JP2019531754A

JP2019531754A - 造血幹細胞および前駆細胞におけるｓｃｉｄ関連遺伝子の遺伝子修正

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Publication number: JP2019531754A
Application number: JP2019522537A
Authority: JP
Inventors: アンソニーコンウェイ，
Original assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2019-11-07
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CA3041668A1; AU2017347928A1; EP3532106A4; JP2022105621A; WO2018081775A1; US11020492B2; US20190262473A1; EP3532106A1; JP7108608B2

Abstract

本開示は、標的化ヌクレアーゼを使用するゲノム操作の分野に関し、特に、ＳＣＩＤにおいて欠如または欠損しているタンパク質を提供するための、細胞の変異型内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子への機能性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）関連遺伝子［たとえば、ＩＬ２ＲＧ−ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、および／または組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ１、ＲＡＧ２）］の標的化組み込みに関する。一局面において、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に１つまたは複数の挿入および／または欠失を含む、Ｔ細胞または幹細胞が提供され、上記挿入および／または上記欠失は、切断ドメインと、配列番号１または配列番号２の９個またはそれよりも多くのヌクレオチドを含む標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインとを含むヌクレアーゼによって作製されたものである。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１０月３１日に出願された米国仮出願第６２／４１５，０５６号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本開示は、ゲノム操作の分野に関し、特に、ＩＬ２Ｒ−ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子の、標的化修飾に関する。

亜鉛フィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）またはＴＡＬエフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）に由来するＤＮＡ結合ドメインと、すべて標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するように設計されている、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼとを含む、組換え転写因子は、内因性遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有し、ゲノム操作および遺伝子療法に有用である。たとえば、米国特許第９，３９４，５４５号、同第９，１５０，８４７号、同第９，２０６，４０４号、同第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、同第８，９５６，８２８号、同第８，９３６，９３６号、同第８，９４５，８６８号、同第８，８７１，９０５号、同第８，５８６，５２６号、同第８，５６３，３１４号、同第８，３２９，９８６号、同第８，３９９，２１８号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６００６３２３１号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１００２１８２６４号、同第２０１２００１７２９０号、同第２０１１０２６５１９８号、同第２０１３０１３７１０４号、同第２０１３０１２２５９１号、同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号、ならびに同第２０１５００５６７０５号（これらの開示は、あらゆる目的で参照によりその全体が組み入れられる）を参照のこと。さらに、アルゴノート系（たとえば、「ＴｔＡｇｏ」として公知のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であり、Ｓｗａｒｔｓら、（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ、５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁を参照されたい）に基づく標的化ヌクレアーゼが開発されており、これもまた、ゲノム編集および遺伝子療法における使用の可能性を有し得る。

ヌクレアーゼ媒介型の遺伝子療法は、１つもしくは複数の不活性化遺伝子を有するように細胞に遺伝子操作を行うため、および／またはその細胞に、これまでにその細胞において産生されていない産物を発現させるために（たとえば、導入遺伝子の挿入および／または内因性配列の修正を通じて）、使用することができる。導入遺伝子挿入の使用の例としては、１つもしくは複数の新規な治療用タンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているタンパク質をコードするコーディング配列の挿入、変異型遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子の挿入、ならびに／または構造核酸、たとえば、ｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡをコードする配列の挿入が挙げられる。内因性遺伝子配列の「修正」の有用な適用の例としては、疾患関連遺伝子変異の改変、スプライシング部位をコードする配列における改変、調節配列における改変、およびタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化改変が挙げられる。導入遺伝子構築物は、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により駆動されるプロセス中の末端捕捉のいずれかによって、挿入され得る。たとえば、米国特許第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、同第７，８８８，１２１号、および同第８，７０３，４８９号を参照されたい。

これらの操作された転写因子およびヌクレアーゼを使用した臨床試験では、これらの分子により、がん、ＨＩＶ、および／または血液障害（たとえば、ヘモグロビン異常症および／または血友病）を含む、様々な状態を処置できることが示されている。たとえば、Ｙｕら、（２００６年）、ＦＡＳＥＢＪ．、２０巻：４７９〜４８１頁、Ｔｅｂａｓら、（２０１４年）、ＮｅｗＥｎｇＪＭｅｄ、３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい。したがって、これらのアプローチは、疾患の処置に使用することができる。

重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）は、少なくとも１１種類の異なる状態を含む、原発性免疫不全の不均一な群である（Ｋｕｔｕｋｃｕｌｅｒら、（２０１２年）、ＩｔＪｏｆＰｅｄ、３８巻：８頁）。ＳＣＩＤを有するすべての患者は、一般的な細菌およびウイルス、ならびに日和見性および真菌性の病原体に感染しやすい。Ｘ連鎖型重症複合免疫不全（Ｘ−ＳＣＩＤ）は、身体から産生されるＴ細胞およびナチュラルキラー細胞が非常に少ない、免疫不全障害である。Ｔ細胞の補助がない状況では、Ｂ細胞に欠陥が生じる（Ｆｉｓｈｅｒら、（２００２年）、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ、２巻：６１５〜６２１頁）。これは、Ｘ連鎖型劣性形質であるため、ほぼすべての患者は男性となり、Ｘ染色体のｘｑ１３．１に位置するＩＬ２ＲＧ遺伝子（「共通ガンマ」遺伝子または「サイトカイン受容体共通ガンマ鎖」とも呼ばれている）の変異バージョンから生じる。共通ガンマタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１の受容体間で共通しており、Ｘ−ＳＣＩＤ患者が、機能性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を生じることができなくなっている。Ｘ−ＳＣＩＤに罹患した人物は、３ヶ月齢にも満たない非常に若齢の時点で、感染症にかかることが多い。これは、３ヶ月の段階で乳児における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルの量の減少に起因して生じる。これに続いて、咳、発熱、悪寒、および息切れなどの一般的な症状をもたらす肺の炎症である肺炎などのウイルス感染が生じることが多い。再発性の湿疹様の皮疹もまた、一般的な症状である。Ｘ−ＳＣＩＤを有する個体が経験する他の一般的な感染症としては、下痢、敗血症、および中耳炎が挙げられる。Ｘ−ＳＣＩＤ患者が経験するいくつかの他の一般的な症状としては、成長障害、胃腸の問題、皮膚の問題、および筋緊張低下が挙げられる（Ｖｉｃｋｅｒｓ、ＳｅｖｅｒｅＣｏｍｂｉｎｅｄＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＥａｒｌｙＨｏｓｐｉｔａｌｉｓａｔｉｏｎａｎｄＩｓｏｌａｔｉｏｎ、（２００９年）、２９〜４７頁、ＩＳＢＮ９７８−０−４７０−３１９８６−４）。治療的介入および／または環境的介入がなければ、Ｘ−ＳＣＩＤは、典型的に、生まれて１年の間に致命的になる（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｒｇ−Ａｂｉｎａら、（２００２年）、ＮＥＪＭ、３４６巻：１１８５〜１１９３頁）。

ＳＣＩＤの別の種類は、組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ１、ＲＡＧ２）における欠陥に関連するものであり、すべてのＳＣＩＤ症例のうちのおよそ１０％が、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２と関係している（Ｋｅｔｕｋｃｕｌｅｒ、同書）。ＲＡＧ１またはＲＡＧ２遺伝子のタンパク質産物（それぞれ、Ｒａｇ１およびＲａｇ２）は、Ｂ細胞受容体およびＴ細胞受容体におけるＶ（Ｄ）Ｊ再配列に必須であり、したがって、Ｂ細胞およびＴ細胞の適正な発生に必要であり、炎症に関与するとも考えられている（たとえば、米国特許公開第２０１１００１６５４３号を参照されたい）。まとめると、Ｒａｇ１およびＲａｇ２は、ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成することによって、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを開始し、この切断が、次いで、ＮＨＥＪ機構によって修復される。

オーメン症候群は、明確な臨床特徴として全身性紅皮症、肝脾腫大、およびリンパ節腫脹を有する、ＳＣＩＤの常染色体性劣性バリアントである。古典的なＳＣＩＤを有する患者とは異なり、オーメン症候群を有する患者は、異常な表現型の循環Ｔ細胞を有する。それらは、典型的に、反応性が乏しく、オリゴクローナルであり、以前の活性化の細胞表面マーカーを呈する。Ｂ細胞は、典型的に、存在しないかまたは少なく、ＩｇＧレベルは、一般に低いが、一方でＩｇＥレベルは高い（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、（２０１５年）、ＰＬｏＳＯｎｅ、１０巻（４号）：ｅ０１２１４８９頁）。オーメン症候群は、典型的に、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２における変異によって引き起こされるが、他の遺伝子における変異によっても生じる場合がある。一般に、低形質性ＲＡＧ変異が、ときにはＲＡＧヌル変異と組み合わせて、オーメン症候群を引き起こす（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、同書）。

現在のところ、ＳＣＩＤ患者に利用可能な処置は３種類、すなわち、医薬品の使用、滅菌環境、および静脈内免疫グロブリン療法（ＩＶＩＧ）がある。第１には、カンジダ症のためのフルコナゾールおよびヘルペスウイルス感染症を予防するためのアシクロビルなど、抗生物質または抗ウイルス薬を、日和見感染を制御するために投与する（Ｆｒｅｅｍａｎら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（２００９年）、９巻（６号）：５２５〜５３０頁）。加えて、患者は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）補充も受けることができる。しかしながら、ＩＶＩＧは、時間および金銭の両方の点で、費用がかさむ。さらに、前述の処置は、日和見感染を予防するように機能するだけであり、決して、Ｘ−ＳＣＩＤまたは他のＳＣＩＤ障害を治癒するものではない。

現時点では、骨髄移植（ＢＭＴ）が、標準的な治癒的手技であり、適切なドナーを特定することができ、生着が成功すれば、完全な免疫再構成が得られる。骨髄移植は、ドナーとレシピエントとの間で、許容されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致を必要とする。ＨＬＡ分子のアレイは、個体間で異なるため、免疫系の細胞は、ＨＬＡ機構を利用して、自己細胞と外来細胞とを区別することができる。ＢＭＴは、同種（ドナーおよびレシピエントが、異なる人物である）または自家（ドナーおよびレシピエントが、同じ人物である）であり得る。自家ＢＭＴは、したがって、完全なＨＬＡ一致を有するが、一方で、同種ＢＭＴの一致は、さらに複雑である。標準的な実施では、公知の主要ＨＬＡ抗原が６つすべてで同一である−６分の６一致である場合には、同種移植がよい。６／６一致を有する患者は、移植片対宿主病、移植片拒絶、弱い免疫系を有すること、および重篤な感染症にかかることの可能性がより低い。骨髄移植および末梢血幹細胞移植については、抗原の不一致が１つであるドナー、６分の５一致のドナーが、使用されることがある。そのため、ＢＭＴは、完全な免疫再構成をもたらすことができ、したがって、Ｘ−ＳＣＩＤ患者において治癒的となり得るが、合併症の可能性により、有効性および広範な使用は制限される。オーメン症候群を有する患者については、ＢＭＴも処置の好ましい方法ではあるが、オーメン症候群の患者は、他のＳＣＩＤ患者よりも、ＢＭＴ後の死亡率が高い。

Ｘ−ＳＣＩＤ患者のこれまでの遺伝子療法の臨床試験では、野生型ＩＬ２ＲＧ遺伝子を含むレトロウイルスベクターが使用されていた（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、（２０００年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８巻（５４６６号）：６６９〜７２頁）。しかしながら、レトロウイルスベクターは、宿主ゲノムにランダムに組み込まれ、そのため、癌原遺伝子に組み込みが生じた場合には、挿入による腫瘍発生が、患者に生じ得る（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、（２００８年）、Ｊ．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１８巻（９号）：３１３２〜４２頁）。この治療法を受ける患者の大半は、この挿入による腫瘍発生の結果として白血病を発症しており、したがって、この方法は、安全で有効な治療法ではない。

インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）（Ｐｈｉｌｉｐｐｅら、（２００６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３巻（４７号）：１７６８４〜９頁）、すなわちＩＤＬＶの開発により、それが宿主ゲノムに組み込むことができないことに起因して、Ｘ−ＳＣＩＤに関するＩＬ２ＲＧの遺伝子修正のさらなる調査が促進された。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ならびにＴｔＡｇｏが、ＤＮＡの特定の領域を標的とし、標的化された二本鎖切断を導入する能力（これが、次に、導入された導入遺伝子の標的化組み込みを促進する）により、このゲノム編集技術は、可能性のある治癒的な処置の開発において非常に魅力的にしている。
この目的で、研究者らは、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）における、ＺＦＮ切断、ならびにそれに続くＩＤＬＶにより送達される修正用ＩＬ２ＲＧｃＤＮＡのＴＩのために、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子座のエクソン５を標的化した。たとえば、米国特許第７，８８８，１２１号および同第７，９５１，９２５号、Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７年）、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ、２５巻（１１号）：１２９８〜３０６頁；Ｇｅｎｏｖｅｓｅら、（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ、５１０巻（７５０４号）：２３５〜４０頁を参照されたい。しかしながら、これらの方法は、導入遺伝子を、エクソンの中央に導入することにより、導入された導入遺伝子の上流において、部分的に転写される領域が生じ、これにより、導入された修正用遺伝子の活性が妨害され得るという点で、潜在的な欠点を有し得る。さらに、送達されたエピソーム性導入遺伝子は、別のウイルス性インテグラーゼが細胞内に存在している場合、依然としてランダムにゲノムに組み込まれる可能性がある。免疫抑制患者（すべてのＸ−ＳＣＩＤ患者など）は、内因性レトロウイルスの活性化を有する場合があり、したがって、ＨＩＶ陽性でもある患者は、Ｘ−ＳＣＩＤ処置のためのウイルス送達される遺伝子療法を受けないようになっている。ＩＬ２ＲＧおよびＲＡＧを標的とするヌクレアーゼはまた、２０１６００３０４７７に記載されている。
しかしながら、ＳＣＩＤの処置および／または予防のためのＩＬ２ＲＧ遺伝子修正およびドナー送達の追加の方法および組成物に対する必要性が残っている。

