JP2009254379A - 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】選択可能マーカーを含む1つまたは複数のDNAフラグメントを細胞に導入する段階と、前記1つまたは複数のDNAフラグメントをゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、サテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階とを含んで成る、ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである、人工染色体の製造方法、このような方法によって得られるサテライト人工染色体、並びにサテライト人工染色体を含むトランスジェニック非ヒト動物または植物。
【選択図】なし
Description
米国の国内段階に関して本出願は、発明の名称「ARTIFICIAL CHROMOSOMES,USES THEREOF AND METHODS FOR PREPARING ARTIFICAL CHROMOSOMES」で1996年8月7日に出願された同時係属中の米国特許出願08/695191号(GYULAHADLACZKYおよびALADAR SZALAY)の一部継続出願である。本出願はさらに、発明の名称「ARTIFICIAL CHROMOSOMES,USES THEREOF AND METHODS FOR PREPARING ARTIFICAL CHROMOSOMES」で1996年7月15日に出願された同時係属中の米国特許出願08/682080号(GYULA HADLACZKYおよびALADAR SZALAY)の一部継続出願でもあり、発明の名称「ARTIFICIAL CHROMOSOMES,USES THEREOF AND METHODS FOR PREPARING ARTIFICAL CHROMOSOMES」で1996年4月10日に出願された同時係属中の米国特許出願08/629822号(GYULA HADLACZKYおよびALADAR SZALAY)の一部継続出願でもある。
前記1つまたは複数のDNAフラグメントをゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
サテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階と
を含んで成る、ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである、人工染色体の製造方法。
断片化用ベクターを導入し、これによって細胞内のメガ染色体のサイズを小さくする段階と、
15〜60Mbのサイズのサテライト人工染色体を含む細胞を同定する段階と
を含むことを特徴とする請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
中期染色体を単離し、
内因性染色体からサテライト人工染色体を識別し、
内因性染色体からサテライト人工染色体を分離することによって行われることを特徴とする上記20に記載の方法。
サテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階と
を含んで成るサテライト人工染色体の製造方法。
前記1つまたは複数のDNAフラグメントをそのゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から新規な動原体を含む二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
サテライト人工染色体が産生される条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る人工染色体の製造方法。
前記1つまたは複数のDNAフラグメントをそのゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から新規な動原体を含む二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
二動原体型染色体が分裂して元二動原体型染色体を産生する細胞を産生するために細胞を増殖させる段階と、
元二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
ソーセージ型染色体が産生される条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る、ここでソーセージ型染色体が増幅された異質染色質および真正染色質腕を含む、人工染色体の製造方法。
サテライト人工染色体にターゲットされる断片化用ベタターを導入する段階と、細胞を増殖させる段階と、断片化用ベクターが導入された細胞のサテライト人工染色体よりも小さいサテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階とを含むことを特徴とする上記42に記載の方法。
前記DNAフラグメントをそのゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から二動原体型染色体を産生した細胞を選択する段階と、
異質染色質アームをもつ染色体を含んでいる細胞が産生されるような、選択可能マーカーを使用する選択条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る人工染色体の製造方法。
得られたターゲット細胞をヒト以外の宿主動物に導入する段階と
を含んで成る遺伝子治療方法。
前記1つまたは複数のDNAフラグメントをそのゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
真性染色質よりも異質染色質を多く含む人工染色体を有している細胞を選択する段階と
を含んで成る人工染色体の製造方法。
核ドナー細胞の核をヒト以外の除核受容体細胞に転移する段階と
を含んで成る方法。
ここでS1はE1によって開裂する制限部位1であり、S2はE2によって開裂する第2の制限部位であり、>は簡単な反復単位を表し、「 」は下記のオリゴヌクレオチド2と相補的な配列が隣にある短い(8〜10)ヌクレオチドを示す。
ここで、S3は酵素E3についての第3の制限部位であり、構築の際に使用されるベクターに存在する。その方法では次の段階を行う。(1)オリゴヌクレオチド1および2をアニーリングする;(2)アニーリングされたオリゴヌクレオチドを埋めて、二本鎖(ds)配列を得る;(3)二本鎖DNAを制限酵素E1およびE3で開裂させ、次に、同じ酵素E1およびE3で開裂させてあったベクター(例:pUC19または酵母ベクター)に連結する;(4)制限酵素E1およびE3で消化させることで、プラスミドの第1の部分から挿入物を単離し、プラスミドの第2の部分を酵素E2(3’の突出を除くための処理)およびE3で切断し、大きい断片(プラスミドDNAと挿入物)を単離する;(5)2個のDNA断片(S1〜S3挿入物断片とベクター+挿入物)を連結する;(6)段階4および5を必要な回数繰り返して、所望の反復配列の大きさとする。各延長サイクルで、反復配列の大きさは倍化する。すなわち、mを延長サイクルの回数とすると、反復配列の大きさはk×2mヌクレオチドとなる。
2)中緊縮性:0.2×SSPE、0.1%SDS、50℃
3)低素縮性:1.0×SSPE、0.1%SDS、50℃
あるいは、塩および温度ならびに他の試薬の組み合わせによって、同程度の不適合または適合を選択することができる。
1.メガレプリコン
本発明で提供される方法、細胞およびMACは、動原体領域に比較的高次の複製単位[メガレプリコン]が存在することを発見したことによって得られたものである。このメガレプリコンは、一次複製開始部位[メガレプリケータ]を境界とし、動原体異質染色質および最も可能性の高いものとして動原体の複製を促進するように思われる。異種DNAのメガレプリケータ領域またはそのごく近くへの組み込みによって、メガ塩基サイズの染色体部分の大量増幅が開始し、それによって生存細胞においてデノボ染色体形成が起こるようになる。
ヒトおよび細菌のDNAを有するλ構築物[λCM8およびλgtWESneo]の同時組み込み後の形質転換マウスLMTK-線維芽細胞系[EC3/7]でのデノボ動原体形成[Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8106-8110および米国特許出願08/375271号参照)が報告されている。「異種」操作ヒト、細菌およびファージDNAの組み込みと、その後のマウスおよび異種DNAの増幅による二動原体染色体形成が、マウス染色体の短腕の動原体領域で起こった。G分染によって、この染色体はマウス7番染色体であることが確認された。同じ染色体上に2個の機能的に活性な動原体が存在することから、動原体間では一定の切断が起こる。そのような特異的染色体切断によって、neo−動原体を有する染色体断片が認められるようになった(細胞の約10%で)。EC3/7細胞系[受託番号90051001でEuropean Collection of Animal Cell Culture(以下ECACCと称する)に寄託された米国特許5288625号参照;Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110および米国特許出願08/375271号ならびに相当する公開欧州出願EP0473253号も参照]から、2つの亜細胞系[EC3/7C5およびEC3/7C6]を反復単一細胞クローニングによって選別した。これらの細胞系では、neo−動原体は専らミニ染色体[neo−ミニ染色体]で認められたが、元二動原体染色体には「異種」DNAの痕跡を有していた。
neo−動原体をマウス染色体から分離するEC3/7細胞での染色体切断がGバンド陽性「異種」DNA領域で起こった。これは、元二動原体染色体の切断末端にλおよびヒトDNA配列の痕跡が認められたことで裏付けられる。neo−動原体を有する染色体断片のGバンドパターンを安定なneo−ミニ染色体のものと比較することで、neo−ミニ染色体が、neo−動原体を有する染色体断片の反転複製物であることが明らかである。これは、neo−ミニ染色体が機能性動原体1個のみを有するが、ミニ染色体のいずれの末端も異質染色性であり、in situハイブリダイセーションによって、これらの異質染色性領域においてマウス付随DNA配列が認められたことで裏付けられる。
SATAC製造のためのプロトコール例を図2[特にD、EおよびF]および図3[実施例、特に実施例4〜7も参照]に図示してある。
ミニ染色体、λneo−染色体およびSATACなどのMACを有する細胞系が本発明で提供されるか、あるいはそれを本発明の方法によって得ることができる。そのような細胞系は、これら染色体の簡便な入手源を提供するものであり、細胞融合または特定細胞系との融合における微小核体の生産などによって操作して、対象とする染色体をハイブリッド細胞系に導入することができる。本明細書では細胞系の例を記載しており、一部はECACCに寄託されている。
細胞系EC3/7C5およびEC3/7C6を、EC3/7の単一細胞クローニングによって得た。例を挙げるとEC3/7C5はECACCに寄託されている。これらの細胞系には、EC3/7からのミニ染色体および元二動原体染色体が含まれている。細胞系EC3/7C5およびEC3/7C6における安定なミニ染色体は同一であるように思われ、それらは二動原体染色体の約10〜15Mbの「分裂」断片の複製誘導体であるように思われる。これらの独立に得られた細胞系でそれらの大きさが同様であることは、約20〜30Mbが、安定なミニ染色体の最小または最小に近い物理的大きさであることを示していると考えられる。
第2の選択可能マーカー、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(すなわち、ハイグロマイシン耐性遺伝子)および検出可能なマーカーβ−ガラクトシダーゼ(すなわち、lacZ遺伝子)をコードするDNAなどの別の異種DNAをEC3/7C5細胞系に導入し、選択条件下に増殖させて、TF1004G19と称する細胞を得た。詳細にはこの細胞系は、抗HIVリボザイム(ribozyme)およびハイグロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドpH132、pCH110[β−ガラクトシダーゼをコード]およびλファージ[λc1875Sam7]DNAとの共トランスフェクションおよびハイグロマイシンBによる選別によって、EC3/7C5細胞系から得られた。
TF1004F−19C5は、neo−ミニ染色体および安定な「ソーセージ」染色体を含むマウスLMTK-線維芽細胞系である。それは、TF1004G19のサブクローンであり、TF1004G19細胞系の単一細胞クローニングによって形成されたものである。それは、細胞系の例およびソーセージ染色体源の例としてECACCに寄託してある。その後、この細胞系とCHO K20細胞との融合を行い、ハイグロマイシンおよびG418およびHAT(ヒボキサンチン、アミノプテリア(aminopteria)およびチミジン培地;Szybalski et al.(1962)Proc.Natl.Acad.Sci.48:2026参照)による選別を行って、ソーセージ染色体とneo−ミニ染色体を有するハイブリッド細胞(19C5×Ha4と称する)を得た。ハイブリッド細胞のBrdU処理とそれに続く単一細胞クローニングおよびG418および/またはハイグロマイシンによる選別によって、GB43およびG3D5などの対象とする染色体を有する各種細胞を得た。
19C5×Ha4細胞をBrdU処理し、次にG418を含有する選択培地で成長させ、BrdUで再度処理することで、細胞系GB43およびG3D5を得た。その2つの細胞系を、所定細胞の単一細胞クローニングによって単離した。GB43細胞にはneo−ミニ染色体のみが含まれている。ECACCに寄託したG3D5には、neo−ミニ染色体およびメガ染色体がある。この細胞系を単一細胞クローニングし、次にサブクローンをG418およびハイグロマイシンを含む培地で成長させて、neo−ミニ染色体およびメガ染色体を有するGHB42細胞系などのサブクローンを得た。H1D3は、メガ染色体を有するが、neo−ミニ染色体を持たないマウス−ハムスターハイブリッド細胞系であり、19C5×Ha4細胞をBrdUで処理し、次にハイグロマイシンを含む選択培地で増殖させ、特定細胞の単一細胞サブクローニングを行って得た。この細胞系を、やはり別の選択(selection)遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子をコードするDNAを有するCD4+HeLa細胞系と融合させて、メガ染色体とCD4neoを有するヒト染色体を持った細胞[H1×HE41細胞]を生成した。さらにBrdU処理を行い、単一細胞クローニングを行うことで、切断メガ染色体を有する細胞を含む1B3などの細胞系を得た。
染色体製造時のいずれかの段階で、トランスフェクションその他の適切な方法によって、異種DNAを細胞に導入することができる[例えば図4参照]。一般に、そのようなDNAのMACへの導入は、異種DNAでのλ−DNAの封入(例示の染色体について)、および別の選択的マーカー遺伝子によって行うことができるように、部位指向性組み込みによって確保される。例えば、ミニ染色体またはSATACなどのMACを含む細胞は、HIVリボザイムをコードするDNA、嚢胞性繊維症遺伝子およびハイグロマイシン耐性などの第2の選択可能マーカーをコードするDNA等の所望の異種DNAを有するプラスミドと共トランスフェクションすることができる。次に、新たな選択可能マーカーを発現しない細胞には有害である薬剤に細胞を曝露することで、細胞に選択圧をかける。そのようにして、異種DNAをMACに封入した細胞が確認される。第2の細胞系との融合によって、一つの特定の種類の染色体構造またはMACを有する細胞系を形成する手段を提供することができる。
本発明で提供されるMACは、当業者に公知の好適な方法によって単離することができる。さらに、本発明では、特にSATACのかなりの精製を行う方法が提供される。SATACは、蛍光活性化細胞選択[FACS]によって単離されている。この方法は、高い異質染色質DNA含量により、細胞中の他の染色体とは異なるSATACのヌクレオチド塩基含有量を利用するものである。特定の実施態様では、中期染色体を単離し、ヘキスト(Hoechst)33258およびクロモマイシンA3などの塩基特異的染料で染色する。蛍光活性化細胞選択は、SATACを内因性染色体と分けるものである。2つのレーザが染料を別個に励起するよう設定されている二重レーザ細胞選択機[FACS Vantage Becton Dickinson Immunocytometry Systems]によって、塩基対の組成および大きさごとに染色体の二変量分析を行うことができた。そのようなSATACを含む細胞を同様に選別することができる。
人工染色体は、細胞における安定な複製および分離を内因性染色体とともに行うことができる完全染色体に寄与する構造的および機能的要素を組み立てることで、in vitroで構築することができる。共同で機能性染色体を生じる別個の要素を確認することで、人工染色体のin vitro形成が可能となった。厳重に制御可能な人工染色体のin vitro構築のプロセスは、例えば大量に必要な染色体または遺伝子導入動物系での特定用途に向けた染色体の形成において望まれる利点を提供するものである。
本発明で提供されるMAC、特にSATACは、人工染色体のin vitro構築で使用される成分の確認および単離で使用するのに好都合な簡単な染色体である。本明細書に記載のように、非常に高レベルの純度までMACを精製する能力により、これらの用途での使用が促進される。例えば、メガ染色体、特にはそれの切断型[すなわち、H1D3(受託番号96040929下にEuropean Collection of Animal Cell Culture(ECACC)に寄託したもの;以下の実施例参照)由来の1B3およびmM2C1等の細胞系]は原料として役立つ。
哺乳動物人工染色体の構築に使用される動原体の例には、例えばH1D3などの本発明で提供される含メガ染色体細胞系およびmM21C1細胞などのそれの誘導体のメガ染色体内に含まれるものがある。メガ染色体は、例えば本明細書に記載の手順を利用してそのような細胞系から単離され、動原体配列はその単離メガ染色体から抽出される。例えばメガ染色体は、例えば主として複製部位および/または異種DNA組み込み部位および/または付随DNAにある部位で認識および切断する特定の制限エンドヌクレアーゼを利用して、断片に分離することができる。得られた断片の大きさに基づいて、含動原体配列から、ある種の望ましくない要素を分離することができる。含動原体DNAは、1Mb程度の大きさであると考えられる。
