ES2681622T3 - Métodos, células y organismos - Google Patents
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- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Abstract
Un vector que comprende una secuencia de ADN flanqueada por sitios de recombinación específicos de sitio y/o elementos de transposón, en el que la secuencia comprende una secuencia nucleotídica expresable que codifica una endonucleasa Cas y uno o más ARNg que comprenden un ARNtracr.
Description
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endonucleasa entre la secuencia de endonucleasa Cas y un elemento de transposón.
- 70.
- La célula, animal o blastocito de una cualquiera de las oraciones 60 a 69 que comprende uno o más ARNg.
- 71.
- La célula, animal o blastocito de la oración 68, 69 o 70, en los que el o los ARNg están flanqueados en 5’ y 3’ por elementos de transposón (p.ej., elementos terminales piggyBac invertidos) o sitios de recombinación específicos de sitio (p.ej., loxP y/o un lox mutante, p.ej., Iox2272 o Iox511; o frt).
- 72.
- Uso de la célula, animal o blastocito de una cualquiera de las oraciones 60 a 71 en un método según una cualquiera de las oraciones 1 a 51 o 73.
- 73.
- Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método proporcionar ADNbc que comprende la primera y segunda hebras y
- (a)
- usar escisión de ácido nucleico mediada por endonucleasa Cas para crear un extremo de corte en la primera hebra en 3’ de un motivo PAM;
- (b)
- usar escisión de ácido nucleico mediada por endonucleasa Cas para crear un corte en la segunda hebra en una posición que corresponde a una posición en 3’ del extremo de corte de la hebra de la parte (a), cuyo corte está en 3’ del motivo PAM;
- (c)
- proporcionar un primer ARNg que hibrida con una secuencia en 5’ del motivo PAM en la hebra de la parte (a);
- (d)
- proporcionar un segundo ARNg que hibrida con una secuencia en 5’ del motivo PAM en la hebra de la parte (b);
en el que las hebras de ácido nucleico de la parte (a) y parte (b) se reparan produciendo una deleción de ácido nucleico entre los cortes.
- 74.
- El método de la oración 6, en el que la secuencia eliminada comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína.
- 75.
- El método de la oración 73 o 74, en el que la escisión mediada por endonucleasa Cas usada en la etapa (a)
o en la etapa (b) es mediante reconocimiento de un motivo PAM GG o NGG.
- 76.
- El método de la oración 75, en el que se usa una nicasa para cortar en la etapa (a) y/o en la etapa (b).
- 77.
- El método de la oración 73 o 74, en el que se usa una nucleasa para cortar en la etapa (a) y/o en la etapa (b).
- 78.
- El método de una cualquiera de las oraciones 74 a 77, en el que se lleva a cabo el método en una célula, p.ej. una célula eucariótica.
- 79.
- El método de la oración 78, en el que se lleva a cabo el método en una célula de mamífero.
- 80.
- El método de la oración 78, en el que la célula es un citoblasto embrionario o cigoto de roedor (p.ej., ratón).
- 81.
- El método de una cualquiera de las oraciones 74 a 80, en el que se lleva a cabo el método en un mamífero no humano, p.ej. un ratón o rata o conejo.
- 82.
- El método de una cualquiera de las oraciones 74 a 81, en el que cada sitio de escisión está flanqueado por un motivo PAM (p.ej., una secuencia NGG o NGGNG en la que N es cualquier base y G es una guanina).
- 83.
- Uso de un primer y un segundo ARNg para orientar a una parte deseada del ácido nucleico, que define la región para deleción, en un método según una cualquiera de las oraciones 74 a 82.
Breve descripción de las figuras
Figura 1A. Inserción de ADN precisa en una localización predefinida (KI): El ARNg diseñado frente a una localización predefinida puede inducir muesca de ADN usando nicasa Cas9 D10A en 5' de la secuencia de PAM (mostrada como un recuadro negro sólido). Como alternativa, puede usarse ARNg junto con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir roturas de ADN bicatenario en 5' de la secuencia de PAM. La adición de un oligo donante
o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología alrededor de la región del punto de rotura que contenga cualquier forma de alteraciones de ADN, incluyendo adición de ADN endógeno o exógeno, puede insertarse precisamente en la unión del punto de rotura donde se repara el ADN por HDR.
Figura 1B. Inserción de ADN precisa en una localización predefinida (KI): Esta figura muestra una descripción más detallada de los mecanismos descritos en la Figura 1A. El ARNsg diseñado frente a una localización predefinida puede inducir muesca de ADN usando nicasa Cas9 D10A en 5' de la secuencia de PAM (mostrada como un
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recuadro negro sólido). Como alternativa, puede usarse ARNsg junto con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir roturas de ADN bicatenario en 5’ de la secuencia de PAM. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con brazos de homología (HA) alrededor de la región del punto de rotura que contenga cualquier forma de alteraciones de ADN, incluyendo la adición de ADN endógeno o exógeno, puede insertarse precisamente en la unión de punto de rotura donde se repara el ADN por HDR.
Figura 2A. Deleción de ADN precisa (KO): Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de la secuencia PAM 2 guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR. La reparación de ADN por HDR reducirá el riesgo de formación de indeles en las uniones de punto de rotura y evitará la reparación de ADN mediante NHEJ, y al hacer esto, eliminará la región flanqueada por la secuencia de PAM y llevará a cabo la reparación de ADN de manera predeterminada y predefinida.
Figura 2B. Deleción de ADN precisa (KO): Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 2A. Los ARNsg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Nota: los PAM pueden localizarse en hebras de ADN opuestas a diferencia del ejemplo representado en la figura, en que ambos PAM están en la misma hebra de ADN. Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de la secuencia PAM 2 guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR. La reparación por HDR reducirá el riesgo de formación de indeles en las uniones de punto de rotura y evitará la reparación de ADN mediante NHEJ y, al hacer esto, eliminará la región flanqueada por la secuencia de PAM y llevará a cabo la reparación de ADN de manera predeterminada y predefinida.