米国特許第７，８８８，１２１号明細書米国特許第７，９５１，９２５号明細書

Ｌｏｍｂａｒｄｏら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ（２００７年）２５巻（１１号）：１２９８〜３０６頁；Ｇｅｎｏｖｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１４年）５１０巻（７５０４号）：２３５〜４０頁

本発明は、遺伝子療法およびゲノム操作において使用するための組成物および方法について記載する。具体的には、記載される方法および組成物は、ヌクレアーゼにより媒介される、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子（変異体または野生型）のゲノム修飾（たとえば、１つもしくは複数の挿入および／または欠失）に関する。ゲノム修飾は、（ｉ）標的遺伝子を不活性化する（たとえば、ヌクレアーゼによる遺伝子の切断後にＮＨＥＪを介して）、（ｉｉ）タンパク質をコードする配列、たとえば、ＳＣＩＤを有する被験体において欠如もしくは欠損しているタンパク質を補うための配列を含む、導入遺伝子（ドナー）の標的化挿入をもたらす、ならびに／または（ｉｉｉ）修正用ドナー（たとえば、変異体ＩＬ２ＲＧ内因性遺伝子における機能性ＩＬ２ＲＧ発現を修復する配列）の標的化挿入を行う、挿入および／または欠失（「インデル」）を含み得る。ある特定の実施形態では、高度にＩＬ２ＲＧ特異的なＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を使用した、修正用ＳＣＩＤ関連遺伝子カセット（たとえば、ＳＣＩＤ関連遺伝子の変異体バージョンを有する造血幹細胞）の、ＩＬ２ＲＧへの標的化組み込み。標的とされるＩＬ２ＲＧ遺伝子に組み込まれるＳＣＩＤ関連遺伝子カセット（たとえば、機能性ＩＬ２ＲＧ導入遺伝子）は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（たとえば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））で運搬することもでき、および／または１つまたは複数のヌクレアーゼを使用して組み込むこともできる。

一態様では、１つまたは複数のヌクレアーゼを使用したＩＬ２ＲＧ遺伝子の標的化修飾のための方法および組成物が、本明細書に開示される。ヌクレアーゼ、たとえば、操作されたメガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（「ＺＦＮ」という用語には、ＺＦＮの対が含まれる）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥエフェクタードメインと、制限エンドヌクレアーゼおよび／もしくはメガヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインとの融合体を含む、ＴＡＬＥＮ（たとえば、メガＴＡＬＥおよびコンパクトＴＡＬＥＮ））（「ＴＡＬＥＮ」という用語には、ＴＡＬＥＮの対が含まれる）、Ｔｔａｇｏ系および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を使用して、細胞のＩＬ２ＲＧ遺伝子座においてＤＮＡを切断する。ＩＬ２ＲＧ遺伝子は、切断後に（たとえば、挿入および／もしくは欠失（「インデル」）によって）および／またはドナー導入遺伝子の標的化挿入によって、不活性化され得る。ドナー導入遺伝子は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同修復機序（たとえば、ＮＨＥＪドナー捕捉）を介するものであり得る。本明細書に記載されるヌクレアーゼは、標的ＤＮＡに、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導し得る。一部の実施形態では、２つのニッカーゼを使用して、２つのニックを導入することによって、ＤＳＢを作製する。一部の事例では、ニッカーゼは、ＺＦＮであるが、一方で他の事例では、ニッカーゼは、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。本明細書に記載されるヌクレアーゼのいずれか（たとえば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）により、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のイントロン（たとえば、イントロン１または２）、たとえば、配列番号１または２の９〜２０個またはそれよりも多くの（９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれよりも多くの）連続的または非連続的アミノ酸を含む標的部位を含む、表２に示される標的配列を標的とすることができる。

一態様では、ゲノム内のＩＬ２ＲＧ遺伝子の標的部位に結合する天然に存在しない亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）が、本明細書に記載され、ここで、ＺＦＰは、１つまたは複数の操作された亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。一実施形態では、ＺＦＰは、目的の標的ゲノム領域を切断する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ここで、ＺＦＮは、１つまたは複数の操作された亜鉛フィンガー結合ドメインと、ヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメイン（ｃｌｅａｖａｇｅｈａｌｆ−ｄｏｍａｉｎ）とを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、たとえば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができ、野生型であっても操作型（変異体）であってもよい。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（たとえば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガードメインは、表１の単一の行で示されているように、認識ヘリックスドメインを有する亜鉛フィンガータンパク質である。これらの亜鉛フィンガータンパク質を含むヌクレアーゼは、任意のリンカー配列（たとえば、それを切断ドメインに連結させる）ならびに任意の切断ドメイン（たとえば、ＥＬＤ変異体などの二量体化変異体；４１６、４２２、４４７、４４８、および／もしくは５２５のうちの１つもしくは複数に変異を有するＦｏｋＩドメイン；および／またはニッカーゼ機能性をもたらす触媒ドメイン変異体）を含み得る。たとえば、米国特許第８，７０３，４８９号、同第９，２００，２６６号、同第８，６２３，６１８号、および同第７，９１４，７９６号、ならびに米国出願第１５／６８５，５８０号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＺＦＮのＺＦＰは、配列番号１または２に示される配列内の９〜１８個またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位に結合する。

別の態様では、ゲノムのＩＬ２Ｒγ遺伝子における標的部位（たとえば、表２の配列番号１または２に示される標的配列の少なくとも９個または１２個（たとえば、９〜２０個またはそれよりも多く）のヌクレオチドを含む、標的部位）に結合する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質が、本明細書に記載され、ここで、ＴＡＬＥは、１つまたは複数の操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含む。一実施形態では、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、ここで、ＴＡＬＥＮは、１つまたは複数の操作されたＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、たとえば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）から得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（たとえば、ＦｏｋＩ）に由来する。他の実施形態では、切断ドメインは、メガヌクレアーゼに由来し、このメガヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能性を呈し得る。

別の態様では、ゲノムのＩＬ２Ｒγ遺伝子における標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、本明細書に記載され、ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、１つまたは複数の操作された一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ）または機能的同等物、ならびにＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、表２（配列番号１または２）に示される標的部位の９個、１２個、またはそれよりも多くの連続したヌクレオチドを含む配列に結合する。

本明細書に記載されるヌクレアーゼ（たとえば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏ、および／またはＴＡＬＥＮ）は、ＩＬＲ２γ遺伝子内またはそれに隣接するコーディング領域または非コーディング領域、たとえば、例として、リーダー配列、トレーラー配列（ｔｒａｉｌｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）もしくはイントロン、またはコーディング領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内の目的の領域に結合し得る、および／またはそれを切断し得る。

別の態様では、１つまたは複数のヌクレアーゼ（たとえば、本明細書に記載されるＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏ、および／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に記載される。ポリヌクレオチドは、たとえば、ｍＲＮＡであり得る。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されていてもよい（たとえば、Ｋｏｒｍａｎｎら、（２０１１年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照されたい）。

別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼ（たとえば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏ、および／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏ、および／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターが、本明細書に記載される。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター（たとえば、ＡＡＶベクター）である。一態様では、ウイルスベクターは、組織特異的向性を呈する。

別の態様では、１つまたは複数のヌクレアーゼ（たとえば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏ、および／またはＴＡＬＥＮ）発現ベクターを含む、宿主細胞が、本明細書に記載される。

別の態様では、本明細書に記載される発現ベクターを含む医薬組成物が、提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つを上回る発現ベクターを含んでもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、および第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターを含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、異なる。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、実質的に同じである。医薬組成物は、ドナー配列（たとえば、疾患または障害、たとえば、ＬＳＤまたは血友病において欠如または欠損しているタンパク質をコードする導入遺伝子）をさらに含み得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、発現ベクターに付随する。

一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγ ＤＮＡ結合ドメイン（たとえば、亜鉛フィンガータンパク質、またはＴＡＬＥ、またはｓｇＲＮＡ、またはメガヌクレアーゼ）および野生型または操作型切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む、融合タンパク質が、提供される。

本明細書に記載されるヌクレアーゼは、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のコーディング領域内、または該遺伝子内もしくはそれに隣接する非コーディング配列、たとえば、例として、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン、またはコーディング領域の上流または下流のいずれかにある非転写領域内で、ＩＬ２ＲＧ遺伝子に結合し得る、および／またはそれを切断し得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、表２に示されるＩＬ２ＲＧ配列内の９〜２０個またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位に結合する。

別の態様では、ＤＮＡ結合分子（たとえば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含むヌクレアーゼを含め、本明細書に記載されるヌクレアーゼ（たとえば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のうちの１つまたは複数を含む、組成物が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本組成物は、１つまたは複数のヌクレアーゼを、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、含む。一部の実施形態では、本組成物は、２つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼセット（対）を含み、それぞれのセットが異なる特異性を有する。他の態様では、本組成物は、異なる種類のヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、本組成物は、ＩＬ２ＲＧヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、他の実施形態では、本組成物は、ＩＬ２ＲＧ特異的ヌクレアーゼタンパク質を含む。なおもさらなる実施形態では、本組成物は、１つまたは複数のドナー分子、たとえば、機能性ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ１、および／またはＲａｇ２タンパク質をコードするドナーを含み、これには、その任意の機能性断片が含まれる。好ましい実施形態では、ドナーは、部分的なＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ（たとえば、ＲＡＧ１もしくはＲＡＧ２）遺伝子を含む。野生型ＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン２から８を含むｃＤＮＡを含むドナーもまた、好ましい。別の好ましいドナーは、野生型ＲＡＧ（ＲＡＧ１および／またはＲＡＧ２）遺伝子のエクソン３を含むｃＤＮＡである。他の態様では、ドナーは、修正用配列を含み、これが、細胞の変異体ＩＬ２ＲＧに組み込まれ、その結果、細胞が、機能性ＩＬ２ＲＧを発現するようになる。

別の態様では、本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ構成要素（たとえば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のヌクレアーゼドメイン）をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に記載される。ポリヌクレオチドは、たとえば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されていてもよい（たとえば、Ｋｏｒｍａｎｎら、（２０１１年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含み得る（たとえば、米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの混合物を含み得る（たとえば、米国特許公開第２０１２０１９５９３６号を参照されたい）。別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載される１つまたは複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含む、ヌクレアーゼ発現ベクターが、本明細書に記載される。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、たとえば、ＡＡＶベクターである。

別の態様では、本明細書に記載される１つもしくは複数のヌクレアーゼ、１つもしくは複数のヌクレアーゼ発現ベクター、および／または１つもしくは複数のドナーを含む、宿主細胞が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＩＬ２ＲＧ特異的ヌクレアーゼによって媒介されるＳＣＩＤ関連遺伝子カセットの組み込みにより、生来の変異体バージョンを修正することによって、細胞において欠如または欠損しているタンパク質の機能性バージョンが得られるように、１つまたは複数のＳＣＩＤ関連遺伝子（たとえば、ＩＬ２ＲＧ遺伝子）の変異体バージョンを含む。宿主細胞は、１つまたは複数のヌクレアーゼ発現ベクターで、安定に形質転換されているか、またはそれで一過的にトランスフェクトされているか、またはこれらの組み合わせであってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞または幹細胞、たとえば、造血幹細胞または人工多能性幹細胞である。他の実施形態では、１つまたは複数のヌクレアーゼ発現ベクターは、宿主細胞において１つまたは複数のヌクレアーゼを発現させる。別の実施形態では、宿主細胞は、外因性ポリヌクレオチドドナー配列（たとえば、ＩＬ２ＲＧまたはＲａｇタンパク質をコードする）をさらに含み得る。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、宿主細胞は、胚性細胞、たとえば、１つまたは複数のマウス、ラット、ウサギ、または他の哺乳動物細胞の胚（たとえば、非ヒト霊長類）を含み得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、組織を含む。多能性細胞、全能性細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、または分化細胞を含め、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子のイントロン（たとえば、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子のイントロン１）に修飾（たとえば、ドナー配列の組み込み）を含む、本明細書に記載される細胞の子孫である細胞または細胞株もまた、記載される。ある特定の実施形態では、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子のイントロン（たとえば、内因性ＩＬ２ＲＧのイントロン１）に修飾（たとえば、ドナー配列の組み込み）を含む、本明細書に記載される分化細胞もまた、本明細書に記載され、この分化細胞は、本明細書に記載される幹細胞の子孫である。

別の態様では、細胞においてＩＬ２ＲＧ遺伝子を切断するための方法であって、（ａ）ヌクレアーゼが発現され、１つまたは複数のＩＬ２ＲＧ遺伝子が切断されるような条件下において、細胞に、１つまたは複数のＩＬ２ＲＧ遺伝子を標的とする１つまたは複数のヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入することを含む、方法が、本明細書に記載される。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼによる切断の後に、標的ＩＬ２ＲＧ遺伝子のゲノム配列が、たとえば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼをコードするベクター）を使用して、切断され、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的化切断の後に、「ドナー」配列が、遺伝子に挿入され、その結果、ドナー配列が、細胞において発現される。ドナー配列は、機能性ＩＬ２ＲＧまたはＲａｇタンパク質をコードし得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、部分的なＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ（ＲＡＧ１またはＲＡＧ２）遺伝子配列を含む。好ましい実施形態では、ドナーは、エクソン２から８を含むＩＬ２ＲＧ遺伝子配列の部分的なｃＤＮＡ、またはエクソン３を含むＲＡＧ１遺伝子の全ｃＤＮＡ、またはエクソン３を含むＲＡＧ２遺伝子の全ｃＤＮＡを含む。さらに、ドナー配列は、ヌクレアーゼ送達系（たとえば、非ウイルスベクターまたはウイルスベクター）に存在してもよく、別個の送達機序（たとえば、ヌクレアーゼがｍＲＮＡの形態で送達され、ドナーが、ウイルスベクター、たとえばＡＡＶを使用して送達される）で存在してもよく、または代替として、別個および／もしくは異なる核酸送達機序を使用して細胞に導入されてもよい。ＩＬ２ＲＧ遺伝子座へのドナーヌクレオチド配列の挿入により、それぞれ、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子制御エレメントの制御下において、導入遺伝子の発現が起こり得る。一部の態様では、目的の導入遺伝子の挿入により、インタクトな外因性タンパク質配列の発現が生じ、あらゆるＩＬ２ＲＧによりコードされるアミノ酸は欠如する。他の態様では、発現される外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子およびＩＬ２ＲＧ遺伝子によってコードされるアミノ酸を含む。一部の事例では、ＩＬ２ＲＧ配列は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分上に存在し、一方で他の事例では、ＩＬ２ＲＧ配列は、外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分上に存在する。他の事例では、ＩＬ２ＲＧ配列は、外因性タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分上の両方に存在するであろう。ドナーはまた、ＩＬ２ＲＧタンパク質を発現しない（または正常な野生型のレベルよりも低いレベルで発現する）変異体内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に組み込まれる「修正用」配列であり得、結果として、ＩＬ２ＲＧの発現が修復される。

