JP6072788B2 - 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｃｆｔｒ）遺伝子を改変するための方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／５１１，４３４号の利益を主張するものであり、該米国仮特許出願の開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本開示はゲノム編集の分野に属する。

発明の権利に関する記載
連邦支援の研究に基づき成された
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたＨＬ０９９５５９を基に、政府支援を用いて成された。政府は本発明において特定の権利を有し得る。

肺疾患、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）および肺サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）欠損症等の遺伝性障害は、小児集団においては依然として問題のままである。ＳＰ−Ｂ欠損症は、タンパク質および脂肪分子が肺の遠位部に蓄積して呼吸に影響を与える、まれな肺疾患である。この疾患は肺サーファクタントタンパク質Ｂの欠損によって引き起こされ、出生後の肺の機能および恒常性に不可欠な両親媒性のサーファクタントタンパク質である肺関連サーファクタントＢタンパク質（pulmonary-associated surfactant B protein：ＳＰＢ）をコードするＳＦＴＰＢ遺伝子における欠損が主な原因である。ＳＰ−Ｂ欠損症における最も一般的な変異は「１２１ｉｎｓ２」と命名された変異であり、この変異により１３１位のヌクレオチド「Ｃ」が「ＧＡＡ」に変換される。

ＣＦは１５００〜４０００に１の出生で発症する常染色体劣性遺伝疾患であり、最も一般的な遺伝性小児疾患のうちの一つである。ＣＦにおける主な異常は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子にコードされる塩素イオンチャネルタンパク質による上皮性塩素輸送の調節に存在する。例えば、非特許文献１;非特許文献２を参照されたい。ＣＦ患者に観察される変異の約７０％はＣＦＴＲヌクレオチド配列内の３つの塩基対の欠失によるものであり、これによって、該タンパク質内の５０８位に位置するアミノ酸、フェニルアラニンの喪失が起こる（ΔＦ５０８と称される変異）。野生型のゲノムでは、アミノ酸５０７はイソロイシンであり、コドンＴＡＧにコードされており、このＧは、前記遺伝子内のヌクレオチド１６５２である。アミノ酸５０８はフェニルアラニンであり、ＡＡＡにコードされている。Δ５０８変異では、コドン５０７のＧがコドン５０８の最初の２つのＡと共に欠失しており、その結果、この変異は欠失した５０７〜５０８コード位置に配列ＴＡＡを有することになる。ＴＡＡもイソロイシンをコードするが、野生型の５０８位のフェニルアラニンは失われる。ΔＩ５０７欠失では、５０６位または５０７位のイソロイシンのいずれかが欠失している。この変異では、１６４８〜１６５０位または１６５１〜１６５３位のヌクレオチドが失われていることによって、またはいくつかのそれらの組み合わせによって、生じたタンパク質にはイソロイシンが１つしか存在しない結果となる。複合型（compound）（ヘテロ接合性）変異（ΔＦ５０８およびΔＩ５０７）も報告されている。例えば、非特許文献３を参照されたい。複合型ヘテロ接合性ΔＩ５０７／ΔＦ５０８またはホモ接合性ΔＦ５０８／ΔＦ５０８のＣＦ患者は、完全グリコシル化ＣＦＴＲタンパク質を発現することができず、ＣＦＴＲ機能に必要となる、完全グリコシル化タンパク質の細胞表面発現が起こらない（例えば、非特許文献２;Cheng et al. (1990) Cell 63:827-834を参照）。ΔＩ５０７またはΔＦ５０８のＣＦＴＲ変異のいずれかを一方の対立遺伝子にのみ有する個体（すなわちｗｔ／ΔＩ５０７またはｗｔ／ΔＦ５０８）はＣＦ保因者であり、肺細胞機能における欠陥は示さない。例えば、Keremet al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:8447-8451を参照されたい。

いくつかの臓器系はＣＦＴＲ遺伝子内の変異によって影響を受けるが、再発性肺感染症がＣＦ患者における死亡の８０〜９０％に関与している。どのヒト肺細胞型がＣＦＴＲを発現するかについてのいくらかの議論はあるが、最新データが示すところによれば、ＣＦＴＲ発現は近位肺で最も大きく、表面気道上皮に存在する繊毛細胞によって主に発現される。非特許文献２; Engelhardt et al.(1992) Nat Genet 2:240-248; Engelhardt et al. (1994) J Clin Invest 93:737-749。

インビボ遺伝子治療によるＣＦ治療の試みは、ＣＦＴＲ導入遺伝子の送達に使用されるウイルスベクターの免疫原性認識およびクリアランス、ＣＦＴＲの長期発現を検出できないこと、並びに肺における関連幹／前駆細胞集団の安定な形質導入を達成できない可能性によって妨げられている（Mueller &Flotte (2008) Clin Rev Allergy Immunol 35:164-178;Anson et al. (2006) Curr Gene Ther 6:161-179）。近年、ヒト肺幹細胞の単離に関する報告がなされている（Kajsturaet al., (2011) New England Journal of Medicine 364(19):1795参照）。その著者らは、これらの細胞を単離し、培養液中で維持し、インビボで損傷を受けたマウス肺に再導入できたこと、これらの細胞が構造的に集積して組織となり、細気管支、肺胞および肺血管を再形成できたこと、を報告している。

従って、新規の抗ＣＦ戦略の開発、例えば、ＣＦＴＲ変異の研究に基づきＣＦをモデル化および治療するための、並びに肺疾患治療の移植および治療用の幹細胞を開発するための、治療およびモデル系（細胞株等のインビトロおよびインビボ動物系）が依然として必要とされている。

Ｋｅｒｅｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５：１０７３〜１０８０ Ｋｒｅｄａら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ（２００５）１６：２１５４〜２１６７ Ｏｒｏｚｃｏら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）５１（２）：１３７〜９

ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢの遺伝子座を改変するための方法および組成物が本明細書で開示される。また、ＣＦ遺伝子（例えば、ＣＦＴＲ）またはＳＦＴＰＢ（例えば、ＳＰ−Ｂ）の機能を研究するためのモデル、ＣＦおよびＳＰ−Ｂ欠損症の創薬のためのモデル、並びにＣＦまたはＳＰ−Ｂを治療するためのモデル、並びにこれらのモデル系を作製および使用するための方法についても記載される。本明細書に記載の組成物および方法は、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢのゲノム編集に使用することができ、例えば、限定はされないが、動物細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子またはＳＦＴＰＢ遺伝子を切断することによる、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子における標的化された改変（挿入、欠失および／または置換変異）（これらの標的化された改変を生殖系列に組み込むことを含む）；非内在性核酸配列のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子への標的化された導入、動物におけるＣＦＴＲ遺伝子の部分的または完全な不活性化；動物におけるＳＦＴＰＢ遺伝子の修復；ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢの遺伝子座に相同組換え修復（homology-directed repair）を誘導する方法；それを必要とする患者に移植するための、修復されたＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子を有する肺幹細胞集団の作製、並びにＣＦＴＲおよび／またはＳＦＴＰＢ遺伝子座で改変された遺伝子導入動物の作製（例えば、げっ歯類および非ヒト霊長類）が挙げられる。

一つの態様では、ゲノム内のＣＦＴＲ遺伝子における標的部位に結合し、一つまたは複数の操作されたＺｎフィンガー結合ドメインを含む、Ｚｎフィンガータンパク質（ＺＦＰ）が本明細書に記載される。一実施形態では、ＺＦＰは、目的の標的ゲノム領域を切断し、一つまたは複数の操作されたＺｎフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたはヌクレアーゼ切断ハーフドメイン（half-domain）を含む、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限酵素および／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（homingendonuclease）から得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインはＩＩＳ型制限酵素（例えば、FokI）由来である。ある実施形態では、ＺｎフィンガードメインはＣＦＴＲ遺伝子における標的部位を認識する。いくつかの実施形態では、Ｚｎフィンガードメインは変異型ＣＦＴＲ遺伝子における標的部位を認識し、その結果、ＺＦＮ対は変異型ＣＦＴＲ対立遺伝子のみを切断する。

一つの態様では、ゲノム内のＳＦＴＰＢ遺伝子における標的部位に結合し、一つまたは複数の操作されたＺｎフィンガー結合ドメインを含む、Ｚｎフィンガータンパク質（ＺＦＰ）が本明細書に記載される。一実施形態では、ＺＦＰは、目的の標的ゲノム領域を切断し、一つまたは複数の操作されたＺｎフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたはヌクレアーゼ切断ハーフドメインを含む、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限酵素および／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインはＩＩＳ型制限酵素（例えば、FokI）由来である。ある実施形態では、ＺｎフィンガードメインはＳＦＴＰＢ遺伝子における標的部位を認識する。

ＺＦＮは、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子に対して、その遺伝子のコード配列内で、またはその遺伝子内もしくはそれに隣接する非コード配列（例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等）において、またはそのコード配列の上流もしくは下流のいずれかにある非転写領域内で、結合および／または切断を行うことができる。

別の態様では、ゲノム内のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子における標的部位に結合し、一つまたは複数の操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ＴＡＬＥタンパク質（Transcription activator like（転写活性化因子様））が本明細書に記載される。一実施形態では、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を切断し、一つまたは複数の操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたはヌクレアーゼ切断ハーフドメインを含む、ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限酵素および／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインはＩＩＳ型制限酵素（例えば、FokI）由来である。ある実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインはＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子における標的部位を認識する。

ＴＡＬＥＮは、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子に対して、その遺伝子のコード配列内で、またはその遺伝子内もしくはそれに隣接する非コード配列（例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等）において、またはそのコード配列の上流もしくは下流のいずれかにある非転写領域内で、結合および／または切断を行うことができる。ある実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインはＣＦＴＲ遺伝子における標的部位を認識する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、変異型ＣＦＴＲ遺伝子における標的部位を認識し、その結果、ＴＡＬＥＮ対は変異型ＣＦＴＲ対立遺伝子のみを切断する。

別の態様では、本明細書に記載のＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを一つまたは複数含む組成物が本明細書に記載される。ある実施形態では、前記組成物は、一つまたは複数のＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを、薬剤的に許容できる賦形剤と共に含む。

別の態様では、本明細書に記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを一つまたは複数コードするポリヌクレオチドが本明細書に記載される。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであり得る。

別の態様では、本明細書に記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを一つまたは複数コードし、プロモーターに機能的に連結したポリヌクレオチドを含むＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターが本明細書に記載される。

別の態様では、一つまたは複数のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載される。宿主細胞を一つまたは複数のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターで安定に形質転換するか、または宿主細胞に該発現ベクターを一過性に形質移入するか、または宿主細胞に対してそれらの組み合わせを行うことができる。一実施形態では、宿主細胞は胚性幹細胞である。一実施形態では、宿主細胞は肺幹細胞である。他の実施形態では、一つまたは複数のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターは、宿主細胞内で一つまたは複数のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを発現する。別の実施形態では、宿主細胞は外来性ポリヌクレオチドドナー配列をさらに含み得る。本明細書に記載される前記実施形態のいずれかにおいて、宿主細胞は、胚、例えば一または複数のマウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物胚（例えば、非ヒト霊長類）内に存在し得る。

別の態様では、細胞中の一つまたは複数のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子を切断するための方法が本明細書に記載され、該方法は、（ａ）ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮが発現され、且つ一つまたは複数の遺伝子（ＣＦＴＲおよび／またはＳＦＴＰＢ）が切断されるような条件下で、一つまたは複数の遺伝子内の標的部位に結合する一つまたは複数のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。

別の実施形態では、細胞のゲノム内の一つまたは複数のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子配列を改変するための方法が本明細書に記載され、該方法は、（ａ）一つまたは複数のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ配列を含む細胞を用意し；（ｂ）細胞内で第一および第二のＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを発現することを含み、該第一ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは第一切断部位で切断を起こし、該第二ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは第二切断部位で切断を起こし、該遺伝子配列は第一切断部位と第二切断部位の間に位置し、該第一および第二切断部位の切断によって、非相同末端結合および／または相同組換え修復による該遺伝子配列の改変がもたらされる。所望により、切断は、細胞にまた導入された外来性配列（導入遺伝子）の挿入をもたらす。他の実施形態では、非相同末端結合は、第一切断部位と第二切断部位の間に欠失をもたらす。遺伝子配列における欠失のサイズは、第一切断部位と第二切断部位の距離によって決定される。従って、いかなるサイズの欠失をも、いかなる目的ゲノム領域内にも、得ることができる。２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ヌクレオチド対の欠失を、またはこの範囲内のいかなる整数値のヌクレオチド対をも、得ることができる。さらに、１，０００ヌクレオチド対を超えるいかなる整数値のヌクレオチド対配列の欠失をも、本明細書で開示される方法および組成物を用いて得ることができる。これらの方法および組成物を用いて、一つまたは複数の既知のドメインを欠如している変異型ＣＦＴＲおよび／またはＳＦＴＰＢタンパク質を開発することができる。これらの構築物は、その後、細胞内での該タンパク質の機能研究に使用することができる。

別の態様では、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢに関連する特定の変異を修復することによって、該変異を有する該遺伝子の機能を理解することができ、並びに／または、例えばＣＦＴＲにおける変異ΔＦ５０８および／もしくはΔＩ５０７を含む、変異遺伝子の修復に関連する表現型を発見することができる。次に、そのような理解を利用して、薬物スクリーニングおよび創薬で使用するための、例えばＣＦまたはＳＰ−Ｂ欠損症の治療のための、細胞、細胞株および遺伝子導入動物を設計することができる。

別の態様では、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ内に部位特異的変異を構築して、既知のまたは新規の変異を設計することができる。例えば、ＣＦＴＲにおけるΔＦ５０８変異を、細胞、細胞株、初代細胞または遺伝子導入動物において構築することができる。一実施形態では、ＣＦＴＲに関しヘテロ接合性の遺伝子型を有する細胞、細胞株または遺伝子導入動物が構築され、一方で別の実施形態では、所望の遺伝子座の両方の対立遺伝子に２つの変異コピーを有するホモ接合性の細胞、細胞株または遺伝子導入動物が作製される。