Figura 3A: Deleción e inserción de ADN precisas (KO • KI): Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de PAM 2 con inclusión de ADN endógeno o exógeno guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la deleción concomitante de la región flanqueada por DSB o muesca y la inserción del ADN de interés.
Figura 3B: Deleción e inserción de ADN precisas (KO • KI): Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 3A. Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 y en 3’ de PAM 2 con inclusión de ADN endógeno o exógeno adicional (inserto de ADN) guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la deleción concomitante de la región flanqueada por DSB o muesca y la inserción del ADN interés. Nota: De nuevo, los PAM pueden localizarse en hebras de ADN opuestas a diferencia del ejemplo representado en la figura, en que ambos PAM están en la misma hebra de ADN.
Figura 4A: Reciclado de PAM para edición genómica secuencial (deleciones): Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 2 y en 3’ de PAM 3 guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR y, al hacer esto, eliminará la región entre PAM 2 y PAM 3. Esta deleción retendrá PAM 3 y por tanto actuará como sitio para llevar a cabo otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas. Puede usarse otro sitio de PAM (p.ej. PAM 1) junto con la secuencia de PAM 3 para llevar a cabo otra ronda de deleción como se describe anteriormente. Usando este enfoque de reciclado de PAM, pueden ejecutarse muchas rondas de deleciones en forma de deleción por etapas, en que PAM 3 se recicla después de cada ronda. Este enfoque puede usarse también para la adición por etapas de ADN endógeno o exógeno.
Figura 4B: Reciclado de PAM para edición genómica secuencial (deleciones): Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 4B. Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas. Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de un oligo donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología con la región en 5’ de PAM 1 (recuadro de PAM claro) y
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en 3’ de PAM 2 (recuadro de PAM negro) guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR y, al hacer esto, eliminará la región entre PAM 1 y PAM 2. La secuencia de PAM junto con el ARNg único puede incluirse en el ADN de intrusión y orientarse de vuelta al sitio de edición. Así, la secuencia PAM 1 puede reciclarse por ejemplo y por tanto actúa como sitio para llevar a cabo otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas. Puede usarse otro sitio de PAM (p.ej., PAM 3, recuadro de PAM gris) junto con la secuencia PAM 1 reciclada para llevar a cabo otra ronda de edición (concretamente inserción) como se describe anteriormente. Usando este enfoque de reciclado de PAM, pueden ejecutarse muchas rondas de edición genómica de forma por etapas, en que PAM 1 se recicla después de cada ronda. Este enfoque puede usarse también para la adición por etapas de ADN endógeno o exógeno.
Figura 5A: Inserción de Lox mediada por CRISPR/Cas para facilitar el RMCE: Los ARNg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de dos oligos donantes o fragmentos de ADN donantes (monocatenarios o bicatenarios) con homología con las regiones 5’ y 3’ de cada secuencia de PAM en que el ADN donante contiene secuencias de reconocimiento de recombinasa (RRS), tales como loxP y lox5171, guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la inclusión de estas RRS. Las RRS introducidas pueden usarse como plataforma de aterrizaje para insertar cualquier ADN de interés con alta eficacia y precisamente usando intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE). El sitio PAM 2 retenido puede reciclarse para otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas para deleción o inserción de ADN de interés. Nota: el ADN de interés insertado podría contener un marcador de selección tal como PGK-Puro flanqueado por LTR PiggyBac para permitir la selección inicial y, tras integración exitosa en el ADN de interés, el marcador de selección puede retirarse convenientemente expresando la transposasa hyperPbase.
Figura 5B: Inserción de Lox mediada por CRISPR/Cas para facilitar el RMCE: Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 5A. Los ARNsg de orientación flanqueantes de la región de interés pueden inducir dos muescas de ADN usando nicasa Cas9 D10A en localizaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseada (mostradas como recuadros negros sólidos). Como alternativa, pueden usarse ARNsg con nucleasa de tipo silvestre Cas9 para inducir dos DSB flanqueantes de la región de interés. La adición de dos oligos donantes o fragmentos de ADN donantes (monocatenarios o bicatenarios) con homología con regiones en 5’ y 3’ de cada secuencia de PAM en que el ADN donante contiene secuencias de reconocimiento de recombinasa (RRS), tales como loxP y lox5171, guiará la reparación de ADN de manera precisa por HDR con la inclusión de estas RRS. Nota: la orientación de los sitios lox puede realizarse secuencialmente o en conjunto en un proceso de una etapa. Las RRS introducidas pueden usarse como plataforma de aterrizaje para la inserción de cualquier ADN de interés con alta eficacia y precisamente usando el intercambio de módulos mediado por recombinasa (RMCE). Como se detalla en la Figura 4, la secuencia de PAM puede reciclarse para otra ronda de edición genómica mediada por CRISPR/Cas para deleción o inserción de ADN de interés. Como opción, el ADN de interés insertado podría contener un marcador de selección tal como PGK-Puro flanqueado por LTR PiggyBac para permitir la selección inicial y, tras integración exitosa en el ADN de interés, el marcador de selección puede retirarse convenientemente expresando la transposasa hyperPbase.