一部の実施形態では、本発明は、ｉｎｖｉｖｏで、ＩＬ２ＲＧプロモーターの制御下において導入遺伝子を発現させるために使用することができる方法および組成物について記載する。一部の態様では、導入遺伝子は、目的の治療用タンパク質をコードし得る。導入遺伝子は、本発明の方法をタンパク質の置換えに使用することができるように、タンパク質をコードし得る。一部の態様では、導入遺伝子は、ＳＣＩＤまたはオーメン症候群を処置および／または予防するＩＬ２ＲＧまたはＲａｇ（たとえば、Ｒａｇ１またはＲａｇ２）タンパク質をコードする。他の態様では、導入遺伝子は、部分的なＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ（ＲＡＧ１もしくはＲＡＧ２）遺伝子配列を含む。

一部の実施形態では、導入遺伝子（たとえば、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ１、またはＲａｇ２をコードする導入遺伝子）が、ＩＬ２ＲＧのイントロンの領域、たとえば、それぞれ、イントロン１、イントロン２またはイントロン２に組み込まれるように、ヌクレアーゼ標的および／または切断部位は、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のイントロンにある。導入遺伝子は、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで、別の目的とされる内因性または外因性プロモーターの制御下にあってもよく、外因性プロモーターは、導入遺伝子の発現を駆動させる。好ましい実施形態では、ＩＬ２ＲＧ、導入遺伝子は、ＩＬ２ＲＧのエクソン２から８を含むｃＤＮＡを含み、さらに、スプライシングアクセプター部位を含み、結果として、組み込みおよび発現の際に、内因性ＩＬ２ＲＧのエクソン１が、導入遺伝子のエクソン２〜８の配列に連結され、それによって、野生型ＩＬ２ＲＧタンパク質が産生され、Ｘ−ＳＣＩＤまたはオーメン症候群が処置または予防される。

別の態様では、内因性遺伝子を修飾する方法であって、細胞に、ＩＬ２ＲＧまたはＲａｇタンパク質をコードする１つまたは複数のドナー配列の存在下において、１つまたは複数のヌクレアーゼ（たとえば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを投与することを含み、それによって、ドナーが、ヌクレアーゼによって標的とされる内因性遺伝子に組み込まれる、方法が、記載される。１つまたは複数のドナー分子の組み込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を伴う修復によって、生じる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレアーゼ対が用いられ、このヌクレアーゼは、同じかまたは異なる核酸によってコードされ得る。

さらに別の態様では、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して、標的化された様式でゲノムに組み込まれているＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、および／またはＲＡＧ２導入遺伝子を含む細胞（たとえば、Ｔ細胞または幹細胞）が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載される方法によって作製される。他の好ましい実施形態では、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２導入遺伝子は、ＩＬ２ＲＧのイントロンの領域に（たとえば、イントロン１、配列番号１または２のいずれかに示される配列の５〜１０塩基対またはその中のものを含むがこれらに限定されない）組み込まれる。組み込まれたＩＬ２ＲＧ、および／またはＲＡＧ（ＲＡＧ１もしくはＲＡＧ２）導入遺伝子を含む細胞は、内因性プロモーター（たとえば、それぞれ、ＩＬ２ＲＧプロモーター）から導入遺伝子を発現してもよく、または代替として、導入遺伝子は、調節エレメントおよび制御エレメント、たとえば、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、もしくはＲＡＧ２導入遺伝子の発現を作動させる外因性プロモーターを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＩＬ２ＲＧ導入遺伝子を含む細胞は、ゲノムに組み込まれたウイルスベクター配列を一切含まない。

本明細書に記載される方法および組成物のいずれかにおいて、細胞は、任意の真核生物細胞であり得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞または幹細胞である。他の実施形態では、細胞は、患者由来であり、たとえば、自家ＣＤ３４＋（造血）幹細胞である（たとえば、患者において、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）投与により、骨髄から末梢血に動員されている）。ＣＤ３４＋細胞を採取し、精製し、培養し、ヌクレアーゼおよび／またはＩＬ２ＲＧドナー（たとえば、アデノウイルスベクタードナー）を、任意の好適な方法によって細胞に導入することができる。

別の態様では、本発明の方法および組成物は、たとえば、ＳＣＩＤ関連障害の処置および／または薬物スクリーニングにおいて使用するための、本明細書に記載される組成物（ヌクレアーゼ、医薬組成物、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、細胞株、および／または動物、たとえば、トランスジェニック動物）の使用を提供する。ある特定の実施形態では、これらの組成物は、Ｘ−ＳＣＩＤまたはオーメン症候群の処置において使用するための薬物ライブラリーおよび／または他の治療用組成物（すなわち、抗体、構造的ＲＮＡなど）のスクリーニングに使用される。そのようなスクリーニングは、操作された細胞株または初代細胞を用いて細胞レベルで開始され得、動物全体（たとえば、ヒト）の処置のレベルへと進められ得る。したがって、ある特定の態様では、それを必要とする被験体において、Ｘ−ＳＣＩＤまたはオーメン症候群の処置および／または予防する方法であって、被験体に、本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、および／または細胞を投与することを含む、方法が、本明細書に記載される。本方法は、ｅｘｖｉｖｏであってもｉｎｖｉｖｏであってもよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞（たとえば、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２導入遺伝子を含む細胞）が、被験体に投与される。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、細胞は、被験体に由来する幹細胞（患者由来の幹細胞）であり得る。

本明細書に記載される組成物および方法のいずれかにおいて、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で、および／または１つもしくは複数の非ウイルスもしくはウイルスベクターを使用して、導入される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で導入される。他の実施形態では、ＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ（ＲＡＧ１またはＲＡＧ２）導入遺伝子は、ウイルスベクター、たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６を含む、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を使用して、またはレンチウイルスもしくは組み込み欠損レンチウイルスベクターを介して、導入され、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で導入される。なおもさらなる実施形態では、ヌクレアーゼおよびドナーは、いずれも、１つまたは複数のウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して導入される。ヌクレアーゼおよびドナーは、同じベクターで運搬されてもよく、同じ種類の異なるベクターで運搬されてもよく、または異なる種類の異なるベクターで運搬されてもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で導入され（たとえば、エレクトロポレーションを介して）、ドナーは、ＡＡＶ（たとえば、ＡＡＶ２／６）、レンチウイルス、または組み込み欠損レンチウイルスを使用して導入される。ある特定の実施形態では、ドナーは、一本鎖ＤＮＡとして導入される。

ヌクレアーゼおよびドナーは、同時に、または順番に、導入され得る。逐次的に導入される場合、ヌクレアーゼの投与とドナーの投与との間に、任意の期間（たとえば、数秒間から数時間）が、経過してもよい。ある特定の実施形態では、ドナーが導入され、１２〜３６時間（またはその間の任意の時間）後に、ヌクレアーゼが、細胞に導入される。ある特定の実施形態では、修飾された細胞を、数時間から数日間（またはその間の任意の時間）インキュベートし、次いでアリコートに分け、凍結させる。

原核生物細胞または真核生物細胞、たとえば、細菌、昆虫、酵母、魚、哺乳動物（非ヒト哺乳動物を含む）、および植物細胞を含むがこれらに限定されない任意の細胞を、本発明の組成物および方法を使用して修飾することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、免疫細胞、たとえば、Ｔ細胞（たとえば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）、樹状細胞、Ｂ細胞などである。他の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞、全能性幹細胞、または複能性幹細胞、たとえば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（たとえば、ＣＤ３４＋）、胚性幹細胞などである。本明細書に記載される方法または組成物のいずれかにおいて、ＩＬ２ＲＧをコードする導入遺伝子を含有する細胞は、幹細胞または前駆細胞であり得る。本発明の方法および組成物に使用され得る具体的な幹細胞の種類としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および造血幹細胞（たとえば、ＣＤ３４＋細胞）が挙げられる。ｉＰＳＣは、患者試料および正常対照に由来するものであり得、ここで、患者由来のｉＰＳＣを、目的の遺伝子において、正常または野生型遺伝子配列に変異させてもよく、または正常細胞を、目的の遺伝子における公知の疾患アレルに改変してもよい。同様に、造血幹細胞を、患者（たとえば、ＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧなどの１つもしくは複数のＳＣＩＤ関連遺伝子の変異体形態を有するＳＣＩＤ患者）またはドナーから単離することができる。これらの細胞は、次いで、機能性ＳＣＩＤ関連タンパク質、たとえば、ＩＬ２ＲＧまたはＲａｇ（たとえば、Ｒａｇ１またはＲａｇ２）を発現するように操作され、拡大増殖（ｅｘｐａｎｄ）された後、患者に再導入される。ある特定の実施形態では、細胞は、患者由来の造血幹細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（たとえば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（たとえば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞である。

本発明の核酸、タンパク質、および／または細胞を含むキットもまた、提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸、（たとえば、ＲＮＡ分子、またはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする遺伝子が、好適な発現ベクターに含まれたもの）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、好適な幹細胞性修飾因子、細胞、本発明の方法を実行するための指示などを含み得る。

これらおよび他の態様は、全体として本開示を踏まえると、当業者に容易に明らかであろう。

図１Ａおよび１Ｂは、意図される部位（オンターゲット（ｏｎｔａｒｇｅｔ））およびオフターゲット（ｏｆｆｔａｒｇｅｔ）部位における、二量体化変異体（ＥＬＤおよびＫＫＲ）、ＺＦＰリン酸接触変異体（ｎＲ−５Ｑａｂｃ）、ならびにＦｏｋＩリン酸接触変異体（Ｒ４１６ＳおよびＫ５２５Ｓ）を含む、示される操作されたＦｏｋＩドメインによる、ＣＤ３４＋細胞におけるＩＬ２ＲＧ特異的ＺＦＮの活性の結果を示す図である。たとえば、米国特許第８，６２３，６１８号および米国出願第１５／６８５，５８０号を参照されたい。図１Ａは、示される対を使用した、オンターゲット（意図される）部位におけるインデルパーセント（「インデル％」）を示す。図１Ｂは、示される対を使用した、オンターゲット事象（インデル）のオフターゲット事象に対する比を示す。「５７６１８−ＥＬＤ」および「５７６２９−ＥＬＤ」は、表１の５７６１８または５７６２９（それぞれ）と表記されるＺＦＰが、ＦｏｋＩＥＬＤ二量体化変異体に融合したものを含む、ＺＦＮを指す。「５５６２９−ＫＫＲ」および「５７７１８−ＫＫＲ」は、表１の５５６２９または５７７１８（それぞれ）と表記されるＺＦＰが、ＦｏｋＩＫＫＲ二量体化変異体に融合したものを含む、ＺＦＮを指す。「５７６１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ」、「５７６２９−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ」、「５５６２９−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ」、および「５７７１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ」は、示されるＺＦＰ（それぞれ、５７６１８、５７６２９、５５６２９、および５７７１８）、および示される二量体化変異体（ＥＬＤまたはＫＫＲ）、なおＺＦＰリン酸接触変異体（ｎＲ−５Ｑａｂｃ）を有する、ＺＦＮを指す。「５７７１８−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓ」、「５７６２９−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」、「５５６２９−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓ」、および「５７６１８−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」は、示されるＺＦＰ（それぞれ、５７７１８、５７６２９、５５６２９、および５７６１８）、および示される二量体化変異体（ＥＬＤまたはＫＫＲ）、なおＦｏｋＩリン酸変異体（Ｒ４１６ＳおよびＫ５２５Ｓ）を有する、ＺＦＮを指す。「５７６１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」、「５７６９２−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」、「５５６２９−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓ」、および「５７７１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ」は、示されるＺＦＰ（それぞれ、５７６１８、５７６２９、５５６２９、および５７７１８）、および示される二量体化変異体（ＥＬＤまたはＫＫＲ）、なおＺＦＰリン酸接触変異体（ｎＲ−５Ｑａｂｃ）とＦｏｋＩリン酸接触変異体（Ｒ４１６ＳおよびＫ５２５Ｓ）との組み合わせを有する、ＺＦＮを指す。図１Ａおよび１Ｂは、意図される部位（オンターゲット）およびオフターゲット部位における、二量体化変異体（ＥＬＤおよびＫＫＲ）、ＺＦＰリン酸接触変異体（ｎＲ−５Ｑａｂｃ）、ならびにＦｏｋＩリン酸接触変異体（Ｒ４１６ＳおよびＫ５２５Ｓ）を含む、示される操作されたＦｏｋＩドメインによる、ＣＤ３４＋細胞におけるＩＬ２ＲＧ特異的ＺＦＮの活性の結果を示す図である。たとえば、米国特許第８，６２３，６１８号および米国出願第１５／６８５，５８０号を参照されたい。図１Ａは、示される対を使用した、オンターゲット（意図される）部位におけるインデルパーセント（「インデル％」）を示す。図１Ｂは、示される対を使用した、オンターゲット事象（インデル）のオフターゲット事象に対する比を示す。「５７６１８−ＥＬＤ」および「５７６２９−ＥＬＤ」は、表１の５７６１８または５７６２９（それぞれ）と表記されるＺＦＰが、ＦｏｋＩＥＬＤ二量体化変異体に融合したものを含む、ＺＦＮを指す。「５５６２９−ＫＫＲ」および「５７７１８−ＫＫＲ」は、表１の５５６２９または５７７１８（それぞれ）と表記されるＺＦＰが、ＦｏｋＩＫＫＲ二量体化変異体に融合したものを含む、ＺＦＮを指す。「５７６１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ」、「５７６２９−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ」、「５５６２９−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ」、および「５７７１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ」は、示されるＺＦＰ（それぞれ、５７６１８、５７６２９、５５６２９、および５７７１８）、および示される二量体化変異体（ＥＬＤまたはＫＫＲ）、なおＺＦＰリン酸接触変異体（ｎＲ−５Ｑａｂｃ）を有する、ＺＦＮを指す。「５７７１８−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓ」、「５７６２９−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」、「５５６２９−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓ」、および「５７６１８−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」は、示されるＺＦＰ（それぞれ、５７７１８、５７６２９、５５６２９、および５７６１８）、および示される二量体化変異体（ＥＬＤまたはＫＫＲ）、なおＦｏｋＩリン酸変異体（Ｒ４１６ＳおよびＫ５２５Ｓ）を有する、ＺＦＮを指す。「５７６１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」、「５７６９２−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤ−Ｋ５２５Ｓ」、「５５６２９−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓ」、および「５７７１８−ｎｒ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ」は、示されるＺＦＰ（それぞれ、５７６１８、５７６２９、５５６２９、および５７７１８）、および示される二量体化変異体（ＥＬＤまたはＫＫＲ）、なおＺＦＰリン酸接触変異体（ｎＲ−５Ｑａｂｃ）とＦｏｋＩリン酸接触変異体（Ｒ４１６ＳおよびＫ５２５Ｓ）との組み合わせを有する、ＺＦＮを指す。

