる。鎌状赤血球貧血（ホモ接合型ＨｂＳＳ）は、米国において報告されている鎌状赤血球症の６０〜７０％を占める鎌状赤血球症の一例である。鎌状赤血球症の他の形態の例は、ＨｂＳと種々の突然変異体β−グロビン鎖バリアント（鎌状−ヘモグロビンＣ疾患（ＨｂＳＣ））及び鎌状βサラセミアの２つの異なる型（Ｈｂ Ｓβ＋ −サラセミア及びＨｂ Ｓ β−サラセミア）との共遺伝が原因である。
細胞中において標的鎌状細胞疾患（ＳＣＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する例示的方法には、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法は、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を含む。本明細書で使用するとき、「βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列」は、βサラセミアに関連づけられた１つ以上のＨＢＢ突然変異を示すＨＢＢ遺伝子のポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、「βサラセミア」とは、２００超の異なるＨＢＢ突然変異体によって生じるヘモグロビンサブユニットβ（例えば、ヘモグロビンβ鎖）の産生の低下を特徴とする遺伝性常染色体劣性疾患を指す。当事者によって理解されるように、βサラセミアとなるＨＢＢ突然変異体としては、非欠損ＨＢＢ突然変異体、欠損ＨＢＢ突然変異体及び転位因子に起因するＨＢＢ突然変異体が挙げられる。下表１５は、例示的非欠損ＨＢＢ突然変異体を示す。


また、当業者は、さまざまな欠失βサラセミア対立遺伝子が存在し、これは特定のリスク集団によく見られる傾向にあることを理解するであろう。欠失βサラセミア対立遺伝子の例としては、限定されるものではないが、２５ｂｐ欠失、４４ｂｐ欠失、１０５ｂｐ欠失、２９０ｂｐ欠失、５３２ｂｐ欠失、６１９ｂｐ欠失、１，３９３ｂｐ欠失、１，６０５ｂｐ欠失（「クロアチア人欠失」）、３，４８５ｂｐ欠失（「タイ人欠失」）、４，２３７ｂｐ欠失（「チェック人欠失」）、７．６ｋｐ欠失（「トルコ欠失」）、１０，３２９ｂｐ欠失（アジアインド人欠失」）、１２，０２３ｂｐ欠失（「オーストラリア欠失」）、１２，６２０ｂｐ欠失（「オランダ人欠失」）、２７ｋｐ欠失（「東南アジア人欠失」）、４５ｋｐ欠失（「フィリピン人欠失」）及び６５ｋｐ欠失（「イタリア人欠失」）が挙げられる。当業者は、対応する核酸及び公的に利用可能な情報源からこれらの欠損に対応するタンパク質配列を取得することができる（例えば、Ａ Ｓｙｌｌａｂｕｓ ｏｆ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ（１９９７）、Ｔｉｔｕｓ Ｈ．Ｊ．Ｈｕｉｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ著、Ｔｈｅ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ａｎｅｍｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ａｕｇｕｓｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ）公開、ｈｔｔｐ：／／ｇｌｏｂｉｎ．ｃｓｅ．ｐｓｕ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／ｈｕｉｓｍａｎ／ｔｈａｌｓ／Ｉ−ｂ．ｅｎｔｒｉｅｓ．ｈｔｍｌからオンラインで閲覧可能）。
細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する例示的方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
本明細書で使用するとき、「接触すること」という用語（すなわち、ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及びまたはリボ核酸に接触させること）は、細胞内のＣａｓタンパク質及び／またはリボ核酸を共にインビトロでインキュベートする（例えば、培養物中において、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に添加すること）ことを含むことを意図している。いくつかの実施形態では、「接触すること」という用語は、微生物（すなわち、細菌）内で自然に発生し得る本明細書にて開示したように、細胞をＣａｓタンパク質及び／またはリボ核酸にインビボで晒すことを含むことを意図していない。本明細書にて開示する、標的ポリヌクレオチド配列をＣａｓタンパク質及び／またはリボ核酸に接触させるステップは、任意の好適な方法で実施することができる。例えば、細胞は、粘着性培養物または懸濁液培養物内で処理されてもよい。また、本明細書にて開示する、Ｃａｓタンパク質及び／またはリボ核酸に接触させた細胞は、同時にまたはその後に別の因子（例えば、成長因子または他の分化剤または環境）に接触させて、細胞を安定させるか、または細胞を更に分化し得ることが理解される。
別の態様では、本発明は、対象においてポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供する。
「処理する」「処理している」「処理」という用語などは、単離細胞に適用されるとき、細胞を任意の種類のプロセスまたは条件にさらすことまたは任意の種類の細胞上の操作または手順を実施することを含む。対象に適用されるとき、この用語は、個人への医学的または外科的考慮、治療または管理を提供することを指す。個人は、通常、母集団であり、こうした配慮、治療または管理を必要とする平均的参加者と比較して病気であるか、障害を受けているか、または病気になるリスクが増大する。
本明細書で使用するとき、「治療すること」及び「治療」とは、対象は、少なくとも１つの疾患の症状の減少または疾患の改善、例えば、有益若しくは所望の臨床結果を有するように、有効量の組成物を対象に投与することを指す。本発明の目的のために、有益若しくは所望の臨床結果とは、限定されないが、１つ以上の症状の緩和、疾患範囲の減少、疾患の安定（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、病態の改善または緩和、及び寛解（部分、または、全体）が挙げられる（検出可能であるか否かにかかわらず）。「治療」は、また、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。したがって、当業者は、治療により、疾患状態が改善し得るが、疾患に対して完全な治癒とはならない可能性があることを理解している。本明細書で使用するとき、「治療」という用語は予防を含む。あるいは、治療は、疾患の進行が減少または停止した場合、「有効」である。また、「治療」は、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。治療を必要とする場合としては、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害並びに遺伝感受性または他の因子によるこうした障害を発現する可能性の高いとすでに診断された場合が挙げられる。
疾患または障害の「治療」「予防」若しくは「改善」は、このような疾または障害の発症の遅延若しくは回避、こうした疾患若しくは障害に関連する病態の進行若しくは重症度の進行、悪化若しくは増悪の逆行、軽減、回復、阻害、遅延若しくは停止を指す。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、（ａ）ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、（ａ）ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法
または予防方法を含む。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、（ａ）βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質をβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
本発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系用いて、当事者が利用可能なあらゆる方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを意図する。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。こうしたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、さまざまなＣａｓタンパク質を使用してもよい（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ． ２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列に改変することができるこうしたＣａｓタンパク質の分子機構としては、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ及びポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。本発明は、目的に応じて細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異細胞を産生するため改変される。本明細書で使用するとき、「突然変異細胞」は、その元の遺伝子型とは異なる得られた遺伝子型を有する細胞を指す。場合によっては、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して正常機能的遺伝子を改変する場合、「突然変異細胞」と突然変異表現型を指す。他の場合、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して突然変異遺伝子型を修正する場合、「突然変異細胞」とは野生型表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＡＤＡ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＡＫ２表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＣＤ３Ｄ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＩＬ２ＲＧ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＩＬ７Ｒ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＪＡＫ３表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＬＩＧ４表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＮＨＥＪ１表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＰＮＰ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＰＲＫＤＣ表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＲＡＧ１表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＲＡＧ２表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＺＡＰ７０表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ＨＢＢ表現型を指す。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の突然変異を修正または修復するために改変される（例えば、正常表現型を細胞に回復させる）。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＡＤＡ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＡＫ２突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＣＤ３Ｄ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＤＣＲＥ１Ｃ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＩＬ２ＲＧ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＩＬ７Ｒ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＪＡＫ３突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＬＩＧ４突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＮＨＥＪ１突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＰＮＰ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＰＲＫＤＣ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＲＡＧ１突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＲＡＧ２突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤに伴う１つ以上のＺＡＰ７０突然変異を修正するまたは修復するため改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＤに伴う１つ以上のＨＢＢ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＤに伴う１つ以上のＨＢＢ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。別の例示的実施形態では、細胞内の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列は、βサラセミアに伴う１つ以上のＨＢＢ突然変異を修正するまたは修復するために改変される。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の突然変異を引き起こすために改変される（例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を切断させるため）。
いくつかの実施形態では、改変はインデルである。本明細書で使用するとき、「インデル」とは、挿入、欠失またはこれらを組み合わせたものに誘発される突然変異を指す。当業者によって理解されているように、ゲノム配列のコード領域内のインデルにより、フレームシフト突然変異となる。ただし、インデルの長さが３の倍数である場合を除く。いくつかの実施形態では、改変は点変異である。本明細書で使用するとき、「点変異」は、１つのヌクレオチドが置き換えられている置換を指す。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ポリヌクレオチド配列内の任意の長さのインデルまたは点変異を誘発することができる。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列またはそれらの一部がノックアウトされる。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ポリヌクレオチド配列またはそれらの一部をノックアウトさせることは、さまざまな用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、研究目的としてインビトロで実施することができる。エクスビボまたはインビボを目的として、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法に有用であり得る。
本明細書で使用するとき、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能に干渉する方法での標的ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部の消失を含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能性ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）において標的ポリヌクレオチド配列内のインデルを誘発して標的ポリヌクレオチド配列を改変することによって得ることができる。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて、標的ポリヌクレオチド配列またはそれらの一部をノックアウトするために本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用方法を容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が減少する。「減少する」「低減する」「低減」及び「減少」という用語は、いずれも、本明細書で一般に、統計上有意な量の減少を指すために使用される。しかし、あらゆる疑いを回避するために、「減少する」「低減する」「低減」及び「減少」は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％の減少または１００％以下の減少（すなわち、標準試料と比較して、不在であるレベル）、または標準レベルと比較して、１０〜１００％のあらゆる減少を指す。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が増加する。「増加させる」「増加」または「改良する」または「活性化する」という用語は、すべて、本明細書で統計上有意な量増加することを指すために使用され、あらゆる疑いを回避するために、「増加させる」「増加」または「改良する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％の増加または１００％以下の増加（すなわち、標準試料と比較して、不在であるレベル）、または標準レベルと比較して、１０〜１００％のあらゆる増加または標準レベルと比較して、少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍若しくは少なくとも約１０倍、または２倍〜１０倍以上のあらゆる増加を指す。
「統計上有意な」または「有意に」という用語は、統計上の有意性を意味し、一般に、標準より２標準偏差（２ＳＤ）下の、すなわち低いマーカーの濃度を指す。この用語は、差異があるという統計的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際に正しい場合に帰無仮説の棄却を判定する確率として定義される。この判定は、多くの場合、ｐ値を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、改変は、同型接合改変である。いくつかの実施形態では、改変は異型接合改変である。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ポリヌクレオチド配列内の任意の型の突然変異またはエラーを修正することができる。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、欠失により標的ポリヌクレオチド配列から消失しているヌクレオチド配列を挿入することができる。また、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、欠失により標的ポリヌクレオチド配列から、ヌクレオチド配列を削除または切除することができる。場合によっては、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、不正確なヌクレオチド配列を正確なヌクレオチド配列に置き換えることができる（例えば、機能の変異の消失、すなわちＳＮＰにより、障害を受けている標的ポリヌクレオチド配列に機能を回復させるために）。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＡＤＡポリヌクレオチド配列を野生型ＡＤＡポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＡＫ２ポリヌクレオチド配列を野生型ＡＫ２ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列を野生型ＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列を野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列を野生型ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列を野生型ＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列を野生型ＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列を野生型ＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列を野生型ＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＰＮＰポリヌクレオチド配列を野生型ＰＮＰポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列を野生型ＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列を野生型ＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列を野生型ＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列を野生型ＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、突然変異ＨＢＢポリヌクレオチド配列を野生型ＨＢＢポリヌクレオチド配列に置換することができる。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、従来のＣＲＩＳＰＲ／系ａｓ系と比較して驚くほど高い効率を有する標的ポリヌクレオチドを改変することができる。ある特定の実施形態では、改変効率は少なくとも約５％である。ある特定の実施形態では、改変効率は少なくとも約１０％である。いくつかの実施形態では、改変効率は約１０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、改変効率は約３０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、改変効率は約５０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、改変効率は約８０％以上である。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、任意の特定の細胞内において、改変される所望の標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列の発現が疾患に関連するか、または病原体の細胞への侵入を促進する任意のゲノム配列に対応し得ることは容易に理解するであろう。例えば、細胞内において改変する所望の標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する１つのポリヌクレオチド多形体（例えば、鎌状細胞貧血症などの鎌状赤血球症）を含むゲノム配列に対応しているポリヌクレオチド配列であり得る。こうした例では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、疾患関連ＳＮＰを野生型対立遺伝子に置き換えること（例えば、ヘモグロビンＳ内のＧｌｕ６ＶａｌＳＮＰからＶａｌ６Ｇｌｕへ、ヘモグロビンＣ内のＧｌｕ６ＬｙｓＳＮＰからＬｙｓ６Ｇｌｕへ、ヘモグロビンＤ内のＧｌｕ１２１ＧｌｎＳＮＰからＧｌｎ１２１Ｇｌｕへ、ヘモグロビンＯ内のＧｌｕ１２１ＬｙｓＳＮＰからＬｙｓ１２１Ｇｌｕへ置き換えること）によって、疾患関連ＳＮＰを修正することができる。別の例として、病原体の細胞への進入または増殖を担う標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の機能を切断し、病原体の細胞への進入または細胞内での増殖を阻止するための消失または挿入に好適な標的であり得る。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳類ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的配列は突然変異体またはバリアントのゲノム配列（例えば、ＡＤＡ突然変異体、ＡＫ２突然変異体、ＣＤ３Ｄ突然変異体、ＤＣＬＲＥ１Ｃ突然変異体、ＩＬ２ＲＧ突然変異体、ＩＬ７Ｒ突然変異体、ＪＡＫ３突然変異体、ＬＩＧ４突然変異体、ＮＨＥＪ１突然変異体、ＰＮＰ突然変異体、ＰＲＫＤＣ突然変異体、ＲＡＧ１突然変異体、ＲＡＧ２突然変異体、ＺＡＰ７０突然変異体、ＨＢＢ突然変異体）である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム突然変異体またはバリアントの配列（例えば、ＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＺＡＰ７０、ＨＢＢ）である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異体またはバリアントの哺乳類ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳類突然変異体またはバリアントのゲノム配列である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、病原性ゲノム配列である。例示的病原性ゲノム配列としては、限定されるものではないが、ウイルス性ゲノム配列、細菌性ゲノム配列、真菌ゲノム配列、毒素ゲノム配列、または寄生虫ゲノム配列が挙げられる。こうした実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、病原体のゲノム配列（例えば、細胞内に進入する危険があるかまたは一旦、病原体が細胞内にあれば、増殖、成長若しくは生存を担うゲノム配列）を切断することによって病原体の機能を切断（例えば、病原体による感染の処理または予防）することができる。