KR20080041146A - 척추동물에서의 유전자 조작 및 분석을 위한 도구로서의피기백 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그의 게놈이 피기백 계열 트랜스포존 시스템의 하나 이상의 요소들을 포함하는, 포유동물을 비롯한 트랜스제닉 척추동물에 관한 것이다. 그의 게놈이 피기백 계열 트랜스포존 시스템의 하나 이상의 요소들을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 포유동물을 비롯한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제공한다. 의료 분야, 수의학 분야, 및 농업 분야에서의 적용을 비롯하여, 본 발명의 세포 및 동물을 제조하고 사용하는 방법 또한 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 방법을 실시하는데 유용한 키트에 관한 것이다.

피기백, 트랜스포존, 트랜스제닉 척추동물

Description

척추동물에서의 유전자 조작 및 분석을 위한 도구로서의 피기백{PIGGYBAC AS A TOOL FOR GENETIC MANIPULATION AND ANALYSIS IN VERTEBRATES}

1. 본 발명의 기술분야

본 발명은 그의 게놈이 피기백 (piggyBac)계열의 트랜스포존 시스템의 하나 이상의 인자들을 포함하는 포유동물을 비롯한 트랜스제닉 척추동물, 세포, 및 인간을 제외한 포유동물을 비롯한 인간을 제외한 척추동물, 및 세포 및 동물의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 방법을 실시하는데 유용한 키트에 관한 것이다.

2. 본 발명의 배경

전위 인자 또는 트랜스포존은 벌레, 곤충, 및 인간을 비롯한 다수의 후생동물에서 확인된 이동성 유전자 단위이다. 인간 및 마우스에서, 트랜스포존 유래 서열이 게놈의 40% 초과를 차지하는데 (문헌 [Lander et al, 2001, Nature 409:860-921]; [Waterston et al, 2002, Nature 420:520-562]), 이는 진화에서 전위의 중요성을 시사하는 것이다. 매클린턱(McClintock)이 옥수수에서 제1 트랜스포존을 발견한 이래 [McClintock, 1950, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 36:344-345], 전위 인 자는 다수 유기체에서의 유전자 분석을 위해 매우 중요한 도구가 되어 왔다. 원핵생물에서는 트랜스포존에 기초한 돌연변이 유발을 통해 미생물성 발병메커니즘에 중요한 유전자를 발견하게 되었다 ([Hutchison et al, 1999, Science 286:2165-2169]; [Vilen et al, 2003, J. Virol. 77: 123-134]). 진핵생물에서는 P-인자 매개성 트랜스제네시스 및 삽입 돌연변이 유발의 도입을 통해 초파리 유전학은 현저히 진보하게 되었다 [Rubin and Spradling, 1982, Science 218:348-353]. P-인자를 비롯한 다수의 트랜스포존은 그들의 천연 숙주 밖에서는 작용성이 없는데, 이는 숙주의 인자가 전위에 관여한다는 것을 제안하는 것이다 [Handler et al, 1993,rchives of Insect Biochemistry & Physiology 22:373-384].

Tc1/마리너(Mariner) 계열의 일원들을 비롯한 트랜스포존 시스템이 마우스 및 제브라피쉬 다니오 레리오(Danio rerio)에서 사용되어 왔다. 비교 계통발생학적 접근법을 사용함으로써 합성 Tc1-유사(like) 트랜스포존 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)(SB)가 마우스 및 인간 세포에서 활성인 것이 입증되었다 ([Ivies et al, 1997, Cell 91:501-510]; [Luo et al, 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:10769-10773]). 슬리핑 뷰티 및 미노스(Minos)와 같은 트랜스포존이 마우스에서의 삽입 돌연변이 유발에 대하여 시험되었지만 ([Dupuy et al, 2001, Genesis 30:82-88]; [Fischer et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764]; [Horie et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:9191-9196]; [Zagoraiou et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:11474-11478]), 신규한 트랜스포존 삽입은 원 부위 부근에 심하게 집중되어 있고, 삽입율은 낮다는 사실에 기인하여 마 우스 유전학에서 이들 트랜스포존의 일반적인 적용은 여전히 한정되어 있다 ([Drabek et al, 2003, Genomics 81:108-111]; [Dupuy et al, 2001, Genesis 30:82-88]; [Fischer et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764]; [Horie et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:9191-9196]; [Horie et al, 2003, Mol. Cell Biol. 23:9189-9207]; [Zagoraiou et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98: 11474-11478]).

피기백 인자는 13-bp의 역위 말단 반복부 ("ITRs")와 594개-아미노산의 트랜스포사제를 갖는 2472-bp의 트랜스포존이다 [Cary et al, Virology, Volume 161, 8-17, 1989]. 양배추 자벌레 나방인 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터의 피기백 전위 인자 [Cary et al, Virology, Volume 161, 8-17, 1989]는 지중해 열매 파리인 세라티티스 카피타타(Ceratitis capitata)에서 효과적인 유전자-전달 벡터인 것으로 밝혀졌다 [Handler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 95, 7520-7525, 1998]. 피기백 프로모터 조절하에 변형되지 않은 트랜스포사제 헬퍼를 사용하는 것은, 전사 조절 뿐만 아니라 효소 활성이 유지된다는 이유에서 피기백이 지중해 열매 파리에서 자율 기능을 보유한다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 관찰은, 모든 기타 성공적인 곤충 생식 계열 형질전환이 동일한 쌍시류 또는 또다른 쌍시류로부터 단리된 벡터를 사용하는 쌍시류 종으로만 한정되기 때문에 유일한 것이었다. 초기의 지중해 열매 파리 형질전환은 [Loukeris et al, Science, Volume 270, 2002-2005, 1995] 드로소필라 하이데이(Drosophila hydei)로부터의 미노스 벡터를 사용하였고 [Franz & Savakis, Nucl. Acids Res., Volume 19, 6646, 1991], 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)는 무스카 도메스티카(Musca domestica) [Warren et al, Genet. Res. Camb., Volume 64, 87-97, 1994]로부터의 헤르메스(Hermes) [Jasinskiene et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 95, 3743-3747, 1998] 및 드로소필라 마우리티아나(Drosophila mauritiana) [Jacobson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 83, 8684-8688, 1986]로부터의 마리너 [Coates et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 95, 3748-3751, 1998]로부터 형질전환되었다. 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster)는 헤르메스 [O'Brochta et al, Insect Biochem. Molec. Biol., Volume 26, 739-753, 1996], 마리너 [Lidholm et al, Genetics, Volume 134, 859-868, 1993], 미노스 [Franz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 91, 4746-4750, 1994], 및 원래 그 자신의 게놈에서 발견되는 P 및 호보(hobo) [Rubin and Spradling, 1989; Blackman et al, EMBO J., Volume 8, 211-217, 1989]에 의해서도 형질전환되었다. 드로소필라 비릴리스(Drosophila virilis) 또한 호보 ([Lozovskaya et al, Genetics, Volume 143, 365-374, 1995]; [Gomez & Handler, Insect Mol. Biol., Volume 6, 1-8, 1997]) 및 마리너 [Lohe et al, Genetics, Volume 143, 365-374, 1996]에 의해서 형질전환되었다. 쌍시류 벡터에 대한 제한은 부분적으로 비-쌍시류 종으로부터 이용가능한 트랜스포존 시스템의 수가 제한되는 것에 기인하는 바, 기능성 트랜스포존이 숙주 게놈에 미칠 수 있는 유해 작용을 고려하면, 계통발생학적 트랜스포존 기능에 대한 제한은 예상되는 것이다. 실제로, 종간, 숙주 종내의 균주간,및 유기체내의 세포 유형간에도 트랜스포존 이동에 대하여 제기되는 조절이 고수준으로 반영된다 [Berg & Howe, Mobile DNA,merican Society for Microbiology, Washington, D.C. 1989].

피기백 (PB)은 그의 인자들이 일반적으로 잘라 붙이기(cut-and-paste) 메커니즘에 의해 하나의 게놈 부위로부터 절단되어 또다른 것으로 통합되는, DNA 트랜스포존에 속하는 것이다. 이는 13-bp의 역위 말단 반복부 (ITRs) 및 594개-아미노산 트랜스포사제를 갖는 2472-bp 트랜스포존이다 ([Cary et al, 1989, Virology 172:156-169]; [Fraser et al, 1995, Virology 211:397-407]; [Fraser et al, 1996, Insect Molecular Biology 5:141-151]). 피기백 인자는 드로소필라 멜라노개스터 및 기타 곤충들에서의 유전자 분석에 사용되어 왔다. 트랜스포존은, 삽입시 복제되는(duplicated) 테트라뉴클레오티드 TTAA 부위 내로 삽입된다는 것이 밝혀졌다 ([Fraser et al, 1995, Virology 211:397-407]; [Fraser et al, 1996, Insect Molecular Biology 5:141-151]). 유일의 트랜스포사제 및 TTAA 표적 부위 서열 때문에 트랜스포존이 신규한 DNA 트랜스포존 계열인 피기백 계열의 시조 일원으로서 제안되었다 [Robertson, 2002, In Mobile DNA II, Craig et al, eds. (Washington, D.C,SM Press), pp. 1093-1110]. 피기백은 4개의 목의 곤충에 이르는 12개 초과의 종의 생식 계열을 형질전환시키는데 사용되어 왔다 ([Handler, 2002, Insect Biochemistry & Molecular Biology 32:1211-1220]; [Sumitani et al, 2003, Insect Biochem. Mol. Biol. 33:449-458]). 돌연변이원으로서 피기백은 적어도 드로소필라에서의 P-인자만큼 효과적으로 전위한다 [Thibault et al, 2004, Nat. Genet. 36:283-287]. 레드 플라워 비틀인 트리볼리움 카스타늄(Tribolium castaneum)에서 피기백 전위는 또한 비-상동성 염색체 사이에서 효율적으로 발생한 다 [Lorenzen et al, 2003, Insect Mol. Biol. 12:433-440]. 다수의 피기백-유사 서열은 진균부터 포유동물까지 계통발생학적으로 다양한 종들의 게놈에서 발견되어 있고, 추가로 그들의 활성은 곤충으로만 한정되지 않을 수 있음을 시사한다 (Sarkar et al, 2003, Mol. Genet. Genomics 270:173-180). 실제, 최근 피기백(piggyBac)이 플라나리아인 기라르디아 티그리나(Girardia tigrina)에서 전위할 수 있는 것으로 나타났다 [Gonzalez-Estevez et al, 2003, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 100:14046-14051].

본원에서 참고를 논의하거나 인용하는 것은 참고가 본 발명의 선행 기술임을 승인하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

3. 발명의 요약

본 발명은 피기백이 포유동물을 비롯한 척추동물, 세포에서 생체내 및 생체외, 양자 모두에서 전위할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 피기백 전위는 정확한 잘라 붙이기 방식에 따라 거의 독점적으로 TTAA 부위에서 일어난다. 수정란으로 도입되었을 때 피기백 트랜스포존은 뚜렷한 염색체 영역을 선호함없이 마우스 게놈 내로 통합될 수 있고, 바람직하게는 전사 단위 내로 삽입될 수 있다. 또한, 피기백 인자는 복수의 마커 유전자를 수반할 수 있고, 다양한 삽입 부위에서 이들 유전자들이 발현될 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 피기백 트랜스포존 시스템, 및 "피기백-유사" 트랜스포존 계열의 기타 일원들은 마우스 및 기타 척추동물에서 효율적인 유전자 조작을 위해 가치가 있는 신규한 도구가 된다.

본 발명은 하나 이상의 그들의 세포의 게놈에 피기백-유사 트랜스포존 및/또는 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 본원에서는 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키거나 고정시키는 방법으로서, 동물 내로 피기백-유사 트랜스포존 및 트랜스포사제를 도입시키는 방법을 제공한다.

특정 실시태양에서, 본 발명은 (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계; (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 수양모 내로 이식하는 단계; 및 (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여; 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 생체외에서 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 제공한다.

적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산을 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 도입시키는 것에 대한 대안으로서, 중복은 핵산이 도입되는 세포내에서 일어나는 상동 재조합에 충분함에 따라, 피기백-유사 트랜스포존의 중복부를 포함하는 다수의 핵산이 도입될 수 있다. 이러한 대안은 거대 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 세포의 게놈 내로 도입시키는데 특히 유용하다. 따라서, 실시태양에서, 제1 핵산은 피기백-유사 트랜스포존의 좌측 말단과 삽입체의 적어도 일부를 포함할 것이고, 제2 핵산은 피기백-유사 트랜스포존의 우측 말단과 삽입체의 적어도 일부를 포함할 것이다. 오직 2개의 핵산만이 사용될 경우, 제1 핵산이 포함하는 삽입체 부분과 제2 핵산이 포함하는 삽입체 부부은 중복된다. 제3 핵산이 사용될 경우, 제3 핵산은 한쪽 단부에는 제1 핵산과의 중복 영역을, 나머지 한쪽 단부에는 제2 핵산과의 중복 영역을 가질 것이다. 도 14B는 그러한 실시태양을 도해한다. 이와 같은 다중 중복 핵산 (예로서, 2, 3, 4, 5개 이상)을 갖는 상동 재조합의 원리는 척추동물 세포 및 유기체의 게놈 내로 거대 삽입체를 갖는 피기백-유사 트랜스포존을 도입시키는데 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계; (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및 (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여; 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 선형 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 도입시키는 단계; (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및 (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여; 하나 이상의 그의 세포의 게놈내, 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에, 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 (a) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 핵산을 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 도입시키는 단계; (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및 (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여; 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기 백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 (a) (i) 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산; 및 (ii) 배아의 하나 이상의 세포의 게놈 내로, 또는 난모세포 또는 그로부터 유래된 배아의 하나 이상의 세포의 게놈 내로 각각 피기백-유사 트랜스포존의 통합을 유도하는데 유효한 양의 피기백-유사 트랜스포사제 폴리펩티드를 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 도입시키는 단계; (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및 (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여; 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계; (b) 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되는 조건하에서 세포를 배양하여 피기백-유사 트랜스포존이 배양물중의 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하여, 그의 게놈은 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 그의 게놈이 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법을 추가로 제공한다.

적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산을 배양물중의 척추동물 세포 내로 도입시키는 것에 대한 대안으로서, 중복은 핵산이 도입되는 세포내에서 일어나는 상동 재조합에 충분함에 따라, 피기백-유사 트랜스포존의 중복부를 포함하는 다수의 핵산이 도입될 수 있다. 기술한 바와 같이, 오직 피기백-유사 트랜스포존 부분과 그의 삽입체만을 포함하는 다중 핵산을 사용함으로써 본 대안은 거대 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 세포의 게놈 내로 생성하고 도입시키는데 특히 유용하다.

본 발명은 (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기 백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기 백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계; (b) 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되는 조건하에서 세포를 배양하여 피기백-유사 트랜스포존이 배양물중 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하여, 그의 게놈이 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 그의 게놈이 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 선형 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계; (b) 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되는 조건하에서 세포를 배양하여 피기백-유사 트랜스포존이 배양물중의 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하여, 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 핵산을 도입시키는 단계; (b) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 배양물중 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건하에서 세포를 배양하여, 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 (a) 하나 이상의 그의 생식 세포의 게놈에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 그의 생식 세포의 게놈에 피기백 -유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물과 교배하여 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (b) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 상기의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되고, 트랜스포존이 이동하도록 하여; 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 방법을 추가로 제공한다. 제1 및 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 (a) 하나 이상의 그의 생식 세포의 게놈에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 그의 생식 세포의 게놈에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물과 교배하여 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (b) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 상기의 피기백 -유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되고, 트랜스포존이 이동하도록 하여; 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 방법을 추가로 제공한다. 제1 및 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 (a) 하나 이상의 그의 생식 세포의 게놈에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 상기 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 그의 생식 세포의 게놈에 피기백 -유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물과 교배하여 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (b) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 상기의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되고, 트랜스포존이 이동하도록 하여; 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 방법을 추가로 제공한다. 제1 및 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 (a) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 (i) 적어도 2kb의 삽입체를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체인 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (b) 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여, 피기백-유사 트랜스포존을 상기 자손에 고정화시킴으로써 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 방법을 추가로 제공한다. 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다. 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 트랜스제닉 동물일 필요는 없지만, 트랜스제닉일 경우에는 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 (a) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 (i) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체인 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (b) 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여, 피기백-유사 트랜스포존을 상기 자손에 고정화시킴으로써 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 방법을 추가로 제공한다. 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다. 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 트랜스제닉 동물일 필요는 없지만, 트랜스제닉일 경우에는 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 (a) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 (i) 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체인 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (b) 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여, 피기백-유사 트랜스포존을 상기 자손에 고정화시킴으로써 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 방법을 추가로 제공한다. 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다. 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 트랜스제닉 동물일 필요는 없지만, 트랜스제닉일 경우에는 본원에 기술된 방법중 임의의 것에 따라 생성될 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 도입시키되, 상기의 하나 이상의 핵산중 적어도 하나는 선형인 단계; 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터, 다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 단계를 포함하는, 다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하되되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 회수한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 성체가 되도록 성장시키는 단계; (c) 단계 (b)의 성체인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계; (d) 단계 (c)의, 그의 게놈내 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하되, 여기에서, 상기 하나 이상의 자손은 각각 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물로서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 단계를 포함한다.

본 발명은 그의 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리를 생성하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 도입시키되, 상기의 하나 이상의 핵산중 적어도 하나는 선형인 단계; 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터, 다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 단계를 포함하는, 다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 회수한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 성체가 되도록 성장시키는 단계; (c) 단계 (b)의 성체인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체 척추동물과 교배시켜 다수의 자손을 얻는 단계; (d) 단계 (c)의 2 이상의 자손을 확인하되, 이들 각각은 그의 게놈내 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하며, 상기 2 이상의 자손은 각각 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물로서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리를 생성하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 단계를 포함하는 단계를 포함한다.

특정 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존 및/또는 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 추가로 제공한다. 특정 실시태양에서, 트랜스포존은 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하거나; 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내 존재한다.

특정 측면에서, 본 발명은 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포존 및/또는 피기 백-유사 트랜스포사제를 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포를 추가로 제공한다. 특정 실시태양에서, 트랜스포존은 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하거나; 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내 존재하고/거나; 척추동물 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 추가로 본원에 기술된 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 또는 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리를 제공한다. 특정 실시태양에서, 라이브러리는 본 발명의 방법에 의해 생산된다. 특정 실시태양에서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리는 적어도 6, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50 또는 적어도 100개의 일원을 포함하며, 그중 적어도 일부 또는 바람직하게 그들 모두는 게놈의 상이한 위치에 피기백-유사 트랜스포존을 포함한다. 특정 실시태양에서, 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100개의 일원, 또는 적어도 1000개의 일원을 포함하며, 그중 적어도 일부 또는 바람직하게 그들 모두는 게놈의 상이한 위치에 피기백-유사 트랜스포존을 포함한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 또는 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리를 제공하는데, 그의 게놈은 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 상기 트랜스포존은 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하거나; 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내 존재하고/거나; 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 질환 및 질병 치료 또는 예방에 유용하다. 따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이는 그의 게놈이 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 재조합 척추동물 세포를 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 척추동물의 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 핵산을 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상의 하나 이상의 세포에 전달하는 방법으로서, 그의 게놈은 (i) 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 상기 대상의 하나 이상의 세포에서 피기백-유사 트랜스포사제의 발현을 지시하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 투여함으로써, 투여 후, 피기백-유사 트랜스포사제를 상기 대상의 하나 이상의 세포의 게놈으로 통합시켜, 척추동물의 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 핵산을 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 전달하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스일 수 있다.

본 발명은 추가로 그의 게놈이 (i) 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 바이러스, 예로서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스를 제공한다.

피기백-유사 트랜스포존은 정확하게 절제되기 때문에, 본 방법은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에 의해 나타나는 표현형이 피기백-유사 트랜스포존에 의해 유발되는 것인지를 여부를 결정하는데 유용할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 방법은 (a) 피기백-유사 트랜스포존이 절제되는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 하나 이상의 자손을 생성하고; (b) 자손내 피기백-유사 트랜스포존의 절제와 표현형의 복귀 사이에 상관관계가 존재하는지 여부를 결정하되, 여기에서, 상관관계는 표현형이 피기백-유사 트랜스포존에 의해 유발되는 것임을 나타냄으로써, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에 의해 나타나는 표현형이 피기백-유사 트랜스포존에 의해 유발되는 것인지를 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존은 인핸서 트랩핑에 유용하다. 따라서, 본 발명은 인간을 제외한 척추동물로부터, 또는 배양물중 척추동물 세포로부터의 인핸서를 단리시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 방법은 (a) 하나 이상의 그의 세포 또는 조직의 게놈내에 최소한의 프로모터 조절하의 리포터 유전자를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 또는 그로부터 유래된 자손의 하나 이상의 세포 또는 조직내 리포터 유전자의 발현을 평가하고; (b) 하나 이상의 세포 또는 조직내 리포터 유전자 발현의 원인이 되는 피기백-유사 트랜스포존 측면에 위치하는 핵산을 단리시켜; 인간을 제외한 척추동물로부터 인핸서를 단리시키는 것을 포함한다. 다른 측면에서 배양물중 재조합 척추동물 세포로부터 인핸서를 단리시키는데 유용한 방법으로서, 재조합 세포가 최소한의 프로모터 조절하의 리포터 유전자를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 것인 방법은 (a) 재조합 척추동물 세포 또는 그의 자손에서 리포터 유전자의 발현을 평가하고; (b) 재조합 척추동물 세포에서 리포터 유전자 발현의 원인이 되는 피기백-유사 트랜스포존 측면에 위치하는 핵산을 단리시켜; 배양물중에서 재조합 척추동물 세포로부터 인핸서를 단리시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 인간을 제외한 키메라 동물을 생성하는데 유용한 방법이다. 따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 (a) 그의 게놈내 (i) 부위-특이 리콤비나제 인식 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존에 대하여 동종 접합성인 유전자좌, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 상기 부위-특이 리콤비나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 배아를 생성하고; (b) 부위-특이 리콤비나제가 발현되고, 증식이 일어나는 조건하에서 인간을 제외한 트랜스제닉 배아를 배양하여; 그의 세포가 피기백-유사 트랜스포존에 대하여 모자이크인 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 그의 세포가 피기백-유사 트랜스포존에 대하여 모자이크인 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 생산되는 키메라 동물 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명은 추가로 본 발명의 실시에 적합한 물질을 포함하는 키트를 제공한다. 따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 용기에 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하고; (b) 제2의 용기에 (i) 배양물중의 척추동물 세포 또는 (ii) 인간을 제외한 척추동물의 난모세포를 포함하는, 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하고/거나, 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 삽입체를 수반한다. 특정 측면에서, 본 발명의 키트내의 적어도 하나의 핵산이 선형이다.