好ましい末端小粒は、本発明で提供される1kB合成末端小粒である(実施例参照)。変わりなく反転配向のままである優性な選択可能マーカー遺伝子に連結した1kB合成末端小粒を含む二重合成末端小粒構成物を用いて、操作しやすくすることができる。そのような二重構成物には、マーカー遺伝子の一連のTTAGGG反復3’と反転配列の一連の反復、すなわちGGGATTであるマーカー遺伝子の5’を、(GGGATTT)n---優性マーカー遺伝子---(TTAGGG)nのように有する。適切に配向した断片のみを選択することから、反転マーカーの使用により、例えば平滑末端連結による等の簡単な挿人方法が提供される。
本発明で提供されるrDNAなどのメガレプリケータ配列は、in vitro構築物での使用で好ましい。rDNAは複製源を提供し、in vitroでの人工染色体の増幅を促進して染色体を大きくし、例えば、対象とする異種遺伝子のコピーを多く有し、その異種遺伝子を連続的に高レベルで発現する配列も提供する。
充填異質染色質、特には付随DNAを含有させて、人工染色体の構造的完全性および安定性を維持し、染色体内に遺伝子を有するための構造的基礎を提供する。付随DNAは、マウス主要付随DNAなどのA/T豊富DNA配列またはハムスター天然付随DNAなどのG/C豊富DNA配列であるのが普通である。そのようなDNA源には、十分なA/TもしくはG/C組成を有する非コード付随DNAを有して、FACSまたは密度勾配などによって、配列ごとの容易な分離を促進する真核生物などがある。付随DNAはさらに、非常にA/TもしくはG/C豊冨なDNA単位の単調な縦列反復を含む配列を形成することで合成することもできる。
簡便な選択可能マーカーを、MACの簡便な座で用いることができる。
単離要素を得たら、それらを組み合わせて、完全で機能的な人工染色体を形成する。この組立は、例えば溶液、LMPアガロースまたはマイクロビーズでin vitro連結を行うことができる。連結を行って、動原体の一端が末端小粒に直接結合するようにする。遺伝子保有染色体腕として機能する動原体の他端は、付随DNAとrDNA配列の組み合わせから形成され、やはり選択可能マーカー遺伝子を有することができる。別の末端小粒は、遺伝子保有染色体腕の末端に結合させる。遺伝子保有腕とは、例えばそれによってコードされた所望の蛋白の発現で、対象の異種遺伝子が染色体のin vitro構築時またはその後のいずれかの時点で組み込まれる部位である。
in vitroで構築された人工染色体は、SATAC、ミニ染色体について本明細書に記載の方法、または当業者に公知の方法のいずれかを用いて、in vivoの哺乳動物細胞系で機能性を調べることができる。
異種DNAは、分子生物学の常法を用いてin vitro合成染色体に導入することができ、SATACについて本明細書に記載の方法を用いて導入することができ、あるいは異質染色質などの合成要素の一つの一部として、in vitro合成染色体に組み込むことができる。異種DNAは、特定の反復断片に連結することができ、次に得られた構築物は、本発明で提供されるようなin vitro増幅法を用いてin vitroで増幅することができる(実施例参照)。
本発明で提供されるMACの導入に好適な宿主には、動物もしくは植物、それらの細胞もしくは組織などがあるが、これらに限定されるものではなく、例としては、哺乳動物、鳥、は虫類、両生類、昆虫、魚、蜘蛛、タバコ、トマト、小麦、植物およびソウ類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞に含まれる場合、MACは細胞融合もしくは微小核体融合によって導入することができる。あるいはMACが細胞から単離されている場合、直接DNA転移、エレクトロポレーション、脂質介在転移(例:リポフェクションおよびリポソーム)、微小粒子衝撃法(microprojectile bombardment)、細胞および胚での微量注入、原形質体の植物への再生および他の好適な方法など(これらに限定されるものではない)を含む当業者には公知の方法によって、これらは宿主細胞に導入することができる[例えば、Weissbach et al.(1988)Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,N.Y.,Section VIII,pp.421-463;Grierson et al.(1988)Plant Molecular Biology,2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9参照;さらに、米国特許5491075号、5482928号および5424409号も参照;哺乳動物の分離細胞の粒子介在形質転換について記載した米国特許5470708号も参照]。
使用する宿主細胞に応じて、そのような細胞に適した標準的方法を用いて形質転換を行う。その方法には、当業者には公知である以下に記載のものなどがある。
細胞壁を持たない哺乳動物細胞の場合、異種DNA導入のためのリン酸カルシウム沈殿法が好ましい場合が多い[例えば、Graham et al.(1978)Virology 52:456-457;Wigler et al.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76 1373-1376;およびCurrent Protocols in Molecular Biology Vol.1,Wiley Inter-Science,Supplement 14,Unit 9.1.1-9.1.9(1990)参照)。DNA取り込みは、DNA単独でまたは融合剤であるポリエチレングリコール存在下に[PEG介在遺伝子転移]、あるいは当業者に公知のそのような方法の変法[例えば、米国特許4684611号参照]によって行うことができる。
エレクトロポレーションでは、原形質体と外来DNAとの混合物を含む溶液に高電圧の電気パルスを印加して、植物原形質体および他の細胞の膜に可逆的な穴を設ける段階が関与する。エレクトロポレーションは、強固な細胞壁障壁を有する植物などの原核生物その他の細胞に用いられる[例えば、米国特許4784737号、5501967号、5501662号、5019034号、5503999号参照;さらには、Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:5824-5828も参照]。
人工染色体を含む微小核体を製造し、次に特定の標的細胞と融合させることで、染色体を転移させることができる。そのような微小核体の製造および融合の方法は公知である[実施例参照。さらには、米国特許5240840号、4806476号、5298429号、5396767号、Fournier(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:6349-6353;およびLambert et al(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:5907-59参照]。人工染色体を含む微小核体を用いた微小核体融合は、DT40ニワトリB前駆細胞などのトリ細胞へのMAC導入の特に有用な方法である[例えば、Dieken et al.(1996)Nature Genet. 12:174-182参照]。
好適な宿主には、異種DNAの導入および発現に有用であることが知られている宿主などがある。ここで特に興味深いものとしては、動物および植物の細胞および組織があり、それには昆虫の細胞および幼虫、植物および動物などがあり(これらに限定されるものではない)、特には遺伝子導入(人間以外)動物ならびに動物細胞がある。他の宿主には、哺乳動物、鳥(特にはニワトリなどの家禽)、は虫類、両生類、昆虫、魚、蜘蛛、タバコ、トマト、小麦、単子葉植物、双子葉植物および藻類、ならびに異種DNAの導入が望ましいあらゆる宿主などがあるが、これらに限定されるものではない。そのような導入は、本発明で提供されるMACを用いて行うことができるか、あるいは必要に応じて、本発明で提供されるMACを用いて、生物固有の動原体および/または機能性染色体単位を確認し、次に得られた動原体もしくは染色体単位を人工染色体として用いるか、あるいは別法として、MACの製造に関して本明細書に例示の方法を行って生物固有の人工染色体を製造することで行うことができる。
遺伝子導入(人間以外)動物は、微量注入によって、哺乳動物接合体の卵核に外来遺伝子材料を導入することで得ることができる[例えば、米国特許4873191号および5354674号参照;さらに、米国特許出願08/159084号に基づく国際PCT出願公開WO95/14769も参照]。接合体は、哺乳動物へ発達することができる。胚または接合体を宿主の雌子宮中に移植し、発達させる。詳細なプロトコールおよび例を以下に説明する。
遺伝子導入植物の製造または開発については、多くの方法が当業者には利用可能である。使用される方法は主として、植物の種類によって決まる。これらの方法には、PEG誘発DNA取り込み、原形質体融合、微量注入、エレクトロポレーションおよび微小粒子衝撃法などのDNAの直接転移などがあるが、これらに限定されるものではない[例えば、そのような方法についての総説に関してはUchimiya et al.(1989)J.of.Biotech.12:1-20参照;さらに、米国特許5436392号および5489520号ならびに多くの他の特許も参照]。この場合、MACの導入に際しては、微量注入、原形質体融合および粒子銃衝撃が好ましい。
(a)有用な蛋白をコードする遺伝子の増幅を人工染色体で行って、昆虫細胞での蛋白収量を高めることができる;(b)蛋白の生理的機能に必要である可能性のある糖付加およびリン酸化などの必要な翻訳後修飾を、昆虫細胞が支持し;(c)昆虫細胞が、哺乳動物ウィルスを支持せず、従ってそのような感染源による生成物の交差汚染の問題がなくなり;(d)その方法は、昆虫細胞系における栄養蛋白、工業用蛋白または医療用蛋白の製造のための従来の組換えバキュロウィルス系より優れており;(e)昆虫細胞の成長に最適な温度が低いことから(28℃)、生産のエネルギーコストが低く;(f)昆虫細胞に対する血清を含まない成長培地によって生産コストが低くなり;(g)人工染色体を含む細胞は、低温でいくらでも保存でき、(h)昆虫の幼虫は、受精昆虫卵の微量注入により栄養蛋白、医療用蛋白または工業用蛋白の生物工場となる等(これらに限定されるものではないが)の多くの理由により、昆虫は人工染色体の導入に有用な宿主である[Bombyx morjの卵に異種DNAを微量注入する方法を提供するJoy et al.(1991)Current Science 66:145-150参照]。
人工染色体は簡便かつ有用なベクターを提供し、場合によっては(例えば、非常に大きい異種遺伝子の場合)、宿主への異種遺伝子の導入のための唯一のベクターである。実質的にあらゆる対象遺伝子が、人工染色体を介しての宿主への導入を行いやすい。そのような遺伝子には、受容体、サイトカイン、酵素、プロテアーゼ、ホルモン、成長因子、抗体、腫瘍抑制遺伝子、治療物質および多重遺伝子経路をコードする遺伝子などがあるが、これらに限定されるものではない。
治療遺伝子産生物または多重遺伝子経路の産生物をコードする核酸は、治療を目的として、ヒトなどの宿主動物に、あるいは動物への導入のために標的細胞系に導入することができる。そのような治療目的には、治癒することまたは欠如もしくは欠陥のある遺伝子産生物を提供して抗腫瘍剤などの薬剤を標的細胞もしくは動物に提供すること、ならびに病原体に対する抵抗性を提供するかもしくは感受性を低下させるか、または疾患もしくは障害の症状を緩和する遺伝子産生物を提供することなどがある。以下に、遺伝子および遺伝子産生物の例をいくつか示す。そのような例示は本発明を限定するものではない。
以下に例示のように、抗HIVリボザイムをコードするDNAを、真正染色質に基づくミニ染色体およびSATACなどのMACを用いて、細胞に導入し、そこで発現させることができる。これらのMACを用いて、リボザイムを発現する遺伝子導入マウスを作ることができる。従ってそれらMACは、そのようなリボザイムの活性を調べるためのモデルとして、あるいはリボザイム産生細胞系を作ることができるモデルとして役立つ。さらに、抗HIVリボザイムをヒト細胞中にコードするMACの導入は、HIV感染の治療として役立つ。そのような系はさらに、疾患特異的リボザイムの使用が特定の疾患を治療もしくは緩和する上で有効であることを示すものである。
腫瘍抑制遺伝子は、それの野生型対立遺伝子において、異常な細胞増殖を抑制する蛋白を発現する遺伝子である。腫瘍抑制蛋白をコードする遺伝子に突然変異もしくは欠失が生じると、生じた突然変異蛋白または腫瘍抑制蛋白発現の完全な喪失のために、細胞増殖が正しく調節されなくなる場合がある。その結果、特に細胞調節機序に対してすでに損傷がある場合には、異常な細胞増殖が起こる場合がある。多くのかなり研究されているヒト腫瘍および腫瘍細胞系が、腫瘍抑制細胞の欠如または機能喪失を有することが明らかになっている。
53遺伝子の体細胞突然変異は、ヒト癌に関連する遺伝子突然変異で最も高頻度のものであると言われている[例えば、Weinberg et al.(1991)Science 254:1138-1146参照]。正常もしくは野生型p53遺伝子は、損傷を受けた場合に細胞形質転換を指向する細胞増殖の陰性調節因子である。p53発現産生物は核で認められ、そこでは他の遺伝子産生物と同時にあるいは共動的に作用し得る。p53が欠失した腫瘍細胞系を野生型p53ベクターで治療することで、腫瘍形成性を低下させることに成功している[Baker et al.(1990)Science 249:912-915参照]。
嚢胞性繊維症[CF]は、気道、汗腺、膵臓その他の臓器の上皮組織に発症する常染色体劣性疾患である。それは、塩素イオン輸送における欠陥と関連する致死性遺伝病であり、各種真核細胞における塩素伝導性の発現と関連していた1480アミノ酸の蛋白である嚢胞性繊維症膜貫通伝導性調節蛋白質[CFTR]をコードする遺伝子における突然変異が原因で生じる。CFTRにおける欠陥によって、気道、汗腺、膵臓その他の組織における上皮細胞が、cAMP介在作働薬に反応して塩素イオンを輸送する能力を破壊もしくは低下させ、cAMP依存性蛋白キナーゼA[PKA]による頂端膜チャンネルの活性化を障害する。この疾患の発生率が高いことおよび破壊的性質を考慮すると、有効なCF治療の開発が急務である。
人工染色体は、例えば、疾患抵抗性、苛酷な環境条件に対する抵抗性、異なった成長パターンおよび物理的特徴向上などのある種の所望の形質を有する鳥および魚ならびに哺乳動物のような脊椎動物および無脊椎動物を含む動物を得るのに、理想的に適している。
大きいDNA断片を各人工染色体に組み込むことができることから、その染色体は、ゲノムDNAライブラリの取得において全ゲノムを有することができるクローニング媒体として用いるのに適しており、スクリーニングを容易に行うことができる。例えはMACを用いて、各種生物から機能性動原体DNAを確認および単離するのに有用なゲノムDNAライブラリを得ることができる。そのような利用分野では、特定生物からゲノムDNAライブラリを得るのに使用されるMACは、その生物の細胞中では機能性ではないものである。すなわちそのMACは、その生物の細胞におけるMAC内にある遺伝子を安定に複製せす、分離せず、その発現を行わない。好ましくはMACには、生物の細胞中の指標遺伝子の転写を促進することができるプロモーターに連結した指標遺伝子(例えば、β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子またはネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える産生物をコードする遺伝子など)を持たせる。生物からのゲノムDNAの断片をMACに組み込み、MACを生物からの細胞に転移させる。ゲノムDNA断片内に含まれる機能性動原体を組み込んだMACを有する細胞は、マーカー遺伝子発現を検出することで確認される。
本発明で提供されるMACおよび/または他の人工染色体は、蛋白の製造、特には生化学的経路もしくは多価ワクチンに関与する複数蛋白などの1つの細胞系からのいくつかの蛋白の製造に使用され、有効である。蛋白をコードする遺伝子を人工染色体に導入し、次にそれを細胞に導入する。別法として、対象の異種遺伝子を、その遺伝子が人工染色体に向かうような形で、すでに人工染色体を有する生産細胞系に転移させる。異種蛋白が発現される条件下で細胞を培養する。蛋白は安定で永久的なゲノム外染色体系において高レベルで発現されることから、選択的条件は必要ない。
一般に、縦列反復DNAの組立により、相補的オリゴの明瞭なアニーリングなどの問題が生じる。例えば、別個にアニーリングされた生成物を、逆の配向で連結することができる。さらに、縦列もしくは反転した反復単位は、その配列を乱し得る組み換えおよび欠失事象を特に受けやすい。縦列反復DNA単位の配列合成のクローニング段階で使用する適切な宿主生物(例:rec株)の選択は、そのような事象の減少および排除に役立ち得るものである。
原料として2個のオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチド1は、長さkの反復配列のものであり(隣接部分とは無関係)、適切に選択された制限部位に隣接している比較的短い長さ(60〜90ヌクレオチド)の反復単位を有する。
5’-S1>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>S2 -3’
ここで、S1はE1[好ましくは3’−突出(例:PacI,PstI,SphI,NsiIなど)または平滑末端を形成する酵素]によって開裂する制限部位1であり;S2はE2(好ましくは、3’−突出を形成する酵素またはTspRIなどの認識部位外で開裂するもの]によって開裂する第2の制限部位であり;>は簡単な反復単位を表し、「 」は下記のオリゴヌクレオチド2に相補的な配列に隣接する短い(8〜10)ヌクレオチドを示す。
ここで、S3は酵素E3についての第3の制限部位であり、構築時に使用されるベクターに存在する部位である。
PacI:TTAAT/TAA--(クレノウ/dNTP)TAA--
PstI:CTGCA/G--(クレノウ/dNTP)G--
NsiI: ATGCA/T--(クレノウ/dNTP)T--
KpnI: GGTAC/C--(クレノウ/dNTP)C--
