JP2016528890A - CRISPR/Cas系を用いるゲノム編集の治療用の使用 - Google Patents

CRISPR/Cas系を用いるゲノム編集の治療用の使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に開示されているのは、遺伝性血液疾患の治療または予防を目的とする細胞の高効率、部位特異的ゲノム編集方法、組成物及びキットである。細胞中において標的重度複合免疫不全(SCID)関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。【選択図】図16

Description

関連出願
本出願は、2013年7月9日出願の米国仮出願番号第61/844,333号及び2013年8月23日に出願の同第61/869,369号の利益を主張する。上記出願の教示全体が参照することにより本明細書に援用される。
政府支援
本発明は、米国国立保健研究所によって与えられたHL118744、HL098364、DK095384及びHL107440のもとで、政府支援を得てなされた。米国政府は、本発明において一定の権利をする。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISPR関連(Cas)系は、哺乳類細胞における所望のゲノム部位を標的にするゲノム編集ツールの新規分類である。近年公表されたII型CRISPR/Cas系では、20ヌクレオチドDNA配列及びCas9によって認識されるNGGモチーフの直前(このため、(N)20NGG標的DNA配列)にハイブリッド形成させる合成ガイドRNAにより複合体化することによってゲノム部位を標的にするCas9ヌクレアーゼを使用する。これにより、二本鎖がNGGモチーフの3つのヌクレオチド上流で切断される。二本鎖の切断は、非相同末端結合(誤りを生じがちであり、遺伝子対立遺伝子をノックアウトさせたフレームシフト突然変異をもたらす)または相同性指向性修復(外因性導入二本鎖または一本鎖DNA修復テンプレートを用いてゲノム内で突然変異をノックインするかまたは修正して、利用できる)のいずれかを誘発する。したがって、CRISPR/Cas系は、治療用用途に有用なツールとなり得るが、残念なことに、これまでに公開された報告では、対立遺伝子標的とする効率は、ヒト幹細胞においてわずかに2%〜4%であることを示している(Mali et al.,Science 339:823〜826(2013))。
Mali et al.,Science 339:823〜826(2013)
本明細書に記載される研究は、最大80%の効率で突然変異細胞をもたらす、CRISPR/Cas系を使用する対立遺伝子を標的とする方法を示す。これらの大きく改善された方法により、治療を目的としてCRISPR/Cas系を初めて効果的に利用することができる。ヒト幹細胞へのCRISPR/Cas系の送達方法が提供される。加えて、有用なRNAガイド配列を特定的に識別する方法が、特定の遺伝子(例えば、ADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2、ZAP70及びHBB)を標的する上で有用な特定のガイド配列と共に提供される。さらに、本明細書に開示の組成物及び方法を使用する治療方法(例えば、重度の複合免疫不全、鎌状赤血球症(例えば、鎌状赤血球貧血)、βサラセミアなど)が提供される。いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、重度複合免疫不全(SCID)関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含む、細胞中において標的のSCID関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であり、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、該方法には、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において標的鎌状赤血球症(SCD)関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、該方法は、SCD関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)SCD関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、SCD関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、該方法には、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、該方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、該方法には、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させること、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes(化膿レンサ球菌)Cas9タンパク質またはその官能性部分である。いくつかの実施形態では、官能性部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されるCas9タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む。いくつかの実施形態では、官能性ドメインは複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、任意の細菌種またはそれらの官能性部分由来のCas9タンパク質である。いくつかの実施形態では、官能性部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されるCas9タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む。いくつかの実施形態では、官能性ドメインは複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1つから2つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、複数のリボ核酸と複合体化される。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Gから始まる20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Gから始まる20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、G(N)19NGGである。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、G(N)19NGGである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、(N)20NGGである。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、(N)20NGGである。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。
いくつかの実施形態では、改変はインデルである。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が減少する。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列(複数)の好ましくない配列から所望の配列(複数)への修正をもたらす。いくつかの実施形態では、改変は、同型接合改変である。いくつかの実施形態では、各改変は、同型接合改変である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、二本鎖である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、二本鎖である。
いくつかの実施形態では、細胞は末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞または多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34動員末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、CD34臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34CD38−系譜−CD90CD45RA細胞である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ADAである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図1のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図1のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、AK2である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図2のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図2のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CD3Dである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図3のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図3のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、DCLRE1Cである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図4のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図4のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL2RGである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図6のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図6のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL7Rである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図7のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図7のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、JAK3である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図8のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図8のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、LIG4である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図9のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図9のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NHEJ1である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図10のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図10のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PNPである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図11のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図11のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PRKDCである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図12のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図12のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG1である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図13のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図13のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG2である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図14のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図14のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ZAP70である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図15のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図15のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、HBBである。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図5のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図5のリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるADA部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるAK2部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図2のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図2のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるCD3D部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図3のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図3のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるDCLRE1C部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図4のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図4のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるIL2RG部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図6のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図6のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるIL7R部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図7のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図7のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるJAK3部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図8のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図8のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるLIG4部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるNHEJ1部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図10のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図10のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるPNP部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図11のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図11のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるPRKDC部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図12のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図12のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるRAG1部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図13のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図13のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるRAG2部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図14のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図14のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるZAP70部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図15のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図15のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるHBB部分を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図5のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図5のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、ADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2及びZAP70からなる群から選択される標的ポリヌクレオチド配列の任意の組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1〜15のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1〜15のリボ核酸配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、疾患はSCIDである。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球症である。いくつかの実施形態では、疾患はβサラセミアである。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸はそれぞれ、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているCasタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているCasタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように各標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質及び1つから2つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質及び1つから2つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質及び複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質及び複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、各遺伝子座での改変効率は約50%から約80%である。いくつかの実施形態では、改変効率は少なくとも約5%である。いくつかの実施形態では、改変効率は少なくとも約10%である。いくつかの実施形態では、改変効率は約50%から約80%である。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、修飾リボ核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。
いくつかの実施形態では、任意のCasタンパク質またはリボ核酸は、プラスミドから発現する。いくつかの実施形態では、任意のCasタンパク質またはリボ核酸は、幹細胞内での発現を増加させるために最適化されたプロモーターを用いて発現する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、この方法は、Casタンパク質を発現する細胞を選択することを更に含む。いくつかの実施形態では、細胞を選択することにはFACSが挙げられる。いくつかの実施形態では、FACSを使用して、Cas及び緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質を共発現する細胞を選択する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミポリヌクレオチド配列を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、細胞中において標的βサラセミポリヌクレオチド配列を改変する方法である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、図1〜15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物である。
いくつの態様では、本明細書に開示されているのは、図1〜15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物である。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。
いくつかの実施形態では、組成物はCasタンパク質をコードする核酸配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物はCas9タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ酸を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図1〜15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物である。
いくつの態様では、本明細書に開示されているのは、Casタンパク質をコードするリボ核酸を含むキメラ核酸及び図1〜15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含む組成物である。
いくつかの実施形態では、組成物は、緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその官能性部分である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているのは、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、該キットは、Cas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図1〜15のリボ核酸配列、図1〜15のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される1種以上の細胞株、培養液または集団を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ADA DNA修復テンプレート、AK2 DNA修復テンプレート、CD3D DNA修復テンプレート、DCLRE1C DNA修復テンプレート、IL2RG DNA修復テンプレート、IL7R DNA修復テンプレート、JAK3 DNA修復テンプレート、LIG4 DNA修復テンプレート、NHEJ1 DNA修復テンプレート、PNP DNA修復テンプレート、PRKDC DNA修復テンプレート、RAG1 DNA修復テンプレート、RAG2 DNA修復テンプレート、ZAP70 DNA修復テンプレート、及びHBB DNA修復テンプレートからなる群から選択されるDNA修復テンプレートを更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、組成物は、Casタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Cas9タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ酸を含む。
いくつかの態様では、本開示は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、Casタンパク質をコードするリボ核酸、及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその官能性部分を含む。
いくつの態様では、本開示は、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列改変するためのキットを提供し、該キットは、Cas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGG、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される1種以上の細胞株、培養液または集団を含む。いくつかの実施形態では、キットは、HBB DNA修復テンプレートを含む。
図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図1は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトADAであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図2は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトAK2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図2は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトAK2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図2は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトAK2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図2は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトAK2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図2は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトAK2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図2は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトAK2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図3は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトCD3Dであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図3は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトCD3Dであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図3は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトCD3Dであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図3は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトCD3Dであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図3は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトCD3Dであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図4は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトDCLRE1Cであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図5は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトHBBであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図5は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトHBBであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図5は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトHBBであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図5は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトHBBであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図6は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL2RGであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図7は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトIL7Rであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図8は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトJAK3であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図9は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトLIG4であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図10は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトNHEJ1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図10は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトNHEJ1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図10は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトNHEJ1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図10は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトNHEJ1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図10は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトNHEJ1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図10は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトNHEJ1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図11は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPNPであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図12は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトPRKDCであるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図13は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG1であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図14は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトRAG2であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図15は、標的ポリヌクレオチド配列がヒトZAP70であるときに有用な例示的ガイドRNA配列を示す。 図16は、Casタンパク質の例示的アミノ酸配列を示す。黄色の強調表示部分は、Ruv−C−様ドメインを示す。下線部は、HNHヌクレアーゼドメインを示す。
本明細書に記載される研究は、80%以下の効率を有する突然変異細胞をもたらす、CRISPR/Cas系を使用する対立遺伝子の標的方法を示す。これらの大きく改善された方法により、治療を目的としてCRISPR/Cas系を初めて効果的に利用することができる。ヒト幹細胞へのCRISPR/Cas系の送達方法が提供される。加えて、RNAガイド配列に有用な特異的に特定する方法が特定の遺伝子(例えば、ADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、HBB、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2、及びZAP70)を標的とするのに有用な特定のガイド配列と共に提供される。さらに、本明細書に開示の組成物及び方法を使用する治療方法(例えば、重度複合免疫不全、鎌状赤血球症及びβサラセミアの治療方法)が提供される。
一態様では、本発明は、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、重度複合免疫不全(SCID)関連ポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法は、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を含む。本明細書で使用するとき、「重度複合免疫不全関連ポリヌクレオチド配列」及び「SCID関連ポリヌクレオチド配列」は、同義的に使用され、1つ以上のSCIDに関連する突然変異体を示す遺伝子のポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、「重度複合免疫不全症」及び「SCID」とは、Bリンパ球の直接的な関与または異常な非機能的Tヘルパー細胞により生じるBリンパ球活性化が原因で、欠陥のある抗体応答を引き起こす機能異常Tリンパ球を特徴とする遺伝性疾患を指す。SCIDは、限定されないが、ADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2、及びZAP70など、1つ以上の遺伝子における突然変異を原因とする適応免疫系のB細胞応答及びT細胞応答の機能異常を含む。したがって、「SCID関連ポリヌクレオチド配列」は、任意のこれらの遺伝子及びそのバリアント形態または突然変異形態のヌクレオチド配列を包含する。