Figuras 6A y 6B: Modificación genómica para producir Cas9 escindible por transposón y ARNg
Figura 6C: Expresión de Cas9 de copia individual: Puede orientarse inicialmente una plataforma de aterrizaje a cualquier locus de elección en citoblastos embrionarios de ratón o cualquier otra estirpe celular eucariótica. La plataforma de aterrizaje contendrá típicamente LTR 5' y 3' PiggyBac, marcador de selección tal como neo, por ejemplo floxeado y un promotor sin gen tal como PGK en la configuración general mostrada. Se realiza la orientación por recombinación homóloga y se seleccionan los clones en G418. La siguiente etapa implicará RCME para insertar Cas9 ligada por una secuencia T2A a Puro-delta-tk, con la opción de insertar un ARN de guía individual o múltiples usando sitios de restricción únicos (RS). El posicionamiento de los sitios lox está dispuesto de manera que solo una vez se inserta el ADN de intrusión que contiene Cas9 en la plataforma de aterrizaje, puede activar el promotor PGK en la plataforma de aterrizaje la transcripción y por tanto la expresión de puromicina y, a través de T2A, la transcripción y expresión de la producción de Cas9. Usando este enfoque, puede conseguirse una expresión estable de Cas9 individual. Después de 4-6 días de selección en puromicina, pueden escindirse la Cas9 entera y el módulo floxeado de ARN de guía usando transposasa PiggyBac (Pbase) y puede analizarse en los clones individuales la edición genómica resultante del ARN de guía introducido. Como opción, puede generarse una estirpe de banco celular estable que expresa Cas9 a partir de la cual pueden generarse múltiples estirpes celulares genomanipuladas. Para hacer esto, se insertará solo Cas9-T2A-Puro-delta-tk sin ARNg en la fase de RMCE. Esto producirá una estirpe celular genérica de expresión de Cas9 de una copia individual en que su genoma puede editarse por transfección de ARNg individual o múltiples.
Figura 7: Representación esquemática de la posición de ARNg con respecto al gen X, la estructura del vector de orientación y el par de oligos usado para genotipar los clones diana resultantes.
Figura 8: Una imagen en gel que muestra los resultados de genotipado después de rotura de ADN bicatenario mediada por nucleasa Cas9 y la posterior orientación a ADN. El genotipado muestra el producto de
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(ADNbc) que comprende una primera y segunda hebras y
- (a)
- usar escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5' y 3' en la primera hebra; y
- (b)
- usar recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, produciendo así una primera hebra modificada; produciendo así ADN en el que la primera hebra se ha modificado por dicha recombinación, pero la segunda hebra no se ha modificado.
Opcionalmente, el método comprende además replicar la primera hebra modificada para producir un ADNbc de progenie en el que cada hebra del mismo comprende una copia de la secuencia nucleotídica de inserto. Opcionalmente, el método comprende (c) aislar el ADNbc de progenie, p.ej. obteniendo una célula que contiene dicho ADNbc de progenie. La replicación puede efectuarse, por ejemplo, en una célula. Por ejemplo, las etapas (a) y
(b) se llevan a cabo en una célula y la célula se replica, en las que la maquinaria de la célula replica la primera hebra modificada, p.ej. produciendo una progenie de ADNbc en que cada hebra comprende la modificación.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se aísla la hebra de ADN modificada resultante de la etapa (b).
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo el método in vitro. Por ejemplo, se lleva a cabo el método en una célula o población celular in vitro.
Como alternativa, opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo el método para modificar el genoma de un virus.
Como alternativa, opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo el método in vivo en un organismo. En un ejemplo, el organismo es un organismo no humano. En un ejemplo, es una planta o un animal o un insecto o una bacteria o una levadura. Por ejemplo, el método se practica en un vertebrado no humano (p.ej., un ave, por ejemplo un pollo) o mamífero no humano (tal como un ratón, una rata o un conejo).
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el método es un método de tratamiento cosmético de un ser humano o un método no terapéutico, no quirúrgico, no diagnóstico, p.ej. practicado en un ser humano o vertebrado o mamífero no humano (p.ej., un ratón o una rata).
La divulgación proporciona también:
Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método
- (a)
- usar escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte 5' y 3' en una hebra individual de ácido nucleico;
- (b)
- usar recombinación homóloga para insertar una secuencia nucleotídica entre los extremos, en la que la secuencia de inserto comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína; y
- (c)
- opcionalmente obtener la hebra de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una hebra de ácido nucleico de progenie que comprende la secuencia nucleotídica insertada, p.ej. obteniendo una célula que contiene dicha hebra de ácido nucleico de progenie.
En un ejemplo, la hebra de progenie es un producto de la replicación de la hebra producida por la etapa (b). La hebra de progenie se produce, por ejemplo, por replicación de ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, se llevan a cabo las etapas (a) y (b) en una célula y se replica la célula, en la que la maquinaria de la célula replica la hebra modificada producida en la etapa (b), p.ej., produciendo una progenie de ADNbc en que cada hebra comprende la modificación.
En un ejemplo, la hebra de ácido nucleico individual es una hebra de ADN o ARN.
En un ejemplo, el elemento regulador es un promotor o potenciador.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica insertada es una secuencia de planta, animal, vertebrado o mamífero, p.ej. una secuencia humana. Por ejemplo, la secuencia codifica una proteína completa, polipéptido, péptido, dominio o una pluralidad (p.ej., uno, dos o más) de uno cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia insertada confiere una propiedad de resistencia a una célula que comprende el ácido nucleico modificado producido por el método (p.ej., resistencia herbicida, vírica o bacteriana). En un ejemplo, la secuencia insertada codifica una interleucina, receptor (p.ej., un receptor de superficie celular), factor de crecimiento, hormona, anticuerpo (o dominio variable o sitio de unión del mismo), antagonista o agonista; p.ej. una versión humana de cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia insertada es un exón.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica insertada reemplaza una secuencia ortóloga u homóloga de la hebra (p.ej., el inserto es una secuencia humana que reemplaza una secuencia de planta o ratón). Por ejemplo, se lleva a cabo el método en un ratón o célula de ratón
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(tal como un citoblasto embrionario) y el inserto reemplaza una secuencia de ratón ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica de ratón implicada en enfermedad). Por ejemplo, se lleva a cabo el método (p.ej. in vitro) en una célula humana y el inserto reemplaza una secuencia humana ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica humana implicada en enfermedad, p.ej. se reemplaza una forma mutada de una secuencia por una secuencia humana diferente (p.ej. de tipo silvestre), lo que puede ser útil para corregir un defecto génico en la célula.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica insertada es de al menos 10 nucleótidos de longitud, p.ej. al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de inserto comprende un sitio de recombinación específica de sitio, p.ej. un sitio lox, frt o rox. Por ejemplo, el sitio puede ser un sitio loxP, Iox511 o Iox2272.