別の態様では、本明細書に記載の通りに、一つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを細胞に導入することによって、細胞内のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子を不活性化させる方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは、細胞のＤＮＡ配列の標的変異、標的欠失を誘導し、および／または予定染色体座において標的組換えを促進することができる。従って、ある実施形態では、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは、標的遺伝子の一つまたは複数のヌクレオチドを欠失または挿入する。いくつかの実施形態では、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの切断と、それに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子は不活性化される。他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列は、例えば本明細書に記載されるＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ（または前記ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮをコードするベクター）、およびＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを用いた標的切断後に遺伝子に挿入される「ドナー」配列を使用して、置換される。ドナー配列は、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮベクター内に存在していてもよいし、別々のベクター（例えば、ＡｄまたはＬＶベクター）内に存在していてもよいし、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入されてもよい。一つの態様では、ドナー配列は既知の変異（例えば、ＣＦＴＲタンパク質内のΔＦ５０８変異）を引き起こす。ある実施形態では、ドナー配列は、ΔＦ５０８変異対立遺伝子への該ドナー配列の標的組込み後に、ＣＦＴＲのイントロン９に塩基対置換（Ａ＞Ｇ）をもたらす配列を含む（注：Ａ＞Ｇ置換は、エクソン１０の開始点に対し、イントロン９内の−６１位で生じる：すなわち−６１Ａ＞Ｇ）。

別の態様では、本明細書に記載の通りに、一つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを細胞に導入することによって、細胞内のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子（例えば、変異遺伝子）を修復する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは、細胞のＤＮＡ配列の標的変異、標的欠失を誘導し、および／または予定染色体座において標的組換えを促進することができる。従って、ある実施形態では、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは、標的遺伝子の一つまたは複数のヌクレオチドを欠失するか、または標的遺伝子に一つまたは複数のヌクレオチドを挿入する。いくつかの実施形態では、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの切断と、それに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、ＣＦＴＲおよび／またはＳＦＴＰＢ遺伝子は修復される。他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列は、例えば本明細書に記載されるＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ（または前記ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮをコードするベクター）、およびＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子の配列を修復するＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを用いた標的切断後に遺伝子に組み込まれる「ドナー」配列を使用して、置換される。いくつかの実施形態では、ドナー配列はセーフハーバー遺伝子座（safe harbor locus）に挿入される（共有に係る米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号参照）。ドナー配列は、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮベクター内に存在していてもよいし、別々のベクター（例えば、ＡｄまたはＬＶベクター）内に存在していてもよいし、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入されてもよい。一つの態様では、ドナー配列は既知の変異を修復する（例えば、ΔＦ５０８変異の修復）。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、修復は完全にグリコシル化されたＣＦＴＲタンパク質の発現をもたらす。

本明細書に記載の方法または組成物のいずれかにおいて、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座を含有する細胞は幹細胞であり得る。本発明の方法および組成物と共に使用することができる特定の幹細胞型としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、肺幹細胞および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。ｉＰＳＣは患者試料または健常ドナーに由来し得、患者由来ｉＰＳＣを目的遺伝子において正常な遺伝子配列に変異させることができ、あるいは、正常細胞を目的遺伝子において既知の疾患対立遺伝子に変化させることができる。これらのｉＰＳＣのパネルを使用して、内在性ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座に一つまたは複数の変異を有する患者細胞および正常細胞の両方を含む同質遺伝子細胞を作製することができる。これら細胞を使用することで、目的の変異においてのみ異なる細胞株および／または遺伝子導入動物を作製することができ、それにより、疾患重症度の多重遺伝子効果並びにＣＦおよび／またはＳＢ−Ｐ欠損症に対する可能な治療的処置を研究することができる。これらの研究に使用することができる他の細胞型は、患者由来線維芽細胞または患者由来幹細胞である。別の態様では、本発明は、治療を必要とする患者へ移植するための肺（または他の）幹細胞を作製するための方法および組成物を提供する。移植用の肺幹細胞は、患者自身に由来し、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座における疾患関連部位で修復され、患者に再び導入され得る。他の態様では、肺幹細胞は、一般的供給源に由来し、野生型ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子を含有し得、移植細胞が患者に拒絶されないように、ＨＬＡおよび／または他の自己標識が改変されている（共有に係る米国特許出願公開第２０１２００６０２３０号）。

別の態様では、少なくとも１つの目的のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座に一つまたは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作製する方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって、動物胚の一つまたは複数の細胞のゲノムにおける一つまたは複数のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座を改変し；その胚を性的成熟期まで育成し；その性的成熟した動物に子孫を産ませること；を含み、その子孫の少なくともいくらかは前記変異対立遺伝子を含む。ある実施形態では、動物は小型の哺乳動物、例えばウサギまたはラット、マウスもしくはモルモット等のげっ歯類である。他の実施形態では、動物は非ヒト霊長類である。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせを含み得る。ある実施形態では、前記ポリヌクレオチドはプラスミドを含む。他の実施形態では、前記ヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含む。

またさらなる態様では、核酸配列を染色体のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座に部位特異的に組込むための方法が本明細書で提供される。ある実施形態では、前記方法は、（ａ）胚に、（ｉ）組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、並びに（ｉｉ）ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座における組込み部位を認識するＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子、を注入すること、並びに（ｂ）該胚を培養してＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを発現させることを含み、ＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮにより組込み部位に導入された二本鎖切断は、該核酸配列を該染色体に組み込むために、該ＤＮＡベクターを用いた相同組換えによって修復される。

安定な胚は、いくつかの異なる脊椎動物種、例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、および魚の種に由来し得る。一般的に、安定な胚とは、採取することができ、注射することができ、且つ培養してＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを発現させることができる胚である。いくつかの実施形態では、安定な胚には、小型哺乳動物（例えば、げっ歯類、ウサギ等）、伴侶動物、家畜、または霊長類に由来する胚が含まれ得る。げっ歯類の非限定例には、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットが含まれ得る。伴侶動物の非限定例には、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが含まれ得る。家畜の非限定例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシが含まれ得る。霊長類の非限定例には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびサバンナモンキーが含まれ得る。他の実施形態では、安定な胚には、魚、爬虫類、両生類、または鳥類に由来する胚が含まれ得る。あるいは、安定な胚には、昆虫の胚、例えば、ショウジョウバエの胚または蚊の胚が含まれ得る。

また、組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、並びに染色体上の組込み部位を認識するＺｎフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む胚も提供される。また、本明細書に記載される胚のいずれかに由来する生物も提供される。

別の態様では、本発明の方法および組成物は、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損症を患う動物の治療に使用するための薬剤ライブラリーおよび／または他の治療用組成物（すなわち、抗体、構造的ＲＮＡ等）のスクリーニングにおける、細胞、細胞株および動物（例えば、遺伝子導入動物）の使用を提供する。そのようなスクリーニングは、操作された細胞株または初代細胞を用いて細胞レベルから始めることができ、動物（例えば、ヒト）全身を治療するレベルにまで進めることができる。

また、本発明に記載のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含むキットも提供される。キットは、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮをコードする核酸（例えばＲＮＡ分子、または安定な発現ベクターに含有されるＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮをコードする遺伝子）、または一定分量のＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮタンパク質、ドナー分子、安定な宿主細胞株、本発明の方法を実行するための説明書等を含み得る。

これらの態様および他の態様は、下記の実施形態を含む全体としての本開示を考慮することにより、当業者には容易に明らかになるであろう。
１．
操作されたＺｎフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６と配列された４、５または６つのＺｎフィンガー認識領域を含み、前記Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６が表１の単一列に示される配列を含む、上記タンパク質。
２．
実施形態１に記載のタンパク質および野生型のまたは操作された切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質。
３．
実施形態１または２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
４．
実施形態１もしくは２に記載のタンパク質または実施形態３に記載のポリヌクレオチドを含む単離細胞。
５．
前記細胞が胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、肺幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および線維芽細胞からなる群から選択される、実施形態４に記載の細胞。
６．
細胞における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子または肺サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）遺伝子を改変する方法であって、ＣＦＴＲまたはＳＰ−Ｂに標的化された一つまたは複数の融合タンパク質を用いてＣＦＴＲまたはＳＰ−Ｂ遺伝子を切断することを含み、該融合タンパク質が実施形態２に記載の融合タンパク質およびＳＰ−Ｂに標的化されたヌクレアーゼからなる群から選択される、上記方法。
７．
前記改変が、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態６に記載の方法。
８．
ＣＦＴＲまたはＳＰ−Ｂ遺伝子に外来性配列を導入することをさらに含む、実施形態６または７に記載の方法。
９．
前記改変がＣＦＴＲまたはＳＰ−Ｂ遺伝子における変異を修復する、実施形態６〜８のいずれか１項に記載の方法。
１０．
前記変異がΔＦ５０８、ΔＩ５０７、１２１ｉｎｓ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
１１．
嚢胞性線維症（ＣＦ）または肺サーファクタントタンパク質Ｂ欠損症の研究用モデル系を作製する方法であって、実施形態６〜１０のいずれかの方法に従って細胞を改変することを含む、上記方法。
１２．
前記モデル系が細胞株または非ヒト動物を含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．
対象においてＣＦまたはＳＰ−Ｂ欠損症を治療する方法であって、実施形態９または１０に記載の方法に従って、前記対象の一つまたは複数の細胞におけるＣＦＴＲまたはＳＰ−Ｂ遺伝子を改変することを含む、上記方法。
１４．
前記細胞がインビトロで改変され、前記細胞が前記対象に投与される、実施形態１３に記載の方法。
１５．
実施形態１に記載のタンパク質、実施形態２に記載の融合タンパク質、または実施形態３に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
操作されたＺｎフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６と配列された４、５または６つのＺｎフィンガー認識領域を含み、前記Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６が表１の単一列に示される配列を含む、上記タンパク質。
（項目２）
項目１に記載のタンパク質および野生型のまたは操作された切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質。
（項目３）
項目１または項目２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目４）
項目１もしくは２に記載のタンパク質または項目３に記載のポリヌクレオチドを含む単離細胞。
（項目５）
前記細胞が胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、肺幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および線維芽細胞からなる群から選択される、項目４に記載の細胞。
（項目６）
細胞における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を改変する方法であって、
一つまたは複数の項目２に記載の融合タンパク質を用いてＣＦＴＲを切断すること、を含む上記方法。
（項目７）
前記改変が、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
ＣＦＴＲ遺伝子に外来性配列を導入することをさらに含む、項目６または項目７に記載の方法。
（項目９）
前記改変がＣＦＴＲ遺伝子における変異を修復する、項目６〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記変異がΔＦ５０８、ΔＩ５０７およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
嚢胞性線維症（ＣＦ）の研究用モデル系を作製する方法であって、項目６〜１０のいずれかの方法に従って細胞を改変することを含む、上記方法。
（項目１２）
前記モデル系が細胞株または非ヒト動物を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
対象においてＣＦを治療する方法であって、項目９または１０に記載の方法に従って、前記対象の一つまたは複数の細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子を改変することを含む、上記方法。
（項目１４）
前記細胞がインビトロで改変され、前記細胞が前記対象に投与される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１に記載のタンパク質、項目２に記載の融合タンパク質、または項目３に記載のポリヌクレオチドを含むキット。