細胞中において標的重度複合免疫不全(SCID)関連ポリヌクレオチド配列を改変する例示的方法は、SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させ、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)またはそのバリアントである。例示的なADA配列は、ヒトADA配列(NCBI遺伝子ID:100)である。当業者は、図1に示すガイド配列は、ヒトADAの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたADAポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にADAの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表1に、Online Mendelian Inheritance in Man(登録商標)(OMIM(登録商標))データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表1に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索語「ADA」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」の縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、アデニル酸キナーゼ2(AK2)またはそのバリアントである。例示的AK2配列は、ヒトAK2配列(NCBI遺伝子ID:204、ADK2及びAK2としても公知)である。いくつかの実施形態では、ヒトAK2配列は、配列1をコードするAK2のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトAK2配列は、配列2をコードするAK2のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトAK2配列は、配列3をコードするAK2のすべてまたは一部を含む。当業者は、図2、3及び4に示すガイド配列は、ヒトAK2、特に配列1、2及び3をそれぞれコードするヒトAK2の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたAK2ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にAK2の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表2に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表2に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「AK2」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、CD3抗原、δサブユニット(CD3D)またはそのバリアントである。例示的CD3D配列は、ヒトCD3D配列(NCBI遺伝子ID:915、T3D及びCD3−δとしても公知)である。いくつかの実施形態では、ヒトCD3D配列は、配列1をコードするCD3Dのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトCD3D配列は、配列2をコードするCD3Dのすべてまたは一部を含む。当業者は、図5及び図6に示すガイド配列は、ヒトCD3D、特に配列1及び2をそれぞれコードするヒトCD3Dの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたCD3Dポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にCD3Dの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表3に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表3に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「CD3D」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、DNA架橋修復タンパク質1C(DCLRE1C)またはそのバリアントである。例示的DCLRE1C配列は、ヒトDCLRE1C配列(NCBI遺伝子ID:64421、SCIDA、SNM1C、A−SCID、hSNM1C、RS−SCID、DCLRE1Cとしても公知)である。いくつかの実施形態では、ヒトDCLRE1C配列は、配列1をコードするDCLRE1Cのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトDCLRE1C配列は、配列2をコードするDCLRE1Cのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトDCLRE1C配列は、配列3をコードするDCLRE1Cのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトDCLRE1C配列は、配列4をコードするDCLRE1Cのすべてまたは一部を含む。当業者は、図7、図8、図9及び図10に示すガイド配列は、ヒトDCLRE1C、特に配列1、2、3及び4をそれぞれコードするヒトDCLRE1Cの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたDCLRE1Cポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にDCLRE1Cの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表4に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表4に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「DCLRE1C」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、インターロイキン2レセプターγ(IL2RG)またはそのバリアントである。例示的IL2RG配列は、ヒトIL2RG配列である(NCBI遺伝子ID:3561、P64、CIDX、IMD4、CD132、SCIDX、IL−2RG及びSCIDX1としても公知である)。当業者は、図12に示すガイド配列は、ヒトIL2RGの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたIL2RGポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にIL2RGの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表5に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表5に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「IL2RG」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、インターロイキン7レセプター(IL7R)またはそのバリアントである。例示的IL7R配列は、ヒトIL7R配列(NCBI遺伝子ID:3575、ILRA、CD127、IL7RA、CDW127、IL−7R−αとしても公知)である。当業者は、図13に示すガイド配列は、ヒトIL7Rの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたIL7Rポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にIL7Rの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表6に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表6に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「IL7R」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、ヤーヌスキナーゼ3(JAK3)またはそのバリアントである。例示的JAK3配列は、ヒトJAK3配列(NCBI遺伝子ID:3718、JAKL、LJAK、JAK−3、L−JAK、JAK3_HUMANとしても公知)である。当業者は、図14に示すガイド配列は、ヒトJAK3の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたJAK3ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にJAK3の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表7に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表7に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「JAK3」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、リガーゼIV、DNA、ATP−依存性(LIG4)またはそれらのバリアントである。例示的LIG4配列は、ヒトLIG4配列である(NCBI遺伝子ID:3981)。いくつかの実施形態では、ヒトLIG4配列は、配列1をコードするLIG4のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトLIG4配列は、配列2をコードするLIG4のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトLIG4配列は、配列3をコードするLIG4のすべてまたは一部を含む。当業者は、図15、図16及び図17に示すガイド配列は、ヒトLIG4、特に配列1、2及び3をそれぞれコードするヒトLIG4の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたLIG4ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にLIG4の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表8に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表8に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「LIG4」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、非相同末端結合因子1(NHEJ1)またはそのバリアントである。例示的NHEJ1配列は、ヒトNHEJ1配列(NCBI遺伝子ID:79840、XLFとしても公知)である。当業者は、図18に示すガイド配列は、ヒトNHEJ1の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたNHEJ1ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にNHEJ1の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表9に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表9に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「NHEJ1」でOMIMに照会し、列挙されている表現型の「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ配列(PNP)またはそのバリアントである。例示的PNP配列はヒトPNP(NCBI遺伝子ID:4860、NP、PUNP及びPRO1837としても公知)である。当業者は、図19に示すガイド配列は、ヒトPNPの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたPNPポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にPNPの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表10に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表10に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「PNP」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、プロテインキナーゼDNA活性化触媒ポリペプチド配列(PRKDC)またはそのバリアントである。例示的PRKDC配列はヒトPRKDC配列(NCBI遺伝子ID:5591、HYRC、p350、DNAPK、DNPK1、HYRC1、XRCC7及びDNA−PKcとしても公知)である。いくつかの実施形態では、ヒトPRKDC配列は、配列1をコードするPRKDCのすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトPRKDC配列は、配列2をコードするPRKDCのすべてまたは一部を含む。当業者は、図20及び図21に示すガイド配列は、ヒトPRKDC、特に配列1及び2をそれぞれコードするヒトPRKDCの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたPRKDCポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にPRKDCの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。いくつかの実施形態では、改変PRKDCポリヌクレオチド配列に関連する表現型は、SCIDである。いくつかの実施形態では、改変PRKDCポリヌクレオチド配列に関連する表現型は、色素性乾皮症における放射線感受性である(Abbaszadeh et al.,「A novel splice variant of the DNA−PKcs gene is associated with clinical and cellular radiosensitivity in a patient with xeroderma pigmentosum」 J Med Genet. 2010;47(3):176−81)。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、RAG1(recombination activating gene 1 sequence)またはそのバリアントである。例示的RAG1配列は、ヒトRAG1(NCBI遺伝子ID:5896、RAG−1及びRNF74としても公知)である。当業者は、図22に示すガイド配列は、ヒトRAG1の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたRAG1ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にRAG1の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表11に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表11に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「RAG1」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、RAG2(recombination activating gene 2 sequence)またはそのバリアントである。例示的RAG2配列は、ヒトRAG2(NCBI遺伝子ID:5896、RAG−2としても公知)である。いくつかの実施形態では、ヒトRAG2配列は、配列1をコードするヒトRAG2のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトRAG2配列は、配列2をコードするRAG2のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトRAG2配列は、配列3をコードするヒトRAG2のすべてまたは一部を含む。当業者は、図23、図24及び図25に示すガイド配列は、ヒトRAG2、特に配列1、2及び3をそれぞれコードするヒトRAG2の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたRAG2ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にRAG2の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表12に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表12に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「RAG2」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつの実施形態では、SCID関連ポリヌクレオチド配列は、ζ鎖関連タンパク質キナーゼ配列(ZAP70)またはそのバリアントである。例示的ZAP70配列は、ヒトZAP70(NCBI遺伝子ID:7535、SRK、STD、TZK、STCD及びZAP−70としても公知)である。いくつかの実施形態では、ヒトZAP70配列は、配列1をコードするヒトZAP70のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトZAP70配列は、配列2をコードするヒトZAP70のすべてまたは一部を含む。当業者は、図26及び図27に示すガイド配列は、ヒトZAP70、特に配列1及び2をそれぞれコードするヒトZAP70の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたZAP70ポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にZAP70の標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表13に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表13に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「ZAP70」でOMIMに照会し、列挙されている表現型の「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヘモグロビンβ(「HBB」)(例えば、ヒトヘモグロビンβ、NCBI遺伝子ID:3043)またはそのバリアントである。当業者は、図11に示すガイド配列は、ヒトHBBの標的ポリヌクレオチド配列を改変するために、本発明のCRISPR/Cas系と共に使用可能であることを理解するであろう。
改変されたHBBポリヌクレオチド配列に関連した任意の異常表現型の治療にHBBの標的ポリヌクレオチド配列の改変を使用可能であることもまた、理解するべきである。下表14に、OMIM(登録商標)データベースにより特定される遺伝子表現型関係を示す。表14に列挙されている表現型に関する更なる情報は、検索用語「HBB」でOMIMに照会し、列挙されている表現型に対応している「表現型MIM番号」縦列のハイパーリンクをクリックすることによって公的に入手可能である。
正常成人ヘモグロビンは、2つのα鎖及び2つのβ鎖から構成される四量体である。HBBにより、ヘモグロビンのβ鎖の構造が決定する。HBBの突然変異は、鎌状赤血球症及び/またはβサラセミアと関連している。例えば、鎌状赤血球貧血は、突然変異βグロビンによって引き起こされる。β鎖が不在の場合には、β−ゼロサラセミアとなる。検出可能なβグロビンの減少量によって、βプラスサラセミアとなる。鎌状赤血球症に伴うHBBの例示的突然変異体は、ヘモグロビンS(Glu6Val)、ヘモグロビンC(Glu6Lys)、ヘモグロビンD(Glu121Gln)及びヘモグロビンO(Glu121Lys)である。
L1レトロトランスポゾン断片がIVS−IIに挿入されると、β−サラセミアとなる。これは、βサラセミアの形態を表す。βグロビン遺伝子により、全β−グロビンmRNAの約15%に等しいレベルで、全長β−グロビン転写物が発現する。
いくつかの実施形態では、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法は、標的鎌状赤血球症(SCD)関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を含む。本明細書で使用するとき、「鎌状赤血球症関連ポリヌクレオチド配列」及び「SCD関連ポリヌクレオチド配列」は、同義的に使用され、SCDに関連づけられた1つ以上のHBB突然変異体を示すHBB遺伝子のポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、「鎌状赤血球症」とは、HBB内の突然変異が関与し、ヘモグロビンS(HbS)の存在によって定義される症候性障害の群を指す。正常ヘモグロビンは、2つのα−ヘモグロビン鎖及び2つのβ−ヘモグロビン鎖から成るヘテロ四量体である。HBBの点変異により、ヘモグロビンSは、例えば、β−ヘモグロビン鎖において、六番目のアミノ酸がグルタミン酸からバリン(Glu6Val)に変わる点変異となる。鎌状赤血球貧血(ホモ接合型HbSS)は、米国において報告されている鎌状赤血球症の60〜70%を占める鎌状赤血球症の一例である。鎌状赤血球症の他の形態の例は、HbSと種々の突然変異体β−グロビン鎖バリアント(鎌状−ヘモグロビンC疾患(HbSC))及び鎌状βサラセミアの2つの異なる型(Hb Sβ サラセミア及びHb S β−サラセミア)との共遺伝が原因である。
細胞中において標的鎌状細胞疾患(SCD)関連ポリヌクレオチド配列を改変する例示的方法には、SCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
いくつかの実施形態では、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法は、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を含む。本明細書で使用するとき、「βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列」は、βサラセミアに関連づけられた1つ以上のHBB突然変異を示すHBB遺伝子のポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、「βサラセミア」とは、200超の異なるHBB突然変異体によって生じるヘモグロビンサブユニットβ(例えば、ヘモグロビンβ鎖)の産生の低下を特徴とする遺伝性常染色体劣性疾患を指す。当事者によって理解されるように、βサラセミアとなるHBB突然変異体としては、非欠損HBB突然変異体、欠損HBB突然変異体及び転位因子に起因するHBB突然変異体が挙げられる。下表15は、例示的非欠損HBB突然変異体を示す。


また、当業者は、さまざまな欠失βサラセミア対立遺伝子が存在し、これは特定のリスク集団によく見られる傾向にあることを理解するであろう。欠失βサラセミア対立遺伝子の例としては、限定されるものではないが、25bp欠失、44bp欠失、105bp欠失、290bp欠失、532bp欠失、619bp欠失、1,393bp欠失、1,605bp欠失(「クロアチア人欠失」)、3,485bp欠失(「タイ人欠失」)、4,237bp欠失(「チェック人欠失」)、7.6kp欠失(「トルコ欠失」)、10,329bp欠失(アジアインド人欠失」)、12,023bp欠失(「オーストラリア欠失」)、12,620bp欠失(「オランダ人欠失」)、27kp欠失(「東南アジア人欠失」)、45kp欠失(「フィリピン人欠失」)及び65kp欠失(「イタリア人欠失」)が挙げられる。当業者は、対応する核酸及び公的に利用可能な情報源からこれらの欠損に対応するタンパク質配列を取得することができる(例えば、A Syllabus of Thalassemia Mutations(1997)、Titus H.J.Huisman, et al著、The Sickle Cell Anemia Foundation(Augusta,GA,USA)公開、http://globin.cse.psu.edu/html/huisman/thals/I−b.entries.htmlからオンラインで閲覧可能)。
細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する例示的方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含み、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させる。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
本明細書で使用するとき、「接触すること」という用語(すなわち、ポリヌクレオチド配列をCRISPR関連(Cas)タンパク質及びまたはリボ核酸に接触させること)は、細胞内のCasタンパク質及び/またはリボ核酸を共にインビトロでインキュベートする(例えば、培養物中において、Casタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸を細胞に添加すること)ことを含むことを意図している。いくつかの実施形態では、「接触すること」という用語は、微生物(すなわち、細菌)内で自然に発生し得る本明細書にて開示したように、細胞をCasタンパク質及び/またはリボ核酸にインビボで晒すことを含むことを意図していない。本明細書にて開示する、標的ポリヌクレオチド配列をCasタンパク質及び/またはリボ核酸に接触させるステップは、任意の好適な方法で実施することができる。例えば、細胞は、粘着性培養物または懸濁液培養物内で処理されてもよい。また、本明細書にて開示する、Casタンパク質及び/またはリボ核酸に接触させた細胞は、同時にまたはその後に別の因子(例えば、成長因子または他の分化剤または環境)に接触させて、細胞を安定させるか、または細胞を更に分化し得ることが理解される。
別の態様では、本発明は、対象においてポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供する。
「処理する」「処理している」「処理」という用語などは、単離細胞に適用されるとき、細胞を任意の種類のプロセスまたは条件にさらすことまたは任意の種類の細胞上の操作または手順を実施することを含む。対象に適用されるとき、この用語は、個人への医学的または外科的考慮、治療または管理を提供することを指す。個人は、通常、母集団であり、こうした配慮、治療または管理を必要とする平均的参加者と比較して病気であるか、障害を受けているか、または病気になるリスクが増大する。
本明細書で使用するとき、「治療すること」及び「治療」とは、対象は、少なくとも1つの疾患の症状の減少または疾患の改善、例えば、有益若しくは所望の臨床結果を有するように、有効量の組成物を対象に投与することを指す。本発明の目的のために、有益若しくは所望の臨床結果とは、限定されないが、1つ以上の症状の緩和、疾患範囲の減少、疾患の安定(すなわち、悪化しない)状態、疾患進行の遅延または減速、病態の改善または緩和、及び寛解(部分、または、全体)が挙げられる(検出可能であるか否かにかかわらず)。「治療」は、また、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。したがって、当業者は、治療により、疾患状態が改善し得るが、疾患に対して完全な治癒とはならない可能性があることを理解している。本明細書で使用するとき、「治療」という用語は予防を含む。あるいは、治療は、疾患の進行が減少または停止した場合、「有効」である。また、「治療」は、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。治療を必要とする場合としては、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害並びに遺伝感受性または他の因子によるこうした障害を発現する可能性の高いとすでに診断された場合が挙げられる。
疾患または障害の「治療」「予防」若しくは「改善」は、このような疾または障害の発症の遅延若しくは回避、こうした疾患若しくは障害に関連する病態の進行若しくは重症度の進行、悪化若しくは増悪の逆行、軽減、回復、阻害、遅延若しくは停止を指す。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%軽減する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、(a)SCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、(a)SCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、SCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法
または予防方法を含む。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、(a)βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質をβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。この態様及び他の態様のいくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法には、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
本発明は、本発明のCRISPR/Cas系用いて、当事者が利用可能なあらゆる方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを意図する。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる任意のCRISPR/Cas系を使用することができる。こうしたCRISPR−Cas系では、さまざまなCasタンパク質を使用してもよい(Haft et al. PLoS Comput Biol. 2005;1(6)e60)。CRISPR/Cas系を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列に改変することができるこうしたCasタンパク質の分子機構としては、RNA結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ及びポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas系は、I型CRISPR系である。いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas系は、II型CRISPR系である。
本発明のCRISPR/Cas系を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。本発明は、目的に応じて細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異細胞を産生するため改変される。本明細書で使用するとき、「突然変異細胞」は、その元の遺伝子型とは異なる得られた遺伝子型を有する細胞を指す。場合によっては、例えば、本発明のCRISPR/Cas系を使用して正常機能的遺伝子を改変する場合、「突然変異細胞」と突然変異表現型を指す。他の場合、例えば、本発明のCRISPR/Cas系を使用して突然変異遺伝子型を修正する場合、「突然変異細胞」とは野生型表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ADA表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型AK2表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型CD3D表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型DCLRE1C表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型IL2RG表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型IL7R表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型JAK3表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型LIG4表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型NHEJ1表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型PNP表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型PRKDC表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型RAG1表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型RAG2表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型ZAP70表現型を指す。例示的実施形態では、突然変異細胞は、野生型HBB表現型を指す。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の突然変異を修正または修復するために改変される(例えば、正常表現型を細胞に回復させる)。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のADA突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のAK2突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のCD3D突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のDCRE1C突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のIL2RG突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のIL7R突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のJAK3突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のLIG4突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のNHEJ1突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のPNP突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のPRKDC突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のRAG1突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のRAG2突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は、SCIDに伴う1つ以上のZAP70突然変異を修正するまたは修復するため改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列は、SCDに伴う1つ以上のHBB突然変異を修正するまたは修復するために改変される。例示的実施形態では、細胞内の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列は、SCDに伴う1つ以上のHBB突然変異を修正するまたは修復するために改変される。別の例示的実施形態では、細胞内の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列は、βサラセミアに伴う1つ以上のHBB突然変異を修正するまたは修復するために改変される。いくつかの実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の突然変異を引き起こすために改変される(例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を切断させるため)。
いくつかの実施形態では、改変はインデルである。本明細書で使用するとき、「インデル」とは、挿入、欠失またはこれらを組み合わせたものに誘発される突然変異を指す。当業者によって理解されているように、ゲノム配列のコード領域内のインデルにより、フレームシフト突然変異となる。ただし、インデルの長さが3の倍数である場合を除く。いくつかの実施形態では、改変は点変異である。本明細書で使用するとき、「点変異」は、1つのヌクレオチドが置き換えられている置換を指す。本発明のCRISPR/Cas系を使用して、標的ポリヌクレオチド配列内の任意の長さのインデルまたは点変異を誘発することができる。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列またはそれらの一部がノックアウトされる。本発明のCRISPR/Cas系を使用して、標的ポリヌクレオチド配列またはそれらの一部をノックアウトさせることは、さまざまな用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、研究目的としてインビトロで実施することができる。エクスビボまたはインビボを目的として、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法に有用であり得る。
本明細書で使用するとき、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能に干渉する方法での標的ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部の消失を含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能性ドメイン(例えば、DNA結合ドメイン)において標的ポリヌクレオチド配列内のインデルを誘発して標的ポリヌクレオチド配列を改変することによって得ることができる。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて、標的ポリヌクレオチド配列またはそれらの一部をノックアウトするために本発明のCRISPR/Cas系の使用方法を容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が減少する。「減少する」「低減する」「低減」及び「減少」という用語は、いずれも、本明細書で一般に、統計上有意な量の減少を指すために使用される。しかし、あらゆる疑いを回避するために、「減少する」「低減する」「低減」及び「減少」は、基準レベルと比較して、少なくとも10%の減少、例えば、少なくとも約20%、若しくは少なくとも約30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、若しくは少なくとも約60%、若しくは少なくとも約70%、若しくは少なくとも約80%、若しくは少なくとも約90%の減少または100%以下の減少(すなわち、標準試料と比較して、不在であるレベル)、または標準レベルと比較して、10〜100%のあらゆる減少を指す。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が増加する。「増加させる」「増加」または「改良する」または「活性化する」という用語は、すべて、本明細書で統計上有意な量増加することを指すために使用され、あらゆる疑いを回避するために、「増加させる」「増加」または「改良する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも10%の増加、例えば、少なくとも約20%、若しくは少なくとも約30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、若しくは少なくとも約60%、若しくは少なくとも約70%、若しくは少なくとも約80%、若しくは少なくとも約90%の増加または100%以下の増加(すなわち、標準試料と比較して、不在であるレベル)、または標準レベルと比較して、10〜100%のあらゆる増加または標準レベルと比較して、少なくとも約2倍、若しくは少なくとも約3倍、若しくは少なくとも約4倍、若しくは少なくとも約5倍若しくは少なくとも約10倍、または2倍〜10倍以上のあらゆる増加を指す。
「統計上有意な」または「有意に」という用語は、統計上の有意性を意味し、一般に、標準より2標準偏差(2SD)下の、すなわち低いマーカーの濃度を指す。この用語は、差異があるという統計的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際に正しい場合に帰無仮説の棄却を判定する確率として定義される。この判定は、多くの場合、p値を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、改変は、同型接合改変である。いくつかの実施形態では、改変は異型接合改変である。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす。本発明のCRISPR/Cas系を使用して、標的ポリヌクレオチド配列内の任意の型の突然変異またはエラーを修正することができる。例えば、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、欠失により標的ポリヌクレオチド配列から消失しているヌクレオチド配列を挿入することができる。また、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、欠失により標的ポリヌクレオチド配列から、ヌクレオチド配列を削除または切除することができる。場合によっては、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、不正確なヌクレオチド配列を正確なヌクレオチド配列に置き換えることができる(例えば、機能の変異の消失、すなわちSNPにより、障害を受けている標的ポリヌクレオチド配列に機能を回復させるために)。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異ADAポリヌクレオチド配列を野生型ADAポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異AK2ポリヌクレオチド配列を野生型AK2ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異CD3Dポリヌクレオチド配列を野生型CD3Dポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異DCLRE1Cポリヌクレオチド配列を野生型DCLRE1Cポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異IL2RGポリヌクレオチド配列を野生型IL2RGポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異IL7Rポリヌクレオチド配列を野生型IL7Rポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異JAK3ポリヌクレオチド配列を野生型JAK3ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異LIG4ポリヌクレオチド配列を野生型LIG4ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異NHEJ1ポリヌクレオチド配列を野生型NHEJ1ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異PNPポリヌクレオチド配列を野生型PNPポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異PRKDCポリヌクレオチド配列を野生型PRKDCポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異RAG1ポリヌクレオチド配列を野生型RAG1ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異RAG2ポリヌクレオチド配列を野生型RAG2ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異ZAP70ポリヌクレオチド配列を野生型ZAP70ポリヌクレオチド配列に置換することができる。
例示的実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、突然変異HBBポリヌクレオチド配列を野生型HBBポリヌクレオチド配列に置換することができる。
本発明のCRISPR/Cas系は、従来のCRISPR/系as系と比較して驚くほど高い効率を有する標的ポリヌクレオチドを改変することができる。ある特定の実施形態では、改変効率は少なくとも約5%である。ある特定の実施形態では、改変効率は少なくとも約10%である。いくつかの実施形態では、改変効率は約10%から約80%である。いくつかの実施形態では、改変効率は約30%から約80%である。いくつかの実施形態では、改変効率は約50%から約80%である。いくつかの実施形態では、改変効率は約80%以上である。