La divulgación proporciona también:
Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método
- (a)
- usar escisión de ácido nucleico para crear una primera y segunda roturas en una hebra de ácido nucleico, creando así extremos de corte 5’ y 3’ y una secuencia nucleotídica entre los extremos;
- (b)
- usar recombinación homóloga para eliminar la secuencia nucleotídica; y
- (c)
- opcionalmente obtener la hebra de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una hebra de ácido nucleico de progenie que comprende la deleción.
En un ejemplo, la hebra de progenie es un producto de la replicación de la hebra producida por la etapa (b). La hebra de progenie se produce, por ejemplo, por replicación de ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, se llevan a cabo las etapas (a) y (b) en una célula y se replica la célula, en la que la maquinaria de la célula replica la hebra modificada producida en la etapa (b), p.ej., produciendo una progenie de ADNbc en que cada hebra comprende la modificación.
En un ejemplo, la hebra de ácido nucleico individual es una hebra de ADN o ARN.
En un ejemplo, la secuencia eliminada comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína. En una realización, el elemento regulador eliminado es un promotor o potenciador.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica eliminada es una secuencia de planta, animal, vertebrado o mamífero, p.ej. una secuencia humana. Por ejemplo, la secuencia codifica una proteína completa, polipéptido, péptido, dominio o una pluralidad (p.ej. uno, dos o más) de uno cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia eliminada codifica una interleucina, receptor (p.ej., un receptor de superficie celular), factor de crecimiento, hormona, anticuerpo (o dominio variable o sitio de unión del mismo), antagonista o agonista; p.ej. una versión no humana de cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia eliminada es un exón.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se reemplaza la secuencia nucleotídica eliminada por una secuencia ortóloga u homóloga de una especie o cepa diferente (p.ej., una secuencia humana reemplaza una secuencia de planta o ratón ortóloga u homóloga). Por ejemplo, se lleva a cabo el método en un ratón o célula de ratón y el inserto reemplaza una secuencia de ratón ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica de ratón implicada en enfermedad). Por ejemplo, se lleva a cabo el método (p.ej., in vitro) en una célula humana y el inserto reemplaza una secuencia humana ortóloga u homóloga (p.ej., una proteína diana biológica implicada en enfermedad, p.ej. se reemplaza una forma mutada de una secuencia por una secuencia humana diferente (p.ej. de tipo silvestre), lo que puede ser útil para corregir un defecto génico en la célula. Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia nucleotídica eliminada es de al menos 10 nucleótidos de longitud, p.ej. al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se ejecuta la etapa (c) aislando una célula que comprende la primera hebra modificada, u obteniendo un vertebrado no humano en que se ha ejecutado el método o una progenie de mismo.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el producto del método comprende una hebra de ácido nucleico que comprende un motivo PAM en 3’ de la inserción o deleción. En un ejemplo, el motivo PAM está dentro de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleótidos de la inserción o deleción. Esto es útil para posibilitar inserciones y/o deleciones en serie según el método explicado adicionalmente a continuación.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el producto del método comprende una hebra de ácido nucleico que comprende un motivo PAM en 5’ de la inserción o deleción. En un ejemplo, el motivo
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conejo, o un tejido u órgano de los mismos (p.ej., in vitro).
En un ejemplo, el sitio 3’ o cada sitio de escisión está flanqueado en 3’ por un motivo PAM (p.ej., un motivo divulgado en la presente memoria, tal como una secuencia NGG o NGGNG, en la que N es cualquier base y G es una guanina). Por ejemplo, uno o más o todos los sitios de escisión están flanqueados en 3’ por la secuencia 5'-TGGTG-3'. Al contrario que el ADNbc, el PAM no es absolutamente necesario para la unión y escisión de ADNmc: un oligodesoxinucleótido monocatenario que contiene un protoespaciador con o sin una secuencia de PAM se une casi tan bien como el ADNbc y puede usarse en la divulgación en la que se modifica una hebra individual de ADN. Además, en presencia de iones de Mg2+, Cas9 corta el ADNmc unido al ARNcr usando su sitio activo HNH independientemente de PAM.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo la etapa (a) por escisión en una única hebra de ADNbc o en ADNmc.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se lleva a cabo la etapa (a) combinando en una célula la hebra de ácido nucleico, una endonucleasa Cas, un ARNcr y un ARNtracr (p.ej., proporcionado por uno o más ARNg) para orientar la endonucleasa a llevar a cabo la escisión, y opcionalmente una secuencia de inserto para recombinación homóloga con la hebra de ácido nucleico. En lugar de una secuencia de inserto, puede usarse una secuencia de entrada que contiene brazos de homología pero no secuencia de inserto, para efectuar la deleción como se describe anteriormente. En un ejemplo, la endonucleasa Cas se codifica por una secuencia nucleotídica que se ha introducido en la célula. En un ejemplo, el ARNg se codifica por una secuencia de ADN que se ha introducido en la célula.
En un ejemplo, se lleva a cabo el método en presencia de Mg2+.
Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se ejecuta la etapa (b) llevando a cabo recombinación homóloga con un ácido nucleico de entrada que comprende un primer y segundo brazos de homología, en la que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’, en la que el segundo brazo de homología comprende una secuencia de PAM tal que la recombinación homóloga entre el segundo brazo de homología y la secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’ produce una secuencia que comprende un motivo PAM en el producto del método. El PAM puede ser cualquier secuencia de PAM divulgada en la presente memoria, por ejemplo. Por tanto, el método produce una hebra de ácido nucleico modificado que comprende un PAM que puede usarse para modificación de ácido nucleico posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, en el que se usa una endonucleasa Cas para cortar el ácido nucleico. Esto es útil, por ejemplo, para ejecutar recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR), más particularmente la sCHDR descrita a continuación.
Recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR)
La divulgación proporciona además:
Un método de recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización anterior una primera vez y una segunda vez, en el que se usa escisión mediada por endonucleasa en cada etapa (a); en el que se usa el producto de la primera vez para la escisión mediada por endonucleasa de la segunda vez; con lo que (i) se eliminan una primera y segunda secuencias nucleotídicas la primera vez y la segunda vez, respectivamente; o bien (ii) se elimina una primera secuencia nucleotídica la primera vez y se inserta una segunda secuencia nucleotídica la segunda vez; o bien (iii) se inserta una primera secuencia nucleotídica la primera vez y se elimina una segunda secuencia nucleotídica la segunda vez; o bien (iv) se insertan una primera y segunda secuencias nucleotídicas la primera y segunda veces, respectivamente; opcionalmente en el que la modificación de hebra de ácido nucleico la segunda vez está dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de la modificación de hebra de ácido nucleico la primera vez o directamente adyacente a la modificación de hebra de ácido nucleico la primera vez.
Por ejemplo, se insertan la primera y segunda secuencias nucleotídicas de modo que sean contiguas después de la inserción la segunda vez. Como alternativa, la primera y segunda deleciones son tales que se elimine una secuencia contigua después de ejecutar la primera y segunda deleciones.
En una realización de sEHDR, el método usa una endonucleasa Cas. Por tanto, se proporciona:
Un método de recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier reivindicación anterior una primera vez y una segunda vez, en el que se usa escisión mediada por endonucleasa Cas en cada etapa (a); en el que se lleva a cabo la etapa (b) de la primera vez ejecutando recombinación homóloga con un ácido nucleico de entrada que comprende un primer y segundo brazos de homología, en el que los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente de una secuencia que se extiende en 5’ desde el extremo 5’ y una secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’, en el que el segundo brazo de homología comprende una secuencia de PAM tal que la recombinación homóloga entre el segundo brazo de homología y la secuencia que se extiende en 3’ desde el extremo 3’ produce una secuencia
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la misma (p.ej., una diana proteica humana activada génicamente en un organismo de ensayo animal no humano). En otro ejemplo, se han usado la invención y divulgación para desactivar génicamente una secuencia endógena (p.ej., una proteína diana) en un organismo, tal como un organismo no humano. Esto puede ser útil para valorar el efecto (fenotipo) de la desactivación génica y por tanto valor las dianas farmacológicas potenciales o proteínas implicadas en enfermedad. En un ejemplo, el organismo es un animal no humano (p.ej., un vertebrado, mamífero, ave, pez, roedor, ratón, rata o conejo) en que se ha activado génicamente una proteína diana humana usando la invención o divulgación. Opcionalmente, se ha usado la invención o divulgación para desactivar génicamente una diana endógena ortóloga u homóloga del organismo (p.ej., se ha reemplazado una secuencia diana endógena en la posición endógena por una secuencia diana humana ortóloga u homóloga). De este modo, puede producirse un modelo de ensayo para probar productos farmacéuticos que actúan a través de la diana humana.
En una realización, el organismo es un vertebrado no humano que expresa regiones variables de anticuerpo humano cuyo genoma comprende un reemplazo de una diana endógena por una secuencia humana ortóloga u homóloga. En un ejemplo, se usa el método de la divulgación para producir un vertebrado generador de anticuerpos
o vertebrado de ensayo como se divulgan en el documento W02013061078.
En un ejemplo, se activa génicamente un elemento regulador exógeno usando el método. Por ejemplo, se activa génicamente reemplazando un elemento regulador endógeno.
En un aspecto, se proporciona un método de producción de una célula o un organismo no humano transgénico (p.ej., cualquier organismo no humano citado en la presente memoria), comprendiendo el método:
- (a)
- llevar a cabo el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización para (i) desactivar génicamente una secuencia nucleotídica diana en el genoma de una primera célula y/o (ii) activar génicamente una secuencia nucleotídica de inserción en el genoma de una primera célula, opcionalmente en el que la secuencia de inserto reemplaza una secuencia diana total o parcialmente en la localización endógena de la secuencia diana en el genoma; en el que la célula o progenie de la misma puede desarrollarse hasta un organismo o célula no humano; y
- (b)
- desarrollar la célula o progenie hasta un organismo no humano o una célula no humana.
En un ejemplo, el organismo o célula es homocigótico para la modificación (i) y/o (ii).
En un ejemplo, la célula es un citoblasto embrionario (tal como un citoblasto embrionario de ratón), citoblasto pluripotente inducido, célula totipotente o célula pluripotente. En un ejemplo, la célula es una célula de vertebrado no humano o una célula humana in vitro. En un ejemplo, la célula es una célula de planta, levadura, insecto o bacteriana.
En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de roedor (p.ej., un ratón o rata) o una célula de conejo, ave, pez, pollo, primate no humano, mono, cerdo, perro, camélido, tiburón, oveja, vaca o gato.
En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia endógena que comprende todo o parte de un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína.
En un ejemplo, la secuencia de inserto es una secuencia sintética; o comprende una secuencia que codifica toda o parte de una proteína de una especie distinta de la especie de la que deriva la primera célula; o comprende un elemento regulador de dicha primera especie. Esto es útil para combinar genes con nuevos elementos reguladores.
En un ejemplo, la secuencia de inserto codifica toda o parte de una proteína humana o subunidad o dominio de proteína humana. Por ejemplo, la secuencia de inserto codifica una proteína de membrana celular, proteína secretada, proteína intracelular, citocina, proteína receptora (p.ej., proteína receptora de Fc, tal como una proteína receptora FcRn o FcY), proteína del sistema inmunitario humano o dominio de la misma (p.ej., una proteína Ig o dominio, tal como un anticuerpo o proteína o dominio de TCR, o una proteína MHC), una hormona o factor de crecimiento.