본원에서 청구하는 본 방법 및 조성물의 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본원에서 청구하는 본 방법 및 조성물의 특정 측면에서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 선형으로서, 하나 이상의 세포의 게놈은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함한다.

본원에서 청구하는 본 방법 및 조성물의 추가의 다른 측면에서, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 선형으로, 하나 이상의 세포의 게놈은, 각각이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본원에서 청구하는 본 방법 및 조성물의 추가의 다른 측면에서, 피기백-유사 트랜스포존은 핵산에 결합하고/거나 핵산을 변형시키는 단백질에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 핵산-변형 단백질은 DNA-결합 단백질, DNA-변형 단백질, RNA-결합 단백질, 또는 RNA-변형 단백질이다. 핵산-변형 단백질은 또한 부위-특이 리콤비나제에 대한 표적 부위, 예를 들면, FRT 또는 lox 리콤비나제에 대한 표적 부위일 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물의 추가의 다른 측면에서, 피기백-유사 트랜스포존은 선별가능한 마커를 포함한다. 추가의 다른 측면에서, 피기백-유사 트랜스포존은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 선별가능한 마커 및 리포터 유전자, 양자 모두를 포함한다. 또다른 특정 실시태양에서, 리포터 유전자는 트랜스포존이 도입되는 종에 대하여 내인성이다.

본 발명의 방법 및 조성물의 추가의 다른 측면에서, 피기백-유사 트랜스포존은 적어도 0.5kb, 적어도 1kb, 또는 적어도 1.5kb의 삽입체를 포함한다. 다른 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 적어도 2kb, 적어도 2.5kb, 적어도 3kb, 적어도 4kb, 적어도 5kb, 적어도 6kb, 적어도 7kb, 적어도 8kb, 적어도 9kb, 적어도 10kb, 적어도 1 1kb, 적어도 11.5kb, 적어도 13kb, 적어도 14kb, 또는 적어도 15kb의 삽입체를 포함한다. 다른 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 15kb 이하, 20kb 이하, 25kb 이하, 30kb 이하, 35kb 이하, 40kb 이하, 45kb 이하, 50kb 이하, 60kb 이하, 75kb, 또는 100kb 이하의 삽입체를 포함한다. 추가의 다른 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 1.5-3kb, 1.5-5kb, 1.5-10kb, 1.5-20kb, 1.5- 30kb, 1.5-50kb, 1.5-75kb, 2-5kb, 2-10kb, 2-20kb, 2-30kb, 2-50kb, 2-75kb, 3-5kb, 3-1Okb, 3-20kb, 3-30kb, 3-50kb, 3-75kb, 5-10kb, 5-20kb, 5-30kb, 5-50kb, 5-75kb, 10-20kb, 10-30kb, 10- 50kb, 또는 10-75kb 범위의 삽입체를 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물이 피기백-유사 트랜스포존, 및 피기백 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 양자 모두를 세포 또는 유기체 내로 도입시키는 것을 포함하는 경우, 피기백-유사 트랜스포존, 및 피기백 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상에 존재할 수 있다. 트랜스포존 및 트랜스포사제 영역이 별도의 핵산상에 존재할 경우의 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산은 DNA이고, 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산은 RNA로서, 이는 피기백-유사 트랜스포존이 세포 또는 유기체의 게놈내 고정화되도록 할 수 있다.

별법으로, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산 및 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산은 둘 모두 DNA일 수 있는데, 이는 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 또는 유기체를 생성할 수 있도록 한다. 바람직하게, 피기백 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 하나의 실시태양에서, 프로모터는 생식 계열내 트랜스포사제의 발현을 지시하며, 예로서는 편재성 프로모터, 또는 더욱 바람직하게, 생식 계열-특이 프로모터이다. 하나의 실시태양에서, 생식 계열 특이 프로모터는 남성-특이 프로모터 (예로서, 본원에 기술된 것과 같은 프로타민 1 (Prm) 프로모터)이다. 또다른 실시태양에서, 생식 계열 특이 프로모터는 여성-특이 프로모터 (예로서, ZP3 프로모터)이다.

본 발명의 치료학적 방법 및 예방학적 방법의 대상은 바람직하게 인간을 제외한 척추동물이다. 바람직한 실시태양에서, 대상은 인간 또는 인간을 제외한 동물이다. 특정 실시태양에서, 동물은 애완동물 (예로서, 고양이, 개) 또는 가축 (소, 말) 동물이다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물은 조류 (예로서, 닭 또는 기타 가금류), 또는 어류 (예로서, 제브라피쉬)이다. 다른 실시태양에서, 척추동물은 인간을 제외한 포유동물로는 인간을 제외한 영장류, 소, 고양이, 개, 말, 양, 마우스, 래트, 기니아 피그, 팬더, 및 돼지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시태양에서, 트랜스제닉 인간을 제외한 척추동물이 가축 동물이다.

본 발명의 재조합 세포는 임의의 척추동물 세포일 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포는 조류 (예로서, 닭 또는 기타 가금류) 또는 어류 (예로서, 제브라피쉬) 공급원의 것이다. 다른 실시태양에서, 세포는 제한하는 것은 아니지만, 영장류 (제한하는 것은 아니지만, 인간 세포 및 침팬지 세포 포함), 소, 고양이, 개, 말, 양, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 밍크, 팬더, 및 돼지를 비롯한 포유동물 공급원의 것이다. 다른 실시태양에서, 세포는 개구리 세포, 예로서, 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 세포이다. 특정 실시태양에서, 세포의 공급원은 가축 동물이다. 세포는 정상 세포이거나 병적 세포일 수 있고, 임의의 분화 유형 또는 상태일 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제 코딩-서열을 포함하는 핵산은 세포 또는 유기체 내로 도입되지 이전에 선형화됨으로써 핵산은 직렬연쇄체로서 유기체의 게놈으로 삽입되어 진다. 바람직하게, 본 발며의 방법 및 조성물에 사용되는 피기백-유사 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이고/거나, 피기백-유사 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 특징에 대한 임의의, 모든 치환을 포함하는 실시태양을 제공한다. 예를 들면, 피기백-유사 트랜스포존 삽입체 크기 또는 세포/유기체 라이브러리 크기와 관련하여 본원에 열거된 모든 값 및 모든 값들 사이의 범위 또한 본 발명에 포함된다.

4. 도면의 간단한 설명

도 1. 포유동물 세포 및 마우스용 피기백 2원성 트랜스포존 시스템의 트랜스포존 벡터 및 트랜스포사제 작제물. (도 1A) PB 도너 작제물. 다양한 프로모터에 의해 유도된 마커 또는 내인성 유전자 (회색으로 표시한 박스로서, 화살표는 전사 방향을 표시한다)를 한쌍의 PB 반복부 말단 (PBL 및 PBR, 검은색 화살표) 사이에 놓았다. 말단 위쪽의 화살촉 모양의 기호는 역 PCR을 위해 사용되는 프라이머의 상대적인 위치를 나타낸다. 트랜스포존의 전체 길이 또한 표시한다. 오픈형 박스는 플라스미드 백본 서열을 나타낸다. M: MfeI; B: BamHI; S: SwaI; A: AscI; H: HindIII (도 1B) PB 트랜스포사제 헬퍼 작제물. 사이토메갈로바이러스 (CMV), 베타-액틴 (Act), 또는 프로타민 1 (Prm1) 프로모터에 의해 유도된 피기백 트랜스포사제 유전자 (PBase) 다음에는 소 성장 호르몬 polyA (BGH pA) 또는 래빗 베타-글로빈 polyA (rBG pA)가 따랐다.

도 2. 포유동물 배양된 세포에서 피기백 통합. (도 2A) 293개의 세포에서 트랜스진 통합이 증진된 통계학적 결과. 헬퍼 플라스미드의 존재 또는 부재하에서 도너 트랜스포존 작제물의 형질감염으로부터 G418-내성 클론의 갯수를 점수화하였다. 각각의 갯수는 3회의 형질감염 실험으로부터 얻은 것의 평균값이다. 막대는 표준 편차를 나타낸다 (P<O.0001). (도 2B) 마우스 W4/129S6 ES 세포에서 트랜스진 통합이 증진된 통계학적 결과. 클론은 (A)에서와 같이 계수하였다. (도 2C) 마우스 ES 세포 형질감염 실험의 일례. 생존 클론은 G418 선별 후 메틸렌 블루로 염색되었다.

도 3. 마우스에서 피기백 인자 전위 (도 3A) 환형 플라스미드를 주사함으로써 수득한 모든 자손중에서 PCR 유전자 분석에 의해 측정된 트랜스포존-양성 시조의 비율. 검은색 막대 및 흰색 막대는 각각 도너 및 헬퍼 플라스미드의 공-주사 결과 또는 도나 플라스미드만을 주사한 결과를 나타낸다. PB 트랜스포사제의 존재로 트랜스제닉율은 증가하였다. (도 3B) PB[Act-RFP] 양성 시조의 써던 분석. 몇몇 경우에 있어서, 단일 시조 마우스 (AFO-41)에서 10개 초과의 통합이 관찰된 반면, 야생형의 대조군에서는 어떤 신호도 발견되지 않았다. (도 3C) 써던 분석을 통해 PB 인자의 생식 계열 유전을 나타내었다. 야생형 동물과 교배시킨 후, 시조 및 그의 자손을 분석하였다. 수컷 시조 (AFO-61)에서의 다중 PB[ Act - RFP ] 통합부 를 그의 자손과 격리시켰다. 단일 PB[ Act - RFP ] 전위 통합부를 수반하는 암컷 PB[Act-RFP] 시조 (AFO-47) (써던 및 역 PCR 결과를 통해 판단됨, 표 3에서 47T6) 또한 그의 트랜스포존을 그의 자손중 하나에 유전시켰다 (47-336).

도 4. 마우스 생식 계열에서 피기백의 정확한 절제 및 전위. Prm1-PBase 및 PB[Act-RFP]이 공-주사된 수컷의 시조 마우스를 생식 계열 전위 분석에 사용하였다. (도 4A) PB[Act-RFP] 트랜스포존의 확대된 구조. 게놈 DNA는 곡선으로 표시한 반면, PB 트랜스포존-함유 플라스미드 직렬연쇄체는 정렬형 박스로 표시한다. 제한 부위: M: MluI: EcoRV B: BglII A: Acc65I. 써던 분석을 위한 프로브의 위치는 검은색 선으로 표시한다. 절제 이벤트를 검출하기 위하여 사용된 프라이머는 화살촉 모양의 기호로 나타낸다. (도 4B) 시조 (BFO-33) 및 그의 자손은 써던 분석시 1.3kb 직렬연쇄체 신호 이외의 밴드를 나타내었고, 이는 생식 계열 전위가 발생하였음을 암시하는 것이다. (도 4C) (도 4A)에 나타낸 프라이머로 PCR 증폭시킨 후, 수개의 자손에서 정확한 절제로부터 예측되는 길이를 갖는 양성 밴드가 관찰되었다 (도 4A).

도 5. 피기백 벡터에서 트랜스진의 발현 (도 5A) 자손에서의 PB[ Act - RFP ] 발현을 통해 휴대용 장파 UV 광 조사하에서 적색 형광을 생성되었다. 동일한 단일 카피 트랜스포존을 수반하는 2마리의 양성 마우스 (화살표) 및 2마리의 음성 한배새끼 (별표)를 나타낸다. (도 5B) 시조 마우스와 그의 자손에서의 PB[ Act - RFP ] 발현. 적색 형광은 시조에너는 모자이크로 나타났다. 자손에서 트랜스포존을 격리시켰을 때 RFP 신호는 상이한 강도로 나타났다. 별표는 트랜스진-음성 한배새끼 를 표시한다. (도 5C) 및 (도 5D) 동일한 피기백 벡터내 2개의 트랜스진의 공-발현. 티로시나제 발현의 결과로서, PB[ K14 - Tyr , Act - RFP ] 시조는 백색광하에서는회색의 코트색을 나타낸 반면, 트랜스진-음성 한배새끼는 알비노 상태로 남아있었다 (도 5C, 각각 우측 및 좌측). UV 조사시, 시조로부터 적색 형광이 관찰되었다 (도 5D).

도 6. 마우스에서 피기백 통합 부위 (도 6A) 100개의 PB 통합 부위로부터의 측면 서열의 뉴클레오티드 조성. TTAA 표적 부위 특이성 이외에도, 측면 서열에는 Ts 및 As가 풍부하다는 것이 관찰되었다. 별표는 측면 서열을 무작위로 샘플링된 TTAA 대조군과 비교하였을 때 P<O.05인 것을 표시한다. (도 6B) 유전자에서 PB 삽입부의 분포. 엑손, 인트론, 5' 조절 서열 (전사 개시 부위에 인접한 10kb), 3' 조절 서열 (polyA 부위에 인접한 10kb)내 PB 삽입 위치의 백분율, 및 4개 모두 (전체)내 PB 삽입 위치의 백분율을 표시한다. 칸이 채워진 막대는 모든 공지 유전자 및 예측된 유전자로부터의 데이타를 나타내고, 빈칸의 막대는 공지 유전자 또는 ESTs로부터의 데이타를 나타내었다. (도 6C) 5' 영역에서 PB 삽입부의 분포. (도 6D) 3' 영역에서 PB 삽입부의 분포. (도 6E) 마우스에서 93개의 통합 부위 분석시 PB 통합은 2개의 가장 작은 염색체 (19번 및 Y)를 제외한 모든 염색체에서 적중한 것으로 나타났다. 칸이 채원진 화살촉 모양의 기호는 엑손에서의 적중을 나타내고, 검은색 화살촉 모양의 기호는 인트론에서의 적중을 나타내며, 빈칸의 화살촉 모양의 기호는 예측되는, 유전자간 영역에서의 적중을 나타낸다.

도 7. 다양한 포유동물 세포주에서의 피기백 통합 증가.

도 8 상이한 종에서 피기백은 전위할 수 있다.

도 9. 피기백은 마우스 절제하고 전위할 수 있다. 교배시켜 Act-PBase 및 PB 직렬연쇄체에 대하여 이중으로 양성인 마우스를 수득하였다. PB 측면에 위치하는 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 원래 부위로부터 트랜스포존의 절제를 검출하였다. 동일 개체로부터의 역 PCR에 의해 신규 트랜스폰 삽입이 추가로 밝혀졌다. 이러한 이벤트는 그의 PB 단일 양성 부모에서는 검출되지 않았다. DNA는 꼬리 샘플로부터 추출하였기 때문에 절제 및 전위는 체세포에서 발생하는 것으로 예측되어 진다.

도 10. Pmr-피기백 트랜스포사제 작제물과 피기백 트랜스포존의 공-주사에 의한 전위.

도 11A-C. 교배에 의한 전위. 도 11A. 교배 전략법을 사용하여 남성 생식 계열 특이 프로모터 (prm)를 추가로 시험하였다. 피기백 트랜스포존을 수반하는 마우스를 Pmr-PBase 트랜스진을 수반하는 마우스와 교배하여, 교배 전략법이 신규의 전위를 유도하는데 사용될 수 있음을 나타내는 결과를 얻었다. 도 11B. Act-PBase 및 PB 직렬연쇄체에 대하여 이중으로 양성인 마우스를 야생형 마우스와 교배시켰다. 역 PCR 및 써던 블롯에 의해 교배의 자손에서 신규의 전위 이벤트가 검출되었다. 시험된 신규의 전위 3개 모두는 다음 세대로 안정적으로 유전될 수 있었다. 도 11C. Pmr-PBase 및 PB 직렬연쇄체에 대하여 이중으로 양성인 수컷 마우스 (DFO-9)는 신규의 트랜스포존 삽입부를 수반하는 자손을 활발하게 생산하였다 (좌측 패널에서의 써던 및 역 PCR에 의해 밝혀짐). 약 50%의 신규 삽입부는 4개의 염 색체 상에서 추정의 원 부위에 근접하게 위치하였고, 이는 PB 점프시 국소적인 도약이 발생할 수 있음을 제안한다. 비자율 트랜스포존 (직렬연쇄체 또는 단일 카피)을 수반하는 마우스를 트랜스포사제를 수반하는 마우스 (예로서, 마우스 생식 계열에서 트랜스포사제를 특이적으로 발현시키는 Pmr-PBase)와 교배하였다. 트랜스포존/트랜스포사제에 대하여 이중으로 양성인 F1 마우스 (Pmr-Pbase의 경우에서는 오직 수컷 마우스만)를 야생형 마우스와 교배하였다. 다음 세대에서는 (F2), 써던 블롯 및 역 PCR을 사용하여 신규의 전위 부위를 클로닝하였다. Pmr-Pbase 및 Act-Pbase, 양자 모두를 사용하여, 시작자 계열로서 단일 카피의 트랜스포존을 수반하는 마우스를 사용한 경우에도, 시도한 매 재조합시마다 신규한 삽입부를 수득하였다. 분석한 전위중 하나는 염색체 5에서 기원하였고, 염색체 1에서 착수되었다.

도 12A-B. 피기백 삽입이 유전자 발현 패턴을 보고한다. lacZ-함유 피기백 트랜스포존은 그들이 삽입되어진 유전자의 발현 패턴을 보고한다. 2개의 일례: F27iR43 (도 12A) 및 Grb10 (도 12B)에서의 삽입. 도 12B에서는, lacZ 리포터 유전자를 수반하는 PB-기초 엑손 트랩 벡터의 결과를 나타낸다. 트랜스포존이 Grb10의 제1 인트론 내로 삽입되었을 때, 다른 것들에 의해 보고된 결과와 비교가능한 Grb10의 발현 패턴을 나타낸 마우스 배아의 lacZ 염색.

도 13A-B. 피기백 삽입이 마우스에서의 표현형을 유발할 수 있다. 2개의 일례: Pkd2 유전자내 삽입시 배아의 치사를 유발한다 (열성, Pkd2 동종 접합 배아에서 국소 출혈과 몸 전체 부종을 유발한다) (도 13A-B) 및 Eya1 유전자내 눈 결함을 유발하는데 (우성) (도 13B), 이는 종래의 넉아웃 방법에 의해 생성된 돌연변이체 마우스와 같다.

도 14A-B는 큰 DNA 조작을 척추동물 게놈 내로 삽입시키는 피기백-유사 트랜스포존 시스템의 용도를 설명한다. 도 14A는 플라스미드, 코스미드, P1 단편, 또는 하나 이상의 유전자들 (검은색 화살표로 나타냄)을 수반하고, 피기백-유사 트랜스포존의 역위 말단 반복부 (ITRs)로 클로닝되는 BAC 단편을 나타낸다. 피기백-유사 트랜스포사제 (원)의 존재하에서, 전체 카세트는 전위에 의해 게놈 (실선)내로 통합될 것이다. 별법으로 도 14B에 나타낸 바와 같이, 큰 염색체 영역은 수개의 부분적인 중복 단편으로 절단되고, 가장 바깥쪽에 있는 조작 2개는 각각 피기백-유사 ITR을 수반한다. 피기백-유사 트랜스포사제의 존재하에서 이들 단편들은 전위 및 상동 재조합에 의해 의해 게놈 (실선)내로 통합될 것이다.

5. 본 발명의 상세한 설명

본 발명은 척추동물 세포 및 인간을 제외한 척추동물 유기체에 피기백-유사 트랜스포존 시스템을 적용하는 것을 제공한다. 본 발명은 피기백-유사 트랜스포존 시스템의 성분들을 발현시키도록 조작된 척추동물 세포 및 인간을 제외한 유기체, 세포 및 유기체의 제조 방법, 조작된 세포 및 유기체의 라이브러리를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존을 세포의 게놈으로 도입하는 것에 관한 것이다. 세포가 또한 피기백-유사 트랜스포사제를 함유할 때, 트랜스포존은 유효하게 혼입된다. 논의된 바와 같이, 피기백-유사 트랜스포사제는 피기백- 유사 트랜스포사제 단백질 또는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산으로서 세포로 제공될 수 있다. 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산은 RNA 또는 DNA 형태를 취할 수 있다. 추가로, 세포에서 피기백-유사 트랜스포사제의 일시적인 발현 또는 장기간의 발현을 용이하게 하기 위하여 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산이 세포 내로 안정적으로 또는 일과적으로 혼입될 수 있다 추가로, 단백질 발현을 정량적 방식으로 또는 조직-특이 방식으로 조절하기 위해 프로모터 또는 기타 발현 조절 영역은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산과 작동하게 연결될 수 있다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존은 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 미세주사, 트랜스포존을 포함하는 핵산과 지질 소포체, 예로서, 양이온 지질 소포체의 조합, 입자 충격, 전기천공, DNA 축합 시약 (예로서, 인산칼슘, 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민) 또는 트랜스포존의 바이러스 벡터 내로의 혼입 및 바이러스 벡터와 세포의 접촉을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 기법중 임의의 것을 사용하여 하나 이상의 세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터가 사용되는 경우, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터를 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 바이러스 벡터들중 임의의 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 특정 마커를 수반하거나, 동물의 하나 이상의 세포에서 특정 단백질을 발현시키는 트랜스제닉 동물을 생산하는 용이하게 사용될 수 있다. 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 또다른 적용에서, 본 발명은 세포에서 피기백-유사 서열을 이동시키는 방법을 제공한다. 본 방법에서, 피기백-유사 트랜스포존은 세포중 DNA 내로 혼입된다. 추가의 피기백-유사 트랜스포사제 또는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산이 세포 내로 도입되고, 단백질은 핵산 단편을 세포 DNA내 제1 위치로부터 세포 DNA내 제2 위치로 이동 (즉, 이주)시킬 수 있다. 본 방법을 통해 핵산 단편은 게놈내 하나의 위치로부터 게놈내 또다른 위치로, 또는 예를 들면, 세포내 플라스미드로부터 당해 세포의 세포의 게놈으로 이주할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 세포는 배양물내 존재한다.

동물과 관련하여, 예를 들면, 하나는 그의 생식 세포중 적어도 일부에 피기 백-유사 트랜스포존을 포함하고, 나머지 하나는 그의 생식 세포중 적어도 일부에 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 2개의 성체를 교배하여 트랜스포존 및 트랜스포사제, 양자 모두를 포함하는 자손을 생성시킴으로써 피기백-유사 트랜스포존 또한 이동시킬 수 있다. 별법으로, (동일한 핵산 또는 별도의 핵산 상의) 피기백-유사 트랜스포존 및 트랜스포사제에 대한 핵산을 난자 또는 수정난 내로 공-주사하여 피기백-유사 트랜스포존 및 트랜스포사제 코딩 서열, 양자 모두를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생성함으로써 트랜스제닉 동물은 생성된다. 트랜스포사제 코딩 서열은 편재 또는 조직-특이 프로모터하에 배치되어 트랜스포존을 포함하는 적어도 일부으 세포에서 발현된다. 이로써 트랜스포존은 이동할 수 있다. 프로모터가 생식 계열에서 활성일 경우, 동물의 자손은 이동된 트랜스포존을 물려줄 수 있다. 이 동된 트랜스포존의 안정성을 보장하기 위하여 트랜스포사제-코딩 유전자를 포함하지 않는 자손을 선택한다. 그러한 자손에서 트랜스포존은 고정화된다.