修正用ＳＣＩＤ関連タンパク質（たとえば、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２）導入遺伝子の、細胞（たとえば、リンパ球前駆体、たとえば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）のＩＬ２ＲＧ遺伝子への組み込みによる修飾を含む、ＩＬ２ＲＧ遺伝子の標的化修飾のための組成物および方法が、本明細書に開示される。細胞は、重症複合免疫不全（Ｘ−ＳＣＩＤまたはＳＣＩＤ）患者への注入に好適であり、結果として、注入後に、この細胞によって、これらの前駆体の、ＳＣＩＤ障害を有する被験体において欠如または欠損している機能性タンパク質を発現する細胞へのｉｎｖｉｖｏでの分化がもたらされ、この細胞により、レシピエントＳＣＩＤ患者における疾患を処置および／または予防することができる。ＩＬ２ＲＧ導入遺伝子を含む細胞は、Ｘ−ＳＣＩＤ患者への注入に好適であり、結果として、注入後に、これらの幹細胞が、機能性ＩＬ２ＲＧタンパク質を発現する細胞にｉｎｖｉｖｏで分化することにより、患者におけるＸ−ＳＣＩＤ疾患が処置および／または予防されることになる。同様に、本明細書に記載されるＩＬ２ＲＧ遺伝子への標的化組み込みの後のＲＡＧ１またはＲＡＧ２導入遺伝子を含む幹細胞は、オーメン症候群患者への注入に好適であり、結果として、注入後に、これらの前駆体が、機能性Ｒａｇ１および／またはＲａｇ２タンパク質を発現する細胞にｉｎｖｉｖｏで分化することにより、オーメン症候群患者における疾患が処置および／または予防されることになる。加えて、本明細書に記載される細胞（細胞集団または細胞株）をｉｎｖｉｔｒｏで使用して、組み込まれた導入遺伝子からタンパク質を産生させることができ、このタンパク質を、単離し、被験体を処置するために使用することができる。

（たとえば、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、および／もしくはＲＡＧ２、ならびに／またはセーフハーバー（ｓａｆｅｈａｒｂｏｒ）遺伝子のイントロン領域への）ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２の標的化組み込みにより、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２の、ゲノムへのランダムな組み込みを伴う遺伝子療法、ならびにＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２のエクソンへの組み込みを伴う方法に付随する問題が回避される。具体的には、ランダムな組み込みは、遺伝子座の上流の領域が部分的に転写されることに起因して、有害事象を引き起こすことが多く、加えて、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、またはＲＡＧ２遺伝子座でのイントロン挿入は、内因性転写調節エレメント、たとえば、生来のＲＮＡスプライシング、プロモーター、およびエンハンサーを利用するため、これにより、最も低い侵襲性で、欠損した遺伝子座が正しい形態に置き換えられる。

本発明は、任意の機能性ＩＬ２ＲＧまたはＲａｇタンパク質の機能性断片、たとえば、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン２〜８、スプライシングアクセプター配列、およびポリアデニル化配列を含む部分的ｃＤＮＡを含め、任意の機能性ＩＬ２ＲＧまたはＲａｇタンパク質を含むドナーの組み込みを企図する。ＲＡＧ１またはＲＡＧ２の完全ｃＤＮＡを含む、ドナーの組み込みもまた、企図される。内因性ＩＬ２ＲＧのイントロン１へのＩＬ２ＲＧドナーの標的化組み込みにより、野生型ＩＬ２ＲＧまたは共通ガンマタンパク質の発現がもたらされ、これによって、Ｘ−ＳＣＩＤが処置または予防される。ＲＡＧ１またはＲＡＧ２ドナーの標的化組み込みにより、野生型Ｒａｇ１またはＲａｇ２の発現がもたらされ、これによって、オーメン症候群が処置または予防される。

概要
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに関連する分野における当業者の技能の範囲内の従来の技法を用いる。これらの技法は、文献において詳細に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９年、および第３版２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７年および定期的なアップデート；ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、１９９９年；およびＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「ＣｈｒｏｍａｔｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換可能に使用され、直鎖状または環状のコンフォメーション、ならびに一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的で、これらの用語は、ポリマーの長さに関する制限として解釈されるものではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（たとえば、ホスホロチオエート骨格）に修飾が行われているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換可能に使用される。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。

「結合すること」とは、高分子間（たとえば、タンパク質と核酸との間）における非共有結合による配列特異的な相互作用を指す。結合相互作用の構成要素は、全体としての相互作用が配列特異的である限り、必ずしもすべてが配列特異的である必要はない（たとえば、ＤＮＡ骨格においてリン酸残基と接触する）。そのような相互作用は、一般に、１０^−６Ｍ^−１またはそれよりも低い解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、低いＫ_ｄと相関する。

「結合ドメイン」は、非共有結合的に別の分子に結合することができる分子である。結合分子は、たとえば、ＤＮＡ分子に結合することができる（ＤＮＡ結合タンパク質、たとえば、亜鉛フィンガータンパク質もしくはＴＡＬエフェクタードメインタンパク質または一本鎖ガイドＲＮＡ）、ＲＮＡ分子に結合することができる（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子に結合することができる（タンパク質結合タンパク質）。タンパク質結合分子の事例では、結合分子は、それ自体と結合することができる（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または１つもしくは複数の異なるタンパク質分子に結合することができる。結合分子は、１種を上回る結合活性を有し得る。たとえば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。したがって、人工ヌクレアーゼおよび転写因子のＤＮＡ結合構成要素を含め、ＤＮＡ結合分子としては、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、およびｓｇＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つまたは複数の亜鉛フィンガーを通じて、配列特異的な様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインであり、亜鉛フィンガーとは、亜鉛イオンの配位を通じてその構造が安定化される、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（ＺＦＮについてはヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ−ＴＦについては転写調節ドメイン）を含み得る。「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」という用語には、１つのＺＦＮ、ならびに二量化して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対が含まれる。

「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含む、ポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的に、３３〜３５個のアミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともいくらかの配列相同性を呈する。たとえば、米国特許８，５８６，５２６号を参照されたい。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（ＴＡＬＥＮについてはヌクレアーゼドメインまたはＴＡＬＥ−ＴＦについては転写調節ドメイン）を含み得る。「ＴＡＬＥＮ」という用語には、１つのＴＡＬＥＮ、ならびに二量体化して標的遺伝子を切断するＴＡＬＥＮの対が含まれる。

亜鉛フィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、たとえば、天然に存在する亜鉛フィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を改変すること）によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（亜鉛フィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作する方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、天然には存在しないタンパク質であり、その設計／組成は、主として、合理的基準から生じる。設計の合理的基準としては、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶しているデータベースにおける情報を処理するためのコンピュータによるアルゴリズムが挙げられる。たとえば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、および同第８，５８５，５２６号；また、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。

「選択された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、自然界では見出されないタンパク質であり、その産生は、主として、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる。たとえば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、同第８，５８６，５２６号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。たとえば、Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、（２０１３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１１巻、６５２頁を参照されたい）。「ＴｔＡｇｏ系」は、たとえば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされるすべての構成要素である。

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間での遺伝子情報の交換のプロセスを指し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれに限定されない。本開示の目的で、「相同組換え（ＨＲ）」とは、たとえば、相同組換え修復機序による細胞における二本鎖切断の修復中に生じる、そのような交換の特別な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性が必要であり、「ドナー」分子を使用して、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の修復の鋳型とし、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。なぜなら、これが、ドナーから標的への遺伝子情報の移行をもたらすためである。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、そのような移行は、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーを使用して遺伝子情報が再合成され、これが、標的の一部となる、「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。そのような特別なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが、標的ポリヌクレオチドに取り込まれるような、標的分子の配列の改変をもたらすことが多い。

本開示の方法では、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位において、標的配列（たとえば、細胞クロマチン）に、二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす。ＤＳＢは、相同組換え修復によって、または非相同組換え修復機序によって、欠失および／または挿入をもたらし得る。欠失には、任意の数の塩基対が含まれ得る。同様に、挿入には、たとえば、必要に応じて切断の領域内のヌクレオチド配列に対して相同性を有する、「ドナー」ポリヌクレオチドの組み込みを含む、任意の数の塩基対が含まれ得る。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよく、または代替として、ドナーポリヌクレオチドが、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用され、結果として、ドナーにあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部が、細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチンにおける第１の配列は、改変され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換され得る。したがって、「置き換える」または「置換え」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の、別のものとの置換え（すなわち、情報的な意味での配列の置換え）を表すと理解することができ、必ずしも、１つのポリヌクレオチドの別のものとの物理的または化学的置換えを必要とするものではない。

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、追加の対の亜鉛フィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断に使用することができる。

本明細書に記載される方法のいずれかを、任意のサイズのドナーの挿入、および／または目的の遺伝子の発現を破壊するドナー配列の標的化組み込みによる細胞における１つもしくは複数の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた、提供される。

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域におけるゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含有し、それによって、目的の領域に非同一配列を挿入するための相同組換えを刺激することができる。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域における配列に相同であるドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％（またはその間の任意の整数値）の間の配列同一性を呈する。他の実施形態では、ドナーとゲノム配列との間の相同性は、たとえば、１００個の連続した塩基対にわたって、１個のヌクレオチドだけがドナーとゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の事例では、ドナー配列の非相同性部分は、目的の領域には存在しない配列を含有してもよく、結果として、新しい配列が、目的の領域に導入されることになる。これらの事例では、非相同性配列は、一般に、目的の領域の配列と相同または同一である、５０〜１，０００塩基対（またはその間の任意の整数値）または１，０００よりも多い任意の数の塩基対の配列が、隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に非相同であり、非相同組換え機序によってゲノムに挿入される。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むがこれらに限定されない様々な方法によって、開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、二本鎖ＤＮＡの標的化切断に使用される。

「切断ハーフドメイン」は、ポリペプチド配列であり、第２のポリペプチド（同一であるか異なるかのいずれか）とともに、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−の切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左の切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指して互換可能に使用される。

「操作された切断ハーフドメイン」とは、別の切断ハーフドメイン（たとえば、別の操作された切断ハーフドメイン）と絶対ヘテロ二量体を形成するように、修飾されている、切断ハーフドメインである。第８，６２３，６１８号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、および同第８，０３４，５９８号（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）もまた参照のこと。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、これは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、直鎖状であっても、環状であっても、分岐状であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さのもの、たとえば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチドの長さ（またはその間もしくはそれを上回る任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１００，０００ヌクレオチドの長さ（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２０００〜２０，０００ヌクレオチドの長さ（またはその間の任意の値）、およびさらにより好ましくは、約５〜１５ｋｂ（またはその間の任意の値）のものであってもよい。

「クロマチン」とは、細胞のゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、主としてＤＮＡである核酸、およびタンパク質を含み、タンパク質には、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質が含まれる。真核生物の細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ここで、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を２つずつ含む八量体を伴うおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて長さは可変のもの）が、ヌクレオソームコアの間に延びている。ヒストンＨ１分子は、一般に、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的で、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方の、すべての種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームの両方のクロマチンを含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部分を含む、クロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その核型によって特徴付けられることが多く、この核型とは、細胞のゲノムを構成するすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。

「エピソーム」とは、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造体である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。

「接触可能領域」は、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチンの部位である。いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、接触可能領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされないものであると考えられている。接触可能領域のはっきりとした構造は、化学的および酵素的なプローブ、たとえば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出することができることが多い。

「標的部位」または「標的配列」とは、結合のための十分な条件が存在する場合に限るが、結合分子が結合する核酸の部分を定める、核酸配列である。標的部位は、任意の長さ、たとえば、９〜２０個またはそれよりも多いヌクレオチドであってよく、長さおよび結合するヌクレオチドは、連続的であっても非連続的であってもよい。

「外因性」分子とは、通常は細胞に存在していないが、１つまたは複数の遺伝的方法、生化学的方法、または他の方法によって、細胞に導入することができる、分子である。「細胞に通常存在している」とは、細胞の特定の発生段階および環境的条件に関して、決定される。したがって、たとえば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関しては、外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関しては、外因性分子である。外因性分子は、たとえば、機能障害性内因性分子の機能性バージョンまたは正常機能性内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。