1個のAを残す公知の制限酵素はないが、この問題は、以下のように全く残さない酵素によって解決できる。
TaiI: ACGT/(クレノウ/dNTP)--
NlaIII: CATG/(クレノウ/dNTP)--
さらに、クレノウに代えてヤエナリヌタレアーゼを用いた場合、次のようになる。
Xbal: T/CTAGAヤエナリヌクレアーゼ A--
さらに、認識配列外で切断する多くの制限酵素があり、その場合には全く制限はない。
TspRI NNCAGTGNN/--(クレノウ/dNTP)--
BsmI GAATG CN/--(クレノウ/dNTP)--
CTTAC/GN--(クレノウ/dNTP)--
オリゴヌクレオチド1および2を、重複の長さに応じて選択した温度でアニーリングする(代表的には、30〜65℃の範囲)。
アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、dNTPの存在下にクレノウポリメラーゼで充填して、二本鎖(ds)配列を得る。
5'-S1>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>S2 -S3-3'
3'-S1<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<S2 - S3-5'
二本鎖DNAを、制限酵素E1およびE3で開裂し、次に同じ酵素E1およびE3で開裂させてあったベクター(例pUC19または酵母ベクター)に連結させた。連結生成物を用いて、使用するベクターに適合する適正な宿主細胞を形質転換し(例:pUC19を用いる場合、大腸菌DH5αなどの細菌細胞が好適な宿主である)、次にそれを選択平板で平板培養する。組換え体は、色(例えば、β−ガラクトシダーゼ発現の場合はXga1染色によって)または32P標識オリゴヌクレオチド2を用いるコロニーハイブリダイゼーション(オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによる検出が好ましい。その理由としては、それの配列はその後の各延長段階で除去され、反復配列の延長が奏功したDNAを含む組み換え体のみに存在するからである)によって確認することができる。
k個のヌクレオチドの反復配列を有する組換えプラスミドの少量サンプルを、制限酵素E1およびE3で消化させ、挿入物をゲルで単離する(挿入物が短い時はポリアクリルアミドであるが、その後の段階での比較的長い挿入物の単離ではアガロースを用いることができる)。組換えプラスミドの第2の少量サンプルを酵素E2(クレノウおよびdNTPで処理して、3’−突出を除去)およびE3で切断し、大きい断片(プラスミドDNAと挿入物)を単離する。
2個のDNA(S1〜S3挿入物断片とベクター+挿入物)を連結し、選択的平板で平板培養し、段階3のように延長組み換え体についてスクリーニングを行う。ここで、制限部位間の反復配列の長さは、前の段階における反復配列の2倍、すなわち2×kである。
段階4および段階5を必要な回数繰り返して、所望の反復配列サイズを得る。
以下の材料および方法は、下記の実施例で使用され、人工染色体を含む細胞系を得るのに使用することができる方法の例である。当業者に公知である他の好適な材料および方法を使用することも可能である。当業者に公知のこれら材料および方法に対する変更も行うことができる。
1.チャイニーズハムスターK−20細胞およびマウスA9線維芽細胞をF−12培地で培養した。EC3/7[米国特許5288625号参照、受託番号90051001下にEuropean Collection of Animal Cell Culture(ECACC)に寄託;さらに、Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8106-8110および米国特許出願08/375271号も参照]およびEC3/7C5[米国特許5288625号およびPraznovszky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:11042-11046参照]マウス細胞系ならびにKE1−2/4ハイブリッド細胞系を、400μg/mLのG418を含むF−12培地[SIGMA,St.Louis,MO]で維持した。
マウスおよびハムスターの細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合した[Davidson et al.(1976)Som.Cell.Genet.2:165-176]。400μg/mLのハイグロマイシンBを含むHAT培地中で、ハイブリッド細胞を選別した。
EC3/7C5細胞から受容体細胞への人工染色体の微小核体介在転移を、グッドフェローら[Goodfellow et al.(1989)Techniques for mammalian genome transfer,Genome Analysis a Practical Approach,K.E.Davies,ed.,IRL Press,Oxford,Washington DC.pp.1-17]およびヤマダら[Yamada et al.(1990)Oncogene 5:1141-1147]の変法を用い、サキソンらの方法に従って[Saxon et al.(1985)Mol.Cell.Biol.1:140-146]行った。すなわち、T25フラスコ中の5×106個のEC3/7C5細胞を、最初に0.05μg/mLのコルセミドで48時間、次に10μg/mLのサイトカラシンBで30分間処理した。T25フラスコを端で遠心し、ペレット化した微小核体を血清を含まないDME培地中に懸濁させた。最初に5ミクロン、次に3ミクロンのポリカーボネートフィルターによって微小核体を篩い、50μg/mLのフィトヘマグルチニンで処理し、受容体細胞とのポリエチレングリコール介在融合に用いた。MMCneoを含む細胞の選別を、400〜800μg/mLのG418を含む培地中で、融合から48時間後に開始した。
染色体のトリプシンG分染を、ワンらの方法(Wang & Fedoroff(1972)Nature 235:52-54]を用いて行い、BSGによる構成異質染色質の検出を行った。C分染法をサムナーの方法(Sumner(1972)Exp.Cell Res.75:304-306)に従って実施した。ブロモデオキシウリジン[BrdU]組み込みによる染色体複製の検出には、ペリーらの(Perry & Wolff(1974)Nature 251:156-158)フルオレセイン−ギムザ[FPG]染色法を用いた。
ヒト抗動原体血清LU851[Hadlaczky et al.(1986)Exp.Cell.Res.167:1-15]による間接免疫蛍光標識および同じ試料に対する間接免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションを、既報の方法に従って行った[Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110参照;さらに、米国特許出願08/375271号も参照]。マウスA9染色体の処理に関して2M塩酸を37℃で25分間行い、ハイブリッド細胞の染色体に関して、1M塩酸を37℃で30分間用いた以外は、メーカー推奨の手順に従って、フルオレセイン標識抗BrdUモノクローナル抗体[Boehringer]による免疫標識を行った。
オスミウム含浸を用いた走査型電子顕微鏡検査のための有糸分裂染色体製造を、既報の方法に従って行った[Sumner(1991)Chromosoma 100:410-418]。その染色体を、加速電圧25kVで動作する日立S−800電界放出走査型電子顕微鏡で観察した。
1.一般的方法
DNA操作はいずれも、標準的方法によって行った[例えば、Sambrook et al.(1989)Molecular cloning:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY参照]。マウスの主要付随体プローブを、ラトナー博士の方法によって得た[Dr.J.B.Rattner,University of Calgary,Alberta,Canada]。カルガリー大学のラトナー博士から、マウスの主要付随体プローブなどのクローニングしたマウス付随DNAプローブ[Wong et al.(1988)Nucl.Acids Res. 16:11645-11661参照]の提供を受けた。完全ハムスターゲノムDNAを用いてハムスター染色体の着色を行い、2番染色体の動原体領域に固有のクローニング反復配列[Fatyol et al.](1994)Nucl.Acids Res.22:3728-3736]も用いた。マウス染色体の着色を、マウス真正染色質に固有のクローニングした長い分散反復配列[pMCP1.51]を用いて行った。
プロマイシン耐性遺伝子およびクローン化2.5kbヒト末端小粒配列[配列番号3]を、pBabe−puroレトロウイルスベクターから構築した[Morgenstern et al.(1990) Nucl. Acids Res. 18: 3587-3596: Dr. L. Szekely (Microbiology and Tumorbiology Center,Karolinska Institutet,Stockholm)によって提供;さらに、Tonghua et al.(1995)Chin.Med.J.(Beijing,Engl.Ed.)108:653-659;Couto et al.(1994)Infect.Immun.62:2375-2378;Dunckley et al.(1992)FEBS Lett.296:128-34;French et al.(1995)Anal.Biochem.228:354-355;Liu et al.(1995)Blood 85:1095-1103;国際PCT出願WO9520044号、WO9500178号およびWO9419456号も参照]。
細胞系KE1−2/4、EC3/7C5、TF1004G19C5、19C5×Ha4、G3D5およびH1D3を、ブダペスト条約に従って、ECACC(European Collection of Animal Cell Culture)に、それぞれ受託番号9604924、9604925、9604926、9604927、9604928および9604929下に寄託した。これらの細胞系の寄託は1996年4月9日に行った(European Collection of Animal Cell Culture(ECACC)Vaccine Research and Production Laboratory,Public Health Laboratory Service,Centre for ApplicedMicrobiology and Research,Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,United Kingdom)。寄託は、本願において寄託細胞系に対する正式の証明書を有し、欧州特許協定の規則28(1)(d)に従って、寄託細胞系を一般に利用可能とすることに対して無条件かつ最終的同意を与えたハドラツキー(Gyula Hadlaczky,H.6723,SZEGED,SMAMOS U.1.A.IX.36.HUNGARY)の名前で行った。
EC3/7細胞系は、neo−動原体を有するLMTK-マウス細胞系である。EC3/7C5細胞系は、neo−ミニ染色体を有するEC3/7の単一細胞サブクローンである。
米国特許5288625号[さらに、Praznovszky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88: 11042-11046およびHadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110も参照]に記載の方法に従って、ヒトおよび細菌のDNAを有するλ構築物[λCM8およびλgtWESneo]の共組み込み後に、デノボ動原体形成を、形質転換マウスLMTK-線維芽細胞系[EC3/7]で行う。
neo−ミニ染色体を有するEC3/7C5細胞を、高濃度のG418[致死用量の40倍]でのEC3/7細胞系の350世代にわたるサブクローニングによって得た。2つの単一細胞由来の安定な細胞系[EC3/7C5およびEC3/7C6]を得た。これらの細胞系は、ミニ染色体上にneo−動原体を有し、二動原体染色体の残りの断片も有する。抗動原体抗体による間接免疫蛍光およびその後のin situハイブリダイゼーション実験から、ミニ染色体が二動原体染色体由来であることが示された。EC3/7C5およびEC3/7C6細胞系(それぞれ、140個および128個の中期)において、無傷の二動原体染色体は認められず、それぞれ細胞の97.2%および98.1%でミニ染色体が検出された。これらのミニ染色体は、150細胞世代にわたって維持したものである。これらは、元二動原体染色体の残りの部分を有する。
EC3/7C5細胞の有糸分裂染色体を、グリシンーヘキシレングリコール緩衝液系[Hadlaczky et al.,(1982)Chromosoma 86: 643-659]を用いて、ハドラツキーら(Hadlaczky et al.,(1981)Chromosoma 81:537-555]記載の方法に従って単離した。染色体懸濁液を1200×gで30分間遠心した。ミニ染色体を含む上清を5000×gで30分間遠心し、ペレットを適切な緩衝液に再懸濁させた。部分的に精製したミニ染色体を−20℃で50%グリセリン中にて保存した。
284日にわたって非選択培地中で成長させ、次に400μg/mLのG418を含む選択培地に転移させたEC3/7C5細胞は、G418の存在下に永久的に培養された対照細胞と比較して、96%平板培養効率[コロニー形成]を示した。細胞形成分析では、選択および非選択培養条件下では、MMCneoが細胞当たり1個のコピーで安定に維持されることが示された。分析した2270個の分裂中期で、2個のMMCneoを有する分裂中期は2個のみ認められた。
A.ミニ染色体転移
neo−ミニ染色体[MMCneoと称する、図2C]は、ハムスターおよびヒトなどの異なる哺乳動物細胞とミニ染色体を有する細胞[EC3/7C5またはEC3/7C6]との融合による遺伝子転移に使用されている。37個の安定なハイブリッド細胞系が得られている。得られたハイブリッド細胞系はいずれも、「染色体着色」用のビオチン化ヒトおよびハムスターのゲノムまたはpMCPE1.51マウス長分散反復DNAプローブを用いるin situハイブリダイゼーションによって明らかなように、真正のハイブリッドであることがわかっている。MMCneoはさらに、EC3/7C5細胞由来の微小核体の融合によってマウスA9、L929および多分化能F9テラトカルシノーマに転移させて奏功している。転移は、PCR、サザンブロッティングおよびミニ染色体特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーションによって確認した。細胞形成分析から、微小核体融合について予想されるように、わずかな細胞[1〜5%]がMMCneoを受けた(または保持した)ことが確認された。
EC3/7およびチャイニーズハムスター卵巣細胞[図2]によって得られたハイブリッド細胞系KE1−2/4では、二動原体染色体からのneo−動原体の分離は、さらなる増幅プロセスと関連していた。この増幅によって、平均的な大きさの安定な染色体が形成された[すなわち、λneo染色体;Praznovszky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:11042-11046参照]。λneo染色体は、末端に位置する機能性動原体を有し、λ、ヒト、細菌およびマウスのDNA配列の複数コピーを有する7個の大きいアンプリコンから構成されている[図2参照]。これらのアンプリコンは、アンプリコン間の構成異質染色質の狭いバンドを形成するマウスの主要な付随DNA[Praznovszky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:11042-11046]によって分離される。
上記の実施例に記載の所見は、マウス7番染色体の動原体領域が大量増幅能力を有することを示している[他の結果は、この能力が7番染色体に固有のものではないことを示している]。この結論は、元二動原体7番染色体とneo−ミニ染色体を有するEC3/7C5に第2の優性選択可能マーカー遺伝子および非選択マーカー遺伝子を導入した共トランスフェクション実験からの結果によってさらに裏付けられる。EC3/7C5細胞系を、λファージDNA、ハイグロマイシン耐性遺伝子構築物[pH132]およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子構築物[pCH110]で形質転換した。安定な形質転換体を、高濃度[400μg/mL]ハイグロマイシンBの存在下に選別し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。取り込まれた外来DNAの複数コピーを示す得られた形質転換細胞系について、in situハイブリダイゼーションによって調べて、取り込み部位の位置を決定し、LacZ染色によってβ−ガラクトシダーゼ発現を検出した。
1.pH132の構築
pH132プラスミドは、β−アクチンプロモーターの制御下に、ハイグロマイシンB耐性遺伝子および抗HIV−1gagリボザイム[リボザイムの配列に相当するDNA配列については配列番号6参照]を有する。このプラスミドは、pHygプラスミド[Sugden et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:410-413;リッグ博士(Dr.A.D.Riggs,Beckman Research Institute,Duarte)から提供;例えば米国特許4997764号参照]およびpPC−RAG12プラスミド[Chang et al.(1990)Clin Biotech 2:23-31;ロッシ博士(Dr.J.J.Rossi,Beckman Research Institute,Duarte)から提供;抗HIVgagリボザイムならびにβ−アクチンプロモーターとSV40後期遺伝子転写終止およびポリAの信号に連結したリボザイム挿入物を有する哺乳動物発現ベクターの構築について記載している米国特許5272262号、5149796号および5144019号も参照]から構築した。BamHIリンカーが隣接しているリボザイム挿入物の挿入が関与するpPC−RAG12の構築を、BamHI消化pHβ−Apr−1gptに行った[Gunning et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:4831-4835参照、米国特許5144019号も参照]。