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＫ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＫ２のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＡＫ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列２をコードするＡＫ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列３をコードするＡＫ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＫ２の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＫ２のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ３Ｄまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ３Ｄのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＣＤ３Ｄまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列２をコードするＣＤ３Ｄまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ３Ｄの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ３Ｄのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＣＬＲＥ１Ｃまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＣＬＲＥ１Ｃのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＣＬＲＥ１Ｃコード配列２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列３をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列４をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃコードまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＣＬＲＥ１Ｃの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＣＬＲＥ１Ｃのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ２ＲＧまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ２ＲＧのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ２ＲＧの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ２ＲＧのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ７Ｒまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ７Ｒのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ７Ｒの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＩＬ７Ｒのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＪＡＫ３またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＪＡＫ３のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＪＡＫ３の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＪＡＫ３のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＬＩＧ４またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＬＩＧ４のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＬＩＧ４またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列２をコードするＬＩＧ４またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列３をコードするＬＩＧ４またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＬＩＧ４の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＬＩＧ４のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＨＥＪ１またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＨＥＪ１のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＨＥＪ１の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＨＥＪ１のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＮＰまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＮＰのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＮＰの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＮＰのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＲＫＤＣまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＲＫＤＣのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＰＲＫＤＣまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列２をコードするＰＲＫＤＣまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＲＫＤＣの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＲＫＤＣのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ１またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ１のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ１の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ１のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ２のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＲＡＧ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列２をコードするＲＡＧ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列３をコードするＲＡＧ２またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ２の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＡＧ２のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＺＡＰ７０またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＺＡＰ７０のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列１をコードするＺＡＰ７０またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列２をコードするＺＡＰ７０またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＺＡＰ７０の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＺＡＰ７０のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（例えば、ＨＢＢの突然変異体、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３０４３）またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の変異型相同体（例えば、ＨＢＢの変異相同体）またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の変異型オルソログ（例えば、ＨＢＢの変異オルソログ）またはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（例えば、ＨＢＢの突然変異体）である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の変異型相同体（例えば、ＨＢＢの変異相同体）またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の変異型オルソログ（例えば、ＨＢＢの変異オルソログ）またはその一部である。これらの標的ポリヌクレオチド配列の関連部分は、それぞれ、図１、図２〜図４、図５〜図６、図７〜図１０、図１２、図１３、図１４、図１５〜図１７、図１８、図１９、図２０〜図２１、図２２、図２３〜図２５、図２６〜図２７及び図１１に示すガイド配列に対応する。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により、さまざまな方法で標的ポリヌクレオチド配列を切断できることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。
本発明の方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質に指向し、標的モチーフへのハイブリッド形成が可能になる、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列が好適な標的モチーフを含む限り、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、特定のポリヌクレオチドを標的にする標的モチーフは、用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び標的とされるポリヌクレオチドの配列に依存することを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、長さが少なくとも２０ｂｐである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇで始まる２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。それぞれのＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２及びＺＡＰ７０標的ポリヌクレオチドモチーフ配列の標的モチーフの型は、それぞれ、図１、２〜４、５〜６、７〜１０、１１、１２、１３、１４、１５〜１７、１８、１９、２０〜２１、２２、２３〜２５及び２６〜２７の「部位型」縦列に見出すことができることを理解すべきである。
本発明の標的モチーフは、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のオフターゲット効果を最小限に抑えるように選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。当業者は、オフターゲット効果を最小限に抑えるために様々な技術を使用して好適な標的モチーフを選択できる（例えば、バイオインフォマティクス解析）ことは理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、相同性指向性修復を用いて、標的ポリヌクレオチド配列を修正する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、一本鎖または二本鎖であり得る。外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、任意の長さであってもよい。当業者は、任意の特定のＤＮＡ修復テンプレートの長さは、修正される標的ポリヌクレオチド配列に依存することを理解するであろう。ＤＮＡ修復テンプレートは、任意の標的ポリヌクレオチド配列、特に疾患関連多型（例えば、ＳＮＰ）を含む標的ポリヌクレオチド配列を修復するまたは置き換えるように設計され得る。例えば、こうしたＳＮＰを含む突然変異体対立遺伝子の相同性指向性修復は、突然変異体対立遺伝子に隣接する２つの標的モチーフを選択することによって、及び野生型対立遺伝子に適合するＤＮＡ修復テンプレートを設計することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて達成することができる。
例示的実施形態では、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列は、ＤＮＡ修復テンプレートとして対応する正常な野生型遺伝子配列を使用して、相同性指向性修復により修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＡＤＡ）は、正常野生型ＡＤＡ配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＡＫ２）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＡＫ２配列（例えば、配列１をコードする野生型ＡＫ２、配列２をコードするＡＫ２及び配列３をコードするＡＫ２またはその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＣＤ３Ｄ）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＣＤ３Ｄ配列（例えば、配列１をコードする野生型ＣＤ３Ｄ、配列２をコードするＣＤ３Ｄ及びその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列（例えば、配列１をコードする野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ、配列２をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃ、配列３をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃ及び配列４をコードするＤＣＬＲＥ１Ｃまたはその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＩＬ２ＲＧ）は、正常野生型ＩＬ２ＲＧ配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＩＬ７Ｒ）は、正常野生型ＩＬ７Ｒ配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＪＡＫ３）は、正常野生型ＪＡＫ３配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＬＩＧ４）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＬＩＧ４配列（例えば、配列１をコードする野生型ＬＩＧ４、配列２をコードするＬＩＧ４、配列３をコードするＬＩＧ４またはその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＮＨＥＪ１）は、正常野生型ＮＨＥＪ１配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＰＮＰ）は、正常野生型ＰＮＰ配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＰＲＫＤＣ）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＰＲＫＤＣ配列（例えば、配列１をコードする野生型ＰＲＫＤＣ、配列２をコードするＰＲＫＤＣ及びその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＲＡＧ１）は、正常野生型ＲＡＧ１配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＲＡＧ２）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＲＡＧ２配列（例えば、配列１をコードする野生型ＲＡＧ２、配列２をコードするＲＡＧ２、配列３をコードするＲＡＧ２またはその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド関連配列（すなわち、突然変異体ＺＡＰ７０）は、ＤＮＡ修復テンプレートとして、正常な野生型ＺＡＰ７０配列（例えば、配列１をコードする野生型ＺＡＰ７０、配列２をコードするＺＡＰ７０及びその一部）を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド関連配列は、正常野生型ＨＢＢ配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド関連配列は、正常野生型ＨＢＢ配列またはその一部をＤＮＡ修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系としては、Ｃａｓタンパク質及び標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにＣａｓタンパク質を指向し、かつハイブリッド形成が可能な少なくとも１つから２つのリボ核酸が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義的に使用され、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸ポリマー）によって結合した一連のアミノ酸残基を意味し、変性アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸類似体を含む。例示的ポリペプチドまたはタンパク質類としては、遺伝子産生物、天然タンパク質、相同遺伝子、側系遺伝子、断片及び上記の他の等価物、バリアント及び類似体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は１つ以上のアミノ酸置換基または変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は保守的アミノ酸置換を含む。場合によっては、細胞中における置換及び変異によりタンパク質分解の阻止若しくは低減及び／またはポリペプチドの半減期の延長が可能である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換基（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は天然アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は代替アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は任意の部分（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど）を含む改変を含むことができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、限定されないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８及びＣａｓ９が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、大腸菌サブタイプ（ＣＡＳＳ２としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。大腸菌サブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４及びＣａｓ５ｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｙｐｅｓｔサブタイプ（ＣＡＳＳ３としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３及びＣｓｙ４が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｍｅｎｉサブタイプ（ＣＡＳＳ４としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄｖｕｌｇサブタイプ（ＣＡＳＳ１としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的Ｃａｓタンパク質としては、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２及びＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｎｅａｐサブタイプ（ＣＡＳＳ７としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２及びＣａｓ５ｔが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２及びＣａｓ５ｈが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ａｐｅｒｎサブタイプ（ＣＡＳＳ５としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５及びＣａｓ５ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｍｔｕｂｅサブタイプ（ＣＡＳＳ６としても公知）のＣａｓタンパク質を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４及びＣｓｍ５が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、限定されないが、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５及びＣｍｒ６が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌） Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種またはそれらの官能性部分由来のＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、トランス−コード小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）及びＣａｓタンパク質を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８のアミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質の例示的アミノ酸配列（配列番号：２９８）は、図２８に示す。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的である標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ−様ドメイン（残基７〜２２、７５９〜７６６及び９８２〜９８９）及びｃｒＲＮＡに相補的である標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０〜８７２）など、２つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。図２８では、ＲｕｖＣ様ドメインは黄色で強調表示し、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは下線で表示する。
本明細書で使用するとき、「官能性部分」とは、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体化し、標的ポリヌクレオチド配列を切断する能力を保持するペプチドの一部を指す。いくつかの実施形態では、官能性部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されるＣａｓ９タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む。いくつかの実施形態では、官能性ドメインは複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の官能性部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの官能性部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の官能性部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの官能性部分を含む。
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列とＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を接触させるさまざまな方法を企図することは理解すべきである。いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞内に導入することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされ得るか、または融合され得る。本明細書で使用するとき、「細胞透過性ポリペプチド」及び「細胞透過性ペプチド」とは、それぞれ、分子の細胞への取り込みを促進するポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能なラベルを含有することができる。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、（例えば、陽性、陰性または全体の中性の電荷を担持する）電荷タンパク質にコンジュゲートされ得るか、または融合され得る。このような連結は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を超正電荷ＧＦＰに融合させて、Ｃａｓタンパク質の能力を有意に増大させ、細胞を貫通させことができる（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７〜５２）。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合させて、その細胞への導入を促進させることができる。例示的ＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン及びペネトラチンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、超正電荷ＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することができる。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって行うことができる。好適な技術としては、リン酸カルシウム法または脂質媒介トランスフェクション法、電気穿孔法、及び形質導入法またはウイルスベクターを用いた感染法が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように修飾ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように修飾ｍＲＮＡ（例えば、合成、修飾ｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つから２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及び１つから２つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及び１つから２つのリボ核酸は、本明細書に記載されるように、脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾リボ核酸（例えば合成、修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成することができる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、細胞中においてＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させるガイドＲＮＡを含む。
本発明のリボ核酸は、当業者によって理解されるように、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系系及び標的ポリヌクレオチドの配列に依存して、さまざまな異なる標的モチーフにハイブリッド形成するために選択され得る。また、１つから２つのリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるようにも選択することができる。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計される。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸はそれぞれ、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているＣａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計される。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧからなる群から選択される配列を含む。これまでの配列は、ガイドＲＮＡ内のプロトスペーサー配列であり、後者の配列は、プロトスペーサー及びＰＡＭであることを理解すべきである。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記の１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜図１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜図１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのいずれかの少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つのリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
また、本発明は、多重のゲノム編集を意図する。当業者は、単一の遺伝子のゲノム編集に関する上記の説明は、以下の多重のゲノム編集の実施形態に同様に適用可能であることを理解するであろう。
別の態様では、本発明は、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法は、細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチドを同時に改変する方法を含む。
細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する例示的方法は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させること、を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法は、細胞中において複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチドを同時に改変する方法を含む。