本発明のCRISPR/Cas系を使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、任意の特定の細胞内において、改変される所望の標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列の発現が疾患に関連するか、または病原体の細胞への侵入を促進する任意のゲノム配列に対応し得ることは容易に理解するであろう。例えば、細胞内において改変する所望の標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する1つのポリヌクレオチド多形体(例えば、鎌状細胞貧血症などの鎌状赤血球症)を含むゲノム配列に対応しているポリヌクレオチド配列であり得る。こうした例では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、疾患関連SNPを野生型対立遺伝子に置き換えること(例えば、ヘモグロビンS内のGlu6ValSNPからVal6Gluへ、ヘモグロビンC内のGlu6LysSNPからLys6Gluへ、ヘモグロビンD内のGlu121GlnSNPからGln121Gluへ、ヘモグロビンO内のGlu121LysSNPからLys121Gluへ置き換えること)によって、疾患関連SNPを修正することができる。別の例として、病原体の細胞への進入または増殖を担う標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の機能を切断し、病原体の細胞への進入または細胞内での増殖を阻止するための消失または挿入に好適な標的であり得る。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳類ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的配列は突然変異体またはバリアントのゲノム配列(例えば、ADA突然変異体、AK2突然変異体、CD3D突然変異体、DCLRE1C突然変異体、IL2RG突然変異体、IL7R突然変異体、JAK3突然変異体、LIG4突然変異体、NHEJ1突然変異体、PNP突然変異体、PRKDC突然変異体、RAG1突然変異体、RAG2突然変異体、ZAP70突然変異体、HBB突然変異体)である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム突然変異体またはバリアントの配列(例えば、ADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2、ZAP70、HBB)である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異体またはバリアントの哺乳類ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳類突然変異体またはバリアントのゲノム配列である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、病原性ゲノム配列である。例示的病原性ゲノム配列としては、限定されるものではないが、ウイルス性ゲノム配列、細菌性ゲノム配列、真菌ゲノム配列、毒素ゲノム配列、または寄生虫ゲノム配列が挙げられる。こうした実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系を使用して、病原体のゲノム配列(例えば、細胞内に進入する危険があるかまたは一旦、病原体が細胞内にあれば、増殖、成長若しくは生存を担うゲノム配列)を切断することによって病原体の機能を切断(例えば、病原体による感染の処理または予防)することができる。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、SCID関連ポリヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ADAまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ADAのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ADAの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ADAのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、AK2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、AK2のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするAK2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列2をコードするAK2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列3をコードするAK2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、AK2の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、AK2のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CD3Dまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CD3Dのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするCD3Dまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列2をコードするCD3Dまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CD3Dの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、CD3Dのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、DCLRE1Cまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、DCLRE1Cのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするDCLRE1Cまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするDCLRE1Cまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、DCLRE1Cコード配列2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列3をコードするDCLRE1Cまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列4をコードするDCLRE1Cコードまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、DCLRE1Cの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、DCLRE1Cのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL2RGまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL2RGのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL2RGの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL2RGのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL7Rまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL7Rのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL7Rの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、IL7Rのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、JAK3またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、JAK3のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、JAK3の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、JAK3のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、LIG4またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、LIG4のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするLIG4またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列2をコードするLIG4またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列3をコードするLIG4またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、LIG4の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、LIG4のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NHEJ1またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NHEJ1のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NHEJ1の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、NHEJ1のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PNPまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PNPのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PNPの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PNPのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PRKDCまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PRKDCのバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするPRKDCまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列2をコードするPRKDCまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PRKDCの相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、PRKDCのオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG1またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG1のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG1の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG1のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG2のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするRAG2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列2をコードするRAG2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列3をコードするRAG2またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG2の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、RAG2のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ZAP70またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ZAP70のバリアントまたはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列1をコードするZAP70またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列2をコードするZAP70またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ZAP70の相同体またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ZAP70のオルソログまたはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、SCD関連ポリヌクレオチド配列(例えば、HBBの突然変異体、NCBI遺伝子ID:3043)またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、SCD関連ポリヌクレオチド配列の変異型相同体(例えば、HBBの変異相同体)またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、SCD関連ポリヌクレオチド配列の変異型オルソログ(例えば、HBBの変異オルソログ)またはその一部である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(例えば、HBBの突然変異体)である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の変異型相同体(例えば、HBBの変異相同体)またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の変異型オルソログ(例えば、HBBの変異オルソログ)またはその一部である。これらの標的ポリヌクレオチド配列の関連部分は、それぞれ、図1、図2〜図4、図5〜図6、図7〜図10、図12、図13、図14、図15〜図17、図18、図19、図20〜図21、図22、図23〜図25、図26〜図27及び図11に示すガイド配列に対応する。
本発明のCRISPR/Cas系により、さまざまな方法で標的ポリヌクレオチド配列を切断できることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。
本発明の方法を使用して、CRISPR/Cas系の少なくとも1つのリボ核酸がCasタンパク質に指向し、標的モチーフへのハイブリッド形成が可能になる、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列が好適な標的モチーフを含む限り、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、特定のポリヌクレオチドを標的にする標的モチーフは、用いられるCRISPR/Cas系及び標的とされるポリヌクレオチドの配列に依存することを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、長さが少なくとも20bpである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Gで始まる20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、G(N)19NGGである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、(N)20NGGである。それぞれのADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、HBB、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2及びZAP70標的ポリヌクレオチドモチーフ配列の標的モチーフの型は、それぞれ、図1、2〜4、5〜6、7〜10、11、12、13、14、15〜17、18、19、20〜21、22、23〜25及び26〜27の「部位型」縦列に見出すことができることを理解すべきである。
本発明の標的モチーフは、本発明のCRISPR/Cas系のオフターゲット効果を最小限に抑えるように選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含むように標的モチーフが選択される。当業者は、オフターゲット効果を最小限に抑えるために様々な技術を使用して好適な標的モチーフを選択できる(例えば、バイオインフォマティクス解析)ことは理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系は、相同性指向性修復を用いて、標的ポリヌクレオチド配列を修正する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。外因性導入DNA修復テンプレートは、一本鎖または二本鎖であり得る。外因性導入DNA修復テンプレートは、任意の長さであってもよい。当業者は、任意の特定のDNA修復テンプレートの長さは、修正される標的ポリヌクレオチド配列に依存することを理解するであろう。DNA修復テンプレートは、任意の標的ポリヌクレオチド配列、特に疾患関連多型(例えば、SNP)を含む標的ポリヌクレオチド配列を修復するまたは置き換えるように設計され得る。例えば、こうしたSNPを含む突然変異体対立遺伝子の相同性指向性修復は、突然変異体対立遺伝子に隣接する2つの標的モチーフを選択することによって、及び野生型対立遺伝子に適合するDNA修復テンプレートを設計することによって、CRISPR/Cas系を用いて達成することができる。
例示的実施形態では、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列は、DNA修復テンプレートとして対応する正常な野生型遺伝子配列を使用して、相同性指向性修復により修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体ADA)は、正常野生型ADA配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体AK2)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型AK2配列(例えば、配列1をコードする野生型AK2、配列2をコードするAK2及び配列3をコードするAK2またはその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体CD3D)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型CD3D配列(例えば、配列1をコードする野生型CD3D、配列2をコードするCD3D及びその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体DCLRE1C配列)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型DCLRE1C配列(例えば、配列1をコードする野生型DCLRE1C、配列2をコードするDCLRE1C、配列3をコードするDCLRE1C及び配列4をコードするDCLRE1Cまたはその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体IL2RG)は、正常野生型IL2RG配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体IL7R)は、正常野生型IL7R配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体JAK3)は、正常野生型JAK3配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体LIG4)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型LIG4配列(例えば、配列1をコードする野生型LIG4、配列2をコードするLIG4、配列3をコードするLIG4またはその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体NHEJ1)は、正常野生型NHEJ1配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体PNP)は、正常野生型PNP配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体PRKDC)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型PRKDC配列(例えば、配列1をコードする野生型PRKDC、配列2をコードするPRKDC及びその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体RAG1)は、正常野生型RAG1配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体RAG2)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型RAG2配列(例えば、配列1をコードする野生型RAG2、配列2をコードするRAG2、配列3をコードするRAG2またはその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCID関連ポリヌクレオチド関連配列(すなわち、突然変異体ZAP70)は、DNA修復テンプレートとして、正常な野生型ZAP70配列(例えば、配列1をコードする野生型ZAP70、配列2をコードするZAP70及びその一部)を使用して相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的SCD関連ポリヌクレオチド関連配列は、正常野生型HBB配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
代表的実施形態において、切断された標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド関連配列は、正常野生型HBB配列またはその一部をDNA修復テンプレートとして使用して、相同性指向性修復によって修正される。
いくつかの実施形態では、本発明のCRISPR/Cas系としては、Casタンパク質及び標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにCasタンパク質を指向し、かつハイブリッド形成が可能な少なくとも1つから2つのリボ核酸が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義的に使用され、ペプチド結合(すなわち、アミノ酸ポリマー)によって結合した一連のアミノ酸残基を意味し、変性アミノ酸(例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など)及びアミノ酸類似体を含む。例示的ポリペプチドまたはタンパク質類としては、遺伝子産生物、天然タンパク質、相同遺伝子、側系遺伝子、断片及び上記の他の等価物、バリアント及び類似体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は1つ以上のアミノ酸置換基または変異を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換は保守的アミノ酸置換を含む。場合によっては、細胞中における置換及び変異によりタンパク質分解の阻止若しくは低減及び/またはポリペプチドの半減期の延長が可能である。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、ペプチド結合置換基(例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など)を含むことができる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は天然アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は代替アミノ酸(例えば、D−アミノ酸、β−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど)を含むことができる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は任意の部分(例えば、PEG化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど)を含む改変を含むことができる。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、コアCasタンパク質を含む。例示的なCasコアタンパク質としては、限定されないが、Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8及びCas9が挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、大腸菌サブタイプ(CASS2としても公知)のCasタンパク質を含む。大腸菌サブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4及びCas5eが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Ypestサブタイプ(CASS3としても公知)のCasタンパク質を含む。Ypestサブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Csy1、Csy2、Csy3及びCsy4が挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Nmeniサブタイプ(CASS4としても公知)のCasタンパク質を含む。Nmeniサブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Csn1及びCsn2が挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Dvulgサブタイプ(CASS1としても公知)のCasタンパク質を含む。Dvulgサブタイプの例示的Casタンパク質としては、Csd1、Csd2及びCas5dが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Tneapサブタイプ(CASS7としても公知)のCasタンパク質を含む。Tneapサブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Cst1、Cst2及びCas5tが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、HmariサブタイプのCasタンパク質を含む。Hmariサブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Csh1、Csh2及びCas5hが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Apernサブタイプ(CASS5としても公知)のCasタンパク質を含む。Apernサブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5及びCas5aが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Mtubeサブタイプ(CASS6としても公知)のCasタンパク質を含む。Mtubeサブタイプの例示的なCasタンパクとしては、限定されないが、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4及びCsm5が挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質はRAMPモジュールCasタンパク質を含む。例示的RAMPモジュールCasタンパク質としては、限定されないが、Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5及びCmr6が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes(化膿レンサ球菌) Cas9タンパク質またはその官能性部分である。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、任意の細菌種またはそれらの官能性部分由来のCas9タンパク質である。Cas9タンパク質は、典型的には、トランス−コード小型RNA(tracrRNA)、内因性リボヌクレアーゼ3(rnc)及びCasタンパク質を含むII型CRISPR系のメンバーである。Cas9タンパク質(CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9/Csn1としても公知)は、1368のアミノ酸を含むポリペプチドである。Cas9タンパク質の例示的アミノ酸配列(配列番号:298)は、図28に示す。Cas9は、crRNAに非相補的である標的DNAを切断するRuvC−様ドメイン(残基7〜22、759〜766及び982〜989)及びcrRNAに相補的である標的DNAを切断するHNHヌクレアーゼドメイン(残基810〜872)など、2つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。図28では、RuvC様ドメインは黄色で強調表示し、HNHヌクレアーゼドメインは下線で表示する。
本明細書で使用するとき、「官能性部分」とは、少なくとも1つのリボ核酸(例えば、ガイドRNA(gRNA))と複合体化し、標的ポリヌクレオチド配列を切断する能力を保持するペプチドの一部を指す。いくつかの実施形態では、官能性部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されるCas9タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む。いくつかの実施形態では、官能性ドメインは複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質の官能性部分は、RuvC様ドメインの官能性部分を含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質の官能性部分は、HNHヌクレアーゼドメインの官能性部分を含む。
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列とCasタンパク質(例えば、Cas9)を接触させるさまざまな方法を企図することは理解すべきである。いくつかの実施形態では、外因性Casタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞内に導入することができる。ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされ得るか、または融合され得る。本明細書で使用するとき、「細胞透過性ポリペプチド」及び「細胞透過性ペプチド」とは、それぞれ、分子の細胞への取り込みを促進するポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能なラベルを含有することができる。
ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、(例えば、陽性、陰性または全体の中性の電荷を担持する)電荷タンパク質にコンジュゲートされ得るか、または融合され得る。このような連結は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を超正電荷GFPに融合させて、Casタンパク質の能力を有意に増大させ、細胞を貫通させことができる(Cronican et al.ACS Chem Biol.2010;5(8):747〜52)。
ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)に融合させて、その細胞への導入を促進させることができる。例示的PTDとしては、Tat、オリゴアルギニン及びペネトラチンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、PTDに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、tatドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、penetratinドメインに融合されたCas9ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、超正電荷GFPに融合されたCas9ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Casタンパク質(例えば、Cas9)をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することができる。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって行うことができる。好適な技術としては、リン酸カルシウム法または脂質媒介トランスフェクション法、電気穿孔法、及び形質導入法またはウイルスベクターを用いた感染法が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はDNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように修飾DNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸はmRNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるように修飾mRNA(例えば、合成、修飾mRNA)を含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、1つから2つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質及び1つから2つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質及び1つから2つのリボ核酸は、本明細書に記載されるように、脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾リボ核酸(例えば合成、修飾mRNA)によってコードされる。
本発明の方法は、Casタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成することができる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、tracrRNAを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、CRISPR RNA(crRNA)を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも1つは、細胞中においてCasタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させるガイドRNAを含む。
本発明のリボ核酸は、当業者によって理解されるように、用いられる特定のCRISPR/Cas系系及び標的ポリヌクレオチドの配列に依存して、さまざまな異なる標的モチーフにハイブリッド形成するために選択され得る。また、1つから2つのリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるようにも選択することができる。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ酸は、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計される。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸はそれぞれ、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているCasタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計される。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGからなる群から選択される配列を含む。これまでの配列は、ガイドRNA内のプロトスペーサー配列であり、後者の配列は、プロトスペーサー及びPAMであることを理解すべきである。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記の1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜図15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜図15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのいずれかの少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つのリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
また、本発明は、多重のゲノム編集を意図する。当業者は、単一の遺伝子のゲノム編集に関する上記の説明は、以下の多重のゲノム編集の実施形態に同様に適用可能であることを理解するであろう。
別の態様では、本発明は、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法は、細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチドを同時に改変する方法を含む。
細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する例示的方法は、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させること、を含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
いくつかの実施形態では、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法は、細胞中において複数の標的SCD関連ポリヌクレオチドを同時に改変する方法を含む。
細胞中において複数の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する例示的方法は、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることを含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
いくつかの実施形態では、細胞中において複数の標的ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法は、細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチドを同時に改変する方法を含む。
細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する例示的方法は、ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させること、を含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
更に別の態様では、本発明は、対象においてポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象においてポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、(a)SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を対応する野生型または正常なポリヌクレオチド配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列を野生型または正常な遺伝子配列と置き換えることができる。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がADAポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なADAポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がAK2ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なAK2ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がCD3Dポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なCD3Dポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がDCLRE1Cポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なDCLRE1Cポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がIL2RGポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なIL2RGポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がIL7Rポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なIL7Rポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がJAK3ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なJAK3ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がLIG4ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なLIG4ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がNHEJ1ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なNHEJ1ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がPNPポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なPNPポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がPRKDCポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なPRKDCポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がRAG1ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なRAG1ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がRAG2ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なRAG2ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がZAP70ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なZAP70ポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、対象においてポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、(a)SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、エキソビボで細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
いくつかの実施形態では、対象においてポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法は、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を含む。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の例示的治療方法または予防方法は、(a)エキソビボで細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)が切断されることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約50%から約80%である。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
本明細書で使用するとき、「投与すること」「埋め込むこと」及び「移植すること」という用語は、導入された細胞が所望の部位にて少なくとも一部局在化する方法または経路によって、本発明の方法に従って改変された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載の細胞などの細胞を対象内に配置する文脈において同義的に使用される。細胞は、直接所望の部位に埋め込むことができるか、あるいは、埋め込まれた細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が依然として生存可能である対象内の所望の場所に送達される任意の好適な経路で投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間度は、24時間などの数時間から数日、数年ほどの長さであり得る。また、場合によっては、細胞は、例えばカプセルで、肝臓または皮下など所望の部位以外の場所に投与され、埋め込まれた細胞を埋め込み場所で保持し、埋め込まれた細胞の移動を回避することができる。