染色体のトリプシンG分染を、実施例1に記載の方法に従って実施した。
以下に記載のTF1004G19およびTF1004G−19C5マウス細胞と19C5×Ha4ハイブリッドならびにそれの亜細胞系を、400μg/mLのハイグロマイシンB[Calbiochem]を含むF−12培地で培養した。
プラスミド[ファルマシアから入手可能なpH132、pCH110;Hall et al.(1983)J.Mol.Appl.Gen.2:101-109も参照]およびλDNA[λcl875Sam7(New England Biolabs)とEC3/7C5との共トランスフェクションを、5×106個の受容体細胞当たりプラスミドDNA2〜5μgおよびλファージDNA20μgを用いて、リン酸カルシウムDNA沈殿法[例えば、Chen et al.(1987)Mol.Cell.Biol.7:2745-2752参照]によって行った。
TF1004G19と称される形質転換体の一つの分析から、それがかなりのコピー数の組み込みpH132配列およびpCH110配列を有し、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現を有していることが明らかになった。G分染およびヒトプローブ[CM8;例えば、米国特許出願08/375271号参照]を用いたin situハイブリダイゼーションによって予想外に、EC3/7C5細胞系の元二動原体7番染色体で組み込みが起こったことが明らかになった。さらにこの染色体は、新たに形成された異質染色質染色体腕を有していた。この異質染色質腕の大きさは、個々の分裂中期で約150〜約800Mbの範囲であった。
TF1004G−19C5細胞系におけるλファージおよびpH132DNAによるin situハイブリダイゼーションにより、ミニ染色体上ならびに「ソーセージ」染色体の異質染色質腕上のみでの陽性のハイブリダイゼーションが明らかになった[図2D]。「ソーセージ」染色体[以下、SCとも称する]がEC3/7C5細胞系の元二動原体染色体(FD)から形成されたように思われる。
マウス動原体配列が「ソーセージ」染色体を形成する増幅プロセスに関与していたか否かならびにアンプリコンが不活性動原体を有するか否かを決定するため、マウスの少量付随DNAを用いてin situハイブリダイゼーションを行った。マウスの少量付随DNAは特に、全てのマウス染色体の動原体付近に局在している。ソーセージ染色体を含む全ての動原体で陽性のハイブリダイゼーションが検出されたが、それは異質染色質腕の開始時に陽性の信号を示すのみであった。
1.高レベル異種遺伝子の発現
そうしてTF1004G−19C5細胞系は、ソーセージ染色体の異質染色質腕にのみ局在するハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の複数コピーを有する。TF1004G−19C5細胞は、200μg/mLのハイグロマイシンBの存在下で、あるいは400μg/mLの場合でさえ、非常に良好に成長することができる[発現レベルは、ハイグロマイシン耐性遺伝子および単一コピー遺伝子の小断片によるノーザンハイブリダイゼーションによって求めた。]。
ソーセージ染色体の構成異質染色質に局在する遺伝子が、TF1004G−19C5形質転換体[すなわち、β−gal発現]のハイグロマイシン耐性およびLacZ染色能力を提供することを示すため、TF1004G−19C5マウス細胞とチャイニーズハムスター卵巣細胞との間のPEG誘発細胞融合を行った。ハイブリッドを選別し、G418[400μg/mL]およびハイグロマイシン[200μg/mL]を含むHAT培地で維持した。19C5×Ha3および19C5×Ha4と称される2個のハイブリッドクローン(これらは受託番号96040927下にECACCに寄託してある)を選別した。そのいずれも、ソーセージ染色体とミニ染色体を有している。
実施例4で説明した通りに、ソーセージ染色体を細胞融合によってチャイニーズハムスター細胞に転移させた。ハイグロマイシンB/HATおよびG418選別を用いて、ソーセージ染色体を有する2つのハイブリッドクローン19C5×Ha3および19C5×Ha4を得た。ハムスターおよびマウス染色体着色プローブおよびハムスター2番染色体特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーションにより、19C5×Ha4が完全なチャイニーズハムスターゲノムと一部のマウスゲノムを有することが確認された。27個の19C5×Ha4コロニーを維持し、個々のサブクローンとして分析した。27個のサブクローン中26個が形態的に未変化のソーセージ染色体を有していた。
A.メガ染色体を有する細胞系の形成
すべての19C5×Ha4サブクローンは完全なハムスターゲノムを保持したが、異なるサブクローンは異なった数のマウス染色体を示したことから、マウス染色体の優先的脱離が示された。実施例4に記載のように、マウス染色体のさらなる脱離を促進するためには、ハイブリッド細胞をBrdUで処理し、G418(G)もしくはハイグロマイシン(H)選択条件下に培養し、次に10-4MのBrdUで16時間の再処理を行い、単一細胞サブクローンを得た。BrdU処理がゲノムを不安定化させて、同様にソーセージ染色体における変化を引き起こしたように思われた。さらに増幅を行った細胞群で、徐々に増加するのが認められた。ソーセージ染色体の約150〜250Mb異質染色質染色体腕が形成され、それはマウス7番染色体のものとは異なっていた。別の真正染色質終端部分を獲得することで、新たな次中部動原体染色体(メガ染色体)が形成された。79個の個々のサブクローンを、単一細胞クローニングによって、これらのBrdU処理培地から得た。42個のサブクローンが無傷のメガ染色体を有し、5個のサブクローンがソーセージ染色体を有し、32個のサブクローンで、メガ染色体の断片もしくは転位部分が認められた。メガ染色体を有する26個のサブクローンを、2ケ月間にわたって、非選択条件下で培養した。26個のサブクローン中19個で、メガ染色体が保持された。メガ染色体を失ったサブクローンはいずれも、ハイグロマイシンBに感受性となり、β−ガラクトシダーゼ発現がなく、両方のマーカーがメガ染色体に連結していることを示していた。
以下の結果は、真正染色質終端部分、組み込み外来DNA(および例示の実施態様の場合にはrDNA配列)は別として、メガ染色体全体が構成異質染色質であり、40ブロック[約7.5Mb]以上のマウス主要付随DNA[図2および3参照]の縦列配置を有する。4つの付随DNAブロックは、各末端に組み込み外来DNA配列を有する巨大な回文構造[アンプリコン]に構成されている。次中部動原体染色メガ染色体の長腕および短腕はそれぞれ、6個のアンプリコンおよび4個のアンプリコンを有する。当然のことながら、各成分の固有の構成および大きさは生物および増幅事象が開始する染色体によって異なり得るものである。
終端領域および組み込み外来DNAを除き、メガ染色体は主として、異質染色質から構成される。これはメガ染色体のC分染法によって明らかになっており、構成異質染色質の染色特性が陽性となっている。終端領域および組み込み外来DNAは別として、メガ染色体全体は異質染色性であるように思われる。マウス主要付随DNAはマウス染色体の挟動原体構成異質染色質の主要成分であり、総DNAの約10%である[Waring et al.(1966)Science 154:791-794]。in situハイブリタイゼーションにマウス主要付随DNAプローブを用いると、終端領域を除いて、メガ染色体全体に強力なハイブリダイゼーションが認められた。そのハイブリダイゼーションは、分割パターンを示した。4つの大きいブロックが短腕に現れ、通常は4〜7ブロックが長腕に認められた。これらの部分を、約15Mbの主要付随DNAを有する正常マウス染色体の挟動原体領域と比較することで、メガ染色体上の主要付随DNAのブロックの大きさが、約30Mbであると推定された。
マウス細胞を単一S期の間、BrdUの存在下に成長させた場合、マウス主要付随体のDNAの2個の鎖の間でチミジン含有量に非対称性があることから、構成異質染色質はFPG染色後に側面非対称を示す。さらに、19C5×Ha4ハイブリッドでは、マウス線維芽細胞のチミジン−キナーゼ[Tk]欠乏が、ハムスターTk遺伝子によって補完されて、BrdU組み込み実験が可能であった。
メガ染色体の異質染色質腕の均一な構成が、高分解能走査型電子顕微鏡観察によって確認された。ヘキスト33258で処理したメガ染色体の延長腕およびマウス染色体の挟動原体異質染色質領域は同様の構造を示した。構成異質染色質領域は、真正染色質部分よりコンパクトであるように見えた。終端領域は別として、メガ染色体の両方の腕は完全に延長され、かすかな窪みを示しており、それは非増幅染色体とメガ染色体における付随DNAブロックの境界に相当するはずである。ヘキスト処理を行わない場合、その溝はメガ染色体腕におけるアンプリコン境界に相当するように思われた。さらに動原体は、周囲の異質染色質よりコンパクトで細かい繊維状外観を示していた。
異種DNAの組み込み部位の領域におけるメガ染色体の配列を、クローニング法を用いたその領域の単離および得られたクローンの配列分析によって調べた。
本明細書に記載の方法(実施例10参照)に従った蛍光活性化細胞選別法を用いて、メガ染色体を1B3細胞(反復BrdU処理とH1×HE41細胞(図4参照)の単一細胞クローニングによって得られ、切断メガ染色体を有するもの)から単離した。内因性染色体からのSATAC(メガ染色体)の分離後、単離したメガ染色体をGH緩衝液(100mMグリシン、1%へキシレングリコール、飽和水酸化カルシウム溶液でpH8.4〜8.6に調節したもの;実施例10参照)に保存し、0.5M EDTA中のアガロース床に遠心して入れた。
クローン30、113、157および161からの挿入DNAを精製し、標識し、いくつかの細胞系のin situハイブリダイゼーション試験におけるプローブとして使用した。ヨウ化プロピジウムを用いた細胞の対比染色によって、ハイブリダイゼーションの細胞部位を確認しやすくした。細胞中で検出された信号の位置を、以下の表にまとめてある。
マウス脾臓組織、マウスLMTK-細胞、K20チャイニーズハムスター卵巣細胞、EJ30ヒト線維芽細胞およびH1D3細胞からDNAを単離した。単離したDNAとラムダファージDNAについて、メガ染色体クローンNo.30、113、157および161から単離した挿入物をプローブとして用いるサザンブロッティングハイブリダイゼーションを行った。プラスミドpWE15を陰性対照プローブとして用いた。4つのメガ染色体クローン挿入物のそれぞれを、ラムダファージDNAを除くDNAサンプル全てに、多コピー法でハイブリダイゼーションした(ハイブリダイゼーションの強度およびハイブリダイゼーションバンド数によって示される)。プラスミドpWE15はラムダDNAのみにハイブリダイゼーションした。
メガ染色体クローンNo.161は、in situ実験およびサザンハイブリダイゼーション実験で最強のハイブリダイゼーションを示すように思われ、挿入配列の分析に選択した。配列分析は、最初にコスミドクローンNo.161のサブクローニングを行って、次のような5個のサブクローンを得ることで行った。
増幅制御要素順プライマー(1〜30)
増幅制御要素逆プライマー(2142〜2111)
複製領域順プライマーの起源(2116〜2141)
複製領域逆プライマーの起源(5546〜5521)
図2に、マウスLMTK-細胞系における二動原体染色体の形成から始まる安定なメガ染色体の形成に至る事象を示してある。(A)λCM8およびλgtWESneoによるLMTK-細胞のトランスフェクション後のマウス7番染色体の動原体領域での1回のE型増幅により組み込み外来DNAに連結したneo−動原体を得て、二動原体染色体を形成する。複数回のE型増幅によってλneo染色体を形成する。それは7番染色体由来のものであり、マウスーハムスターハイブリッド細胞系で安定化したものである。(B)二動原体7番染色体の動原体間の特異的切断により、neo−動原体を有する染色体断片と、末端に外来DNAの痕跡を有する7番染色体とを形成する。(C)neo−動原体を有する断片の反転複製により、安定なneo−ミニ染色体を形成する。(D)元二動原体7番染色体の外来DNA領域への外因性DNAの組み込みによってH型増幅を行い、異質染色質腕を形成する。真正染色質終端部分を捕捉することで、この新たな染色体腕を「ソーセージ」染色体の形で安定化させる。(E)BrdU処理および/または薬剤選別によってさらにH型増幅が誘発され、それによって不安定なギガ染色体が形成されるように見える。(F)繰り返しBrdU処理および/または薬剤選別により、動原体複製を含むさらなるH型増幅を誘発し、それによって別の異質染色質染色体腕を形成する。染色体切断によって、それを7番染色体から切り離し、終端部分を獲得させて、安定なメガ染色体を形成する。
メガ染色体またはそれの誘導体を有する細胞系での異種遺伝子(すなわち、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子)発現のレベルを量的に測定した。異種遺伝子のコピー数間の関係およびそれから発現される蛋白のレベルも測定した。
a.細胞系
上記のような250〜400Mbのメガ染色体を有するH1D3細胞と50〜60Mbのミクロメガ染色体を有するmM2C1細胞の異種遺伝子発現レベルを量的に評価した。H1×He41細胞系(メガ染色体ならびにCD4およびneo遺伝子を有する単一のヒト染色体を有するマウス−ハムスター−ヒトハイブリッド細胞系;図4参照)の再度のBrdU処理および単一細胞クローニングによって、mM2C1細胞を形成した。F12培地中で、選択条件(120μg/mLハイグロマイシン)もしくは非選択条件下に、その細胞系を成長させた。
mM2C1もしくはH1D3細胞培養物の単層を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。細胞をゴム製ポリスマンで掻き取り、懸濁させて、再度PBSで洗浄した。洗浄した細胞を0.25Mトリス−HCl(pH7.8)に再憑濁させ、液体窒素中での冷凍および37℃での解凍を3サイクル行って破壊した。抽出液を4℃にて12000rpmで5分間遠心することで透明とした。
β−ガラクトシダーゼアッセイ混合物は、1mMのMgCl2、45mMのβ−メルカプトエタノール、0.8mg/mLのo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドおよび66mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)を含んでいた。反応混合物を細胞抽出物とともに時間を長<して37℃でインキュベーションした後、3倍容量の1M Na2CO3を加えることで反応を停止し、420nmで光学密度を測定した。細胞抽出物を加えずにインキュベーションしたアッセイ混合物を対照として用いた。反応の直線範囲を測定したところ、0.1〜0.80D420であった。β−ガラクトシダーゼ活性1単位を、37℃で1分間に3nmolのo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドを加水分解する酵素量と定義する。
細胞を上記のように洗浄し、20mMのヘペス(Hepes)緩衝液(pH7.3)、100mMの酢酸カリウム、5mMの酢酸マグネシウムおよび2mMのジチオトレイトールに再懸濁させた。微小先端プローブを用い、MSE超音波破砕機中0℃で10秒間印加を6回行うことで、細胞を破壊した。各超音波印加後1分間、細胞を放冷した。抽出物を微量遠心管中、2000rpmで1分間遠心することで透明とした。
ホスホセルロース紙結合アッセイ(Haas and Dowding(1975),Meth.Enzmol.43:611-628に記載のもの)によって、酵素活性を測定した。細胞抽出物に、0.1Mの塩化アンモニウムおよび1mMのアデノシン−γ−32P−トリホスフェート(比放射能:300Ci/mmol)を補給した。0.1mg/mLのハイグロマイシンを加えて反応開始し、長い時間にわたって37℃でインキュベーションした。水浴で75℃にて5分間サンプルを加熱することで反応停止し、沈殿した蛋白を微量遠心管中で5分間遠心することで除去した後、上清の少量サンプルをワットマン(Whatman)P−81ホスホセルロース紙(2cm2)にスポットとしてしみ込ませた。室温で30秒後、紙を高温(75℃)蒸留水500mLに3分間入れた。この条件下で放射性ATPが溶液中に残っている間、ハイグロマイシンホスフェートはホスホセルロースに強力かつ定量的に結合している。紙を蒸留水500mL中で3回すすぎ、ベックマン(Beckman)液体シンチレーションカウンタで、トルエンシンチレーションカクテル中にて、結合している放射能を測定した。ハイグロマイシンを加えずにインキュベーションした反応混合物を対照とした。
細胞のSDS溶解とそれに続くプロテイナーゼK処理およびフェノール/クロロホルム抽出が関与する標準的な精製プロトコールを用いて、DNAをH1D3およびmM2C1細胞から得た。単離DNAを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させ、アガロースゲルで分別し、ナイロンフィルターに吸い取らせ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子もしくはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子由来の放射性プローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションのレベルを定量した(Molecular Dynamics Phosphorlmage Analyzerにて)。異なった細胞系から負荷したDNAの総量を補正するため、フィルターを単一コピー遺伝子で再プロービングし、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を単一コピー遺伝子ハイブリダイゼーションに対して正規化した。
細胞抽出物の総蛋白量を、標準としてウシ血清アルブミンを用いるブラッドフォード比色分析によって測定した。