図１は、ＣＦ患者由来の誘導多能性幹細胞（ＣＦ ｉＰＳＣ）のゲノムにおけるΔＩ５０７またはΔＦ５０８ ＣＦＴＲ変異の、標的化された、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを介した修復、並びにＣＦＴＲ特異的ヌクレアーゼおよびＣＦＴＲドナーの同時送達（co-delivery）と、それに続くＣｒｅ−リコンビナーゼを介した切除を示す模式図である。ｌｏｘ：ｌｏｘＰ部位；ｐｇｋ：マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター；ｐｕｒｏＴＫ：ピューロマイシン−チミジンキナーゼ融合遺伝子；ｐＡ：ポリアデニル化シグナル配列；Ｃｒｅ：Ｃｒｅ−リコンビナーゼ。 図２（パネルＡ〜Ｃ）は、ＣＦ ｉＰＳＣにおけるＺＦＮを介したゲノム改変を示す。図２Ａは、標的化された対立遺伝子を示す模式図である。上流の特徴付け（characterization）（１．８ｋｂの単位複製配列を生成）に利用されるプライマー１／１’および下流の特徴付け（０．９ｋｂの単位複製配列）に利用されるプライマー２／２’が示される。 図２Ｂは、２１種中１８種のＣＦＴＲ標的化ｉＰＳＣクローンにおける、上流の１．８ｋｂの１／１’単位複製配列の同定を示すゲルである。ｉＰＳＣクローン番号は各レーンの上部に示される。示されているように、他のｐｕｒｏＲｉＰＳクローン（クローン１７−２２、１７−２３）についても、オリジナルのＣＦクローン１７ｉＰＳＣについても、ＭＥＦについても、１．８ｋｂ単位複製配列は同定されなかった。 図２Ｃは、７種のＣＦＴＲ標的化ｉＰＳＣクローンにおいて同定された、下流の０．９ｋｂの２／２’単位複製配列の同定を示すゲルである。示されているように、先に同定された１８種の標的化クローンのうちの１１種について、他のｐｕｒｏＲｉＰＳクローン（クローン１７−２２、１７−２３）について、オリジナルのＣＦクローン１７ ｉＰＳＣについて、およびＭＥＦについては、０．９ｋｂ単位複製配列は同定されなかった。 図３（パネルＡおよびＢ）は、ＣＦＴＲ編集されたｉＰＳＣクローンによる修復後（corrected）ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの発現を示している。図３Ａは、７種のＣＦＴＲ標的化ＣＦ ｉＰＳクローンについての、ＣＦＴＲ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示すゲルである。また、オリジナルクローン１７ＣＦ ΔＩ５０７／ΔＦ５０８ ｉＰＳ細胞、ＷＡ０９（Ｈ９）ｈＥＳ細胞、およびＡ５４９肺上皮細胞株によるＣＦＴＲ発現も示される。ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡ（エクソン８／９〜１１）の予想サイズは０．４６ｋｂである。クローン１７−１、１７−９、１７−１４、および１７−１６の分析は予測されたバンドを生じ（図示）、一方でクローン１７−１３、１７−１７、および１７−２０は、より大きなサイズのバンドも示した。 図３Ｂは、オリジナルのΔＩ５０７／ΔＦ５０８ＣＦＴＲ ｉＰＳ細胞（クローン１７、上側の鎖はΔＩ５０７（配列番号１）を示し、下側の鎖はΔＦ５０８（配列番号２）を示している）：修復されたｗｔ／ΔＦ５０８ ＣＦＴＲｉＰＳ細胞（クローン１７−１、上側の鎖はΔＦ５０８（配列番号３）を示し、下側の鎖は野生型（ｗｔ）（配列番号４）を示している）、およびｗｔ／ｗｔ ＣＦＴＲ Ａ５４９細胞（配列番号５）から得られたＣＦＴＲＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を示している。 図４（パネルＡおよびＢ）は、修復されたＣＦｗｔ／ΔＦ５０８ ｉＰＳ細胞から得られたｐｕｒｏＴＫカセットのＣｒｅによる切除を示している。図４Ａは、Ｃｒｅによる切除の前および後の改変された対立遺伝子、並びに未改変の対立遺伝子を示す模式図である。増幅による検証に使用され、共にドナー配列の外側に位置付けされたＰＣＲプライマーの３および３’の位置が示される。また、改変された対立遺伝子および未改変の対立遺伝子に関する、ＣｌａＩ消化産物の予想サイズも示される。 図４Ｂは、２種の標的化されたＣＦ ｉＰＳクローン（１７−９および１７−１６）、並びにそれら由来のＣｒｅ切除クローンに関する、ＣＦＴＲ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示すゲルである。また、オリジナルクローン１７ＣＦ ΔＩ５０７／ΔＦ５０８ ｉＰＳ細胞、ＷＡ０９ ｈＥＳ細胞、およびＡ５４９肺上皮細胞株によるＣＦＴＲ発現も示される。修復されたｗｔ／ΔＦ５０８ ＣＦＴＲ ｉＰＳ細胞（クローン１７−９および１７−１６）、並びにＣｒｅ切除後（Cre-excised）ｗｔ／ΔＦ５０８ ＣＦＴＲ ｉＰＳ細胞（１７−９−Ｃ１および１７−９−Ｃ２；１７−１６−Ｃ１および１７−１６−Ｃ２）から得られたＣＦＴＲＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定が、ゲルの下側に示される（上側の鎖はΔＦ５０８（配列番号６）および下側の鎖はｗｔ（配列番号７））。ＲＴ−ＰＣＲ単位複製配列の配列決定により、Ｃｒｅ切除後クローンにおけるｗｔＣＦＴＲ配列およびΔＦ５０８ ＣＦＴＲ配列の均等混合物が明らかにされた。 図５（パネルＡ〜Ｃ）は、修復後ＣＦｉＰＳ由来細胞による修復後ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの発現を示している。図５Ａは、未分化の（ｄ０）またはアクチビンＡ下で１〜３日間培養後のオリジナルクローン１７ ＣＦｉＰＳＣの遺伝子発現パターンを示しており、Ｓｏｘ１７ ｍＲＮＡおよびＣＦＴＲ ｍＲＮＡ両方の明らかな経時的発現上昇を示している。 図５Ｂは、修復およびＣｒｅ切除後のクローン１７−９−Ｃ１ｉＰＳＣの遺伝子発現パターンを示しており、また３〜５日目のアクチビンＡ下培養物によるＳｏｘ１７ ｍＲＮＡおよびＣＦＴＲ ｍＲＮＡ両方の発現上昇を示している。 図５Ｃは、表示のクローンおよび細胞における遺伝子発現レベルを示している。 図６（パネルＡおよびＢ）はさらなるＣＦＴＲ特異的ＺＦＮを示している。図６Ａは、各ＺＦＮに対する結合部位を示すＣＦＴＲ遺伝子配列の図解である（配列番号４５は上側のＤＮＡ鎖に対応し、配列番号４６は下側のＤＮＡ鎖であり；配列番号４７はアミノ酸配列を示しており；配列番号４８は図中で下線が引かれた（ＴＴＡＴＡＧＴＡＡＣＣＡ）、変異に対応する遺伝子配列の一部を示している）。ＺＦＮはＣＦＴＲのエクソン１内の配列と結合する。さらに、Δ５０８変異が生じ得る領域の周囲が囲まれている。 図６Ｂは、Ｋ５６２細胞におけるＺＦＮによるゲノム改変を実証するゲルを示している。３２３６５／３２３６６および３２３７５／３２３７６のＺＦＮ対は、それぞれ９％および１２％の割合のインデル形成を引き起こした。

ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損症の治療の評価に有用なモデルを治療および／または開発するための組成物および方法が、本明細書で開示される。具体的には、ヌクレアーゼを介した切断および組込みを利用して、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子における既知の変異を導入または修復する。これらの組成物および方法を使用して、選択されたいかなる遺伝的背景においても特定のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異を修復または導入することができ、それにより、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損症の研究を可能とすることができる。

従って、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢにおける一連の変異の同質遺伝子的なパネルを作出することができ、それにより、これらの変異の対照試験を可能とし、ある変異と細胞機能障害の因果関係を調査し、その変異またはその変異の修復に関連する表現型を同定することができる。さらに、いずれのＣＦＴＲ変異をもＳＦＴＰＢ変異をも、患者由来細胞（例えば患者由来誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））に導入することができ、それにより、患者細胞背景におけるある変異の影響を調査することができる。さらに、インフレーム改変によるＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異の作出も、本明細書に記載の発明の一部であり、これらのタンパク質の機能ドメインのきめ細かい分析を可能とする。さらに、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ２に関連するＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異を、モデル動物（ラット、非ヒト霊長類等）における天然遺伝子内に作出して、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損症モデルを作製することができる。これらの動物は、一つまたは複数の挿入されたＣＦＴＲおよび／またはＳＦＴＰＢ変異を含有し得る。

また、患者細胞における特定のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ欠損を変化させるための方法および組成物も本明細書に記載される。例えば、変異型のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子は、変異対立遺伝子には作用するが野生型遺伝子配列には作用しない特定のヌクレアーゼを使用することで、ノックアウトすることができる。特定遺伝子のノックアウトは、切断後のＮＨＥＪの結果、または該遺伝子内の２つの遺伝子座で切断が起こり該遺伝子の大部分が欠失されたことによる結果、または切断後のオリゴヌクレオチドもしくはより大きなドナーＤＮＡの標的組込みによる結果であり得る。さらに、患者細胞におけるＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ関連遺伝子内の特定の変異を修復するための方法および組成物が、本明細書に記載される。次に、そのような修復された細胞は、ＣＦまたはＳＦ−Ｂ欠損症の治療のために、患者に再導入され得る。患者細胞は幹細胞であってもｉＰＳＣであってもよい。一般的な幹細胞は、本発明の方法を用いて作製され得、その後、いかなるＣＦまたはＳＦ−Ｂ患者の治療にも使用され得る。

一般
本明細書で開示される方法の実践、並びに本明細書で開示される組成物の調製および使用には、特に明記しない限り、当業者の技能の範囲内である、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ並びに関連分野における従来技術が使用される。これらの技術は以下の文献において十分に説明がなされている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY, JohnWiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarmanand A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; および METHODS IN MOLECULARBIOLOGY, Vol. 119, “ChromatinProtocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義的に使用され、直鎖または環状高次構造の、且つ一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を指す。本開示の目的上、これらの用語は、重合体の長さに関する限定と解釈されるべきではない。これらの用語には、天然ヌクレオチドの既知の類似体、並びに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドが包含され得る。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は同一の塩基対形成特性を有し、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対形成する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すのに同義的に使用される。これらの用語は、一つまたは複数のアミノ酸が対応する天然のアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸重合体にも当てはまる。

「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸間）の配列特異的な、非共有結合性の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的でありさえすれば、結合性相互作用の構成要素の全てが配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触）。そのような相互作用は、一般的には、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は結合の強さを指し、結合親和性の増加はＫ_ｄの低下と相関している。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、該タンパク質は、それ自体に結合し得（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成）、および／または異なる1個のタンパク質の一つもしくは複数の分子もしくは複数のタンパク質に結合し得る。結合タンパク質は２つ以上の結合活性型を有し得る。例えば、Ｚｎフィンガータンパク質はＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。

「ＺｎフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化する結合ドメイン内アミノ酸配列領域である一つまたは複数のＺｎフィンガーを介して、配列特異的にＤＮＡと結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ＺｎフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、Ｚｎフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、一つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同起源の標的ＤＮＡ配列への結合に関与している。１個の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。

Ｚｎフィンガー結合ドメインは、例えば、天然のＺｎフィンガータンパク質の認識へリックス領域の操作（一つまたは複数のアミノ酸の変化）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。同様に、例えばＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（ＲＶＤ領域）を操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するようにＴＡＬＥを「操作」することができる。従って、操作されたＺｎフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然タンパク質である。Ｚｎフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを操作するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準から導かれる、天然には発生しないタンパク質である。設計に関する合理的基準には、置換法則、並びに既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を保存しているデータベース内の情報を処理するための計算機化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６を参照されたい。

「選択された」Ｚｎフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ（interaction trap）またはハイブリッド選択等の経験的な方法からもたらされる、天然には存在しないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。

「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的上、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞内の二本鎖切断の修復中に起こる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）の修復の鋳型とするために「ドナー」分子を使用する。このプロセスは、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらすので、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト（short tract）遺伝子変換」として、様々な名称で知られている。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、そのような移動は、切断された標的およびドナーの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、並びに／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング（synthesis-dependentstrand annealing）」、並びに／または関連プロセスを伴い得る。そのような特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子配列の変化をもたらす。

本開示の方法において、本明細書に記載の一つまたは複数の標的化ヌクレアーゼが標的配列（例えば、細胞性クロマチン）内の所定の部位に二本鎖切断を生成し、切断領域内のヌクレオチド配列に対し相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る。二本鎖切断の存在によって、ドナー配列の組込みが促進されることが示されている。ドナー配列は物理的に組み込まれてもよいし、あるいは、ドナーポリヌクレオチドは相同組換えにより切断を修復するためのテンプレートとして使用されて、その結果、ドナー内のヌクレオチド配列の全てまたは一部が細胞性クロマチンに導入される。そのようにして、細胞性クロマチン内の第一配列を変化させることができ、ある実施形態では、該配列をドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。従って、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報的な意味での配列の置換）を表すものと理解することができ、必ずしも、物理的または化学的な、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換を必要とするわけではない。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、さらなるＺｎフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質対を、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用することができる。

細胞性クロマチンにおける目的領域内の配列を標的組換えおよび／または置換および／または改変する方法のある実施形態では、外来性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって染色体配列は改変される。切断領域に相同な配列が存在する場合、細胞性クロマチン内の二本鎖切断の存在によって、そのような相同組換えが刺激される。

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第一ヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的領域内のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含有し得、それにより相同組換えを刺激して、非同一配列を目的領域内に挿入する。従って、ある実施形態では、目的領域内の配列に相同なドナー配列の一部は、置換されるゲノム配列に対して、約８０〜９９％（またはそれらの間のあらゆる整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００個超の連続する塩基対から成るドナー配列とゲノム配列の間で１個のヌクレオチドしか異なっていないならば、ドナー配列とゲノム配列間の相同性は９９％超である。ある場合では、ドナー配列の非相同性部分は、目的領域内に存在しない配列を含有し得、その結果、新しい配列が目的領域内に導入される。これらの場合、非相同配列は、一般的に、目的領域内の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間のあらゆる整数値）の、または１，０００を超えるあらゆる数の塩基対の配列に挟まれている。他の実施形態では、ドナー配列は第一配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム内に挿入される。

目的遺伝子の発現を乱すドナー配列を標的組込みすることにより、細胞内の一つまたは複数の標的配列を部分的または完全に不活性化するために、本明細書に記載の方法のいずれかを使用することができる。また、部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。

さらに、本明細書に記載の標的組込みの方法を使用して、一つまたは複数の外来性配列を組み込むこともできる。外来性核酸配列は、例えば、一つまたは複数の遺伝子またはｃＤＮＡ分子、またはあらゆる種類のコード配列もしくは非コード配列、および一つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、外来性核酸配列は、一つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の切断を指す。種々の方法、例えば、限定はされないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解によって、切断を惹起することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの別々な一本鎖切断事象の結果として発生し得る。ＤＮＡ切断は平滑末端または付着末端のいずれかを生み出し得る。ある実施形態では、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために融合ポリペプチドが使用される。

「切断ハーフドメイン」は、第二のポリペプチド（同一または異なる）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。「第一および第二切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」並びに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために同義的に使用される。

「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と強制的にヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号および同第２００８／０１３１９６２号（これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）も参照されたい。

「配列」という用語は、該ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖、環状または分岐鎖であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、いかなる長さのヌクレオチド配列をも指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列はいかなる長さであってもよく、例えば２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超えるあらゆる整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。

「クロマチン」は細胞ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、核酸（主にＤＮＡ）、およびタンパク質（例えばヒストンおよび非ヒストン性染色体タンパク質）を含む。真核細胞性クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、そこで、ヌクレオソームコアはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合しているおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物に応じて様々な長さの）がヌクレオソームコアの間に伸びている。通常、ヒストンＨ１分子がリンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的上、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物両方の、全種類の細胞性核タンパク質を包含するよう意図されている。細胞クロマチンには、染色体性クロマチンおよびエピソーム性クロマチンの両方が含まれる。