エクスビボ法では、細胞としては、自家細胞、すなわち、細胞(複数可)中において標的ポリヌクレオチド配列の改変を必要とする対象由来の細胞(複数可)(すなわち、ドナー及びレシピエントが同一個体である)を挙げることができる。自家細胞は、細胞の任意の免疫ベースの拒絶を回避する利点を有する。あるいは、細胞は、例えば、ドナー由来の異種であってもよい。第2の対象は、同一のまたは異なる種のものであってもよい。典型的には、細胞がドナー由来である場合、免疫学的にレシピエントと十分に適合性がある、すなわち、移植拒絶を受けることのないドナー由来のものとなり、免疫抑制の必要性が低減するか、または不要となる。いくつかの実施形態では、細胞は異種供給源(すなわち、レシピエントまたはレシピエントの種と十分に免疫学的適合性があるように遺伝子組み換えされた非ヒト乳房哺乳類)から採取される。免疫親和性の判定方法は、当技術分野において既知であり、HLA及びABO判定のドナー−レシピエント適合性を評価する組織適合検査が挙げられる。例えば、Transplantation Immunology,Bach and Auchincloss, Eds.(Wiley, John & Sons,Incorporated 1994)を参照されたい。
任意の好適な細胞培養物培地を、本発明のエクスビボ法に使用可能である。
対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の別の例示的治療方法または予防方法は、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成され、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を対応する野生型または正常なポリヌクレオチド配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列を対応する野生型または正常なポリヌクレオチド配列と置き換えることができる。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がADAポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なADAポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がAK2ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なAK2ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がCD3Dポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なCD3Dポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がDCLRE1Cポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なDCLRE1Cポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がIL2RGポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なIL2RGポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がIL7Rポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なIL7Rポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がJAK3ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なJAK3ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がLIG4ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なLIG4ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がNHEJ1ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なNHEJ1ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がPNPポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なPNPポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がPRKDCポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なPRKDCポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がRAG1ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なRAG1ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がRAG2(複数)ポリヌクレオチド配列を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なRAG2ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がZAP70ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なZAP70ポリヌクレオチド配列を含む。
対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の別の例示的治療方法または予防方法は、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、細胞中において標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)が切断され、これによって、ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の別の例示的治療方法または予防方法は、細胞中において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われること、を含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
「対象」及び「個体」という用語は、本明細書において同義的に用いられ、例えば、細胞を得ることができる及び/または予防的処置など、本明細書に記載されるように細胞を用いて処置を行うことができるヒトなどの動物を意味し、提供される。ヒト対象など特定の動物に特異的である感染、状態または病態の処置については、用語対象は、その特定の動物を指す。本明細書において同義的に用いられる「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳類」は、ラット、ネズミ、ウサビ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ及び非ヒト霊長類などの哺乳類が挙げられる。また、「対象」は、限定されないが哺乳類、爬虫類、両生類及び魚類など任意の脊椎動物を包含する。しかし、有利にも、対象は、ヒトなどの哺乳類またはイヌ、ネコ、ウマなどの半飼育哺乳類などの他の哺乳類またはウシ、ヒツジ、ブタなどの産生哺乳類である。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ADAポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的AK2ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的CD3Dポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的DCLRE1Cポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的IL2RGポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的IL7Rポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的JAK3ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的LIG4ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的NHEJ1ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的PNPポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的PRKDCポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的RAG1ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的RAG2ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的ZAP70ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。例示的実施形態では、改変により、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する。いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ADAポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的AK2ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的CD3Dポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的DCLRE1Cポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的IL2RGポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的IL7Rポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的JAK3ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的LIG4ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的NHEJ1ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的PNPポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的PRKDCポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的RAG1ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的RAG2ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的ZAP70ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。例示的実施形態では、改変により、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる。
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列(複数)の好ましくない配列(複数)から所望の配列(複数)への修正をもたらす。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型ポリヌクレオチド配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型ADA配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型AK2配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型CD3D配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型DCLRE1C配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型IL2RG配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型IL7R配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型JAK3配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型LIG4配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型NHEJ1配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型PNP配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型PRKDC配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型RAG1配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型RAG2配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型ZAP70配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型HBB配列(複数)に修正される。例示的実施形態では、改変により、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)が対応する正常な野生型HBB配列(複数)に修正される。いくつかの実施形態では、各改変は、同型接合改変である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約5%から約80%である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約10%から約80%である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約30%から約80%である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での改変効率は約50%から約80%である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座での変化効率は、約80%以上である。
いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるADA部分(例えば、ADA遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ADAの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるAK2部分(例えば、AK2遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、AK2の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるCD3D部分(例えば、CD3D遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、CD3Dの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるDCLRE1C部分(例えば、DCLRE1C遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、DCLRE1Cの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるIL2RG部分(例えば、IL2RG遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、IL2RGの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるIL7R部分(例えば、IL7R遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、IL7Rの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるJAK3部分(例えば、JAK3遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、JAK3の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるLIG4部分(例えば、LIG4遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、LIG4の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるNHEJ1部分(例えば、NHEJ1遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、NHEJ1の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるPNP部分(例えば、PNP遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、PNPの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるPRKDC部分(例えば、PRKDC遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、PRKDCの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるRAG1部分(例えば、RAG1遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、RAG1の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるRAG2部分(例えば、RAG2遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、RAG2の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるZAP70部分(例えば、ZAP70遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、ZAP70の少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、複数の異なるHBB部分(例えば、HBB遺伝子内の1つ以上の突然変異)を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列(複数)は、HBBの少なくとも一部分を含む。
いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Gから始まる20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列であり、Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある。いくつかの実施形態において、各標的モチーフは、G(N)19NGGである。いくつかの実施形態において、各標的モチーフは、(N)20NGGである。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように各標的モチーフが選択される。いくつかの実施形態では、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように各標的モチーフが選択される。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列(複数)の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では外因性導入DNA修復テンプレートは、二本鎖である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型ADA配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ADA配列に対応する正常または野生型ADA配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型AK2配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異AK2配列に対応する正常または野生型AK2配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型CD3D配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異CD3D配列に対応する正常または野生型CD3D配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型DCLRE1C配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異DCLRE1C配列に対応する正常または野生型DCLRE1C配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型IL2RG配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異IL2RG配列に対応する正常または野生型IL2RG配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型IL7R配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異IL7R配列に対応する正常または野生型IL7R配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型JAK3配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異JAK3配列に対応する正常または野生型JAK3配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型LIG4配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異LIG4配列に対応する正常または野生型LIG4配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型NHEJ1配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異NHEJ1配列に対応する正常または野生型NHEJ1配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型PNP配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異PNP配列に対応する正常または野生型PNP配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型PRKDC配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異PRKDC配列に対応する正常または野生型PRKDC配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型RAG1配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異RAG1配列に対応する正常または野生型RAG1配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型RAG2配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異RAG2配列に対応する正常または野生型RAG2配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型ZAP70配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCID関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異ZAP70配列に対応する正常または野生型ZAP70配列である。
いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、正常または野生型HBB配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、SCD関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異HBB配列に対応する正常または野生型HBB配列である。いくつかの実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を含む突然変異HBB配列に対応する正常または野生型HBB配列である。
いくつかの実施形態では、Casタンパク(例えばCas9)質は、複数のリボ核酸と複合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Casタンパク質及び複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Casタンパク質及び複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸及び複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Casタンパク質をコードする核酸及び複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようにCasタンパク質をコードする修飾合成mRNA及び修飾合成RNAを含む少なくとも1つの複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようにCas9タンパク質をコードする修飾合成mRNA及び修飾合成RNAを含む少なくとも1つの複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列(例えば、1つの標的ポリヌクレオチド配列の複数の改変)以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列(複数)(例えば、複数の標的ポリヌクレオチド配列の1つ以上の改変)以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ酸はそれぞれ、細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接しているCasタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1〜15のリボ核酸配列及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択される異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、上記の複数のリボ核酸の異なる配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。
例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、複数のリボ核酸の配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも12のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも12のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、GTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも13のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも13のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、AGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも14のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも14のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、CAGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも15のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも15のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、TCAGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも16のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも16のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、CTCAGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも17のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも17のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、GCTCAGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも18のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも18のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも19のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも19のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のリボ核酸の異なる配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも20のヌクレオチ断片配列を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも12のヌクレオチド断片を含む複数のリボ核酸の異なる配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTを含む。
任意のCasタンパク質またはリボ核酸は、プラスミドから発現し得ることは理解するべきである。いくつかの実施形態では、任意のCasタンパク質またはリボ核酸は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)内での発現を増加させるために最適化されたプロモーターを用いて発現させる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明の本方法は、Casタンパク質を発現する細胞を選択することを更に含む。本発明は、細胞を選択する任意の好適な方法を企図する。いくつかの実施形態では、細胞を選択することにはFACSが挙げられる。いくつかの実施形態では、FACSを使用して、Casタンパク質及び緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質を共発現する細胞を選択する。
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連するさまざまな疾患を処置及び/または予防すること企図する。本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加並びに標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少に関連する疾患の処置または予防を行うことができることは理解すべきである。標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加及び減少としては、正常な発現及び/または活性レベルと比較して、標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルがそれぞれ増加または減少する状況並びに機能及び/または標的ポリヌクレオチド配列の発現生成物の活性レベルがそれぞれ増加または減少する状況が挙げられる。当業者は、本明細書に記載の方法を適用するか、または組成物を投与した後、関連のある細胞内において標的ポリヌクレオチド配列(またはその発現生成物)のレベル及び/または活性が減少しているかを判断することによって、標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加に関連する疾患を治療または予防することが評価され得ることを理解するであろう。当業者は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少に関連する疾患を治療または予防することは、本明細書に記載の方法を適用するか、または組成物を投与した後、関連のある細胞内において標的ポリヌクレオチド配列(またはその発現生成物)のレベル及び/または活性が増加しているかを判断することによって評価され得ることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は一遺伝性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は多重遺伝子性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は1つ以上のSNPと関連した疾患である。1つ以上のSNPに関連する例示的疾患としては、米国特許第7,627,436号に記載の複合病、国際出願公開WO/2009/112882号に記載のアルツハイマー病、米国特許明細書第2011/0039918号に記載の炎症性疾患、米国特許明細書第2012/0309642号に記載の多嚢胞性卵巣症候群、米国特許第7,732,139号に記載の心臓血管系疾患、米国特許明細書第2012/0136039号に記載のハンチントン病、欧州特許明細書公開第EP2535424号に記載の血栓塞栓症、国際出願公開WO/2012/001613号に記載の神経血管性疾患、米国特許明細書第2010/0292211号に記載の精神病、米国特許明細書第2011/0319288号に記載の多発硬化症、国際出願公開WO/2006/023719A2に記載の統合失調症状、分裂情動障害及び双極性障害、米国特許明細書第号2011/0104674号に記載の双極性障害及び他の病気、国際出願公開WO/2006/104370A1号に記載の大腸癌、米国特許公開第2006/0204969号に記載のAKT1遺伝子座に近接するSNPに関連する疾患、国際出願公開第WO/2003/012143A1号に記載の摂食障害、米国特許公開第2007/0269827号に記載の自己免疫病、米国特許第7,790,370号に記載のクローン病(Chrohn’s disease)患者の線維性狭窄疾患及び米国特許第8,187,811号に記載のパーキンソン病などが挙げられ、それぞれ全体が参照によって本明細書に援用される。本発明の方法に従って処置または予防され得る1つ以上のSNPに関連する他の疾患は、当事者には明かである。
いくつかの実施形態では、疾患は重度複合免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患は中程度のX連鎖性複合免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患はX連鎖性重度複合免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患はアデノシン脱アミノ酵素欠乏またはアデノシン脱アミノ酵素欠乏関連SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患はAthabascan型SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患はT細胞−陰性、B細胞/ナチュラルキラー細胞陽性SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患はT陰性/B陽性型常染色体劣性SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患は電離放射線過敏症を伴うSCIDである。いくつかの実施形態では、疾患は小頭症、成長遅滞及び電離放射線過敏症を伴うSCIDである。いくつかの実施形態では、疾患は細網異形成症である。いくつかの実施形態では、疾患はLIG4症候群である。いくつかの実施形態では、疾患はγ/δT細胞増加、重症サイトメガロウイルス感染及び自己免疫を伴うα/βT細胞リンパ球減少症である。いくつかの実施形態では、疾患は肉芽腫を伴う複合型細胞性免疫不全及び体液性免疫不全である。いくつかの実施形態では、疾患はB細胞陰性SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患は選択的T細胞欠損症またはSCIDに関連する選択的T細胞欠損症である。いくつかの実施形態では、疾患はプリンヌクレオシドホスホリル欠損症またはプリンヌクレオシドホスホリル欠損症関連SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患はオーメン症候群である。いくつかの実施形態では、疾患は不全リンパ球症候群である。いくつかの実施形態では、疾患はJAK3突然変異関連SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患はDCLRE1C突然変異関連SCIDである。いくつかの実施形態では、疾患は本明細書に列挙した遺伝子表現型関係表のいずれか1つに列挙されている疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球貧血症である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球症である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球貧血症である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状βサラセミアである。いくつかの実施形態では、疾患はβサラセミアである。
本発明の方法では、さまざまな異なる細胞中において標的ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、その後対象に導入するために、エキソビボで細胞中において標的ポリヌクレオチド配列(複数)を改変する。いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、インビボで細胞中において標的ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することができる。いくつかの実施形態では、細胞は末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞または多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34動員末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、CD34臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はCD34+CD38−系譜−CD90+CD45RA−細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は一次ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非形質転換細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は腫瘍細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は形質転換細胞ではない。
いくつかの態様では、本発明は、SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供し、該方法は、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内のSCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列は切断され、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である。
いくつの態様では、本発明は、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列が切断され、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
いくつの態様では、本発明はヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミポリヌクレオチド配列が切断され、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、細胞中の標的βサラセミポリヌクレオチド配列を改変する方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供し、該方法は、(a)ヒト多能性細胞、初代人細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、エキソビボで細胞中において、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を対応する正常なまたは野生型ポリヌクレオチド配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列を対応する正常なまたは野生型ポリヌクレオチド配列と置き換えることができる。標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がADAポリヌクレオチド配列を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なADAポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がAK2ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なAK2ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がCD3Dポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なCD3Dポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がDCLRE1Cポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なDCLRE1Cポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がIL2RGポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なIL2RGポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がIL7Rポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なIL7Rポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がJAK3ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なJAK3ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がLIG4ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なLIG4ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がNHEJ1ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なNHEJ1ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がPNPポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なPNPポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がPRKDCポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なPRKDCポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がRAG1ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なRAG1ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がRAG2ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なRAG2ポリヌクレオチド配列を含む。