量的条件を確立するため、β−ガラクトシダーゼおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の最も重要な動力学的パラメータについて調べた。この比色分析で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性は、nM2C1およびH1D3細胞系の両方について、0.1〜0.8OD420の範囲で線形であった。β−ガラクトシダーゼ活性は、いずれの細胞系においても、総蛋白濃度範囲5〜100μg以内で反応混合物に加えた蛋白量にも比例していた。nM2C1およびH1D3細胞系のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼについて記載の条件下での反応時間または加えた細胞抽出物の総量にも比例していた。
対数増殖期mM2C1およびH1D3細胞系から得られた細胞抽出物についてβ−ガラクトシダーゼ活性を調べ、10回の独立の実験で比活性を比較した。H1D3細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性は、440±25U/mg総蛋白であった。同じ条件下で、mM2C1細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性は1/4.8であり、92±13U/mg総蛋白であった。
細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、H1D3またはmM2C1細胞系に膜結合型で存在する。これは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を、これら細胞抽出物の高速遠心によって完全に取り除くことができ、その酵素活性は高速ペレットを再懸濁することで回復できるという所見によるものである。
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現レベルを、30世代にわたって非選択条件下で成長させたH1D3およびmM2C1細胞系における比酵素活性定量に基づいて測定した。培地にハイグロマイシンがないことは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現に影響しなかった。
前述のように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、メガ染色体、すなわちH1D3およびmM2C1細胞におけるミクロメガ染色体内のみにある。H1D3およびmM2C1細胞系から単離したDNAのゲノムサザンブロットの定量分析(PhosphorlmageAnalyzerによる)から、メガ染色体に組込んだβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のコピー数は、mM2C1細胞の場合と比較してH1D3細胞での方が約10倍であることがわかった。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数は、mM2C1細胞の場合と比較してH1D3細胞での方が約7倍である。
異質染色質メガ染色体における細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する高等真核生物(例:H1D3細胞)のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量測定により、細胞染色法によって検出される組込み細菌遺伝子が高レベルで発現するのが認められることが確認された。遺伝子導入動物における外来遺伝子の発現についての研究の報告では、導入遺伝子発現は正確な組織および発達の特異性を示すが、発現レベルは低いのが普通であり、広範囲の位置依存性の変動性を示す(すなわち、導入遺伝子発現のレベルは、染色体組込みの部位によって決まる)ことが明らかになっている。導入遺伝子の発現が低レベルであるのは、導入遺伝子を周囲の染色質の阻害効果から絶縁し、有効な遺伝子発現に必要な活性染色質構造の形成を促進する特殊なDNA配列がないためであると仮定されている。この位置依存的変動性を無効にし得て、高等真核生物における導入遺伝子座作用性領域(LAR)配列および下等真核生物における固有の染色質構造(scs)要素の高レベル発現を保証できるいくつかのシス作用性DNA配列要素が確認されている(例えば、Eissenbergand Elgin(1991)Trends in Genet.7:335-340参照)。これらのシス作用性DNA配列がない場合、導入遺伝子発現のレベルは低く、コピー数依存性である。
1.EC3/7由来細胞系
マウス線維芽細胞系であるLMTK-由来細胞系を、λCM8およびλgtWESneoDNAでトランスフェクションして[実施例2参照]、形質転換細胞系を得た。これらの細胞系には、受託番号90051001下にECACC(European Collection of Animal Cell Culture)に寄託されたEC3/7があった[米国特許5288625号参照;Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8106-8110および米国特許出願08/375271号も参照]。
EC3/7のCHO−K20細胞との融合およびG418/HATによる選別によってハイブリッド細胞系が得られ、その中にKE1−2/4があって、それは受託番号96040924下にECACCに寄託してある。KE1−2/4は、λneo染色体を有する安定な細胞系であり[図2D参照;米国特許5288625号も参照]、E型増幅によって得られたものである。KE1−2/4は、λDNA、プロマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカー、p53および抗HIVリボザイム遺伝子などの対象遺伝子を有するベクターでトランスフェクションされている。これらのベクターは、染色体中の異種DNAによる相同組換えによってλneo染色体中に対象遺伝子を導入する。
EC3/7C5細胞系をpH132、pH110およびλDNAならびに他の構築物と共トランスフェクションしている(実施例2参照)。各種クローンおよびサブクローンが選別されている。例えば、p53をコードするDNAを有する構築物による形質転換によって、C5pMCT53と称される細胞を得た。
前述のように、プラスミド[ファルマシアから入手のpH132、pCH110;Hall et al.(1983)J.Mol.Appl.Gen.2:101-109も参照]およびλDNA[λc1875Sam7(New England Biolabs)]とのEC3/7C5細胞の共トランスフェクションによって、形質転換細胞を得た。これらの中には、neo−ミニ染色体中で抗HIVリボザイムをコードするDNAを有するTF1004G24がある。TF1004G24の再クローニングによって、多くの細胞系が得られた。その中にはNHHL24細胞系がある。この細胞系も、neo−ミニ染色体に抗HIVリボザイムを有し、高レベルのβ−galを発現する。それをCHO−K20細胞と融合させて、各種ハイブリッドを得た。
TF1004G形質転換体の再クローニングおよび選別によって、不安定なソーセージ染色体およびneo−ミニ染色体を有する、実施例4で前述した細胞系TF1004G19を得た。単一細胞クローニングによって、安定なソーセージ染色体およびneo−ミニ染色体を有するTF1004G−19C5[図4参照]細胞系を得た。TF1004G−19C5をCHO細胞と融合させて、ハイブリッドを選択条件下に成長させて、19C5×Ha4および19C5×Ha3細胞系[実施例4参照]およびその他の細胞系を得た。19C5×Ha3細胞系の再クローニングによって、ギガ染色体を有する細胞系、すなわち細胞系19C5×Ha47(図2E参照)を得た。19C5×Ha4細胞のBrdU処理および選択条件下[ネオマイシン(G)および/またはハイグロマイシン(H)]での成長によって、G3D5およびG4D6細胞系ならびに他の細胞系などのハイブリッド細胞系が得られている。G3D5はneo−ミニ染色体およびメガ染色体を有している。G4D6は、neo−ミニ染色体のみを有する。
メガ染色体の均一構造により、構成異質染色質の複製についての詳細な分析を行う特有の機会が得られる。
1.細胞系の培養
メガ染色体を有するH1D3マウス−ハムスターハイブリッド細胞[実施例4参照]を、10%ウシ胎仔血清[FCS]および400μg/mLハイグロマイシンB[Calbiochem]を含むF−12培地で培養した。G3D5ハイブリッド細胞[実施例4参照]を、10%のFCS、400μg/mLのハイグロマイシンB(Calbiochem)および400μg/mLのG418[SIGMA]を含むF−12培地で維持した。マウスA9線維芽細胞を、10%FCSを補給したF−12培地で培養した。
代表的な実験では、並行して20〜24個の半集密細胞培養物を10cmシャーレに準備した。ブロモデオキシウリジン(BrdU)(Fluka)を、NaOH1滴でアルカリ性とした蒸留水に溶かして、10-2M原液を得た。このBrdU原液10〜50μLずつを各10mL培地に加えて、BrdUの最終濃度を10〜50μMとした。細胞をBrdU存在下に30分間培養し、温完全培地で洗浄し、用時までBrdU不在下にインキュベーションした。この時点で、5μg/mLのコルヒチンをサンプル培養物に1時間ごとまたは2時間ごとに加えた。1〜2時間のコルヒチン処理後、有糸分裂細胞を「振り落とし(shake-off)」によって回収し、通常の染色体調製物を得て、免疫標識に供した。
マウスA9染色体の場合には2M塩酸を37℃で25分間使用し、ハイブリッド細胞の染色体については1M塩酸を37℃で30分間使用した以外は、メーカーの説明に従って、フルオレセイン接合抗BrdUモノクローナル抗体(Boehringer)による免疫標識を行った。ビオチン標識プローブによるin situハイブリダイゼーション、ならびに同一調製物についての間接免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションを、既報の方法に従って行った[Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8106-8110;米国特許5288625号も参照]。
観察および顕微鏡写真撮影はいずれも、顕微鏡(Vanox AHBS;Olympus)を用いて行った。写真には、フジカラー400SuperGまたはフジカラー1600SuperHG高速カラーネガを用いた。
BrdUパルス標識とそれに続く免疫標識によって、メガ染色体の複製を分析した。最初にin vivoでのDNA標識についての基本的パラメータを決定した。
染色体の挾動原体領域の構成異質染色質は後期複製性であると考えられている[例えば、Miller(1976)Chromosoma 55:165-170参照]。それとは対照的に、それらの実験から、異質染色質ブロックの複製がS期の前半で明瞭な開始部位にて開始し、S期のほぼ3/4期にわたって続くことが明らかになっている。この差は、次のようにして説明することができる。(i)通常の染色体では、付随DNA周囲にある活発に複製する真正染色質配列によって開始信号が不明瞭となることから、開始部位の正確な位置がわかりにくい。(ii)異質染色質の複製は、異質染色質複製物の大部分と他のほとんどの染色体領域がすでにその複製を完了しているかまたはそれをまだ開始していないS期の後半期にのみ明瞭に検出することができる。そこで、オートラジオグラフィーによる放射能標識前駆体の取り込みの分析などの低分解能の細胞学的方法では、隣接する真正染色質部分がもはや複製を行っていないS期の後半で、異質染色質における顕著な複製信号を検出するのみである。
実施例2〜7に記載の事象がマウス7番染色体に固有のものではないこと、ならびに人工染色体形成にEC7/3細胞系が必要条件というわけではないことを示すため、異なる初期細胞系およびDNA断片を用いて実験を繰り返した。いかなる細胞または細胞系も使用が可能であるか、あるいは使用できないことを容易に決定することができる。
5×106個の受容体細胞についてプラスミドDNA25μgを用いて、「掻き取り負荷」トランスフェクション法[Fechheimer et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:8463-8467]によって、LP11細胞系を得た。LP11細胞を、3〜15μg/mLのプロマイシン[SIGMA]を含むF−12培地で維持した。
上記の実施例に記載の大量増幅は、形質転換EC3/7細胞系やマウスの7番染色体に限定されるものではない。独立の形質転換実験で、選択可能なプロマイシン耐性遺伝子を含む構築物でpPuroTelと称されるもの[このプラスミドの記載については、実施例1.E.2参照]を用いたリン酸カルシウム沈殿法によって、LMTK-細胞をトランスフェクションして、細胞系LP11を得た。細胞系LP11は、異なった長さ[約150〜600Mb]の増幅染色体部分のある染色体を有する。LP11細胞の細胞学的分析から、増幅は、ロバートソン(Robertsonian)転座によって生成する次中部動原体染色体の長腕の挟動原体領域で起こることが示された。この染色体腕は、G分染によって1番染色体であると確認された。C分染およびマウス主要付随DNAプローブとのin situハイブリダイゼーションは、E型増幅が起こっていることを示しており、新たに形成された領域は、異なる量の異質染色質を含む真正染色質染色体部分の配置から構成されていた。増幅部分の大きさおよびCバンドパターンは不均一であった。いくつかの細胞で、これら増幅単位の数は50を超えていた。しかしながら、LP11細胞系の単一細胞サブクローンは、10〜15個の部分と一定のCバンドパターンを有する安定なマーカー染色体を有する。
1.内因性染色体からの人工染色体の単離
SATACなどの人工染色体は、好適な方法を用いて内因性染色体から分けることができ、代表的には中期染色体の単離、人工染色体と内因性染色体との識別および人工染色体と内因性染色体との分離が関与する。そのような方法には通常、(1)好ましくは1×106個程度で人工染色体を得ることができるだけの数の細胞(代表的には、約2×107個の有糸分裂細胞)を培養する段階、(2)コルヒチンなどの有糸分裂停止剤を用いて、有糸分裂の段階、好ましくは中期で、細胞の細胞周期を停止する段階、(3)特には、細胞を低張緩衝液中で膨張させることで処理して、破壊に対する細胞の感受性を高める段階、(4)放出された染色体を安定化させるための単離緩衝液の存在下に、物理的力を加えて細胞を破壊する段階、(5)遊離染色体を安定化させるための単離緩衝液の存在下で染色体を分散させる段階、(6)人工染色体と内因性染色体とを分離する段階、(7)単離した染色体を適切な緩衝液中で保存する段階(および所望に応じて輸送する段階)という基本的段階がある。例えば、成長の特性および要件が異なる各種細胞型を扱い、停止剤による有糸分裂遮断の期間を至適化して染色体収量と残屑レベルの望ましい均衡を得るための人工染色体の一般的単離方法の改良法および変法を経験的に決定することができる。
ある単離方法では、メガ染色体または切断メガ染色体を有する1B3マウス−ハムスター−ヒトハイブリッド細胞[図4参照]を、10%ウシ胎仔血清、150μg/mLハイグロマイシンBおよび400μg/mL G418を補給したF−12培地で増殖させた。メガ染色体およびミニ染色体を有するGHB42[G3D5細胞から再クローニングした細胞系]マウス−ハムスターハイブリッド細胞も、10%ウシ胎仔血清、150μg/mLハイグロマイシンBおよび400μg/mL G418を含むF−12培地で培養した。両方の細胞系の倍化時間は約24〜40時間、代表的には約32時間であった。
一般に、細胞は級数的成長で2世代にわたって培養してから、有糸分裂停止を行うのが普通である。ある特定の単離法で有糸分裂1B3およびGHB42細胞を蓄積するため、5μg/mLコルヒチンを培地に12時間加えた。得られた有糸分裂指数は60〜80%であった。有糸分裂細胞を、単層細胞での培地の慎重なピペット採取による選択的分離によって回収した。集めた(有糸分裂)細胞を平板から放出させる手段として、機械的振り落としを利用することも可能である。200×gで10分間の遠心によって、細胞を沈降させた。
1B3またはGHB42細胞から人工染色体を単離するのに使用したポリアミン法では、約107個の有糸分裂細胞を低張緩衝液(75mM KCl、0.2mMスペルミン、0.5mMスペルミジン)10mL中で室温にて10分間インキュベーションすることで、細胞を膨張させた。細胞は低張緩衝液中で膨張して、中期染色体を放出するが、細胞溶解には至らない。次に細胞を、代表的には室温で、100×gで8分間遠心した。細胞ペレットを注意深く取り出し、約107個の細胞をポリアミン緩衝液[15mMトリス−HCl、20mM NaCl、80mM KCl、2mM EDTA、0.5mM EGTA、14mM β−メルカプトエタノール、0.1%ジギトニン、0.2mMスペルミン、0.5mMスペルミジン]1mLに再懸濁させて、中期染色体を物理的に分散させた。次に、細胞懸濁液を慎重に抜き取り、それを3mLプラスチック注射器に取り付けた22G針から排出することで、染色体を放出させた。染色体濃度は、染色体約1〜3×108個/mLであった。
1B3またGHB42細胞から人工染色体を単離するのに用いたヘキシレングリコール緩衝液法では、約8×106個の有糸分裂細胞を、グリシン−ヘキシレングリコール緩衝液[100mMグリシン、1%ヘキシレングリコール、飽和水酸化カリウム溶液でpH8.4〜8.6に調節]10mLに再懸濁させ、37℃で10分間インキュベーションし、次に10分間遠心することで、核をペレット化した。上清を再度、200×gで20分間遠心して、染色体をペレットとした。染色体を単離緩衝液中に再懸濁させた(染色体1〜3×108個/mL)。
この緩衝液系は、ポリアミンおよびヘキシレングリコール緩衝液系との関連で上述したような細胞膨張法および染色体分散法のいずれにおいても使用することができる。この方法では、有糸分裂細胞を、4.8mM HEPES(pH8.0)、9.8mM MgSO4、48mM KCl、2.9mMジチオトレイトールからなる緩衝液に再懸濁させる[Van den Engh et al.(1985)Cytometry 6:92およびVan den Engh et al.(1984)Cytometry 5: 108]。
この緩衝液系は、ポリアミンおよびヘキシレングリコール緩衝液系との関連で上述したような細胞膨張法および染色体分散法のいずれにおいても使用することができる。この方法では、有糸分裂細胞を、25mMトリス−HCl(pH3.2)、750mM(1,6)−ヘキサンジオール、0.5mM CaCl2、1.0%酢酸からなる緩衝液に再懸濁させる[Stoehr et al.(1982)Histochemistr 74:57-61]。