「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしばその核型により特徴付けられ、核型は、細胞のゲノムを構成する全ての染色体の集合である。細胞のゲノムは一つまたは複数の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製核酸、核タンパク質複合体または他の構造体である。エピソームの例としては、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。

「標的部位」または「標的配列」は、十分な結合条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。

「外来性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、一つまたは複数の遺伝学的手法、生化学的手法または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「細胞内の通常な存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件ごとに決定される。従って、例えば、筋肉の胚発生期にのみ存在する分子は、成体筋細胞に対する外来性分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、熱ショックされていない細胞に対する外来性分子である。外来性分子は、例えば、正常に機能しない内在性分子の正常機能バージョンまたは正常に機能する内在性分子の機能不全バージョンを含み得る。

外来性分子は、特に、コンビナトリアルケミストリー工程により生成されるような小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポ蛋白、多糖類、上記分子のあらゆる修飾誘導体、もしくは上記分子のうちの一つまたは複数を含むあらゆる複合体等の高分子であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく；直鎖であっても、分岐鎖であっても環状であってもよく；いかなる長さであってもよい。核酸は、二本鎖を形成することができる核酸、並びに三本鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、、限定はされないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。

外来性分子は、内在性分子と同種の分子（例えば、外来性のタンパク質または核酸）であってもよい。例えば、外来性核酸には、細胞内に通常は存在しない、細胞内または染色体に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソームが含まれ得る。外来性分子を細胞に導入する方法は当業者に既知であり、例えば、限定はされないが、脂質介在性導入（すなわち、中性および陽イオン性の脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性導入およびウイルスベクター介在性導入が挙げられる。外来性分子は内在性分子と同種の分子であり得るが、細胞が由来する種とは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列を、元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入することができる。

対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階の特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然のエピソーム性核酸を含み得る。さらなる内在性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が連結した、好ましくは共有結合的に連結した、分子である。サブユニット分子は、同一の化学的種類の分子であってもよいし、異なる化学的種類の分子であってもよい。融合分子の第一の種類の例としては、限定はされないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと一つまたは複数の活性化ドメインの融合）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。融合分子の第二の種類の例としては、限定はされないが、三本鎖形成核酸とポリペプチドの融合、および副溝結合剤と核酸の融合が挙げられる。

細胞における融合タンパク質の発現は、該融合タンパク質の細胞への送達された結果として、または該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞へ送達され、該ポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳され、該融合タンパク質が生成された結果として起こり得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションも、細胞内のタンパク質発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達する方法は、本開示の別の場所で示される。

「遺伝子」には、本開示の目的上、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域が含まれ、そのような制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかは問わない。従って、遺伝子には、必ずしも限定はされないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（例えばリボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域が含まれる。

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは他のあらゆるタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳により生成されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスにより改変されたＲＮＡ、並びに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化（myristilation）、およびグリコシル化により改変されたタンパク質も含まれる。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節には、限定はされないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得る。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較した場合の、遺伝子発現におけるいかなる低減をも指す。従って、遺伝子不活性化は部分的であっても完全であってもよい。

「目的領域」は、細胞性クロマチンのあらゆる領域、例えば、外来性分子と結合することが望ましい、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えのためであり得る。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノム内に存在し得る。目的領域は、遺伝子のコード配列内、転写された非コード配列（例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等）内、またはコード配列の上流もしくは下流の非転写領域内に存在し得る。目的領域は、１個のヌクレオチド対ほどの小ささであってもよく、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、またはいかなる整数値のヌクレオチド対であってもよい。

「真核」細胞には、限定はされないが、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれる。

「機能的連結」および「機能的に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、近位の２つ以上の構成要素（配列エレメント等）に対して同義的に使用され、ここで、これらの構成要素は、両構成要素が正常に機能し、且つこれらの構成要素のうち少なくとも１つがその他の構成要素のうちの少なくとも１つと接することで発現する機能を媒介することを可能とするように、配置されている。例として、プロモーター等の転写制御配列は、一つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを調節している場合、コード配列に機能的に連結していることになる。転写制御配列は一般的には、コード配列とシスに機能的に連結しているが、それに直接隣接している必要は無い。例えば、エンハンサーはコード配列に機能的に連結した転写制御配列であるが、それらは近接していない。

融合ポリペプチドに関して、「機能的に連結した」という用語は、各構成要素が、その他の構成要素に連結した状態において、そのように連結していない場合に発揮するであろう機能と同一の機能を発揮するという事実を意味し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインと融合している融合ポリペプチドに関して、仮に、その融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御可能であるならば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは機能的に連結していることになる。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合している融合ポリペプチドの場合では、仮に、その融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位と結合可能であり、一方切断ドメインが標的部位の近傍のＤＮＡを切断可能であるならば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは機能的に連結していることになる。

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能性フラグメント」は、配列は完全長の該タンパク質、該ポリペプチドまたは該核酸と同一ではないが、完全長の該タンパク質、該ポリペプチドまたは該核酸と同一の機能を保持している、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能性フラグメントは、対応する天然分子と比較してより多くの、より少ない、または同じ数の残基を有する可能性があり、および／または一つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を含有する可能性がある。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定する方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。上記Ausubel et al.を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共に遺伝学的および生化学的な、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性によって決定され得る。例えば、Fieldset al. (1989) Nature 340:245-246；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。

「ベクター」は遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能である。典型的に、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる、いかなる核酸コンストラクトをも意味する。従って、前記用語には、クローニング、および発現ビヒクル、並びに組込みベクターも含まれる。

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、測定が容易な、好ましくは必ずしも通例のアッセイでなくとも測定が容易なタンパク質産物を生成する、いかなる配列をも指す。適切なレポーター遺伝子には、限定はされないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、並びに細胞成長および／または遺伝子増幅の増強を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれる。エピトープ標識には、例えば、一つまたは複数コピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは検出可能なあらゆるアミノ酸配列が含まれる。「発現標識」には、目的遺伝子の発現をモニターするための、所望の遺伝子配列に機能的に連結し得るレポーターをコードする配列が含まれる。

ヌクレアーゼ
例えばＣＦのモデルを作製するための、一つまたは複数の変異型ＣＦＴＲ対立遺伝子および／または一つまたは複数のＣＦＴＲ対立遺伝子の変異の修復に有用な組成物、特にヌクレアーゼが、本明細書に記載される。ある実施形態では、ヌクレアーゼは天然のものである。他の実施形態では、ヌクレアーゼは天然でないもの、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインに操作を受けたものである。例えば、天然のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを改変して、選択された標的部位に結合することができる（例えば、その同起源の結合部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは異種性のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む（例えば、異種切断ドメインを有する、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬ作動因子ヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）。

Ａ． ＤＮＡ結合ドメイン
ある実施形態では、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般的には４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は既知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al.(1997) NucleicAcidsRes.25:3379‐3388; Dujonet al. (1989) Gene 82:115‐118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125‐1127; Jasin(1996) Trends Genet. 12:224‐228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163‐180;Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345‐353およびニュー・イングランド・バイオラボ社（NewEngland Biolabs）のカタログも参照されたい。

ある実施形態では、ヌクレアーゼは操作された（天然でない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列は既知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379‐3388; Dujonet al. (1989) Gene 82:115‐118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125‐1127; Jasin(1996) Trends Genet. 12:224‐228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol.263:163‐180;Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.280:345‐353およびニュー・イングランド・バイオラボ社のカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位と結合するように操作することが可能である。例えば、Chevalier et al.(2002) Molec. Cell10:895-905; Epinat et al.(2003) Nucleic Acids Res.31:2952-2962;Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) CurrentGene Therapy 7:49-66;米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、全体としてのヌクレアーゼとの関連において（すなわち、ヌクレアーゼが同起源の切断ドメインを含むように）改変することができ、あるいは異種切断ドメインと融合することができる。

他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然のまたは操作された（天然でない）ＴＡＬ作動因子ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。植物病原菌であるザントモナス属は、重要な作物において多くの疾患を引き起こすことが知られている。ザントモナス属の病原性は、２５種を超える様々な作動因子タンパク質を植物細胞に注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）装置によるものである。これらの注入されたタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化物質様作動因子（transcription activator-like effector：ＴＡＬＥ）がある（Kay et al (2007)Science 318:648-651参照）。これらのタンパク質はＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も特徴がはっきりしているＴＡＬＥの一つは、ピーマン・シシトウ斑点細菌病菌（Xanthomonascampestgrispv.Vesicatoria）由来のＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136およびＷＯ２０１００７９４３０参照）。ＴＡＬＥは縦列反復の集中ドメイン（centralizeddomain）を含有し、各反復はおよそ３４個のアミノ酸を含有し、これらのアミノ酸は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である。さらに、ＴＡＬＥは、核局在配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総括に関してSchornackS, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照）。さらに、植物病原細菌である青枯病菌（Ralstoniasolanacearum）において、操作されたｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７の２つの遺伝子が、ラルストニア・ソラナケアルムビオヴァル１（R.solanacearumbiovar 1）株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００におけるザントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリーと類似していることが発見された（Heueret al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384参照）。これらの遺伝子はヌクレオチド配列において９８．９％互いに同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにける１，５７５ｂｐの欠失によって異なっている。しかし、両方の遺伝子産物は、ザントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性しか有さない。

従って、いくつかの実施形態では、標的部位であるＣＦＴＲ遺伝子に結合するＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体ザントモナス属（Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512 および Moscou and Bogdanove,(2009) Science326: 1501参照）およびラルストニア属（Heueret al (2007) Applied andEnvironmental Microbiology 73(13): 4379-4384参照）由来のものに類似したＴＡＬ作動因子を操作して得られたドメインである；米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号および同第２０１１０１４５９４０号。

ある実施形態では、標的部位であるＣＦＴＲ遺伝子に結合するＤＮＡ結合ドメインは、Ｚｎフィンガータンパク質を含む。Ｚｎフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するよう操作されているという点で、天然でないことが好ましい。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo et al.(2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan et al. (2001) NatureBiotechnol.19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637;Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号（全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

操作されたＺｎフィンガー結合ドメインは、天然のＺｎフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、限定はされないが、合理的設計および各種の選択が含まれる。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のＺｎフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、そのデータベースでは、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列が、特定の三つ組または四つ組配列と結合するＺｎフィンガーの一つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）

例示的な選択方法（例えばファージディスプレイおよびツーハイブリッド法）は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；並びにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に記載されている。さらに、Ｚｎフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に記載されているように、ＤＮＡドメイン（例えば、多指型（multi-fingered）Ｚｎフィンガータンパク質）は、あらゆる適切なリンカー配列（例えば、５以上のアミノ酸長のリンカー）を用いて、連結することができる。６以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関する、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のＺｎフィンガータンパク質は、該タンパク質の個々のＺｎフィンガー間に、あらゆる組み合わせの適切なリンカーを含み得る。さらに、Ｚｎフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

標的部位；ＤＮＡ結合ドメインの選択、並びに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は当業者に既知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号；同第７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に記載されているように、Ｚｎフィンガードメインおよび／または多指型Ｚｎフィンガータンパク質は、あらゆる適切なリンカー配列（例えば、５以上のアミノ酸長のリンカー）を用いて、連結することができる。６以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関する、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、該タンパク質の個々のＺｎフィンガー間に、あらゆる組み合わせの適切なリンカーを含み得る。

Ｂ． 切断ドメイン
何らかの適切な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに機能的に連結して、ヌクレアーゼを形成させることができる。例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することで、ＺＦＮ（その目的の核酸標的をその操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介して認識し、ヌクレアーゼ活性によってＺＦＰ結合部位付近でＤＮＡ切断を引き起こすことができる機能的実体）が生成された。例えば、Kim et al. (1996) Proc Nat’l Acad Sci USA 93(3):1156-1160を参照されたい。より最近では、種々の生物におけるゲノム改変にＺＦＮが使用された。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開番号ＷＯ０７／０１４２７５を参照されたい。

上記で言及したように、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメインに対して異種性であってもよい（例えばＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮＤＮＡ結合ドメインと切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメイン）。異種切断ドメインは、いかなるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼからも得ることができる。切断ドメインを得ることができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、限定はされないが、制限酵素およびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２年〜２００３年カタログ、ニュー・イングランド・バイオラボ社（マサチューセッツ州ベバリー）；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；大豆ヌクレアーゼ；膵臓デオキシリボヌクレアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linnet al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照）。これらの酵素（またはその機能性フラグメント）の１つまたは複数を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。

同様に、切断ハーフドメインは、上記のいかなるヌクレアーゼまたはその部分にも由来し得、切断活性に二量体化を必要とする。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断には２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２つの切断ハーフドメインが同一のエンドヌクレアーゼ（またはその機能性フラグメント）に由来していてもよいし、あるいは各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性フラグメント）に由来していてもよい。さらに、２つの融合タンパク質の標的部位は、その２つの融合タンパク質のそのそれぞれの標的部位への結合が、切断ハーフドメインを、切断ハーフドメインが（例えば二量体化により）機能的切断ドメインを形成するのを可能にする互いに対する空間定位に、配置するように、互いに対して配置されることが好ましい。従って、ある実施形態では、標的部位の近端は５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドで隔てられている。しかし、いかなる整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対も、２つの標的部位の間に介在することができる（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般的に、切断の部位は標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在しており、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合し、結合部位で、またはその近傍でＤＮＡを切断することが可能である。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、およびもう一方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；並びにLi et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Liet al. (1993) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887;Kim et al. (1994b) J. Biol.Chem. 269:31,978-31,982を参照されたい。従って、一実施形態では、融合タンパク質は、操作されていてもいなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および一つまたは複数のＺｎフィンガー結合ドメインを含む。

切断ドメインと結合ドメインが分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特殊な酵素は二量体であるときに活性がある。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575。従って、本開示の目的上、開示の融合タンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインであると考えられる。従って、Ｚｎフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた標的化された二本鎖切断および／または標的化された細胞配列置換のために、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を使用して、酵素として活性がある切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子も使用することができる。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体を形成（例えば二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持する、タンパク質のいかなる部分であってもよい。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、国際公開番号ＷＯ０７／０１４２７５（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有しており、これらは本開示によって企図されている。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res.31:418-420を参照されたい。