피기백-유사 트랜스포사제 단백질 또는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산과 함께 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 다양한 척추동물 종에서 생식 계열 형질전환, 트랜스제닉 동물의 생산, 세포내 DNA로의 핵산 도입, 삽입 돌연변이 유발, 및 유전자 태깅을 위해 효능이 있는 도구이다.

본 발명은 추가로 의료 산업, 제약업계 및 축산업에서의 적용과 함께, 척추동물에서 본 시스템의 유효한 유전자 조작 및 분석을 위한 도구로서의 적용을 제공한다.

5.1. 피기백 -유사 트랜스포존 시스템

본 발명은 척추동물 세포에서 피기백-유사 트랜스포존 시스템의 용도에 관한 것이다. 그러한 시스템은 핵산 서열을 척추동물 세포의 DNA 내로 도입시키는데 사용된다. 피기백-유사 트랜스포사제는 피기백-유사 트랜스포존의 역위 반복부중 인식 부위에 결합하고, DNA, 예로서, 표적 세포의 게놈 DNA 내로의 트랜스포존의 혼입을 촉매화시킨다. 실시예에서 설명되는 바와 같이, 피기백-유사 트랜스포존과 피기백-유사 트랜스포사제-코딩 핵산의 조합을 통해 세포 또는 유기체 내로 트랜스포존 서열을 통합시킬 수 있다.

피기백-유사 트랜스포존은 피기백-유사 트랜스포사제의 존재하에 DNA상의 하나의 위치로부터 DNA상의 또다른 위치로 이주할 수 있다는 점에서 피기백-유사 트 랜스포존은 이동성이다. 피기백-유사 트랜스포존 시스템에는 활성 피기백-유사 트랜스포사제의 공급원, 및 트랜스포사제에 의해 인식되고 이동하게 되는 피기백-유사 트랜스포존 ITRs라는 2개의 기본 성분이 존재한다. ITRs의 이동을 통해 ITRs 사이의 개재 핵산 또한 이동할 수 있게 된다.

그러므로, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존은 2개의 성분: 피기백-유사 트랜스포사제 또는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산, 및 피기백-유사 트랜스포사제에 의해 인식되는 적어도 2개의 역위 반복부을 포함하는 핵산인, 클로닝된 피기백-유사 트랜스포존을 포함한다. 2개의 성분들은 이들이 함께 할 때 활성인 트랜스포존 활성을 제공한다. 사용시, 트랜스포사제는 역위 반복부에 결합하고, 개재 핵산 서열의 세포 DNA 내로의 통합을 촉진시킨다.

따라서, 본 조성물의 방법을 실시하는 것은 피기백-유사 트랜스포존 인자 및 피기백-유사 트랜스포사제 또는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존 시스템을 포함한다. 피기백-유사 성분들은 피기백 또는 임의의 관련된 피기백-유사 트랜스포존 시스템으로부터 유래할 수 있다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존에서, 좌측 및 우측 트랜스포존 말단 (피기 백-유사 트랜스포사제에 의해 인식되는 5' 및 3' 말단 역위 반복부을 포함한다)은, 표적 세포 게놈 내로 삽입되거나 선별가능한 마커 또는 표현형 마커를 코딩하는 핵산인 삽입체 측면에 위치하며, 이는 하기에 더욱 상세히 설명된다.

피기백-유사 트랜스포존의 좌측과 우측 말단 사이에 위치하거나 배치된 삽입체의 크기는 매우 다양할 수 있다. 실제로, 본 발명자는 놀랍게도 피기백이 14kb 이상의 거대 삽입체를 수반할 경우에도 안정적으로 전위할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 특정 실시태양에서, 삽입체는 적어도 0.5kb, 적어도 1kb, 적어도 1.5kb, 적어도 2kb, 적어도 2.5kb, 적어도 3kb, 적어도 4kb, 적어도 5kb, 적어도 6kb, 적어도 7kb, 적어도 8kb, 적어도 9kb, 적어도 1Okb, 적어도 11kb, 적어도 11.5kb, 적어도 13kb, 적어도 14kb, 또는 적어도 15kb이다. 다른 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 15kb 이하, 20kb 이하, 25kb 이하, 30kb 이하, 35kb 이하, 40kb 이하, 45kb 이하, 50kb 이하, 60kb 이하, 75kb, 또는 100kb 이하의 삽입체를 포함한다. 추가의 다른 특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 1.5-3kb, 1.5-5kb, 1.5-1Okb, 1.5-20kb, 1.5-30kb, 1.5-50kb, 1.5-75kb, 2-5kb, 2-10kb, 2-20kb, 2-30kb, 2-50kb, 2-75kb, 2.5-5kb, 2.5-10kb, 2.5-20kb, 2.5-30kb, 2.5-50kb, 2.5-75kb, 3-5kb, 3-10kb, 3-20kb, 3-30kb, 3-50kb, 3-75kb, 5-10kb, 5-20kb, 5-30kb, 5-50kb, 5-75kb, 10-20kb, 10-30kb, 10-50kb, 또는 10-75kb 범위의 삽입체를 포함한다.

삽입체의 크기가 트랜스포존을 표적 게놈 내로 통합시키는 트랜스포존 시스템의 능력을 불활성화시킬 만큼 충분히 클 경우, 트랜스포존은 상이한 핵산상의 중복부 (예로서, 2 또는 3 또는 4개)에 공급됨으로써 상동 재조합을 통해 상이한 핵산은 세포내에서 재조합될 수 있고, 피기백-유사 트랜스포사제의 존재하에 단일의 거대 트랜스포존으로서 게놈 내로 통합될 수 있을 것이다. 따라서, 실시태양에서, 제1 핵산은 피기백-유사 트랜스포존의 좌측 말단과 삽입체의 적어도 일부를 포함할 것이고, 제2 핵산은 피기백-유사 트랜스포존의 우측 말단과 삽입체의 적어도 일부 를 포함할 것이다. 오직 2개의 핵산만이 사용될 경우, 제1 핵산이 포함하는 삽입체 부분과 제2 핵산이 포함하는 삽입체 부부은 중복된다. 제3 핵산이 사용될 경우, 제3 핵산은 한쪽 단부에는 제1 핵산과의 중복 영역을, 나머지 한쪽 단부에는 제2 핵산과의 중복 영역을 가질 것이다. 도 14B는 그러한 실시태양을 도해한다. 이와 같은 다중 중복 핵산 (예로서, 2, 3, 4, 5, 6개 이상)을 갖는 상동 재조합의 원리는 척추동물 세포 및 유기체의 게놈 내로 거대 삽입체를 갖는 피기백-유사 트랜스포존을 도입시키는데 적용될 수 있다. 이러한 방식으로 50kb 이하, 60kb 이하, 75kb 이하, 100kb 이하, 120kb 이하, 140kb 이하, 160kb 이상 값의 이하의 삽입체를 포함하는 트랜스포존을 표적 세포의 게놈 내로 도입시킬 수 있다.

이러한 상동 재조합 시스템은 인트론, 엑손 및 조절 인자를 포함하는 전장의유전자와 같은 거대 DNA 조각을 표적 세포 내로 삽입시킬 수 있다. 각 핵산쌍 사이의 중복 정도는 표적 세포에 대한 재조합 조건에 따라 다르지만, 약 20개의 뉴클레오티드 내지 수개의 킬로베이스 만큼 작을 수 있다. 특정 실시태양에서, 중복 정도는 적어도 50개의 뉴클레오티드, 적어도 100개의 뉴클레오티드, 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드, 적어도 500개의 뉴클레오티드, 적어도 750개의 뉴클레오티드 또는 적어도 1kb이다. 다른 실시태양에서, 중복 정도는 750개 이하의 뉴클레오티드, 1kb 이하, 1.5kb 이하, 또는 1.5kb 이하이다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 또한 피기백-유사 트랜스포사제 활성의 공급원을 포함한다. 피기백-유사 트랜스포사제 활성은 피기백-유사 트랜스포존의 역위 반복부에 결합하고, 트랜스포존이 표적 세 포의 게놈 내로 통합되는 것을 매개하는 것이다. 임의의 적합한 피기백-유사 트랜스포사제 활성은 파라미터를 충족시키는 한, 본 방법에 사용될 수 있다. 피기백-유사 트랜스포사제 활성은 피기백-유사 트랜스포존 그 자체와 동일한 공급원으로부터, 또는 상이한 공급원으로부터의 것일 수 있다.

피기백-유사 트랜스포사제 활성의 공급원은 다양할 수 있다. 특정 실시태양에서, 공급원은 피기백-유사 트랜스포사제 활성을 나타내는 단백질일 수 있다. 그러나, 공급원은 일반적으로 피기백-유사 트랜스포사제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산이다. 공급원이 피기백-유사 트랜스포사제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산인 경우, 기술한 바와 같이 트랜스포사제 단백질을 코딩하는 핵산은 일반적으로 발현 모듈의 일부이고, 필요할 경우, 추가의 인자가 트랜스포사제 발현을 위해 제공된다. 이로써, 트랜스포사제는 표적 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 그러나, 특정 실시태양에서, 트랜스포사제는 단백질 또는 RNA로서 세포로 제공된다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존은 일반적으로 예로서, 플라스미드, 바이러스-기초 벡터, 선형 DNA 분자 등과 같은 벡터 상에서 표적 세포 내로 도입된다. 바람직하게, 피기백-유사 트랜스포존은 오픈 리딩 프레임중 적어도 일부를 함유하는 삽입체를 포함한다. 적합한 오픈 리딩 프레임은 섹션 5.14에서 제공한다. 하나의 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존 삽입체는 추가로 조절 영역, 예로서, 전사 조절 영역 (예로서, 프로모터, 인핸서, 사일렌서, 좌위-조절 영역, 또는 보다 인자)를 함유한다. 적합한 조절 영역은 섹션 5.11에서 제공한다. 바람직하게, 조 절 영역은 오픈 리딩 프레임과 연결되어 있다.

특정 실시태양에서, 트랜스포사제 활성의 공급원이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산일 경우, 피기백-유사 트랜스포존 및 트랜스포사제를 코딩하는 핵산은 별도의 벡터, 예로서, 별도의 플라스미드 상에 존재한다. 특정의 다른 실시태양에서, 트랜스포사제 코딩 서열은 트랜스포존과 동일한 벡터, 예로서, 동일한 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 동일한 플라스미드 상에 존재하는 경우, 피기백-유사 트랜스포사제 코딩 영역 또는 도메인은 트랜스포존 ITRs 바깥쪽에 위치한다.

본 발명의 트랜스포존 및 트랜스포사제 인자가 수득될 수 있는 예시적인 트랜스포존 시스템을 하기 표 1에 나열한다:

명칭 또는 설명	참조	적합한 공급원
pk[BIG-알파]피기백 형질전환 벡터	Genebank Accession No. AF402295	트랜스포존
피기백 헬퍼 플라스미드 pBlu-uTp, 전장 서열	Genebank Accession No. AY196821	트랜스포사제
도마도역병(Phytophtra Infestant) 피기백-유사 트랜스포존 피기Pi-1	Genebank Accession No. AY830111	트랜스포존 트랜스포사제
피기백 형질전환 벡터 pB-MCS w+	Genebank Accession No. AY196822	트랜스포존
피기백 형질전환 벡터 pB-UAS w+	Genebank Accession No. AY196823	트랜스포존
피기백 형질전환 벡터 pB-UGateway w+	Genebank Accession No. AY196824
피기백 형질전환 벡터 pB-UGIR w+	Genebank Accession No. AY196825	트랜스포존
피기백 유비퀴틴-트랜스포사제 P 대체 치환 EP3005	Genebank Accession No. AY196826	트랜스포사제
클로닝 벡터 피기백_PB	Genebank Accession No. AY515146	트랜스포존
클로닝 벡터 피기백_RB	Genebank Accession No. AY515147	트랜스포존
클로닝 벡터 피기백_WH	Genebank Accession No. AY515148	트랜스포존
헬리오씨스 비레센스 (heliothis virescens) 트랜스포존 피기백 트랜스포사제 유전자	Genebank Accession No. AY264805	트랜스포사제
50개 초과의 피기백-유사 서열	[Sarkar et al, 2003, Mol. Genet. Genomics 270:173-180]	트랜스포존 트랜스포사제
드로소필라 멜라노개스터내 피기백-유사 서열	[Kapitonov & Jurka, 2003, Proc Natl. Acad Sci USA 100(11):6569-74]	트랜스포존 트랜스포사제
다양한 종으로부터의 피기백-유사 서열	[Robertson, 2002, In Mobile DNA II, Craig et al, eds. (Washington, D.C, ASM Press), pp. 1093-1110]	트랜스포존 트랜스포사제

표 1 - 트랜스포존 시스템의 적합한 공급원

상기 표 1, 및 하기 섹션 6에서 제공되는 특정의 피기백-유사 트랜스포사제 서열 이외에도, 피기백-유사 트랜스포사제는 코딩된 단백질이 피기백-유사 트랜스포존과 관련하여 트랜스포사제 활성을 보유하는 한, 엄격한 혼성화 조건하에서 표 1에서 제공된 트랜스포사제-코딩 핵산과 혼성화할 수 있는 DNA에 의해 코딩될 수 있다. 특정 실시태양에서, 트랜스포사제는 표 1에서 제공된 트랜스포사제-코딩 서열에 관하여 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 일치도를 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

특정 실시태양에서, 피기백-유사 활성은 변경시키지 않으면서 피기백-유사 트랜스포사제의 아미노산 서열을 다양하게 보존적으로 변화시킬 수 있다. 이러한 변화는 보존적 돌연변이라고 명명되고, 즉, 특정 크기 또는 특징을 갖는 아미노산 분류에 속하는 아미노산은 특히, 예를 들면, 촉매 활성 또는 DNA 결합 활성과는 무관한 단백질의 영역내에서 또다른 아미노산을 치환할 수 있다. 피기백-유사 트랜스포사제의 기타 아미노산 서열은 트랜스포사제의 기능을 현저히 변경시키지는 않고, 본원에 제시된 서열에 관하여 보존적 변화를 함유하는 아미노산 서열을 갖는 트랜스포사제를 포함한다. 아미노산 서열 치환은 당해 아미노산이 속하는 부류의 다른 일원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 및 트립토판을 포함한다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하성 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함한다. 음전하성 (산성) 아미노산으로는 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 특히 바람직한 보존적 치환으로는 양전하를 유지시키기 위하여 Arg를 Lys로, 및 그 반대로; 음전하를 유지시키기 위하여 Asp를 Glu로, 및 그 반대로; 유리 하이드록실기를 유지시키기 위하여 Thr을 Ser로; 및 유리 아미노기를 유지시키기 위하여 Asn을 Gln을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

추가로, 특정 세포 유형에 바람직한 코돈, 예로서, 트랜스포사제 코딩 서열을 도입시키고자 하는 표적 세포에 대한 코돈을 사용하기 위하여 피기백-유사 트랜 스포사제를 코딩하는 특정 DNA 서열을 변형시킬 수 있다.

상기 표 1, 및 하기 섹션 6에 구체적으로 열거되어 있는 피기백-유사 트랜스포사제 서열 이외에도, 용어 "피기백-유사 트랜스포존"은 천연 또는 합성 트랜스포사제에 의해 절단될 수 있고, 게놈내 TTAA 표적 부위로 재삽입되어 인자 측면에 위치하는 표적-부위 복제(TSD)를 일으킬 수 있는 임의의 DNA 단편을 포함한다. 특정 실시태양에서, 이러한 서열은 표 1에 열거되어 있거나, 하기 섹션 6에 기술되는 피 기백 또는 피기백-유사 인자로부터 유래된다.

5.2. 피기백 -유사 트랜스포존 시스템 제조 방법.

본 방법에 사용되는 피기백-유사 트랜스포존 시스템의 다양한 인자, 예로서, 피기백-유사 트랜스포존 또는 트랜스포사제 인자를 포함하는 벡터는 제한 효소 절단,결찰 및 분자 클로닝의 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 본 벡터를 작제하는 하나의 프로토콜은 하기 단계를 포함한다. 먼저, 원하는 성분인 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 외래 서열을 함유하는 정제된 핵산 단편을 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 초기 공급원, 예로서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 벡터로부터 절단한다. 이어서, 원하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단편을 종래의 분리 방법, 예로서, 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 크기가 상이한 원치않는 단편으로부터 분리한다. 원하는 단편을 겔로부터 절제하고, 적절한 입체형상으로 함께 결찰시켜 본원에 기술된 바와 같은, 원하는 서열을 함유하는 환형 핵산 또는 플라스미드를 생산한다. 원하는 경우, 그렇게 작제된 환형 분자를 이어서 원핵생물 숙주, 예로서, E. 콜라이(E. coli)에서 증식시킨다. 이들 단계에 포함된 절단, 플라스미드 작제, 세포 형질전환 및 플라스미드 생산에 대한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 제한 및 결찰을 위해 필요한 효소는 상업적으로 구입가능하다 (예로서, [T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]; [Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalog 1982- 83, Bethesda Research Laboratories, Inc.] 참조한다). 본 방법에 사용되는 벡터를 작제하는 방법에 때한 추가의 일례는 하기 섹션 6에서 제공한다.

5.3. 핵산을 표적 세포 게놈 내로 통합시기 위해 피기백 -유사 트랜스포존을 사용한다

본원에 기술된 방법에서는 외래 핵산을 표적 세포 또는 유기체 내로 도입하고 안정적으로 통합시키는 것이 바람직한 다양한 적용에서의 용도를 발견할 수 있다.

관심의 대상이 되는 유기체는 척축동물인데, 다수의 실시태양에서 척추동물은 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 척추동물은 조류 (예로서, 닭 또는 기타 가금류), 또는 어류 (예로서, 제브라피쉬)이다. 다른 실시태양에서, 척추동물은 인간을 제외한 포유동물로는 인간을 제외한 영장류, 소, 고양이, 개, 말, 양, 마우스, 래트, 기니아 피그, 팬더, 및 돼지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시태양에서, 유기체는 개구리, 예로서, 제노푸스 래비스이다. 특정 실시태양에서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 가축 동물이다.

트랜스포존 시스템을 다세포 유기체에 직접 투여하는 것을 포함하는 실시태 양에서, 예를 들면, 유전자 요법의 목적을 위해서 (하기 섹션 5.4에서 보다 광범위하게 기술된다), 포유동물은 인간일 수 있다.

5.4. 다세포 유기체로의 피기백 -유사 전위 시스템의 도입 방법

다세포 유기체로의 피기백-유사 트랜스포존 시스템의 경로는 시스템 성분들을 수반하는 벡터의 성질, 전달 비히클의 성질, 유기체의 성질 등을 비롯한 수개의 파라미터에 따라 다르다. 이러한 투여 방식의 공통적인 특성은 트랜스포존 시스템 성분들을 표적 세포(들)로 생체내에서 전달한다는 것이다. 특정 실시태양에서, 선형 또는 환형 DNA, 예로서, 플라스미드를 표적 세포로 트랜스포존 시스템을 전달하기 위한 벡터로서 사용한다. 그러한 실시태양에서, 플라스미드는 수성 전달 비히클, 예로서, 생리 식염수중에서 투여될 수 있다. 별법으로, 다세포 유기체내 벡터의 분포를 조절하는 제제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 시스템 성분들을 포함하는 벡터가 플라스미드 벡터, 지질 기초의, 예로서, 리포좀인 경우, 지질 기초의 비히클이 벡터의 세포 또는 조직 특이 전달을 위한 특이 세포 유형에 대하여 표적될 수 있는 비히클이 사용될 수 있다. 방법을 개시하는 특허는 미국 특허번호 제5,877,302호; 제5,840,710호; 제5,830,430호; 및 제5,827,703호를 포함하며, 개시 내용은 본원에서 참고로 인용된다. 별법으로, 폴리리신 기초 펩티드가 담체로서 사용될 수 있되, 이는 표적 부위 등으로 변형될 수 있거나, 변형되지 않을 수 있다 ([Brooks,. I., et al. 1998, J. Neurosci. Methods V. 80 p: 137-47]; [Muramatsu, T., Nakamura, A., and H. M. Park 1998, Int. J. Mol. Med. V. 1 p: 55-62]). 추가의 다른 실시태양에서, 시스템 성분들은 바이러스 벡터, 예로서, 아 데노바이러스 유래 벡터, 신드비스 바이러스 유래 벡터, 레트로바이러스 유래 벡터 등, 하이브리드 벡터 등의 상에 혼입될 수 있다. 벡터와 전달 비히클은 단지 대표예일 뿐이다. 임의의 벡터/전달 비히클 조합물은 그가 트랜스포존 시스템을 다세포 유기체 및 표적 세포로 생체내에서 투여할 수 있는 한, 사용될 수 있다. 유전자 요법과 관련하여 적합한 벡터/전달 비히클은 하기 5.13에서 제공한다.

사용될 수 있는, 상이한 유형의 벡터와 전달 비히클이 다수 존재하기 때문에 다수의 상이한 경로로 투여될 수 있으며, 대표적인 투여 경로로는 경구, 국소, 동맥내, 정맥내, 복강내, 근육내 등을 포함한다. 특정의 투여 방식은 적어도 부분적으로는 피기백-유사 트랜스포존 시스템을 포함하는 벡터에 대하여 사용되는 전달 비히클의 성질에 따라 달라진다. 다수의 실시태양에서, 벡터 또는 피기백-유사 트랜스포존 시스템을 포함하는 벡터는 수성 기재 전달 비히클, 예로서, 생리 식염수를 사용하여 혈관 내로, 예로서, 동맥내 또는 정맥 내로 투여된다.

피기백-유사 트랜스포존 시스템의 인자, 예로서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제 공급원은 트랜스포존을 수반하는 벡터로부터 역위 반복부 측면에 위치하는 핵산을 절제한 후, 절제한 핵산을 표적 세포 게놈 내로 통합시키는데 충분한 조건하에서 다세포 유기체의 표적 세포 내로 도입되도록 하는 생체내 방식으로 다세포 유기체에 투여된다. 트랜스포존 벡터 그 자체의 구조에 따라, 즉, 벡터가 피기백-유사 트랜스포사제 활성을 갖는 산물을 코딩하는 영역을 포함하는지 여부에 따라, 본 방법은 추가로 필수적인 트랜스포사제 활성을 코딩하는 제2 벡터를 표적 세포 내로 도입시키는 것을 포함한다.