この緩衝液系は、ポリアミンおよびヘキシレングリコール緩衝液系との関連で上述したような細胞膨張法および染色体分散法のいずれにおいても使用することができる。この方法では、有糸分裂細胞を、25mM KCl、50μg/mLヨウ化プロピジウム、0.33%トリトンX−100、333μg/mL RNaseからなる緩衝液に再懸濁させる[Cram et al.(1990)Methods in Cell Biology 33:376]。
単離後、染色体取得物を6μg/mLのヘキスト33258および200μg/mKLのクロモマイシンA3で染色した。分析の15分前に、25mMの亜硫酸ナトリウムおよび10mMのクエン酸ナトリウムを染色体懸濁液に加えた。
1B3およびGHB42細胞から得られ維持された染色体を、ポリアミンに基づくシース(sheath)緩衝液(0.5mM EGTA、2.0mM EDTA、80mM KC、70mMNaCl、15mMトリス−HCl(pH7. 2)、0.2mMスペルミンおよび0.5mMスペルミジン)に懸濁させた[Sillar and Young(1981)J.Histochem.Cytochem.29:74-78]。次に染色体を、2個のレーザが染色体を別個に励起して、大きさと塩基対組成によって染色体の二変量解析ができるようになっている二重レーザセルソーター[FACStar PlusまたはFAXStar Vantage Becton Dickinson Immunocytometry System;Coulter Electronics製造のもの(Elite ESP)およびCytomation製造のもの(MoFlo)などの他の二重レーザ選別機も使用可能である]に通した。SATACと他の染色体の塩基組成の差と結果的に生じる染料との相互作用における差、ならびに大きさの差があることから、SATACは他の染色体と分離された。
選別した染色体を遠心によってペレットとし、各種緩衝液中に懸濁させ、4℃で保存した。例えば、単離した人工染色体をGH緩衝液(100mMグリシン、1%ヘキシレングリコール(飽和水酸化カルシウム溶液でpH8.4〜8.6に調節したもの)[例えば、Hadlaczky et al.(1982)Chromosoma 86:643-659参照]中で1日間保存して、遠心によってアガロースに包埋することができる。選別された染色体を遠心してアガロース床に入れ、固形物を500mM EDTA中4℃で保存する。別の保存緩衝液には、CMB−I/ポリアミン緩衝液(17.5mMトリス−HCl(pH7.4)、1.1mM EDTA、50mM ε−アミノカプロン酸、5mMベンズアミドHCl、0.40mMスペルミン、1.0mMスペルミジン、0.25mM EGTA、40mM KCl、35mM NaCl)ならびにCMB−II/ポリアミン緩衝液(100mMグリシン(pH7.5)、78mMヘキシレングリコール、0.1mM EDTA、50mM ε−アミノカプロン酸、5mMベンズアミド−HCl、0.40mMスペルミン、1.0mMスペルミジン、0.25mM EGTA、40mM KCl、35mM NaCl)などがある。
1.純度分析
選別された染色体の純度を、ビオチン標識マウス付随DNAプローブによる蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)によって調べた[Hadlaczky et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110参照]。単離染色体の純度は約97〜99%であった。
パルスフィールドゲル電気泳動およびサザンハイブリダイゼーションを行って、選別された人工染色体のDNA含有量の大きさ分布を求めた。
これら染色体の活性が保存されているか否かを調べるため、純粋な人工染色体を、初代培養細胞、体細胞および幹細胞に微量注入し(実施例13に記載のような方法によって)、次にそれについて、選択培地での増殖に関する分析およびβ−ガラクトシダーゼ活性のアッセイなどの人工染色体が有する異種遺伝子の発現を分析する。
A.小核化
細胞を、4T150フラスコ中で、80〜90%集密度となるまで増殖させた。コルセミドを、最終濃度0.06μg/mLとなるまで加え、次に37℃で細胞と24時間インキュベーションした。
10μg/mLのサイトカラシンBを加え、得られた微小核体を28〜33℃で15000rpmにて70分間遠心した。
スイネックス(Swinnex)フィルターユニットおよびヌクレオポア(Nucleopore)フィルター[5μmおよび3μm]を用いて、微小核体を精製した。
上述のように、細胞をヘキストおよびクロモマイシンA3染料を用いて染色した。微小核体は、セルソーターによって選別し、哺乳動物人工染色体を含む微小核体を単離した。
人工染色体を含む微小核体を、例えば実施例1.A.5に記載の方法に従って、所定の初代培養細胞、体細胞、胚幹細胞に融合させて、遺伝子導入(人間以外)動物を形成して遺伝子療法に用いたり、他の細胞に融合させてその染色体を細胞に導入する。
昆虫細胞は、MAC用、特に遺伝子産生物の生産で使用するのに有用な宿主であるが、それには以下のような多くの理由がある。
2.人工染色体が大きいと、メガ塩基の大きさのDNA組み込みが可能となり、蛋白またはアルカロイド[ジギタリス、モルヒネ、タキソール]などの治療的価値のある非蛋白を生じる経路全体をコードする遺伝子を人工染色体に持たせることができる。
3.有用な蛋白をコードする遺伝子の増幅を、人工哺乳動物染色体で行って、昆虫細胞での蛋白収量を上昇させることができる。
4.昆虫細胞は、蛋白の生理機能に必須の必要な翻訳後修飾(糖付加、リン酸化)を支持する。
5.昆虫細胞は、哺乳動物ウィルスを支持せず、ヒト感染因子による生成物の交差汚染が起こらない。
6.染色体を導入する能力は、昆虫細胞系における栄養用、工業用または医療用蛋白の生産に向けた従来の組換えバキュロウィルス系より優れている。
7.昆虫細胞成長に最適な低い温度(28℃)により、生産のエネルギーコストを下げることができる。
8.昆虫細胞用の血清を含まない成長培地により、生産コストが低くなる。 9.人工染色体を含む細胞は、低温で無期限に保存することができる。
10.昆虫の幼虫は、受精昆虫卵の微量注入によって、栄養用蛋白、医療用蛋白または工業用蛋白の生産のための生物工場として役立つ。
検出可能なマーカー遺伝子[Renillaルシフェラーゼ遺伝子(RenillaルシフェラーゼをコードするDNAならびにそのようなベクターの構築のための原料を提供し得るプラスミドpTZrLuc−1の説明については、例えば米国特許5292658号参照。さらに、配列番号10も参照)]に連結されたCMVプロモーターや、さらにはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に機能的に連結されたサルウィルス40(SV40)プロモーターなどの哺乳動物プロモータを有する遺伝子構築物を、2種類の動物Trichoplusia ni[イラクサキンウワバ]およびBombyx mori[カイコ]の細胞に導入した。
1.発現ベクターを有するLMTK-細胞を下記のもので形質転換する。
a.B.moriβ−アクチンプロモーター昆虫細胞におけるHygr選択可能マーカー遺伝子
b.哺乳動物細胞におけるプロマイシンr選択可能マーカー遺伝子を制御するSV40またはCMVプロモーター。
2.LMTK細胞(プロマイシン rLMTK細胞)で哺乳動物プロモータの発現を検出する。
3.Bombyx細胞およびTrichoplusia細胞との融合実験でプロマイシンr細胞を用い、Hygr細胞を選別する。
これらの実験は、昆虫細胞に導入されたMACにある検出可能マーカー遺伝子[pSV40などの哺乳動物プロモータの制御下に発現されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子など]を検出するためのものである。データは、β−galが発現されたことを示している。
2.カルシウム/PEG細胞融合:(10分間〜0.5時間)、
3.ヘテロカリオン(+72時間)を選別する。
MACを含む昆虫細胞について選別を行う以下の選別条件を用いることができる[+=陽性選別」、−=陰性選別]。
1.28℃での成長(+昆虫細胞、−哺乳動物細胞);
2.グレーシズ(Graces)昆虫細胞培地[SIGMA](−哺乳動物細胞]
3.外因性CO2がないこと(−哺乳動物細胞)および/または
4.抗生物質選択(HygまたはG418)(+形質転換昆虫細胞)
融合プロトコールの直後に、哺乳動物と各昆虫細胞の間に多くのヘテロカリオン[融合事象]が認められる[90%以下のヘテロカリオン]。形質転換哺乳動物細胞の選別に使用される選別レベルでG418および/またはハイグロマイシンを含む昆虫培地での増殖[2週間以上]後、個々のコロニーについて、融合平板での増殖を検出する。MACによって与えられる抗生物質耐性の選択および昆虫細胞の選択によって、これらのコロニーはMACを有するはずである。
メガ染色体の断片化によって最終的には、ベクターとして使用するために操作し易いサイズである約15Mb〜50Mbに短縮された安定な染色体が得られる。このような断片化用ベクターはまた、in vitro産生される人工染色体の調製に必要な要素を容易に決定及び同定するために使用できる。
1.pTEMPUDの構築
プラスミドpTEMPUD(図5参照)は、in vivo染色体断片化を行うため及び部位特異的組込みによって大規模増幅を誘発するために用いられるマウス相同組換え“キラー”ベクターである。図5を参照すると、〜3,625bpのSa11−PstIフラグメントはpBabe−puroレトロウィルスベクターから得られた(Morgensternら(1990)Nucleic Acids Res.18:3587−3596参照)。このフラグメントは、アンピシリン耐性をコードするDNAと、pUC複製起点と、SV40初期プロモーターのコントロール下のピューロマイシンN−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とを含む。URA3遺伝子部分はpYAC5クローニングベクター(SIGMA)に由来する。URA3をSalI−XhoI消化によってpYAC5から切出し、pNEB193(New England Biolabs)にクローニングし、次いでEcoRI−SalIで切断し、pBabepuroのSalI部位に結合させてpPUを作製した。
m13順方向プライマーとして配列:
5’−GCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC−3’(配列32)、逆方向プライマーとして配列:
5’−TATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT−3’(配列33)の使用に基づくpUC/M13配列決定プライマーを用いたPCRによってpTel29インサートを増幅させた。
BglIIによってpTEMPUDを直鎖化すると、一端にヒトテロメアをもつ直鎖状分子が得られる。この直鎖状フラグメントを染色体、例えばハイブリッド細胞のメガ染色体またはマウス主要サテライト配列の反復を含む任意のマウス染色体に組込むと、選択可能マーカーであるピューロマイシン耐性遺伝子が組込まれ、テロメア末端によってプラスミドが開裂される。DT遺伝子は組込み及び発現のときに毒性であるため、完全直鎖状フラグメントがランダムイベントによって組込まれることを阻止する。従ってランダム組込みは毒性であり、このため、ターケットされたDNAに対する部位特異的組込みが選択されるであろう。このような組込みが、断片化された染色体を産生させる。
染色体をin vivo断片化するため、及び、部位特異的組込みによる大規模増幅を誘発するために好適であるがマウス主要サテライトDNAでなくマウスrDNA配列に基づく、pTEMPUDに類似の断片化/ターゲッティングベクターはpTERPUDと命名されている。このベクターにおいては、pTEMPUDのマウス主要サテライトDNA配列が、配列16のヌクレオチド10,232−15,000に対応する配列を含むメガ染色体クローン161の4770bpのBamHIフラグメントによって置換されている。
ヒト染色体を特異的にターゲットするベタターをpTEMPUDから構築できる。これらのベクターは、選択されたサテライト配列に従って特異的ヒト染色体を断片化し、ヒトミニクロモソームを作製し、またヒト動原体を単離するために使用できる。
pTEMPUDがヒト染色体の断片化に好適なプラスミドとなるように、マウス主要サテライト配列をヒトサテライト配列によって置換する。マウス染色体と違って、ヒト染色体の各々は、非反復サテライト配列を有している。例えば、マウス主要サテライトをヒト6量体αサテライト(またはアルホイド(alphoid)サテライト)DNA配列によって置換した。この配列はヒト結腸癌細胞系Colo320(受託番号ATCCCCL 220.1で寄託)から単離されEMBLデータベースに受託番号X60716で寄託されたタローンpS12に由来の813bpのフラグメント(配列2のヌクレオチド232−1044)である。813bpのアルホイドフラグメントは、各々がEcoRI部位を含む合成プライマーを用いた核酸増幅によってpS12クローンから得られる。合成プライマーは、配列:GGGGAATTCAT TGGGATGTTT CAGTTGA(配列4)の順方向プライマーと、配列:CGAAAGTCCCC CCTAGGAGAT CTTAAGGA(配列5)の逆方向プライマーとから成る。
pTEMPhu3中では、マウス主要サテライト配列がD3Z1(ATCC受託番号85434で寄託;Yrokov(1989)Cytogenet.Cell Genet.51:1114も参照)に由来の3kbのヒト染色体3特異的αサテライトによって置換されている。
ヒト染色体の各々は非反復染色体特異的アルホイド配列を含む。従って、3番染色体特異的αサテライトにターゲットされたpTEMHU3は、3番染色体の動原体領域の大規模増幅と新規な染色体の産生とが確保される選択条件下でヒト細胞に導入できる。このような誘発された大規模増幅は、新規な(denovo)染色体形成を誘発する手段を提供し、また、規定されたヒト染色体フラグメントをメガ塩基のサイズまでin vivoクローニングする手段を提供する。
縮小されたサイズの機能性哺乳類人工染色体ユニットを作製し、このユニットを動原体DNAのクローニングに使用する別の方法では、YACベクターに基づく哺乳類DNAのライブラリーをスクリーニングし、トランスジェニックマウスモデル系で潜在的陽性クローンの機能性を分析する。マウスのチロシナーゼ遺伝子を含む哺乳類DNAライブラリーを、YRT2(Schedlら(1993)Nuc.Acids Res.21:4783−4787参照)のようなYACベクター中で調製する。哺乳類のテロメア及び動原体の配列プローブに対するハイブリダイゼーションによってライブラリーをスクリーニングする。標準方法に従って陽性クローンを単離し、NMRI/Hanマウスの受精卵母細胞の前核に微量注入する。次に、胚をNMRI/Hanの養母に移入する。トランスジェニック子孫中でのチロシナーゼ遺伝子の発現は同定可能な表現型(色素沈着)を与える。従って、チロシナーゼを発現するトランスジェニックマウスを生じるクローンは機能性哺乳類人工染色体ユニットを含むことが確認される。
上述のように、ヘテロロガス遺伝子を発現させるために哺乳類人工染色体を使用すると、レシピエント細胞ゲノム内へのヘテロロガスプラスミドDNAのランダム組込みに起因するいくつかの不利な効果が回避される。ランダム組込みに伴う不利な効果を回避するための有効なツールとなり得る哺乳類人工染色体の本質的な特徴は、この染色体がレシピエント細胞中にゲノム外遺伝子ソースとして存在することにある。従って、哺乳類人工染色体からヘテロロガス遺伝子を発現させるためには、レシピエント細胞ゲノム内への不要なランダム組込みを生じることなく、哺乳類人工染色体に限定されたヘテロロガス遺伝子の特異的なターゲット化取込みが望ましい。
ベクターλCF−7は、遺伝子治療に使用される哺乳類人工染色体に取込まれ得る治療用分子をコードする代表的な核酸として嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子を含む。選択可能マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含み、またパン酵母(Saccharomyces cerevisiae)のura3遺伝子(オロチジン−5−ホスフェートデカルボキシラーゼ)を更に含むこのベクターを以下の一連段階で構築した。
S.cerevisiae ura3遺伝子を含む酵母人工染色体ベクターpYAC5(Sigma;YACベタターの記述に関してはBurkeら(1987)Science 236:806−812参照;pYAC5の完全配列に関してはGenBank受託番号U01086参照)に由来の2.6kbのSalI/XhoIフラグメントを、pHygの3.3kbのSalI/SmaIフラグメント(例えば、米国特許第4,997,764号、第4,686,186号及び第5,162,215号、並びに前記参照)に結合させることによってプラスミドpURAを調製した。結合に先立って、pHygの3.3kbフラグメントのSmaI末端に平滑末端結合できるようにXhoI末端をクレノウポリメラーゼによって処理した。従って、pURAはS.cerevisiae ura3遺伝子と大腸菌ColE1の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含む。組込まれた構築物をYACクローンとして哺乳類細胞から回収する手段を提供するためにuraE遺伝子が含まれている。
プラスミドpURAをSalIで消化し、pCEPURの1.5kbのSalIフラグメントに結合させた。プラスミドpCEPURは、pCEP4(Invitrogen)のNheI−NruIフラグメントに、pBabe−puroの1.1kbのSnaBI−NhaIフラグメントを結合させることによって調製した(Morgensternら(1990)Nucl.Acids Res.18:3587−3596;Dr.L.Szekely(Microbiology and Tumorbiology Center,Karolinska Institutet,Stockholm)によって提供された;また、Tonghuaら(1995)Chin.Med.J.(Beijing,Engl.Ed.)108:653−659;Coutoら(1994)Infect.Immun.62:2375−2378;Dunckleyら(1992)FEBS Lett.296:128−34;Frenchら(1995)Anal.Biochem.228:354−355;Liuら(1995)Blood 85:1095−1103;国際PCT出願WO9520044;WO9500178及びWO9419456参照)。