標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)がZAP70ポリヌクレオチド配列(複数)を含む実施形態では、外因性導入DNA修復テンプレートは、対応する野生型または正常なZAP70ポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代人細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供し、該方法は、(a)エキソビボで細胞中、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフにハイブリッド形成され、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法を提供し、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である。
いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、本方法には、切断した標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を対応する正常なまたは野生型配列(例えば、ADA遺伝子、AK2遺伝子、CD3D遺伝子、DCLRE1C遺伝子、IL2RG遺伝子、IL7R遺伝子、LIG4遺伝子、NHEJ1遺伝子、PNP遺伝子、PRKDC遺伝子、RAG1遺伝子、RAG2遺伝子、ZAP70遺伝因子)を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を対応する正常なまたは野生型配列(例えば、ADA遺伝子、AK2遺伝子、CD3D遺伝子、DCLRE1C遺伝子、IL2RG遺伝子、IL7R遺伝子、LIG4遺伝子、NHEJ1遺伝子、PNP遺伝子、PRKDC遺伝子、RAG1遺伝子、RAG2遺伝子、ZAP70遺伝因子)と置き換えることができる。
いくつの態様では、本発明は細胞中の複数の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断した標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を正常なHBB配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、細胞中の複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることを含み、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である。
いくつかの実施形態では、本方法には、切断した標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を正常なHBB配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞中においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)が切断され、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を対応する正常なまたは野生型配列(例えば、ADA遺伝子、AK2遺伝子、CD3D遺伝子、DCLRE1C遺伝子、IL2RG遺伝子、IL7R遺伝子、LIG4遺伝子、NHEJ1遺伝子、PNP遺伝子、PRKDC遺伝子、RAG1遺伝子、RAG2遺伝子、ZAP70遺伝因子)を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列の突然変異部分を正常なまたは野生型配列(例えば、ADA遺伝子、AK2遺伝子、CD3D遺伝子、DCLRE1C遺伝子、IL2RG遺伝子、IL7R遺伝子、LIG4遺伝子、NHEJ1遺伝子、PNP遺伝子、PRKDC遺伝子、RAG1遺伝子、RAG2遺伝子、ZAP70遺伝因子)と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であり、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復により、切断したSCD関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
いくつかの態様では、本発明は、対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、該方法は、(a)エキソビボで細胞中において、ヒト多能性細胞、初代人細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を改変することであって、リボ核酸は、Casタンパク質を標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)が切断され、Casタンパク質を発現する細胞の変化効率は約8%から約80%であることと、(b)その細胞を対象に導入することであって、これによって、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法には、その細胞を対象に導入するステップの前に、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を正常なHBB配列を含む外因性導入DNA修復テンプレートと接触させるステップを含み、それによって、相同性指向性修復によって、切断したβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を正常なHBB配列と置き換えることができる。
本発明は、細胞中に本発明のCasタンパク質またはその官能性部分、Casタンパク質またはその官能性部分をコードする核酸、及びCasタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチドの標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させるリボ核酸配列(複数)を含む組成物を提供する。
対象に投与する場合、本明細書にて開示した組成物は、例えば、薬学的に許容可能な組成物中で対象に投与され得る。薬学的に許容可能な組成物は、治療有効量の本発明のCasタンパク質またはその官能性部分、Casタンパク質をコードする核酸(例えば、修飾合成mRNA)、及びCasタンパク質を指向させ、かつハイブリッド形成させる、リボ核酸配列(複数)を、1つ以上の薬学的に許容可能な担体(添加剤類)及び/または希釈剤と共に調合されて含む。
詳細に後述のように、本発明の医薬組成物は、次に適合する形態など、固体形態または液体形態で投与するために特別に配合されてもよい:(1)例えば、飲薬(水性溶液または非水性溶液、または懸濁液)、ロゼンジ、糖衣丸、カプセル、ピル、錠剤(例えば、頬、舌下、全身吸収を標的とするもの)、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト剤などの経口投与、(2)例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液、または徐放性製剤としての非経口投与(例えば、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは硬膜外注入)、(3)局所投与(例えば、クリーム、軟膏剤若しくは徐放性パッチ、または皮膚に塗布する噴霧)、(4)腟内若しくは直腸内投与(例えば、膣座薬、クリーム、若しくは発泡体)、(5)舌下投与、(6)眼投与、(7)経皮的投与、(8)経粘膜的投与、または(9)経鼻投与。さらに、化合物は、患者に埋め込むことができるかまたは薬物送達系を用いて注入させることができる。例えば、Urquhart,et al.,Ann. Rev. Pharmacol.Toxicol. 24:199〜236(1984);Lewis, ed.「Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals」(Plenum Press,New York,1981)、米国特許明細書第3,773,919号及び米国特許明細書第35 3,270,960号を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、健全な医学的判断の範囲内であり、ヒト及び動物の組織との接触に使用するのに好適であり、過度の毒性、炎症、アレルギー応答または他の問題若しくは合併症を有さず、正当な有益性/リスク比に相応である、これらの化合物、材料、組成物及び/または投薬形態を指す。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的に許容可能な物質、組成物または例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤(例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、カルシウム若しくはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸)などのビヒクル、または身体の1つの臓器若しくは一部から身体の別の臓器若しくは部分の対象化合物の担持若しくは運搬に伴う溶媒封入材料を指す。各担体は、製剤の他の成分と親和性があり、患者に有害ではないという意味で「許容可能」である必要がある。薬学的に許容可能な担体として機能し得るいくつかの材料の例としては、(1)糖(例えばラクトース、グルコース及びショ糖)、(2)デンプン(例えば、コーンスターチ、及び、バレイショデンプン)、(3)セルロース及びその誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース及び酢酸セルロースなど)、(4)トラガント末、(5)麦芽、(6)ゼラチン、(7)滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、硫酸ラウリルナトリウム及びタルク)、(8)賦形剤(例えばカカオバター及び坐薬ワックス)、(9)油(例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油)、(10)グリコール(例えば、プロピレングリコール)、(11)多価アルコール(例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール(PEG))、(12)エステル(例えばオレイン酸エチル及びエチルラウリン酸)、(13)寒天、(14)緩衝薬(例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム)、(15)アルギン酸、(16)発熱性物質非含有水、(17)等張食塩水、(18)リンガー溶液、(19)エチルアルコール、(20)pH緩衝液、(21)ポリエステル、ポリカーボネート及び/またはポリ無水物、(22)増量剤、(例えばポリペプチド及びアミノ酸)(23)血清成分(例えば血清アルブミン、HDL及びLDL)、(22)C2〜C12のアルコール(例えば、エタノール)、及び(23)医薬組成物で使用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香料添加剤、芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤もまた配合物内に存在し得る。「賦形剤」「担体」「薬学的に許容される担体」という用語などは、本明細書では同義的に用いられる。
本明細書で使用するとき、本明細書に記載のCasタンパク質及び/またはリボ核酸に関して、語「治療有効量の」という表現は、動物における少なくとも細胞の副集団において、任意の薬物療法に適用可能である正当な有益性/リスク比にて若干の所望の治療効果を生み出すために有効である、関連のあるタンパク質及び/若しくはリボ核酸またはこれら含む組成物の量を指す。例えば、鎌状細胞貧血症において少なくとも1つの症状(例えば、赤血球計数の減少)における統計上有意であり計測可能な変化を生み出すのに十分な対象ヘの投与量である。治療的有効量の決定は、十分当業者の能力の範囲内である。概して、治療的有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別並びに重症度及び対象における病状の型及び他の薬学的活性剤の投与に応じて変動し得る。
本明細書で使用するとき、「投与すること」という用語は、所望の効果を生み出すように組成物を所望の部位にて少なくとも一部局在化することになる方法または経路によって対象内に組成物を配置すること意味する。本明細書に記載の化合物または組成物は、限定されないが、経口経路または非経口経路(静脈内、筋肉内、皮下内、経皮内、気道内(エアゾール)、肺内、経鼻、直腸内及び局所(包含する頬側及び舌下)投与)など、当該技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。
例示的投与様式としては、限定されないが、注射、注入、滴注、吸入または経口摂取が挙げられる。「注射」としては、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、側脳室内脊髄及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。好ましい実施態様では、組成物は静脈内注射または注入によって投与される。
いくつの態様では、本発明は、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGを有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつの態様では、本発明は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。
例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも1つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのいずれかに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、組成物中の少なくとも1つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。
いくつかの実施形態では、組成物中のリボ核酸のうちの少なくとも1つは、本明細書に記載されるように、修飾リボ核酸である(例えば、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む合成修飾リボ核酸、任意の他の修飾ヌクレオチドまたは本明細書に記載の改変)である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物はCasタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はCas9タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質(例えば、Cas9)をコードする核酸は、本明細書に記載されるように、修飾リボ核酸(例えば、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む本明細書に記載の合成修飾mRNA、または任意の他の修飾ヌクレオチドまたは本明細書に記載の改変)を含む。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図1のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図2のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図3のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図4のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図5のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図6のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図7のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図8のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図9のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図10のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図11のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図12のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図13のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図14のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGを有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。
例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも1つの追加のリボ核酸配列のリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのいずれかの少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図1のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図2のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図3のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図4のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図5のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図6のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図7のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図8のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図9のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図10のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図11のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図12のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図13のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図14のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつの態様では、本発明は、Casタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも1つの追加のリボ核酸配列のリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGからなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸のリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、本明細書に記載の少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその官能性部分を含む。
インビボ法では、治療的有効量の本明細書に記載の組成物を、対象に投与し得る。組成物の対象への投与方法は、当技術分野において既知であり、かつ当業者は容易に利用可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連した疾患の治療または予防のための1つ以上の追加の薬学的活性剤を含む。
また、本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキット並びに本発明の組成物を含むキット、細胞中において標的ポリヌクレオチド配列の改変のためのキットを用いるための指示書を提供する。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図1のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図2のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図3のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図4のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図5のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図6のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図7のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図8のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図9のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図10のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図11のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図12のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図13のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図14のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及び図15のリボ核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGを有する少なくとも1つのリボ核酸配列を改変するためのキットを含む。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも1つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図1のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図2のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図3のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図4のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図5のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図6のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図7のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図8のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図9のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図10のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図11のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図12のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図13のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図14のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中においてCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む標的ポリヌクレオチド配列、及び図15のリボ核酸配列からなる群から選択されるリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列またはそれらを組み合わせたものを改変するためのキットを含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸を含む及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記の単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも1つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGのリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図1の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図1のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図2の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図2のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図3の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図3のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図4の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図4のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図5の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図5のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図6の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図6のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図7の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図7のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図8の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図8のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図9の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図9のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図10の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図10のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図11の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図11のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図12の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図12のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図13の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図13のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図14の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図14のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及び図15の少なくとも1つのリボ核酸配列及び図15のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列及びそれらを組み合わせたものからなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつの態様では、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットを含み、該キットはCas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードする核酸、及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも1つのリボ核酸配列及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1つのリボ核酸配列から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸配列は、3つのヌクレオチドNGG配列を含まない。例えば、標的部位配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも1つのリボ核酸配列のリボ核酸配列はGATGCTCAGTACAGCCACCTである。別の例として、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、3つのヌクレオチドNGG配列を含まず単一のヌクレオチドミスマッチを有するリボ核酸配列は、

であり、イタリック体のGは、ミスマッチヌクレオチドである。しかし、当業者は、単一のヌクレオチドミスマッチは、リボ核酸内の任意のヌクレオチド、例えば、リボ核酸の1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、または20番目のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも12のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも13のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも13のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも13のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、AGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも14のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも14のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも14のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも15のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも15のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも15のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも16のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも16のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも16のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、CTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも17のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも17のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも17のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも18のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも18のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも18のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、TGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも19のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも19のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも19のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、ATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列の少なくとも20のヌクレオチ断片を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、図1〜15のいずれかのリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。例えば、標的配列がGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGである場合、少なくとも20のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸のリボ核酸配列は、GATGCTCAGTACAGCCACCTである。
いくつかの実施形態では、上述の少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGの少なくとも12のヌクレオチド断片、少なくとも13のヌクレオチド断片、少なくとも14のヌクレオチド断片、少なくとも15のヌクレオチド断片、少なくとも16のヌクレオチド断片、少なくとも17のヌクレオチド断片、少なくともの18のヌクレオチド断片、少なくとも19のヌクレオチド断片または少なくとも20のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも1つのリボ核酸は、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列の少なくとも12のヌクレオチド断片、少なくとも13のヌクレオチド断片、少なくとも14のヌクレオチド断片、少なくとも15のヌクレオチド断片、少なくとも17のヌクレオチド断片、少なくともの18のヌクレオチド断片、少なくとも19のヌクレオチド断片または少なくとも20のヌクレオチド断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される1種以上の細胞株、培養液または集団を含む。いくつかの実施形態では、キットはDNA修復テンプレートを含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型ADA遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体ADA配列に対応する1つ以上の正常または野生型ADA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型AK2遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体AK2配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型CD3D遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体CD3D配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型DCLRE1C遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体DCLRE1C配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型IL2RG遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体IL2RG配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型IL7R遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体IL7R配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型JAK3遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体JAK3配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型NHEJ1遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体NHEJ1配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型PNP遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体PNP配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型PRKDC遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体PRKDC配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型RAG1遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体RAG1配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型RAG2遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体RAG2配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型ZAP70遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体ZAP70配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、1つ以上の正常または野生型HBB遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体HBB配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、DNA修復テンプレートは、標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)から切断される変異体HBB配列(複数)に対応する1つ以上の正常または野生型DNA遺伝子配列を含む。
本発明の方法、組成物及びキットには、Casタンパク質及び/または本発明のリボ核酸を細胞に送達させるか、または導入するためのビヒクルとしてナノ粒子または脂質ナノ粒子を使用できる点を理解すべきである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む。