세포 내로 도입되는 트랜스포존 인자를 포함하는 벡터 핵산의 양, 및 다수의 실시태양에서, 트랜스포사제를 코딩하는 벡터 핵산의 양은 원하는 절제, 및 트랜스포존 핵산을 표적 세포 게놈 내로 삽입하는데 충분하다. 그 자체로서, 도입되는 벡터 핵산의 양은 충분한 양의 트랜스포사제 활성을 제공하여야 하고, 표적 세포 내로 삽입되어야 하는 충분한 카피수의 핵산을 제공하여야 한다. 표적 세포 내로 도입되는 벡터 핵산의 양은 사용되는 특정 도입 프로토콜, 예로서, 사용되는 특정의 생체내 투여 프로토콜의 효율에 따라 달라진다.

다세포 유기체에 투여되는 시스템의 각 성분의 특정 투여량은 트랜스포존 핵산의 성질, 예로서, 발현 모듈 및 유전자의 성질, 성분 인자가 존재하는 벡터의 성질, 전달 비히클의 성질 등에 따라 달라진다. 투여량은 당업자에 의해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 생리 식염수 비히클중에서 포유동물 내로 정맥 투여되는 별도의 플라스미드 상에 피기백-유사 트랜스포존 시스템 성분들이 존재하는 마우스에서, 다수의 실시태양에서 투여되는 트랜스포존 플라스미드의 양은 전형적으로 약 0.5 내지 40 범위이고, 전형적으로 약 25㎍인 반면, 투여되는 플라스미드를 코딩하는 피기백-유사 트랜스포사제의 양은 약 0.5 내지 25 범위이고, 일반적으로는 약 1㎍이다.

일단 벡터 DNA가 필수 트랜스포사제와 함께 표적 세포로 진입하게 되면, 역위 반복부 측면에 위치하는 벡터의 핵산 영역, 즉, 피기백-유사 트랜스포사제 인식되는 역위 반복부 사이에 배치되어 있는 벡터 핵산을 제공된 트랜스포사제를 통해 벡터로부터 절제하고 표적화된 세포의 게놈 내로 삽입한다. 그 자체로서, 벡터 DNA를 표적 세포 내로 도입한 후, 트랜스포사제 매개된 절제에 이어서 벡터에 의해 수반되는 외래 핵산을 표적화된 세포의 게놈 내로 삽입한다.

상기 섹션 5.1에 기술되어 있는 바와 같이, 크기가 다양한 핵산을 표적 세포 게놈 내로 통합시키기 위해 본 발명을 사용할 수 있다.

본 방법을 통해 핵산을 표적 세포 게놈 내로 안정적으로 통합시킬 수 있다. 안정적인 통합이란, 핵산이 일과적 기간보다 장시간동안 표적 세포 게놈내에 존재하는 상태로 남아있고, 염색체 유전 물질의 일부분 상에서 표적 세포의 자손에게로 전해지는 것을 의미한다.

5.5. 피기백 -유사 트랜스포존 을 포함하는 재조합 세포 생성 방법

형질전환된 세포의 생성을 위해서는 먼저 DNA가 물리적으로 숙주 세포에 배치될 필요가 있다. 현 형질전환 방법은 DNA를 세포 내로 도입시키기 위하여 다양한 기법을 사용한다. 형질전환의 한 형태에서 DNA는 마이크로피펫을 사용함으로써 직접 세포 내로 미세주사된다. 별법으로, 작은 DNA 결합 입자를 세포 내로 추진시키기 위하여 고속 유전자총을 사용할 수 있다. 또다른 형태에서, 세포는 폴리에틸렌 글리콜 존재에 의해 투과화됨으로써 DNA는 확산을 통해 세포로 진입하게 된다. DNA는 또한 DNA를 함유하는 다른 실체(entity)와 원형질체를 융합시킴으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 실체로는 미니세포, 세포, 리소좀 또는 기타 융합가능한 지질-표면화된 소체를 포함한다. 전기 천공 또한 DNA를 세포 내로 도입시키는데 허용되는 방법이다. 이러한 기법에서는 세포에 가역적으로 생체막을 투과시키는 고자장 강도의 전기 충격을 가하여 외래 DNA 서열이 진입할 수 있도록 한다. 본 발명에 따라 형질전환 작제물을 세포 내로 도입시키는 바람직한 방법은 작제물을 포함하는 수정란을 미세주사하는 것이다. 트랜스포존 역위 반복부 측면에 위치하는 DNA 서열은 유기체가 발생하는 동안 수정란의 게놈 내로 삽입될 것이고, 이 DNA는 모든 자손 세포로 전달되어 트랜스제닉 유기체를 생산하게 될 것이다. 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해 난에 미세주사하는 것은 이전에 기술된 바 있고, 형질전환된 포유동물을 생산하기 위해 사용되어 왔다 ([Hogan etal, Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y., 1986; Shirk et al, In Biotechnology For Crop Protection, Hedin et al (eds.),CS Books, Washington D.C., 135-146, 1988]; [Morgan et al, Annu. Rev., Biochem., Volume 62, 191-217, 1993] (상기 모두는 본원에서 참고로 인용된다)).

별법으로, 2개부의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 및 기타를 비롯한 바이러스를 통해 세포로 전달될 수 있다. 역위 말단 반복부 (ITRs) 측면에 위치하는 관심의 대상이 되는 트랜스진을 함유하는 트랜스포존 부분과 트랜스포사제를 코딩하는 유전자에 대한 전달 메커니즘은 수개로 가능하게 조합된다. 예를 들면, 트랜스포존 및 트랜스포사제 유전자, 양자 모두는 동일한 재조합 바이러스 게놈 상에 함께 함유될 수 있고; 단일 감염을 통해 피기백-유사 시스템의 2개부 모두가 전달되고, 이어서 트랜스포사제의 발현은 추후의 세포 염색체 내로의 통합을 위해 재조합 바이러스 게놈으로부터 트랜스포존의 절단을 지시한다. 또다른 일례에서, 트랜스포사제 및 트랜스포존은 바이러스 및/또는 비-바이러스성 시스템, 예로서, 지질-함유 시약의 조합에 의해 개별적으로 전달될 수 있다. 이러한 경우 트랜스포사제 및/또는 트랜스포존은 재조합 바이러스에 의해 전달될 수 있다. 모든 경우에 있어서 발현된 트랜스포사제 유전자는 염색체 DNA 내로의 통합을 위해 그의 수반체 DNA (바이러스 게놈)으로부터의 트랜스포존의 유리를 지시한다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 척추동물 기원의 임의의 세포주 또는 1차 세포주 내로 도입될 수 있다.

특정 실시태양에서, 세포는 세포주, 예로서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, 다발골수종 (예로서 NSO, NSI), HT-1080, 또는 W138 세포이다. 척추동물 세포는 또한 세포 융합 이벤트의 산물, 예로서, 하이브리도마 세포일 수 있다.

특정 실시태양에서, 세포는 분화다능성 세포 (즉, 그의 후손이 수개의 제한된 세포 유형, 예로서, 조혈 줄기 세포 또는 기타 줄기 세포로 분화할 수 있는 세포) 또는 분화전능성 세포 (즉, 그의 후손이 유기체에서 임의의 세포 유형, 예로서, 배아 줄기 세포가 될 수 있는 세포)일 수 있다. 세포, 예로서, 난모세포, 난, 및 하나 이상의 배아 세포 또한 본 발명에서 주시된다.

추가의 다른 실시태양에서, 세포는 다양한 기관 또는 조직으로부터의 성숙한 세포일 수 있다. 그러한 세포로는 림프구, 간세포, 신경 세포, 근육 세포,다양한 혈액 세포, 및 유기체의 다양한 세포들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

5.6. 피기백 -유사 트랜스포존을 포함하는 재조합 동물을 생성하는 방법

상기 기술한 피기백-유사 트랜스진은 인간을 제외한 포유동물 내로 도입된다. 설치류, 예로서, 마우스 및 래트, 토끼, 양과 동물, 예로서, 양 및 염소, 돼지과 동물, 예로서, 돼지, 및 소과 동물, 예로서, 소 및 버팔로를 비롯한, 대부분의 인간을 제외한 포유동물이 적합하다.

몇몇의 트랜스제네시스 방법에서, 트랜스진은 수정한 난모세포의 전핵으로 도입된다. 몇몇 동물, 예로서, 마우스의 경우, 수정은 생체내에서 실시되고, 수정한 난세포는 외과적으로 제거된다. 기타 동물, 특히 소의 경우, 살아있는 동물 또는 도살장 동물로부터 난세포를 제거하고 시험관내에서 난세포를 수정시키는 것이 바람직하다. WO 91/08216 (DeBoer et al)을 참조한다. 시험관내 수정을 통해 트랜스진을 통합을 위해 최적인 세포 주기중의 시기 (S기 이후는 아니다)에 실질적으로 동조인 세포 내로 도입될 수 있다. 트랜스진은 보통 미세주사에 의해 도입된다. 미국 특허번호 제4,873,292호를 참조한다. 이어서, 수정한 난모세포를 착상전 약 16-150개의 세포를 함유하는 세포를 수득할 때까지 시험관내에서 배양한다. 배아의 16-32 세포기를 상실기로서 기술한다. 32개 초과의 세포를 함유하는 착상전 배아는 포배로서 명명된다. 이들 배아는 전형적으로 64 세포기에 포배강의 발생을 나타낸다. 수정한 난모세포를 착상전 단계까지 배양하는 방법은 ([Gordon et al (1984) Methods Enzymol. 101, 414]; [Hogan et al, Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C.S.H.L. N.Y. (1986)] (마우스 배아); 및 [Hammer et al. (1985) Nature 315, 680] (래빗 및 돼지 배아); [Gandolfi et al (1987) J. Reprod. Fert. 81, 23-28]; [Rexroad et al. (1988) J. Anim. Sci. 66, 947-953] (양 배아) 및 [Eyestone et al. (1989) J. Reprod. Fert. 85, 715-720]; [Camous et al (1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785]; 및 [Heyman et al. (1987) Theriogenology 27, 5968] (소 배아)] (모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다))에 기재되어 있다. 종종 착상전 배아를 착상까지의 기간동안 냉동 저장한다. 착상전 배아를 적절한 암컷으로 옮겨 트랜스진이 통합되는 발생 단계에 따라 트랜스제닉 또는 키메라 동물을 출생시킨다. 키메라 포유동물을 교배시켜 순종 생식 계열 트랜스제닉 동물을 형성할 수 있다.

별법으로, 트랜스진을 배아 줄기 세포 (ES) 내로 도입시킬 수 있다. 이러한 세포는 시험관내에서 배양된 착상전 배아로부터 수득한다. [Bradley et al. (1984), Nature 309, 255-258] (모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다). 트랜스진은 전기천공 또는 미세주사에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 형질전환된 ES 세포는 인간을 제외한 동물로부터의 포배와 조합된다. ES 세포는 배아를 집락화하고, 몇몇 배아에서는 생성된 키메라 동물의 생식 계열을 형성한다. [Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988)] (모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다)을 참조한다. 별법으로, ES 세포는 핵제거된 수정한 난모세포로 이식시켜 트랜스제닉 포유동물을 생성하기 위한 핵의 공급원으로서 사용될 수 있다.

2개 이상의 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물을 생산하기 위하여, 예로서, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제 성분들이 별도의 핵산을 통해 동물 내도 도입되는 실시태양에서, 트랜스진은 단일 트랜스진에 대한 것과 동일한 방법을 사용하여 동시에 도입될 수 있다. 별법으로, 트랜스진은 처음에 별도의 동물 내로 도입되고 동물을 교배시킴으로써 동일 게놈 내로 조합될 수 있다. 별법으로, 트랜스진중 하나를 함유하는 제1 트랜스제닉 동물을 생산한다. 이어서, 제2 트랜스진을 수정한 난세포 또는 동물로부터의 배아 줄기 세포 내로 도입한다.

몇몇 실시태양에서, 그의 길이가 약 50kb를 초과하는 트랜스진은 중복 단편으로서 작제된다. 그러한 중복 단편은 동시에 수정한 난모세포 또는 배아 줄기 세포 내로 도입되고, 생체내에서 상동 재조합된다. WO 92/03917 (Kay et al.) (모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다)을 참조한다.

통상적으로 기술된 트랜스진을 포유동물의 수정란 (전핵기의 것)으로 미세주사하여 도입하고, 추가로 얼마간 인큐베이션시킨 후 난을 암컷 포유동물 (수혜 포유동물)의 수란관에, 또는 거짓임신에 동조인 그의 자궁에 직접 착상시키고, 자손을 수득함으로써 트랜스제닉 포유동물을 생성할 수 있다.

생성된 자손이 트랜스제닉인지 여부를 확인하기 위하여 하기 기술하는 도트-블롯팅, PCR, 면역조직학적, 보체-저해 분석법 등을 사용할 수 있다.

통상적으로 교배시키고 자손을 수득함으로써, 또는 초기화되었거나 초기화되지 않은 트랜스제닉 포유동물의 체세포의 핵을, 사전에 핵이 제거된 수정란 내로 전달 (핵 전달)하고, 수혜 포유동물의 수란관 또는 자궁에 상기난을 착상시키고, 클론 자손을 수득함으로써 상기와 같이 생성된 트랜스제닉 포유동물을 번식시킬 수 있다.

선별가능한 마커가 도입된 DNA 서열의 일부로서 포함되어 있는 경우, 형질전 환된 세포 및/또는 트랜스제닉 유기체 (숙주 세포의 DNA 내로 삽입된 DNA를 함유하는 것)를 형질전환되지 않는 세포 및/또는 형질전환된 유기체로부터 선별할 수 있다. 선별가능한 마커는, 예를 들면, 항생제 내성을 제공하는 유전자; 숙주의 생리를 변형시키는 유전자, 예로서, 예를 들면, 가시적으로 표현형을 변경시키는 녹색의 형광성 단백질 등을 포함한다. 이들 유전자를 함유하는 세포 및/또는 유기체는 형질전환되지 않는 세포/유기체를 죽이는 항생제, 살충제 또는 제초제 농축물의 존재하에서 생존가능하거나, 가시적으로 표현형을 변경시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는, 써던 블롯팅 및 중합효소 연쇄반응과 같은 표준 기법을 사용하여, DNA를 트랜스제닉 세포 및/또는 유기체로부터 단리시켜 도입된 DNA가 삽입되었는지 여부를 확인할 수 있다.

5.7. 피기백 -유사 트랜스포존 수반 부위-특이 리콤비나제 인식 부위

본 발명의 피키백-유사 트랜스포존 시스템을 사용하여 인간을 제외한 척추동물의 염색체에 무작위적으로 부위-특이 리콤비나제 인식 서열을 삽입시킴으로써 돌연변이체 및/또는 모자이크 동물이 용이하게 생성될 수 있도록 할 수 있다. 특정 실시태양에서, 부위-특이 리콤비나제는 Cre-loxP 시스템 또는 FLP-FRT 시스템이다 ([Kilby, 1993, Trends Genet 9(12):413-421] 및 본원에서 인용되는 참고문헌을 참조한다).

상이한 염색체 상에 통합된 2개의 부위-특이 리콤비나제 인식 서열 사이의 재조합을 통해 염색체들 사이의 전좌를 일으킬 수 있다. 그러한 전좌가 발달이상 또는 종양발생을 이끄는 돌연변이을 생성하는 공통된 수단이 된다.

정반복부 배향으로 2개의 부위-특이 리콤비나제 인식 서열 사이의 재조합이 이루어질 경우, 개재 DNA 서열 (예로서, 유전자)을 절제할 수 있다. 그러한 이벤트는 잠재적으로는 가역성이지만, 세포 분열시 또는 분해에 의해 잘려진 DNA 서열의 손실은 돌연변이를 비가역적으로 만든다. 임의의 유전자에서 형질제거 돌연변이(null mutation)는 이러한 방식으로 생성될 수 있고, 유전자의 기능은 특정 세포 및/또는 특정 발달 단계에서 연구된다.

역위 정반복부 배향으로 2개의 부위-특이 리콤비나제 인식 서열 사이의 재조합이 이루어질 경우, 개재 서열 또는 유전자는 역전될 수 있다. 역전에 의해 유전자는 활성화되거나 불활성화될 수 있다. 유전자 활성이 검출가능할 경우 (예로서, 선별가능한 마커, 조직화학적 마커, 수용체 유전자), 유전자 활성화 또는 불활성화의 검출을 통해 세포와 그의 후손을 마킹하는 재조합 이벤트를 확인함으로써 세포 계통을 추적할 수 있다. 유전자 활성과는 무관하게, 부위-특이 리콤비나제 인식 서열의 통합 부위의 차이를 모니터함으로써 세포 계통을 추적할 수 있다.

염색체상에서 통합된 부위-특이 리콤비나제 인식 서열과 염색체외 유전 물질상에서 통합된 부위-특이 리콤비나제 인식 서열 사이의 재조합이 이루어질 경우, 유전 물질이 염색체 내로 삽입될 수 있다. 이러한 방식으로 생성된 삽입은 염색체 부위-특이 리콤비나제 인식 서열에 의해 지정되는 게놈 부위에 단일 카피수의 트랜스진이 부위-특이 통합된 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 생성하는 수단을 제공한다.

바람직하게, 개재 서열 또는 유전 물질은 유전자 예로서, 예를 들면, 발생 유전자, 필수 유전자, 사이토카인 유전자, 신경전달물질 유전자, 신경전달물질 수용체 유전자, 종양유전자, 종양 억제자 유전자, 선별가능한 마커, 또는 조직화학적 마커, 또는 그의 일부분을 함유한다. 재조합에 의해 조절 영역을 유전자에 병치시킴으로써, 또는 조절 영역을 근접부위로부터 분리시킴으로써 각각 유전자를 활성화 또는 불활성화시킬 수 있다.

5.8. 엑손 트랩핑

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 또한 다양한 조직에서 차별적인 유전자 발현을 검출하는 엑손-트랩핑 클로닝, 또는 프로모터 트랩 방법에서 사용될 수 있다. 예로서, ([D. Auch & Reth, et al, "Exon Trap Cloning: Using PCR to Rapidly Detect and Clone Exons from Genomic DNA Fragments", Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 22, p. 6743]; [Buckler, et al, 1996, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4005-4009 (1991)]; [Henske, et al,m. J. Hum. Genet. 59:400-406])을 참조한다. 그러한 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 바람직하게, 엑손 스플라이싱 도너 및 어셉터 부위 측면에 위치하는 검출가능한 마커 유전자, 예로서, GFP 또는 친화성 태그를 포함한다. 따라서, 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 피기백-유사 트랜스포존이 삽입된 유전자좌에 의해 코딩되는 단백질내에서 번역됨으로써, 유전자좌에 의해 코딩되는 단백질이 검출될 수 있도록 한다.

5.9. 폴리펩티드 합성 적용

본원에 기술된 트랜스제닉 및 모자이크 동물 및 재조합 세포를 생성하는 방법에서는 폴리펩티드, 예로서, 관심의 대상이 되는 단백질의 합성에서의 용도를 발 견할 수 있다.

그러한 적용으로, 그의 몇몇 또는 모든 세포의 게놈이 필수 및/또는 원하는 발현 조절 서열, 예로서, 프로모터 등과 함께 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 삽입체 (즉, 발현 모듈)를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 것으로서, 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 숙주로서의 역할을 하는 트랜스제닉 또는 모자이크 동물이 생성된다. 유사하게, 그러한 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 배양물중의 척추동물 세포가 이들 방법에서 사용될 수 있다. 이어서, 트랜스제닉 또는 모자이크 동물 또는 재조합 세포를, 피기백-유사 트랜스포존에 포함된 삽입체에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시키기에 충분한 조건에 가한다. 이어서, 발현된 단백질을 수거하고, 바람직한 경우, 임의의 편리한 프토토콜을 사용하여 정제한다.

트랜스제닉 또는 모자이크 동물과 관련하여, 본 발명의 방법은 동물에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키거나, 관심의 대상이 되는 단백질을 고도한 수준으로 발현시킬 수 있는 세포주를 생산하는 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명에 의해 생산되는 동물 및 세포는 관심의 대상이 되는 단백질의 생산을 위한 "생물반응기"로서 유용하다. 관심의 대상이 되는 단백질은 세포 또는 동물에 대하여 내인성이거나 외래의 것일 수 있다.

게다가, 본원에 기술된 방법은 가축의 형질을 개선시키는데 유용하다.

5.10. 치료학적 적용

본 발명의 방법은 피기백-유사 트랜스포존 시스템이 치료학적 핵산, 예로서, 유전자를 표적 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키기 위하여 사용되는 치료학적 적용, 유전자 요법 적용에서 유용하다. 매우 다양한 치료학적 핵산을 대상에게 전달하기 위하여 피기백-유사 트랜스포존 시스템이 사용될 수 있다. 관심의 대상이 되는 치료학적 핵산으로는 표적 숙주 세포에서 결손 유전자를 대체하는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임, 예로서, 유전자 결손에 기초한 병적 증상의 원인이 되는 것; 암 치료에 치료학적 유용성을 갖는 것 등을 포함한다. 일례의 치료학적으로 유익한 코딩 서열은 섹션 5.13에 개시한다.

상기 기술된 바와 같은 본 발명의 중요한 특징은 본 발명이 생체내 유전자 요법 적용을 위해 사용될 수 있다는 점이다. 생체내 유전자 요법 적용은 표적 세포 또는 치료학적 유전자의 발현이 요구되는 세포는 트랜스포존 시스템과의 접촉 이전에 숙주로부터 제거되지 않는 것을 의미한다. 대조적으로, 트랜스포존 시스템을 포함하는 벡터는 다세포 유기체로 직접 투여되고, 표적 세포에 의해 흡수된 후, 유전자는 표적 세포 게놈 내로 통합된다.

5.11. 프로모터

본 발명의 하나의 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존 내로 삽입되는 핵산은 ORF의 발현을 조절하는 인자에 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임("ORF")을 코딩한다. 게다가, 특히 트랜스포사제를 코딩하는 핵산이 동물의 게놈 내로 도입되는 본 발명의 실시태양에서 조절 인자는 피기백-유사 트랜스포사제의 발현을 조절하는데 바람직할 수 있다.

바람직하게, 피기백-유사 트랜스포존내 발현 모듈은 트랜스포존이 포함하는 ORF의 발현을 제공하는 전사 조절 인자를 포함한다. 특정 전사 조절 인자의 일례로 [Dijkema et al, EMBO J. (1985) 4:761]에 기재되어 있는 것과 같은 SV40 인자; [Gorman et al, Proc. Nat'l Acad. Sci USA (1982) 79:6777]에 기재되어 있는 것과 같은, 라우스 육종 바이러스의 LTR로부터 유래된 전사 조절 인자; [Boshart et al, Cell (1985) 41:521]에 기재되어 있는 것과 같은, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 의 LTR로부터 유래된 전사 조절 인자; hsp70 프로모터([Levy-Holtzman, R. and I. Schechter (Biochim. Biophys. Acta (1995) 1263: 96-98) Presnail, J. K.] 및 [M. A. Hoy, (Exp. Appl. Acarol. (1994) 18: 301-308)]) 등을 포함한다.