ある実施形態では、切断ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号および同第２００８０１３１９６２号（これら全ての開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ホモ二量体化を最小限にする、またはそれを阻止する、一つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。

強制的なヘテロ二量体を形成する、ＦｏｋＩの操作された切断ハーフドメインの例には、第一切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位および５３８位にアミノ酸残基変異を含み、第二切断ハーフドメインが４８６位および４９９位にアミノ酸残基変異を含む一対が含まれる。

従って、一実施形態では、４９０位の変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；５３８位の変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；４８６位の変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し；４９９位の変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、一方の切断ハーフドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを作製することによって、並びにもう一方の切断ハーフドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを作製することによって、作製された。本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限にされた、またはそれが取り除かれた、強制的なヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号（この開示はあらゆる目的でその全体が参照によって組み込まれる）を参照されたい。

ある実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）に変異を含み、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する変異を含む（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）に変異を含み、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する変異を含む（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）に変異を含み、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する変異を含む（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）。（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号参照）。

本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、あらゆる適切な方法を用いて、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００８０１３１９６２号に記載される野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって、作製することができる。

あるいは、いわゆる「開裂酵素（split-enzyme）」技術（例えば米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照）を用いて、ヌクレアーゼを核酸標的部位でインビボ構築することができる。そのような開裂酵素の構成要素は、別々の発現構築体上に発現され得、または、一方のオープンリーディングフレームに連結され得、そこで個々の構成要素は例えば自己切断型２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成要素は、個々のＺｎフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

ヌクレアーゼは、例えば、ＷＯ２００９／０４２１６３およびＷＯ２００９００６８１６４に記載の酵母染色体系で、使用前に活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼ発現構築体は、当該技術分野において既知の方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開ＷＯ０７／０１４２７５を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコース存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーター）の制御下にあり得る。

標的部位
上記で詳細に説明したように、ＤＮＡドメインは、ＣＦＴＲ遺伝子座またはＳＦＴＰＢ遺伝子座におけるあらゆる最適な配列に結合するように、操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、限定はされないが、合理的設計および各種の選択が含まれる。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々の（例えばＺｎフィンガーの）アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、そのデータベースでは、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列が、特定の三つ組または四つ組配列と結合するＤＮＡ結合領域の一つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＴＡＬ作動因子ドメインの合理的設計を行うこともできる。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド法を含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；並びにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に記載されている。

標的部位；ヌクレアーゼの選択、並びに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は当業者に既知であり、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号（その全体が参照によって組み込まれる）に詳細に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に記載されているように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、多指型（multi-fingered）Ｚｎフィンガータンパク質）は、あらゆる適切なリンカー配列（例えば、５以上のアミノ酸のリンカー）を用いて、連結することができる。６以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関しては、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、該タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に、あらゆる組み合わせの適切なリンカーを含み得る。米国仮特許公開（U.S.Provisional Patent Publication）第２０１１０２８７５１２号も参照されたい。

ドナー
上記で言及したように、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子の改変は、例えば、変異遺伝子の修復または野生型遺伝子の変異のための、外来性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる）の挿入を含み得る。ドナー配列が典型的には置換するゲノム配列と同一でないことは、容易に明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との相同性が十分に存在する限りは、ゲノム配列に対して、一つまたは複数の一塩基の変化、挿入、欠失、逆位または再配列を含有し得る。あるいは、ドナー配列は、２つの相同領域に挟まれた非相同配列を含有し得る。さらに、ドナー配列は、細胞性クロマチン内の目的領域と相同でない配列を含有するベクター分子を含み得る。ドナー分子は、いくつかの非連続的な、細胞性クロマチンに相同な領域を含有し得る。例えば、目的領域内に通常は存在しない配列を標的挿入するために、前記配列を、ドナー核酸分子内に含ませ、目的領域内の配列に相同な領域で挟ませていてもよい。

ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよく、細胞に直鎖形態で導入されても環状形態で導入されてもよい。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号および米国特許出願公開第２００９／０２６３９００号；同第２０１０００４７８０５号および同第２０１１０２０７２２１号（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。直鎖形態で導入する場合、当業者に既知の方法で、ドナー配列の末端を（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護してもよい。例えば、一つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖分子の３’末端に付加し、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一方または両方の末端に連結する。例えば、Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889を参照されたい。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、限定はされないが、末端アミノ基の付加および修飾されたヌクレオチド間結合の使用（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等）が挙げられる。

ポリヌクレオチドを、さらなる配列（例えば、複製開始点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子等）を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマー等の媒介物と複合体化した核酸として、導入することができ、あるいは、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。

通常、組込み部位における内在性プロモーター、すなわちＣＦＴＲ遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって発現が駆動されるように、ドナーは挿入される。しかしながら、ドナーがプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば構成的プロモーターまたは誘導性または組織特異的プロモーターを含んでいてもよいことは明らかであろう。

さらに、発現には必要ではないが、外来性配列は転写制御配列または翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列）であってもよい。

送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、並びに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含んで成る組成物は、いかなる適切な手段によっても、インビボまたはエキソビボで送達することができる。

本明細書に記載されるヌクレアーゼ送達法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号（これら全ての開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。

本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築体は、ＺｎフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質のうちの一つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することができる。いかなるベクター系をも使用することができ、例えば、限定はされないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）も参照されたい。さらに、これらのいずれのベクターも治療に必要な配列のうちの一つまたは複数を含み得ることは明らかである。従って、一つまたは複数のヌクレアーゼおよびドナー構築体が細胞に導入される場合、これらのヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一のベクター上に保有されていてもよいし、異なるベクター上に保有されていてもよい。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築体をコードする配列を含んでいてもよい。

従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、ヌクレアーゼおよびドナー構築体をコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞へ送達された後にエピソーム性ゲノムまたは組み込まれたゲノムを有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療法の総括については、Anderson Science256:808-813 (1992); Nabel&Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani &Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller,Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988);Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer&Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al.,Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995);およびYuet al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。

ウイルスを用いずに核酸を送達する方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸ＤＮＡ、人工ウイルス粒子、および薬剤によるＤＮＡ取り込み増強が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（リッチ・マー社（Rich-Mar））を用いるソノポレーション（sonoporation）も、核酸の送達に使用することができる。

さらなる例示的な核酸送達系には、アマクサバイオシステムズ社（AmaxaBiosystems）（ドイツ、ケルン）、マックスサイト社（Maxcyte, Inc.）（メリーランド州ロックヴィル）、ＢＴＸモレキュラー・デリバリー・システムズ社（BTXMolecular Delivery Systems）（マサチューセッツ州ホリストン）およびコペルニクス・セラピューティクス社（CopernicusTherapeutics Inc）によって供給されるものが含まれる（例えばＵＳ６００８３３６参照）。リポフェクションについては、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切な陽イオン性および中性脂質には、Felgner、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４に記載のものが含まれる。

免疫脂質複合体等の標的化されたリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer GeneTher. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remyet al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722(1995); Ahmad etal., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照）。

さらなる送達方法として、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）中への送達される核酸の封入の使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、一方の抗体腕が標的組織に対する特異性を有し、もう一方の腕がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織へ特異的に送達される。抗体はＥＤＶを標的細胞表面へと運び、その後ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞内に移入される。細胞内に入ると、中身が放出される（MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643参照）。

ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに基づく系を、操作されたＺＦＰをコードする核酸の送達に使用する際には、体内の特定の細胞に対してウイルスを標的化し、ウイルスの積荷（payload）を核へ輸送するための高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターを直接患者に投与してもよいし（インビボ）、あるいはウイルスベクターを使用して細胞をインビトロで処理し、改変された細胞を患者に投与してもよい（エキソビボ）。従来のウイルスに基づくＺＦＰ送達系としては、限定はされないが、遺伝子導入用の、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入法を用いることで可能となり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い導入効率が認められている。

外来性エンベロープタンパク質を組込み、標的細胞の潜在的標的集団を増殖させることによって、レトロウイルスの指向性を変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞への形質導入または感染が可能なレトロウイルスベクターであり、典型的に、高いウイルス価を生み出す。レトロウイルス性遺伝子導入系の選択は、標的組織によって異なる。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に対しパッケージング容量を有するシス作動性末端反復配列から成る。最少のシス作動性ＬＴＲであっても、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、それが治療的遺伝子を標的細胞に組み込むために使用されて、永続的な導入遺伝子発現をもたらす。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくレトロウイルスベクターが挙げられる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann etal., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990);Wilson et al., J. Virol.63:2374-2378(1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）。

一過性発現が好ましい適用においては、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率での導入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高い力価およいび高い発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成における、並びにインビボおよびエキソビボ遺伝子治療法のための、標的核酸による細胞の形質導入に使用される（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987)；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、いくつかの刊行物、例えば米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinet al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell.Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984);およびSamulskiet al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)に記載されている。

現在、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが臨床試験における遺伝子導入に利用可能であり、形質導入媒介物を生成するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を含むアプローチが利用される。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102(1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験に使用された最初の治療的ベクターであった（Blaeseetal., Science 270:475-480 (1995)）。ＭＦＧ−Ｓパッケージベクター（MFG-S packaged vector）に関しては、５０％以上の導入効率が認められている（Ellem et al., ImmunolImmunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥および非病原性のパルボウイルスアデノ随伴ＩＩ型ウイルスに基づく別の有望な遺伝子送達系である。全てのベクターは導入遺伝子発現カセットと隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆位末端配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みによる効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達が、このベクター系の重要な特徴である（Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., GeneTher. 9:748-55 (1996)）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。さらに、ＡＡＶベクターＩＴＲおよびＡＡＶカプシドタンパク質が、異なるＡＡＶ血清型、またはカプシドタンパク質が２つ以上のＡＡＶ血清型から作出されるキメラＡＡＶ粒子由来である、偽型ＡＡＶベクターを使用することができる。

複製欠損性組換え型アデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で作製することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し；その後、複製欠損性ベクターがトランスに欠失した遺伝子機能を補うヒト２９３細胞内で増殖するように、操作される。Ａｄベクターは複数種類の組織、例えば、肝臓、腎臓および筋肉に存在するような非分裂性分化細胞に、インビボで形質導入を生じさせることができる。従来のＡｄベクターは運搬能が大きい。臨床試験におけるＡｄベクターの使用例には、抗腫瘍性免疫化のための筋肉内注射によるポリヌクレオチド処置が含まれる（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneckeret al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:71083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez etal., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513(1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が含まれる。

宿主細胞に感染可能なウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって作出される。前記ベクターは、典型的に、パッケージングおよび後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列を含有し（妥当な場合）、他のウイルス配列は発現されるタンパク質をコードする発現カセットに置換されている。失われたウイルス機能はパッケージング細胞株によってトランスに与えられる。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要とされる、ＡＡＶゲノム由来の逆位末端配列（ＩＴＲ）配列を有するのみである。その他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列は欠如しているヘルパープラスミドを含有するウイルスＤＮＡは、細胞株内でパッケージングされる。細胞株はヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからの、ＡＡＶベクターの複製およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如により、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの混入は減らすことができる（例えば、ＡＡＶよりも、アデノウイルスの方がより感受性がある加熱処理）。

多くの遺伝子治療への適用において、遺伝子治療ベクターは特定の組織型に高度の特異性でもって送達されることが望ましい。従って、リガンドをウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として、ウイルスの外表面上に発現することにより所与の細胞型に対する特異性を有するように、ウイルスベクターは改変され得る。目的の細胞型の表面に存在することが知られている受容体に対し親和性を有するリガンドが選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)では、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変できること、およびその組換えウイルスがヒト上皮増殖因子受容体を発現するあるヒト乳がん細胞に感染することが報告された。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスがその細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいかなる選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をも提示するように、操作することができる。上記は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む、特殊な取り込み配列を含有するように、操作することができる。

個々の患者に投与することによって、典型的には、下記のような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下、または頭蓋内の点滴）または局所投与によって、遺伝子治療ベクターをインビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能給血者の造血幹細胞等の細胞にエキソビボで送達し、その後、通常は組み込まれたベクターを有する細胞の選択の後に、その細胞を患者に再移植することができる。

インビボでの細胞の形質導入のために、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築体を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞に最大限接触するように導入するために通常用いられる経路のいずれかによるものであり、例えば、限定はされないが、注射、点滴、局所投与およびエレクトロポレーションが挙げられる。そのような核酸を投与する適切な方法は、利用可能であり、当業者に周知である。特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の一経路が、別の経路よりも、より即時的で且つより効率的な応答をしばしば提供し得る。特に、肺組織への送達では、気管支動脈を用いてベクターの導入を行うことができる。取り込みを増加させるために、気管支送達を、流れ停止法と併せて、または内皮バリアー撹乱物質（例えばＶＥＧＦまたはヒスタミン）の使用と併せて、起こすことができる。

本明細書に記載のポリヌクレオチドの導入に適切なベクターには、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388;Dull et al. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J.Virol.72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222；米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

薬剤的に許容できる担体は、部分的には、投与されている特定の組成物によって、並びに組成物を投与するのに用いられている特定の方法によって、決定される。従って、下記のような、利用できる適切な医薬組成物製剤は種々様々である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989参照）。

ヌクレアーゼをコードする配列およびドナー構築体が、同じまたは異なる系を用いて送達できることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドはプラスミドによって運搬され得、一方、一つまたは複数のヌクレアーゼはＡＡＶベクターによって運搬され得る。さらに、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射によって、これらの異なるベクターを投与することができる。同時にまたはいかなる順序でも、これらのベクターを投与することができる。