外因性分子は、とりわけ、小分子、たとえば、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの、または高分子、たとえば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上述の分子の任意の修飾誘導体、もしくは上述の分子のうちの１つもしくは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状であっても、分岐状であっても、環状であってもよく、任意の長さのものであってよい。核酸には、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖を形成する核酸が含まれる。たとえば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼ、およびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、たとえば、外因性タンパク質または核酸であり得る。たとえば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在していない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入する方法は、当業者に公知であり、その方法としては、脂質に媒介される移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介される移入、およびウイルスベクターに媒介される移入が挙げられるが、これらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子であるが、細胞が由来するものとは異なる種に由来するものであってもよい。たとえば、ヒト核酸配列を、もともとマウスまたはハムスターに由来する細胞株に、導入してもよい。外因性分子を植物細胞に導入するための方法は、当業者に公知であり、その方法としては、プロトプラスト形質転換、シリコンカーバイド（たとえば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介される形質転換、脂質に媒介される移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝突（たとえば、「遺伝子銃」を使用する）、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介される移入、ならびにウイルスベクターに媒介される移入が挙げられるが、これらに限定されない。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下において、特定の発生段階で、特定の細胞に通常存在しているものである。たとえば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体、もしくは他の小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子としては、タンパク質、たとえば、転写因子および酵素を挙げることができる。

本明細書において使用されるとき、「外因性核酸の産物」という用語には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、たとえば、転写産物（ポリヌクレオチド、たとえば、ＲＮＡ）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。

「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結された、分子である。サブユニット分子は、同じ化学種の分子であってもよく、または異なる化学種の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例としては、融合タンパク質（たとえば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、１つまたは複数の活性化ドメインとの間の融合体）、および融合核酸（たとえば、上に記載される融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合体、および副溝結合剤と核酸との間の融合体が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達により生じ、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写産物が翻訳されて、融合タンパク質が生成される。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法は、本開示の別の箇所に提示されている。

本開示の目的で、「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域が含まれ、そのような調節配列が、コーディング配列および／または転写される配列に隣接しているかどうかは関係ない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、たとえば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリクス結合部位、ならびに遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれている情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写の産物（たとえば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されているＲＮＡ、ならびにたとえば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されているタンパク質も含まれる。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節としては、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。ゲノム編集（たとえば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した場合の、遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的であっても完全であってもよい。

「目的の領域」とは、外因性分子に結合することが望ましい、細胞クロマチンの任意の領域、たとえば、遺伝子または遺伝子内もしくはそれに隣接する非コーディング配列などである。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えを目的とするものであり得る。目的の領域は、たとえば、染色体、エピソーム、小器官ゲノム（たとえば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコーディング領域内、転写される非コーディング領域内、たとえば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロンなど、またはコーディング領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内などであり得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小さなものであってもよく、または最大２，０００個のヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。

「真核生物」細胞としては、幹細胞（多能性および複能性）を含め、真菌細胞（たとえば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞（たとえば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。

「動作可能な連結」および「動作可能に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、２つまたはそれよりも多くの構成要素（たとえば、配列エレメント）の並置に関して互換可能に使用され、ここで、構成要素は、両方の構成要素が、正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性を許容する。例示の目的で、転写調節配列、たとえば、プロモーターは、転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コーディング配列の転写のレベルを制御する場合、コーディング配列に動作可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コーディング配列とｃｉｓで動作可能に連結しているが、必ずしもそれに直接隣接していなくてもよい。たとえば、エンハンサーは、連続的でなくとも、コーディング配列に動作可能に連結された、転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、「動作可能に連結した」という用語は、構成要素のそれぞれが、他の構成要素と連結した状態で、そのように連結されてない場合に行うであろう機能と同じ機能を行うという事実を指し得る。たとえば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメインが、活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、同時に、活性化ドメインが、遺伝子発現を上方調節することができる場合、動作可能な連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメインが、切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、同時に、切断ドメインが、標的部位の近傍で、ＤＮＡを切断することができる場合、動作可能な連結状態にある。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能性断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、依然として、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能性断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（たとえば、コーディング機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も、周知である。たとえば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、たとえば、フィルター結合、電気泳動移動度のシフト、または免疫沈降アッセイによって、決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照されたい。タンパク質が、別のタンパク質と相互作用する能力は、たとえば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的および生化学的両方の相補性によって、決定することができる。たとえば、Ｆｉｅｌｄｓら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４０巻：２４５〜２４６頁、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を誘導することができ、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターが含まれる。

「被験体」および「患者」という用語は、互換可能に使用され、哺乳動物、たとえば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、たとえば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物を指す。したがって、「被験体」または「患者」という用語は、本明細書において使用されるとき、本発明のヌクレアーゼ、ドナー、および／または遺伝子修飾された細胞が投与され得る任意の哺乳動物患者または被験体を意味する。本発明の被験体には、障害を有するものが含まれる。

「幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」とは、任意の細胞が、幹細胞様の様式で機能する相対能力、すなわち、任意の特定の幹細胞が有し得る、全能性、多能性、または少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔｃｙ）、ならびに拡大したまたは無限の自己複製の程度を指す。

融合分子
細胞における選択された標的遺伝子（たとえば、ＩＬ２ＲＧ）の切断に有用な組成物、たとえば、ヌクレアーゼが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、融合分子（たとえば、ヌクレアーゼ）のうちの１つまたは複数の構成要素は、天然に存在する。他の実施形態では、融合分子（たとえば、ヌクレアーゼ）の構成要素のうちの１つまたは複数は、天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合分子および／または切断ドメインにおいて、操作されている。たとえば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分を、選択された標的部位に結合するように改変してもよい（たとえば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはメガヌクレアーゼの一本鎖ガイドＲＮＡ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む（たとえば、異種切断ドメインを有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）。したがって、少なくとも１つのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどを含むがこれらに限定されない、標的（たとえば、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧなど）遺伝子を切断し、その切断が、標的遺伝子のゲノム修飾（たとえば、切断された遺伝子への挿入および／または欠失）をもたらす、任意のヌクレアーゼを、本発明の実施に使用することができる。

ヌクレアーゼ複合体の操作された切断ハーフドメインのパートナーの独立した滴定を通じて、切断活性の特異性を増加させる方法もまた、本明細書に記載される。一部の実施形態では、２つのパートナー（切断ハーフドメイン）の比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０、または１：２０の比、またはそれらの間の任意の値で提供される。他の実施形態では、２つのパートナーの比は、１：３０を上回る。他の実施形態では、２つのパートナーは、１：１とは異なるように選択された比で、展開される。個別または組み合わせて使用する場合、本発明の方法および組成物は、オフターゲット切断活性の低減を通じて、標的化特異性の驚くべきかつ予想外な増加をもたらす。これらの実施形態において使用されるヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ、およびＴｔＡｇｏ、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。

Ａ．ＤＮＡ結合分子
本明細書に記載される融合分子は、タンパク質ドメインおよび／またはポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインを含む、任意のＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される）を含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１または配列番号２の９〜１２個の連続したヌクレオチドを含む配列に結合する。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノムにおける目的の領域への結合に、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを用いる。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、次の４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリー。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ、（１９９６年）、ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．、１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓのカタログもまた、参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、（２００２年）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、１０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら、（２００６年）、Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら、（２００７年）、ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、７巻：４９〜６６頁；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼの文脈で全体として改変されてもよく（すなわち、ヌクレアーゼが、同族切断ドメインを含むように）、または異種切断ドメインに融合されてもよい。

他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用されるヌクレアーゼのうちの１つまたは複数のもののＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。たとえば、米国特許第８，５８６，５２６号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。植物病原性細菌であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属は、重要な作物において多数の疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５種類を上回る異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがあり、これは、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する（Ｋａｙら、（２００７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられているＴＡＬエフェクターのうちの１つが、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら、（１９８９年）、ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ、２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデム反復の集中ドメインを含有し、それぞれの反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となるおよそ３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説については、ＳｃｈｏｒｎａｃｋＳら、（２００６年）ＪＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。加えて、植物病原細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００において、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら、（２００７）、ＡｐｐｌａｎｄＥｎｖｉｒＭｉｃｒｏ、７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いに、ヌクレオチド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５塩基対の欠失が異なる。しかしながら、いずれの遺伝子産物も、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーのタンパク質と、４０％よりも低い配列同一性を有する。たとえば、米国特許第８，５８６，５２６号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。反復配列は、およそ１０２塩基対を含み、反復は、典型的に、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。反復の多型性は、通常、１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変二残基（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列における連続的なヌクレオチドの正体との間に、１対１対応が存在すると見られる（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０１頁、ならびにＢｏｃｈら、（２００９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合反復は、植物細胞において新しい配列と相互作用し、非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる、人工転写因子を作製するために、新しい組み合わせおよび反復の数でタンパク質にアセンブリされている（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結され、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）が得られている。たとえば、米国特許第８，５８６，５２６号、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、（（２０１０年）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓｅｐｕｂ１０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されるように、Ｎキャップおよび／またはＣキャップを含む。

ある特定の実施形態では、ｉｎｖｉｖｏでの切断および／または細胞のゲノムの標的化切断に使用されるヌクレアーゼのうちの１つもしくは複数のもののＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。好ましくは、亜鉛フィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するように操作されているという点で、天然に存在しない。たとえば、Ｂｅｅｒｌｉら、（２００２年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら、（２００１年）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら、（２００１年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら、（２００１年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら、（２０００年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号（これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

操作された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有し得る。操作方法としては、合理的な設計および様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的な設計としては、たとえば、三つ組（ｔｒｉｐｌｅｔ）（または、四つ組（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、ここで、それぞれの三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合する亜鉛フィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられている。たとえば、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、ならびにＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインの結合特異性の強化は、たとえば、共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されているように、亜鉛フィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、たとえば、５個またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して、一緒に連結させることができる。６個またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間に任意の組み合わせの好適なリンカーを含み得る。

ＺＦＰは、１つまたは複数のヌクレアーゼ（切断）ドメインに作動可能に会合（連結）して、ＺＦＮを形成することができる。「ＺＦＮ」という用語には、二量体化して標的遺伝子を切断する、ＺＦＮの対が含まれる。意図される標的に対する、ヌクレアーゼ対を含めたＺＦＮの特異性を、オフターゲット部位として公知の他の意図されない切断部位と比べて増加させるための方法および組成物もまた、使用することができる（米国特許出願１５／６８５，５８０を参照されたい）。したがって、本明細書に記載されるヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ結合ドメイン骨格領域のうちの１つもしくは複数における変異、ならびに／またはそれらのヌクレアーゼ切断ドメインにおける１つもしくは複数の変異を含み得る。これらのヌクレアーゼは、ＤＮＡ骨格上のホスフェートと非特異的に相互作用し得るＺＦＰＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸に対する変異を含み得るが、それらは、ＤＮＡ認識ヘリックスには変化を含まない。したがって、本発明は、ヌクレオチド標的特異性には必要でないＺＦＰ骨格におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を、中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの変異は、極性アミノ酸残基を、中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。好ましい実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して、（−５）位、（−９）位、および／または（−１４）位に行われる。一部の実施形態では、亜鉛フィンガーは、（−５）、（−９）、および／または（−１４）に１つまたは複数の変異を含み得る。さらなる実施形態では、マルチフィンガーの亜鉛フィンガータンパク質における１つまたは複数の亜鉛フィンガーは、（−５）、（−９）、および／または（−１４）に変異を含み得る。一部の実施形態では、（−５）、（−９）、および／または（−１４）のアミノ酸（たとえば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、および／またはグルタミン（Ｑ）に変異される。

一部の態様では、ＤＮＡ結合ドメイン（たとえば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）は、ＩＬ２ＲＧまたはＲＡＧ遺伝子を標的とする。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＬ２ＲＧまたはＲＡＧ遺伝子のイントロン領域、たとえば、イントロン１またはイントロン２を標的とする。

標的部位の選択（たとえば、ＩＬ２ＲＧまたはＲＡＧ遺伝子のイントロン領域内）；ＺＦＰならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。たとえば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許公開第２０１５００５６７０５号を参照されたい。この系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．、１巻：ｅ６０頁）により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列が構成されている。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組み合わせ、ならびにＣＲＩＳＰＲに媒介される核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コーディングＲＮＡエレメントを含む。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられている系の１つであり、４つの逐次的なステップで、標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コーディングＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識の追加の要件である標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的プロトスペーサーとの間のワトソンクリック塩基対合によって、標的ＤＮＡへと指向させる。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内での二本鎖切断が生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と称されるプロセスにおける、将来の攻撃を予防するためのＣＲＩＳＰＲアレイへの外来ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）ＲＮＡに媒介される外来核酸の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入などの機能において役割を果たす。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」には、限定せずに天然配列の断片、ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が含まれる。ただし、対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有することを条件とする。本明細書において企図される生物学的活性とは、機能性誘導体が、ＤＮＡ基質を加水分解して断片にする能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合修飾体、およびその融合体を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合体、共有結合修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含む、Ｃａｓタンパク質は、細胞から得ることができる場合もあり、または化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組み合わせによって得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよく、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または内因性Ｃａｓと同じかもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってもよい。一部の事例では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介した送達のための小さなＣａｓ９オルソログである（Ｒａｎら、（２０１５年）、Ｎａｔｕｒｅ、５１０巻、１８６頁）。

一部の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書、Ｓｈｅｎｇら、同書を参照されたい）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、アルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは、スモール（１９〜３１ヌクレオチド）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、スモールＲＮＡと標的との間のワトソンクリック塩基対合を介して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖分解的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に切断する（Ｖｏｇｅｌ、（２０１４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（しばしばウイルス）ＤＮＡを検出し、それを除去するように機能する可能性が高い（Ｙｕａｎら、（２００５年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、１９巻、４０５頁；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら、（２０１３年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ５１巻、５９４頁；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものが挙げられる。