カオチン性脂質は、例えば、N,N−ジオレオイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(I−(2,3−ジオレシルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、N−(I−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N−ジメチル−2,3−ジオレイロキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2−ジリノレ二ルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2−ジリノレイルカルバモイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−C−DAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin−DAC)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−モルホリノプロパン(DLin−MA)、1,2−ジリノレオイル−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2−ジリノレイルチオ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−S−DMA)、1−リノレオイル−2−リノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−2−DMAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin−TMA.Cl)、1,2−ジリノレオイル−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin−TAP.Cl)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−(N−メチルピペラジノ)プロパン(DLin−MPZ)、または、3−(N,N−ジリノレイルアミノ)−1,2−プロパンジオール(DLinAP)、3−(N,N−ジオレイルアミノ)−1,2−プロパンジオ(DOAP)、1,2−ジリノレイルオキソ−3−(2-N,Nジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin−EG−DMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)、またはその類似体、(3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニル)テトラヒドロ−−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン(ALNY−100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート(MC3)、または、その混合物であってもよい。
ほぼ生理学的pHで実効正電荷を運搬する、他のカチオン性脂質も、上記に具体的に記述したものに加えて、本発明の脂質粒子に含まれ得る。このようなカチオン性脂質類としては、限定さないが、N,N−ジオレオイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAC」);N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル−N,N−N−トリエチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」);N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(「DDAB」);N−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTAP」);1,2−ジオレイルオキシ−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(「DOTAP.Cl」);3.ベータ(N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(「DCChol」)、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N−2−(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート(「DOSPA」)、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(「DOGS」)、1,2−ジレオイル(dileoyl)−sn−3−ホスホエタノールアミン(「DOPE」)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(「DODAP」)、N,N−ジメチル−2,3−ジオレイルオキシ)プロピルアミン(「DODMA」)、及びN−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(「DMRIE」)、並びにこれらの混合物が挙げられる。さらに、例えばLIPOFECTIN(DOTMA及びDOPE(GIBCO/BRLより市販)など)、並びにLIPOFECTAMINE(DOSPA及びDOPE(GIBCO/BRLより市販)を含む)などの市販のカチオン性脂質の調製物をいくつか使用することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。
本明細書で使用するとき、「アミノ脂質」という用語は、1つまたは2つの脂肪酸鎖または脂肪アルキル基鎖及びプロトン化して生理学的pHでカチオン性脂質を形成し得るアミノ頭部基(アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基など)を有するこれらの脂質を包含することが意図される。
他のアミノ脂質は、代替的脂肪酸基及びアルキル置換基が異なる(例えば、N−エチル−N−メチルアミノ−、N−プロピル−N−エチルアミノ−など)ものなどの他のジアルキルアミノ基を有するようなものが挙げられる。R11及びR12がいずれも長鎖アルキル基またはアシル基であるこれらの実施形態では、これらは同一であってもまたは異なっていてもよい。一般に、ろ過滅菌のために、特に、錯体のサイズを約0.3マイクロメートル未満にする必要がある場合、より容易に飽和の少ないアシル鎖を有するアミノ脂質のサイズにすることができる。C14からC22の範囲内の炭素鎖長さを有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が好ましい。また、他のスカフォールドを使用し、アミノ基及びアミノ脂質の脂肪酸または脂肪アルキル基部分とを分離することができる。好適なスカフォールドは、当業者に既知である。
本発明で有用なPEG修飾脂質(または脂質ポリオキシエチレンコンジュゲート)の具体例は、PEG部分を脂質小胞の表面に固定するさまざまな「アンカー」脂質部分を有し得る。好適なPEG修飾脂質の実施例としては、PEG−修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、PEG−セラミドコンジュゲート(例えば、PEG−CerC14またはPEG−CerC20)(参照によって本明細書に援用される米国特許明細書第5,820,873号)、PEG−修飾ジアルキルアミン及びPEG−修飾l,2−ジアシルオキシプロパン−3−アミンが挙げられる。PEG修飾されたジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールが特に好ましい。
好適な中性脂質の例としては、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、その最も広い範囲において「核酸」としては、ホスホジエステラーゼ結合を介して結合されるヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/または物質が挙げられる。例示的核酸としては、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸類(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸類(PNA)、ロックド核酸類(LNA)またはこれらのハイブリッドが挙げられる。また、これらとしては更に、RNAi−誘導剤、RNAi剤、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA,tRNA,三重らせん形成体、アプタマー、ベクターなどを誘発するRNAも挙げられる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、修飾核酸(例えば、本明細書に記載の合成修飾mRNA)によってコードされる。
本発明は、当業者が利用可能な任意の核酸修飾を使用することを企図する。本発明のリボ核酸は、任意の数の改変を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ピリジン−4ーオンーリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオプソイドウリジン、2−チオプソイドウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチル−プソイドウリジン、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジン、5−アザ−シチジン、プソイドシチジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−プソイドシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドシチジン、4−メトキシ−1−メチル−プソイドシチジン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリシニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、及び2−メトキシ−アデニン、イノシン、1−メチル−イノシン、ウィオシン、ウィブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオグアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオグアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、及びN2,N2−ジメチル−6チオグアノシン、並びにその組合せからなる群から選択される1つ以上の改変を含む。
修飾ヌクレオシド及び本発明の修飾RNAの製造または合成に使用されるヌクレオチドの調製には、種々の化学基の保護及び脱保護を伴う。保護及び脱保護の必要性及び適切な保護基の選択は、当業者によって容易に判定され得る。
保護基の化学については、例えば、Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed.,Wiley&Sons,1991に見出すことができ、これは、参照によってその全体が本明細書に援用される。
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、Ogata et al. Journal of Organic Chemistry 74:2585〜2588, 2009;Purmal et al.Nucleic Acids Research 22(1):72〜78,1994;Fukuhara et al.Biochemistry 1(4):563〜568,1962;and Xu et al. Tetrahedron 48(9):1729〜1740,1992に記載されている合成方法に従って調製することができ、これらはそれぞれ、参照によってその全体が援用される。
修飾核酸(例えば、リボ核酸)は、分子の全長に沿って均一に修飾させる必要はない。異なるヌクレオチド改変及び/または主鎖構造は、核酸内の種々の位置に存在し得る。当業者は、ヌクレオチド類似体または他の改変(複数可)は、核酸の機能を実質的に低下させることのないように核酸の任意の位置(複数可)に配置され得ることを理解するであろう。また、改変は、5’または3’末端改変であってもよい。核酸は、最低1%及び最大100%の修飾ヌクレオチドまたはその間の任意の割合(例えば少なくとも50%修飾ヌクレオチド、少なくとも80%修飾ヌクレオチド、または少なくとも90%修飾ヌクレオチドなど)で含有してもよい。
いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、1つから2つのリボ核酸はそれぞれ、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸の少なくとも1つは、修飾リボ核酸である。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は修飾されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸の複数はそれぞれ修飾されている。当業者は、修飾リボ核酸は、本明細書に記載の1つ以上の核酸修飾を含み得ることを理解するであろう。
いくつの態様では、本明細書に提供されているものはポリぺプチドをコードする合成修飾RNA分子であり、合成修飾RNA分子は、合成修飾RNA分子を細胞に導入することによって、1つ以上の改変を含まないポリペプチドをコードする合成RNA分子と接触させた細胞に対する先天性免疫応答の低下となるように、1つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、Casタンパク質はタンパク質をコードする合成修飾RNA分子を含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質はCas9タンパク質をコードする合成修飾RNA分子を含む。
本明細書に記載の合成修飾RNAとしては、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる急速な悪化を予防するための及び細胞のRNAに対する先天性免疫応答またはインターフェロン応答の回避または低減を行うための改変が挙げられる。改変としては、限定されないが、例えば以下が挙げられる。(a)末端部改変(例えば、5’末端部改変(リン酸化脱リン酸化、コンジュゲート、逆結合など)、3’末端部改変(コンジュゲート、DNAヌクレオチド、逆結合など)、(b)塩基改変(例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または拡大したパートナーレパートリーと塩基対である塩基またはコンジュゲート塩基との置換物)、(c)糖の改変(例えば、2’位または4’位にて)または糖の置換、並びに(d)ホスホジエステラーゼ結合の改変または置換などのヌクレオシド間連結改変。こうした改変が翻訳に介在する範囲では(すなわち、改変がない場合(例えば、ウサギの網状赤血球インビトロ翻訳アッセイにおいて)と比較して50%以上の翻訳の低減となる)、変形は本明細書に記載の方法及び組成物にとって好適ではない。本明細書に記載の方法と共に有用な合成修飾RNA組成物の具体例としては、限定されるものではないが、修飾されているか、または非天然ヌクレオシド間連結を含有するRNA分子が挙げられる。修飾ヌクレオシド間連結を有する合成修飾RNAとしては、とりわけ、ヌクレオシド間連結にリン原子を有しないものが挙げられる。他の実施形態では、合成修飾RNAはそのヌクレオシド間連結(複数可)内にリン原子を有する。
修飾ヌクレオシド間連結の非限定的例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート(3’−アルキレンホスホネートなど)、及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート(3’−アミノホスホルアミデートなど)、及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びにこれらの類似体に連結される正常な3’−5’連結、2’−5’連結を有する及びヌクレオシド単位の近接対が3’−5’から5’−3’または2’−5’から5’−2’に連結される逆極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。また、種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も挙げられる。
それぞれが上記のリン−含有連結の調製を教示している代表的な米国特許明細書としては、限定されないが、米国特許明細書第3,687,808号、同第4,469,863号、同第4,476,301号、同第5,023,243号、同第5,177,195号、同第5,188,897号、同第5,264,423号、同第5,276,019号、同第5,278,302号、同第5,286,717号、同第5,321,131号、同第5,399,676号、同第5,405,939号、同第5,453,496号、同第5,455,233号、同第5,466,677号、同第5,476,925号、同第5,519,126号、同第5,536,821号、同第5,541,316号、同第5,550,111号、同第5,563,253号、同第5,571,799号、同第5,587,361号、同第5,625,050号、同第6,028,188号、同第6,124,445号、同第6,160,109号、同第6,169,170号、同第6,172,209号、同第6,239,265号、同第6,277,603号、同第6,326,199号、同第6,346,614号、同第6,444,423号、同第6,531,590号、同第6,534,639号、同第6,608,035号、同第6,683,167号、同第6,858,715号、同第6,867,294号、同第6,878,805号、同第7,015,315号、同第7,041,816号、同第7,273,933号、同第7,321,029号、及び米国特許明細書RE39464が挙げられ、そのすべての内容全体を参照によって援用される。
リン原子を含まない修飾ヌクレオシド間連結は、短鎖アルキル基によって形成されるヌクレオシド間連結、またはシクロアルキル基ヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル基またはシクロアルキル基ヌクレオシド間連結、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間連結を有する。これらとしては、シロキサン主鎖;スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖;ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖;メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖;アルケン含有主鎖;スルファメート主鎖;メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖;スルホネート及びスルホンアミド主鎖;アミド主鎖;混合N、O、S及びCH成分部を有する他の主鎖など、(ヌクレオシドの糖部分から一部形成された)モルホリノ連結を有するものが挙げられる。
修飾オリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許明細書としては、限定されないが、米国特許明細書第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,64,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、第5,677,439号が挙げられ、そのすべての内容全体を参照によって援用される。
本明細書に記載の合成修飾RNAのいくつかの実施形態としては、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する核酸、へテロ原子ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオシド、及び特に−CH−NH−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−[メチレン(メチルイミノ)若しくはMMIとして公知]、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−及び−N(CH)−CH−CH−[未変性ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、−O−P−O−CH−として表される]が挙げられ、上記は米国特許明細書第5,489,677号を参照し、上記アミド主鎖は、米国特許明細書第5,602,240号を参照しており、そのいずれもの全体が、参照によって本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本明細書において機能する核酸配列は、モルホリノ主鎖構造を有し、これは、米国特許明細書第5,034,506号を参照しており、その内容全体を参照によって本明細書に援用される。
また、本明細書に記載の合成修飾RNAは、1つ以上の置換された糖部分を含んでもよい。本明細書において機能する核酸としては、2’位に以下の1つを含むことができ:H(デオキシリボース)基;OH(リボース)基;F;O−、S−、またはNまたはN−アルキル基;O−,S−またはN−アルケニル基;O−、S−またはN−アルキニル基;またはO−アルキル基−O−アルキル基、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は、置換または非置換C1〜C10アルキル基またはC2〜C10アルケニル基及びアルキニル基であってもよい。例示的改変としては、O[(CHO]mCH、O(CH).nOCH、O(CHNH、O(CHCH、O(CHONH及びO(CHON[(CH)nCH)](式中、n及びmは1〜約10である)が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成修飾RNAとしては、2’位での以下の1つが挙げられる:C1〜C10低級アルキル基、置換低級アルキル基、アルカリル基、アラルキル基、O−アルカリル基またはO−アラルキル基、SH、SCH、OCN、Cl、Br、CN、CF、OCF、SOCH、SOCH、ONO、NO、N、NH、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリル基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、レポーター基、インターカレーター基、RNAの薬物動態学特性を改善するための基または合成修飾RNAの薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、改変としては、2’メトキシエトキシ(2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても公知の2’−O−CH2CH2OCH3)(Martin et al.,Helv. Chim.Acta,1995,78:486〜504)すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。別の例示的改変は2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち2’−DMAOEとしても公知のO(CHON(CH基、2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(また、2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとして当該技術分野において公知である)、すなわち、2’−O−CH−O−CH−N(CHである。
他の改変としては、2’−メトキシ(2’−OCH)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCHCHCHNH)及び2’−フルオロ(2’−F)が挙げられる。また、核酸配列の他の位置、特に3’端末ヌクレオチドの糖の3’位、または2’−5’結合ヌクレオチド及び5’末端ヌクレオチドの5’位で類似の改変が行われてもよい。合成修飾RNAもまた、ペントフラノシル糖の代わりに例えばシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許明細書としては、限定されないが、米国特許明細書第米国特許明細書第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、同第5,700,920号が挙げられ、そのうちのある特定のものは、一般に本願発明と共に所有され、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用される。
非限定的例としては、本明細書に記載の合成修飾RNAとしては、2’−O−メチル修飾ヌクレオシド、5’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、2’−アミノ修飾ヌクレオシド、2’−アルキル修飾ヌクレオシド、モルフォリノヌクレオシド、ホスホラミデートまたはヌクレオシドを含む非天然塩基またはこれらの任意の組み合わせなどの少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを挙げることができる。
本明細書に記載のこの態様及び他のすべてのこうした態様のいくつかの実施形態では、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドは、5−メチルシチジン(5mC)、N6−メチルアデノシン(m6A)、3,2’−O−ジメチルウリジン(m4U)、2−チオウリジン(s2U)、2’フルオロウリジン、プセウドウリジン、2’−O−メチルウリジン(Um)、2’デオキシウリジン(2’dU)、4−チオウリジン(s4U)、5−メチルウリジン(m5U)、2’−O−メチルアデノシン(m6A)、N6,2’−O−ジメチルアデノシン(m6Am)、N6,N6,2’−O−トリメチルアデノシン(m62Am)、2’−O−メチルシチジン(Cm)、7−メチルグアノシン(m7G)、2’−O−メチルグアノシン(Gm)、N2,7−ジメチルグアノシン(m2,7G)、N2,N2,7−トリメチルグアノシン(m2,2,7G)及びイノシン(I)からなる群から選択される。
あるいは、合成修飾RNAは、少なくとも2つの修飾ヌクレオシド、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20以上、ヌクレオシドの全長までの修飾ヌクレオシドを含むことができる。最低でも、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含む合成修飾RNA分子は、本明細書に記載されるような改変を有する単一のヌクレオシドを含む。均一に修飾される所与の合成修飾RNAでは、すべての位置について必須ではなく、実際に、2つ以上の上述の改変は、1つの合成修飾RNAにまたは合成修飾RNA内の1つのヌクレオシドに導入することができる。しかし、分子内の所与のヌクレオシドのそれぞれの発生が修飾される(例えば、それぞれのシトシンは、修飾シトシン(例えば、5mC)である)ことが好ましいが、必須ではない。しかし、同一ヌクレオシドの異なる発生が所与の合成修飾RNA分子(例えば、5mCなどで修飾されたいくつかのシトシン、2’−O−メチルシチジンとして修飾された他のものまたは他のシトシン類似体など)において異なる方法で修飾され得ることも検討される。改変は、合成修飾RNA中の複数の修飾ヌクレオシドがそれぞれ同一である必要はない。更に、本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、合成修飾RNAは、少なくとも2つの異なる修飾ヌクレオシドを含む。更に、本明細書に記載の態様のいくつかのこうした好ましい実施形態では、少なくとも2つの異なる修飾ヌクレオシドは5−メチルシチジン及びプセウドウリジンである。また、合成修飾RNAは、修飾及び未改質ヌクレオシドの双方の混合物を含有し得る。
本明細書で使用するとき、「未改質」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基としては、プリン塩基アデニン(A)及びグアニン(G)及びピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成修飾RNAは、少なくとも1つのヌクレオシド(「塩基」)修飾または置換を含む。修飾ヌクレオシドしては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン(nubularine)、イソグアニシン(isoguanisine)、ツベルシジン(tubercidine)、2−(ハロ)アデニン、2−(アルキル)アデニン、2−(プロピル)アデニン、2(アミノ)アデニン、2−(アミノアルキル)アデニン、2(アミノプロピル)アデニン、2(メチルチオ)N6(イソペンテニル)アデニン、6(アルキル)アデニン、6(メチル)アデニン、7(デアザ)アデニン、8(アルケニル)アデニン、8−(アルキル)アデニン、8(アルキニル)アデニン、8(アミノ)アデニン、8−(ハロ)アデニン、8−(ヒドロキシル)アデニン、8(チオアルキル)アデニン、8−(チオール)アデニン、N6−(イソペンチル)アデニン、N6(メチル)アデニン、N6、N6(ジメチル)アデニン、2−(アルキル)グアニン、2(プロピル)グアニン、6−(アルキル)グアニン、6(メチル)グアニン、7(アルキル)グアニン、7(メチル)グアニン、7(デアザ)グアニン、8(アルキル)グアニン、8−(アルケニル)グアニン、8(アルキニル)グアニン、8−(アミノ)グアニン、8(ハロ)グアニン、8−(ヒドロキシル)グアニン、8(チオアルキル)グアニン、8−(チオール)グアニン、N(メチル)グアニン、2−(チオ)シトシン、3(デアザ)5(アザ)シトシン、3−(アルキル)シトシン、3(メチル)シトシン、5−(アルキル)シトシン、5−(アルキニル)シトシン、5(ハロ)シトシン、5(メチル)シトシン、5(プロピニル)シトシン、5(プロピニル)シトシン、5(トリフルオロメチル)シトシン、6−(アゾ)シトシン、N4(アセチル)シトシン、3(3アミノ−3カルボキシプロピル)ウラシル、2−(チオ)ウラシル、5(メチル)2(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)−2(チオ)ウラシル、4−(チオ)ウラシル、5(メチル)4(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)−4(チオ)ウラシル、5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)−2,4(ジチオ)ウラシル、5(2−アミノプロピル)ウラシル、5−(アルキル)ウラシル、5−(アルキニル)ウラシル、5−(アリルアミノ)ウラシル、5(アミノアリル)ウラシル、5(アミノアルキル)ウラシル、5(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5(1,3−ジアゾール−1−アルキル)ウラシル、5−(シアノアルキル)ウラシル、5−(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5−(ハロ)ウラシル、5−(メトキシ)ウラシル、ウラシル−5オキシ酢酸、5(メトキシカルボニルメチル)−2−(チオ)ウラシル、5(メトキシカルボニル−メチル)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(トリフルオロメチル)ウラシル、6(アゾ)ウラシル、ジヒドロウラシル、N3(メチル)ウラシル、5−ウラシル(すなわち、プソイドウラシル)、2(チオ)プソイドウラシル,4(チオ)プソイドウラシル,2,4−(ジチオ)プソイドウラシル,5−(アルキル)プソイドウラシル、5−(メチル)プソイドウラシル、5−(アルキル)−2−(チオ)プソイドウラシル、5−(メチル)−2−(チオ)プソイドウラシル、5−(アルキル)−4(チオ)プソイドウラシル、5−(メチル)−4(チオ)プソイドウラシル、5−(アルキル)−2,4(ジチオ)プソイドウラシル、5−(メチル)−2,4(ジチオ)プソイドウラシル、1置換プソイドウラシル、1置換2(チオ)−プソイドウラシル、1置換4(チオ)プソイドウラシル、1置換2,4−(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)−プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)−2(チオ)−プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)−4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)−2,4−(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)−プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニルl)−2(チオ)−プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)−4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)−2,4−(ジチオ)プソイドウラシル、1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェノキサジン−1−イル、1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェノキサジン−1−イル、1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェンチアジン−1−イル、1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェンチアジン−1−イル、7置換1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェノキサジン−1−イル、7置換1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェノキサジン−1−イル、7置換1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェンチアジン−1−イル、7置換1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェンチアジン−1−イル、7−(アミノアルキルヒドロキシ)−1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェノキサジン−1−イル、7−(アミノアルキルヒドロキシ)−1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェノキサジン−1−イル、7−(アミノアルキルヒドロキシ)−1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェンチアジン−1−イル、7−(アミノアルキルヒドロキシ)−1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェンチアジン−1−イル、7−(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)−1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェノキサジン−1−イル、7−(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)−1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェノキサジン−1−イル、7−(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)−1,3−(ジアザ)−2−(オキソ)−フェンチアジン−1−イル、7−(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)−1−(アザ)−2−(チオ)−3−(アザ)−フェンチアジン−1−イル、1,3,5−(トリアザ)−2,6−(ジオキサ)−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、2−アザ−イノシニル、7−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、3−(メチル)イソカルボスチリリル、5−(メチル)イソカルボスチリリル、3−(メチル)−7−(プロピニル)イソカルボスチリリル、7−(アザ)インドリル、6−(メチル)−7−(アザ)インドリル、イミジゾピリジニル、9−(メチル)−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7−(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル−7−(アザ)インドリル、2,4,5−(トリメチル)フェニル、4−(メチル)インドリル、4,6−(ジメチル)インドリル、フェニル、ナフタレニル(napthalenyl)、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラアセニル、ペントアセニル、ジフルオロトリル、4−(フルオロ)−6−(メチル)ベンズイミダゾール、4−(メチル)ベンズイミダゾール、6−(アゾ)チミン、2−ピリジンオン、5ニトロインドール、3ニトロピロール、6−(アザ)ピリミジン、2(アミノ)プリン、2,6−(ジアミノ)プリン、5置換ピリミジン、N2−置換プリン、N6−置換プリン、06−置換プリン、置換1,2,4−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、パラ−置換−6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、オルソ−置換−6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イルビス−オルソ−置換−6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、パラ−(アミノアルキルヒドロキシ)−6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、オルソ−(アミノアルキルヒドロキシ)−6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、ビス−オルソ−(アミノアルキルヒドロキシ)−6−フェニル−ピロロ−ピリミジン−2−オン−3−イル、ピリドピリミジン−3−イル、2−オキソ−7−アミノ−ピリドピリミジン−3−イル、2−オキソ−ピリドピリミジン−3−イル、またはこれらの任意のO−アルキル化若しくはN−アルキル化誘導体などの他の合成及び天然ヌクレオ塩基が挙げられる。また、修飾ヌクレオシドとしては、コンジュゲート部分(例えば、リガンド)を含む天然塩基も更に挙げられる。本明細書において上記で検討するとおり、修飾ヌクレオシド含有RNAは、宿主細胞中において翻訳可能であるものとする(すなわち、修飾RNAによってコードされるポリペプチドの翻訳が阻害されることはない)。例えば、s2U及びm6A含有転写物は、ウサギ網状赤血球溶血液での翻訳は良好でなく、プソイドウリジン、m5U及びm5Cが効率的な翻訳に適合する。加えて、転写物のヌクレアーゼ耐性の増大に有用な2’−フルオロ−修飾塩基は、非常に非効率な翻訳となることが当業者に公知である。当業者は、例えば、ウサギ網状赤血球溶血液翻訳アッセイなどを用いて、翻訳を解析することができる。
更なる修飾ヌクレオ塩基としては、米国特許明細書第3,687,808号に開示されているもの、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn, P. ed. Wiley−VCH,2008に開示されているもの、2009年3月26日出願の国際公開特許PCT/US09/038,425に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858−859, Kroschwitz,J. L,ed. John Wiley & Sons,1990に開示されているもの、及びEnglisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613に開示されているものが挙げられる。
ある特定の上述の修飾ヌクレオ塩基並びに他の修飾ヌクレオ塩基の調製を教示している代表的米国特許明細書は、限定されないが、上述の米国特許明細書第3,687,808号並びに米国特許明細書第4,845,205号、同第5,130,30号、同第5,134,066号、同第5,175,273号、同第5,367,066号、同第5,432,272号、同第5,457,187号、同第5,457,191号、同第5,459,255号、同第5,484,908号、同第5,502,177号、同第5,525,711号、同第5,552,540号、同第5,587,469号、同第5,594,121号,同第5,596,091号、同第5,614,617号、同第5,681,941号、同第6,015,886号、同第6,147,200号、同第6,166,197号、同第6,222,025号、同第6,235,887号、同第6,380,368号、同第6,528,640号、同第6,639,062号、同第6,617,438号、同第7,045,610号、同第7,427,672号、及び同第7,495,088号(そのすべての内容全体が参照によって援用され)、及び米国特許明細書第5,750,692号(その内容全体が参照によって本明細書に援用される)が挙げられる。
本明細書に記載の合成修飾RNAと共に使用する別の改変としては、RNAとRNAの活性、細胞分布または細胞取り込みを改善する1つ以上のリガンド、部分またはコンジュゲートとの化学的連結を含む。リガンドは、例えば、インビボで合成修飾RNAを投与する場合に特に有用であり得る。こうした部分は、限定されないがコレステロール部分などの脂質部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86: 6553〜6556、その全体が、参照によって本明細書に援用される)、コール酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053〜1060その全体が、参照によって本明細書に援用される)、チオエーテル(例えば、ベリル−S−トリチルチオール)(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad.Sci.,1992,660:306〜309;Manoharan et al., Biorg. Med. Chem.Let.,1993,3:2765〜2770、そのすべての内容全体を参照によって援用され)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,1992,20:533〜538、その全体が、参照によって本明細書に援用される)、脂肪鎖(例えば、ドデカジオール残基またはウンデシル残基)(Saison−Behmoaras et al., EMBO J, 1991,10:1111〜1118;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327〜330;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75:49〜54、そのすべての内容全体を参照によって援用され)、リン脂質(例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−ホスホネート)(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651〜3654;Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777〜3783、そのすべての内容全体を参照によって援用され)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969〜973、その全体が、参照によって本明細書に援用される)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett.,1995,36:3651〜3654、その全体が、参照によって本明細書に援用される)、パルミチル部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys. Acta,1995,1264:229〜237、その全体が、参照によって本明細書に援用される)、またはオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al.,J.Pharmacol. Exp. Ther.,1996,277:923〜937、その全体が、参照によって本明細書に援用される)が挙げられる。