エキソビボ投与およびインビボ投与両用の製剤には、液状懸濁剤または乳化液剤が含まれる。活性成分はしばしば、薬剤的に許容可能で且つ活性成分と混合可能な賦形剤と、混合される。適切な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびこれらの組み合わせが挙げられる。さらに、本組成物は、少量の補助剤、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または本医薬組成物の有効性を増強する他の試薬を含有していてもよい。

適用
本発明は、ＣＦ疾患および／またはＳＢ−Ｐ欠損症等の肺障害における変異を導入または修復するために使用することができる方法および組成物を記載している。具体的には、ＣＦの発症において病原性であることが示されているＣＦＴＲ遺伝子における特定の変異には、ΔＦ５０８およびΔＩ５０７が含まれる。ＳＦＴＰＢにおける変異は、ＳＢ−Ｐ欠損症を引き起こす最も一般的な変異であり、１２１ｉｎｓ２（１２１Ｃ＞ＧＡＡ）が含まれる。従って、本発明の方法および組成物は、患者由来幹細胞の修復によって、またはヌクレアーゼおよびドナー分子のインビボ投与によって、ＣＦＴＲおよび／またはＳＢ−Ｐにおける変異を修復するのに有用である。また、ＣＦＴＲおよびＳＦＴＰＢ変異に関連した細胞内の異常を研究するための、並びにその生物全体におけるこれらの変異の結果を研究するための、細胞および遺伝子導入動物モデルを開発する方法も有用であり、本明細書に記載される。従って、特定のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異（例えばＣＦＴＲにおけるΔＦ５０８変異）をノックアウト、ノックインおよび／または修復するよう設計された手段を使用して、根底にある生物学の理解を促進することに、および特異的な薬物療法の開発に有用な細胞モデルおよび動物モデルを作製することができる。さらに、特定のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異に標的化された特異的ヌクレアーゼを使用して、その変異をノックアウトまたは修復することができる。ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異に特異的な治療薬の研究のための細胞株を開発するために、ヌクレアーゼを使用して、ＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異に特異的な標識の挿入を引き起こすこともできる。

さらに、本明細書に記載の細胞、細胞株および遺伝子導入動物は薬剤開発に有用である。そのような細胞および動物は、特定の変異（例えばＣＦＴＲΔＦ５０８）またはその修復に関連する表現型を明らかにすることができ、問題の変異と特異的に相互作用する、または罹患動物における疾患の治療に有用である薬剤をスクリーニングために使用することができる。治療上、ｉＰＳＣは、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損症に関連する既知の遺伝子変異を持つ患者からエキソビボで得ることができ、その変異は、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを介した遺伝子修復を用いて修復することができる。同様に、肺、皮膚または他の幹細胞を患者から単離し、その後、本発明の方法および組成物を用いてＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ遺伝子座を修復することができる。その後、修復された幹細胞を使用して、患者を治療することができる。さらに、目的のＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢ変異を含有する患者試料から細胞株を作製することができる。これらの細胞株により、患者特異的ｉＰＳ細胞株における特定の変異の影響を研究するための手段が提供され得る。例えば、一方の株では目的の変異が修復されているが、その対応する株では修復されていない、比較細胞株（parallel cell line）を作製することができる。これにより、疾患の原因となる変異によってのみ異なる細胞株が作製される。得られた、内在性遺伝子座にＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢの異なる対立形質を有する同質遺伝子的なｉＰＳＣパネルは、疾患特異的変異の修復、薬物スクリーニングおよび創薬、並びに疾患メカニズムの研究のための遺伝的手段を提供する。

修復された変異および導入された変異の両方を有する患者特異的ｉＰＳ細胞株の有効性並びにそれらの同質遺伝子的な対照も、多種多様な医学的応用において有用であり、例えば、限定はされないが、これらの変異が疾患を引き起こすメカニズムの研究、および「実験室的な治療」の、これらの変異により引き起こされる疾患を実際に発症した患者の治療への転化、が含まれる。さらに、これらの細胞株は、高度に特異的な挙動を示す化合物を同定するための、治療化合物候補のスクリーニングに有用であり得る。

肺幹／前駆細胞の細胞移植は、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損症等の種々の遺伝性単一遺伝子肺疾患に対する有望な治療方法の一例である。修復されたＣＦまたはＳＢ−ＰｉＰＳ細胞は、自己肺細胞の移植のための、または失活した肺の足場をエキソビボで播種して自己の肺を作り出すための（例えば、Ottet al. (2010) Nat Med 16:927-933参照）、種々の肺幹／前駆細胞にインビトロで分化可能な患者特異的細胞の有望な供給源である（例えば、Chenet al. (2009) Proc Am Thorac Soc 6:602-606; Kajstura et al. (2011) N Engl J Med364:1795-1806参照 。さらに、損傷した肺を有するマウスにインビボで与えられた場合に、細気管支、肺胞（aveoli）、および肺血管を形成することができるヒト肺幹細胞を同定したという報告がある（Kajsturaet al、同節参照）。従って、一つの可能性として、肺または他の型の幹細胞が、患者から単離され、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮによってエキソビボで改変され、その後前記患者に再導入されることにより、疾患を治療することが可能であり得る。従って、本明細書に記載の方法および組成物を使用することで、ＣＦまたはＳＢ−Ｐ欠損性疾患の原因となる変異に関して修復された（遺伝子型および表現型の両方において）、移植に用いる細胞（およびそれらの子孫）を作製することができる。これらの移植細胞は受容者において免疫応答を誘発しないであろう。罹患患者由来の皮膚または血液細胞を使用することで、自己由来の誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は得られる。次に、部位特異的相同組換え修復を利用することで、疾患の原因となる変異は内在性の染色体ＤＮＡ配列において修復されるであろう。最後に、定方向分化アプローチを使用することで、移植を目的とした修復されたｉＰＳ細胞から、関連する肺幹／前駆細胞の高度に純化された集団が得られるだろう。

以下の実施例は、ヌクレアーゼがＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む、本開示の例示的な実施形態に関する。例示のみが目的であり、他のヌクレアーゼ、例えば操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または天然のもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）の融合物を使用することができることは理解されよう。

実施例１：材料と方法
Ａ． 嚢胞性線維症初代線維芽細胞
ΔＦ５０８変異に関してホモ接合性と報告された患者（１７歳男性）由来のＣＦ初代線維芽細胞株ＧＭ０４３２０を入手した（コリエルレポジトリー（Coriell Repository）、ニュージャージー州キャムデン）。この患者に関する臨床症状は、進行性肺疾患および膵不全と報告されたが；加えて、不完全なｃＡＭＰ誘導塩素イオンチャネル活性もこの患者に由来する線維芽細胞で示された。Lin& Gruenstein (1987) J Biol Chem 262:15345-15347も参照されたい。

ＧＭ０４３２０線維芽細胞から単離されたゲノムＤＮＡ内のＣＦＴＲ対立遺伝子の配列決定によって、患者が、実際には、一方はΔＦ５０８で他方はΔＩ５０７である対立遺伝子の複合ヘテロ接合体であったことが示された。ΔＦ５０８／ΔＩ５０７複合型ヘテロ接合性は、以前からＣＦ患者において報告されている。例えば、Kerem et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:8447-8451を参照されたい。

Ｂ． ＣＦ ｉＰＳ細胞の作製および特徴付け
Lowry etal. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:2883-2888に記載される、ヒト再プログラム因子（ＯＣＴ４［１７９６４］、ＳＯＸ２［１７９６５］、ＫＬＦ４［１７９６７］、Ｃ−ＭＹＣ［１７９６６］、ＮＡＮＯＧ［１８１１５］）をコードするｐＭＸｓレトロウイルスベクターを、ＣＦ初代線維芽細胞に導入した。非組込み法または組込みを含まない方法（例えばＲＮＡ、エピソームベクター、切除可能な再プログラム導入遺伝子、および／または小分子）を、再プログラム因子の導入に使用することもできる。例えば、Somerset al. (2010) Stem Cells 28:1728-1740; Warren et al. (2010) Cell StemCell7:618-630; Yu et al. (2009) Science 324:797-801; Li et al. (2009) Cell StemCell 4:16-19を参照されたい。Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞（セルバイオラボ社（Cell Biolabs））にベクターＤＮＡおよびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ［８４５４］）を形質移入し、超遠心で１００倍に濃縮することにより、ＶＳＶ−Ｇエンベロープウイルスのストックを調製した。並行してｐＭＸｓ−ＧＦＰベクターストックの製造を行い；初代ヒト線維芽細胞に感染させることでｐＭＸｓ−ＧＦＰウイルスの力価測定を行い、続いてＧＦＰ−発現細胞のＦＡＣＳ解析を行った。

０日目に６ウェルプレートに１０^５細胞／ウェルを播種されたＣＦ線維芽細胞を、１日目および２日目に、スピンフェクション（spinfection）（２００×ｇ、３０分間）によって、２１．５の感染効率で、１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で、形質導入した。４日目に、線維芽細胞を被照射マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ；ＣＦ−１マウス株、チャールズリバー（CharlesRiver））上に移し、１日後、培地を４０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有するヒト胚性幹（ＥＳ）細胞培地に交換し（インターネットで入手できる米国立幹細胞バンク（NationalStem Cell Bank）のプロトコルＳＯＰ−ＣＣ−００１Ｃに従って）、毎日再供給した。１２日目から、被照射ＭＥＦ上で事前に順化されたヒトＥＳ細胞培地を、細胞に毎日再供給した。形質導入後１６日目から、形態学的基準に基づくｉＰＳ様コロニーが確認され始めた。次に、Ａｌｅｘａ４８８結合抗Ｔｒａ−１−６０モノクローナル抗体（ステムジェント社（Stemgent））または抗Ｔｒａ−１−８１モノクローナル抗体（ミリポア社）のいずれか、続いてＡｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウスＩｇＭ（インビトロジェン社）を用いた生細胞染色を使用して、その後の増殖および特徴付けのための再プログラムされたコロニーを同定した。最初に選んだ３２個のコロニーのうち（それらは全てＴｒａ−１−６０陽性および／またはＴｒａ−１−８１陽性に染色された）、９個のコロニーを引き続き増殖させ、凍結保存し、２つのｉＰＳクローン（クローン１７および２８）をより詳細な特徴付けのために選択した。

ＮＳＣＢプロトコルＳＯＰ−ＣＨ−１０２Ｃに従ってＣＦｉＰＳ細胞をＯｃｔ４およびＳＳＥＡ−４の発現について染色し、蛍光顕微鏡法または蛍光標識細胞解析（ＬＳＲ−ＩＩ、ベクトン・ディッキンソン社）のいずれかにより解析した。抗ＣＤ２９（ＦＩＴＣ結合；ソース社（Source））を用いた共染色を使用して、汚染したＭＥＦを除外した。非特異的アルカリホスファターゼ活性も評価した（ベクターラボ社（VectorLab））。ＣＦ ｉＰＳクローン１７（継代数５および１７）および２８（継代数５および１３）の核型分析をテキサス小児病院の臨床および研究細胞遺伝学研究所（TexasChildren’s Hospital Clinical and Research Cytogenetic Laboratory）で行った。ゲノムＤＮＡをＣＦｉＰＳクローン１７および２８から単離し；エクソン１０を含有する配列をＰＣＲで増幅し、配列決定した。

Ｃ． 奇形腫アッセイ
ＣＦ ｉＰＳ細胞（クローン１７）を四週齢のＦｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤベージュマウス（チャールズリバー）の後肢背側に筋肉内注射し、腫瘍増殖の様子を毎週モニターした。注射後７週間目に、腫瘍を摘出し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンによる組織学的検討用に調製し、ベイラー医科大学の比較医学センターでの解析を行った。

Ｄ． ＺＦＮを介した標的化
ＣＦＴＲに対し標的化されたＺｎフィンガーヌクレアーゼを、基本的には米国特許第６，５３４，２６１号に記載の通りに設計した。表１は、例示的なＣＦＴＲ標的ＺＦＰの認識へリックスＤＮＡ結合ドメインを示している。設計されたＤＮＡ結合ドメインは、特定の標的配列（表２参照）を認識する４〜６個のＺｎフィンガーを含有する。ＺＦＰ認識へリックスと接触する標的部位のヌクレオチドは大文字で表され；接触しないヌクレオチドは小文字で表される。

所望のＤＮＡ結合モチーフをＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合することにより、ＺＦＮ対１２８９７／９９４０を構築した。ＺＦＮを、ＤＮＡ発現プラスミドまたはインビトロ生成ＲＮＡ（エピセンター社（Epicentre）およびアンビオン社（Ambion））のいずれかの形態で、細胞に送達した。野生型エクソン１０配列（それぞれエクソン１０の上流および下流にあるおよそ８６０ｂｐおよび２９０ｂｐの相同配列）を含有する１．６ｋｂドナーを、ＢＡＣクローンＲＰ１１−１１５２Ａ２３から得られたゲノムＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅により、最初に構築した。導入されたＺＦＮが相同組換え修復の前または後にドナーを切断する能力を妨げるために、右側の（right）ＺＦＮ結合部位に２つのサイレント一塩基対置換を導入し；新規のＣｌａＩ制限酵素部位を作出するために、１つの追加のサイレント一塩基対置換を野生型エクソン１０ドナー配列に導入した。エクソン１０の１２５ｂｐ下流にあるイントロン１０ドナー配列に３つの追加の一塩基対変化を導入して、ユニークなＡｖｒＩＩ制限酵素部位を作出した。野生型ドナーにおける変化は全て、Quikchange(登録商標)LightningSite-Directed Mutagenesis（アジレント社）で導入した。ｌｏｘＰ認識配列およびＡｖｒＩＩ部位を含むプライマーを用いる、プラスミドｐＰｔｈＣ−Ｏｃｔ３／４由来ｐｇｋ−ｐｕｒｏＴＫ−ｂｐＡ配列のＰＣＲ増幅（例えば、Masuiet al. (2007) Nat Cell Biol9:625-635参照）によって、ＣＦＴＲドナー内の導入ＡｖｒＩＩ部位にクローニングするための物質を生成した。