細胞中において複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する例示的方法は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法は、細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチドを同時に改変する方法を含む。
細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する例示的方法は、ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させること、を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
更に別の態様では、本発明は、対象においてポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象においてポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、（ａ）ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を対応する野生型または正常なポリヌクレオチド配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を野生型または正常な遺伝子配列と置き換えることができる。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＡＤＡポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＡＤＡポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＡＫ２ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＡＫ２ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＰＮＰポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＰＮＰポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、対象においてポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、（ａ）ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
いくつかの実施形態では、対象においてポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）が切断されることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約５０％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
本明細書で使用するとき、「投与すること」「埋め込むこと」及び「移植すること」という用語は、導入された細胞が所望の部位にて少なくとも一部局在化する方法または経路によって、本発明の方法に従って改変された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載の細胞などの細胞を対象内に配置する文脈において同義的に使用される。細胞は、直接所望の部位に埋め込むことができるか、あるいは、埋め込まれた細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が依然として生存可能である対象内の所望の場所に送達される任意の好適な経路で投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間度は、２４時間などの数時間から数日、数年ほどの長さであり得る。また、場合によっては、細胞は、例えばカプセルで、肝臓または皮下など所望の部位以外の場所に投与され、埋め込まれた細胞を埋め込み場所で保持し、埋め込まれた細胞の移動を回避することができる。
エクスビボ法では、細胞としては、自家細胞、すなわち、細胞（複数可）中において標的ポリヌクレオチド配列の改変を必要とする対象由来の細胞（複数可）（すなわち、ドナー及びレシピエントが同一個体である）を挙げることができる。自家細胞は、細胞の任意の免疫ベースの拒絶を回避する利点を有する。あるいは、細胞は、例えば、ドナー由来の異種であってもよい。第２の対象は、同一のまたは異なる種のものであってもよい。典型的には、細胞がドナー由来である場合、免疫学的にレシピエントと十分に適合性がある、すなわち、移植拒絶を受けることのないドナー由来のものとなり、免疫抑制の必要性が低減するか、または不要となる。いくつかの実施形態では、細胞は異種供給源（すなわち、レシピエントまたはレシピエントの種と十分に免疫学的適合性があるように遺伝子組み換えされた非ヒト乳房哺乳類）から採取される。免疫親和性の判定方法は、当技術分野において既知であり、ＨＬＡ及びＡＢＯ判定のドナー−レシピエント適合性を評価する組織適合検査が挙げられる。例えば、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｈ ａｎｄ Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ， Ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ １９９４）を参照されたい。
任意の好適な細胞培養物培地を、本発明のエクスビボ法に使用可能である。
対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の別の例示的治療方法または予防方法は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成され、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を対応する野生型または正常なポリヌクレオチド配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を対応する野生型または正常なポリヌクレオチド配列と置き換えることができる。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＡＤＡポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＡＤＡポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＡＫ２ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＡＫ２ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＰＮＰポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＰＮＰポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＲＡＧ２（複数）ポリヌクレオチド配列を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列を含む。
対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の別の例示的治療方法または予防方法は、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が切断され、これによって、ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の別の例示的治療方法または予防方法は、細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
「対象」及び「個体」という用語は、本明細書において同義的に用いられ、例えば、細胞を得ることができる及び／または予防的処置など、本明細書に記載されるように細胞を用いて処置を行うことができるヒトなどの動物を意味し、提供される。ヒト対象など特定の動物に特異的である感染、状態または病態の処置については、用語対象は、その特定の動物を指す。本明細書において同義的に用いられる「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳類」は、ラット、ネズミ、ウサビ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ及び非ヒト霊長類などの哺乳類が挙げられる。また、「対象」は、限定されないが哺乳類、爬虫類、両生類及び魚類など任意の脊椎動物を包含する。しかし、有利にも、対象は、ヒトなどの哺乳類またはイヌ、ネコ、ウマなどの半飼育哺乳類などの他の哺乳類またはウシ、ヒツジ、ブタなどの産生哺乳類である。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＡＤＡポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＡＫ２ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＰＮＰポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＡＤＡポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＡＫ２ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＰＮＰポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列（複数）の好ましくない配列（複数）から所望の配列（複数）への修正をもたらす。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ポリヌクレオチド配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＡＤＡ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＡＫ２配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＣＤ３Ｄ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＩＬ２ＲＧ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＩＬ７Ｒ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＪＡＫ３配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＬＩＧ４配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＮＨＥＪ１配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＰＮＰ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＰＲＫＤＣ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＲＡＧ１配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＲＡＧ２配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＺＡＰ７０配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＨＢＢ配列（複数）に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）が対応する正常な野生型ＨＢＢ配列（複数）に修正される。いくつかの実施形態では、各改変は、同型接合改変である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約５％から約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約１０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約３０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での改変効率は約５０％から約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約８０％以上である。
いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＡＤＡ部分（例えば、ＡＤＡ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＡＫ２部分（例えば、ＡＫ２遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＡＫ２の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＣＤ３Ｄ部分（例えば、ＣＤ３Ｄ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＣＤ３Ｄの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＤＣＬＲＥ１Ｃ部分（例えば、ＤＣＬＲＥ１Ｃ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＤＣＬＲＥ１Ｃの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＩＬ２ＲＧ部分（例えば、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＩＬ２ＲＧの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＩＬ７Ｒ部分（例えば、ＩＬ７Ｒ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＩＬ７Ｒの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＪＡＫ３部分（例えば、ＪＡＫ３遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＪＡＫ３の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＬＩＧ４部分（例えば、ＬＩＧ４遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＬＩＧ４の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＮＨＥＪ１部分（例えば、ＮＨＥＪ１遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＮＨＥＪ１の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＰＮＰ部分（例えば、ＰＮＰ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＰＮＰの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＰＲＫＤＣ部分（例えば、ＰＲＫＤＣ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＰＲＫＤＣの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＲＡＧ１部分（例えば、ＲＡＧ１遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＲＡＧ１の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＲＡＧ２部分（例えば、ＲＡＧ２遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＲＡＧ２の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＺＡＰ７０部分（例えば、ＺＡＰ７０遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＺＡＰ７０の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、複数の異なるＨＢＢ部分（例えば、ＨＢＢ遺伝子内の１つ以上の突然変異）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列（複数）は、ＨＢＢの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Ｇから始まる２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態において、各標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態において、各標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように各標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように各標的モチーフが選択される。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（複数）の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、二本鎖である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＡＤＡ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＡＤＡ配列に対応する正常または野生型ＡＤＡ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＡＫ２配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＡＫ２配列に対応する正常または野生型ＡＫ２配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＣＤ３Ｄ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＣＤ３Ｄ配列に対応する正常または野生型ＣＤ３Ｄ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列に対応する正常または野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＩＬ２ＲＧ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＩＬ２ＲＧ配列に対応する正常または野生型ＩＬ２ＲＧ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＩＬ７Ｒ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＩＬ７Ｒ配列に対応する正常または野生型ＩＬ７Ｒ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＪＡＫ３配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＪＡＫ３配列に対応する正常または野生型ＪＡＫ３配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＬＩＧ４配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＬＩＧ４配列に対応する正常または野生型ＬＩＧ４配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＮＨＥＪ１配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＮＨＥＪ１配列に対応する正常または野生型ＮＨＥＪ１配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＰＮＰ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＰＮＰ配列に対応する正常または野生型ＰＮＰ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＰＲＫＤＣ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＰＲＫＤＣ配列に対応する正常または野生型ＰＲＫＤＣ配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＲＡＧ１配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＲＡＧ１配列に対応する正常または野生型ＲＡＧ１配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＲＡＧ２配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＲＡＧ２配列に対応する正常または野生型ＲＡＧ２配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＺＡＰ７０配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＺＡＰ７０配列に対応する正常または野生型ＺＡＰ７０配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、正常または野生型ＨＢＢ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＨＢＢ配列に対応する正常または野生型ＨＢＢ配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ＨＢＢ配列に対応する正常または野生型ＨＢＢ配列である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク（例えばＣａｓ９）質は、複数のリボ核酸と複合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｃａｓタンパク質及び複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｃａｓタンパク質及び複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸及び複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸及び複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようにＣａｓタンパク質をコードする修飾合成ｍＲＮＡ及び修飾合成ＲＮＡを含む少なくとも１つの複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようにＣａｓ９タンパク質をコードする修飾合成ｍＲＮＡ及び修飾合成ＲＮＡを含む少なくとも１つの複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、１つの標的ポリヌクレオチド配列の複数の改変）以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列（複数）（例えば、複数の標的ポリヌクレオチド配列の１つ以上の改変）以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているＣａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１〜１５のリボ核酸配列及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、上記の複数のリボ核酸の異なる配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。
例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、複数のリボ核酸の配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１２のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１３のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１４のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１５のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１６のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１７のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１８のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１９のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも２０のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴを含む。
任意のＣａｓタンパク質またはリボ核酸は、プラスミドから発現し得ることは理解するべきである。いくつかの実施形態では、任意のＣａｓタンパク質またはリボ核酸は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）内での発現を増加させるために最適化されたプロモーターを用いて発現させる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明の本方法は、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することを更に含む。本発明は、細胞を選択する任意の好適な方法を企図する。いくつかの実施形態では、細胞を選択することにはＦＡＣＳが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳを使用して、Ｃａｓタンパク質及び緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質を共発現する細胞を選択する。
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連するさまざまな疾患を処置及び／または予防すること企図する。本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加並びに標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少に関連する疾患の処置または予防を行うことができることは理解すべきである。標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加及び減少としては、正常な発現及び／または活性レベルと比較して、標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルがそれぞれ増加または減少する状況並びに機能及び／または標的ポリヌクレオチド配列の発現生成物の活性レベルがそれぞれ増加または減少する状況が挙げられる。当業者は、本明細書に記載の方法を適用するか、または組成物を投与した後、関連のある細胞内において標的ポリヌクレオチド配列（またはその発現生成物）のレベル及び／または活性が減少しているかを判断することによって、標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加に関連する疾患を治療または予防することが評価され得ることを理解するであろう。当業者は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少に関連する疾患を治療または予防することは、本明細書に記載の方法を適用するか、または組成物を投与した後、関連のある細胞内において標的ポリヌクレオチド配列（またはその発現生成物）のレベル及び／または活性が増加しているかを判断することによって評価され得ることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は一遺伝性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は多重遺伝子性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は１つ以上のＳＮＰと関連した疾患である。１つ以上のＳＮＰに関連する例示的疾患としては、米国特許第７，６２７，４３６号に記載の複合病、国際出願公開ＷＯ／２００９／１１２８８２号に記載のアルツハイマー病、米国特許明細書第２０１１／００３９９１８号に記載の炎症性疾患、米国特許明細書第２０１２／０３０９６４２号に記載の多嚢胞性卵巣症候群、米国特許第７，７３２，１３９号に記載の心臓血管系疾患、米国特許明細書第２０１２／０１３６０３９号に記載のハンチントン病、欧州特許明細書公開第ＥＰ２５３５４２４号に記載の血栓塞栓症、国際出願公開ＷＯ／２０１２／００１６１３号に記載の神経血管性疾患、米国特許明細書第２０１０／０２９２２１１号に記載の精神病、米国特許明細書第２０１１／０３１９２８８号に記載の多発硬化症、国際出願公開ＷＯ／２００６／０２３７１９Ａ２に記載の統合失調症状、分裂情動障害及び双極性障害、米国特許明細書第号２０１１／０１０４６７４号に記載の双極性障害及び他の病気、国際出願公開ＷＯ／２００６／１０４３７０Ａ１号に記載の大腸癌、米国特許公開第２００６／０２０４９６９号に記載のＡＫＴ１遺伝子座に近接するＳＮＰに関連する疾患、国際出願公開第ＷＯ／２００３／０１２１４３Ａ１号に記載の摂食障害、米国特許公開第２００７／０２６９８２７号に記載の自己免疫病、米国特許第７，７９０，３７０号に記載のクローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）患者の線維性狭窄疾患及び米国特許第８，１８７，８１１号に記載のパーキンソン病などが挙げられ、それぞれ全体が参照によって本明細書に援用される。本発明の方法に従って処置または予防され得る１つ以上のＳＮＰに関連する他の疾患は、当事者には明かである。