특정 실시태양에서, 조절 인자는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있고, 트랜스포사제 유전자의 발현을 일으키기 위하여 사용될 수 있는 다양한 것이 존재한다. 유도성 시스템으로는, 예를 들면, 열 쇼크 프로모터 시스템, 금속티오네인 시스템, 글루코코르티코이드 시스템, 조직 특이 프로모터 등을 포함한다. 열 쇼크에 의해 조절되는 프로모터, 예로서, 보통 70-kDa 열 쇼크 단백질을 코딩하는 유전자와 관련된 프로모터는 승온에 노출된 후 발현을 수배 증가시킬 수 있다. 글루코코르티코이드 시스템 또한 유전자를 발현시키는 작용을 잘한다. 시스템은, 스테로이드 호르몬 (즉, 글루코코르티코이드 또는 그의 합성 등가물줄 하나, 예로서, 덱사메타손)의 존재하에 호르몬과 복합체를 형성하는 글루코코르티코이드 수용체 단백질 (GR)를 코딩하는 유전자로 구성된다. 이어서, 이러한 복합체는 글루코코르티코이드 반응 인자 (GRE)로 명명되는 짧은 뉴클레오티드 서열 (26 bp)에 결합하고, 이러한 결합을 통해 연결된 유전자의 발현을 활성화시킨다. 따라서, 유도성 프로모터는 도입된 유전자의 발현을 조절하는, 환경적으로 유도성인 프로모터로서 사용될 수 있다. 유전자 산물의 작용성의 활성을 조절하는, 유도성 프로모터 이외의 다른 수단들은 당업자에게 공지되어 있다.

특정 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포사제는 생식 계열 특이 프로모터의 조절하에 발현된다. 특정 실시태양에서, 생식 계열 특이 프로모터는 남성-특이 프로모터 (예로서, 본원에 기술된 것과 같은 프로타민 1 (Prm) 프로모터)이다. 다른 실시태양에서, 생식 계열 특이 프로모터는 여성-특이 프로모터 (예로서, ZP3 프로모터, 예로서, 뮤린 ZP3 (mZP3) 프로모터 [Lira et al, 1990, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 87(18):7215-9])이다.

생물반응기로서 가축 동물을 사용하는 경우, 단백질은 우유, 뇨, 혈액 또는 난으로 대량 생산될 수 있다 프로모터는 우유, 뇨, 혈액 또는 난의 발현을 촉진시키는 것으로 공지되어 있고, 이는 각각 카세인 프로모터, 마우스 뇨 단백질 프로모터, β-글로빈 프로모터 및 오브알브민 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

5.12. 피기백 -유사 트랜스포존 돌연변이 유발 및 유전자 발견

트랜스포존 태깅은, 트랜스제닉 DNA를 세포로 전달하여 유전자 내로 통합시킴으로써 삽입 돌연변이 유발에 의해 그를 불활성화시키는 기법이다. 본 공정에서, 불활성화된 유전자는 전위 인자에 의해 태깅된 후, 돌연변이화된 대립유전자를 회수하는데 사용될 수 있다. 전위 입자의 삽입이 유전자의 기능을 파괴시킴으로써 이것인 특징적인 표현형을 나타내도록 할 수 있다.

게놈내에서 및 게놈간에 하나의 염색체 위치로부터 또다른 위치로 이동하는 그들 고유의 능력에 기인하여 전위 인자는 세균 ([Gonzales et al, 1996 Vet. Microbiol. 48, 283-291]; [Lee and Henk, 1996. Vet. Microbiol. 50, 143-148]), 드로소필라 ([Ballinger and Benzer, 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9402-9406]; [Bellen et al, 1989 Genes Dev. 3, 1288-1300]; [Spradling et al, 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10824-10830]), C. 엘레강스(C. elegans)[Plasterk, 1995. Meth. Cell. Biol.,cademic Press, Inc. pp. 59-80] 및 다양한 식물종 ([OpiggyBac-likeome and Baker, Curr. Opin. Cell Biol, 7, 406-413 (1995)])을 비롯한 특정 유기체의 유전자 조작에 급격한 변화를 가져왔다. 트랜스포존은 트랜스포존-태깅, 인핸서 트랩핑 및 트랜스제네시스를 위한 유용한 벡터로서 사용되어 왔다. 그러한, 모두는 아니지만, 대부분의 척축동물에는 상기와 같이 강력한 도구는 존재하지 않는다. 그의 간소함과 다양한 유기체에서 작용할 수 있는 능력에 있어, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 현재 DNA 트랜스포존 기술이 이용되지 못하는 종에 대하여 유효한 벡터로서 유용하다.

트랜스포존 태깅은 트랜스포존을 이동시켜 유전자 내로 "도약"시킴으로써 삽입 돌연변이 유발에 의해 그들을 불활성화시키는 기술이다. 이러한 방법은 [Evans et al, TIG 1997 13:370-374]에서 논의되고 있다. 본 공정에서, 불활성화된 유전자는 전위 인자에 의해 "태깅"된 후, 돌연변이화된 대립유전자를 회수하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 피기백-유사 트랜스포존 태그를 세포의 게놈 내로 도입시키는 유효한 방법을 제공한다. 태그가 특정 표현형과 관련된 단백질의 발현을 파괴시키는, 세포내의 위치로 삽입될 경우, 피기백-유사 트랜스포존을 함유하는 세포에서의 변경된 표현형의 발현은 특정 표현형을 트랜스포존에 의해 파괴된 특정 유전자와 관련시킬 수 있다. 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 태그로서의 역할을 한다. 역 PCR을 위해 디자인된 프라이머 또는 본 발명의 핵산 단편 측면에 위치하는 게놈 DNA를 서열화하기 위하여 디자인된 프라이머를 사용하여 파괴된 유전자에 대한 서열 정보를 수득할 수 있다.

태깅된 유전자를 단리시키는 방법은 수개 존재한다. 모든 경우에서 있어서, 게놈 DNA는 종래 기법 (상이한 조직 및 동물에 대해서는 달라진다)에 의해, 돌연변이화된 동물의 하나 이상의 조직으로부터의 세포로부터 단리된다. DNA는 트랜스포존 태그에서 전달할 수 있거나, 전달할 수 없는 (대개는 공지 부위에서 전달한다) 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단된다. 이어서, 생성된 단편은 플라스미드 또는 파지 벡터로 직접 클로닝되어 트랜스포존 DNA에 대한 프로브를 사용함으로써 확인될 수 있다 ([Kim et al., 1995 for references in Mobile Genetic Elements, IRL Press, D. L. Sheratt eds.]를 참조한다). 별법으로, DNA는 다수의 방법중 임의의 것으로 PCR 증폭될 수 있다. 아이즈바크(Izsvak) 및 아이비에스(Ivies) [1993, Bio기법. 15(5):814-8]의 LM-PCR 방법이 사용될 수 있다. LM-PCR 방법은 데본(Devon) 등 [1995, Nucleic Acids Res. 23(9): 1644-5]에 의해 변형된 바와 같이 실시될 수 있고, 트랜스포존 프로브에 대한 그의 혼성화에 의해 확인될 수 있다. 대체 방법은 역-PCR이다 (예로서, [Allende et al, 1996, Genes Dev., 10:3141-3155]). 클로닝 방법과는 상관없이 확인된 클론을 서열화한다. 트랜스포존 (또는 기타 삽입된 DNA) 측면에 위치하는 서열은 삽입 인자에 대한 그들의 비-아이덴티티에 의해 확인될 수 있다. 서열은 조합된 후, 기타 이전에 특징화된 유전자(들)과의 상동성, 또는 일부 작용을 코딩하는 유전자 또는 서열 모티프에 대한 부분적인 상동성에 관한 핵산 데이타베이스를 검색하는데 사용될 수 있다. 몇몇 경우에 있어, 유전자는 임의의 공지 단백질에 대하여 상동성을 갖고 있지 않다. 이것이 기타의 것들과 비교하게 될 신규 서열이 될 것이다. 코딩된 단백질이 그의 회수를 유도한 표현형을 나타내는 역할에 대한 추가 연구의 중심이 될 것이다.

따라서, 피기백-유사 트랜스포존을 사용하여 척추동물 게놈을 돌연변이화하여 기능상실 돌연변이체를 생성할 수 있고, 관심의 대상이 되는 표현형에 대한 돌연변이체를 스크리닝할 수 있다. 전형적으로, 트랜스포존을 함유하는 동물을 검출할 수있도록 하는 하나 이상의 인자를 함유하는 피기백-유사 트랜스포존이 사용된다. 가장 자주는, 시각적으로 표시되는 형질, 예로서, 코트 또는 눈 색상에 영향을 주는 마커 유전자가 사용된다. 그러나, 임의의 유전자가 트랜스제닉 동물에서 신뢰할 수 있고 용이하게 점수화되는 표현형상의 변화을 일으키는 마커로서 사용될 수 있다.

피기백-유사 트랜스포존 서열을 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로 트랜스포존이 삽입된 세포의 DNA를 분해하고; 트랜스포존의 역위 반복부 서열을 확인하고; 역위 반복부 서열에 근접한 핵산을 서열화하여 오픈 리딩 프레임으로부터 DNA 서열을 수득하고; DNA 서열과 컴퓨터 데이타베이스내 서열 정보를 비교함으로써 피기백-유사 트랜스포존이 삽입된 유전자를 확인할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 제한 엔도뉴클레아제는 4-염기 인식 서열을 인식한다. 또다른 실시태양에서, 분해 단계는 추가로 분해된 단편을 클로닝하거나 분해된 단편을 PCR 증폭시키는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 유전자는 역 PCR에 의해 확인된다.

따라서, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존 시스템은 또한 유전자 발견을 위해 사용될 수 있다. 일례로, 피기백-유사 트랜스포사제 단백질 또는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산과 함께 피기백-유사는 세포 내로 도입된다. 피기백-유사 트랜스포존은 바람직하게 마커 단백질, 예로서, GFP 및 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 바람직하게, 6-염기 인식 서열을 포함하는 삽입체를 포함한다. 통합 후, 세포 DNA는 단리되고, 제한 엔도뉴클레아제로 분해된다. 4-염기 인식 서열을 사용하는 제한 엔도뉴클레아제가 사용되는 경우, 세포 DNA는 대략 약 256-bp 단편으로 절단된다. 이들 단편은 클로닝될 수 있거나, 링커가 분해된 단편의 말단에 첨가되어 PCR 프라이머에 대하여 상보적인 서열을 제공할 수 있다. 링커가 첨가되는 경우, PCR 반응의 사용으로 링커로부터의 프라이머 및 핵산 단편중 역위 반복부의 정반복부에 결합하는 프라이머를 사용함으로써 단편을 증폭시킨다. 이어서, 증폭된 단편을 서열화하고, 정반복부 측면에 위치하는 DNA를 사용하여 컴퓨터 데이타베이스, 예로서, 진뱅크를 검색한다.

5.12.1. 돌연변이 검정을 위한 표현형 복귀

생체내 전위시, 본 발명의 방법에 사용된 피기백-유사 트랜스포존을 정확하게 절제하되, 절제시 임의의 트랜스포존 서열도 남기지 않도록 한다. 이러한 피기백-유사 트랜스포존 시스템의 특징은 인간을 제외한 척추동물에서 관찰되는 표현형 은 직접적으로 피기백-유사 트랜스포존이 게놈내로 삽입된 것으로부터 초래되었음을 확인하는데 이용될 수 있다.

5.13. 유전자 요법

유전자 요법을 위한 유전자 전달 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터로서 광범위하게 분류될 수 있다. 피기백-유사 트랜스포존 시스템을 사용한다는 것이 비-바이러스 DNA-매개 유전자 전달의 개선된 점이다. 현재까지는 바이러스 벡터가 세포에 유전자를 도입하고 발현시키는 보다 유효한 것으로 알려져 왔다. 신규한 유전자 요법의 개발을 위해 비-바이러스 유전자 전달이 바이러스-매개 유전자 전달보다 우수한 데에는 수개의 이유가 존재한다. 예를 들면, 유전자 요법용 제제로서 바이러스를 적합화시키는 것은 크기, 구조 및 발현 조절에 관한 바이러스 게놈의 제약조건으로 유전자 디자인을 제한한다. 비-바이러스 벡터는 대개 합성 출발물질로부터 생성되는 바, 바이러스 벡터보다 더욱 용이하세 제조된다. 비-바이러스 시약은 반복부 투여를 가능케 하는 바이러스 제제보다 면역원성일 가능성은 더욱 작다. 비-바이러스 벡터는 바이러스 벡터보다 더욱 안정적인 바, 따라서, 약제학적 제형 및 적용을 위해서 바이러스 벡터보다는 더욱 적합한 것이다.

현 비-바이러스 유전자 전달 시스템은 핵산을, 숙주 염색체를 비롯한 세포의 DNA 내로 통합시키는 것을 촉진시킬 수 있는 장비를 갖추고 있지 않다. 그 결과, 비-바이러스 시스템을 사용하여 안정적으로 유전자를 전달할 수 있는 빈도수는 매우 낮다; 조직 배양 세포에서는 최대 0.1%이고, 1차 세포 및 조직에서는 훨씬 더 낮다. 본 시스템은 통합을 촉진시키고 안정적인 유전자 전달의 빈도수를 현저히 개 선시키는 비-바이러스 유전자 전달 시스템이다.

본 발명의 유전자 전달 시스템에서, 피기백-유사 트랜스포사제는 단백질 또는 단백질을 코딩하는 핵산으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 단백질을 코딩하는 핵산은 RNA이고, 또다른 경우, 핵산은 DNA이다. 추가로, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 핵산은 바이러스 벡터, 양이온성 지질, 또는 진핵 세포에 대하여 사용되는 진핵 세포을 비롯한 기타 표준 형질감염 메커니즘을 통해 세포 내로 혼입될 수 있다. 피기백-유사 트랜스포존을 코딩하는 핵산이 도입된 후, 피기백-유사 트랜스포사제가 동일한 세포 내로 도입될 수 있다.

유사하게, 피기백-유사 트랜스포사제는 선형 단편으로서 또는 환형 단편으로서, 바람직하게, 플라스미드로서 또는 재조합 바이러스 DNA로서 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게, 핵산 서열은 오픈 리딩 프레임의 적어도 일부분을 포함함으로써 아미노산 함유 산물을 생산하게 된다. 바람직한 실시태양에서, 피기백-유사 트랜스포존은 적어도 하나의 단백질, 예를 들면, 선별가능한 마커, 리포터, 치료학적 단백질 또는 축산업에서 가치가 있는 단백질을 코딩하고, 피기백-유사 트랜스포존 내로 삽입된 피기백-유사 트랜스포존 또는 코딩 영역의 발현을 지시하도록 선택되는 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 삽입체를 포함한다. 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존에 함유되어 있는 적합한 코딩 영역에 대한 보다 광범위한 설명은 하기 섹션 5.14에서 제공한다.

유전자 요법의 방법에 대한 일반적 리뷰를 위해서는 ([Goldspiel et al, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505]; [Wu and Wu, 1991, Bio요법 3:87-95]; [Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596]; [Mulligan, 1993, Science 260:926-932]; 및 [Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215])를 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 보편적으로 공지되어 있는 방법은 ([Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York]; 및 [Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, Laboratory Manual, Stockton Press, New York])에 기재되어 있다. 본 발명의 피기백-유사 핵산을 전달을 위해서는 임의의 상기와 같은 방법이 사용될 수 있다.

피기백-유사 핵산, 예로서, 피기백-유사 트랜스포존 및/또는 임의로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 환자 내로 직접적으로 또는 간접적으로 전달할 수 있는데, 직접 전달하는 경우에는, 환자를 핵산 또는 핵산-수반 벡터에 직접 노출시키고, 또는 간접 전달하는 경우에는, 세포를 먼저 시험관내에서 피기백-유사 핵산으로 형질전환시킨 후, 환자 내로 이식한다. 이러한 2개의 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 유법으로서 공지되어 있다.

특정 실시태양에서, 핵산은 생체내에서 직접 투여되고 발현되어 코딩 산물이 생산된다. 이는 당업계에 공지되어 있는 다수의 방법들중 임의의 것에 의해서 달성될 수 있고, 예를 들면, 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 핵산을 작제하고, 세포내 존재하도록 투여될 수 있는데, 예로서, 결손 또는 약독화된 레트로바이러스 또는 기타 바이러스 벡터 (미국 특허번호 제4,980,286호 참조한다)에 의해, 또는 네이키드 DNA의 직접적인 주사에 의해, 또는 미세입자 충격 (예로서, 유전자 총; 발리스틱스(Ballistics), 듀퐁)에 의해, 지질 또는 세포-표현 수용체 또는 형질감염제를 사용하여 코팅힘으로써 리폼좀, 미세입자 또는 미세캡슐내 캡슐화함으로써, 또는 핵으로 진입하는 공지되어 있는 펩티드에 핵산을 연결시켜 투여함으로써, 수용체-매개 세포내이입 되도록 리간드에 핵산을 연결시켜 투여함으로써 (예로서, [Wu and Wu5 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432]을 참조한다) (이는 특이적으로 수용체를 발현시키는 세포 유형을 표적하기 위하여 사용될 수 있다), 그외의 것으로서 달성될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 핵산-리간드 복합체는 리간드가 엔도좀을 파괴시키는 융합 바이러스 펩티드를 포함함으로써 핵산이 리소좀 분해를 피할 수 있게 하는 경우에 형성될 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 핵산은 특이 수용체를 표적화함으로써 세포 특이 흡수 및 발현에 대하여 표적화될 수 있다 (예로서, 1992년 4월 16일자의 PCT 공개번호 WO 92/06180(Wu et al); 1992년 12월 23일자의 WO 92/22635(Wilson et al.); 1992년 11월 26일자의 WO 92/20316(Findeis et al); 1993년 7월 22일자의 WO93/14188(Clarke et al), 1993년 10월 14일자의 WO 93/20221(Young)을 참조한다). 별법으로, 핵산은 세포 내로 도입될 수 있고, 상동 재조합에 의해서 발현을 위한 숙주 세포 DNA내에 혼입될 수 있다 ([Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935]; [Zijlstra et al, 1989, Nature 342:435-438]).

특정 실시태양에서, 피기백-유사 핵산을 함유하는 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 ([Miller et al, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599]를 참조한다). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈 패깅과 숙주 세포 DNA의 통합에는 필요치 않은 레트로바이러스 서열을 결실시키기 위해서 변형될 수 있다. 유전자 요법에서 사용되는 피기백-유사 핵산은 벡터 내로 클로닝되고, 이는 환자내 유전자 전달을 촉진시킨다. 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 설명은 [Boesen et al, 1994, Bio요법 6:291-302]에서 찾아볼 수 있다. 유전자 요법에서 레트로바이러스 벡터의 사용을 설명하는 기타 참고문헌은 ([Clowes et al, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651]; [Kiem et al, 1994, Blood 83:1467-1473]; [Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141]; 및 [Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114])이다.

아데노바이러스는 유전자 요법에서 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 유전자를 호흡 상피로 전달하는 특히 관심의 대상이되는 비히클이다. 아데노바이러스는 자연적으로 호흡 상피를 감염시킴으로써 경미한 질환을 유발한다. 아데노바이러스-기초 전달 시스템에 대한 다른 표적은 간, 중추 신경계, 내피 세포, 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있다는 장점을 갖고 있다. [Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503]에는 아데노바이러스-기초 유전자 요법에 대하여 리뷰되어 있다. [Bout et al, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10]에서는 붉은 털 원숭이의 호흡 상피로 유전자를 전달하는 아데노바이러스 벡터의 용도에 대하여 입증되었다. 유전자 요법에서 아데노바이러스의 용도에 대한 기타 일례는 ([Rosenfeld et al, 1991, Science 252:431-434]; [Rosenfeld et al, 1992, Cell 68: 143-155]; 및 [Mastrangeli et al, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234])에서 찾아볼 수 있다.

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 또한 유전자 요법에서의 용도에 대하여 제안되었다 [Walsh et al, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300].

유전자 요법에 대한 또다른 접근법은 전기천공, 리포펙션, 인산칼슘 매개 형질감염, 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 피기백-유사 핵산을 조직내 세포로 전달하는 것을 포함한다. 일반적으로 전달 방법은 세포로 선별가능한 마커를 전달하는 것을 포함한다. 이어서, 전달된 유전자를 흡수하고 발현시키는 세포를 단리시키기 위하여 세포를 선별한다. 이어서 세포를 환자에게 전달한다.

본 실시태양에서, 생성된 재조합 세포를 생체내로 투여하기 이전에 피기백-유사 핵산을 세포 내로 도입시킨다. 그러한 도입은 제한하는 것은 아니지만, 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터의 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 미세세포-매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 외래 유전자를 세포 내로 도입시키는 다수의 기법이 당업계에 공지되어 있고 (예로서, [Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618]; [Cohen et al, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644]; [Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92]), 본 발명과 함께 사용될 수 있는데, 단, 수혜 세포의 필수적인 발달 작용 및 생리학적 작용은 파괴되지 않아야 한다. 기법은 핵산을 세포로 안정적으로 전달함으로써 핵산이 세포에 의해 발현될 수 있도록 하여야 하고, 바람직하게는, 그의 세포 자손에 의해 유전되어야 하고 발현될 수 있어야 한다.

생성된 재조합 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에게 전달될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상피 세포는 예로서 피하 주사된다. 또다른 실시태양에서, 재조합 피부 세포는 환자상에서 피부 이식편으로서 적용될 수 있다. 재조합 혈액 세포 (예로서, 조혈 줄기 또는 전구 세포)는 바람직하게 정맥내로 투여된다. 사용을 위해 구상되는 세포의 양은 원하는 효능, 환자 상태 등에 따라 다르고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.

유전자 요법을 목적으로 하여 피기백-유사 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 원하는, 이용가능한 세포 유형을 포함하며, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포 예로서, T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 중성구, 호산구, 거핵세포, 과립구; 다양한 줄기 또는 전구 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니고, 특히, 예로서, 골수, 제대 혈액, 말초 혈액, 태아 간 등으로부터 수득한 조혈 줄기 또는 전구 세포를 포함한다.