最もよく特徴付けられている原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（ＴｔＡｇｏ、Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する、１５ヌクレオチドまたは１３〜２５ヌクレオチドのいずれかの一本鎖ＤＮＡ断片に会合する。ＴｔＡｇｏが結合したこの「ガイドＤＮＡ」は、第三者のＤＮＡ分子においてワトソンクリック相補性ＤＮＡ配列に結合するように、タンパク質−ＤＮＡ複合体を誘導するように働く。これらのガイドＤＮＡにおける配列情報により、標的ＤＮＡの特定が可能となると、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。このような機序は、その標的ＤＮＡに結合している間のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても補助される（Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓに由来するＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、同様の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性は、ガイドＤＮＡによって誘導されるため、外因性のインベスティゲーター（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ）により指定されたガイドＤＮＡを用いて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、相補的なインベスティゲーターにより指定された標的ＤＮＡへと指向させる。このようにして、ＤＮＡに標的化二本鎖切断が生じ得る。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物に由来するオルソログＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内でのゲノムＤＮＡの標的化切断が可能となる。そのような切断は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断については、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたバージョンのＴｔＡｇｏコドンを使用することが好ましいであろう。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合されているｉｎｖｉｔｒｏで形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で、細胞を処置することが好ましい場合がある。さらに、摂氏３７度で改善された活性を有するように変異誘発によって改変されているバージョンのＴｔＡｇｏタンパク質を使用することが、好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡに媒介されるＤＮＡ切断は、ＤＮＡ切断の利用の分野における標準的な技法を使用して、遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子修正、標的化遺伝子欠失を含む多数の結果に影響を与えるために使用することができる。

このように、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）、特に、ＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ導入遺伝子を挿入することが所望される任意の遺伝子において、標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合分子を含む。

Ｂ．切断ドメイン
任意の好適な切断ドメインを、ＤＮＡ結合ドメインに動作可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。たとえば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮが作製されており、ＺＦＮは、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを通じてその意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡをＺＦＰ結合部位の近傍で切断させることができる機能性実体であり、これには、様々な生物におけるゲノム修飾での使用が含まれる。たとえば、米国特許公開第７，８８８，１２１号、同第８，６２３，６１８号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、および同第８，０３４，５９８号、並び米国公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮが作製されている。たとえば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってもよく、たとえば、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼに由来する切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮＤＮＡ結合ドメインと切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメインであってもよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（たとえば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。これらの酵素のうちの１つまたは複数（またはその機能性断片）を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。

同様に、切断ハーフドメインは、上述のように、任意のヌクレアーゼまたはその部分に由来し得、切断活性には二量体化が必要である。一般に、融合タンパク質が、切断ハーフドメインを含む場合は、切断に、２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が、使用され得る。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよく、またはそれぞれの切断ハーフドメインが、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよい。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質がそれらのそれぞれの標的部位に結合することで、切断ハーフドメインが、たとえば二量体化によって機能性切断ドメインを形成することが可能となるような空間的配向に置かれるように、互いに対して配置されることが好ましい。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近傍端部は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ離れている。しかしながら、任意の整数値のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在していてもよい（たとえば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれよりも多く）。一般に、切断の部位は、標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多数の種に存在しており、ＤＮＡに配列特異的に結合すること（認識部位において）、および結合の部位もしくはその近傍でＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（たとえば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。たとえば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上の認識部位から９ヌクレオチドで、および他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。たとえば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉら、（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら、（１９９４年ａ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら、（１９９４年ｂ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作されていても操作されていなくてもよい１つまたは複数の亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。

その切断ドメインが、結合ドメインから分離可能である、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら、（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的で、本開示の融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化された二本鎖切断および／または標的化された細胞配列の置換えのために、それぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。あるいは、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子もまた、使用することができる。亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用した標的化切断および標的化配列改変のためのパラメーターは、本開示の他の箇所に提供されている。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（たとえば、二量体化）して、機能性切断ドメインを形成する能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されており、これは、参照により本明細書に組み入れられる。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは、本開示によって企図される。たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００３年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。

ある特定の実施形態では、切断ドメインは、たとえば、米国特許公開第８，６２３，６１８号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９１４，７９６号、および同第８，０３４，５９８号、ならびに米国公開第２０１１０２０１０５５号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防止する、１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含み、これらのすべての文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は、すべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。

ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、ＦｏｋＩに由来し、以下に示される野生型全長ＦｏｋＩに対して付番された４１６、４２２、４４７、４４８、および／または５２５のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数に、１つまたは複数の変異を含む（たとえば、米国出願第１５／６８５，５８０号を参照されたい）。
これらの変異は、ＦｏｋＩドメインとＤＮＡ分子との間の非特異的な相互作用を減少させる。他の実施形態では、ＦｏｋＩに由来する切断ハーフドメインは、アミノ酸残基４１４〜４２６、４４３〜４５０、４６７〜４８８、５０１〜５０２、および／または５２１〜５３１のうちの１つまたは複数における変異を含む。変異は、ＦｏｋＩに相同な天然の制限酵素において見出される残基に対する変異を含み得る。ある特定の実施形態では、変異は、置換、たとえば、野生型残基と、異なるアミノ酸、たとえば、セリン（Ｓ）との置換、たとえば、Ｒ４１６ＳまたはＫ５２５Ｓである。好ましい実施形態では、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、および／または５２５位における変異は、正に荷電したアミノ酸残基と、荷電していないかもしくは負に荷電したアミノ酸との置換えを含む。別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、１つまたは複数のアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６、および４８６における変異を含む。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基が、Ｇｌｕ（Ｅ）残基と置き換えられており、４９９位の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基が、Ｌｅｕ（Ｌ）残基と置き換えられており、４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基と置き換えられている（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）ポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。

１つを上回る変異、たとえば、一方の切断ハーフドメインにおける「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表記される操作された切断ハーフドメインをもたらす４９０位（ＥからＫ）および５３８位（ＩからＫ）における変異、ならびにもう一方の切断ハーフドメインにおける「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」変異と表記される操作された切断ハーフドメインをもたらす４８６位（ＱからＥ）および４９９位（ＩからＬ）の変異；４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基と置き換わり、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基と置き換わり、４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基と置き換わる変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）；４９０位、５３８位、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する付番）に変異、たとえば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基と置き換わり、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基と置き換わり、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基と置き換わる変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む操作された切断ハーフドメイン；ならびに／または４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する付番）に変異、たとえば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基と置き換わり、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基と置き換わる変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインと称される）を含む操作された切断ハーフドメインを有する切断ドメインを、使用してもよい。たとえば、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、および同第８，６２３，６１８号（これらの開示は、あらゆる目的で、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」変異を含む（Ｇｕｏら、（２０１０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸の標的部位において、ｉｎｖｉｖｏでアセンブルされてもよい（たとえば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物に発現されてもよく、または個々の構成要素が、たとえば、自己切断性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレームにおいて連結されていてもよいかのいずれかである。構成要素は、個別の亜鉛フィンガー結合ドメインであってもよく、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。

ヌクレアーゼは、たとえば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されるように、酵母に基づく染色体系において、使用前に活性をスクリーニングすることができる。

Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コーディング構成要素を含む：同一の直列反復（ＤＲ）が間に入るヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ゲノム操作を達成するためには、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら、（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ１２３１１４３を参照されたい）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を介して、または別個のＲＮＡとして、供給される。他の実施形態では、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を与える）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用をもたらす）に融合されて、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（一本鎖ガイドＲＮＡとも称される）が形成された、キメラＲＮＡが構築される。（Ｊｉｎｅｋ、同書；およびＣｏｎｇ、同書を参照されたい）。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｓｐｐにおいて特定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞において堅固なＤＮＡ干渉を媒介する、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１とＣａｓ９とは、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含め、多くの側面で異なっている（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄら、（２０１５年）、ＧｅｎｏｍＢｉｏ、１６巻：２５１頁を参照されたい）。Ｃａｓ９タンパク質とＣｐｆ１タンパク質との間の主要な差異は、Ｃｐｆ１が、ｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがって、ｃｒＲＮＡのみを必要とすることである。ＦｎＣｐｆ１ｃｒＲＮＡは、４２〜４４ヌクレオチドの長さ（１９ヌクレオチドの反復および２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、単一のステム−ループを含有し、これにより、二次構造を保持する配列の変化を許容する。加えて、Ｃｐｆ１ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が必要とする約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも著しく短く、ＦｎＣｐｆｌのＰＡＭ要件は、置換鎖における５’−ＴＴＮ−３’および５’−ＣＴＡ−３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１のいずれも、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を作製するが、Ｃａｓ９は、そのＲｕｖＣ様およびＨＮＨ様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端切断部を作製し、一方でＣｐｆ１は、ＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側に付着切断部を産生する。Ｃｐｆ１は、重要なシード領域から離れて付着切断部を作製するため、ＮＨＥＪにより標的部位が破壊されることがなく、したがって、Ｃｐｆ１は、確実に、所望されるＨＤＲ組換え事象が生じるまで、同じ部位を切断し続けることができる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物において、「Ｃａｓ」という用語には、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方のタンパク質が含まれることが理解される。したがって、本明細書において使用されるとき、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼ系および／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の両方を指す。

標的部位
上記で詳細に記載されるように、ＤＮＡ結合ドメインは、選択される任意の配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規な結合特異性を有し得る。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＩＬ２Ｒ２遺伝子またはＲＡＧ遺伝子（たとえば、ＲＡＧ１もしくはＲＡＧ２）、たとえば、遺伝子のイントロン（たとえば、イントロン１またはイントロン２）またはエクソン（たとえば、エクソン１）を標的とする。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、表２に示される配列内の９〜２０個またはそれよりも多くのヌクレオチド（連続的または非連続的）の標的部位に結合する。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、「セーフハーバー」遺伝子座、たとえば、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、ＡＬＢ、およびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６（たとえば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第８，５８６，５２６号、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６００６３２３１号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１２００１７２９０号、同第２０１１０２６５１９８号、同第２０１３０１３７１０４号、同第２０１３０１２２５９１号、同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号を参照されたい）、ならびに植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許ＵＳ８，３２９，９８６を参照されたい）を標的とする。

好適な標的遺伝子のさらなる非限定的な例としては、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（δ）グロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｕｎｇｔｉｎｇｉｎ）（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡＢ遺伝子、ＨＬＡＣ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、Ｒａｇ−１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子、および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。一部の態様では、ヌクレアーゼは、チェックポイント阻害剤遺伝子、たとえば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、阻害性リガンドのＢ７ファミリーの受容体に結合する、および／もしくはそれを切断するか、またはＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、およびキラー阻害剤受容体（ＫＩＲおよびＣ型レクチン受容体）を通じたシグナル伝達に関与する受容体もしくはリガンド遺伝子（Ｐａｒｄｏｌｌ、（２０１２年）、ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ、１２巻（４号）：２５２頁を参照されたい）、ＨＬＡ複合体遺伝子（クラスＩ：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、Ｂ２Ｍ；クラスＩＩ：ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＲＢ）もしくはＴＣＲ；ならびに／またはＨＬＡ複合体についてのペプチド負荷プロセスおよび抗原プロセシングに関与する産物をコードする遺伝子（たとえば、ＴＡＰ、タパシン、カルレティキュリン、カルネキシン、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、またはＥｒｐ５７）を切断する。たとえば、米国特許第８，９５６，８２８号および同第８，９４５，８６８号を参照されたい。

ドナー
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞のゲノムへの、外因性配列（たとえば、ＩＬ２ＲＧおよび／もしくはＲａｇタンパク質の任意の機能性断片、ならびに／または変異体野生型ＩＬ２ＲＧ配列を修正するドナーを含む、ＩＬ２ＲＧおよび／またはＲａｇタンパク質をコードする導入遺伝子）の、ヌクレアーゼに媒介される標的化組み込みに関する。上述のように、たとえば、指定される領域の欠失、および／または変異体遺伝子の修正、または野生型遺伝子の発現の増加のため外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも称される）の挿入。ドナー配列が、典型的に、それが配置されるゲノム配列とは同一ではないことは、容易に理解されよう。ドナー配列は、目的の位置における効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同性領域が隣接した非相同性配列（たとえば、導入遺伝子）を含有してもよく、または非相同組換え修復機序を介して組み込まれてもよい。たとえば、米国特許第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、および同第７，８８８，１２１号を参照されたい。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞ＤＮＡに相同性の複数の非連続領域を含み得る。さらに、目的の領域には通常存在していない配列の標的化挿入のために、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し、目的の領域にある配列に対して相同性の領域が隣接していてもよい。

ヌクレアーゼと同様に、ドナーは、任意の形態で導入することができる。ある特定の実施形態では、ドナーは、ＤＮＡおよび／またはウイルスベクターを使用して、当該技術分野において公知の方法によって、導入することができる。たとえば、米国特許第９，００５，９７３号、同第８，９３６，９３６号、および同第８，７０３，４８９号を参照されたい。ドナーは、二本鎖または一本鎖の形態で、細胞に導入することができる。ドナーは、環状または直鎖状の形態で、細胞に導入することができる。直鎖状の形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法によって、保護され得る（たとえば、エキソヌクレアーゼ的分解から）。たとえば、１つもしくは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが、一方もしくは両方の末端にライゲーションされる。たとえば、Ｃｈａｎｇら、（１９８７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら、（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、末端アミノ基の付加、ならびに修飾ヌクレオチド間連結、たとえば、例として、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、ドナーは、長さが１ｋｂを上回る、たとえば、２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）の配列（たとえば、コーディング配列、導入遺伝子とも称される）を含む。ドナーはまた、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位を含み得る。ある特定の実施形態では、ドナーは、少なくとも２つの標的部位、たとえば、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥＮ対、ＴｔＡｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。典型的に、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の切断のために、導入遺伝子配列の外側、たとえば、導入遺伝子配列に対して５’側および／または３’側にある。ヌクレアーゼ切断部位は、任意のヌクレアーゼに対するものであってよい。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位は、同じヌクレアーゼに対するものであり、内因性標的を切断し、そこに、切断されたドナーを、相同性非依存的方法によって組み込むために使用される。

ドナーは、その発現が、組み込み部位において、内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動させるプロモーターによって、駆動されるように、挿入され得る。しかしながら、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、たとえば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことが、明らかである。