いくつかの実施形態では、疾患は重度複合免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患は中程度のＸ連鎖性複合免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患はＸ連鎖性重度複合免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患はアデノシン脱アミノ酵素欠乏またはアデノシン脱アミノ酵素欠乏関連ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患はＡｔｈａｂａｓｃａｎ型ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患はＴ細胞−陰性、Ｂ細胞／ナチュラルキラー細胞陽性ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患はＴ陰性／Ｂ陽性型常染色体劣性ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患は電離放射線過敏症を伴うＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患は小頭症、成長遅滞及び電離放射線過敏症を伴うＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患は細網異形成症である。いくつかの実施形態では、疾患はＬＩＧ４症候群である。いくつかの実施形態では、疾患はγ／δＴ細胞増加、重症サイトメガロウイルス感染及び自己免疫を伴うα／βＴ細胞リンパ球減少症である。いくつかの実施形態では、疾患は肉芽腫を伴う複合型細胞性免疫不全及び体液性免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患はＢ細胞陰性ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患は選択的Ｔ細胞欠損症またはＳＣＩＤに関連する選択的Ｔ細胞欠損症である。いくつかの実施形態では、疾患はプリンヌクレオシドホスホリル欠損症またはプリンヌクレオシドホスホリル欠損症関連ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患はオーメン症候群である。いくつかの実施形態では、疾患は不全リンパ球症候群である。いくつかの実施形態では、疾患はＪＡＫ３突然変異関連ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患はＤＣＬＲＥ１Ｃ突然変異関連ＳＣＩＤである。いくつかの実施形態では、疾患は本明細書に列挙した遺伝子表現型関係表のいずれか１つに列挙されている疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球貧血症である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球症である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球貧血症である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状βサラセミアである。いくつかの実施形態では、疾患はβサラセミアである。
本発明の方法では、さまざまな異なる細胞中において標的ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、その後対象に導入するために、エキソビボで細胞中において標的ポリヌクレオチド配列（複数）を改変する。いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、インビボで細胞中において標的ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することができる。いくつかの実施形態では、細胞は末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞または多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８−系譜−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は一次ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非形質転換細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は腫瘍細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は形質転換細胞ではない。
いくつかの態様では、本発明は、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供し、該方法は、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内のＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列は切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である。
いくつの態様では、本発明は、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
いくつの態様では、本発明はヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミポリヌクレオチド配列が切断され、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、細胞中の標的βサラセミポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供し、該方法は、（ａ）ヒト多能性細胞、初代人細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を対応する正常なまたは野生型ポリヌクレオチド配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を対応する正常なまたは野生型ポリヌクレオチド配列と置き換えることができる。標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＡＤＡポリヌクレオチド配列を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＡＤＡポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＡＫ２ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＡＫ２ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＣＤ３Ｄポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＤＣＬＲＥ１Ｃポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＩＬ７Ｒポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＪＡＫ３ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＬＩＧ４ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＮＨＥＪ１ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＰＮＰポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＰＮＰポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＰＲＫＤＣポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＲＡＧ１ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＲＡＧ２ポリヌクレオチド配列を含む。
標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）がＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列（複数）を含む実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは、対応する野生型または正常なＺＡＰ７０ポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代人細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供し、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリッド形成され、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法を提供し、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、本方法には、切断した標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を対応する正常なまたは野生型配列（例えば、ＡＤＡ遺伝子、ＡＫ２遺伝子、ＣＤ３Ｄ遺伝子、ＤＣＬＲＥ１Ｃ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、ＩＬ７Ｒ遺伝子、ＬＩＧ４遺伝子、ＮＨＥＪ１遺伝子、ＰＮＰ遺伝子、ＰＲＫＤＣ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子、ＲＡＧ２遺伝子、ＺＡＰ７０遺伝因子）を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を対応する正常なまたは野生型配列（例えば、ＡＤＡ遺伝子、ＡＫ２遺伝子、ＣＤ３Ｄ遺伝子、ＤＣＬＲＥ１Ｃ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、ＩＬ７Ｒ遺伝子、ＬＩＧ４遺伝子、ＮＨＥＪ１遺伝子、ＰＮＰ遺伝子、ＰＲＫＤＣ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子、ＲＡＧ２遺伝子、ＺＡＰ７０遺伝因子）と置き換えることができる。
いくつの態様では、本発明は細胞中の複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断した標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、細胞中の複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断した標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞中においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を対応する正常なまたは野生型配列（例えば、ＡＤＡ遺伝子、ＡＫ２遺伝子、ＣＤ３Ｄ遺伝子、ＤＣＬＲＥ１Ｃ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、ＩＬ７Ｒ遺伝子、ＬＩＧ４遺伝子、ＮＨＥＪ１遺伝子、ＰＮＰ遺伝子、ＰＲＫＤＣ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子、ＲＡＧ２遺伝子、ＺＡＰ７０遺伝因子）を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を正常なまたは野生型配列（例えば、ＡＤＡ遺伝子、ＡＫ２遺伝子、ＣＤ３Ｄ遺伝子、ＤＣＬＲＥ１Ｃ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、ＩＬ７Ｒ遺伝子、ＬＩＧ４遺伝子、ＮＨＥＪ１遺伝子、ＰＮＰ遺伝子、ＰＲＫＤＣ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子、ＲＡＧ２遺伝子、ＺＡＰ７０遺伝因子）と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であり、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、（ａ）エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代人細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を改変することであって、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）が切断され、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の変化効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を正常なＨＢＢ配列を含む外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なＨＢＢ配列と置き換えることができる。
本発明は、細胞中に本発明のＣａｓタンパク質またはその官能性部分、Ｃａｓタンパク質またはその官能性部分をコードする核酸、及びＣａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチドの標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させるリボ核酸配列（複数）を含む組成物を提供する。
対象に投与する場合、本明細書にて開示した組成物は、例えば、薬学的に許容可能な組成物中で対象に投与され得る。薬学的に許容可能な組成物は、治療有効量の本発明のＣａｓタンパク質またはその官能性部分、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸（例えば、修飾合成ｍＲＮＡ）、及びＣａｓタンパク質を指向させ、かつハイブリッド形成させる、リボ核酸配列（複数）を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体（添加剤類）及び／または希釈剤と共に調合されて含む。
詳細に後述のように、本発明の医薬組成物は、次に適合する形態など、固体形態または液体形態で投与するために特別に配合されてもよい：（１）例えば、飲薬（水性溶液または非水性溶液、または懸濁液）、ロゼンジ、糖衣丸、カプセル、ピル、錠剤（例えば、頬、舌下、全身吸収を標的とするもの）、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト剤などの経口投与、（２）例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液、または徐放性製剤としての非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは硬膜外注入）、（３）局所投与（例えば、クリーム、軟膏剤若しくは徐放性パッチ、または皮膚に塗布する噴霧）、（４）腟内若しくは直腸内投与（例えば、膣座薬、クリーム、若しくは発泡体）、（５）舌下投与、（６）眼投与、（７）経皮的投与、（８）経粘膜的投与、または（９）経鼻投与。さらに、化合物は、患者に埋め込むことができるかまたは薬物送達系を用いて注入させることができる。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２４：１９９〜２３６（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ， ｅｄ．「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）、米国特許明細書第３，７７３，９１９号及び米国特許明細書第３５ ３，２７０，９６０号を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、健全な医学的判断の範囲内であり、ヒト及び動物の組織との接触に使用するのに好適であり、過度の毒性、炎症、アレルギー応答または他の問題若しくは合併症を有さず、正当な有益性／リスク比に相応である、これらの化合物、材料、組成物及び／または投薬形態を指す。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的に許容可能な物質、組成物または例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、カルシウム若しくはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸）などのビヒクル、または身体の１つの臓器若しくは一部から身体の別の臓器若しくは部分の対象化合物の担持若しくは運搬に伴う溶媒封入材料を指す。各担体は、製剤の他の成分と親和性があり、患者に有害ではないという意味で「許容可能」である必要がある。薬学的に許容可能な担体として機能し得るいくつかの材料の例としては、（１）糖（例えばラクトース、グルコース及びショ糖）、（２）デンプン（例えば、コーンスターチ、及び、バレイショデンプン）、（３）セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース及び酢酸セルロースなど）、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、硫酸ラウリルナトリウム及びタルク）、（８）賦形剤（例えばカカオバター及び坐薬ワックス）、（９）油（例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油）、（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）、（１１）多価アルコール（例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、（１２）エステル（例えばオレイン酸エチル及びエチルラウリン酸）、（１３）寒天、（１４）緩衝薬（例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質非含有水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／またはポリ無水物、（２２）増量剤、（例えばポリペプチド及びアミノ酸）（２３）血清成分（例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ）、（２２）Ｃ２〜Ｃ１２のアルコール（例えば、エタノール）、及び（２３）医薬組成物で使用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香料添加剤、芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤もまた配合物内に存在し得る。「賦形剤」「担体」「薬学的に許容される担体」という用語などは、本明細書では同義的に用いられる。
本明細書で使用するとき、本明細書に記載のＣａｓタンパク質及び／またはリボ核酸に関して、語「治療有効量の」という表現は、動物における少なくとも細胞の副集団において、任意の薬物療法に適用可能である正当な有益性／リスク比にて若干の所望の治療効果を生み出すために有効である、関連のあるタンパク質及び／若しくはリボ核酸またはこれら含む組成物の量を指す。例えば、鎌状細胞貧血症において少なくとも１つの症状（例えば、赤血球計数の減少）における統計上有意であり計測可能な変化を生み出すのに十分な対象ヘの投与量である。治療的有効量の決定は、十分当業者の能力の範囲内である。概して、治療的有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別並びに重症度及び対象における病状の型及び他の薬学的活性剤の投与に応じて変動し得る。
本明細書で使用するとき、「投与すること」という用語は、所望の効果を生み出すように組成物を所望の部位にて少なくとも一部局在化することになる方法または経路によって対象内に組成物を配置すること意味する。本明細書に記載の化合物または組成物は、限定されないが、経口経路または非経口経路（静脈内、筋肉内、皮下内、経皮内、気道内（エアゾール）、肺内、経鼻、直腸内及び局所（包含する頬側及び舌下）投与）など、当該技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。
例示的投与様式としては、限定されないが、注射、注入、滴注、吸入または経口摂取が挙げられる。「注射」としては、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、側脳室内脊髄及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。好ましい実施態様では、組成物は静脈内注射または注入によって投与される。
いくつの態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧを有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。
例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのいずれかに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、組成物中の少なくとも１つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、組成物中のリボ核酸のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載されるように、修飾リボ核酸である（例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む合成修飾リボ核酸、任意の他の修飾ヌクレオチドまたは本明細書に記載の改変）である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物はＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はＣａｓ９タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸は、本明細書に記載されるように、修飾リボ核酸（例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む本明細書に記載の合成修飾ｍＲＮＡ、または任意の他の修飾ヌクレオチドまたは本明細書に記載の改変）を含む。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図６のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図７のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図８のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図９のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧを有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。
例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１つの追加のリボ核酸配列のリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのいずれかの少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図６のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図７のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図８のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図９のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１つの追加のリボ核酸配列のリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧからなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、本明細書に記載の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分を含む。
インビボ法では、治療的有効量の本明細書に記載の組成物を、対象に投与し得る。組成物の対象への投与方法は、当技術分野において既知であり、かつ当業者は容易に利用可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連した疾患の治療または予防のための１つ以上の追加の薬学的活性剤を含む。