5.14. 피기백 -유사 트랜스포존에 의해 코딩되는 단백질

본원에서 논의되는 바, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존은 핵산이 포함하는 다양한 핵산을 대상에게 전달하는데 유용하다. 게다가, 예로서, 인핸서 트랩핑과 같은 특정 적용에 있어서, 트랜스포존은 마커 유전자를 유용하게 포함한다. 추가의 다른 측면에서, 피기백-유사 트랜스포존은 표적 세포 또는 유기체의 게놈에서 형질을 변형시키는 뉴클레오티드 서열, 선별가능한 마커 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존이 포함하는 그러한 핵산의 일례는 하기에 제공한다.

유전자 결손에 기초한 질환 용태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 특적의 치료학적 유전자로는 하기 산물을 코딩하는 유전자를 포함한다: 인자 IX, β-글로빈, 저밀도 단백질 수용체, 아데노신 디아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 스핑고마이엘린나제, 글루코세레브로시다제, 낭성 섬유증 막전도 조절자, α-항트립신, CD 18, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 페닐알라닌 수산화효소, 분지쇄 α-케톤산 탈수소효소, 푸마릴아세토아세테이트 가수분해 효소, 글루코스 6-인산분해 효소, α-L-푸코시다제, β-글루쿠로니다제, α-L-이두로니다제, 갈락토스 1-인산염 우리딜트랜스퍼라제, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 에리트로포에틴, 응고인자 VII, 소 성장 호르몬, 혈소판 유래 성장 인자, 응고 인자 VIII, 트롬보포이에틴, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-1 RA, 과산소 디스뮤타아제, 카탈라제, 섬유모세포 성장 인자, 신경돌기 성장 인자, 과립구 집락 자극 인자, L-아스파라긴 분해 효소, 요산 분해 효소, 키모트립신, 카르복시펩티드 분해 효소, 수크라제, 칼시토닌, Ob 유전자 산물, 글루카곤, 인터페론, 형질전환 성장 인자, 섬모 신경돌기 형질전환 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1, 과립구 대식세포 집락 자극 인자, 뇌-유래 신경돌기 인자, 인슐린트로핀, 조직 플라스미노겐 활성제, 우로키나제, 스트렙토키나제, 아데노신 데아미다제, 칼시토닌, 아르기닌 분해 효소, 페닐알라닌 암모니아 분해 효소, 감마-인터페론, 펩신, 트립신, 엘라스타제, 락타제, 내인 인자, 콜레시스토키닌, 및 인슐린 친화성 호르몬 등.

본 방법을 통해 전달될 수 있는 암의 치료학적 유전자로는 림프구의 항종양 활성을 증진시키는 유전자, 그의 발현 산물이 종양 세포의 면역원성을 증진시키는 유전자, 종양 억제자 유전자, 독소 유전자, 자살 유전자, 다-약물 내성 유전자, 및 안티센스 서열 등을 포함한다.

본 발명의 피기백-유사 트랜스포존이 포함하는 마커 유전자 서열은 효소, 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드, 수용체, 전달체, tRNA, rRNA, 또는 생물발광성, 화학발광성 또는 형광성 분자일 수 있다. 특정 실시태양에서, 마커는 녹색 형광성 단백질 (GFP) 또는 그의 돌연변이체, 예로서, 형광 파장이 변경되었거나, 형광이 증가되었거나, 양자 모두인 돌연변이체 GFP이다. 특정의 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 GFP는 청색 GFP이다. 본 실시태양의 다른 모드에서, 형광성 분자는 적색 형광성 단백질 (섹션 6 참조한다) 또는 황색 형광성 단백질이다. 추가의 다른 실시태양에서, 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), β-갈락토시다제 (lacZ), 및 루시퍼라제 (LUC)이다.

가축에서의 용도로, 피기백-유사 트랜스포존은 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 성장을 촉진시키기 위하여 성장 호르몬, 예로서, 인슐린-유사 성장 인자 (IGFs)에 대한 서열을 포함할 수 있다. 가축에서의 기타 용도로, 피기백-유사 트랜스포존이 포함하는 트랜스진이 질환에 대한 보다 우수한 내성을 제공할 수 있다.

다수의 마커 유전자가 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존가 삽입될 수 있으며,각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 [Wigler et al, 1977, Cell 11:223], 하이포크산틴-구아닌 포스포리 보실트랜스퍼라제 [Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Lowy et al, 1980, 세포 22:817] 유전자를 하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항대사물질 내성은, 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공하는 것인 dhfr ([Wigler et al, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567]; [O'Hare et al, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]); 미코페론산에 대한 내성을 제공하는 것인 gpt [Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 제공하는 것인 neo [Colberre-Garapin et al, 1981, J. Mol. Biol. 150:1]; 하이드로마이신에 대한 내성을 제공하는 hygro [Santerre et al, 1984, 유전자 30:147]; 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용할 수 있도록 하는 trpB [Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047]; 및 오르니틴 데카르복실라제 저해제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 제공하는 ODC (오르니틴 데카르복실라제) [McConlogue, L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed.]에 대한 선택 기준으로서 사용될 수 있다.

5.15. 피기백 -유사 트랜스포존 에 의해 포함된 비-코딩 서열

ORF 이외에도, 또는 ORF의 대안으로서, 본 발명의 피기백-유사 트랜스포존은 또한 핵산에 결합하고/거나 핵산을 변형시키는 단백질에 의해 인식되는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질은 DNA-결합 단백질, PNA-변형 단백질, RNA-결합 단백질, 또는 RNA-변형 단백질이다.

특정의 구체적인 실시태양에서, 서열은 제한 엔도뉴클레아제, 즉, 제한 부위에 의해 인식되는 것이다. 다양한 제한 부위가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 하기 효소들에 의해 인식되는 부위들을 포함한다: HindIII, PstI, SalI, AccI, HincII, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI, KpnI, SacI, EcoRI 등.

다른 특정 실시태양에서, 서열은 부위-특이 리콤비나제, 예로서, FLP 리콤비나제 (즉, 서열은 FRT이다) 또는 CRE 리콤비나제 (즉, 서열은 loxP이다)에 대한 표적 부위이다. 그러한 실시태양은 섹션 5.7에 기술된 것과 같이 모자이크 동물 생성에 유용하다.

5.16. 본 발명의 수의학적 및 가축적 용도

본 발명의 방법 및 조성물은 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해, 또는 가축의 질을 개선시키기 위한 수의학적 용도로 인간을 제외한 동물에서 사용될 수 있다.

특정 실시태양에서, 인간을 제외한 동물은 가내 애완동물이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 인간을 제외한 동물은 포유동물, 가장 바람직하게, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 래빗, 햄스터, 밍크, 또는 기니아 피그이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 인간을 제외한 동물은 가금류의 종, 가장 바람직하게, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 또는 메추라기이다.

6. 실시예

6.1. 도입

전위 인자는 트랜스제닉 동물 생성 및 삽입 돌연변이 유발을 비롯한, 하등 유기체에서의 유전자 조작을 위한 도구로서 통상 사용되어 왔다. 대조적으로, 유효한 트랜스포존 시스템이 부족하기 때문에 마우스 및 기타 척추동물 시스템에서 트랜스포존을 사용하는 것에는 여전히 제한이 따른다. 본 발명자는 양배추 자벌레 나방인 트리코플루시아 니로부터의 DNA 트랜스포존인 피기백의 포유동물 시스템에서의 전위 능력을 시험하고, 다중 유전자를 수반하는 피기백 인자가 인간 및 마우스 세포주에서, 및 마우스에서도 효율적으로 전위할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 본원에서 제시한 데이타는, 생식 계열 전위시 피기백 인자를 원래의 삽입 부위로부터 정확하게 절제하고, 이를 다양한 부위, 바람직하게, 전사 단위의 마우스 게놈내로 전위하여 트랜스포존에 의해 수반되는 마커 유전자를 발현시킬 수 있다는 것을 시사한다. 본 데이타는 마우스 및 기타 척추동물에서 트랜스제네시스 및 삽입 돌연변이 유발을 비롯한 다양한 유전자 조작을 위한 고도로 유효한 트랜스포존 시스템으로의 중요한 계기를 제공한다.

6.2. 재료 및 방법

6.2.1. 플라스미드 작제

PB [ SV40 - neo ] :

pSLfal 180fa [Horn and Wimmer, 2000, Dev Genes Evol 210, 630-637]의 BamHI-KpnI 단편을 pCLXSN(임제넥스(IMGENEX))으로부터의 BamHI-KpnI 단편으로 대체하였다. 이어서, 네오마이신 카세트를 AscI로 절단하고, pBac{3xP3-EGFPafm} [Horn and Wimmer, 2000, Dev. Genes Evol. 210:630-637]의 AscI 부위로 삽입하였다.

CMV - PBase : 피기백 트랜스포사제의 코딩 서열은 프라이머 BacEN-F (5'-GCCACCATGGGATGTTCTTTAG-3') (서열 번호: 1) 및 BacEN-B (5'-GTACTCAGAAACAACTTTGGC-3') (서열 번호: 2)를 사용하여 phsp-Bac [Handler and Harrell, 2001, Insect Biochem Mol Biol 31:199-205]로부터 PCR 증폭시키고, pSLfal 180fa의 SpeI 및 SphI 부위로 클로닝하여 pSL-BacEN을 생성하였다. 트랜스포사제 유전자를 함유하는 HindIII-EcoRI 단편을 pSL-BacEN으로부터 단리시키고, pcDNA4/HisA (인비트로겐(Invitrogen))으로 삽입하여 최종 작제물을 생성하였다.

PB [ PGK - neo ]: pPNT로부터의 PGK-neo 유전자 [Tybulewicz et al, 1991, 세포 65:1153-1163]를, 변형된 피기백 작제물인 pBac-AB의 BglII 부위로 클로닝하여 PB[PGK-neo]를 생성하였다.

PB [ Act - RFP ]: pCX-EGFP [Okabe et al, 1997, FEBS Lett 407:313-319]의 0.7kb EcoRI 단편을 mRFP [Campbell et al, 2002, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:7877-7882]의 코딩 서열로 대체하여 pCX-RFP를 제조하였다. 온전한 RFP 발현 카세트를 포함하는 pCX-RFP의 SalI-BamHI 단편을 추가로 pBac-AB의 BglII 부위로 클로닝하여 PB[Act-RFP]를 생성하였다. 폴리 링커를 가하여 만능 PB 벡터 PB[ Act -RFP]DS를 생성하였는데, 이는 다중의 유일한 클로닝 부위를 가졌다.

Prm1 - PBase : Pmr-1 프로모터 및 pPrm1-SB10 [Fischer et al, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764]으로부터의 BamHI-SalI 단편을 각각 pSL- BacEN의 HindIII 부위 및 BamHI-XhoI 부위로 클로닝하여 고환 특이 트랜스포사제 헬퍼 플라스미드를 생성하였다.

Act - PBase : NheI-NotI 링커를 사용하여 pCX-EGFP의 EcoRI 단편을 pSL-BacEN의 SpeI-EagI 트랜스포사제 단편으로 대체하여 편재적으로 발현되는 트랜스포사제 헬퍼 플라스미드를 생성하였다.

PB [ K14 - Tyr ] : plnK14-알비노 [Saitou et al, 1995, Nature 374:159-162]중 K14 프로모터의 Smal 단편, RT-PCR에 의해 129Sv 마우스의 피부 샘플로부터 증폭된 티로신 cDNA, 및 SV40 polyA를 pBac-AB의 BglII 부위 내로 삽입하여 PB[K14-Tyr]를 생성하였다.

PB [ K14 - Tyr , Act - RFP ] : pCX-RFP로부터의 SalI-BamHI 단편을 PB[K14-Tyr]의 AscI 부위로 클로닝하여 본 작제물을 생성하였다.

PB [ Act - RFP , MCK - TSC1 ] : RFP 발현 카세트 및 좌측 말단 (피기백L)으로 구성된, PB[Act-RFP]로부터의 Smal 단편을 사용하여 pBluescript의 SalI-EcoRV 단편을 대체함으로써 pBS-BLRFP를 생성하였다. 이어서, 우측 말단 (PBR)으로 구성된 PB[Act-RFP]DS의 Smal-EcoRV 단편을 pBS-BLRFP의 PmeI 부위로 클로닝하여 PB[Act-RFP]를 생성하였는데, 이는 만능 피기백-기초 트랜스제닉 벡터로서의 역할을 하였다. MCK-TSC1 작제물 [Inoki et al., 2002, Nat. Cell Biol. 4:648-657]의 BssHII 단편 및 hGH polyA [Nguyen et al., 1998, Science 279:1725-1729]를 PB[Act-RFP]DS의 SwaI 부위로 클로닝하였다.

6.2.2. 세포 형질감염

293개의 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 혈청으로 보충된 DMEM (GIBCO/BRL)에서 배양하였다. 형질감염하기 하루 전날, 1.5x10⁵개의 세포를 24-웰-플레이트의 각 웰에 시딩하였다. 각 웰당, 시험군에서는 0.5㎍의 환형 PB[SY40-neo] 및 0.5㎍의 환형 CMV-PBase, 또는 대조군에서는 0.5㎍의 환형 pcDNA4/HisA를 표준 프로토콜 (인비트로겐)에 따라 LipofectAMINE 2000에 의해 형지감염시켰다. 형질감염 후 1일째, 각 웰의 세포를 트립신화하고, 500mg/ml G-418 (GIBCO/BRL)을 함유하는 배지중의 10-cm 플레이트 하나 위에 시딩하였다. 2주 동안 계속하여 약물 선별하였다.

W4/129S6 마우스 배아 줄기 (ES) 세포의 배양 및 전기천공 조건은 제조사의 권고된 프로토콜(타코닉(Taconic))에 기재되어 있었다. 시험군에서는 24㎍의 환형 PB[PGK-neo] 및 6㎍의 AcX-PBase 또는 대조군에서는 6㎍의 청어 정자 DNA (프로메가(Promega))를 1,000개의 세포를 전기천공하기 위하여 사용하였다. 전기천공 후 즉시, 각 군의 세포를, 미토마이신 C 처리된 마우스 배아 섬유모세포 공급자 세포를 함유하는 3개의 10-cm 플레이트 위에 시딩하였다. 200mg/ml G-418를 함유하는 배지를 사용하여 전기천공 후 48시간째 선별하기 시작하였다. 2주 동안 계속하여 약물 선별하였다.

약물 선별 종결시, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS로 세포를 10분 동안 고정시키고, 0.2% 메틸렌 블루로 1시간 동안 염색하였다. 탈이온수로 철저하게 세척한 후, 클론을 계수하였다.

6.2.3. PCR 및 서열 분석

게놈 DNA의 HaeIII 또는 MspI 분해물을 자기-결찰시켜 역 PCR에 대한 주형으로서의 역할을 하도록하였다. 피기백 트랜스포존의 좌측 측면에 위치하는 서열을 회수하기 위하여 사용된 프라이머는 LF1 (5'-CTT GAC CTT GCC ACA GAG GAC TAT TAG AGG-3') (서열 번호:3) 및 LR1 (5'-CAG TGA CAC TTA CCG CAT TGA CAA GCA CGC-3') (서열 번호:4)이었다. 피기백 트랜스포존의 우측 측면에 위치하는 서열을 회수하기 위하여 사용된 프라이머는 RF1 (5'-CCT CGA TAT ACA GAC CGA TAA AAC ACA TGC-3') (서열 번호:5) 및 RR1 (5'-AGT CAG TCA GAA ACA ACT TTG GCA CAT ATC-3') (서열 번호:6)이었다.

프라이머 EL1 (5'-CCA TAT ACG CAT CGG GTT GA-3') (서열 번호:7) 및 프라이머 ER1 (5'-TTA AAG TTT AGG TCG AGT AAA GCG C-3') (서열 번호:8)을 사용하여 절제 부위에 대한 PCR 검출을 수행하였다.

PCR 산물은 pGEM-T 벡터 (프로메가)로 클로닝한 후, 서열화하였다. 서열화 결과를 NCBI BLAST 검색 (www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 앙상블(Ensembl) 인간 또는 마우스 게놈 데이타베이스 (www.ensembl.org)로 분석하였다.

PB 삽입 이벤트의 추가 서열의 선호도를 검출하기 위하여 TTAA 표적 부위의 5개 염기쌍의 상류 및 하류를 마우스에서 100개의 피기백 삽입부에 대하여 분석하였다. 동시에, 100개의, 무작위로 선별된 TTAA 부위를 대조군으로서 분석하였다. STATISTICA 6.0.을 사용하여 2개 부분 사이의 일측성 확률을 산출하였다.

6.2.4. 트랜스제닉 마우스 생성

환형 피기백 도너 작제물을 헬퍼 플라스미드와 2:1의 비율로 혼합하였다. 혼 합된 DNA 샘플 (2ng/㎕)을 [Nagy et al, 2003, Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 기재되어 있는 것과 같이 수정된 FVB/Nj 난모세포 내로 미세주사하였다.

6.2.5. 써던 블롯트

게놈 DNA를 꼬리 샘플로부터 단리시키고, EcoRV 및 BglII로 분해한 후, 써던 분석하기 앞서 0.7% 아가로스 겔에서 분별화하였다. 프로브는 PB[Act-RFP]의 SacII 분해물의 499bp 단편이었다.

6.3. 결과

6.3.1. 배양된 포유동물 세포에서 피기백 의 전위 활성

조직 배양 세포에서 피기백 매개의 염색체 통합 이벤트를 검출하기 위하여 도너와 헬퍼 플라스미드로 구성된 2원성 공-형질감염 분석 시스템을 디자인하였다. 도너 플라스미드는 피기백 트랜스포사제 (PBase)가 약물 선별 마커로 대체되어 있는 피기백 인자를 함유하였다 (도 1A). 헬퍼 플라스미드는 트랜스포사제 단편을 수반하지만, 전위에 필요한 말단 서열은 포함하지 않았다 (도 1B). 헬퍼 플라스미드의 부재하에서, 도너 플라스미드는 무작위적으로 게놈으로 통합될 수 있지만, 이러한 무작위적인 통합은 플라스미드가 환형 형태로 유지된다면 최소화될 수 있다. 따라서, 헬퍼 플라스미드의 존재하에서 약물 내성 클론의 증가가 전위 이벤트를 나타낼 것이다.

본 발명자는 먼저 인간 293개의 세포에서 피기백 전위를 조사하였다. SV40 프로모터 유도 네오마이신 내성 (neo) 유전자를 수반하는 도너 PB[SV40-neo] 인자 및 편재적으로 발현되는 트랜스포사제를 수반하는 헬퍼 CMV-PBase의 공-형질감염을 통해 (도 1) 도너 플라스미드만으로 형질감염된 것 (도 2A)보다 10배 많은 네오마이신-내성 클론이 생산되었다. 도너 통합의 증가 원인이 전위인지 여부를 시험하기 위하여 역 PCR을 실시하여 통합된 PB[ SV40 - neo ] (도 1A)의 피기백 우측 역위 말단 반복부 (PBR) 부위에 인접한 서열을 회수하였다. 순종 전위 이벤트로부터의 PCR 산물은 플라스미드 서열 보다는 PBR 바깥쪽의 게놈 서열을 생성하여야 한다. 18개의 독립적인 게놈 서열을 5개의 약물 내성 클론으로부터 회수하였다. 이들 서열들 모두 통합 부위에 표시 TTAA 서열을 함유하였다 (표 2).

표 2. 인간 293개의 세포에서의 PB 전위

트랜스포존의 다른쪽 말단에서 수개의 연접 단편을 서열화하여 TTAA 복제를 확인하였다 (데이타는 나타내지 않음). 반대로, PB[ SV40 - neo ] 만으로 안정적으로 형질감염된 네오마이신 내성 클론의 역 PCR 분석을 통해서는 연접 플라스미드 서열만을 검출하였고, 이는 무작위 삽입 이벤트와 일치한다 (데이타로 나타내지 않음). 본 실험을 통해 인간 세포에서의 피기백 전위는 곤충 세포와 동일한 부위-선호도를 갖고 발생한다는 것이 입증되었다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 (밍크 기원의) Mv1Lu 세포에서 공-형질감염 방법을 수행하였을 때 유사한 결과를 수득하였다 (도 7 참조한다).

이어서 본 발명자는 마우스 W4/129S6 배아 줄기 (ES) 세포에서 전위할 수 있는 피기백의 능력을 시험하였다. 본 시험에서 도너 플라스미드 PB[ PGK - neo ] 인자는 PGK 프로모터 유도 neo 유전자를 수반하였고, 헬퍼 플라스미드 Act-PBase는 하이브리드 액틴 프로모터의 조절하에 피기백 트랜스포사제를 제공하였다 (도 1B). 3회 반복된 형질감염 실험에서, PB[ PGK - neo ] 및 Act-PBase 공-형질감염을 통해 PB[PGK-neo]만으로 형질감염된 것보다 대략 50배 많은 약물 내성 클론이 생산되었다 (도 2B 및 2C). 역 PCR 분석을 통해 클론 생산의 증가 원인이 전위임을 확인하였다 (표 3).

표 3. 마우스 W4/129S6 배아 줄기 세포에서의 PB 전위

밍크, 햄스터, 래트, 원숭이, 인간 및 닭을 비롯한, 상이한 기원의 다양한 세포주에서 공-형질감염을 수행하였을 때 유사한 전위 결과를 수득하였다 (도 8 참조한다).

6.3.2. 피기백 은 마우스 생식 계열에서 효율적으로 전위한다

마우스 ES 세포에서의 유효한 전위를 통해 본 발명자는 마우스 생식 계열에서 피기백 전위의 실행 가능성을 시험할 수 있었다. 트랜스포존 도너 및 트랜스포사제 헬퍼 플라스미드의 전핵 공-주사를 실시하여 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 트랜스제닉 마우스에서의 전위 분석을 용이하게 하기 위하여 본 발명자는 도 너 플라스미드내 약물 내성 마커 대신 시각적으로 표시되는 마커 (적색 형광성 단백질, RFP)를 사용하였다. 도너 PB[ Act - RFP ] 인자 및 헬퍼 플라스미드 Act-PBase를 환형 형태로 FVB/Nj 마우스 배아의 전핵 내로 공-주사하였다. PCR 분석을 통해 34.8% (62/184)의 시조는 PB[ Act - RFP ] 단일 양성이고, 0.5% (1/184)는 Act-PBase 단일 양성이며, 2.7% (5/184)는 이중으로 양성인 것으로 나타났다. 비교로, PB[Act-RFP] 만을 사용하여 주사하였을 때 오직 10.4% (10/96)의 자손만이 양성이었다. 상이한 마커 유전자로서 피부 색소침착에 영향을 주는 티로시나제를 갖는 장쇄의 PB 인자, PB[ K14 - Tyr ]를 동일한 헬퍼 작제물과 함께 공-주사하였을 때 유사한 결과를 수득하였다 (도 1 및 도 3A).