Se proporciona también:
Una célula (p.ej., una célula aislada o purificada, p.ej. una célula in vitro, o cualquier célula divulgada en la presente memoria) o un organismo no humano (p.ej., cualquier organismo divulgado en la presente memoria, tal como un ratón) cuyo genoma comprende una modificación que comprende una secuencia nucleotídica no endógena flanqueada por secuencias nucleotídicas endógenas, en los que la célula u organismo es obtenible mediante el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, y en los que la secuencia no endógena está flanqueada en 3' y/o 5' por (p.ej., dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de, o directamente adyacente a) un motivo PAM Cas; en los que la célula no está incluida en un ser humano; y se aplican uno, más o todos de (a) a (d) (por ejemplo, (a); (b); (c); (d); (a) y (b); (a) y (c); (a) y (d); (b) y (c); (b) y (d); (c) y (d); (a), (b) y (c); (a), (b) y (d); (a), (c) y (d); (b), (c) y (d) o todos de (a), (b), (c) y (d)).
(a) El genoma es homocigótico para la modificación; o comprende la modificación en un alelo y no está
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modificado por recombinación homóloga mediada por Cas en el otro alelo;
- (b)
- la secuencia no endógena comprende todo o parte de un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína;
- (c)
- la secuencia no endógena es de al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud;
(d) la secuencia no endógena reemplaza una secuencia ortóloga u homóloga en el genoma. La célula puede ser una célula humana, o incluida en tejido humano pero no parte de un ser humano. Por ejemplo, la célula es una célula humana in vitro. En un ejemplo, la secuencia no endógena es una secuencia humana. En un ejemplo, el motivo PAM es cualquier PAM divulgado en la presente memoria o comprende una secuencia
seleccionada de CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT y GAA. Por ejemplo,
el motivo es un motivo PAM Cas9. Por ejemplo, el PAM es NGG. En otro ejemplo, el PAM es GG. En un ejemplo, hay un motivo PAM a no más de 10 nucleótidos (p.ej., 3 nucleótidos) en 3’ y/o 5’ de la secuencia no endógena.
En un ejemplo, el motivo PAM se reconoce por una Cas9 de Streptococcus. En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena pesada de anticuerpo humano (y opcionalmente ningún dominio
variable de cadena pesada de una especie de vertebrado no humano). Por ejemplo, el organismo es un vertebrado generador de anticuerpos o vertebrado de ensayo divulgado en el documento WO2013061078. En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que
expresa uno o más dominios variables de cadena ligera kappa de anticuerpo humano (y opcionalmente ningún
dominio variable de cadena ligera kappa de una especie de vertebrado no humano). En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera lambda de anticuerpo humano (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena ligera kappa de una especie de vertebrado no humano).
En un ejemplo, la secuencia no endógena codifica una proteína receptora de Fc humana o subunidad o dominio de
la misma (p.ej., una proteína receptora FcRN o Fcy humana, subunidad o dominio). En un ejemplo, la secuencia no endógena comprende uno o más segmentos génicos de anticuerpo humano, una región variable de anticuerpo o una región constante de anticuerpo.
En un ejemplo, la secuencia de inserto es una secuencia humana que reemplaza o suplementa una secuencia no humana ortóloga.
Se proporciona también: Un anticuerpo monoclonal o policlonal preparado mediante inmunización de un vertebrado (p.ej., ratón o rata) de la divulgación (o producido mediante un método de la divulgación) con un antígeno.
La divulgación proporciona también: Un método de aislamiento de un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método:
- (a)
- proporcionar un vertebrado (opcionalmente un ratón o rata) de la divulgación (o producido por un método de la divulgación);
- (b)
- inmunizar dicho vertebrado con dicho antígeno;
- (c)
- retirar linfocitos B del vertebrado y seleccionar uno o más linfocitos B que expresen anticuerpos que se unen al antígeno;
- (d)
- opcionalmente, inmortalizar dichos linfocitos B seleccionados o progenie de los mismos, opcionalmente produciendo hibridomas a partir de los mismos; y
(e) aislar un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo de tipo IgG) expresado por los linfocitos B. En un ejemplo, el método comprende la etapa de aislar de dichos linfocitos B ácido nucleico que codifica dicho
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anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia nucleotídica de región constante de cadena pesada del anticuerpo por una secuencia nucleotídica que codifica una región constante de cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un hospedador.
En un ejemplo, el método comprende elaborar un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método.
La divulgación proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado, descrito en la presente memoria,
- o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a dicho antígeno, en la fabricación de una composición para uso como medicamento.
La divulgación proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado descrito en la presente memoria,
- o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a dicho antígeno, para uso en medicina.
La divulgación proporciona un método de tratamiento de un paciente necesitado de ello (p.ej., un paciente humano), que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado descrito en la presente memoria, o un anticuerpo mutante o derivado de mismo que se une a un antígeno.
La divulgación proporciona una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria, opcionalmente en el que la secuencia nucleotídica es parte de un vector. La divulgación proporciona también una célula hospedadora que comprende dicha secuencia nucleotídica.
La divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o anticuerpos descritos en la presente memoria y un diluyente, excipiente o portador.
La invención proporciona un citoblasto embrionario no humano, un animal no humano o un blastocito no humano que comprende una secuencia nucleotídica genómicamente integrada expresable que codifica una endonucleasa Cas (p.ej., Cas9 o Cys4) y opcionalmente una secuencia nucleotídica genómicamente integrada expresable que codifica un ARNtracr o un ARNg. Por ejemplo, el citoblasto embrionario es cualquier tipo de citoblasto embrionario descrito en la presente memoria.