本明細書に記載の合成修飾RNAは、5’キャップを更に含むことができる。本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、合成修飾RNAは、5’−5’トリホスフェート連結を用いて、RNA分子の5’末端部に連結された修飾グアニンヌクレオチドを含む5’キャップを含む。また、本明細書で使用するとき「5’キャップ」という用語は、例えば、5’ジグアノシンキャップ、メチレン−ビス(ホスホネート)部分を有するテトラホスフェートキャップ類似体(例えば、Rydzik, A M et al.,(2009)Org Biomol Chem 7(22):4763〜76を参照されたい)、チオリン酸塩改変を有するジヌクレオチドキャップ類似体(例えば、Kowalska,J.et al.,(2008)RNA 14(6):1119〜1131を参照されたい)、非架橋酸素のための硫黄置換基を有するキャップ類似体(例えば、Grudzien−Nogalska,E. et al.,(2007)RNA 13(10):1745〜1755を参照されたい)、N7−ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体(例えば、Grudzien,E. et al.,(2004)RNA 10(9):1479〜1487を参照されたい)、またはアンチリバースキャップ類似体(例えば、Jemielity,J. et al.,(2003)RNA 9(9):1108〜1122及びStepinski, J.et al.,(2001)RNA7(10):1486−1495を参照されたい)など他の5’キャップ類似体を包含することを意図する。こうした一実施形態では、5’キャップ類似体は、5’ジグアノシンキャップである。いくつかの実施形態では、合成修飾RNAは、5’トリホスフェートを含まない。
5’キャップは、mRNAを認識してリボソームに付着し、翻訳開始に重要である。また、5’キャップは、合成修飾RNAをエキソヌクレアーゼ媒介分解から保護する。合成修飾RNAは5’キャップを含むことは必須ではなく、このため、他の実施形態では合成修飾RNAは5’キャップが欠失している。しかし、5’キャップを含む合成修飾RNAの半減期が長く、翻訳効率が上昇するという理由から、本明細書では、5’キャップを含む合成修飾RNAが好ましい。
本明細書に記載の合成修飾RNAは、5’及び/または3’非翻訳領域(UTR)を更に含む。非翻訳領域は、開始コドン(5’)前及び停止コドン(3’)後のRNA領域であり、このため、翻訳機構により翻訳されることはない。非翻訳領域は、リボヌクレアーゼ及びRNA分解に伴う他のタンパク質と干渉し得るために、1つ以上の非翻訳領域を有するRNA分子の改変によりmRNAの安定性が向上され得る。加えて、5’及び/または3’非翻訳領域を有するRNAの改変は、mRNAへのリボソーム結合を改変する結合タンパク質によって翻訳効率を向上させ得る。3’UTRを有するRNAの改変を使用して、RNAの細胞質局在化を維持することができ、細胞の細胞質内で翻訳が発生し得る。一実施形態では、本明細書に記載の合成修飾RNAは、5’または3’UTRを含まない。一実施形態では、合成修飾RNAは、5’または3’UTRをいずれか含む。別の実施形態では、本明細書に記載の合成修飾RNAは、5’及び3’UTRをいずれも含む。一実施形態では、5’及び/または3’UTRは、細胞中(例えば、ネズミα−グロビン3’UTR)において高安定性を有することが判明しているmRNAから選択される。いくつかの実施形態では、5’UTR、3’UTRまたはその両方は1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成修飾RNAは、コザック配列を更に含む。「コザック配列」とは、コンセンサス配列(gcc)gccRccAUGG配列番号:1481を有する真核mRNA上の配列を意味し、Rは開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、その後に別の「G」が続く。コザックコンセンサス配列は、リボソームによって認識され、ポリペプチドの翻訳が開始される。典型的には、転写物の5’末端の近位にある翻訳機構によって出会う最初のAUGコドンで開始する。しかし、場合によっては、このAUGコドンは、読み漏らしと称されるプロセスにおいてバイパスされ得る。AUGコドン付近にコザック配列が存在することにより、正確なポリペプチドの翻訳が生じるように、翻訳開始部位としてそのコドンが強化される。更に、コザック配列を合成修飾RNAに付加すると、たとえ、開始コドンに関する曖昧性がないとしても、更に効率のよい翻訳が促進されることになる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成修飾RNAは、翻訳を開始する所望の部位でコザックコンセンサス配列を更に含み、正確な長さのポリペプチドを作成する。いくつかの実施形態では、コザック配列は1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成修飾RNAは、「ポリ(A)テイル」を更に含み、これは、アデニンヌクレオチドの3’ホモポリマーテイルを指し、長さが変動してもよく(例えば、少なくとも5つのアデニンヌクレオチド)、最大数百のアデニンヌクレオチドとなってもよい。3’ポリ(A)テイルを包含することによって、合成修飾RNAを細胞中の分解から保護することができ、また、核外局在化が促進され、翻訳効率が向上し得る。いくつかの実施形態では、ポリ(A)テイルは1〜500のアデニンヌクレオチドを含み、他の実施形態では、ポリ(A)テイルは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475、少なくとも500、またはそれ以上のアデニンヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリ(A)テイルは1〜150アデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリ(A)テイルは90〜120アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ(A)テイルは1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載の合成修飾RNAへの1つ以上の改変により、細胞中において合成修飾RNAの安定性が更に増すと考えられている。こうした改変が、翻訳が可能であり、合成修飾RNAに対する細胞の先天性免疫応答またはインターフェロン応答を減少させるか、または悪化させない限り、そのような修飾は本明細書での使用が特定的に企図される。概して、合成修飾RNAの安定性が高いほど、その合成修飾RNAから多くのタンパク質が産生され得る。典型的には、細胞タンパク質がAU富化領域に動員され、転写物のポリ(A)テイルの除去が刺激されるので、、哺乳類mRNAにAU富化領域が存在することによって転写物を不安定化させる傾向にある。合成修飾RNAのポリ(A)テイルが欠失することにより、RNA分解が増加し得る。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されるように、合成修飾RNAは、AU富化領域を含まない。特に、3’UTRは実質的に、AUUUA配列要素を欠いていることが好ましい。
一実施形態では、リガンドにより、それが取り込まれる合成修飾RNAの細胞取り込み、細胞内標的または半減期が変化する。いくつかの実施形態では、リガンドにより、例えばこうしたリガンドなどのない組成物と比較して、選択された標的(例えば、分子、細胞または細胞型)、細胞内コンパートメント(例えば、ミトコンドリア、細胞質、ペルオキシソーム、リソソーム)に対する親和力の向上がもたらされる。好ましいリガンドは、合成修飾RNA由来のポリペプチドの発現に干渉しない。
リガンドとしては、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、若しくはグロブリン)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸)、または脂質などの天然物質を挙げることができる。また、リガンドは組み換え体または例えば合成ポリマー(例えば、合成ポリアミノ酸)などの合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン(PL)、ポリLアスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L−ラクチド−co−グリコリド(glycolied))コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2−エチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリフォスファジン(polyphosphazine)が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド擬態ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαらせん型ペプチドが挙げられる。
リガンドとしては、例えば、細胞標的剤(例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質若しくはタンパク質)または線維芽細胞などの特定の細胞型に結合する抗体などの標的基も更に挙げることができる。標的基としては、例えば、とりわけ、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチンまたはRGDペプチド若しくはRGDペプチド擬態体であってもよい。
他のリガンドの例としては、染料、挿入剤(例えばアクリジン)、架橋剤(例えば、ソラーレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えばEDTA)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1、3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1、3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸(O3−(oleoyl)cholenic acid)、ジメトキシトリチル、または、フェノキサジン)、及びペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、並びに輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)が挙げられる。
リガンドは、糖タンパク質などのタンパク質、ペプチド(例えば、コ−リガンドに対して特定の親和力を有する分子)、若しくは抗体(例えば、線維芽細胞など指定の細胞型に結合する抗体)、またはポリペプチドの生成に有用な他の細胞であってもよい。また、リガンドとしては、ホルモン及びホルモンレセプターを挙げることができる。また、非ペプチド種(例えば脂質、レクチン、炭化水素、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコース)も挙げることができる。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって(例えば、細胞の微小管、ミクロフィラメント及び/または中間体フィラメントを破壊することによって)、例えば合成修飾RNAまたはそれらの組成物の細胞への取り込みが増加し得る薬剤などの物質であってもよい。薬剤は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド(japlakinolide)、latrunculin A、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、またはミオセルビン(myoservin)であってもよい。
1つの例示的リガンドは、脂質または脂質系分子である。脂質または脂質系リガンドは、(a)分解への耐性の増大及び/または(b)標的細胞若しくは細胞膜への標的若しくは輸送の増大が可能である。脂質系リガンドを使用して、例えば修飾RNA組成物の標的細胞への結合を調節することができる。
別の態様では、リガンドは部分(例えば、宿主細胞によって取り込まれるビタミン)である。例示的ビタミンとしては、ビタミンA、E及びKが挙げられる。他の例示的ビタミンとしては、ビタミンB(例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサルまたは例えば癌細胞によって取り込まれる他のビタミン若しくは栄養素)が挙げられる。また、HSA及び低密度リポタンパク質(LDL)も挙げられる。
別の態様では、リガンドは細胞透過剤、好ましくはらせん型細胞透過剤である。薬剤は両親媒性であることが好ましい。例示的薬剤は、tatまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、ペプチド擬態体、逆転異性体、非ペプチド結合若しくはプソイド−ペプチド結合及びD−アミノ酸の使用など、改変され得る。らせん型薬剤は、好ましくは、α−らせん型薬剤であり、好ましくは、親油性相及び疎油性相を有する。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞(例えば、微生物細胞(例えば細菌細胞または真菌細胞)若しくは哺乳類細胞(ヒト細胞など)など)の透過が可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−らせん型直鎖ペプチド(例えば、LL−37若しくはセロピンP1)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン若しくはバクテネシン)または1つ若しくは2つの重要アミノ酸のみを含有するペプチド(例えば、PR−39若しくはインドリシジン)であってもよい。例えば、細胞透過性ペプチドは、二連の(bipartite)両親媒性ペプチド(MPGなど)であってもよく、HIV−1 gp41とSV40ラージT抗原のNLSとの融合ペプチドドメインから誘導される(Simeoni et al.,Nucl. Acids Res.31:2717−2724,2003)。
本明細書に記載の合成修飾RNAは、「Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry」(Beaucage, S. L. et al. (Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,N.Y.,USA)に記述されている方法など、当該分野において確立されている方法によって合成及び/または修飾することができ、これらは、本明細書によってその全体が、参照によって援用される。転写方法は、本明細書の実施例において更に記載されている。
本明細書に記載の態様の一実施形態では、合成修飾RNA用のテンプレートは、「splint介在ライゲーション」を用いて合成し、長オリゴ及び/またはdsDNA PCR産物の制御された連結により、結合領域で制限酵素認識部位を導入する必要なくDNA構造体の迅速な合成を可能にする。これは、T7テンプレートの生成中に遺伝性非翻訳領域(UTR)を遺伝子コード配列に加えるために使用することができる。また、Splint介在ライゲーションを使用して、核の局在化配列をオープンリーディングフレームに添加することができ、また野生型オープンリーディングフレームから開始する点変異により優性ネガティブ構造体を産生することができる。要約すると、一本鎖及び/または変性dsDNA構成要素が、所望の末端部をコンジュゲートに入れるsplintオリゴにアニーリングされ、熱安定性DNAリガーゼ及びPCRによって増幅される所望の構造体によって末端部がライゲートされる。次に、テンプレートからインビトロでRNAポリメラーゼを用いて合成修飾RNAを合成する。合成修飾RNAの合成完了後、DNAテンプレートは、本明細書に記載の方法により用いる前に転写反応物から取り除く。
これらの態様のいくつかの実施形態では、合成修飾RNAはアルカリホスファターゼにより更に処理される。
当業者は、本発明が目的の実施及び上記の並びに本明細書内に本来備わる目的及び利点を得るのに十分に適応していることを容易に理解する。本明細書内の詳細な説明及び例は、ある特定の実施形態の代表であり、例示であり、かつ本発明の範囲に対して制限することを意図するものではない。その中の変化形態及び他の使用は、当業者において発生する。これらの変化形態は、本発明の趣旨内に包含される。当業者は、本明細書の範囲及び趣旨を逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して置換及び変化形態の変更が行われ得ることを速やかに理解するであろう。
本明細書で使用するとき、本明細書及び特許請求の範囲において冠詞「a」及び「an」は、複数形を含むことを理解するべきである。ただし、明確に単数形であることが示されている場合を除く。任意の群の1つ以上の員を含むか、「または」任意の群の1つ以上の員の間にある特許請求の範囲または説明は、特に別に示されない限り、または別の方法で文脈から明らかである場合を除き、その群の員の1つ、2つ以上、またはすべてが所与の生成物またはプロセス中に存在する、所与の生成物またはプロセスに用いられる、または別の方法で所与の生成物またはプロセスに関連がある場合、満足しているとみなされる。本発明は、その群の1つの員が確実に、所与の生成物またはプロセス中に存在する、所与の生成物またはプロセスに用いられる、または別の方法で所与の生成物またはプロセスに関連がある実施形態を含む。また、本発明は、群の員の1つより多い、またはすべてが所与の生成物またはプロセス中に存在する、所与の生成物またはプロセスに用いられる、または別の方法で所与の生成物またはプロセスに関連がある実施形態を含む。さらに、本発明は、1つ以上の列挙された請求項の1つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが同一の基本請求項(または関連のある他の請求項として)に応じて別の請求項に導入されるすべての変化形態、組み合わせ及び順列を提供することを理解すべきである。ただし、別段の指定がある場合、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明かである場合を除く。本明細書に記載のすべての実施形態が、適切であれば、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが企図される。任意の実施形態または態様は、適切であれば、1つ以上の他のこうした実施形態または態様と自由に組み合わせることができることが企図される。要素がマルクーシュ群または類似のフォーマットなどのリストとして表される場合、その要素の各サブグループも開示され、任意の要素(複数可)がその群から排除され得ることが理解される。一般に、発明または本発明の態様は、特定の要素、特長などを含むとして言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、こうした要素、特長などからなるか、またはこうした要素、特長などから実質的になると理解すべきである。これらの実施形態は、いずれの場合においても、簡潔性のために、本明細書では具体的に多くの語句で記述していない。本明細書に規定の除外が記述されているか否かに関係なく、本発明の任意の実施形態または態様は、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることを理解するべきである。例えば、任意の1つ以上の有効成分、添加剤、成分、任意の薬剤、有機体の種類、疾患、対象、若しくはこれらの組み合わせは、除外することができる。
特許請求の範囲または説明が対象の組成物に関する場合、別段の指定がない限りまたは矛盾または不一致が生じることが当業者に明かでない限り、本明細書で開示される任意の方法に従った対象の組成物の製造方法または使用方法は本発明の態様であることと理解すべきである。請求項または説明が方法に関する場合、例えば、その方法を実施するにあたって有用な組成物の製造方法及びその方法によって産生される生成物は、本発明の態様であることが理解すべきである。ただし、別段の指定がある場合、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明かである場合を除く。
本明細書に範囲が記載されている場合、本発明はエンドポイントが含まれる実施形態、双方のエンドポイントを除外している実施形態、及び1つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントは除外されている実施形態を含む。特に指示がない限り、双方のエンドポイントを含むことを想定すべきである。さらに、別段の指定がない限り、ないしは別の方法で文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値から、本発明の異なる実施形態において規定範囲内にあり、その範囲の下限値単位の10分の1までの任意の特定の値またはサブ範囲が想定され得ることを理解すべきである。ただし、別の方法にて文脈が明示している場合を除く。また、本明細書に一連の数値が記述されている場合、本発明は、同様に任意の連続する2つの値によって画定されている間に入っている値または範囲のいずれにも関する任意の実施形態を含み、最小値を最低値として、最大値を最高値としてもよいことが理解される。本明細書で使用するとき、数値としては、百分率として表される値が挙げられる。数値に「ほぼ(about)」または「約(approximately)」が付随している本発明の任意の実施形態については、本発明は正確な値が引用されている実施形態も含む。数値に「ほぼ(about)」または「約(approximately)」が付随していない本発明の任意の実施形態については、本発明は、「ほぼ(about)」または「約(approximately)」が付随している実施形態を含む。
「ほぼ(about)」または「約(approximately)」は、別段の指定がない限り、ないしは別の方法で文脈から明らかでない限り、いずれの方向(その数を超える若しくはその数未満)においても、概して、1%の範囲内、いくつかの実施形態では5%の範囲内、いくつかの実施形態では10%の範囲内に含まれる数字を含む(こうした数字が考え得る値の100%を許されないほど超える場合を除く)。その反対が明示されない限り、2つ以上の行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、本方法の行為の順序は、必ずしもその方法の順序が記述されている順序を制限するものではないが、本発明には、その順序がそのように制限されている実施形態を含むことと理解すべきである。別段の指定がない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の任意の生成物または組成物は、「単離されている」と考えられ得ることと理解すべきである。
本明細書で使用するとき、「含んでいる(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、本発明に必須であるが、必須であるか否かに関わらず、規定されていない要素の包含の可能性も含む組成物、方法及びそれらの対応する成分(複数可)に関して使用される。
本明細書で使用するとき、「から実質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語により、本発明の実施形態の基本的及び新規または機能的な特性(複数可)に実質的に影響を及ぼすことのない追加の要素が存在してもよい。
「からなる」という用語は、本明細書に記載されるような組成物、方法及びこれらの対応する成分を意味し、実施形態の説明に引用されない任意の要素は除く。
転写活性化剤様エフェクタ−ヌクレアーゼ(TALEN)は、ゲノム部位の周囲にある対として結合し、FokIヌクレアーゼドメインの二量体によって二重鎖切断(DSB)が導入される。近年、厳格な疾患モデリングを実施する手段として、ヒト多能性幹細胞(hPSC)において15の異なる遺伝子の突然変異体対立遺伝子を迅速かつ効率良く発生させるTALENゲノム編集系の使用が報告されており(Ding et al.,Cell Stem Cell 12:238〜251(2013))、少なくとも1つの突然変異体対立遺伝子のクローン比率は2%〜34%の範囲であった。
後述のように、同一のhPSC株において、同一のゲノム部位を標的にするCRISPR及びTALENの相対的有効性を、前述の同一送達プラットフォームを使用して評価した(Ding et al.,Cell Stem Cell 12:238〜251(2013))。TALENゲノム編集系では、CAGプロモーターを使用して、(ウイルス性2Aペプチドを介して)共翻訳し、それぞれのTALENは緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)を有する。CRISPRでは、ヒトコドン最適化Cas9遺伝子は、C末端核局在化シグナル(Mali et al.,Science 339:823〜826(2013))によりGFPを用いて同一CAG発現プラスミドにサブクローニングし、ガイドRNA(gRNA)は、ヒトU6ポリメラーゼIIIプロモーターによりプラスミドから別途に発現させた(Mali et al., Science 339:823〜826(2013))。それぞれのgRNAの20のヌクレオチドプロトスペーサー配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(ポリメラーゼ連鎖反応)系方法を使用して導入させた。TALENまたはCRISPRのいずれを使用しても、等量の2つのプラスミドは、hPSCsに共に電気穿孔(ノックインを試みる場合、25μgのDNA修復テンプレートと共に各プラスミド25μg、または各プラスミド12.5μgのいずれか)し、その後、24〜48時間して、FACS(fluorescence−activated cell sorting)を行い、ゲノム標的部位での単一の細胞のクローン増殖及びPCRを介する突然変異体のスクリーニングを行った。
LDLRにおいて以前TALENにより上手く標的された(Ding et al.,Cell Stem Cell 12:238〜251(2013))6つの遺伝子(AKT2、CELSR2、CIITA、GLUT4、LINC00116及びSORT1)における7つの遺伝子座内及び1つの追加の遺伝子座においてG(N)19NGG配列をマッチングさせて、gRNAを設計した。この系では、CRISPRは、遺伝子座及びhPSC株にわたって一貫してかつ顕著ににTALENよりも要項な性能を示した(表S1を参照されたい)。TALENにより、効率0%〜34%で少なくとも1つの突然変異体対立遺伝子を有するクローンを産生したが、マッチされたCRISPRにより効率51%〜79%(表S1)で突然変異体クローンを産生した。TALENと同様にCRISPRによりヌクレオチドのサイズが1つから数十の範囲であり、予想される切断部位に集中させた、さまざまなサイズのインデルが産生され、これは、CRISPRまたはTALENが使用されるか否かに関係なく、非相同性末端結合突然変異体の生成が同じ方法で発生することが示唆される。さらに、配列化によって識別されるように、CRISPRにより、同型接合突然変異体クローンを速やかに発生させた(すべてのクローンの7%〜25%;表S1)。
また、先に記載したとおり、67のヌクレオチド一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを使用してE17K突然変異体をAKT2にノックインする試みを行った(Ding et al.,Cell Stem Cell 12:238−251(2013))。予想されたCRISPR切断部位は、点突然変異からそれぞれ11及び13ヌクレオチドにあったが、CRISPRにより11%の収率でノックインクローンを産生した(TALENでは、わずかに1.6%であった(表S1))。
G(N)19NGG標的配列の要件は、ある程度、部位選択を制限することは注目に値する。いずれのDNA鎖も標的とすることができるため、標的配列が平均して32塩基対毎に発生する。遺伝子のノックアウトに関してはいかなる障壁もなく、いかなるコード配列も標的とすることができるが、特定の場所でノックインまたは変異体の修正を試みるにあたって問題点も存在し得る。しかし、プロトスペーサーの開始点でのGに関する要件は、gRNAを発現させるためのU6プロモーターの使用によって決定され、代替CRISPR/Cas系によりこの要件が緩和され得る(Cong et al.,Science 339:819〜823(2013))。このため、(N)20NGG標的配列の使用が可能であり、これらは、平均8塩基対ごとに見出される。
加えて、CRISPRオフターゲット効果の範囲が確定された状態が維持され、かつ配列依存性が高い。以前の解析では、プロトスペーサーの最初の半分における1つのヌクレオチドミスマッチは、第二の半分におけるミスマッチよりもより許容されることが示唆されている(Jinek et al.,Science 337:816−821(2012);Cong et al.,Science 339:819〜823(2013))。AKT2配列については、プロトスペーサーの更に「耐性」のある半分内において、ヌクレオチド1及び3にて異なる2つのミスマッチ配列がある。こうした潜在的ターゲットオフ部位では、ターゲットオン部位での61%と比較して得られたクローンはゼロであった(表S1)。SORT1配列の1つとして、単一のヌクレオチド多形体により、標的部位にて単一のヌクレオチドミスマッチとなる異なるヒト多能性幹細胞株を使用することによって、突然変異体クローンが産生され、最初の細胞株の66%と比較して、効率は42%である。このため、標的部位を思慮深く選定することが、系統的オフターゲット効果を最小限に抑えるのに必要であり、完全マッチまたはゲノム内の他の場所に単一のヌクレオチドミスマッチ配列を有する標的部位は避けるべきである。
実用的観点から、CRISPRはTALENよりも実施が容易である。各TALEN対は、新規構築されなければならず、CRISPRについては、Cas9構成要素は固定され、gRNAは、20のヌクレオチドプロトスペーサーの交換のみを必要とする。他は同一の系内でTALENをCRISPRに置き換えた結果として、大いに効率が上昇する本発明の考察及び例証を考慮すると、CRISPRは、特に治療的状況において、ゲノム編集にとって非常に強力であり、かつ幅広く適用可能なツールであることがわかる。

Claims (272)

  1. 細胞中において標的重度複合免疫不全(SCID)関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  2. 対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  3. 対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  4. 細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させる、前記方法。
  5. 対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  6. 対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  7. 細胞中において標的鎌状赤血球症(SCD)関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  8. 対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  9. 対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  10. 細胞中、複数の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  11. 対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによってエキソビボでを改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  12. 対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的部分に指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  13. 細胞中において標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列をCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させる、前記方法。
  14. 対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  15. 対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  16. 細胞中において複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)をCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸と接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させる、前記方法。
  17. 対象において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  18. 対象において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることを含む、前記方法。
  19. 前記Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes(化膿レンサ球菌)Cas9タンパク質またはその官能性部分である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記官能性部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作用可能に連結されたCas9タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む、請求項19に記載の方法。
  21. 前記官能性ドメインは複合体を形成する、請求項20に記載の方法。
  22. 前記Casタンパク質は、任意の細菌種由来のCas9タンパク質またはその官能性部分である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記官能性部分は、DNA結合ドメイン、少なくとも1つのRNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作用可能に連結されたCas9タンパク質官能性ドメインを組み合わせたものを含む、請求項22に記載の方法。
  24. 前記官能性ドメインは複合体を形成する、請求項22に記載の方法。
  25. 前記Casタンパク質は、前記1つから2つのリボ核酸と複合体化される、請求項1〜3、請求項7〜9または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記Casタンパク質は、前記複数のリボ核酸と複合体化される、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列である、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  28. 各標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列である、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記標的モチーフは、Gから始まる20ヌクレオチドDNA配列であり、前記Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  30. 各標的モチーフは、Gから始まる20ヌクレオチドDNA配列であり、前記Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列であり、前記Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  32. 各標的モチーフは、20ヌクレオチドDNA配列であり、前記Casタンパク質によって認識されるNGGモチーフの直前にある、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記標的モチーフは、G(N)19NGGである、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  34. 各標的モチーフは、G(N)19NGGである、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記標的モチーフは、(N)20NGGである、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  36. 各標的モチーフは、(N)20NGGである、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  38. 各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖の切断となるように切断される、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  40. 各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖の切断となるように切断される、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記改変はインデルである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列の発現が減少する、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列(複数)の発現が減少する、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列がノックアウトされる、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列(複数)がノックアウトされる、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記改変により、前記標的ポリヌクレオチド配列(複数)の好ましくない配列から所望の配列への修正をもたらす、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記改変は同型接合改変である、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  49. 各改変は同型接合改変である、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  51. 外因性導入DNA修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる、請求項50に記載の方法。
  52. 前記外因性導入DNA修復テンプレートは一本鎖である、請求項51に記載の方法。
  53. 前記外因性導入DNA修復テンプレートは二本鎖である、請求項51に記載の方法。
  54. 前記標的ポリヌクレオチド配列(複数)の切断に続いて、相同性指向性修復が生じる、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  55. 外因性導入DNA修復テンプレートを使用して相同性指向性修復が行われる、請求項54に記載の方法。
  56. 前記外因性導入DNA修復テンプレートは一本鎖である、請求項55に記載の方法。
  57. 前記外因性導入DNA修復テンプレートは二本鎖である、請求項55に記載の方法。
  58. 前記細胞は末梢血細胞である、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記細胞は幹細胞または多能性細胞である、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記細胞は造血幹細胞である、請求項1〜59のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記細胞はCD34細胞である、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記細胞はCD34動員末梢血細胞である、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記細胞はCD34臍帯血細胞である、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記細胞は、CD34骨髄細胞である、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記細胞は、CD34CD38−系譜−CD90CD45RA細胞である、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記標的ポリヌクレオチド配列はADAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図1の前記リボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片からなる群から選択される配列を含む、請求項66に記載の方法。
  68. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図1の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項66に記載の方法。
  69. 前記標的ポリヌクレオチド配列はAK2である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図2の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項69に記載の方法。
  71. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図2の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項69に記載の方法。
  72. 前記標的ポリヌクレオチド配列はCD3Dである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図3の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項72に記載の方法。
  74. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図3の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項72に記載の方法。
  75. 前記標的ポリヌクレオチド配列はDCLRE1Cである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図4の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項75に記載の方法。
  77. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図4の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項75に記載の方法。
  78. 前記標的ポリヌクレオチド配列はIL2RGである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図6の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項78に記載の方法。