RFP 양성 시조에서 통합된 트랜스진의 구조를 분석하기 위하여 트랜스포존 특이 프로브를 사용하여 써던 혼성화를 실시하였다 (도 1A). 대부분의 시조들은 다중 통합 이벤트를 수반하였다 (도 3B). 이어서, 본 발명자는 역 PCR을 실시하여 트랜스포존 말단 측면에 위치하는 게놈 서열을 회수하였다. 총 85개의 전위 이벤트를 42개의 RFP 양성 시조로부터 회수하였다 (표 4).

표 4. 마우스에서의 PB 전위. 1. A, B: PB[Act-RFP]; C: PB[K14-Tyr, Act-RFP]; D: PB[Act-RFP, MCK-TSC1]; 2. 공지 유전자 또는 예측 유전자로부터 10kb 미만의 하류; 3. 공지 유전자 또는 예측 유전자로부터 10kb 미만의 상류; 4. 생식 계열 전위로부터의 삽입

이들 전위 대부분을 통합된 트랜스포존의 우측 말단 반복부 측면에 위치하는 게놈 서열에 따라 마우스 게놈에 대하여 지도화하였다. 본 발명자는 무작위적으로 9개의 전위 이벤트를 선택하고, 트랜스포존 반대측상의 게놈 연접 서열을 증폭시켰다. 각각의 경우에서, 트랜스포존 삽입이 통합 부위를 정확하게 TTAA 복제하는 것으로 밝혀졌다 (데이타는 나타내지 않음). 이들 결과는 공-주사로 생산된 트랜스진 통합 대부분이 전위의 원인임을 나타낸다.

생식 계열을 통해 유전시킬 수 있는지에 대한 통합된 트랜스포존의 능력을 시험하기 위하여, PB[Act-RFP]는 양성이되 헬퍼 플라스미드는 음성인 수개의 시조를 야생형 FVB/Nj 마우스와 교배하여 트랜스제닉계를 생성하였다. 8개의 PB[Act-RFP] 통합을 갖는 시조 (AFO-61)중 하나를 상세히 분석하였다. PCR-기초한 유전자 분석을 통해 시조의 16마리의 자손중 15마리가 트랜스포존 DNA을 보유하고 있다는 것이 나타났다. PCR 양성 개체의 써던 분석을 통해, 그들 모두는 전위된 PB[Act-RFP]중 적어도 하나의 카피를 유전시켰다는 것이 나타났다 (도 3C 및 데이타는 나타내지 않음). 이들 트랜스진을 무작위적으로 격리시킴으로써 시조에서 초기의 전위 이벤트의 다양한 염색체 분포를 제안하였다. 단일 트랜스포존을 수반하는 두번째 시조 (AFO-47)의 자손 분석을 통해 단일의 한배새끼에서 8마리의 F1중 2마리가 트랜스포존을 유전시켰다는 것이 나타났다 (도 3C 및 데이타는 나타내지 않음). 수개의 개별적인 트랜스포존 통합 부위를 표적하는 프라이머를 사용하여 PCR-기초한 유전자 분석을 통해서도 시조로부터 F1 세대로 통합된 트랜스포존이 안정적으로 유전되었음을 확인하였다 (데이타는 나타내지 않음). 이와 함께, 빈도가 높은 전위-매개 유전자 통합 및 생식 계열을 통해 유전시킬 수 있는 통합된 트랜스진의 능력을 통해 마우스에서 유전자 전달 도구로서 피기백 인자를 사용할 수 있는 가능성이 입증되었다.

6.3.3. 마우스 생식 계열에서 피기백 의 정확한 절제 및 전위

본 발명자는 "점프스타터(jumpstarter)" 및 "돌연변이 유발 유전자" 스톡의 종래 교배번식 전략법을 사용하여 마우스 생식 계열에서 피기백의 전위 양상을 추 가로 시험하였다 ([Cooley et ah, 1988, Science 239:1121-1128]; [Horn et al., 2003, Genetics 163:647-661]). 본 방법에서, 비자율 트랜스포존을 수반하는 돌연변이 유발 유전자계를 수컷 생식 계열에서 트랜스포사제를 발현시키는 점프스타터계와 교배시킨다. 트랜스포존 및 트랜스포사제 DNA, 양자 모두를 수반하는 수컷의 생식 세포에서만 전위가 활발하게 일어날 것으로 예측된다. 이어서, 이들 수컷을 야생형 암컷과 교배시켜 신규의 트랜스포존 삽입부를 갖는 계열을 생산한다. 본 발명자는 방법을 수정하여 공-주사 방법을 사용함으로써 비자율 트랜스포존 및 헬퍼 트랜스포사제 유전자에 대하여 이중으로 양성이 마우스를 직접 생산하였다. 선형 플라스미드를 종래의 전핵에 주사함으로써 동일한 좌위에 도너 및 헬퍼 플라스미드, 양자 모두를 확실하게 공-통합시켜 트랜스제닉 동물을 생산하게 되었다. PB[Act-RFP] 및 프로타민 1 (prm1) 프로모터-유도 피기백 트랜스포사제 트랜스진 (Prm1-PBase), 양자 모두를 수반하는 수개의 트랜스제닉 마우스계가 생성되었다. 정자형성시 prm1 프로모터는 활성일 것으로 예측되었다 [O'Gorman et al, 1997, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94:14602-14607]. 따라서, 상기와 같이 이중으로 양성인 트랜스제닉계에서, 수컷 마우스는 신규의 전위 이벤트를 유발할 것으로 예측된 반면, 암컷 마우스는 종축(breeder)로서 사용될 수 있다.

상기의 이중 트랜스제닉계중 하나로서, BF0-33으로서 언급되는 것을 그의 자손에서 전위에 대하여 시험하였다. 트랜스포존 특이 프라이머 (도 1A)와의 써던 혼성화를 통해 트랜스포존 양성 자손중 67.8% (19/28)에서 신규하게 트랜스포존이 통합되었다는 것이 밝혀졌다 (도 4A 및 데이타는 나타내지 않음). 생식체당 대량 1.1개의 신규한 삽입부가 생성되었다. 신규한 삽입주중 3개는 연속으로 나열되어 있고, 별도의 염색체 3개 위에 위치하는 것으로 밝혀진 바, 신규의 삽입부는 국소적인 것으로는 보이지 않았다 (표 4에서 BF1-29T6, BF1-30T43,nd BF1-44T10).

트랜스포존 측면에 위치하는 PB[Act-RFP] 플라스미드 서열을 표적하는 프라이머를 사용하여 생식 계열에서 피기백의 전위 양상을 조사하였다 (도 4B). 피기백이 잘라 붙이기 방식을 통해 전위할 경우, 273 bp PCR 산물이 검출될 것이다. 실제로, 계열 BFO-33으로부터 17마리의 자손중 10마리에서 PCR 산물이 검출되었다 (도 4C). 이들 샘플중 7개를 서열화하였고, 단일 TTAA 표적 부위가 존재하는 것으로 밝혀졌는 바 (데이타는 나타내지 않음), 이를 통해 피기백은 수컷 생식 계열의 마우스에서 잘라 붙이기 방식을 통해 전위한다는 것이 입증되었다. 시조는 트랜스진 어레이를 수반하기 때문에 몇몇의 전위 이벤트 (도 4B-C에서 자손 BF1-30 내지 BF1-32)는 이러한 273 bp 산물 검출과 관련이 없을 것으로 예측된다.

6.3.4. 유일한 트랜스제닉 도구로서의 피기백 트랜스포존 시스템

몇몇 트랜스포존의 길이가 증가함에 따라 전위율은 현저히 감소하며, 이는 유전적 도구로서의 유용성을 제한한다고 앞서 나타낸 바 있다. 예를 들면, Hela 세포에서 SB 트랜스포존은 그의 원래의 길이인 2.2kb에서 길이가 매 1kb씩 증가함에 따라 전위율은 대략 30%씩 감소하는 것으로 나타났다 [Izsvak et al, 2000, J. Mol. Biol. 302:93-102]. 마우스에서 PB 전위의 크기 제한을 결정하기 위하여 4.8 내지 14.3kb 범위의 수개의 PB 인자를 사용하여 트랜스제닉 마우스를 생산하였다 (도 1A). 이들 트랜스포존은 RFP 리포터 카세트 및/또는 별도의 전사 단위를 수반 하였다. Act-PBase 헬퍼 플라스미드의 부재 또는 존재하에서 환형 플라스미드에서 이들 PB 인자의 통합율을 시험하였다 (도 3A). 결과, PB 인자는 통합율을 현저히 감소시키지 않으면서 9.1kb의 외래 서열을 수반할 수 있는 것으로 나타났다. PCR 분석을 통해 2개의 마커 유전자를 수반하는, PB [ K14 - Tyr , Act - RFP ] 인자를 갖는 시조중 83.9% (26/31)에서 전위 이벤트가 존재하는 것을 확인하였다. 헬퍼-보조 통합은 14.3kb PB[ Act - RFP , MCK - TSC1 ] 인자 사용시 감소하였다. 11마리의 PB[ Act -RFP, MCK - TSC1 ] 양성 시조를 써던 혼성화 및 역 PCR에 의해 분석하고, 4마리가 전위 통합을 수반하는 것으로 밝혀졌다 (표 4 및 데이타는 나타내지 않음). 따라서, PB는 14kb 이하의 서열을 전위시킬 수 있다.

이어서, 본 발명자는 통합된 PB 인자로부터 트랜스진 발현의 양상을 평가하였다. PB[ Act - RFP ]를 수반하는 마우스중 98% (39/40)에서 RFP 마커를 발현시켰다. 본 발명자들의 실험에서는 PB[ Act - RFP ] 트랜스포존 카피 하나라도 UV 조사하에서는 시각적으로 표시되는 적색 신호를 나타내었다 (도 5A). 이들 시조중 일부는, 대개 1세포기 이후의 배아 발생에서 전위에 기인하여 발생하는 현상인 모자이크 RFP 신호를 나타내었다 (도 5B). K14 프로모터-유도 티로시나제 유전자 (K14-tyr) 및 RFP 발현 카세트, 양자 모두를 함유하는 트랜스포존인 PB[ K14 - Tyr , Act - RFP ]을 수반하는 시조중 29% (9/31)에서 RFP 및 티로시나제 마커, 양자 모두가 공-발현된 것이 관찰되었다 (도 1A, 5C 및 5D). 따라서, 유일한 클로닝 부위 및 RFP 마커을 함유하는 PB[Act - RFP] 작제물이 만능 트랜스제닉 PB 벡터로서의 역할을 한다. 2개의 별도의 전사 단위가 동시에 발현될 수 있는 능력 및 통합 이벤트의 빈도가 높은 것 은 PB 전위가 트랜스제닉 마우스을 생성하는 효과적인 방법으로서 사용될 수 있음을 제안하는 것이다.

6.3.5. 삽입 돌연변이 유발 도구로서의 피기백 트랜스포존 시스템

척추동물에서 삽입 돌연변이 유발 도구로서의 PB의 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자는 마우스에서 생산된 104개의 전위 이벤트를 평가하였다 (표 3). 먼저, TTAA 서열은 1개를 제외하고 모든 PB 통합 부위에서 발견되었다. 이어서, 본 발명자는 마우스 게놈에서 통합의 TTAA 부위 측면에 위치하는 게놈 서열과 무작위적으로 샘플링된 TTAA 부위를 비교하고, 핵심 TTAA 서열 주변에 Ts 및 As가 풍부하다는 것을 발견하게 되었다 (도 6A). 곤충에서 발견된 통합 부위와 유사하다[Li et al, 2005, Insect Mol Biol. 14(1): 17-30.]. 마지막으로, 이들 전위 부위의 게놈 위치를 앙상블 마우스 게놈 데이타베이스에 대하여 분석하였다. 데이타베이스중 반복 서열과 서열 갭이 존재하는 이유로 부위중 일부는 지도화할 수 없었지만, 93개의 트랜스포존 통합 부위의 정확한 위치가 결정되었다 (표 4, 도 6E). 이들 전위 부위에서는 매우 광범위한 염색체 분포가 관찰되었다. 2개 (염색체 19 및 염색체 Y)를 제외한, 모든 마우스의 염색체가 PB 전위에 의해 적중되었다 (도 6E).

모든 전위 부위중 67% (70/104)를 공지 또는 예측 전사 단위에 대하여 지도화하였다. 이들 통합중, 약 97% (68/70)는 인트론에 적중한 반면, 3% (2/70)는 엑손에 적중하였다 (도 6B). 미확인 (즉, 예측된) 유전자 및 ESTs는 분석에서 제외시켰음에도 불구하고 (48% (50/104)), 전사 단위내 통합에 대한 선호성은 여전히 높게 남아있었다. 추가로, 50Kb의 공지 유전자 또는 ESTs내에서 40% 초과의 "유전 자간" 전위를 지도화하였다 (도 6C 및 6D). 10Kb 간격을 전사 단위의 5' 및 3' 말단의 조절 영역에 대한 임의의 역치로서 설정하였을 때, PB 전위에 의한 유전자 적중 빈도는 공지 또는 예측 전사 단위에 대하여 약 80% (83/104)였다 (도 6B). 광범위한 염색체 분포와, 전사 단위로의 전위의 선호성은 PB 인자가 게놈 전체의 유전자 스크린에 대하여 고도로 효과적인 돌연변이원으로서 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

총 128개 이하의 신규 삽입부에 대한 추가 연구를 통해 112개는 전사 단위에 위치하며, 염색체 모두에 걸쳐있고, 5개의 트랜스포존 지도는 엑손에, 63개는 인트론에 있다는 것을 나타내었다.

6.4. 논의

본 발명자는 PB 인자가 마우스 및 인간 세포에서 활발하게 전위할 수 있음을 제시하였다. PB 전위는 12개 초과의 상이한 곤충 종에서 전위할 수 있는 유일한 공지 트랜스포존이라는 점에서 PB 전위는 기타 트랜스포존 보다는 숙주 인자에 덜 의존하는 것으로 판단되었다 ([Handler, 2002, Insect Biochemistry & Molecular Biology 32:1211-1220]; [Sumitani et al, 2003, Insect Biochem. Mol. Biol. 33:449-458]). PB는 곤충 및 포유동물, 양자 모두에서 효과적으로 전위할 수 있다는 사실은 이러한 트랜스포존 시스템이 무척추동물과 척추동물, 양자 모두에서의 유전자 연구를 위해 광범위하게 적용될 수 있다는 것을 시사한다. PB 인자의 전위 메커니즘은, 오직 고도로 제한된 종에서만 작용을 하는 기타 천연 트랜스포존과는 현저히 상이할 수 있음을 추가로 제안한다.

6.4.1. 트랜스제네시스에 대한 도구로서의 피기백

본 발명자의 연구를 통해 PB가 트랜스제닉 마우스를 생성하고, 가능하다면, 기타 트랜스제닉 척추동물도 생성하는 실용적인 도구임을 제안한다. 먼저, PB는 고효율로 마우스 생식 계열 내로 도입될 수 있다. 헬퍼 및 도너 플라스미드를 전핵에 공-주사함으로써 그들 생식 계열내 도너 수반의 통합된 도너 플라스미드를 30% 초과로 수득한다 (도 3A). 이어서, 접근법을 통해 단일 카피수의 통합된 트랜스진을 생산한다. 대개의 경우, 종래에는 선형 DNA를 마우스 내로 전핵애 주사할 경우 트랜스진 직렬연쇄체가 형성된다 [Nagy et al, 2003, Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]. 본 발명자들은 개개의 트랜스포존 부위를 역 PCR에 의해 신속하게 정의할 수 있다는 것을 나타내었다. 이로써, 통합된 트랜스진에 대하여 크로마틴 환경이 미치는 영향을 추정할 수 있다. 세째로, PB 인자는 그가 수반하는 트랜스진을 발현시킬 수 있다. 예측된 트랜스제닉 발현 패턴을 나타내는 마우스의 전체 빈도수는 종래 트랜스제닉 실험에 필적하였다. 마지막으로, 본 발명자의 결과는 PB가 9.1kb 이하의 트랜스진을, 전위 빈도수를 현저히 감소시키지 않으면서 수반할 수 있다는 것을 시사한다. 14.3kb 만큼 큰 트랜스진에 대한 전위가 관찰되었고, 이로써 삽입부는 레트로바이러스 벡터가 수반할 수 있는 것보다 훨씬 클 수 있다. 따라서, 단일 PB 인자는 다중 유전자를 수반할 수 있고, 이로써, 예를 들면, 시각적으로 표시되는 마커의 도움하에 양성 트랜스제닉 동물을 확인할 수 있는, 복합 트랜스제닉 실험을 실시할 수 있다.

6.4.2. 유전자의 기능을 해독하는 게놈 도구로서의 피기백

포스트-게놈 시대에서는 체계적인 유전자 불활성화가 유전자의 기능을 해독하는 가장 강력한 접근법중 하나가 된다. 세균 및 효모와 같은 단세포 유기체 뿐만 아니라, 다세포 유기체 예로서, C. 엘레강스, 드로소필라, 제브라피쉬 및 아리비놉시스(Arabidopsis)의 연구에서 이러한 접근법이 성공적임이 입증되었다. 불행하게도, 포유동물에서 게놈 전체의 유전자를 불활성화시키는 유효한 방법은 여전히 제한되어 있다. ENU 돌연변이 유발이 마우스에서 게놈-규모의 유전자를 불활성시키는 단지 몇개의 이용가능한 방법들중 하나이지만; ENU-유도 돌연변이를 지도화하고, 돌연변이에 의해 정의된 유전자를 클로닝하는 것은 보통 힘이 들고 많은 시간이 소비된다 [Herron et al, 2002, Nat. Genet. 30:185- 189]. 레트로바이러스-매개 삽입 돌연변이 유발 또한 마우스 게놈 전역의 돌연변이를 생산하기 위하여 광범위하게 사용되어 왔다. 실제 이러한 방법은 다수의 돌연변이를 생산할 수 있지만, 이러한 돌연변이중 대부분은 마우스 ES 세포에서 생성되는 것이며, 이러한 유전자 특이 돌연변이를 살아있는 동물 내로 전달하기 위해서는 현저히 많은 추가 노력이 요구된다. 최근, 마우스에서 삽입 돌연변이 유발을 위해 SB가 시험되였다. 그러나, 국소적인 도약과, 상대적으로 낮은 전사 단위로의 전위율로 인하여 광범위하게 사용될 수 없다.

대조적으로, PB는 마우스에서 열성 돌연변이를 스크리닝하는 신규의, 그리고 관심의 대상이 되는 대안을 제공한다. 마우스 생식 계열에서 유효한 PB 전위의 성공을 통해 삽입 돌연변이 유발을 위해서 트랜스포존이 적합하다는 것이 제안된다. PB의 유일한 여러 성질들이 마우스에서의 삽입 돌연변이 유발 연구에 현저한 도움을 줄 수 있다. 삽입 돌연변이 유발 실험에서 하나의 중요 고려사항은 돌연변이원이 공평한 방식으로 게놈내 모든 유전자를 적중시킬 수 있는지 여부이다. 본 발명자의 실험을 통해 PB 통합이 마우스 게놈에서 다양하게 분포하는 것으로 나타났고, 이는 PB가 광범위하게 사용되는 P-인자에서 보다 덜 편향된 방식으로 유전자를 적중시킬 수 있음을 보여주는 드로소필라에서의 최근 연구와 일치하는 것이다 [Thibault et al, 2004, Nat. Genet. 36:283-287].

흥미롭게도, 본 발명자의 연구를 통해 전사 단위에 대한 PB 전위의 고도한 선호성이 밝혀졌다. 67%의 트랜스포존 통합이 공지 또는 예측된 전사 단위내에서 발견되었다. 전사 개시 및 종결 부위에 인접한 조절 영역내 삽입을 비롯하여, 유전자중 PB 전위의 빈도는 훨씬 더 높다. 단, 단지 ~15%의 마우스 진정염색질 서열만이 유전자를 코딩한다는 점에서 PB 전위는 코딩 서열에 대한 고도로 선택적인 것이다. 이러한 통합 성질이 PB 인자에 의해 수반되는 게놈 또는 외래 서열의 전사 활성에 의해 영향을 받는지 여부는 불명확하다. 그럼에도 불구하고, 이러한 통합 선호성을 통해 PB는 게놈 전체의 삽입 돌연변이 유발을 위해 가능성이 있으며 이상적인 도구가 될 수 있다.

무작위 돌연변이 유발로부터 수득되는 돌연변이 분석에서 중요한 측면은 돌연변이와 돌연변이를 유발한 표현형 사이의 관계를 확인한다는 것이다. 이는 신규 유전자 분석에서 특히 중요하다. 유전자형/표현형 사이의 상관관계를 확인하는 것은 보통 야생형 유전자를 돌연변이체 배경에 도입시키고 표현형상의 "구제" (이상 적으로, 유도된 돌연변이가 야생형으로 복귀되는 것)를 찾는 것으로서 수행된다. 유전자형/표현형 사이의 상관관계를 결정하는 또다른 방법은 삽입 돌연변이를 절게하고 표현형상의 복귀를 찾는 것이다. 따라서, 트랜스포존이 절제할 수 있는 능력이 항상 레트로바이러스 벡터보다 중요한 잇점으로서 고려되어 왔다. 그러나, 대부분의 트랜스포존은 원래의 부위로부터 절제된 후 소량의 결실부 또는 삽입부를 남겨둔다. 흥미롭게도, PB는 일반적으로 절제후 흔적을 남기지 않으며, 이로써 복귀 돌연 변이체를 생산하는데 이상적일 수 있다. 이러한 특징으로 PB는 또한 돌연변이 유발시 게놈 손상을 덜 일으킬 수 있고, 여기에서, 다중 전위 이벤트가 단일 게놈내에서 발생하게 된다. 본 발명자들의 연구를 통해 트랜스포사제의 생식 계열 발현으로 PB가 용이하게 절제될 수 있다는 것이 입증되었다. PB는 전위시 다중 유전자를 수반할 수 있다는 사실이 삽입 돌연변이 유발을 비롯한 다수의 유전자 조작 및 표현형의 특징화에 대하여 현저한 잇점을 제공하는 것이다. 이로써 시각적으로 표시되는 마커, 에로서, RFP 및 티로시나제에 의해 삽입/돌연변이, 및 돌연변이 상태, 예로서, 이종 대 동종, 및 단일 돌연변이체 대 이중 돌연변이체를 이해할 수 있다. 마우스 교대번식과 관련하여 세대기간이 길고 동물의 하우징 비용이 높다는 점에서, 이는 다수의 실험 유형에 대한 비용을 현저히 절감시키고, 실행 불가능한 몇몇 실험을 실시가능하게 할 수 있다.