ドナー分子は、内因性遺伝子のすべてが発現されるか、一部が発現されるか、一切発現されないように、内因性遺伝子に挿入することができる。一部の実施形態では、ＳＣＩＤ関連導入遺伝子は、変異体バージョンを修正するために、ＩＬ２ＲＧ遺伝子の内因性遺伝子座に組み込まれる（たとえば、ＳＣＩＤ関連遺伝子の機能性バージョンが欠如または欠損しているＳＣＩＤ患者に由来する細胞において）、たとえば、ＩＬ２ＲＧ導入遺伝子が、内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に、たとえば、Ｘ−ＳＣＩＤと関連する変異体ＩＬ２ＲＧのイントロン領域（たとえば、イントロン１）に、組み込まれる。他の実施形態では、ＳＣＩＤ関連導入遺伝子は、機能性ＩＬ２ＲＧまたはＲＡＧタンパク質（ＲＡＧ１および／またはＲＡＧ２）が発現されるように、ＩＬ２ＲＧ遺伝子の内因性遺伝子座に組み込まれる。したがって、ドナーは、機能性タンパク質を産生する任意のＳＣＩＤ関連タンパク質コード配列を含み得、これには、全長ＳＣＩＤ関連遺伝子（たとえば、ＩＬ２ＲＧ、ＲＡＧ１、および／またはＲＡＧ２）、ＳＣＩＤ関連遺伝子の部分的（機能性）配列（たとえば、ＩＬ２ＲＧのエクソン２〜８、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２のエクソン３など）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

さらに、発現には必要とされないが、外因性配列は、転写もしくは翻訳調節配列、または他の配列、たとえば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含み得る。加えて、スプライシングアクセプター配列が、含まれてもよい。例示的なスプライシングアクセプター部位配列は、当業者に公知であり、単なる例として、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号２２）（ヒトＨＢＢ遺伝子に由来）およびＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号２３）（ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子に由来）が挙げられる。

本明細書に記載されるドナー配列で運搬されるＳＣＩＤ関連導入遺伝子は、当該技術分野において公知の標準的な技法、たとえば、ＰＣＲを使用して、プラスミド、細胞、または他の供給源から単離され得る。使用するためのドナーには、環状スーパーコイル型、ほどけた環状型、直鎖状などを含む、様々な種類のトポロジーが含まれ得る。あるいは、これらは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学的に合成してもよい。加えて、ドナーは、メチル化されていてもよく、またはメチル化が欠如していてもよい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であってもよい。

本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然の塩基および／または骨格を含み得る。具体的には、目的の領域における転写休止の状態を達成するために、本明細書に記載される方法を使用して、メチル化シトシンを有するドナー分子の挿入を実行してもよい。

外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の目的とされる配列（外因性配列）を含み得る。例示的な外因性配列としては、任意のポリペプチドコーディング配列（たとえば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、および様々な種類の発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性（たとえば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色もしくは蛍光もしくは発光タンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質、強化型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞成長および／または遺伝子増幅の強化を媒介するタンパク質（たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとしては、たとえば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列のうちの１つもしくは複数のコピーが挙げられる。

一部の実施形態では、ドナーは、細胞における発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、このポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面もしくは核内受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記のもののいずれかの機能性断片が挙げられるが、これらに限定されない。コーディング配列は、たとえば、ｃＤＮＡであり得る。

ある特定の実施形態では、外因性配列は、標的化組み込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述）、および追加の機能性をコードする連結配列を含み得る。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカーなどが挙げられる。

ある特定の実施形態では、導入遺伝子としては、たとえば、変異型内因性配列を置き換えるための野生型遺伝子を挙げることができる。たとえば、野生型（または他の機能性）ＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ遺伝子配列が、遺伝子の内因性コピーが変異されている幹細胞のゲノムに挿入され得る。導入遺伝子は、内因性遺伝子座に挿入されてもよく、または代替として、セーフハーバー遺伝子座を標的としてもよい。

そのような発現カセットの構築は、本明細書の教示に従い、分子生物学の分野において周知の手法を利用する（たとえば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。発現カセットを使用してトランスジェニック動物を産生する前に、選択された制御エレメントに関連するストレス誘導因子に対する発現カセットの応答性を、発現カセットを好適な細胞株（たとえば、初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞株）に導入することによって、試験することができる。

さらに、発現には必要とされないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、たとえば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列も含み得る。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントを、レポーター遺伝子に作動可能に連結して、キメラ遺伝子（たとえば、レポーター発現カセット）を作製してもよい。

非コーディング核酸配列の標的化挿入もまた、達成することができる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的化挿入に使用することができる。

追加の実施形態では、ドナー核酸は、追加のヌクレアーゼ設計に特異的な標的部位である非コーディング配列を含み得る。続いて、追加のヌクレアーゼが、細胞に発現され得、それによって、元のドナー分子が切断され、別の目的とされるドナー分子の挿入によって修飾される。この様式では、ドナー分子の反復的な組み込みが生じ、特定の目的とされる遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座において形質を重ねることが可能となる。

細胞
このように、細胞に、ＳＣＩＤ関連導入遺伝子、すなわち、ＳＣＩＤにおいて欠如または欠損している機能性タンパク質を発現する導入遺伝子を含む、遺伝子修飾された細胞が本明細書に提供され、これには、本明細書に記載される方法によって産生された細胞（たとえば、Ｔ細胞または幹細胞）が含まれる。導入遺伝子は、１つまたは複数のヌクレアーゼを使用して、標的化された様式で、細胞のゲノムに組み込まれる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＩＬ２ＲＧ、たとえば、Ｘ−ＳＣＩＤ患者において見出される変異体ＩＬ２ＲＧ遺伝子に組み込まれる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、オーメン症候群の患者の処置および／または予防のための機能性ＲＡＧ遺伝子を含む。導入遺伝子は、ＩＬ２ＲＧの任意のイントロン領域またはエクソン領域、たとえば、イントロン１またはイントロン２に組み込まれていてもよい。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１または２のいずれかの側の５〜１０個のヌクレオチドにまたはその中に、組み込まれる。したがって、ＳＣＩＤ関連遺伝子のイントロン１またはイントロン２に組み込まれたＳＣＩＤ関連導入遺伝子（ＳＣＩＤにおいて欠如または欠損している機能性タンパク質を発現する）を含む、遺伝子修飾された細胞、ならびに遺伝子修飾を含むこれらの細胞の子孫である細胞が、本明細書に提供される。

ランダム組み込みとは異なり、標的化組み込みでは、確実に、導入遺伝子が、指定された遺伝子に組み込まれる。導入遺伝子は、標的遺伝子の任意の箇所に組み込まれていてもよい。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ヌクレアーゼ切断部位またはその近傍、たとえば、切断の部位の上流または下流の１〜３００（またはその間の任意の値）塩基対内、より好ましくは、切断部位のいずれかの側の１〜１００（またはその間の任意の値）塩基対内、さらにより好ましくは、切断部位のいずれかの側の１〜５０（またはその間の任意の値）塩基対内に、組み込まれる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む組み込まれる配列は、任意のベクター配列（たとえば、ウイルスベクター配列）を含まない。

細胞および細胞株を含むがこれらに限定されない任意の細胞型を、本明細書に記載されるように、ＩＬ２ＲＧ導入遺伝子を含むように遺伝子修飾することができる。本明細書に記載されるＩＬ２ＲＧ導入遺伝子を含有する細胞の他の非限定的な例としては、Ｔ細胞（たとえば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）、樹状細胞、Ｂ細胞、自家（たとえば、患者由来）または異種多能性幹細胞、全能性幹細胞、または複能性幹細胞（たとえば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、Ｘ−ＳＣＩＤ患者に由来するＣＤ３４＋細胞である。

本明細書に記載されるＳＣＩＤ関連タンパク質を発現する細胞は、障害を有する被験体において、たとえば、ｅｘｖｉｖｏ療法によって、ＳＣＩＤ（たとえば、Ｘ−ＳＣＩＤおよび／またはオーメン症候群）を処置および／または予防するのに有用である。ヌクレアーゼ修飾細胞を、拡大増殖させ、次いで、標準的な技法を使用して患者に再導入することができる。たとえば、Ｔｅｂａｓら、（２０１４年）、ＮｅｗＥｎｇＪＭｅｄ、３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい。幹細胞の事例では、被験体に注入した後、これらの前駆体の、機能性ＩＬ２ＲＧタンパク質を発現する細胞へのｉｎｖｉｖｏでの分化も生じる。本明細書に記載される細胞を含む医薬組成物もまた、提供される。加えて、細胞は、患者に投与する前に凍結保存してもよい。

本明細書に記載される細胞およびｅｘｖｉｖｏでの方法により、被験体（たとえば、哺乳動物被験体）におけるＳＣＩＤの処置および／または予防を提供し、継続的な予防的医薬品投与の必要性または同種骨髄移植もしくはガンマレトロウイルス送達などの危険性のある手順を排除する。そのため、本明細書に記載される本発明は、ＳＣＩＤを処置および／または予防する安全で費用効果的かつ時間効率の良い手段を提供する。

送達
本明細書に記載されるヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって送達することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、ｉｎｖｉｖｏで送達される。他の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、ＳＣＩＤ患者へのｅｘｖｉｖｏ送達に有用な修飾細胞を提供するために、単離細胞（たとえば、自家幹細胞または異種幹細胞）に送達される。

本明細書に記載されるヌクレアーゼを送達する方法は、たとえば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物はまた、ネイキッドＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）、ならびに構成要素の１つもしくは複数をコードする配列を含有するベクターを含む、任意の核酸送達機序を使用して送達することができる。プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなど、ならびにこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意のベクター系を使用することができる。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号、ならびに米国特許公開番号ＵＳ−２０１４−０３３５０６３−Ａ１（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）もまた参照のこと。さらに、これらの系のいずれも、処置に必要とされる配列のうちの１つまたは複数を含み得ることが、明らかであろう。したがって、１つまたは複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物が、細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じ送達系で運搬されてもよく、または異なる送達機序で運搬されてもよい。複数の系が使用される場合、それぞれの送達機序は、１つもしくは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列（たとえば、１つもしくは複数のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および／または１つもしくは複数のドナー構築物を運搬するｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）を含み得る。

従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を、細胞（たとえば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ネイキッド核酸、およびリポソームもしくはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは、細胞に送達した後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法の手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；ＶａｎＢｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Ｖｉｇｎｅ、ＲｅｓｔｏｒａｔｉｖｅＮｅｕｒｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Ｈａｄｄａｄａら、ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編）、（１９９５年）；ならびにＹｕら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。

核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、キャップされたＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によるＤＮＡの取込み強化が挙げられる。たとえば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションもまた、核酸の送達に使用することができる。

追加の例示的な核酸送達系としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ．（たとえば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されているものが挙げられる。リポフェクションは、たとえば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（たとえば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。一部の態様では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡとして送達され、導入遺伝子は、他のモダリティ、たとえば、ウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子などによって送達される。

標的化リポソーム、たとえば、免疫脂質複合体を含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（たとえば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Ｂｌａｅｓｅら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Ｂｅｈｒら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．、５巻：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Ｇａｏら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ａｈｍａｄら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。

さらなる送達方法としては、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達されるが、この場合、抗体の一方のアームが、標的組織に対する特異性を有し、他方が、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体が、ＥＤＶを標的細胞表面へと運び、次いで、ＥＤＶが、エンドサイトーシスによって細胞内に入る。細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）：６４３頁を参照されたい）。

操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸の送達にＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系を使用することは、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化させ、ウイルスのペイロードを核へと輸送するための高度に発展したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接的に投与されてもよく（ｉｎｖｉｖｏ）、またはウイルスベクターを使用して、細胞をｉｎｖｉｔｒｏで処置し、修飾した細胞を被験体に投与することもできる（ｅｘｖｉｖｏ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達のための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を用いると、宿主ゲノムへの組み込みが可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされることが多い。加えて、多数の異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。

レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことによって改変することができ、標的細胞の潜在的な標的集団が拡大される。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的に高いウイルス力価をもたらすことができる、レトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するｃｉｓ作用型の長い末端反復から構成される。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のｃｉｓ作用型ＬＴＲで十分であるため、これが、次に、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永続的な導入遺伝子の発現をもたらすために使用される。広範に使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、およびそれらの組み合わせが挙げられる（たとえば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多数の細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いることで、高い力価および高い発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、たとえば、核酸およびペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏでの遺伝子療法手順のために、細胞に標的核酸を形質導入するために使用されている（たとえば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含む、多数の刊行物に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０、ならびに偽型ＡＡＶ、たとえば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６を含む、任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。

現在のところ、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、臨床試験において、遺伝子移入に利用可能であり、これらは、形質導入剤を生成するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって不完全なベクターを補完することを伴うアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法の試験で使用された初めての治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターには、５０％またはそれを上回る形質導入効率が、観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス２型に基づく有望な代替的な遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）の末端逆位反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。効率的な遺伝子移入、および形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ、３５１巻：９１１７号１７０２〜３頁（１９９８年）；Ｋｅａｒｎｓら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにそれらのすべてのバリアントを含む、他のＡＡＶ血清型を、本発明により使用することができる。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生することができ、多数の異なる細胞型に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、ＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子と置き換わるように操作されており、結果として、複製欠損ベクターが、ヒト２９３細胞において増殖し、欠失した遺伝子機能がｔｒａｎｓで供給される。Ａｄベクターは、非分裂性の分化細胞、たとえば、肝臓、腎臓、および筋肉においてみられるものを含め、ｉｎｖｉｖｏで複数の種類の組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法に関係していた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験において遺伝子移入にアデノウイルスベクターを使用するさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Ｔｏｐｆら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染する能力のあるウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする、産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットで置き換えられている。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によって、ｔｒａｎｓで供給される。たとえば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要な、ＡＡＶゲノムに由来する末端逆位反復（ＩＴＲ）配列だけを有する。ウイルスＤＮＡが細胞株においてパッケージングされるが、これは、他のＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードするヘルパープラスミドを含有するが、ＩＴＲ配列は欠如している。細胞株はまた、ヘルパーとして、アデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、たとえば、熱処理によって低減することができ、熱処理に対しては、ＡＡＶよりもアデノウイルスの感受性が高い。