また、本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキット並びに本発明の組成物を含むキット、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列の改変のためのキットを用いるための指示書を提供する。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図２のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図３のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図４のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図５のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図６のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図７のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図８のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図９のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧを有する少なくとも１つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図２のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図３のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図４のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図５のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図６のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図７のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図８のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図９のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１０のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１１のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１２のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１３のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１４のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図１５のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記の単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図２の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図２のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図３の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図３のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図４の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図４のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図５の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図５のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図６の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図６のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図７の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図７のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図８の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図８のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図９の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図９のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１０の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１０のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１１の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１１のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１２の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１２のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１３の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１３のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１４の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１４のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１５の少なくとも１つのリボ核酸配列及び図１５のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１つのリボ核酸配列及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１つのリボ核酸配列から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸配列は、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まない。例えば、標的部位配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。別の例として、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、３つのヌクレオチドＮＧＧ配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のＧは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、または２０番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１２のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１３のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１３のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１４のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１４のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１５のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１５のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１６のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１６のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１７のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１７のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１８のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１８のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも１９のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも１９のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも２０のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図１〜１５のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧである場合、少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴである。
いくつかの実施形態では、上述の少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧの少なくとも１２のヌクレオチド断片、少なくとも１３のヌクレオチド断片、少なくとも１４のヌクレオチド断片、少なくとも１５のヌクレオチド断片、少なくとも１６のヌクレオチド断片、少なくとも１７のヌクレオチド断片、少なくともの１８のヌクレオチド断片、少なくとも１９のヌクレオチド断片または少なくとも２０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも１つのリボ核酸は、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも１２のヌクレオチド断片、少なくとも１３のヌクレオチド断片、少なくとも１４のヌクレオチド断片、少なくとも１５のヌクレオチド断片、少なくとも１７のヌクレオチド断片、少なくともの１８のヌクレオチド断片、少なくとも１９のヌクレオチド断片または少なくとも２０のヌクレオチド断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される１種以上の細胞株、培養液または集団を含む。いくつかの実施形態では、キットはＤＮＡ修復テンプレートを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＡＤＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＡＤＡ配列に対応する１つ以上の正常または野生型ＡＤＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＡＫ２遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＡＫ２配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＣＤ３Ｄ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＣＤ３Ｄ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＤＣＬＲＥ１Ｃ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＤＣＬＲＥ１Ｃ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＩＬ２ＲＧ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＩＬ７Ｒ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＩＬ７Ｒ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＪＡＫ３遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＪＡＫ３配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＮＨＥＪ１遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＮＨＥＪ１配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＰＮＰ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＰＮＰ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＰＲＫＤＣ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＰＲＫＤＣ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＲＡＧ１遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＲＡＧ１配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＲＡＧ２遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＲＡＧ２配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＺＡＰ７０遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＺＡＰ７０配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、１つ以上の正常または野生型ＨＢＢ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＨＢＢ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートは、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）から切断される変異体ＨＢＢ配列（複数）に対応する１つ以上の正常または野生型ＤＮＡ遺伝子配列を含む。
本発明の方法、組成物及びキットには、Ｃａｓタンパク質及び／または本発明のリボ核酸を細胞に送達させるか、または導入するためのビヒクルとしてナノ粒子または脂質ナノ粒子を使用できる点を理解すべきである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む。
カオチン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレシルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイロキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレ二ルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２-Ｎ，Ｎジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮＹ−１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、または、その混合物であってもよい。
ほぼ生理学的ｐＨで実効正電荷を運搬する、他のカチオン性脂質も、上記に具体的に記述したものに加えて、本発明の脂質粒子に含まれ得る。このようなカチオン性脂質類としては、限定さないが、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３．ベータ（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣＣｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、並びにこれらの混合物が挙げられる。さらに、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより市販）など）、並びにＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより市販）を含む）などの市販のカチオン性脂質の調製物をいくつか使用することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。
本明細書で使用するとき、「アミノ脂質」という用語は、１つまたは２つの脂肪酸鎖または脂肪アルキル基鎖及びプロトン化して生理学的ｐＨでカチオン性脂質を形成し得るアミノ頭部基（アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基など）を有するこれらの脂質を包含することが意図される。
他のアミノ脂質は、代替的脂肪酸基及びアルキル置換基が異なる（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）ものなどの他のジアルキルアミノ基を有するようなものが挙げられる。Ｒ１１及びＲ１２がいずれも長鎖アルキル基またはアシル基であるこれらの実施形態では、これらは同一であってもまたは異なっていてもよい。一般に、ろ過滅菌のために、特に、錯体のサイズを約０．３マイクロメートル未満にする必要がある場合、より容易に飽和の少ないアシル鎖を有するアミノ脂質のサイズにすることができる。Ｃ１４からＣ２２の範囲内の炭素鎖長さを有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が好ましい。また、他のスカフォールドを使用し、アミノ基及びアミノ脂質の脂肪酸または脂肪アルキル基部分とを分離することができる。好適なスカフォールドは、当業者に既知である。
本発明で有用なＰＥＧ修飾脂質（または脂質ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体例は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定するさまざまな「アンカー」脂質部分を有し得る。好適なＰＥＧ修飾脂質の実施例としては、ＰＥＧ−修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）（参照によって本明細書に援用される米国特許明細書第５，８２０，８７３号）、ＰＥＧ−修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ−修飾ｌ，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールが特に好ましい。
好適な中性脂質の例としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、その最も広い範囲において「核酸」としては、ホスホジエステラーゼ結合を介して結合されるヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質が挙げられる。例示的核酸としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸類（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸類（ＰＮＡ）、ロックド核酸類（ＬＮＡ）またはこれらのハイブリッドが挙げられる。また、これらとしては更に、ＲＮＡｉ−誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ，ｔＲＮＡ，三重らせん形成体、アプタマー、ベクターなどを誘発するＲＮＡも挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、修飾核酸（例えば、本明細書に記載の合成修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明は、当業者が利用可能な任意の核酸修飾を使用することを企図する。本発明のリボ核酸は、任意の数の改変を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ピリジン−４ーオンーリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオプソイドウリジン、２−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ウィオシン、ウィブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオグアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６チオグアノシン、並びにその組合せからなる群から選択される１つ以上の改変を含む。
修飾ヌクレオシド及び本発明の修飾ＲＮＡの製造または合成に使用されるヌクレオチドの調製には、種々の化学基の保護及び脱保護を伴う。保護及び脱保護の必要性及び適切な保護基の選択は、当業者によって容易に判定され得る。
保護基の化学については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ． Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１に見出すことができ、これは、参照によってその全体が本明細書に援用される。
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４：２５８５〜２５８８， ２００９；Ｐｕｒｍａｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（１）：７２〜７８，１９９４；Ｆｕｋｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １（４）：５６３〜５６８，１９６２；ａｎｄ Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８（９）：１７２９〜１７４０，１９９２に記載されている合成方法に従って調製することができ、これらはそれぞれ、参照によってその全体が援用される。
修飾核酸（例えば、リボ核酸）は、分子の全長に沿って均一に修飾させる必要はない。異なるヌクレオチド改変及び／または主鎖構造は、核酸内の種々の位置に存在し得る。当業者は、ヌクレオチド類似体または他の改変（複数可）は、核酸の機能を実質的に低下させることのないように核酸の任意の位置（複数可）に配置され得ることを理解するであろう。また、改変は、５’または３’末端改変であってもよい。核酸は、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチドまたはその間の任意の割合（例えば少なくとも５０％修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％修飾ヌクレオチドなど）で含有してもよい。
いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、１つから２つのリボ核酸はそれぞれ、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸の少なくとも１つは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は修飾されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸の複数はそれぞれ修飾されている。当業者は、修飾リボ核酸は、本明細書に記載の１つ以上の核酸修飾を含み得ることを理解するであろう。
いくつの態様では、本明細書に提供されているものはポリぺプチドをコードする合成修飾ＲＮＡ分子であり、合成修飾ＲＮＡ分子は、合成修飾ＲＮＡ分子を細胞に導入することによって、１つ以上の改変を含まないポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子と接触させた細胞に対する先天性免疫応答の低下となるように、１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はタンパク質をコードする合成修飾ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＣａｓ９タンパク質をコードする合成修飾ＲＮＡ分子を含む。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡとしては、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる急速な悪化を予防するための及び細胞のＲＮＡに対する先天性免疫応答またはインターフェロン応答の回避または低減を行うための改変が挙げられる。改変としては、限定されないが、例えば以下が挙げられる。（ａ）末端部改変（例えば、５’末端部改変（リン酸化脱リン酸化、コンジュゲート、逆結合など）、３’末端部改変（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、（ｂ）塩基改変（例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または拡大したパートナーレパートリーと塩基対である塩基またはコンジュゲート塩基との置換物）、（ｃ）糖の改変（例えば、２’位または４’位にて）または糖の置換、並びに（ｄ）ホスホジエステラーゼ結合の改変または置換などのヌクレオシド間連結改変。こうした改変が翻訳に介在する範囲では（すなわち、改変がない場合（例えば、ウサギの網状赤血球インビトロ翻訳アッセイにおいて）と比較して５０％以上の翻訳の低減となる）、変形は本明細書に記載の方法及び組成物にとって好適ではない。本明細書に記載の方法と共に有用な合成修飾ＲＮＡ組成物の具体例としては、限定されるものではないが、修飾されているか、または非天然ヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡ分子が挙げられる。修飾ヌクレオシド間連結を有する合成修飾ＲＮＡとしては、とりわけ、ヌクレオシド間連結にリン原子を有しないものが挙げられる。他の実施形態では、合成修飾ＲＮＡはそのヌクレオシド間連結（複数可）内にリン原子を有する。
修飾ヌクレオシド間連結の非限定的例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートなど）、及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートなど）、及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びにこれらの類似体に連結される正常な３’−５’連結、２’−５’連結を有する及びヌクレオシド単位の近接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に連結される逆極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。また、種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も挙げられる。
それぞれが上記のリン−含有連結の調製を教示している代表的な米国特許明細書としては、限定されないが、米国特許明細書第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９５号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３１６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号、同第６，０２８，１８８号、同第６，１２４，４４５号、同第６，１６０，１０９号、同第６，１６９，１７０号、同第６，１７２，２０９号、同第６，２３９，２６５号、同第６，２７７，６０３号、同第６，３２６，１９９号、同第６，３４６，６１４号、同第６，４４４，４２３号、同第６，５３１，５９０号、同第６，５３４，６３９号、同第６，６０８，０３５号、同第６，６８３，１６７号、同第６，８５８，７１５号、同第６，８６７，２９４号、同第６，８７８，８０５号、同第７，０１５，３１５号、同第７，０４１，８１６号、同第７，２７３，９３３号、同第７，３２１，０２９号、及び米国特許明細書ＲＥ３９４６４が挙げられ、そのすべての内容全体を参照によって援用される。
リン原子を含まない修飾ヌクレオシド間連結は、短鎖アルキル基によって形成されるヌクレオシド間連結、またはシクロアルキル基ヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル基またはシクロアルキル基ヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間連結を有する。これらとしては、シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部を有する他の主鎖など、（ヌクレオシドの糖部分から一部形成された）モルホリノ連結を有するものが挙げられる。
修飾オリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許明細書としては、限定されないが、米国特許明細書第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，６７７，４３９号が挙げられ、そのすべての内容全体を参照によって援用される。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡのいくつかの実施形態としては、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する核酸、へテロ原子ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオシド、及び特に−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）若しくはＭＭＩとして公知］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［未変性ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］が挙げられ、上記は米国特許明細書第５，４８９，６７７号を参照し、上記アミド主鎖は、米国特許明細書第５，６０２，２４０号を参照しており、そのいずれもの全体が、参照によって本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本明細書において機能する核酸配列は、モルホリノ主鎖構造を有し、これは、米国特許明細書第５，０３４，５０６号を参照しており、その内容全体を参照によって本明細書に援用される。
また、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、１つ以上の置換された糖部分を含んでもよい。本明細書において機能する核酸としては、２’位に以下の１つを含むことができ：Ｈ（デオキシリボース）基；ＯＨ（リボース）基；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮまたはＮ−アルキル基；Ｏ−，Ｓ−またはＮ−アルケニル基；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル基；またはＯ−アルキル基−Ｏ−アルキル基、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基またはＣ２〜Ｃ１０アルケニル基及びアルキニル基であってもよい。例示的改変としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡとしては、２’位での以下の１つが挙げられる：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル基、置換低級アルキル基、アルカリル基、アラルキル基、Ｏ−アルカリル基またはＯ−アラルキル基、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリル基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、レポーター基、インターカレーター基、ＲＮＡの薬物動態学特性を改善するための基または合成修飾ＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、改変としては、２’メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知の２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６〜５０４）すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。別の例示的改変は２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２’−ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（また、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして当該技術分野において公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の改変としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。また、核酸配列の他の位置、特に３’端末ヌクレオチドの糖の３’位、または２’−５’結合ヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位で類似の改変が行われてもよい。合成修飾ＲＮＡもまた、ペントフラノシル糖の代わりに例えばシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許明細書としては、限定されないが、米国特許明細書第米国特許明細書第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７００，９２０号が挙げられ、そのうちのある特定のものは、一般に本願発明と共に所有され、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用される。