  80. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図6の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項78に記載の方法。
  81. 前記標的ポリヌクレオチド配列はIL7Rである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図7の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項81に記載の方法。
  83. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図7の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項81に記載の方法。
  84. 前記標的ポリヌクレオチド配列はJAK3である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図8の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項84に記載の方法。
  86. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図8の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項84に記載の方法。
  87. 前記標的ポリヌクレオチド配列はLIG4である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図9の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項87に記載の方法。
  89. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図9の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項87に記載の方法。
  90. 前記標的ポリヌクレオチド配列はNHEJ1である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図10の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項90に記載の方法。
  92. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図10の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項90に記載の方法。
  93. 前記標的ポリヌクレオチド配列はPNPである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図11の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項93に記載の方法。
  95. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図11の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項93に記載の方法。
  96. 前記標的ポリヌクレオチド配列はPRKDCである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図12の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項96に記載の方法。
  98. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図12の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項96に記載の方法。
  99. 前記標的ポリヌクレオチド配列はRAG1である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図13の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項99に記載の方法。
  101. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図13の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項99に記載の方法。
  102. 前記標的ポリヌクレオチド配列はRAG2である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図14の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項102に記載の方法。
  104. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図14の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項102に記載の方法。
  105. 前記標的ポリヌクレオチド配列はZAP70である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図15の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項105に記載の方法。
  107. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図15の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項105に記載の方法。
  108. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、HBBである、請求項6〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図5の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項108に記載の方法。
  110. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、図5の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項108に記載の方法。
  111. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるADA部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項111に記載の方法。
  113. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項111に記載の方法。
  114. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるAK2部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項114に記載の方法。
  116. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図2のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項114に記載の方法。
  117. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるCD3D部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項117に記載の方法。
  119. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図3のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項117に記載の方法。
  120. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるDCLRE1C部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項120に記載の方法。
  122. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図4のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項120に記載の方法。
  123. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるIL2RG部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項123に記載の方法。
  125. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図6のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項123に記載の方法。
  126. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるIL7R部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項126に記載の方法。
  128. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図7のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項126に記載の方法。
  129. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるJAK3部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項129に記載の方法。
  131. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図8のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項129に記載の方法。
  132. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるLIG4部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項132に記載の方法。
  134. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図9のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項132に記載の方法。
  135. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるNHEJ1部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項135に記載の方法。
  137. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図10のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項135に記載の方法。
  138. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるPNP部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図11のリボ核酸配列またはからなる群から選択される異なる配列それらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項138に記載の方法。
  140. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図11のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項138に記載の方法。
  141. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるPRKDC部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項141に記載の方法。
  143. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図12のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項141に記載の方法。
  144. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるRAG1部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項144に記載の方法。
  146. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図13のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項144に記載の方法。
  147. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるRAG2部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項147に記載の方法。
  149. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図14のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項147に記載の方法。
  150. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるZAP70部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項150に記載の方法。
  152. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図15のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項150に記載の方法。
  153. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、複数の異なるHBB部分を含む、請求項10〜12または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項153に記載の方法。
  155. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図5のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項153に記載の方法。
  156. 前記標的ポリヌクレオチド配列は、ADA、AK2、CD3D、DCLRE1C、IL2RG、IL7R、JAK3、LIG4、NHEJ1、PNP、PRKDC、RAG1、RAG2及びZAP70からなる群から選択される標的ポリヌクレオチド配列の任意の組み合わせの少なくとも一部を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1〜図15のリボ核酸配列またはからなる群から選択される異なる配列それらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項156に記載の方法。
  158. 前記複数のリボ核酸のうちのそれぞれは、図1〜図15のリボ核酸配列からなる群から選択される異なる配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはそれらの少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項156に記載の方法。
  159. 前記疾患はSCIDである、請求項2〜3及び請求項5〜6のいずれか一項に記載の方法。
  160. 前記疾患は鎌状赤血球症である、請求項8〜9及び請求項11〜12のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記疾患はβサラセミアである、請求項14〜15または請求項17〜18のいずれか一項に記載の方法。
  162. 前記1つから2つのリボ核酸は、前記Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項1〜3、請求項7〜9または13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記1つから2つのリボ核酸はそれぞれ、前記標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接している前記Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記複数のリボ核酸は、前記Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記複数のリボ核酸は、前記標的モチーフ間に配置されている突然変異体対立遺伝子に隣接している前記Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直近接である標的モチーフにハイブリッド形成するように設計されている、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記1つから2つのリボ核酸は、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように選択される、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記複数のリボ核酸は、前記標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように選択される、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように選択される、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  169. 各標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含むように選択される、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  170. 前記標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含むように選択される、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記標的モチーフは、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含むように選択される、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記1つから2つのリボ酸は、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  173. 前記複数のリボ酸はそれぞれ、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  174. 前記1つから2つのリボ酸は、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項1〜3、請求項7〜9、または請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  175. 前記複数のリボ酸はそれぞれ、前記細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリッド形成させる、請求項4〜6、請求項10〜12、または請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  176. 前記Casタンパク質及び前記1つから2つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項3、9または15のいずれか一項に記載の方法。
  177. 前記Casタンパク質及び前記1つから2つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項3、9または15のいずれか一項に記載の方法。
  178. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む、請求項177に記載の方法。
  179. 前記カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項178に記載の方法。
  180. 前記中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項178に記載の方法。
  181. 前記PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項178に記載の方法。
  182. 前記Casタンパク質及び前記複数のリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項6、12または18のいずれか一項に記載の方法。
  183. 前記Casタンパク質及び前記複数のリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項6、12または18のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む、請求項183に記載の方法。
  185. 前記カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項184に記載の方法。
  186. 前記中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項184に記載の方法。
  187. 前記PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項184に記載の方法。
  188. 各遺伝子座での改変効率は約50%から約80%である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  189. 前記改変効率は少なくとも約5%である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  190. 前記改変効率は少なくとも約10%である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記改変効率は約50%から約80%である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記Casタンパク質は、修飾リボ核酸によってコードされる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  193. 前記修飾核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むリボ核酸を含む、請求項192に記載の方法。
  194. 前記リボ核酸の少なくとも1つは、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項1〜193のいずれか一項に記載の方法。
  195. 任意の前記Casタンパク質または前記リボ核酸は、プラスミドから発現する、請求項1〜194のいずれか一項に記載の方法。
  196. 任意の前記Casタンパク質または前記リボ核酸は、幹細胞内での発現を増加させるために最適化されたプロモーターを用いて発現する、請求項1〜195のいずれか一項に記載の方法。
  197. 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項196に記載の方法。
  198. 前記Casタンパク質を発現する細胞を選択することを更に含む、請求項1〜2、請求項4〜5、請求項7〜8、請求項10〜11、請求項13〜14、または請求項16〜17のいずれか一項に記載の方法。
  199. 細胞を選択することはFACSを含む、請求項198に記載の方法。
  200. FACSを使用して、Casタンパク質並びに緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質を共発現する細胞を選択する、請求項199に記載の方法。
  201. 細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内の前記SCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、前記方法。
  202. 細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内の前記SCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、前記方法。
  203. 細胞中の標的βサラセミポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内の前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミ関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミポリヌクレオチド配列を切断させ、Casタンパク質が発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、前記方法。
  204. 対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記SCID関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによってエキソビボで改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  205. 対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記SCD関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  206. 対象においてβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を切断させ、改変効率は約8%から約80%であることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  207. 細胞中において複数の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、前記方法。
  208. 細胞中の複数の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び1つから2つのリボ核酸とを接触させることを含む方法であって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、前記方法。
  209. 細胞中の複数の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列を同時に改変する方法であって、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内でβサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%である、前記方法。
  210. 対象においてSCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、(a)細胞中の標的SCID関連ポリヌクレオチド配列を(複数)、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって、改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  211. 対象においてSCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記SCD関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  212. 対象において、βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は、(a)細胞中の標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を、エキソビボで、ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換ヒト細胞からなる群から選択される細胞内で前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)とCRISP関連(Cas)タンパク質及び複数のリボ核酸とを接触させることによって改変することであって、前記リボ核酸は、Casタンパク質を前記標的SCID関連ポリヌクレオチド配列(複数)の標的モチーフに指向させ、かつハイブリッド形成させ、前記標的βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)を切断させ、Casタンパク質を発現する細胞の改変効率は約8%から約80%であることと、(b)前記細胞を前記対象に導入することであって、これによって、前記βサラセミア関連ポリヌクレオチド配列(複数)の発現に関連する疾患の治療または予防が行われることとを含む、前記方法。
  213. 図1〜15の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物。
  214. 図1〜15の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物。
  215. 前記少なくとも1つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項213または214のいずれか一項に記載の組成物。
  216. 前記少なくとも1つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項213〜215のいずれか一項に記載の組成物。
  217. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む、請求項216に記載の組成物。
  218. 前記カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項217に記載の組成物。
  219. 前記中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項217に記載の組成物。
  220. 前記PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項217に記載の組成物。
  221. 前記リボ核酸の少なくとも1つは、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項213〜220のいずれか一項に記載の組成物。
  222. Casタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項213〜221のいずれか一項に記載の組成物。
  223. Cas9タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を更に含む、請求項213〜221のいずれか一項に記載の組成物。
  224. 前記核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項221〜223のいずれか一項に記載の組成物。
  225. Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図1〜15の前記リボ核酸配列からなる群から選択される配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物。
  226. Casタンパク質をコードするリボ核酸及び図1〜15のリボ核酸配列からなる群から選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸配列を含むキメラ核酸を含む組成物。
  227. 緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項225または226のいずれか一項に記載の組成物。
  228. 前記キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む、請求項225〜227のいずれか一項に記載の組成物。
  229. 前記プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される、請求項228に記載の組成物。
  230. 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項229に記載の組成物。
  231. 前記キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項225〜230のいずれか一項に記載の組成物。
  232. 前記キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項225〜231のいずれか一項に記載の組成物。
  233. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む、請求項232に記載の組成物。
  234. 前記カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項233に記載の組成物。
  235. 前記中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項233に記載の組成物。
  236. 前記PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項233に記載の組成物。
  237. 前記キメラ核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項225〜236のいずれか一項に記載の組成物。
  238. 前記Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその官能性部分を含む、請求項225〜237のいずれか一項に記載の組成物。
  239. 細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、Cas9タンパク質または前記Cas9タンパク質をコードする核酸、及び図1〜15のリボ核酸配列、図1〜15のリボ核酸配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列またはその少なくとも12ヌクレオチドの断片を含む、前記キット。
  240. ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される1種以上の細胞株、培養液または集団を更に含む、請求項236に記載のキット。
  241. ADA DNA修復テンプレート、AK2 DNA修復テンプレート、CD3D DNA修復テンプレート、DCLRE1C DNA修復テンプレート、IL2RG DNA修復テンプレート、IL7R DNA修復テンプレート、JAK3 DNA修復テンプレート、LIG4 DNA修復テンプレート、NHEJ1 DNA修復テンプレート、PNP DNA修復テンプレート、PRKDC DNA修復テンプレート、RAG1 DNA修復テンプレート、RAG2 DNA修復テンプレート、ZAP70 DNA修復テンプレート、及びHBB DNA修復テンプレートからなる群から選択されるDNA修復テンプレートを更に含む、請求項236に記載のキット。
  242. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項108に記載の方法。
  243. 前記1つから2つのリボ核酸のうちの少なくとも1つは、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、請求項108に記載の方法。
  244. リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物。
  245. リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つのリボ核酸を含む組成物。
  246. 前記少なくとも1つのリボ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項244または245のいずれか一項に記載の組成物。
  247. 前記少なくとも1つのリボ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項244〜246のいずれか一項に記載の組成物。
  248. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む、請求項247に記載の組成物。
  249. 前記カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項248に記載の組成物。
  250. 前記中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項247に記載の組成物。
  251. 前記PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項247に記載の組成物。
  252. 前記リボ核酸の少なくとも1つは、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される1つから2つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸である、請求項244〜251のいずれか一項に記載の組成物。
  253. Casタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項244〜252のいずれか一項に記載の組成物。
  254. Cas9タンパク質またはその官能性部分をコードする核酸配列を更に含む、請求項244〜253のいずれか一項に記載の組成物。
  255. 前記核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む修飾リボ核酸を含む、請求項244〜254のいずれか一項に記載の組成物。
  256. Casタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGまたはその少なくとも12のヌクレオチド断片を有する少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物。
  257. Casタンパク質をコードするリボ核酸及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む少なくとも1つの追加のリボ核酸を含むキメラ核酸を含む組成物。
  258. 緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項256または257のいずれか一項に記載の組成物。
  259. 前記キメラ核酸に作用可能に連結されるプロモーターを更に含む、請求項256〜258のいずれか一項に記載の組成物。
  260. 前記プロモーターは、ヒト幹細胞内での発現を増加させるために最適化される、請求項259に記載の組成物。
  261. 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−1αプロモーター及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項259または260に記載の組成物。
  262. 前記キメラ核酸はナノ粒子内に含まれる、請求項256〜261のいずれか一項に記載の組成物。
  263. 前記キメラ核酸は脂質ナノ粒子内に含まれる、請求項256〜262のいずれか一項に記載の組成物。
  264. 前記脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、アミノ脂質、ステロール及びPEGまたはPEG修飾脂質の少なくとも1つを含む、請求項263に記載の組成物。
  265. 前記カチオン性脂質は、ALNY−100、C12−200、DODAC、DDAB、DOTAP、DOTMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、DLin−C−DAP、DLin−DAC、DLin−MA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLin−TMA.Cl、DLin−TAP.Cl、DLin−MPZ、DLinAP、DOAP、DLin−EG−DMA、DLinDMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、DLin−M−C3−DMA、KC2、MC3、DOTAP.Cl、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DMRIE、XTC、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項264に記載の組成物。
  266. 前記中性脂質は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、SM及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項264に記載の組成物。
  267. 前記PEG修飾脂質は、PEG−DMG、PEG−CerC14、PEG−CerC20及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項264に記載の組成物。
  268. 前記キメラ核酸は、プソイドウリジン、5−メチルシトジン、2−チオ−ウリジン、5−メチルウリジン−5’−三リン酸、4−チオウリジン−5’−三リン酸、5,6−ジヒドロウリジン−5’−三リン酸及び5−アザウリジン−5’−三リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項256〜267のいずれか一項に記載の組成物。
  269. 前記Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその官能性部分を含む、請求項256〜268のいずれか一項に記載の組成物。
  270. 細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、Cas9タンパク質または前記Cas9タンパク質をコードする核酸、及びリボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGG、リボ核酸配列GTAACGGCAGACTTCTCCACAGGに対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列からなる群から選択される少なくとも1つのリボ核酸配列またはその少なくとも12のヌクレオチド断片を含む、キット。
  271. ヒト多能性細胞、初代ヒト細胞及び非形質転換細胞からなる群から選択される1種以上の細胞株、培養液または集団を更に含む、請求項270に記載のキット。
  272. HBB DNA修復テンプレートを更に含む、請求項270または271のいずれか一項に記載のキット。
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