ＤＮＡ発現プラスミド（１または２μｇ）またはインビトロで転写されたＲＮＡ（１．５または３μｇ）の形態のＺＦＮを、ドナーＤＮＡ（４または８μｇ）と共に、ＣＦｉＰＳ細胞（２×１０^６個の細胞、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理で得た細胞；クローン１７）に、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（ＡｍａｘａプログラムＡ２３）を介して送達し、細胞を、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤（アレクシス・バイオケミカルズ社（Alexis Biochemicals）、Ｙ２７６３２）存在下で、ピューロマイシン抵抗性被照射ＭＥＦ上に播種した。ピューロマイシン選択（０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクションの４日後に開始し、２〜５日後にピューロマイシン抵抗性のコロニーを採取し、ピューロマイシン存在下で増殖させて、クローン細胞株を確立した。

Ｅ． 標的ｉＰＳクローンの分子解析
継代数２の時点で、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）またはＡｒｃｈｉｖｅＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（５プライム社（５ Ｐｒｉｍｅ））により、ピューロマイシン抵抗性クローンからゲノムＤＮＡを単離した。製造業者のプロトコルに従って、種々のプライマーを使用するＰＣＲ増幅を行った。ＡＢＩ３７３０ＸＬ配列決定装置上で配列決定を行った。

Ｆ． サザンブロット法
サザンブロットしたゲノムＤＮＡをプローブするための放射線標識ＤＮＡを作製するために、ドナープラスミドをＮｄｅＩ＋ＳｐｅＩで消化し、０．８％アガロースゲルで分離し、その後２．３ｋｂ断片を切り出し、ゲル精製（キアゲン社）した。製造業者の取扱説明書に従ってＰｒｉｍｅ−Ｉｔ（登録商標）ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（アジレント・テクノロジーズ社）を用いて、２．３ｋｂ断片を［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。２５μｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＳｐｅＩで一晩消化し、フェノール／クロロホルム抽出で精製した。次にｇＤＮＡを１％アガロースゲルで分離し、Ｎｙｔｒａｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒ Ｃｈａｒｇｅメンブレン（シュライヒャー＆シュール社（Schleicher and Schuell）に転写し、^３２Ｐ標識プローブでハイブリダイズした。システム（モレキュラー・ダイナミクス社（MolecularDynamics）を用いてメンブレンを露光し画像をスキャンした。

Ｇ． 選択マーカーのＣｒｅ介在性切除
Ｃｒｅ発現プラスミド（ｐＢＳ５１３ ＥＦ１α−ｃｒｅおよびｐＣＡＧ−Ｃｒｅ（例えば、Le et al. (1999) Anal Biochem270:334-336; Matsuda & Cepko (2007)ProcNatl Acad Sci U S A 104:1027-1032を参照）を、Ａｍａｘａ（商標）ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによりＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理細胞に送達し、被照射ＭＥＦ上に播種した。各コロニーを採取して増殖させ、次に２連で播種して、ピューロマイシン感受性になっていたそれらのクローンを同定した。あるいは、いくつかのクローンをＦＩＡＵ（１μＭ、モラベック・バイオケミカルズ社（MoravekBiochemicals））に対するそれらの抵抗性に基づいて最初に同定し、増殖させ、次に２連で播種して、ピューロマイシン感受性クローンを同定した。

Ｈ． ｍＲＮＡ解析
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社）を用いてｉＰＳおよびｉＰＳ由来細胞からＲＮＡを単離し、Ｉｍｐｒｏｍ−ＩＩ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｏｌｉｇｏｄＴキット（プロメガ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行い、Ｇｏｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼ（プロメガ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。

Ｉ． インビトロ分化
基本的にはD'Amouret al. (2005) Nat Biotechnol 23:1534-1541に記載の通りに、ｉＰＳ細胞の胚体内胚葉（definitiveendoderm）への短期分化を行った。簡潔に説明すると、ＭＥＦ上に播種されたｉＰＳ細胞を、低濃度のウシ胎児血清（０日目は０＆、１日目は０．２％、２〜５日目は２％）存在下で、アクチビンＡ（１００μｇ／ｍｌ）に曝した。培養物を示された日にＲＮＡ用に採取し、遺伝子発現についてＲＴ−ＰＣＲで解析した。長期分化については、VanHaute et al. (2009) Respir Res 10:105により報告された気相液相界面プロトコルを適合して、ヒトＥＳ細胞から肺上皮組織を作出した。簡潔に説明すると、コラゲナーゼ消化により回収したｉＰＳ細胞を、被照射ＭＥＦとの同時播種に先立ち、１２ウェルプレートのウェル中の８．０μｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ ｉｎｓｅｒｔ（Ｐ１８Ｐ０１２５０、ミリポア社）上に細胞塊として播種した。最初の８日間（０〜４日目：ヒトＥＳ培地；５〜８日目：分化培地［ＤＭ］：βメルカプトエタノールおよび塩基性線維芽細胞増殖因子を含有しないヒトＥＳ培地）は、メンブレンに播種された細胞を完全に覆うのに十分なレベルに培地を維持し；８〜２８日目は、培地（ＤＭ）の体積を減少させて、所望の気相液相界面を得た。培養物を示された日にＲＮＡ用に回収し、遺伝子発現についてＲＴ−ＰＣＲで解析した。

Ｊ． ＣＦＴＲ変異に対し標的化されたヌクレアーゼの試験
Δ５０８変異部位に近接するよう設計された表１に示されるＺＦＮ対には、Δ５０８の部位からおよそ１１５ｎｔ離れて結合するＺＦＮ対１２８９７／９９４０、並びに標的部位がそれぞれ１８および４８ヌクレオチド離れている対３２３６５／３２３６６および３２３７５／３２３７６が含まれる。図６を参照されたい。さらに、Δ５０８対立遺伝子を特異的に標的とし、野生型対立遺伝子は標的としないように、対３２４０１／３２３９８を設計した（図６参照）。

表示されるこれらの対を、Ｋ５６２細胞におけるヌクレアーゼ活性について試験したところ、３２３６５／３２３６６対は測定値９％のインデル形成を引き起こし、３２３７５／３２３７６は１２％のインデルを引き起こすことが判明した。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＤＬＳＳＡレポーター系を使用する際の、３２４０１／３２３９８対を試験した（共同所有の米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号参照）。このアッセイにおいて、３２４０１／３２３９８対はホタル発光／ウミシイタケ発光の比率が１．４５（ｐＶＡＸベクター対照の０．１６と比較）であったが、このことは全ての対が活性であったことを示している。

実施例２： ＣＦ ｉＰＳ細胞の誘導および特徴付け
ΔＦ５０８ＣＦＴＲ変異に関してホモ接合性と報告された患者から、ＣＦ初代線維芽細胞（ＧＭ０４３２０；コリエルレポジトリー）を入手した。エクソン１０の直接配列決定により、これらの細胞が実際には、ＣＦＴＲ遺伝子座において、一方の対立遺伝子はΔＦ５０８で、もう一方の対立遺伝子はΔＩ５０７である複合型ヘテロ接合性であることが明らかにされた。

再プログラム因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ）をコードするＶＳＶ−Ｇ偽型ｐＭＸｓレトロウイルスベクターを使用して、ＣＦ皮膚線維芽細胞に形質導入し、それらをマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に移し、実施例１に記載の通りにヒトＥＳ細胞培地において再プログラム化された細胞を選択した。形質導入後１６日目に、形態学的基準に基づいてｉＰＳ様コロニーが最初に同定された。次に、抗Ｔｒａ−１−６０抗体および／または抗Ｔｒａ−１−８１抗体を用いた生細胞染色を使用して、再プログラム化されたコロニーを上手く同定し、続いて増殖および特徴付けを行った。９個の再プログラム化されたコロニーを同定し、それをさらに増殖させ、凍結保存した。

２つのクローン（番号１７および２８）をさらなる試験のために選択した。これらのクローンはｈＥＳ細胞と一致する形態および増殖特性を示した。所望のｉＰＳ細胞におけるΔＩ５０７／ΔＦ５０８複合型ヘテロ接合性を確認した。また、これら２つのクローンが未分化ｈＥＳ細胞に特有な細胞性抗原を発現することを、免疫染色により確認した。ＦＡＣＳ解析により、少なくとも３３継代間で、９０％のｉＰＳ細胞によるＯｃｔ４およびＳＳＥＡ４抗原の共発現が示された。奇形腫アッセイによりＣＦｉＰＳ細胞の多能性が示され；中胚葉、外胚葉、および内胚葉に特有の細胞型がレシピエントマウスに存在した。また、これらのＣＦ ｉＰＳ細胞が正常な核型を有していることを確認した。

実施例３： ＺＦＮ介在性ＨＤＲによるＣＦＴＲ変異の修復
ＣＦＴＲエクソン１０変異の全体的な修復戦略は図１に要約されており、ＣＦＴＲ特異的ＺＦＮを、適切なＣＦＴＲドナーＤＮＡと共に送達することを含み；ｌｏｘＰ隣接ｐｕｒｏＴＫ選択カセットは、ピューロマイシンによる初期クローンの選択、およびそれに続くＦＩＡＵによるＣｒｅ切除後クローンの選択を可能にする。ＣＦＴＲエクソン１０を標的とするＺＦＮを設計して、ＨＤＲによるΔＩ５０７またはΔＦ５０８の修復を促進させた（図１参照）。ＣＦＴＲエクソン１０特異的ＺＦＮ（ＣＦＴＲ ＺＦＮ）は、エクソン１０の開始点付近のＤＮＡ配列、ΔＩ５０７またはΔＦ５０８三塩基対欠失のおよそ１１０ｂｐ上流を認識する。

ＣＦＴＲ ＤＮＡドナー修復テンプレートは、合計がおよそ１．６ｋｂの隣接相同配列を含み；該ドナーにコードされるエクソン１０配列は３つのサイレント塩基対置換を含むように改変されている。２つは、修復されたＣＦＴＲ遺伝子座のＺＦＮによる再切断を防止するために、ＺＦＮ−Ｒ標的配列内に存在し；並びに、１つのサイレント変異が、遺伝子編集された細胞をＰＣＲにより迅速に同定するための、新規のＣｌａＩ制限酵素部位を作出するために、修復された３つの塩基対野生型配列の２２ｂｐ下流に存在する。さらに、ｌｏｘＰ隣接ｐｇｋ−ｐｕｒｏＴＫ選択カセットを、エクソン１０の末端の１２５ｂｐ下流のドナーのイントロン１０に、アンチセンス方向に挿入した。従って、所望のＣＦＴＲ遺伝子編集事象は、ΔＩ５０７またはΔＦ５０８対立遺伝子におけるエクソン１０内の３つの塩基対欠失の修復、およびイントロン１０への選択カセットの標的化された挿入の両方を含む。

ＣＦＴＲ ＺＦＮを、実施例１に記載の通りに、ＤＮＡ発現プラスミドまたはインビトロで転写されたＲＮＡの形態で、ＣＦＴＲドナーをコードするプラスミドと共に、ＣＦｉＰＳ細胞に共送達した。まずピューロマイシン抵抗性コロニーをＰＣＲでスクリーニングし、次に配列決定して、ＣＦＴＲエクソン１０がＨＤＲにより修復されたことを確認した（図２）。最初のＰＣＲスクリーニングでは、一方のプライマーがイントロン９の上流の配列（ドナー中に存在しない）にアニーリングし、もう一方のプライマーがｌｏｘＰ隣接選択マーカー内にアニーリングすることで、内在性ＣＦＴＲ遺伝子座のイントロン１０へのピューロマイシン選択マーカーの標的挿入がアッセイされた（図２）。

この初期スクリーニングにより、ピューロマイシン抵抗性コロニーの３３％（分析されたクローンの６４種中２１種）において、ＣＦＴＲ対立遺伝子の一方で、起こり得る標的挿入事象が確認された。野生型エクソン１０ドナー配列の組込みと合わせて、この単位複製配列をＣｌａＩで完全に消化した。単位複製配列を直接配列決定でさらに解析して、編集された対立遺伝子が、ΔＩ５０７またはΔＦ５０８変異遺伝子型の代わりに、ドナー由来の修復配列をコードしていたことを確認した。さらに、右巻きの（right-hand）ＺＦＮに対する認識部位の位置でドナーに導入されたサイレント塩基対置換も、修復された対立遺伝子内に存在していた。

ドナーにコードされた相同領域の外側にある配列にアニーリングするプライマーを利用して、２１種のクローンにそれぞれ由来する未改変ＣＦＴＲ対立遺伝子のみを選択的にＰＣＲ増幅した。未改変対立遺伝子の配列決定により、全てのクローンにおいて、ΔＩ５０７変異対立遺伝子（２１中３種のクローンに存在）またはΔＦ５０８変異対立遺伝子（２１中１８種のクローンに存在）のいずれかを含有する純粋配列がもたらされ；この結果は、クローンあたり１つのＣＦＴＲ対立遺伝子のみに生じた選択マーカーの標的挿入と一致する。

独立して行われた２つの遺伝子編集実験の結果を表３に示す。表３において、「ＴＩ」は標的組込みを指す。

一方のプライマーがｌｏｘＰ隣接選択マーカーにアニーリングし、もう一方のプライマーがドナー配列の外側のイントロン１０内の下流の部位にアニーリングするＰＣＲ増幅によって、１／１’基準を満たす２１種のクローンをさらに解析した。