En un ejemplo de célula, animal o blastocito, la secuencia de endonucleasa es constitutivamente expresable.
En un ejemplo de célula, animal o blastocito, la secuencia de endonucleasa es expresable induciblemente.
En un ejemplo de célula, animal o blastocito, la secuencia de endonucleasa es expresable de manera específica de tejido en el animal o progenie del mismo, o en un animal no humano que es progenie de la célula o blastocito.
En un ejemplo, la célula, animal o blastocito comprende uno o más ARNg o una secuencia nucleotídica expresable que codifica un ARNg o una pluralidad de secuencias nucleotídicas expresables que codifican cada una un ARNg diferente.
La divulgación proporciona el uso de la célula, animal o blastocito en un método según cualquier configuración, aspecto, realización o ejemplo.
Un aspecto proporciona un anticuerpo producido por el método de la divulgación, opcionalmente para uso en medicina, p.ej. para el tratamiento y/o la prevención (tal como en un método de tratamiento y/o prevención) de una afección médica o enfermedad en un paciente, p.ej. un ser humano.
Un aspecto proporciona una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo de la divulgación, opcionalmente en el que la secuencia nucleotídica es parte de un vector. Los vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el especialista, p.ej. un vector de expresión de anticuerpo convencional que comprende la secuencia nucleotídica ligada operativamente con uno o más elementos de control de la expresión.
Un aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la divulgación y un diluyente, excipiente o portador, opcionalmente en el que la composición está contenida en un envase intravenoso
(IV) (p.ej., una bolsa IV) o un envase conectado con una jeringa IV.
Un aspecto proporciona el uso del anticuerpo de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad o afección en un paciente, p.ej. un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a anticuerpos humanizados y cadenas de anticuerpos producidos según la presente divulgación, tanto en forma quimérica como totalmente humanizada, y al uso de dichos anticuerpos en medicina. La divulgación se refiere también a una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo y un portador u otro excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las cadenas de anticuerpo que contienen secuencias humanas, tales como cadenas de anticuerpo quiméricas humanas-no humanas, se consideran humanizadas en la presente memoria en virtud de la presencia de regiones de codificación de la proteína humana. Pueden producirse anticuerpos totalmente humanos a partir de ADN que
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codifica una cadena de anticuerpo quimérico de la divulgación usando técnicas estándares.
Los métodos para la generación tanto de anticuerpos monoclonales como policlonales son bien conocidos en la materia, y la presente divulgación se refiere tanto a anticuerpos policlonales como monoclonales de anticuerpos quiméricos o totalmente humanizados producidos en respuesta a la exposición a antígeno en vertebrados no humanos de la presente divulgación.
En un aspecto adicional más, los anticuerpos quiméricos o cadenas de anticuerpo generados en la presente divulgación pueden manipularse, adecuadamente a nivel de ADN, para generar moléculas con propiedades o estructura de tipo anticuerpo, tales como una región variable humana de una cadena pesada o ligera con ausencia de una región constante, por ejemplo un anticuerpo de dominio; o una región variable humana con cualquier región constante de cadena pesada o bien ligera de la misma o diferente especie; o una región variable humana con una región constante de origen no natural; o una región variable humana junto con cualquier otro copartícipe de fusión. La divulgación se refiere a todos tales derivados de anticuerpo quiméricos derivados de anticuerpos quiméricos identificados según la presente divulgación.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al uso de animales de la presente divulgación en el análisis de los efectos probables de fármacos y vacunas en el contexto de un repertorio de anticuerpos casi humanos.
La divulgación se refiere también a un método para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, comprendiendo el método suministrar la vacuna o fármaco a un mamífero de la divulgación y monitorizar uno o más de: respuesta inmunitaria, perfil de seguridad y efecto sobre la enfermedad.
La divulgación se refiere también a un kit que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se divulga en la presente memoria y a instrucciones para el uso de tal anticuerpo o bien a un reactivo de laboratorio adecuado, tal como un tampón o reactivo de detección de anticuerpo.
El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa junto con el término “comprender” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero es también consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno” y “uno y más de uno”. El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se hace referencia a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente exclusivas, aunque la divulgación apoya una definición que hace referencia a solo alternativas e “y/o”. A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicaciones, las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen elementos o etapas del método adicionales no citados.
El término “o combinaciones de los mismos” como se usa en la presente memoria hace referencia a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados antes del término. Por ejemplo, “A, B, C o combinaciones de los mismos” pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluye expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más artículos o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB y demás. El especialista en la técnica entenderá que típicamente no hay límite al número de artículos o términos en cualquier combinación, a menos que sea evidente otra cosa a partir del contexto.
Cualquier parte de esta divulgación puede leerse en combinación con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que sea evidente otra cosa a partir del contexto.
Todas las composiciones y/o métodos divulgados y reivindicados en la presente memoria pueden elaborarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la vista de la presente divulgación.
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EJEMPLOS
Ejemplo de referencia 1: Modificaciones de ADN precisas
(a) Uso de nicasa para HDR
Se ha reseñado que la nucleasa Cas9 puede convertirse en una nicasa mediante la sustitución de un aspartato por alanina (D10A) en el dominio RuvCI de SpCas9 (Cong et al.). Cabe destacar que las roturas monocatenarias de ADN se reparan preferencialmente mediante la ruta de HDR. La nicasa Cas9 D10A, cuando está en un complejo con ARNcr:ARNtracr maduro, puede inducir específicamente muescas de ADN en una localización precisa. Teniendo esto en mente, se propone extender la aplicación del sistema CRISPR/Cas creando una muesca en una localización dada en un genoma usando la nicasa Cas9 D10A y explotando entonces la ruta de HDR para insertar un fragmento de ADN monocatenario (endógeno o exógeno) que contendrá homología de ADN (típicamente, para recombinería, son suficientes 50 pb para una recombinación eficaz) flanqueante de la unión de ADN con muesca para llevar e insertar un ADN dado en la localización precisa; se usará una homología de tamaño similar con el presente ejemplo (Figura 1A). Se diseñará el ARN de guía (ARNg) individualmente por secuencia protoespaciadora diana o se incorporará a una matriz de CRISPR individual que codifica 2 o más secuencias espaciadoras que permiten una edición genómica multiplexada a partir de un ensayo de CRISPR individual.