1つのプラスミド中でpUP2の要素をCFTR遺伝子と組合わせるために中間プラスミドpUP−CFTRを作製した。先ず、エプスタイン・バールウイルス(EBV)に基づくベクターpCEP4(Invitrogen,San Diego,CA;Yatesら(1985)Nature 313:812−815参照;また、米国特許第5,468,615号参照)の多数クローニング部位のCMVプロモーターとSV40ポリアデニル化シグナルとの間にCFTR遺伝子を挿入するために、CFTRをコードするDNA(Riordanら(1989)Science 245:1066−1073参照;CFTR遺伝子の配列に関しては米国特許第5,240,846号及びGenbank受託番号M28668参照)を含むpCMV−CFTRのCFTR遺伝子だけを含んでいる4.5kbのSalIフラグメントを、XhoI消化したpCEP4(Invitrogen及び本文中にも記載)に結合させた。得られたプラスミドをpCEP−CFTRと命名した。プラスミドpCEP−CFTRを次にSalIで消化し、CMVプロモーターとSV40ポリアデニル化シグナルとが隣接したCFTR遺伝子を含む5.8kbのフラグメントを、SalI消化したpUP2に結合させてpUP−CFTRを作製した。従って、pUP−CFTRは、pUP2の全部の要素に加えて、CMVプロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナルに連結されたCFTR遺伝子を含む。
次に、プラスミドpUP−CFTRをEcoRIで部分消化することによって直鎖化し、CFTR遺伝子を含む13kbのフラグメントを、EcoRI消化したCharon 4Aλに結合させた(Charon 4Aλの記述に関しては、Blattnerら(1977)Science 196:161;Williams and Blattner(1979)J.Virol.29:555;及びSambrookら(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Volume 1,Secion 2.18参照)。得られたベクターλCF8は、Charon 4Aλバクテリオフアージの左アームと、CMVプロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナルに連結されたCFTR遺伝子と、ura3遺伝子と、SV40プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子と、チミジンキナーゼプロモーター(TK)と、ColE1複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子と、Charon 4Aλバクテリオファージの右アームとを含む。λCF8構築物を次にXhoIで消化し、得られた27.1kbを、SV40ポリAシグナルとEcoRI消化したCharon 4Aλの右アームとを含むpJBP86(後述)の0.4kbのXhoI/EcoRIフラグメントに結合させた。得られたベクターλCF−7は、Charon 4Aλの左アームと、CMVプロモーター及びSV40ポリAシグナルに連結されたCFTRのコーディングDNAと、ura3遺伝子と、SV40プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子と、Charon 4Aλの右アームとを含む。λDNAフラグメントは、代表的な人工染色体に存在するヌクレオチドに相同なコード配列を提供する。
ベクターλCF−7−DTAもまた、λCF−7に含まれている全部の要素を含み、加えて、致死選択マーカーとジフテリア毒素A(DT−A)遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子と複製起点とを含む。このベクターを以下の一連段階で構築した。
上記λCF−7の構築にプラスミドpJBP86を使用した。SV40プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を含むpCEPURの1.5kbのSalIフラグメントを、HindIII消化したpJB8に結合させた(例えばIsh−Horowitzら(1981)Nucleic Acids Res.9:2989−2998参照;ATCC受託番号37074から入手可能;Amersham,Arlington Heights,ILの市販製品)。結合に先立って、pCEPURの1.5kbフラグメントのSalI末端とHindIII直鎖化したpJB8末端とをクレノウポリメラーゼによって処理した。得られたベクターpJBP86は、SV40プロモーター及びポリAシグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子と、Charon 4Aλの1.8kbのCOS領域と、ColE1複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子とを含む。
ジフテリア毒素−A遺伝子を含むpMC1−DT−A(例えばMaxwellら(1986)Cancer Res.46:4660−4666参照)の1.1kbのXhoI/SalIフラグメントを、XhoI消化したpMEP4(Invitrogen,San Diego,CA)に結合させてpMEP−DTAを作製した。pMC1−DT−Aを作製するためには、DTA遺伝子のコーディング領域をp2249−1から800bpのPstI/HindIIIフラグメントとして単離し、pMC1neopolyA(Stratageneから入手可能なpMC1)のneo遺伝子に置換してTKプロモーターのコントロール下に導入した。得られた構築物pMC1DT−AをHindIIIで消化し、クレノウで末端を埋め戻し、SaIIリンカーを結合させて、XhoI末端(5’)と、270bpのTKプロモーターと、〜790bpのDT−Aフラグメントとを含むSalI末端とをもつ1061bpのTK−DTA遺伝子カセットを作製した。このフラグメントをXhoI消化したpMEP4に結合させた。
プラスミドpJB8をHindIII及びClaIで消化し、オリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチドのセンス鎖としては配列7参照、アンチセンス鎖としては配列8参照)に結合させてpJB83を作製した。ClaI/HindIII消化したpJB8に結合したオリゴヌタレオチドは、制限エンドヌタレアーゼSwaI、PacI及びSrfIの認識部位を含んでいた。これらの部位はpλCF−7−DTA構築物の直鎖化を容易にする。
λCF−7の12bpのオーバーハングを、Mung beanヌタレアーゼ及びT4ポリメラーゼを順次用いた処理によって除去した。得られた41.1kbの直鎖状λCF−7ベクターを、ClaIで消化しT4ポリメラーゼで処理しておいたpFB83−DTA9に結合させた。得られたベクターλCF−7−DTAは、λCF−7の全部の要素と、TKプロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナルに連結されたDT−A遺伝子と、1.8kbのCharon 4Aλ COS領域と、アンピシリン耐性遺伝子(pJB83−DTA9に由来)と、ColE1複製起点(pJB83−DT9Aに由来)とを含む。
哺乳類人工染色体にRenillaルシフェラーゼ遺伝子を部位特異的にターゲットするプラスミドpMCT−RUC(14kbp)を構築した(RenillaルシフェラーゼをコードするDNA及びこのようなベクターを構築するための出発物質を提供し得るプラスミドpTZrLuc−1の記述に関しては米国特許第5,292,658号及び第5,418,155号参照)。このプラスミドの有利な特徴は、Renillaルシフェラーセ遺伝子がヒトサイトメガロウイルスの前初期遺伝子エンハンサー/プロモーターの転写調節下に維持されていること、及び、正の選択可能マーカーであるヒグロマイシン耐性遺伝子がチミジンキナーゼプロモーターの転写調節下に維持されていることである。特にこのプラスミドは、ミニクロモソームに相同のDNA(即ちネオマイシン耐性遺伝子)を含むプラスミドpAG60(米国特許第5,118,620号、第5,021,344号、第5,063,162号及び第4,946,952号参照;また、Colbert−Gapapinら(1981)J.Mol.Biol.150:1−14参照)と、Renilla遺伝子及びヒグロマイシン耐性遺伝子と、相同組換えの負の選択可能マーカーであるtkプロモーターのコントロール下のHSG−tk遺伝子と、プラスミドを直鎖化するための非反復HpaI部位とを含む。
哺乳類細胞発現系において細胞内産生されたヘテロロガスタンパク質を単離するためには、苛酷にもなり得る条件下で細胞破壊を行うこと、及び、細胞夾雑物から組換えタンパク質を精製することが必要である。組換え産生されたタンパク質を、精製による除去を要する夾雑物の少ない細胞外媒質に分泌させることによって、タンパク質単離のプロセスを簡単にすることができる。従って、哺乳類の人工染色体系と共に使用するための分泌用ターゲッティングベタターを構築した。
ベクターpLNCX−ILRUCは、哺乳類細胞中で遺伝子を構成的に発現させるためにヒトサイトメガロウイルス(CMV)の前初期プロモーターに連結されたヒトIL−2シグナルペプチド−R.reniformis融合遺伝子を含む。構築物を以下の手順で調製した。
適当なIL−2プライマーを用いたHEK 293細胞系の核酸増幅によって、ヒトIL−2シグナルペプチドをコードするDNAを含む69bpのDNAフラグメントが得られた(例えば、IL−2をコードするDNAに関しては米国特許第4,518,584号及び配列9参照;IL−2遺伝子及び対応するアミノ酸配列はGenbank Sequence Databaseで受託番号K02056及びJ00264として提供される)。シグナルペプチドは、双方のGenbankに収録された翻訳産物及び配列9の最初の20個のアミノ酸を含む。
TTTGAATTCAGTAGGTGCACTGTTTGTGAC(逆方向、配列12)
b.R.reniformisルシフェラーゼをコードするDNAの調製
R.reniformisルシフェラーゼ遺伝子の出発ソースはプラスミドpLXSN−RUCであった。ベタターpLXSN(例えば、米国特許第5,324,655号、第5,470,730号、第5,468,634号及び第5,358,866号並びにMillerら(1989)Biotechniques 7:980参照)は、ヘテロロガスDNAをレトロウイルスLTRの転写調節下に発現させ得るレトロウイルスベクターである。このベクターは更に、SV40初期領域プロモーターに発現動作可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含む。R.reniformisルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドpTZrLuc−1(例えば、米国特許第5,292,658号参照;また、Genbank Sequence Database受託番号M63501参照;また、Lorenzら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:4438−4442参照)から入手し、配列10に示す。pTZrLuc−1の0.97kbのEcoRI/SmaIフラグメントは、RenillaルシフェラーゼをコードするDNAのコーディング領域を含む。ベクターpLXSNを消化し、pLXSN−RUCに含まれたルシフェラーゼ遺伝子に結合させた。pLXSN−RUCは、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を指令するSV40プロモーターの上流でウイルスLTRに作動可能に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた。
項1.aで前述したIL−2シグナルペプチドをコードするDNAを含むベクターpGEMTをEcoRIで消化し、得られたシグナルペプチドをコードするフラグメントを、EcoRI消化したpLXSN−RUCに結合させた。得られたプラスミドをpLXSN−ILRUCと命名したが、このプラスミドは、pLXSN−RUC中のR.reniformis遺伝子の直ぐ上流にIL−2シグナルペプチドをコードするDNAを含む。次に、融合遺伝子の3’端にSmaI部位を付加するために融合遺伝子の核酸増幅鋳型としてプラスミドpLXSN−ILRUCを使用した。直鎖化した(EcoRI/SmaI消化した)pGEMT(Promega)に増幅産物をサブクローニングしてILRUC−pGEMTを作製した。
プラスミドILRUC−pGEMTをKspI及びSmaIで消化し、IL−2シグナルペプチド−ルシフェラーゼ融合遺伝子を含むフラグメントを遊離させ、これをHpaI消化したpLNCXに結合させた。ベクターpLNCX(例えば、米国特許第5,324,655号及び第5,457,182号参照;また、Miller and Rosman(1989)Biotechniques 7:980−990参照)は、ヘテロロガスDNAをCMVプロモーターのコントロール下に発現させるレトロウイルスベクターである。このベクターはまた、ウイルスプロモーターの転写調節下のネオマイシン耐性遺伝子を含む。結合反応によって得られたベクターをpLNCX−ILRUCと命名した。ベクターpLNCX−ILRUCは、pLNCX中のCMVプロモーターの直ぐ下流でウイルス3’LTR及びポリアデニル化シグナルの上流にIL−2シグナルペプチド−ルシフェラーゼ融合遺伝子を含む。この配置によって融合遺伝子がCMVプロモーターのコントロール下で発現し得る。ヘテロロガスタンパク質をコードするDNA(即ち、ルシフェラーゼ遺伝子)がIL−2シグナルペプチドをコードするDNAに作動可能に連結された配置によって、ベクターがトランスフェクトされた哺乳類細胞中で融合タンパク質が発現され、ヘテロロガスタンパク質が宿主細胞から細胞外媒質に分泌される。
IL−2シグナルペプチド−ルシフェラーゼ融合遺伝子を宿主細胞の哺乳類人工染色体に導入するために、ベクターpLNCX−ILRUCを修飾して使用するとよい。pLNXC−ILRUC発現ベクターによる哺乳類人工染色体の特異的取込みを促進するために、人工染色体に存在するヌクレオチドに相同な核酸配列を部位特異的組換え可能な状態でベクターに付加する。
エレクトロポレーション(BIORAD、製造業者の指示通りに実施)によって、哺乳類細胞(LMTK−、ACTTから入手)にベクターpLNCX−ILRUC(〜10μg)を一過性にトランスフェクトした。また、neo選択用G418中の増殖によって産生された安定なトランスフェクタントも調製した。
(i)細胞ペレットのRenillaルシフェラーゼアッセイ
以下の細胞を試験した:
ベクター非含有細胞:陰性対照としてベクター非含有のLMTK−細胞;
pLNCX単独をトランスフェクトした細胞:
RUC−pLNCX(pLNCXベクター中にRenillaルシフェラーゼ遺伝子を含むベクター)をトランスフェクトした細胞;
pLNCX−ILRUC(pLNCXベクター中にIL−2リーダー配列+Renillaルシフェラーゼ融合遺伝子を含むベタター)をトランスフェクトした細胞。
4つの細胞プレートに由来の40ミリリットルの培地を採取して遠心沈殿させた。各ルシフェラーゼ活性アッセイに200マイクロリットルの培地を使用した。アッセイを数回繰返し、生物発光の平均測定値を算出した。これらの結果は、pLNCX−ILRUCで形質転換させた細胞の細胞培地中で比較的高いレベルの生物発光が検出されることを示した。RUC−pLNCXをトランスフェクトした細胞中の検出レベルは約1/10という低い値(ベクター非含有またはpLNCX単独をトランスフェクトした細胞の培地中のバックグラウンドレベルをやや上回る値)であった。
これらの実験の結果は、RenillaルシフェラーゼがIL−2シグナルペプチドの指令下でLMTK−細胞から分泌されると考えられることを示した。IL−2分泌シグナルをコードするDNAに連結されたRenillaルシフェラーゼをコードするDNAをトランスフェクトした細胞の培地は、対照またはルシフェラーゼをコードするDNAを含むがシグナルペプチドをコードするDNAを含まない細胞よりも実質的に高いレベルのRenillaルシフェラーゼ活性を有していた。また、対照とルシフェラーゼをコードするDNAを含む細胞との差は、ルシフェラーゼ活性がルシフェラーゼ特異的であり、非特異的反応に由来しないことを示す。更に、RUC−pLNCXをトランスフェクトした細胞の培地から得られた結果がバックグラウンドと同様であることは、培地中のルシフェラーゼ活性が細胞溶解に由来するのでなく分泌ルシフェラーゼに由来することを示す。
哺乳類人工染色体からIL−2シグナルペプチド−R.reniformis融合遺伝子を発現させるために、ベクターpLNCX−ILRUCλは、哺乳類人工染色体に含まれているλDNA配列との相同組換えによって哺乳類人工染色体に部位特異的に組込まれるようにターゲットされる。これは、哺乳類人工染色体を担持している融合細胞系または哺乳類人工染色体を含む哺乳類宿主細胞にpLNCX−ILRUCλを導入することによって行われる。例えばベクターのマイクロインジェクションまたはベクターによる融合細胞系のトランスフェクションを介して人工染色体を担持している融合細胞系にベクターが導入される場合、細胞を選択的条件下で増殖させる。ベクターpLNCX−ILRUCλを取込んだ人工染色体を、前述のような精製手順を用いて生存細胞から単離し、次いで哺乳類宿主細胞に注入する。
ベクターpMCT−RUCに基づくこれらのベクターは二重組換え体の挿入及び選択を確保するために正の選択及び負の選択に依存する。1回の交差によって細胞を殺傷するDT−Aが取込まれ、2回の交差組換えによってDT−1遺伝子が欠失する。
DT−A:ジフテリア毒素遺伝子(負の選択可能マーカー)と、Hyg:ヒグロマイシン遺伝子(正の選択可能マーカー)と、ruc:Renillaルシフェラーゼ遺伝子(非選択可能マーカー)と、1:LTR−MMTVプロモーターと、
2:TKプロモーターと、
3:CMVプロモーターと、
MMR:相同領域(プラスミドpAG60)。
pNEM−2:“−”選択可能マーカーとしてヒグロマイシンアンチセンス遺伝子、
pNEM−3:“−”選択可能マーカーとしてチミジンキナーゼHSV−1遺伝子。
pNEMλ−1:ベースベクター、
pNEMλ−2:p5=遺伝子を含むベースベクター、
1:LTR MMTVプロモーター、
2:SV40プロモーター、
3:CMVプロモーター、
4:μTIIAプロモーター(メタロチオネイン遺伝子プロモーター)。