図２に示すように、この解析によって、２１中７種の先に同定されたクローンにおいて、選択マーカーの標的挿入が確認された。

表３に示されるように、ＨＤＲ駆動型のゲノム編集は、ΔＦ５０８対立遺伝子よりも、ΔＩ５０７ＣＦＴＲ対立遺伝子でより頻繁に生じていた。従って、各変異対立遺伝子（ΔＩ５０７またはΔＦ５０８）の、ドナーに対応する、１．６ｋｂ内在性ＣＦＴＲ配列を完全配列決定して、いずれかの変異対立遺伝子に対するドナー配列の類似度が増加したか否かを調べた（恐らくは、もう一方の対立遺伝子よりも、一方の対立遺伝子対におけるＨＤＲを好む。配列解析）。この配列解析により、ＺＦＮ切断部位の７６ｂｐ上流のイントロン９における一塩基対置換（Ａ＞Ｇ）（Ａ＞Ｇ置換が、エクソン１０の開始部位に対し、イントロン９における−６１位で生じる：すなわち、−６１Ａ＞Ｇ 、が、ΔＦ５０８変異対立遺伝子には存在するが、ΔＩ５０７変異対立遺伝子およびドナーのどちらにも存在しないことが明らかにされた。この一塩基対の差異は、ＣＦｉＰＳ細胞のΔＦ５０８対立遺伝子において選択的に生じるため、ΔＦ５０８対立遺伝子およびドナー鋳型の相同性対合およびストランド侵入の効率において、有意な減少を引き起こし得る。従って、このＡ＞Ｇ変異のドナー配列への導入によって、ΔＦ５０８対立遺伝子の標的化修復に有利になることが予想される。

実施例４： 遺伝子編集されたｉＰＳ細胞およびｉＰＳ由来細胞における修復されたＣＦＴＲ遺伝子の発現
また、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列解析によって、ＺＦＮにより修復された細胞におけるＣＦＴＲの発現を決定した。実施例１を参照されたい。

図３Ａに示すように、および他のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞株の量的発現解析と一致して（例えば、Bock et al. (2011) Cell 144:439-452参照 、元の、未修復のΔＩ５０７／ΔＦ５０８クローン１７ ｉＰＳ細胞におけるＣＦＴＲ発現をＲＴ−ＰＣＲによって検出した。配列決定により、ΔＩ５０７およびΔＦ５０８対立遺伝子の両方からの、ほぼ等レベルのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ発現が明らかにされた（図３Ｂ）。対照として、Ａ５４９肺上皮細胞株の解析により、野生型ＣＦＴＲ発現が確認された（図３Ａおよび３Ｂ）。図３Ａに示すように、７種中４種の標的化ｉＰＳ株（クローン１７−１、１７−９、１７−１４、１７−１６）についてのＲＴ−ＰＣＲ分析により、ΔＩ５０７／ΔＦ５０８クローン１７ ｉＰＳおよびＡ５４９細胞株において見られたバンドと同じサイズの単一バンドが生じた。７種中３種のクローン（クローン１７−１３、１７−１７、１７−２０）は、より大きなサイズの第二のＲＴ−ＰＣＲバンドも示したため、解析を検討しなかった。

配列決定により、予想されたｃＤＮＡ構成（エクソン９‐エクソン１０‐エクソン１１）を確認し、非標的化変異対立遺伝子（ΔＦ５０８）および修復された対立遺伝子の両方から生じたＣＦＴＲ発現を明らかにした。図３Ｂも参照されたい。特に、修復された対立遺伝子の発現が未改変変異対立遺伝子のおよそ２５〜３５％であったことが、一貫して観察された。これら４種の各クローンについて、標的化された対立遺伝子（全ての場合でΔＩ５０７）および未改変対立遺伝子（ΔＦ５０８）の両方におけるＣＦＴＲゲノムＤＮＡエクソン１０配列を決定し、ｐｇｋ−ｐｕｒｏＴＫプローブを利用してサザンブロット解析を行い、修復されたＣＦＴＲ対立遺伝子における正しいゲノム構築を確認し、編集が成功したｉＰＳクローンのいずれかが、ドナー配列の非特異的な組込みも示しているかどうかを確認した。

この解析により、これら４種のクローン（１７−１、１７−９、１７−１４、１７−１６）が、いかなる追加のドナー配列組込みも無く、編集に成功したこと；ＲＴ−ＰＣＲ（上記参照）に基づき先に除外したクローンのうちの２種（１７−１７および１７−２０）が追加のｐｇｋ−ｐｕｒｏＴＫ組込みを示したことが明らかにされた。正しく編集されたクローン（１７−９、１７−１６）のうち２種に対して核型解析を行ったところ、両方のクローンが通常の核型を示すことが明らかにされた。

配列決定によって、４種全ての細胞株が、参照ゲノムと比較して、同レベルの推定上の新規の一塩基変異（single nucleotide variation：ＳＮＶ）を有し、変異型ＣＦ線維芽細胞には１，１５５個のＳＮＶ、変異型ｉＰＳ細胞（クローン１７）には１，１２７個のＳＮＶ、修復された１７−９−Ｃ１には１，１８０個のＳＮＶ、および１７−１４−Ｃ１細胞には１，１２１個のＳＮＶが存在することも示された。全ゲノム配列決定によって、修復された、Ｃｒｅ切断されたｉＰＳ細胞（１７−９−Ｃ１および１７−１４−Ｃ１）の両方において、ＣＦＴＲエクソン１０に修復が導入され、３つの同義的塩基対変化が挿入されたことを、確認することができた。全体的に見て、未修復ｉＰＳまたは修復された細胞株において、変異のレベルの増加は見られなかった。ｉＰＳクローン１７に特有の５個のＮＳＣＶ、１７−９−Ｃ１に特有の２個のＮＳＣＶ、および１７−１４−Ｃ１に特有の８個のＮＳＣＶが発見された。さらに、Cradicket al. (2011) BMC Bioinformatics 12:152に記載の通りに決定されたように、非特異的なＺＦＮ結合部位は、各ＺＦＮ結合部位が２５個の塩基対によって隔てられている場合にのみ生じた。従って、非特異的なＺＦＮ結合部位の順列間に配列類似性は存在せず、ＮＳＣＶは修復された細胞株に存在した。

ｐｇｋ−ｐｕｒｏＴＫカセットのＣｒｅを介した切除を、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ発現プラスミドの一過性送達によって達成した。ｐｇｋ−ｐｕｒｏＴＫカセットの切除の成功により、クローンのｐｕｒｏ^Ｒからｐｕｒｏ^Ｓへの、およびＦＩＡＵ^ＳからＦＩＡＵ^Ｒへの表現型転換がもたらされることが予想される（図２）。

この方法から、４種の編集に成功したクローン（１７−１、１７−９、１７−１４、１７−１６）の各々から多数のＣｒｅ切除後クローンを同定することができ、ＰＣＲ分析およびＣｌａＩ消化を介して切除の成功を確認した（図４；Ｃｒｅ切除後クローンは‐Ｃ１または‐Ｃ２で示される）。図４に示すように、Ｃｒｅ切除後クローンのＲＴ−ＰＣＲおよび配列解析により、修復された対立遺伝子および変異対立遺伝子の両方から、およそ等しいレベルのＣＦＴＲｍＲＮＡ発現が示された。

修復されたＣＦ ｉＰＳ細胞における修復されたＣＦＴＲ対立遺伝子の発現が示されたため、次に、インビトロ分化条件下で、修復されたＣＦＴＲ遺伝子の発現の発現上昇が観察され得るかどうかを試験した。ｈＥＳ／ｈｉＰＳ細胞のアクチビンＡ処置は、胚体内胚葉の発生を誘導することが、以前に示されている。例えば、D'Amour et al. (2005) Nat Biotechnol23:1534-1541を参照されたい。

図５に示すように、この方法で３〜５日間培養されたオリジナルクローン１７ＣＦ ｉＰＳ細胞および修復された、Ｃｒｅ切除されたクローン１７−９−Ｃ１ ＣＦ ｉＰＳ細胞は、Ｓｏｘ１７およびＣＦＴＲ両方のｍＲＮＡの発現上昇についての証拠を示す。５日目のクローン１７−９−Ｃ１のＣＦＴＲのＲＴ−ＰＣＲ単位複製配列の配列決定により、修復された野生型および変異型ΔＦ５０８ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの両方の、およそ等しいレベルでの共発現が明らかにされた。

また、肺上皮のものと似ているある特徴（例えば細胞構成および組織構造）を有する上皮組織をもたらすことが以前に示されている気相液相界面（air-liquid-interface：ＡＬＩ）分化アッセイ系において、クローン１７ ＣＦ ｉＰＳ細胞および修復されたクローン１７−１４および１７−１６ＣＦ ｉＰＳ細胞を２８日間培養した。例えば、Van Haute et al. (2009)RespirRes10:105; Coraux et al. (2005) Am J Respir Cell MolBiol32:87-92を参照されたい。これらの培養条件下で、ＣＦＴＲ発現は上方制御された。２８日目のクローン１７−１４および１７−１６のＣＦＴＲのＲＴ−ＰＣＲ単位複製配列の配列決定により、修復された野生型および変異型ΔＦ５０８ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ両方の等しい強発現が明らかにされた。

これらの結果により、修復されたＣＦＴＲ対立遺伝子の適切に制御された発現が示された。

実施例５： ＣＦ研究のためのモデル系の作製
このようにして、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、ＣＦ研究のためのモデル系を作製することができる。例えば、修復された、または破損したΔＦ５０８（および／またはΔＩ５０７）を有する患者由来ｉＰＳＣは、ＣＦ治療用の薬剤を試験するための細胞および動物モデルを提供する。

下流の特徴付けにおいて観察された表現型が、ｉＰＳＣ作製方法（例えば再プログラムカセットのランダム組込み）に内因的な変化によるものであるという懸念を緩和するために、同一患者に由来する最低２種の独立したｉＰＳＣ株において、ΔＦ５０８の修復および破損を行い；同じ方法を、前記変異を有する３人の無関係な患者に由来するｉＰＳＣに実行し、それによって、異なる遺伝的背景との関連においてΔＦ５０８変異を研究するための、同質遺伝子細胞モデルを得た。

あるモデルに関して、ＣＦＴＲ ＺＦＮを使用して、正常対象由来のｉＰＳＣにおけるＣＦＴＲ遺伝子座へＤＳＢを導入し、単一対立遺伝子の、または二対立遺伝子のΔＦ５０８変異を新規に生成するためにＨＤＲを引き起こした。細胞がＣＦＴＲ−正常対象に由来すること、およびドナー構築体がΔＦ５０８変異を導入するヌクレオチド配列を含有すること以外は上記の通りに、ｉＰＳＣを変化させた。予想される消化パターンを有するクローンを配列決定して、操作された変異を確認する。

具体的には、免疫ブロット解析を用いて、対応する未改変細胞および／または野生型細胞と比較して、ＺＦＮ改変細胞における膜中のＣＦＴＲの蓄積を評価することにより、ＣＦＴＲタンパク質およびｉＰＳ細胞におけるその活性に対するＺＦＮ介在性遺伝子編集の影響もアッセイする。ある実施形態では、ＣＦＴＲに標的化された抗体により、ＣＦＴＲ活性のさらなる読み出しを得ることができる。さらに、試薬を使用して、直接標的であるＣＦＴＲの改変を検出することができる。同質遺伝子的な対照細胞株によって、これらのモデルに、正確性が大いに加えられる。
実施例６： ＳＦＴＰＢの修復

ＳＰ−Ｂ欠損症に存在する最も一般的な変異は、１２１ｉｎｓ２（１２１Ｃ＞ＧＡＡ）変異である。従って、ＣＦＴＲ遺伝子座に関する上記の通りに、１２１ｉｎｓ２（１２１ｃ＞ＧＡＡ）ＳＦＴＰＢ遺伝子座を標的とするようにＺＦＮを設計し、遺伝子修復に使用した。

実施例７： ＴＡＬＥＮ設計およびＣＦＴＲの改変
ＣＦＴＲ遺伝子座に対して特異的なＴＡＬＥＮ対も設計し、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号（本明細書に記載のように参照によって組み込まれる）に記載の通りに、標準的な、および新規のＲＶＤの両方を用いて構築する。ＴＡＬＥＮは、上記の通りに試験すると、活性である。

本明細書で言及された全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

理解を明確にする目的で、説明および例示として開示について多少詳しく記述したが、本開示の精神または範囲から逸脱せずに様々な変更および修正を実施することができることは当業者には明らかである。従って、上記の記述および例は、限定と解釈されるべきではない。

Claims (17)

1. 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子における標的部位に結合する操作されたＺｎフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質であって、前記Ｚｎフィンガータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６と配列された４、５または６つのＺｎフィンガー認識領域を含み、前記Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６が表１：
   の単一列に示される配列を含む、上記タンパク質。
2. 請求項１に記載のタンパク質および野生型のまたは操作された切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質。
3. 請求項１または請求項２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
4. 請求項１もしくは２に記載のタンパク質または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む単離細胞。
5. 前記細胞が胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、肺幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および線維芽細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の細胞。
6. 細胞における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を改変するための組成物であって、
   ＣＦＴＲを切断する一つまたは複数の請求項２に記載の融合タンパク質を含む上記組成物。
7. 前記改変が、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
8. ＣＦＴＲ遺伝子に導入される外来性配列をさらに含む、請求項６または請求項７に記載の組成物。
9. 前記改変がＣＦＴＲ遺伝子における変異を修復する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記変異がΔＦ５０８、ΔＩ５０７およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
11. 嚢胞性線維症（ＣＦ）の研究用モデル系を作製するための、細胞を改変する請求項６〜１０のいずれかに記載の組成物。
12. 前記モデル系が細胞株または非ヒト動物を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 対象においてＣＦを治療するための、請求項９または１０に記載の組成物であって、前記組成物が、前記対象の一つまたは複数の細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子を改変することを特徴とする、上記組成物。
14. 前記細胞がインビトロで改変され、前記細胞が前記対象に投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
15. 請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の融合タンパク質、または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
16. 野生型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞を生成する方法であって、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物によって細胞における変異型ＣＦＴＲ遺伝子を改変して、前記野生型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞を得ることを含む方法。
17. 請求項１６に記載の方法に従って前記野生型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞を生成するのに使用するための、変異型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞を含む組成物であって、前記野生型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞が、対象におけるＣＦの治療に使用されることを特徴とする、組成物。