非限定的例としては、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡとしては、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレオシド、モルフォリノヌクレオシド、ホスホラミデートまたはヌクレオシドを含む非天然塩基またはこれらの任意の組み合わせなどの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを挙げることができる。
本明細書に記載のこの態様及び他のすべてのこうした態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、プセウドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）及びイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。
あるいは、合成修飾ＲＮＡは、少なくとも２つの修飾ヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上、ヌクレオシドの全長までの修飾ヌクレオシドを含むことができる。最低でも、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む合成修飾ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるような改変を有する単一のヌクレオシドを含む。均一に修飾される所与の合成修飾ＲＮＡでは、すべての位置について必須ではなく、実際に、２つ以上の上述の改変は、１つの合成修飾ＲＮＡにまたは合成修飾ＲＮＡ内の１つのヌクレオシドに導入することができる。しかし、分子内の所与のヌクレオシドのそれぞれの発生が修飾される（例えば、それぞれのシトシンは、修飾シトシン（例えば、５ｍＣ）である）ことが好ましいが、必須ではない。しかし、同一ヌクレオシドの異なる発生が所与の合成修飾ＲＮＡ分子（例えば、５ｍＣなどで修飾されたいくつかのシトシン、２’−Ｏ−メチルシチジンとして修飾された他のものまたは他のシトシン類似体など）において異なる方法で修飾され得ることも検討される。改変は、合成修飾ＲＮＡ中の複数の修飾ヌクレオシドがそれぞれ同一である必要はない。更に、本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡは、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオシドを含む。更に、本明細書に記載の態様のいくつかのこうした好ましい実施形態では、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオシドは５−メチルシチジン及びプセウドウリジンである。また、合成修飾ＲＮＡは、修飾及び未改質ヌクレオシドの双方の混合物を含有し得る。
本明細書で使用するとき、「未改質」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）修飾または置換を含む。修飾ヌクレオシドしては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル，４（チオ）プソイドウラシル，２，４−（ジチオ）プソイドウラシル，５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）−プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニルｌ）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラアセニル、ペントアセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール、４−（メチル）ベンズイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジンオン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、０６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルソ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イルビス−オルソ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルソ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルソ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、またはこれらの任意のＯ−アルキル化若しくはＮ−アルキル化誘導体などの他の合成及び天然ヌクレオ塩基が挙げられる。また、修飾ヌクレオシドとしては、コンジュゲート部分（例えば、リガンド）を含む天然塩基も更に挙げられる。本明細書において上記で検討するとおり、修飾ヌクレオシド含有ＲＮＡは、宿主細胞中において翻訳可能であるものとする（すなわち、修飾ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの翻訳が阻害されることはない）。例えば、ｓ２Ｕ及びｍ６Ａ含有転写物は、ウサギ網状赤血球溶血液での翻訳は良好でなく、プソイドウリジン、ｍ５Ｕ及びｍ５Ｃが効率的な翻訳に適合する。加えて、転写物のヌクレアーゼ耐性の増大に有用な２’−フルオロ−修飾塩基は、非常に非効率な翻訳となることが当業者に公知である。当業者は、例えば、ウサギ網状赤血球溶血液翻訳アッセイなどを用いて、翻訳を解析することができる。
更なる修飾ヌクレオ塩基としては、米国特許明細書第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ． ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されているもの、２００９年３月２６日出願の国際公開特許ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３８，４２５に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ． Ｌ，ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、及びＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているものが挙げられる。
ある特定の上述の修飾ヌクレオ塩基並びに他の修飾ヌクレオ塩基の調製を教示している代表的米国特許明細書は、限定されないが、上述の米国特許明細書第３，６８７，８０８号並びに米国特許明細書第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５７，１９１号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号，同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第６，０１５，８８６号、同第６，１４７，２００号、同第６，１６６，１９７号、同第６，２２２，０２５号、同第６，２３５，８８７号、同第６，３８０，３６８号、同第６，５２８，６４０号、同第６，６３９，０６２号、同第６，６１７，４３８号、同第７，０４５，６１０号、同第７，４２７，６７２号、及び同第７，４９５，０８８号（そのすべての内容全体が参照によって援用され）、及び米国特許明細書第５，７５０，６９２号（その内容全体が参照によって本明細書に援用される）が挙げられる。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡと共に使用する別の改変としては、ＲＮＡとＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを改善する１つ以上のリガンド、部分またはコンジュゲートとの化学的連結を含む。リガンドは、例えば、インビボで合成修飾ＲＮＡを投与する場合に特に有用であり得る。こうした部分は、限定されないがコレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６： ６５５３〜６５５６、その全体が、参照によって本明細書に援用される）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３〜１０６０その全体が、参照によって本明細書に援用される）、チオエーテル（例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６〜３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５〜２７７０、そのすべての内容全体を参照によって援用され）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３〜５３８、その全体が、参照によって本明細書に援用される）、脂肪鎖（例えば、ドデカジオール残基またはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１，１０：１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９〜５４、そのすべての内容全体を参照によって援用され）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１〜３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７〜３７８３、そのすべての内容全体を参照によって援用され）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９〜９７３、その全体が、参照によって本明細書に援用される）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１〜３６５４、その全体が、参照によって本明細書に援用される）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９〜２３７、その全体が、参照によって本明細書に援用される）、またはオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３〜９３７、その全体が、参照によって本明細書に援用される）が挙げられる。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、５’キャップを更に含むことができる。本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡは、５’−５’トリホスフェート連結を用いて、ＲＮＡ分子の５’末端部に連結された修飾グアニンヌクレオチドを含む５’キャップを含む。また、本明細書で使用するとき「５’キャップ」という用語は、例えば、５’ジグアノシンキャップ、メチレン−ビス（ホスホネート）部分を有するテトラホスフェートキャップ類似体（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ， Ａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ７（２２）：４７６３〜７６を参照されたい）、チオリン酸塩改変を有するジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＲＮＡ １４（６）：１１１９〜１１３１を参照されたい）、非架橋酸素のための硫黄置換基を有するキャップ類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＲＮＡ １３（１０）：１７４５〜１７５５を参照されたい）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＲＮＡ １０（９）：１４７９〜１４８７を参照されたい）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．，（２００３）ＲＮＡ ９（９）：１１０８〜１１２２及びＳｔｅｐｉｎｓｋｉ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ７（１０）：１４８６−１４９５を参照されたい）など他の５’キャップ類似体を包含することを意図する。こうした一実施形態では、５’キャップ類似体は、５’ジグアノシンキャップである。いくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡは、５’トリホスフェートを含まない。
５’キャップは、ｍＲＮＡを認識してリボソームに付着し、翻訳開始に重要である。また、５’キャップは、合成修飾ＲＮＡをエキソヌクレアーゼ媒介分解から保護する。合成修飾ＲＮＡは５’キャップを含むことは必須ではなく、このため、他の実施形態では合成修飾ＲＮＡは５’キャップが欠失している。しかし、５’キャップを含む合成修飾ＲＮＡの半減期が長く、翻訳効率が上昇するという理由から、本明細書では、５’キャップを含む合成修飾ＲＮＡが好ましい。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を更に含む。非翻訳領域は、開始コドン（５’）前及び停止コドン（３’）後のＲＮＡ領域であり、このため、翻訳機構により翻訳されることはない。非翻訳領域は、リボヌクレアーゼ及びＲＮＡ分解に伴う他のタンパク質と干渉し得るために、１つ以上の非翻訳領域を有するＲＮＡ分子の改変によりｍＲＮＡの安定性が向上され得る。加えて、５’及び／または３’非翻訳領域を有するＲＮＡの改変は、ｍＲＮＡへのリボソーム結合を改変する結合タンパク質によって翻訳効率を向上させ得る。３’ＵＴＲを有するＲＮＡの改変を使用して、ＲＮＡの細胞質局在化を維持することができ、細胞の細胞質内で翻訳が発生し得る。一実施形態では、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含まない。一実施形態では、合成修飾ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲをいずれか含む。別の実施形態では、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、５’及び３’ＵＴＲをいずれも含む。一実施形態では、５’及び／または３’ＵＴＲは、細胞中（例えば、ネズミα−グロビン３’ＵＴＲ）において高安定性を有することが判明しているｍＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはその両方は１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、コザック配列を更に含む。「コザック配列」とは、コンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ配列番号：１４８１を有する真核ｍＲＮＡ上の配列を意味し、Ｒは開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、その後に別の「Ｇ」が続く。コザックコンセンサス配列は、リボソームによって認識され、ポリペプチドの翻訳が開始される。典型的には、転写物の５’末端の近位にある翻訳機構によって出会う最初のＡＵＧコドンで開始する。しかし、場合によっては、このＡＵＧコドンは、読み漏らしと称されるプロセスにおいてバイパスされ得る。ＡＵＧコドン付近にコザック配列が存在することにより、正確なポリペプチドの翻訳が生じるように、翻訳開始部位としてそのコドンが強化される。更に、コザック配列を合成修飾ＲＮＡに付加すると、たとえ、開始コドンに関する曖昧性がないとしても、更に効率のよい翻訳が促進されることになる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、翻訳を開始する所望の部位でコザックコンセンサス配列を更に含み、正確な長さのポリペプチドを作成する。いくつかの実施形態では、コザック配列は１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、「ポリ（Ａ）テイル」を更に含み、これは、アデニンヌクレオチドの３’ホモポリマーテイルを指し、長さが変動してもよく（例えば、少なくとも５つのアデニンヌクレオチド）、最大数百のアデニンヌクレオチドとなってもよい。３’ポリ（Ａ）テイルを包含することによって、合成修飾ＲＮＡを細胞中の分解から保護することができ、また、核外局在化が促進され、翻訳効率が向上し得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは１〜５００のアデニンヌクレオチドを含み、他の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００、またはそれ以上のアデニンヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは１〜１５０アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは９０〜１２０アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡへの１つ以上の改変により、細胞中において合成修飾ＲＮＡの安定性が更に増すと考えられている。こうした改変が、翻訳が可能であり、合成修飾ＲＮＡに対する細胞の先天性免疫応答またはインターフェロン応答を減少させるか、または悪化させない限り、そのような修飾は本明細書での使用が特定的に企図される。概して、合成修飾ＲＮＡの安定性が高いほど、その合成修飾ＲＮＡから多くのタンパク質が産生され得る。典型的には、細胞タンパク質がＡＵ富化領域に動員され、転写物のポリ（Ａ）テイルの除去が刺激されるので、、哺乳類ｍＲＮＡにＡＵ富化領域が存在することによって転写物を不安定化させる傾向にある。合成修飾ＲＮＡのポリ（Ａ）テイルが欠失することにより、ＲＮＡ分解が増加し得る。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されるように、合成修飾ＲＮＡは、ＡＵ富化領域を含まない。特に、３’ＵＴＲは実質的に、ＡＵＵＵＡ配列要素を欠いていることが好ましい。
一実施形態では、リガンドにより、それが取り込まれる合成修飾ＲＮＡの細胞取り込み、細胞内標的または半減期が変化する。いくつかの実施形態では、リガンドにより、例えばこうしたリガンドなどのない組成物と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞または細胞型）、細胞内コンパートメント（例えば、ミトコンドリア、細胞質、ペルオキシソーム、リソソーム）に対する親和力の向上がもたらされる。好ましいリガンドは、合成修飾ＲＮＡ由来のポリペプチドの発現に干渉しない。
リガンドとしては、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、若しくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、または脂質などの天然物質を挙げることができる。また、リガンドは組み換え体または例えば合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）などの合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬ）、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリフォスファジン（polyｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド擬態ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαらせん型ペプチドが挙げられる。
リガンドとしては、例えば、細胞標的剤（例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質若しくはタンパク質）または線維芽細胞などの特定の細胞型に結合する抗体などの標的基も更に挙げることができる。標的基としては、例えば、とりわけ、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド擬態体であってもよい。
他のリガンドの例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１、３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１、３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（Ｏ３−（ｏｌｅｏｙｌ）ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、または、フェノキサジン）、及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、並びに輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）が挙げられる。
リガンドは、糖タンパク質などのタンパク質、ペプチド（例えば、コ−リガンドに対して特定の親和力を有する分子）、若しくは抗体（例えば、線維芽細胞など指定の細胞型に結合する抗体）、またはポリペプチドの生成に有用な他の細胞であってもよい。また、リガンドとしては、ホルモン及びホルモンレセプターを挙げることができる。また、非ペプチド種（例えば脂質、レクチン、炭化水素、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコース）も挙げることができる。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって（例えば、細胞の微小管、ミクロフィラメント及び／または中間体フィラメントを破壊することによって）、例えば合成修飾ＲＮＡまたはそれらの組成物の細胞への取り込みが増加し得る薬剤などの物質であってもよい。薬剤は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ Ａ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であってもよい。
１つの例示的リガンドは、脂質または脂質系分子である。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）分解への耐性の増大及び／または（ｂ）標的細胞若しくは細胞膜への標的若しくは輸送の増大が可能である。脂質系リガンドを使用して、例えば修飾ＲＮＡ組成物の標的細胞への結合を調節することができる。
別の態様では、リガンドは部分（例えば、宿主細胞によって取り込まれるビタミン）である。例示的ビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが挙げられる。他の例示的ビタミンとしては、ビタミンＢ（例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサルまたは例えば癌細胞によって取り込まれる他のビタミン若しくは栄養素）が挙げられる。また、ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
別の態様では、リガンドは細胞透過剤、好ましくはらせん型細胞透過剤である。薬剤は両親媒性であることが好ましい。例示的薬剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、ペプチド擬態体、逆転異性体、非ペプチド結合若しくはプソイド−ペプチド結合及びＤ−アミノ酸の使用など、改変され得る。らせん型薬剤は、好ましくは、α−らせん型薬剤であり、好ましくは、親油性相及び疎油性相を有する。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞（例えば、微生物細胞（例えば細菌細胞または真菌細胞）若しくは哺乳類細胞（ヒト細胞など）など）の透過が可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−らせん型直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７若しくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン若しくはバクテネシン）または１つ若しくは２つの重要アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９若しくはインドリシジン）であってもよい。例えば、細胞透過性ペプチドは、二連の（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）両親媒性ペプチド（ＭＰＧなど）であってもよく、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとの融合ペプチドドメインから誘導される（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
本明細書に記載の合成修飾ＲＮＡは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）に記述されている方法など、当該分野において確立されている方法によって合成及び／または修飾することができ、これらは、本明細書によってその全体が、参照によって援用される。転写方法は、本明細書の実施例において更に記載されている。
本明細書に記載の態様の一実施形態では、合成修飾ＲＮＡ用のテンプレートは、「ｓｐｌｉｎｔ介在ライゲーション」を用いて合成し、長オリゴ及び／またはｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物の制御された連結により、結合領域で制限酵素認識部位を導入する必要なくＤＮＡ構造体の迅速な合成を可能にする。これは、Ｔ７テンプレートの生成中に遺伝性非翻訳領域（ＵＴＲ）を遺伝子コード配列に加えるために使用することができる。また、Ｓｐｌｉｎｔ介在ライゲーションを使用して、核の局在化配列をオープンリーディングフレームに添加することができ、また野生型オープンリーディングフレームから開始する点変異により優性ネガティブ構造体を産生することができる。要約すると、一本鎖及び／または変性ｄｓＤＮＡ構成要素が、所望の末端部をコンジュゲートに入れるｓｐｌｉｎｔオリゴにアニーリングされ、熱安定性ＤＮＡリガーゼ及びＰＣＲによって増幅される所望の構造体によって末端部がライゲートされる。次に、テンプレートからインビトロでＲＮＡポリメラーゼを用いて合成修飾ＲＮＡを合成する。合成修飾ＲＮＡの合成完了後、ＤＮＡテンプレートは、本明細書に記載の方法により用いる前に転写反応物から取り除く。
これらの態様のいくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡはアルカリホスファターゼにより更に処理される。
当業者は、本発明が目的の実施及び上記の並びに本明細書内に本来備わる目的及び利点を得るのに十分に適応していることを容易に理解する。本明細書内の詳細な説明及び例は、ある特定の実施形態の代表であり、例示であり、かつ本発明の範囲に対して制限することを意図するものではない。その中の変化形態及び他の使用は、当業者において発生する。これらの変化形態は、本発明の趣旨内に包含される。当業者は、本明細書の範囲及び趣旨を逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して置換及び変化形態の変更が行われ得ることを速やかに理解するであろう。
本明細書で使用するとき、本明細書及び特許請求の範囲において冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、複数形を含むことを理解するべきである。ただし、明確に単数形であることが示されている場合を除く。任意の群の１つ以上の員を含むか、「または」任意の群の１つ以上の員の間にある特許請求の範囲または説明は、特に別に示されない限り、または別の方法で文脈から明らかである場合を除き、その群の員の１つ、２つ以上、またはすべてが所与の生成物またはプロセス中に存在する、所与の生成物またはプロセスに用いられる、または別の方法で所与の生成物またはプロセスに関連がある場合、満足しているとみなされる。本発明は、その群の１つの員が確実に、所与の生成物またはプロセス中に存在する、所与の生成物またはプロセスに用いられる、または別の方法で所与の生成物またはプロセスに関連がある実施形態を含む。また、本発明は、群の員の１つより多い、またはすべてが所与の生成物またはプロセス中に存在する、所与の生成物またはプロセスに用いられる、または別の方法で所与の生成物またはプロセスに関連がある実施形態を含む。さらに、本発明は、１つ以上の列挙された請求項の１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが同一の基本請求項（または関連のある他の請求項として）に応じて別の請求項に導入されるすべての変化形態、組み合わせ及び順列を提供することを理解すべきである。ただし、別段の指定がある場合、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明かである場合を除く。本明細書に記載のすべての実施形態が、適切であれば、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが企図される。任意の実施形態または態様は、適切であれば、１つ以上の他のこうした実施形態または態様と自由に組み合わせることができることが企図される。要素がマルクーシュ群または類似のフォーマットなどのリストとして表される場合、その要素の各サブグループも開示され、任意の要素（複数可）がその群から排除され得ることが理解される。一般に、発明または本発明の態様は、特定の要素、特長などを含むとして言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、こうした要素、特長などからなるか、またはこうした要素、特長などから実質的になると理解すべきである。これらの実施形態は、いずれの場合においても、簡潔性のために、本明細書では具体的に多くの語句で記述していない。本明細書に規定の除外が記述されているか否かに関係なく、本発明の任意の実施形態または態様は、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることを理解するべきである。例えば、任意の１つ以上の有効成分、添加剤、成分、任意の薬剤、有機体の種類、疾患、対象、若しくはこれらの組み合わせは、除外することができる。