추가로, 삽입 돌연변이 유발을 위한 PB 트랜스포존은 또한 인핸서/프로모터 검출을 위한 리포터 유전자, 또는 "유전자 트랩핑"을 수반할 수 있는데, 이는 마우스 게놈의 기능 해독을 현저히 용이하게 하고, 다수 유형의 생물학적 분석에 대한 시약을 제공한다. 에를 들면, 유전자 트랩 기술을 PB 시스템과 함께 사용할 수 있다. 미세주사 또는 교배법을 사용하여 유전자 트랩 벡터를 수반하는 PB 트랜스포존이 마우스 게놈 내로 전위하도록 유도할 수 있다. 트랜스포존이 우측 방향으로 유전자의 인트론 내로 삽입되는 경우, 그 안의 마커 유전자 (예로서, LacZ)는 활성화될 것이며, 내인성 유전자는 파괴될 것이다. 이로써 리포터 발현을 검출할 수 있고, 몇몇 경우에는, 트랩핑된 계열중 몇몇에서의 유전자 파괴에 의해 유발되는 시각적으로 표시되는 표현형을 검출할 수 있다.

결론적으로, 본 실험은 마우스에서 고도로 유효한 트랜스제네시스 및 삽입 돌연변이 유발 시스템에 대한 기초를 제공하고, PB 시스템도 기타 척추동물 유기체에서 유전자 조작을 위한 강력한 도구로서 사용될 수 있음을 제안한다 [Thibault et al, 2004, Nat. Genet. 36:283-287].

7. 인용된 참고 문헌

각 개개의 공보 또는 특허 또는 특허출원이 구체적이고 개별적으로 모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용되는 것으로 제시된 것과 동일한 정도로 본원에서 인용된 모든 참고문헌들은 모든 목적을 위해 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

본 발명은 그의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다수 변형되고 변화될 수 있고, 이는 당업자에게는 자명할 것이다. 본원에 기술된 특정 실시태양은 단지 일례로서 제공된 것이며, 본 발명은 첨부되는 청구범위와, 청구범위에 의해 부여된 전 범주의 등가물에 의해서만 제한되어야 한다.

Claims (152)

1. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사(piggyBac-like) 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계;

   (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

   (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여;

   하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계

   를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 피기백 -유사 트랜스포존이 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방 법.
3. 제1항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 선형이고, 이로써, 하나 이상의 세포의 게놈은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 선형이고, 이로써, 하나 이상의 세포의 게놈은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 핵산에 결합하고/거나 핵산을 변형시키는 단백질에 의해 인식되는 서열을 포함하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 핵산-변형 단백질이 DNA-결합 단백질, DNA-변형 단백질, RNA-결합 단백질, 또는 RNA-변형 단백질인 방법.
7. 제5항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 부위-특이 리콤비나제에 대한 표적 부위를 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 표적 부위가 FRT 표적 부위 또는 lox 표적 부위인 방법.
9. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 선별가능한 마커를 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 리포터 유전자를 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 리포터 유전자가 상기 종류의 종에 대하여 내인성인 방법.
12. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 선별가능한 마커 및 리포터 유전자를 둘다 포함하는 방법.
13. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 동일한 핵산내 존재하는 방법.
14. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 별도의 핵산상에 존재하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 DNA이고, 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산이 RNA인 방법.
16. 제15항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 인간을 제외한 척추동물내 고정화되는 방법.
17. 제14항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산 및 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산이 둘다 DNA인 방법.
18. 제17항에 있어서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 방법.
20. 제19항에 있어서, 프로모터가 생식 계열에서 트랜스포사제의 발현을 지시하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 프로모터가 생식 계열-특이 프로모터인 방법.
22. 제18항에 있어서, 하나 이상의 세포의 게놈이 직렬연쇄체내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 직렬연쇄체는 각각의 뉴클레오티드 서열이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
23. 제1항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유동물인 방법.
24. 제1항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 가축 동물인 방법.
25. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계;

    (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

    (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여;

    하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계

    를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 선형이고, 이로써, 하나 이상의 세포의 게놈은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 방법.
27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 핵산에 결합하고/거나 핵산을 변형시키는 단백질을 인식하는 서열을 포함하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 핵산-변형 단백질이 DNA-결합 단백질, DNA-변형 단백질, RNA-결합 단백질, 또는 RNA-변형 단백질인 방법.
29. 제27항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 부위-특이 리콤비나제에 대한 표적 부위를 포함하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 표적 부위가 FRT 표적 부위 또는 lox 표적 부위인 방법.
31. 제25항 또는 제26항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 선별가능한 마커를 포함하는 방법.
32. 제25항 또는 제26항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 리포터 유전자를 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 리포터 유전자가 상기 종류의 종에 대하여 내인성인 방법.
34. 제25항 또는 제26항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 선별가능한 마커 및 리포터 유전자를 둘다 포함하는 방법.
35. 제25항 또는 제26항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 동일한 핵산내 존재하는 방법.
36. 제25항 또는 제26항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 별도의 핵산상에 존재하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 DNA이고, 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산은 RNA인 방법.
38. 제37항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 인간을 제외한 척추동물내 고정화되는 방법.
39. 제36항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산 및 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산이 둘다 DNA인 방법.
40. 제39항에 있어서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 방법.
42. 제41항에 있어서, 프로모터가 생식 계열에서 트랜스포사제의 발현을 지시하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 프로모터가 생식 계열-특이 프로모터인 방법.
44. 제40항에 있어서, 하나 이상의 세포의 게놈이 직렬연쇄체내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 직렬연쇄체는 각각의 뉴클레오티드 서열이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
45. 제25항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유동물인 방법.
46. 제25항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 가축 동물인 방법.
47. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 선형 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계;

    (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

    (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 상기 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여;

    하나 이상의 그의 세포의 게놈내, 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계

    를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에, 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
48. 제47항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 핵산에 결합하고/거나 핵산을 변형시키는 단백질을 인식하는 서열을 포함하는 방법.
49. 제48항에 있어서, 핵산-변형 단백질이 DNA-결합 단백질, DNA-변형 단백질, RNA-결합 단백질, 또는 RNA-변형 단백질인 방법.
50. 제48항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 부위-특이 리콤비나제에 대한 표적 부위를 포함하는 방법.
51. 제50항에 있어서, 표적 부위가 FRT 표적 부위 또는 lox 표적 부위인 방법.
52. 제47항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 선별가능한 마커를 포함하는 방법.
53. 제47항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 리포터 유전자를 포함하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 리포터 유전자가 상기 종류의 종에 대하여 내인성인 방법.
55. 제47항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 선별가능한 마커 및 리포터 유전자를 둘다 포함하는 방법.
56. 제47항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 동일한 핵산내 존재하는 방법.
57. 제47항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 별도의 핵산상에 존재하는 방법.
58. 제57항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산이 DNA이고, 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산은 RNA인 방법.
59. 제58항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 인간을 제외한 척추동물내 고정화되는 방법.
60. 제57항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산 및 피기백-유사 트랜스포사제를 포함하는 핵산이 둘다 DNA인 방법.
61. 제60항에 있어서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 방법.
62. 제61항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 방법.
63. 제62항에 있어서, 프로모터가 생식 계열에서 트랜스포사제의 발현을 지시하는 방법.
64. 제63항에 있어서, 프로모터가 생식 계열-특이 프로모터인 방법.
65. 제61항에 있어서, 하나 이상의 세포의 게놈이 직렬연쇄체내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 직렬연쇄체는 각각의 뉴클레오티드 서열이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
66. 제47항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유동물인 방법.
67. 제47항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 가축 동물인 방법.
68. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 핵산을 도입시키는 단계;

    (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

    (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여;

    하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계

    를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포사제 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
69. 제68항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 방법.
70. 제69항에 있어서, 프로모터가 생식 계열에서 트랜스포사제의 발현을 지시하는 방법.
71. 제70항에 있어서, 프로모터가 생식 계열-특이 프로모터인 방법.
72. 제68항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유동물인 방법.
73. 제68항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 가축 동물인 방법.
74. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 (i) 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산; 및 (ii) 배아의 하나 이상의 세포의 게놈 내로, 또는 난모세포 또는 그로부터 유래된 배아의 하나 이상의 세포의 게놈 내로 각각 피기백-유사 트랜스포존의 통합을 유도하는데 유효한 양의 피기백-유사 트랜스포사제 폴리펩티드를 도입시키는 단계;

    (b) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동일한 종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

    (c) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하여;

    하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계

    를 포함하는, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
75. 제74항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 방법.
76. 제74항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
77. 제74항에 있어서, 핵산이 선형이고, 이로써, 피기백-유사 트랜스포존이 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내 존재하는 방법.
78. 제74항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유동물인 방법.
79. 제74항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물이 가축 동물인 방법.
80. (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기 백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계;

    (b) 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되는 조건하에서 세포를 배양하여 피기백-유사 트랜스포존이 배양물중의 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하여,

    그의 게놈은 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 배양물에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계

    를 포함하는, 그의 게놈이 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법.
81. (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계;

    (b) 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되는 조건하에서 세포를 배양하여 피기백-유사 트랜스포존이 배양물중 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하여,

    그의 게놈이 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계

    를 포함하는, 그의 게놈이 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법.
82. (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 선형 핵산, 및 동일한 핵산내 또는 별도의 핵산상의 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 단계;

    (b) 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되는 조건하에서 세포를 배양하여 피기백-유사 트랜스포존이 배양물중의 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하여,

    그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계

    를 포함하는, 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법.
83. (a) 배양물중의 척추동물 세포 내로 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 핵산을 도입시키는 단계;

    (b) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 배양물중 척추동물 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건하에서 세포를 배양하여,

    그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 단계

    를 포함하는, 그의 게놈이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하고, 다수의 뉴클레오티드 서열 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 것인, 배양물중에서 재조합 척추동물 세포를 생성하는 방법.
84. 제80항 내지 제83항중 어느 한 항에 있어서, 척추동물 세포가 포유동물 세포인 방법.
85. 제84항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
86. (a) 하나 이상의 그의 생식 세포의 게놈에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 그의 생식 세포의 게놈에 피기백 -유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물과 교배하여 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

    (b) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백 -유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되고, 트랜스포존이 이동하도록 하여; 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 단계

    를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 방법.
87. 제86항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제14항의 방법에 의해 생성되는 방법.
88. 제86항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제74항의 방 법에 의해 생성되는 방법.
89. 제86항에 있어서, 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제68항의 방법에 의해 생성되는 방법.
90. (a) 하나 이상의 그의 생식 세포의 게놈에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기 백-유사 트랜스포존을 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 그의 생식 세포의 게놈에 피기백 -유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물과 교배하여 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

    (b) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존 및 기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되고, 트랜스포존이 이동하도록 하여; 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 단계

    를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 방법.
91. 제90항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제36항의 방 법에 의해 생성되는 방법.
92. 제90항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제74항의 방법에 의해 생성되는 방법.
93. 제90항에 있어서, 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제68항의 방법에 의해 생성되는 방법.
94. (a) 하나 이상의 그의 생식 세포의 게놈에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 상기 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 그의 생식 세포의 게놈에 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물과 교배하여 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

    (b) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여 피기백-유사 트랜스포사제가 발현되고, 트랜스포존이 이동하도록 하여; 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시키는 단계

    를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에서 피기백-유사 트랜스포존을 이동시 키는 방법.
95. 제94항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제57항의 방법에 의해 생성되는 방법.
96. 제94항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제74항의 방법에 의해 생성되는 방법.
97. 제94항에 있어서, 제2의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제68항의 방법에 의해 생성되는 방법.
98. (a) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 (i) 적어도 1.5kb의 삽입체를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체인 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

    (b) 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여, 피기백-유사 트랜스포존을 상기 자손에 고정화시킴으로써,

    인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 단계

    를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 방법
99. 제98항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제18항의 방법에 의해 생성되는 방법.
100. (a) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 (i) 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피 기 백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체인 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

     (b) 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여, 피기백-유사 트랜스포존을 상기 자손에 고정화시킴으로써 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 단계

     를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 방법.
101. 제100항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제40항의 방 법에 의해 생성되는 방법.
102. (a) 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 (i) 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체인 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

     (b) 그의 게놈내 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 단계 (a)의 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하여, 피기백-유사 트랜스포존을 상기 자손에 고정화시킴으로써 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 단계

     를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물에 피기백-유사 트랜스포존을 고정화시키는 방법.
103. 제102항에 있어서, 제1의 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 제61항의 방법에 의해 생성되는 방법.
104. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 도입시키되, 상기의 하나 이상의 핵산중 적어도 하나는 선형인 단계;

     인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

     인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터, 다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 단계를 포함하는,

     다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코 딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 것인 단계;

     (b) 단계 (a)의 회수한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 성체가 되도록 성장시키는 단계;

     (c) 단계 (b)의 성체인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체 척추동물과 교배시켜 하나 이상의 자손을 얻는 단계;

     (d) 단계 (c)의, 그의 게놈내 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 하나 이상의 자손들중 적어도 하나를 확인하되, 여기에서, 하나 이상의 자손은 각각 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물로서,

     하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생선하는 단계를 포함하는,

     하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
105. (a) 생체외에서 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포 내로 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 연결된 피 기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 도입시키되, 상기의 하나 이상의 핵산중 적어도 하나는 선형인 단계;

     인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아 발생에 바람직한 조건하에서, 생성된 인간을 제외한 척추동물 배아 또는 수정한 난모세포를 동종의 수양모 내로 이식하는 단계; 및

     인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 내의 배아가 발생할 수 있는 충분한 시간이 경과한 후, 모체로부터, 다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 회수하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각이 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 단계를 포함하는,

     다수의 그의 생식 계열 세포의 게놈내 (i) 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 둘다 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하되, 여기에서, 상기 피기백-유사 트랜스포존 및 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 상기의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내, 또는 각각은 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 직렬연쇄체에 존재하는 것인 단계;

     (b) 단계 (a)의 회수한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물이 성체가 되도록 성장시키는 단계;

     (c) 단계 (b)의 성체인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 제2 성체 척추동물과 교배시켜 다수의 자손을 얻는 단계;

     (d) 단계 (c)의 2 이상의 자손을 확인하되, 이들 각각은 그의 게놈내 생식 계열에서 발현되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않고, 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하며, 상기 2 이상의 자손은 각각 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물로서,

     인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리를 생성하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 단계를 포함하는, 그의 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 고정화된 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리를 생성하는 방법.
106. 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물.
107. 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백 -유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물.
108. 하나 이상의 그의 세포의 게놈내 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물.
109. 그의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포.
110. 그의 게놈내에 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포.
111. 그의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백 -유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포.
112. 그의 게놈내에 피기백 -유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백 -유사 트랜스포존은 다수의 피기백 -유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 배양물중의 척추동물 세포.
113. 제105항의 방법에 의해 생산된, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리.
114. 다수의 상이한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 포함하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리.
115. 다수의 상이한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 포함하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리.
116. 다수의 상이한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 포함하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리.
117. 다수의 상이한 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 포함하되, 각각은 하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기 백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 라이브러리.
118. 제113항, 제114항, 제115항, 제116항 및 제117항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 10마리의, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물의 라이브러리.
119. 제118항에 있어서, 적어도 20마리의, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 포함하는, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물의 라이브러리.
120. 다수의 상이한 세포를 포함하되, 각 세포는 그의 게놈내에 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리.
121. 다수의 상이한 세포를 포함하되, 각 세포는 그의 게놈내에 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리.
122. 다수의 상이한 세포를 포함하되, 각 세포는 그의 게놈내에 인간을 제외한 트 랜스제닉 척추동물에서 형질을 변형시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리.
123. 다수의 상이한 세포를 포함하되, 각 세포는 그의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하되, 여기에서, 피기백-유사 트랜스포존은 다수의 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 직렬연쇄체내에 존재하는, 배양물중의 척추동물 세포의 라이브러리.
124. 그의 게놈이 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 재조합 척추동물 세포를 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
125. 제124항에 있어서, 재조합 척추동물 세포가 제81항의 방법에 따라 생성되는 방법.
126. 그의 게놈이 (i) 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존 및 (ii) 대상의 하나 이상의 세포에서 피기백-유사 트랜스포사제의 발현을 지시하는 프로모 터에 작동가능하게 연결된 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 투여함으로써, 투여 후, 피기백-유사 트랜스포사제를 상기 대상의 하나 이상의 세포의 게놈으로 통합시켜, 척추동물의 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 핵산을 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 전달하는 단계를 포함하는, 척추동물의 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 핵산을 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상의 하나 이상의 세포에 전달하는 방법.
127. 제126항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스인 방법.
128. 그의 게놈이 (i) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 피기백-유사 트랜스포사제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스.
129. 제128항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스인 재조합 바이러스.
130. (a) 피기백-유사 트랜스포존이 절제되는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물의 하나 이상의 자손을 생성하고;

     (b) 자손내 피기백-유사 트랜스포존의 절제와 표현형의 복귀 사이에 상관관계가 존재하는지 여부를 결정하되, 여기에서, 상관관계는 표현형이 피기백-유사 트랜스포존에 의해 유발되는 것임을 나타냄으로써,

     하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에 의해 나타나는 표현형이 피기백-유사 트랜스포존에 의해 유발되는 것인지를 여부를 결정하는 것을 포함하는,

     하나 이상의 그의 세포의 게놈내에 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에 의해 나타나는 표현형이 피기백-유사 트랜스포존에 의해 유발되는 것인지를 여부를 결정하는 방법.
131. (a) 하나 이상의 그의 세포 또는 조직의 게놈내에 최소한의 프로모터 조절하의 리포터 유전자를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물에서, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물 또는 그로부터 유래된 자손의 하나 이상의 세포 또는 조직내 리포터 유전자의 발현을 평가하는 단계;

     (b) 하나 이상의 세포 또는 조직내 리포터 유전자 발현의 원인이 되는 피 기백-유사 트랜스포존 측면에 위치하는 핵산을 단리시켜;

     인간을 제외한 척추동물로부터 인핸서를 단리시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 척추동물로부터 인핸서를 단리시키는 방법.
132. (a) 재조합 척추동물 세포 또는 그의 자손에서 리포터 유전자의 발현을 평가 하는 단계;

     (b) 재조합 척추동물 세포에서 리포터 유전자 발현의 원인이 되는 피기백-유사 트랜스포존 측면에 위치하는 핵산을 단리시켜;

     배양물중에서 재조합 척추동물 세포로부터 인핸서를 단리시키는 단계를 포함하는, 재조합 세포가 최소한의 프로모터 조절하의 리포터 유전자를 포함하는 피기백-유사 트랜스포존을 포함하는, 배양물중 재조합 척추동물 세포로부터 인핸서를 단리시키는 방법.
133. (a) 그의 게놈내 (i) 부위-특이 리콤비나제 인식 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존에 대하여 동종 접합성인 유전자좌, 및 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 상기 부위-특이 리콤비나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 배아를 생성하고;

     (b) 부위-특이 리콤비나제가 발현되고, 증식이 일어나는 조건하에서 인간을 제외한 트랜스제닉 배아를 배양하여;

     피기백-유사 트랜스포존에 대하여 모자이크인 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 단계를 포함하는, 피기백-유사 트랜스포존에 대하여 모자이크인 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물을 생성하는 방법.
134. (a) 하나 이상의 용기에 (i) 적어도 1.5kb의 삽입체를 수반하는 피기백-유사 트랜스포존; 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하고;

     (b) 제2의 용기에 (i) 배양물중의 척추동물 세포 또는 (ii) 인간을 제외한 척추동물의 난모세포를 포함하는 키트.
135. (a) 하나 이상의 용기에 (i) 척추동물의 질환 또는 질병 치료 또는 예방에 가치가 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존; 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하고;

     (b) 제2의 용기에 (i) 배양물중의 척추동물 세포 또는 (ii) 인간을 제외한 척추동물의 난모세포를 포함하는 키트.
136. (a) 하나 이상의 용기에 (i) 피기백-유사 트랜스포존; 및 (ii) 피기백-유사 트랜스포사제을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하되, 여기에서, 하나 이상의 핵산중 적어도 하나는 선형이고;

     (b) 제2의 용기에 (i) 배양물중의 척추동물 세포 또는 (ii) 인간을 제외한 척추동물의 난모세포를 포함하는 키트.
137. 제1항, 제25항, 제47항, 제68항, 제80항, 제81항, 제82항, 제83항, 제86항, 제90항, 제94항, 제98항, 제100항, 제102항, 제104항, 제105항, 제124항, 제126항, 제128항, 제130항, 제131항, 제132항 및 제133항중 어느 한 항에 있어서, 피기백- 유사 트랜스포존이 피기백 트랜스포존이고/거나, 피기백-유사 트랜스포사제가 피기백 트랜스포사제인 방법.
138. 제106항 내지 108항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 피기백 트랜스포존이고/거나, 피기백-유사 트랜스포사제가 피기백 트랜스포사제인, 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물.
139. 제113항 내지 제117항, 및 제120항 내지 제123항중 어느 한 항에 있어서, 피 기백-유사 트랜스포존이 피기백 트랜스포존이고/거나, 피기백-유사 트랜스포사제가 피기백 트랜스포사제인 라이브러리.
140. 제109항 내지 제112항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 피기백 트랜스포존이고/거나, 피기백-유사 트랜스포사제가 피기백 트랜스포사제인 척추동물 세포.
141. 제128항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 피기백 트랜스포존이고/거나, 피 기백-유사 트랜스포사제가 피기백 트랜스포사제인 재조합 바이러스.
142. 제134항 내지 제136항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 피기 백 트랜스포존이고/거나, 피기백-유사 트랜스포사제가 피기백 트랜스포사제인 키 트.
143. 제1항, 제80항 및 제86항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 적어도 2.5kb의 삽입체를 수반하는 방법.
144. 제106항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 적어도 2.5kb의 삽입체를 수반하는 인간을 제외한 트랜스제닉 척추동물.
145. 제114항 및 제120항중 어느 한 항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 적어도 2.5kb의 삽입체를 수반하는 라이브러리.
146. 제109항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 적어도 2.5kb의 삽입체를 수반하는 척추동물 세포.
147. 제134항에 있어서, 피기백-유사 트랜스포존이 적어도 2.5kb의 삽입체를 수반하는 키트.
148. 제105항에 있어서, 단계 (d)의 확인이 역중합 효소 연쇄 반응을 실시하는 것을 포함하는 방법.
149. 제21항, 제43항, 제64항 및 제71항중 어느 한 항에 있어서, 생식 계열 특이 프로모터가 남성-특이 프로모터인 방법.
150. 제149항에 있어서, 남성-특이 프로모터가 프로타민 (Prm) 프로모터인 방법.
151. 제21항, 제43항, 제64항 및 제71항중 어느 한 항에에 있어서, 생식 계열 특이 프로모터가 여성-특이 프로모터인 방법.
152. 제151항에 있어서, 여성-특이 프로모터가 ZP3 프로모터인 방법.

Images