(b) Ejemplo de deleción de ADN precisa
Para demostrar una deleción precisa usando Cas9 en asociación con ARNg y sin vector de orientación ni ADN donante, se diseñaron dos ARNg en un gen que estaban separados 55 pb. Los dos ARNg estaban en hebras de ADN opuestas como se muestra en la Figura 9.
Se transfectaron citoblastos embrionarios de ratón con nucleasa Cas9 humana y los dos ARNg. Se llevó a cabo el procedimiento de transfección como se detalla anteriormente, pero no se seleccionaron los clones resultantes. Se genotiparon los clones de citoblastos embrionarios transfectados usando un par de oligos que cubren los dos ARNg (cebador 1 y 2) para detectar la deleción de 55 pb específica (Figura 10).
La mayoría de los clones no mostraba la deleción de 55 pb específica, sin embargo, se identificaron claramente clones que contenían la deleción definida. De los 384 clones analizados, se encontró que aproximadamente un 4 % de los clones contenían la deleción de 55 pb específica. Nota: No se muestran todos los datos de genotipado. Los clones que contenían la deleción de 55 pb específica se analizaron adicionalmente por secuenciación de los productos de PCR como confirmación final (datos no mostrados). Además, cuando se vio la deleción específica, se observó que ambos alelos contenían la deleción específica. Estos datos confirmaban, que cuando se usan dos ARNg, puede hacerse una deleción precisa y específica sin el requisito de un vector de orientación. Sin embargo, puede suponerse que la eficacia de la deleción definida puede potenciarse en gran medida usando la combinación de dos ARNg con un vector de orientación o un fragmento de ADN donante que contiene brazos de homología flanqueantes de la región de deleción pretendida.
(c) Metodología alternativa para la deleción de ADN
En un escenario separado, pueden diseñarse dos ARNg o una matriz de CRISPR individual que codifica múltiples secuencias espaciadoras flanqueantes de un gen o una región de interés, y con la asociación de la nicasa Cas9 D10A pueden inducirse dos roturas monocatenarias separadas. Esto, en asociación con un fragmento de ADN monocatenario que contiene homología de ADN con la unión de punto de rotura en 5’ de la primera muesca de ADN, y homología de ADN con la unión de punto de rotura en 3’ de la segunda muesca, hace que la región entre las dos muescas de ADN monocatenarias pueda eliminarse precisamente (Figura 2A).
(d) Metodología alternativa para el reemplazo de ADN
En otro escenario, pueden diseñarse dos ARNg separados o una matriz de CRISPR individual multiplexada flanqueantes de un gen o una región de interés y, con la asociación de la nicasa Cas9 D10A, pueden inducirse dos roturas monocatenarias separadas. En este caso, el fragmento de ADN monocatenario de intrusión (o ADN bicatenario) puede contener una secuencia de ADN de fuente endógena o bien exógena que contiene una secuencia de un gen, elemento regulador, promotor, etc. conocido. Este fragmento de ADN monocatenario (o ADN bicatenario) puede integrarse para reemplazar la región de ADN de interés flanqueada por la muesca de ADN dotándolo con homología de ADN de la región 5’ de la primera muesca y la región 3’ de la segunda muesca (Figura 3A). Debido a la alta eficacia del sistema CRISPR/Cas para escindir ADN, la estrategia propuesta anterior no requerirá la introducción de ningún marcador de selección, creando por tanto una edición genómica continua exacta de manera precisa y definida. Como opción, puede incluirse un marcador de selección flanqueado por LTR PiggyBac para permitir la selección directa de clones correctamente modificados. Una vez se han identificado los clones correctos, puede retirarse el marcador de selección convenientemente mediante la expresión de transposasa piggyBac hiperactiva (Yusa K., Zhou L., Li MA, Bradley A., Craig N.L.: A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011,108(4): 1531-1536). Además, pueden aplicarse los enfoques anteriores a citoblastos embrionarios, células de mamífero, células de levadura, células bacterianas, células de planta así como ejecutarse directamente en cigotos para acelerar el proceso de genomanipulación
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El sistema de edición genómica CRISPR/Cas se ha reconstruido in vitro y ejemplificado en citoblastos embrionarios de ratón usando el vector pX330 que contiene S pyogenes humanizado (hSpCsn1) (Cong et al.). El sistema CRISPR/Cas puede reconstruirse como se describe en Cong et al usando tiras de ADN sintético y ensamblaje de ADN. En el presente ejemplo, el ensamblaje de ADN completo constituiría un fragmento de 6006 pb que contiene 45 5 pb de homología con el vector pBlueScript KS+ en 5' del sitio de corte EcoRV, el promotor U6 humano, dos sitios de restricción Bbsl para clonar en la secuencia espaciadora que se fusiona con una secuencia de ARN de guía quimérica, el promotor de beta-actina de pollo con 3 FLAG, la señal de localización nuclear (NLS) seguida de la secuencia de hSpCsn1 y otra NLS, poliA de bGH, secuencia de repetición terminal invertida y finalmente otros 45 pb de homología con pBlueScript KS+ en 3’ del sitio de corte de EcoRV. Este tramo de 6006 pb de ADN se sintetizará
10 como 7 fragmentos de ADN individuales en que cada fragmento tendrá una superposición de 45 pb con el fragmento de ADN adyacente para permitir el ensamblaje de ADN. La secuencia de ADN de estos fragmentos se muestra a continuación en el orden de ensamblaje.
Fragmento 1A (1340 pb)
15 Fragmento 2 (852 pb)
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