特許請求の範囲または説明が対象の組成物に関する場合、別段の指定がない限りまたは矛盾または不一致が生じることが当業者に明かでない限り、本明細書で開示される任意の方法に従った対象の組成物の製造方法または使用方法は本発明の態様であることと理解すべきである。請求項または説明が方法に関する場合、例えば、その方法を実施するにあたって有用な組成物の製造方法及びその方法によって産生される生成物は、本発明の態様であることが理解すべきである。ただし、別段の指定がある場合、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明かである場合を除く。
本明細書に範囲が記載されている場合、本発明はエンドポイントが含まれる実施形態、双方のエンドポイントを除外している実施形態、及び１つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントは除外されている実施形態を含む。特に指示がない限り、双方のエンドポイントを含むことを想定すべきである。さらに、別段の指定がない限り、ないしは別の方法で文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値から、本発明の異なる実施形態において規定範囲内にあり、その範囲の下限値単位の１０分の１までの任意の特定の値またはサブ範囲が想定され得ることを理解すべきである。ただし、別の方法にて文脈が明示している場合を除く。また、本明細書に一連の数値が記述されている場合、本発明は、同様に任意の連続する２つの値によって画定されている間に入っている値または範囲のいずれにも関する任意の実施形態を含み、最小値を最低値として、最大値を最高値としてもよいことが理解される。本明細書で使用するとき、数値としては、百分率として表される値が挙げられる。数値に「ほぼ（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が付随している本発明の任意の実施形態については、本発明は正確な値が引用されている実施形態も含む。数値に「ほぼ（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が付随していない本発明の任意の実施形態については、本発明は、「ほぼ（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が付随している実施形態を含む。
「ほぼ（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、別段の指定がない限り、ないしは別の方法で文脈から明らかでない限り、いずれの方向（その数を超える若しくはその数未満）においても、概して、１％の範囲内、いくつかの実施形態では５％の範囲内、いくつかの実施形態では１０％の範囲内に含まれる数字を含む（こうした数字が考え得る値の１００％を許されないほど超える場合を除く）。その反対が明示されない限り、２つ以上の行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、本方法の行為の順序は、必ずしもその方法の順序が記述されている順序を制限するものではないが、本発明には、その順序がそのように制限されている実施形態を含むことと理解すべきである。別段の指定がない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の任意の生成物または組成物は、「単離されている」と考えられ得ることと理解すべきである。
本明細書で使用するとき、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に必須であるが、必須であるか否かに関わらず、規定されていない要素の包含の可能性も含む組成物、方法及びそれらの対応する成分（複数可）に関して使用される。
本明細書で使用するとき、「から実質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語により、本発明の実施形態の基本的及び新規または機能的な特性（複数可）に実質的に影響を及ぼすことのない追加の要素が存在してもよい。
「からなる」という用語は、本明細書に記載されるような組成物、方法及びこれらの対応する成分を意味し、実施形態の説明に引用されない任意の要素は除く。
転写活性化剤様エフェクタ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ゲノム部位の周囲にある対として結合し、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの二量体によって二重鎖切断（ＤＳＢ）が導入される。近年、厳格な疾患モデリングを実施する手段として、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）において１５の異なる遺伝子の突然変異体対立遺伝子を迅速かつ効率良く発生させるＴＡＬＥＮゲノム編集系の使用が報告されており（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２：２３８〜２５１（２０１３））、少なくとも１つの突然変異体対立遺伝子のクローン比率は２％〜３４％の範囲であった。
後述のように、同一のｈＰＳＣ株において、同一のゲノム部位を標的にするＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮの相対的有効性を、前述の同一送達プラットフォームを使用して評価した（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２：２３８〜２５１（２０１３））。ＴＡＬＥＮゲノム編集系では、ＣＡＧプロモーターを使用して、（ウイルス性２Ａペプチドを介して）共翻訳し、それぞれのＴＡＬＥＮは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を有する。ＣＲＩＳＰＲでは、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９遺伝子は、Ｃ末端核局在化シグナル（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６（２０１３））によりＧＦＰを用いて同一ＣＡＧ発現プラスミドにサブクローニングし、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターによりプラスミドから別途に発現させた（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６（２０１３））。それぞれのｇＲＮＡの２０のヌクレオチドプロトスペーサー配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応）系方法を使用して導入させた。ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲのいずれを使用しても、等量の２つのプラスミドは、ｈＰＳＣｓに共に電気穿孔（ノックインを試みる場合、２５μｇのＤＮＡ修復テンプレートと共に各プラスミド２５μｇ、または各プラスミド１２．５μｇのいずれか）し、その後、２４〜４８時間して、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を行い、ゲノム標的部位での単一の細胞のクローン増殖及びＰＣＲを介する突然変異体のスクリーニングを行った。
ＬＤＬＲにおいて以前ＴＡＬＥＮにより上手く標的された（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２：２３８〜２５１（２０１３））６つの遺伝子（ＡＫＴ２、ＣＥＬＳＲ２、ＣＩＩＴＡ、ＧＬＵＴ４、ＬＩＮＣ００１１６及びＳＯＲＴ１）における７つの遺伝子座内及び１つの追加の遺伝子座においてＧ（Ｎ）１９ＮＧＧ配列をマッチングさせて、ｇＲＮＡを設計した。この系では、ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子座及びｈＰＳＣ株にわたって一貫してかつ顕著ににＴＡＬＥＮよりも要項な性能を示した（表Ｓ１を参照されたい）。ＴＡＬＥＮにより、効率０％〜３４％で少なくとも１つの突然変異体対立遺伝子を有するクローンを産生したが、マッチされたＣＲＩＳＰＲにより効率５１％〜７９％（表Ｓ１）で突然変異体クローンを産生した。ＴＡＬＥＮと同様にＣＲＩＳＰＲによりヌクレオチドのサイズが１つから数十の範囲であり、予想される切断部位に集中させた、さまざまなサイズのインデルが産生され、これは、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮが使用されるか否かに関係なく、非相同性末端結合突然変異体の生成が同じ方法で発生することが示唆される。さらに、配列化によって識別されるように、ＣＲＩＳＰＲにより、同型接合突然変異体クローンを速やかに発生させた（すべてのクローンの７％〜２５％；表Ｓ１）。
また、先に記載したとおり、６７のヌクレオチド一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用してＥ１７Ｋ突然変異体をＡＫＴ２にノックインする試みを行った（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２：２３８−２５１（２０１３））。予想されたＣＲＩＳＰＲ切断部位は、点突然変異からそれぞれ１１及び１３ヌクレオチドにあったが、ＣＲＩＳＰＲにより１１％の収率でノックインクローンを産生した（ＴＡＬＥＮでは、わずかに１．６％であった（表Ｓ１））。
Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧ標的配列の要件は、ある程度、部位選択を制限することは注目に値する。いずれのＤＮＡ鎖も標的とすることができるため、標的配列が平均して３２塩基対毎に発生する。遺伝子のノックアウトに関してはいかなる障壁もなく、いかなるコード配列も標的とすることができるが、特定の場所でノックインまたは変異体の修正を試みるにあたって問題点も存在し得る。しかし、プロトスペーサーの開始点でのＧに関する要件は、ｇＲＮＡを発現させるためのＵ６プロモーターの使用によって決定され、代替ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によりこの要件が緩和され得る（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９〜８２３（２０１３））。このため、（Ｎ）２０ＮＧＧ標的配列の使用が可能であり、これらは、平均８塩基対ごとに見出される。
加えて、ＣＲＩＳＰＲオフターゲット効果の範囲が確定された状態が維持され、かつ配列依存性が高い。以前の解析では、プロトスペーサーの最初の半分における１つのヌクレオチドミスマッチは、第二の半分におけるミスマッチよりもより許容されることが示唆されている（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１（２０１２）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９〜８２３（２０１３））。ＡＫＴ２配列については、プロトスペーサーの更に「耐性」のある半分内において、ヌクレオチド１及び３にて異なる２つのミスマッチ配列がある。こうした潜在的ターゲットオフ部位では、ターゲットオン部位での６１％と比較して得られたクローンはゼロであった（表Ｓ１）。ＳＯＲＴ１配列の１つとして、単一のヌクレオチド多形体により、標的部位にて単一のヌクレオチドミスマッチとなる異なるヒト多能性幹細胞株を使用することによって、突然変異体クローンが産生され、最初の細胞株の６６％と比較して、効率は４２％である。このため、標的部位を思慮深く選定することが、系統的オフターゲット効果を最小限に抑えるのに必要であり、完全マッチまたはゲノム内の他の場所に単一のヌクレオチドミスマッチ配列を有する標的部位は避けるべきである。
実用的観点から、ＣＲＩＳＰＲはＴＡＬＥＮよりも実施が容易である。各ＴＡＬＥＮ対は、新規構築されなければならず、ＣＲＩＳＰＲについては、Ｃａｓ９構成要素は固定され、ｇＲＮＡは、２０のヌクレオチドプロトスペーサーの交換のみを必要とする。他は同一の系内でＴＡＬＥＮをＣＲＩＳＰＲに置き換えた結果として、大いに効率が上昇する本発明の考察及び例証を考慮すると、ＣＲＩＳＰＲは、特に治療的状況において、ゲノム編集にとって非常に強力であり、かつ幅広く適用可能なツールであることがわかる。

Claims (272)

  1. 細胞中において標的重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  2. 対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  3. 対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  4. 細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させる、前記方法。
  5. 対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  6. 対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  7. 細胞中において標的鎌状赤血球症（ＳＣＤ）関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  8. 対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  9. 対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  10. 細胞中、複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  11. 対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによってエキソビボでを改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  12. 対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  13. 細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  14. 対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  15. 対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  16. 細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）をＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させる、前記方法。
  17. 対象において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  18. 対象において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  19. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記官能性部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作用可能に連結されたＣａｓ９タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記官能性ドメインは複合体を形成する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその官能性部分である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記官能性部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されたＣａｓ９タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記官能性ドメインは複合体を形成する、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記Ｃａｓタンパク質は、前記１つから２つのリボ核酸と複合体化される、請求項１〜３、請求項７〜９または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記Ｃａｓタンパク質は、前記複数のリボ核酸と複合体化される、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記標的モチーフは、Ｇから始まる２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  30. 各標的モチーフは、Ｇから始まる２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  32. 各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  34. 各標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  36. 各標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  38. 各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  40. 各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記改変はインデルである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現が減少する、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列（複数）の発現が減少する、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列がノックアウトされる、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列（複数）がノックアウトされる、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列（複数）の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記改変は同型接合改変である、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 各改変は同型接合改変である、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  51. 外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは一本鎖である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは二本鎖である、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記標的ポリヌクレオチド配列（複数）の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  55. 外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは一本鎖である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記外因性導入ＤＮＡ修復テンプレートは二本鎖である、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記細胞は末梢血細胞である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記細胞は幹細胞または多能性細胞である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記細胞は造血幹細胞である、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記細胞はＣＤ３４＋細胞である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記細胞はＣＤ３４＋動員末梢血細胞である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記細胞はＣＤ３４＋臍帯血細胞である、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記細胞は、ＣＤ３４＋骨髄細胞である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−系譜−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＡＤＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１の前記リボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＡＫ２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図２の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＣＤ３Ｄである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図３の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図３の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＤＣＬＲＥ１Ｃである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図４の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図４の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＩＬ２ＲＧである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図６の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図６の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＩＬ７Ｒである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図７の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図７の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＪＡＫ３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図８の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図８の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＬＩＧ４である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図９の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図９の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項８７に記載の方法。
  90. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＮＨＥＪ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１０の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１０の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９０に記載の方法。
  93. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＰＮＰである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１１の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１１の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９３に記載の方法。
  96. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＰＲＫＤＣである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１２の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１２の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９６に記載の方法。
  99. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＲＡＧ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１３の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１３の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項９９に記載の方法。
  102. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＲＡＧ２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１４の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１４の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０２に記載の方法。
  105. 前記標的ポリヌクレオチド配列はＺＡＰ７０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図１５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０５に記載の方法。
  108. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、ＨＢＢである、請求項６〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、図５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＡＤＡ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１１１に記載の方法。
  114. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＡＫ２部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１１４に記載の方法。
  117. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＣＤ３Ｄ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１１７に記載の方法。
  120. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＤＣＬＲＥ１Ｃ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２０に記載の方法。
  123. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＩＬ２ＲＧ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図６のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＩＬ７Ｒ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図７のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＪＡＫ３部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図８のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１２９に記載の方法。