多数の遺伝子療法の適用では、遺伝子療法ベクターを、特定の組織型に対して高い特異性の程度で送達することが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面に、ウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾され得る。リガンドは、目的の細胞型に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。たとえば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）では、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することが、報告されている。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルスー標的細胞対に拡張することができる。たとえば、糸状ファージは、事実上あらゆる選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（たとえば、ＦＡＢまたはＦｖ）を呈するように操作することができる。上述の説明は、主として、ウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理は、非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みに好ましい、特定の取込み配列を含有するように操作することができる。

遺伝子療法ベクターは、典型的に、全身投与（たとえば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下、または頭蓋内注入）、以下に記載されるような局所適用、または肺吸入による、個々の被験体への投与によって、ｉｎｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、ｅｘｖｉｖｏで、細胞に、たとえば、個々の患者から外植された細胞（たとえば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検材料）または万能ドナーの造血幹細胞に送達され、続いて、通常はベクターを取り込んだ細胞を選択した後に、この細胞が患者に再度埋め込まれる。

ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）もまた、ｉｎｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接的に投与され得る。あるいは、ネイキッドＤＮＡを、投与してもよい。投与は、注射、注入、局所適用、吸入、およびエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、分子を血液または組織細胞との最終的な接触に誘導するために通常使用される経路のいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、かつ当業者に周知である。１つを上回る経路を使用して、特定の組成物を投与してもよいが、特定の経路が、別の経路よりも即時かつより有効な反応をもたらすことが多い場合がある。

本明細書に記載されるポリヌクレオチドの導入に好適なベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。たとえば、Ｏｒｙら、（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Ｄｕｌｌら、（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｙら、（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、（２０００年）、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許第８，９３６，９３６号を参照されたい。

薬学的に許容される担体は、投与される具体的な組成物、ならびに組成物を投与するために使用される具体的な方法によって、部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、利用可能な医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。

ヌクレアーゼをコードする配列およびドナー構築物が、同じ系を使用して送達されてもよく、または異なる系を使用して送達されてもよいことが、明らかであろう。たとえば、ドナーポリヌクレオチドは、ＡＡＶによって運搬されてもよく、一方で１つまたは複数のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによって運搬されてもよい。さらに、異なる系は、同じかまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与、および／または筋肉内注射によって投与され得る。複数のベクターを、同時に送達してもよく、または任意の逐次的順序で送達してもよい。

ｅｘｖｉｖｏ投与およびｉｎｖｉｖｏ投与の両方のための製剤としては、液体中の懸濁物または乳化した液体が挙げられる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤としては、たとえば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの混合物が挙げられる。加えて、組成物は、少量の補助物質、たとえば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を強化する他の試薬を含有し得る。

適用
本明細書に開示される方法および組成物は、ＳＣＩＤ関連障害（たとえば、Ｘ−ＳＣＩＤ、オーメン症候群）の治療法を、たとえば、ＳＣＩＤ障害において欠如または欠損しているタンパク質の提供を通じて、提供するためのものである。細胞は、ｉｎｖｉｖｏで修飾されてもよく、またはｅｘｖｉｖｏで修飾された後に、被験体に投与されてもよい。したがって、本方法および組成物は、ＳＣＩＤ障害の処置および／または予防を提供する。

ＳＣＩＤ関連導入遺伝子（たとえば、ＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧ導入遺伝子）の標的化組み込みを使用して、異常なＳＣＩＤ関連遺伝子を修正するか、野生型遺伝子を挿入するか、または内因性遺伝子の発現を変化させることができる。たとえば、Ｘ−ＳＣＩＤ患者において欠損しているＩＬ２ＲＧをコードする野生型導入遺伝子を、細胞に組み込み、機能性タンパク質を産生する細胞を得ることができる。同様に、オーメン症候群ＳＣＩＤ患者において欠損しているＲＡＧ遺伝子（たとえば、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２）をコードする野生型導入遺伝子を、細胞に組み込み、機能性Ｒａｇタンパク質を産生する細胞を得ることができる。ゲノム編集にはまた、欠陥のある内因性遺伝子における変異（たとえば、点変異）の修正、それによって、遺伝子の発現を修復し、障害を処置することも含まれ得る。

非限定的な例として、本明細書に記載される方法および組成物は、ＳＣＩＤの処置および／または予防に使用することができる。

以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態に関し、ここで、ヌクレアーゼは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。これは、単に例示目的のものにすぎず、他のヌクレアーゼ、たとえば、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／もしくは天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種切断ドメインとの融合体、ならびに／またはメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質との融合体を使用してもよいことが、理解されるであろう。たとえば、追加のヌクレアーゼは、配列番号１または２の９〜１２個の連続したヌクレオチドを含む配列に結合するように設計され得る。

（実施例１：ＩＬ２ＲＧに標的化された亜鉛フィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ））
ＩＬ２ＲＧに標的化された亜鉛フィンガータンパク質を、設計し、Ｕｒｎｏｖら、（２００５年）、Ｎａｔｕｒｅ、４３５巻（７０４２号）：６４６〜６５１頁；Ｐｅｒｅｚら、（２００８年）、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６巻（７号）：８０８〜８１６頁に本質的に記載され、米国特許第６，５３４，２６１号に記載されるように、ｍＲＮＡ、プラスミド、ＡＡＶ、またはアデノウイルスベクターに取り込ませた。表１は、例示的なＩＬ２ＲＧＺＦＰＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合ドメイン内の認識ヘリックス、およびこれらのＺＦＰの標的部位を示す（ＤＮＡ標的部位は、大文字で示し、非接触ヌクレオチドは、小文字で示す）。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位のヌクレオチドは、大文字で示し、非接触ヌクレオチドは、小文字で示す。また、当該技術分野において公知の方法に従って、表２に示されるＩＬ２ＲＧ配列に対して、ＴＡＬＥＮおよび／またはｓｇＲＮＡも設計する（たとえば、標的部位は、９〜２０個またはそれよりも多くの（配列番号１または配列番号２の９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、またはそれよりも多くの）ヌクレオチド（連続的または非連続的）を含む）。たとえば、米国特許第８，５８６，５２６号（ＴＡＬＥＮの正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）または非正準ＲＶＤを使用）および米国特許公開第２０１５００５６７０５号を参照されたい。

ＺＦＮ対のすべての組み合わせ（５５６２９と５７６１８、５７７１８と５７６２９、５５６２９と５７６２９、および５７７１８と５７６１８）を、切断活性に関して試験し、活性であることが見出された。これらの設計が、フィンガーモジュールのいずれかの間、および／またはＺＦＰと切断ドメインとの間に、正準もしくは非正準リンカー、またはＴＧＥＫＰ（配列番号１８）、ＴＧＥＲＧ（配列番号１９）、ＴＧＳＱＫＰリンカー（配列番号２０）（フィンガー間）などのリンカー、ならびに／または米国特許第９，３９４，５３１号に記載されるようなＺＦＰと切断ドメインとの間のリンカーを含むがこれらに限定されない、任意のリンカーを含み得ることが、明らかである。米国特許第８，７７２，４５３号および２０１５００６４７８９も参照されたい。

さらに、ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、およびＴＡＬＥＮ）のうちのいずれかは、操作された切断ドメイン、たとえば、米国特許第８，６２３，６１８号に開示されるヘテロ二量体（たとえば、ＥＬＤおよびＫＫＲの操作された切断ドメイン）ならびに／または米国出願第１５／６８５，５８０号に記載される４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、および／もしくは５２５位に１つもしくは複数の変異を有する切断ドメインを含み得る。これらの変異体を、本明細書に記載される例示的なＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと併せて使用した。

（実施例２：ＩＬ２ＲＧ標的化ヌクレアーゼの活性および特異性）
表１に示されるＺＦＮを、米国出願第１５／６８５，５８０号に記載されるように、ＦｏｋＩ二量体化変異体およびリン酸変異体を使用して、オンターゲットおよびオフターゲットの両方の標的部位を用いて、活性について評価した。

ＺＦＮを、図１に示されるように、様々な組み合わせで、ＣＤ３４＋において試験した。凍結乾燥した動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞を、１００ｎｇ／ｍＬＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＴＰＯを含有するＸ−ＶＩＶＯ１０培地において解凍し、３７℃で２日間増殖させた。次いで、細胞を、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡとともに、２０μｇ／ｍＬまたは４０μｇ／ｍＬの合計濃度で、ＢＴＸデバイスを使用してエレクトロポレーションした。細胞を、培養物中でさらに１日間回復させた後、次世代シーケンシングによるゲノムＤＮＡならびにインデル（ＮＨＥＪによる挿入および／または欠失）の分析のために、採取した。

図１に示されるように、すべてのＺＦＮは、意図された標的部位（オンターゲット）で活性であり、すべてが、オンターゲット部位において、オフターゲット部位よりも高い活性を示した。オンターゲット活性のオフターゲット活性に対する比が最も高かった組み合わせは、５７７１８−ｎＲ−５Ｑａｂｃ−ＫＫＲ−Ｋ５２５Ｓおよび５７６２９−ｎＲ−５Ｑａｂｃ−ＥＬＤであった。

したがって、ＩＬ２ＲＧに標的化されたＦｏｋＩ変異体（二量体化および／またはリン酸接触）を有するヌクレアーゼは、すべてが、高い特異性で標的遺伝子を切断することができる。

（実施例３：ヌクレアーゼ修飾ＣＤ３４＋細胞におけるメチルセルロースアッセイ）
実施例２において処置したＣＤ３４＋細胞の分化を、既述の標準的な手法（Ｇｅｎｏｖｅｓｅら、（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ、５１０巻（７５０４号）：２３５〜４０頁）を使用して、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ誘導性分化により生じるコロニー型のアッセイによって分析する：コロニー形成単位、赤血球（「ＣＦＵ−Ｅ」）；バースト形成単位、赤血球（「ＢＦＵ−Ｅ」）；コロニー形成単位、顆粒球／マクロファージ（「ＣＦＵ−ＧＭ」）、およびコロニー形成単位；顆粒球／赤血球／単球／マクロファージ（「ＣＦＵ−ＧＥＭＭ」）。簡単に述べると、ＣＤ３４＋細胞を、ゲノム修飾し、ｉｎｖｉｔｒｏでの回収を可能にし、次いで、メチルセルロース培地に播種し、２週間分化させた後、コロニーを分析する。

本明細書に記載されるＩＬ２ＲＧ修飾は、ＣＤ３４＋細胞を著しく損傷することはない。

（実施例４：標的化ＩＬ２ＲＧドナー挿入）
ＩＬ２ＲＧ遺伝子座への標的化組み込みもまた、行う。米国特許公開２０１６００３０４７７に示される例示的なＩＬ２ＲＧおよび／またはＲＡＧドナー構築物を、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して、ＣＤ３４＋細胞のＩＬ２ＲＧに組み込む。

細胞株におけるＩＬ２ＲＧの発現は、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用した修正用ＩＬ２ＲＧ導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性導入によってレスキューされるが、これには、内因性レベルに匹敵するレベルまでＩＬ２ＲＧ発現をレスキューすることが含まれる。

（実施例５：Ｅｘｖｉｖｏ方法）
既述のように（Ａｉｕｔｉら、（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１巻、１２３３１５１頁）、本明細書に記載されるＩＬ２ＲＧまたはＲＡＧ１を発現する、Ｘ−ＳＣＩＤまたはオーメン症候群の被験体から取得した遺伝子修飾された細胞、特に、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（患者由来のＣＤ３４＋細胞）を、それぞれ、既述のように（Ａｉｕｔｉら、同書）Ｘ−ＳＣＩＤまたはオーメン症候群の患者に、投与する。

本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

本開示は、理解の明確さの目的で、例証および例を用いていくらか詳細に提供されているが、当業者であれば、様々な変更および修正が、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく実施され得ることを理解するであろう。したがって、前述の説明および実施例は、制限とみなされるべきではない。

Claims

内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に１つまたは複数の挿入および／または欠失を含む、Ｔ細胞または幹細胞であって、前記挿入および／または前記欠失は、切断ドメインと、配列番号１または配列番号２の９個またはそれよりも多くのヌクレオチドを含む標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインとを含むヌクレアーゼによって作製されたものである、Ｔ細胞または幹細胞。
前記挿入および／または前記欠失が、前記内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子を不活性化させる、請求項１に記載の細胞。
外因性配列が、前記内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されている、請求項１または２に記載の細胞。
前記外因性配列が、ＩＬ２ＲＧまたはＲＡＧポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、請求項３に記載の細胞。
前記内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子が、変異体遺伝子であり、前記外因性配列が、機能性ＩＬ２ＲＧタンパク質が前記細胞から発現されるように、前記内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子における変異を修正する配列を含む、請求項３に記載の細胞。
前記ヌクレアーゼが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１から５のいずれかに記載の細胞。
前記ヌクレアーゼが、ポリヌクレオチドとして前記細胞に導入される、請求項１から６のいずれかに記載の細胞。
前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項７に記載の細胞。
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、請求項１から８のいずれかに記載の細胞。
前記ＺＦＮが、表１の単一の行に示される認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含む、請求項６から９のいずれかに記載の細胞。
前記細胞が、幹細胞である、請求項１から１０のいずれかに記載の細胞。
前記幹細胞が、造血幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１１に記載の細胞。
請求項１から１２のいずれかに記載の造血幹細胞を作製する方法であって、ヌクレアーゼを、細胞に導入することを含み、切断後に１つまたは複数の挿入および／または欠失が内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に導入されるように、前記ヌクレアーゼが、前記内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子を切断する、方法。
切断後に内因性配列が前記細胞のゲノムに導入されるように、外因性配列を前記細胞に導入することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
被験体におけるＳＣＩＤ関連障害を処置または予防する方法であって、前記被験体に、請求項３から１２のいずれかに記載の造血幹細胞の集団を導入することを含む、方法。
前記ＳＣＩＤ関連障害が、Ｘ−ＳＣＩＤまたはオーメン症候群である、請求項１５に記載の方法。