  132. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＬＩＧ４部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図９のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１３２に記載の方法。
  135. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＮＨＥＪ１部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１０のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１３５に記載の方法。
  138. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＰＮＰ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１１のリボ核酸配列またはからなる群から選択される異なる配列それらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１１のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１３８に記載の方法。
  141. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＰＲＫＤＣ部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１２のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１４１に記載の方法。
  144. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＲＡＧ１部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１３のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１４４に記載の方法。
  147. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＲＡＧ２部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１４のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１４７に記載の方法。
  150. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＺＡＰ７０部分を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１５０に記載の方法。
  153. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるＨＢＢ部分を含む、請求項１０〜１２または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１５３に記載の方法。
  156. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＤＡ、ＡＫ２、ＣＤ３Ｄ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＪＡＫ３、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＰＮＰ、ＰＲＫＤＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２及びＺＡＰ７０からなる群から選択される標的ポリヌクレオチド配列の任意の組み合わせの少なくとも一部を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１〜図１５のリボ核酸配列またはからなる群から選択される異なる配列それらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図１〜図１５のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１５６に記載の方法。
  159. 前記疾患はＳＣＩＤである、請求項２〜３及び請求項５〜６のいずれか一項に記載の方法。
  160. 前記疾患は鎌状赤血球症である、請求項８〜９及び請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記疾患はβサラセミアである、請求項１４〜１５または請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  162. 前記１つから２つのリボ核酸は、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項１〜３、請求項７〜９または１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記１つから２つのリボ核酸はそれぞれ、前記標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接している前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記複数のリボ核酸は、前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記複数のリボ核酸は、前記標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接している前記Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記１つから２つのリボ核酸は、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように選択される、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記複数のリボ核酸は、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように選択される、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように選択される、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  169. 各標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように選択される、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  170. 前記標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含むように選択される、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含むように選択される、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記１つから２つのリボ酸は、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  173. 前記複数のリボ酸はそれぞれ、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  174. 前記１つから２つのリボ酸は、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項１〜３、請求項７〜９、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  175. 前記複数のリボ酸はそれぞれ、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項４〜６、請求項１０〜１２、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  176. 前記Ｃａｓタンパク質及び前記１つから２つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項３、９または１５のいずれか一項に記載の方法。
  177. 前記Ｃａｓタンパク質及び前記１つから２つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項３、９または１５のいずれか一項に記載の方法。
  178. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む、請求項１７７に記載の方法。
  179. 前記カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７８に記載の方法。
  181. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７８に記載の方法。
  182. 前記Ｃａｓタンパク質及び前記複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項６、１２または１８のいずれか一項に記載の方法。
  183. 前記Ｃａｓタンパク質及び前記複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項６、１２または１８のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８４に記載の方法。
  186. 前記中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８４に記載の方法。
  187. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８４に記載の方法。
  188. 各遺伝子座での改変効率は約５０％から約８０％である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  189. 前記改変効率は少なくとも約５％である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  190. 前記改変効率は少なくとも約１０％である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記改変効率は約５０％から約８０％である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記Ｃａｓタンパク質は、修飾リボ核酸によってコードされる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  193. 前記修飾核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むリボ核酸を含む、請求項１９２に記載の方法。
  194. 前記リボ核酸の少なくとも１つは、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項１〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. 任意の前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸は、プラスミドから発現する、請求項１〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. 任意の前記Ｃａｓタンパク質または前記リボ核酸は、幹細胞内での発現を増加させるために最適化されたプロモーターを用いて発現する、請求項１〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
  197. 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項１９６に記載の方法。
  198. 前記Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することを更に含む、請求項１〜２、請求項４〜５、請求項７〜８、請求項１０〜１１、請求項１３〜１４、または請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  199. 細胞を選択することはＦＡＣＳを含む、請求項１９８に記載の方法。
  200. ＦＡＣＳを使用して、Ｃａｓタンパク質並びに緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質を共発現する細胞を選択する、請求項１９９に記載の方法。
  201. 細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内の前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、前記方法。
  202. 細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内の前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、前記方法。
  203. 細胞中の標的βサラセミポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内の前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミポリヌクレオチド配列を切断させ、Ｃａｓタンパク質が発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、前記方法。
  204. 対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  205. 対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  206. 対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  207. 細胞中において複数の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、前記方法。
  208. 細胞中の複数の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び１つから２つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、前記方法。
  209. 細胞中の複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％である、前記方法。
  210. 対象においてＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、（ａ）細胞中の標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列を（複数）、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  211. 対象においてＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記ＳＣＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  212. 対象において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、（ａ）細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）とＣＲＩＳＰ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を前記標的ＳＣＩＤ関連ポリヌクレオチド配列（複数）の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）を切断させ、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞の改変効率は約８％から約８０％であることと、（ｂ）前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列（複数）の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  213. 図１〜１５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
  214. 図１〜１５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
  215. 前記少なくとも１つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項２１３または２１４のいずれか一項に記載の組成物。
  216. 前記少なくとも１つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項２１３〜２１５のいずれか一項に記載の組成物。
  217. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む、請求項２１６に記載の組成物。
  218. 前記カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２１７に記載の組成物。
  219. 前記中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２１７に記載の組成物。
  220. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２１７に記載の組成物。
  221. 前記リボ核酸の少なくとも１つは、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項２１３〜２２０のいずれか一項に記載の組成物。
  222. Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項２１３〜２２１のいずれか一項に記載の組成物。
  223. Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を更に含む、請求項２１３〜２２１のいずれか一項に記載の組成物。
  224. 前記核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項２２１〜２２３のいずれか一項に記載の組成物。
  225. Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１〜１５の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物。
  226. Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及び図１〜１５のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸配列を含むキメラ核酸を含む組成物。
  227. 緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項２２５または２２６のいずれか一項に記載の組成物。
  228. 前記キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む、請求項２２５〜２２７のいずれか一項に記載の組成物。
  229. 前記プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される、請求項２２８に記載の組成物。
  230. 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２２９に記載の組成物。
  231. 前記キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項２２５〜２３０のいずれか一項に記載の組成物。
  232. 前記キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項２２５〜２３１のいずれか一項に記載の組成物。
  233. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む、請求項２３２に記載の組成物。
  234. 前記カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２３３に記載の組成物。
  235. 前記中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２３３に記載の組成物。
  236. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２３３に記載の組成物。
  237. 前記キメラ核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２２５〜２３６のいずれか一項に記載の組成物。
  238. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分を含む、請求項２２５〜２３７のいずれか一項に記載の組成物。
  239. 細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、及び図１〜１５のリボ核酸配列、図１〜１５のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列またはその少なくとも１２ヌクレオチドの断片を含む、前記キット。
  240. ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される１種以上の細胞株、培養液または集団を更に含む、請求項２３６に記載のキット。
  241. ＡＤＡ ＤＮＡ修復テンプレート、ＡＫ２ ＤＮＡ修復テンプレート、ＣＤ３Ｄ ＤＮＡ修復テンプレート、ＤＣＬＲＥ１Ｃ ＤＮＡ修復テンプレート、ＩＬ２ＲＧ ＤＮＡ修復テンプレート、ＩＬ７Ｒ ＤＮＡ修復テンプレート、ＪＡＫ３ ＤＮＡ修復テンプレート、ＬＩＧ４ ＤＮＡ修復テンプレート、ＮＨＥＪ１ ＤＮＡ修復テンプレート、ＰＮＰ ＤＮＡ修復テンプレート、ＰＲＫＤＣ ＤＮＡ修復テンプレート、ＲＡＧ１ ＤＮＡ修復テンプレート、ＲＡＧ２ ＤＮＡ修復テンプレート、ＺＡＰ７０ ＤＮＡ修復テンプレート、及びＨＢＢ ＤＮＡ修復テンプレートからなる群から選択されるＤＮＡ修復テンプレートを更に含む、請求項２３６に記載のキット。
  242. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０８に記載の方法。
  243. 前記１つから２つのリボ核酸のうちの少なくとも１つは、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、請求項１０８に記載の方法。
  244. リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
  245. リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのリボ核酸を含む組成物。
  246. 前記少なくとも１つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項２４４または２４５のいずれか一項に記載の組成物。
  247. 前記少なくとも１つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項２４４〜２４６のいずれか一項に記載の組成物。
  248. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む、請求項２４７に記載の組成物。
  249. 前記カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４８に記載の組成物。
  250. 前記中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４７に記載の組成物。
  251. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４７に記載の組成物。
  252. 前記リボ核酸の少なくとも１つは、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される１つから２つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項２４４〜２５１のいずれか一項に記載の組成物。
  253. Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項２４４〜２５２のいずれか一項に記載の組成物。
  254. Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を更に含む、請求項２４４〜２５３のいずれか一項に記載の組成物。
  255. 前記核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項２４４〜２５４のいずれか一項に記載の組成物。
  256. Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧまたはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を有する少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物。
  257. Ｃａｓタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物。
  258. 緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項２５６または２５７のいずれか一項に記載の組成物。
  259. 前記キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む、請求項２５６〜２５８のいずれか一項に記載の組成物。
  260. 前記プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される、請求項２５９に記載の組成物。
  261. 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２５９または２６０に記載の組成物。
  262. 前記キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項２５６〜２６１のいずれか一項に記載の組成物。
  263. 前記キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項２５６〜２６２のいずれか一項に記載の組成物。
  264. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の少なくとも１つを含む、請求項２６３に記載の組成物。
  265. 前記カチオン性脂質は、ＡＬＮＹ−１００、Ｃ１２−２００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎ−ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＸＴＣ、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２６４に記載の組成物。
  266. 前記中性脂質は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２６４に記載の組成物。
  267. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２６４に記載の組成物。
  268. 前記キメラ核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトジン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸及び５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２５６〜２６７のいずれか一項に記載の組成物。
  269. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその官能性部分を含む、請求項２５６〜２６８のいずれか一項に記載の組成物。
  270. 細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、及びリボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧ、リボ核酸配列ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸配列またはその少なくとも１２のヌクレオチド断片を含む、キット。
  271. ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される１種以上の細胞株、培養液または集団を更に含む、請求項２７０に記載のキット。
  272. ＨＢＢ ＤＮＡ修復テンプレートを更に含む、請求項２７０または２７１のいずれか一項に記載のキット。
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