λの左右のアームのλL.A.及びλR.A.相同領域(λgt−WES)。
これらの手順は、哺乳類細胞、昆虫類細胞などの真核細胞にMACを微量注入するために使用される。
35×10mmのNunclon組織培養皿、マウス細胞系EC3/7C5プラスミドDNA pCH110(Pharmacia)、精製した緑色蛍光タンパク質(Purified Green Fluorescent Protein,GFP)(Aequorea及びRenillaに由来のGFPは精製されており、GFPをコードするDNAもクローニングされている。例えば、Prasherら(1992)Gene 111:229−233;米国特許出願08/119,678及び08/192,264に基づく国際PCT出願WO95/07463参照)、ZEISS Axiovert 100顕微鏡、エッペンドルフトランスジェクター5246、エッペンドルフマイタロマニピュレータ5171、エッペンドルフのセロケート・カバースライド、エッペンドルフ微量充填器、エッペンドルフのフェムトチップス及びその他の標準装置。
(1)35mmの組織培養皿(37℃、5%CO2)で細胞密度が80%集密度に達するまで線維芽細胞を増殖させる。インキュベータから皿を取出し、培地を深さ約5mmまで加える。
(2)皿ホルダーに皿を載せ、倍率10×の対物レンズで細胞を観察する。細胞表面上方に焦点を合わせるのが望ましい。
(3)微粒状落屑を完全に除去するために十分な遠心力でDNAサンプルを遠心(典型的には微量遠心管で約10,000rpmで10分間)することによって、プラスミドまたは染色体DNA溶液(1ng/μl)及びGFPタンパク質溶液を更に精製する。
(4)2つの2μlのDNA溶液(1ng/μl)をエッペンドルフ微量充填器で微量毛細管に充填する。充填中、微量毛細管の先端に充填器を挿入する。GFP(1mg/ml)を同じ手順で充填する。
(5)微量毛細管から保護シースを外し、微量毛細管をマイクロマニピュレータに接続した毛細管ホルダーに固定する。
(6)毛細管の先端を培地の表面まで下降させ、徐々に細胞に焦点を合わせていきながら毛細管の先端を細胞の表面に到達させる。更に下降させて毛細管を細胞に挿入する。毛細管のレベル、時間及び圧力のような種々のパラメーターは特定装置毎に決定される。例えば、線維芽細胞系C5と上記装置とを使用したときの最良条件は、注入時間0.4秒、圧力80psiである。DNAは次に細胞の核に自動的に注入される。
(7)注入後、細胞をインキュベータに戻し、約18〜24時間インキュベートする。
(8)インキュベーション後、選択マーカーに依存する適当な方法で形質転換体の数を測定し得る。例えば、緑色蛍光タンパク質を使用する場合、UV光源及び注入後0〜24時間に設定した蛍光フィルターを使用してアッセイを実施し得る。pHC110に由来のDNAのようなβ−gal含有DNAを注入した場合、形質転換体のβ−galを検定し得る。
培養プレートから培地を除去し、5mlの定着溶液(1%のグルタルアルデヒド;0.1Mのリン酸ナトリウムバッファ溶液;1mMのMgCl2)を加えて細胞を定着させ、37℃で15分間インキュベートする。定着溶液1を、5mlのX−gal溶液II(0.2%のX−gal;10mMのリン酸ナトリウムバッファ(pH7.0);150mMのNaCl;1mMのMgCl2;3.3mMのK4Fe(CN)6H20;3.3mMのK3Fe(CN)6)で置換し、プレートを37℃で30〜60分間インキュベートする。X−gal溶液を除去し、2mlの70%グリセロールを各プレートに添加する。青色に染色された細胞を光学顕微鏡で確認する。
動物体に所望の形質、例えば疾病耐性を与えるヘテロロガス遺伝子を発現する(ヒト以外の)トランスジェニック動物を作製し得る。疾病耐性動物のモデルとして役立つトランスジェニックマウスを作製する。ワクチンをコードしているかまたは治療用分子をコードしている遺伝子を胚または胚幹細胞(ES細胞)に導入して遺伝子産物を発現させ、特定の疾病に耐性または低感受性の動物を作製し得る。
ベクターに担持されたトランスジーンDNAを用いて発育させたマウス(対照マウス)中のトランスジーン発現と、人工メガ染色体に担持されたトランスジーンを用いて発育させたマウス中の発現との安定性及び量を比較するために対照トランスジェニックマウスを作製する。
β−ガラタトシダーゼ遺伝子を単独でマウス胚にマイタロインジェクションすることによって1組の対照トランスジェニックマウスを作製した。プラスミドDNAをマウス胚に導入するために使用したマイクロインジェクション手順は実施例13に記載の手順を胚を使用するように修正したものである(例えば、Hoganら(1994)Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,特にpp255−264及び付録3参照)。受胎マウス肝(Charles River Co.から得られたCB6株)に、BamHI消化によって直鎖化しておいた1ngのプラスミドpCH110(Pharmacia)を注入した。このプラスミドは、SV40後期プロモーターに連結されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子産物は、トランスジーン発現の成否を知るための検出容易なマーカーを提供する。更に、これらの対照マウスは、プラスミドを胚に導入するために使用したマイクロインジェタション手順を追認する。更に、モデル系(下記参照)のマウス胚に導入されるメガ染色体がβ−ガラタトシダーゼ遺伝子も含むので、pCH110の胚注入によって作製された対照トランスジェニックマウスは、プラスミドに由来のヘテロロガス遺伝子の発現と人工染色体に担持された遺伝子に由来のヘテロロガス遺伝子の発現とを比較するための相似的な系として役立つ。
異なる3つの遺伝子、即ち、(1)抗HIVリボザイムをコードするDNAと、(2)ピューロマイシン耐性遺伝子と、(3)ヒグロマイシン耐性遺伝子とを含むプラスミドpCEPUR−132をマイクロインジェクションによってマウス胚に導入し1組の抗HIVリボザイム遺伝子含有対照トランスジェニックマウスを作製した。プラスミドpCEPUR−132は、抗HIVリボザイム遺伝子(以後、Changら(1990)Clin.Biotech.2:23−31に準じてリボザイムDと呼ぶ;他の参考文献としてはRossiらの米国特許第5,144,019号、特に図4)とヒグロマイシン耐性遺伝子とを含むプラスミドpCEP−132の部分をピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドpCEPURの部分に結合させることによって構築された。
受精マウス胚に、融合細胞系G3D5またはH1D3(前出)から単離したメガ染色体(1plあたり0−1個の染色体を含む1−10plの材料)を前述の手順で微量注入する。メガ染色体は本文中に記載の手順で単離する。どちらの細胞系から単離したメガ染色体も、抗HIVリボザイム(リボザイムD)遺伝子とヒグロマイシン耐性遺伝子及びβ−ガラタトシダーゼ遺伝子とを含む。注人を受けた胚を発育させ、前述のようなトランスジェニックマウスを得る。
上述のように作製したトランスジェニックマウスが3〜4週齢に成長したときに、発育場所である胚(または受精卵)に導入されたトランスジーンの安定な発現を分析する。以下のような複数の方法でトランスジェニックマウスを分析し得る。
トランスジェニックマウスから細胞サンプル(例えば、脾臓、肝臓及び腎臓の細胞、リンパ球、尾細胞)を採取する。どの細胞を用いてトランスジーン発現を試験してもよい。しかしながら、メガ染色体含有細胞を受精卵にマイクロインジェクションするかまたは胚幹細胞と融合させることによって作製したキメラマウスの場合、トランスジーンを担持する領域のマウス細胞だけがトランスジーンを発現すると予想される。細胞がヒグロマイシン(細胞が2つの抗生物質耐性遺伝子の導入によって作製されたマウスに由来する場合にはヒグロマイシンとピューロマイシンまたはネオマイシン)上で増殖を維持する場合、この増殖維持は、これらの細胞がトランスジーンを安定に発現しているという指標となる。標準方法に従って細胞から単離したRNAをノーザンブロット手順によって分析し、細胞が、抗生物質耐性遺伝子に基づく核酸プローブにハイブリダイズする転写物を発現するか否かを判断し得る。更に、トランスジェニックマウスから得られた細胞によるβ−ガラクトシダーゼ発現の分析は、このマーカー酵素用の標準アッセイ(例えば、β−ガラクトシダーゼ及びX−gal基質が関与する反応の産物の直接染色、例えば、Jones(1986)EMBO 5:3133−3142、またはβ−ガラクトシダーゼ活性の測定、例えばMiller(1972)Experiments in Molecular Genetics pp.352−355,Cold Spring Harbor Press参照)を用いて行うとよい。特に、胚に導入されたトランスジーンがβ−ガラタトシダーセ遺伝子だけであるような対照トランスジェニックマウスから得られた細胞中のトランスジーン発現を評価するときは、β−ガラクトシダーゼ発現の分析を使用する。
抗HIVリボザイム遺伝子(並びに選択及びマーカー遺伝子)を胚または受精卵に導入することによって作製した完全トランスジェニッタマウスにおけるトランスジーンの発現は、マウスをHIV感染で攻撃することによってを分析し得る。高生産性HIV感染U937細胞(例えば、Locardiら(1992)J.Virol.66:1649−1654参照)の腹膜組織内注入によってマウスをHIV感染させることが可能である。感染の成否は、HTV感染ヒト細胞を注入したトランスジェニッタマウスから得られた末梢血単核細胞のような細胞から単離したDNAの分析によって確認し得る。例えば、HIV特異的プライマーを用いる核酸増幅によって証明されるように、感染トランスジェニックマウス細胞のDNAはHIV特異的gag及びenv配列を含むであろう。細胞が抗HIVリボザイムも安定に発現させているならば、細胞のRNA抽出物を分析したときに、リボザイムによるgag転写物の開裂によって生じた短縮gagフラグメントが検出されるであろう。
トランスジェニックニワトリの発育は、商業的に重要な農畜産品種である家禽を病気耐性遺伝子及び治療用タンパタ質をコードする遺伝子によって改良するなどの多くの用途を有している。この分野では、トランスジェニックニワトリの作製を目指す研究が、ランダム導入によってレシピエント細胞に遺伝子を導入する従来の方法でニワトリ細胞にトランスジーンを安定に発現させることが難しいという問題に直面していた。人工染色体は、宿主細胞中でトランスジーンを安定に維持させるので、トランスジェニックニワトリの発育に特に有用である。
(i)哺乳類人工染色体
本文中に記載のSATAC及びミニクロモソームのような哺乳類人工染色体は、検出可能なリポーター遺伝子及び/またはトランスジェニックニワトリの発育に使用される有益なトランスジーンを取込むように修飾され得る。あるいは、本文中に記載の方法を使用してニワトリ特異的人工染色体を構築し得る。より特定的には、本文中に記載のMACの作製方法を用いてニワトリ人工染色体(CAC)を調製し得る。また、上述のように、本発明によって提供されるMACにニワトリライブラリーを導入し、得られたMACをニワトリ細胞に導入し、ニワトリ細胞中で機能性のMACを選択し得る。
更に、ニワトリ人工染色体を本文中に記載の方法を用いて作製し得る。例えば、初代ニワトリ線維芽細胞(例えば、Brazolotら(1991)Mol.Reprod.Devel.30:304−312)のようなニワトリ細胞に、選択可能マーカー(例えば、抗生物質耐性を与えるタンパク質)をコードし且つ導入DNAを内在性ニワトリ染色体の動原体周囲領域にターゲットするDNA(例えばニワトリサテライトDNA)を含むDNAをトランスフェクトするとよい。次に、選択培地で増殖を維持するトランスフェクタントを本文中に記載の方法を用いて分析し、ミニクロモソーム及び特にSATACのような人工染色体の有無を判定する。次に、人工染色体含有トランスフェクタント細胞に、有益なトランスジーン(適当なプロモーターに融合)をコードするDNAを、外来DNAをニワトリ人工染色体にターゲットするDNAと共にトランスフェクトする。
染色体をレシピエント細胞に導入するために、有益な(1つまたは複数の)トランスジーンを担持している人工染色体を含む細胞系(即ち、ドナー細胞)をレシピエントニワトリ細胞に融合し得る。あるいは、例えば本文中に記載の方法(例えば実施例10参照)を用いて人工染色体をドナー細胞から単離し、レシピエント細胞に直接導入してもよい。
レシピエント細胞として(人工染色体を受容した)X期胞胚葉細胞を同じ発生期の胚に注入することによってトランスジェニックニワトリを発育させ得る(例えば、Etchesら(1993)Poultry Sci.72:882−889;Petitteら(1990)Development 108:185−189;Carsienceら(1993)Development 117:669−675参照)。卵殻内のレシピエントニワトリ胚を明りに透かして良否を判定して孵化させ、いずれかの細胞が(1つまたは複数の)トランスジーンを発現している生殖系キメラニワトリを産生させる。
Claims (30)
- 植物細胞の染色体の挟動原体異質染色質に選択可能マーカーをコードするDNAが導入されるよう、選択可能マーカーを含む1つまたは複数のDNAフラグメントを植物細胞に導入する段階と、
前記1つまたは複数のDNAフラグメントをゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で前記植物細胞を増殖させる段階と、
サテライト人工染色体またはソーセージ型染色体を含む細胞を選択する条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る、ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものであり、
ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものであり、
ソーセージ染色体は(i)増幅された異質染色質部分および(ii)真正染色質部分を含むものである、植物人工染色体または植物ソーセージ型染色体の製造方法。 - 選択された細胞が、ソーセージ染色体を含有している、請求項1記載の方法。
- 選択された細胞が、サテライト人工染色体を含有する、請求項1記載の方法。
- 更に、遺伝子産物をコードするDNAを導入する段階を含んでおり、この遺伝子産物をコードするDNAは選択可能マーカーを含むフラグメントに存在するかまたは第二のDNAフラグメントに存在し、得られるサテライト人工染色体またはソーセージ染色体が遺伝子産物をコードする異種DNAを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 該細胞がサテライト人工染色体を含有し、
該サテライト人工染色体がメガ染色体であり、
ここでメガ染色体は、2個の反転メガレプリコンを有するアンプリコンを含む、50Mb〜400Mbを含有するサテライト人工染色体であり、
メガレプリコンが反復異質染色質DNA単位を含むものであり、
該方法が、末端切断されたメガ染色体を含む細胞が産生される条件に細胞を置く段階を更に含むことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記条件が、X線照射と、染色体内部の塩基対合を不安定化する物質の存在下の増殖とから選択されることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記物質がブロモデオキシウリジンであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 更に、15〜60Mbからなるサテライト人工染色体を含んでいる細胞を選択する段階を含むことを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞からサテライト人工染色体を単離する段階を更に含むことを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 単離が、
中期染色体を単離し、
内因性染色体からサテライト人工染色体を識別し、
内因性染色体からサテライト人工染色体を分離することによって行われることを特徴とする請求項9に記載の方法。 - DNA配列特異的染料で染色体を染色することによってサテライト人工染色体を内因性染色体から識別し、フローセルソーターによって分離することを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 植物細胞が、植物プロトプラストである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって製造されるサテライト人工染色体。
- 実質的に純粋であり、真正染色質よりも異質染色質を多く含む、単離された植物サテライト人工染色体。
- 50〜450Mbからなるメガ染色体であることを特徴とする請求項14に記載のサテライト人工染色体。
- 選択可能マーカーを含む1つまたは複数のDNAフラグメントを植物細胞に導入する段階と、
前記1つまたは複数のDNAフラグメントをそのゲノムDNAに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から新規な動原体を含む二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
サテライト人工染色体またはソーセージ染色体が産生される条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成り、ここで
サテライト人工染色体が真正染色質よりも異質染色質を多く含み;および
ソーセージ染色体が(i)増幅された異質染色質部分および(ii)真正染色質部分を含むものである、
植物人工染色体または植物ソーセージ型染色体の製造方法。 - サテライト人工染色体またはソーセージ型染色体を含有する細胞、ここで該サテライト人工染色体は請求項1から12のいずれか一項に記載の方法で調製されたものであり、
ソーセージ型染色体は請求項1から12のいずれか一項に記載の方法で調製されたものである。 - 植物プロトプラスト細胞である、請求項17記載の細胞。
- 請求項17または18記載の植物細胞を、トランスジェニック植物が産生される条件下で培養する段階を含む、トランスジェニック植物の産生方法。
- サテライト人工染色体を植物細胞に導入する段階と、該植物細胞をトランスジェニック植物が産生される条件下で培養する段階を含むことを特徴とするトランスジェニック植物の産生方法。
- サテライト人工染色体が細胞融合およびミクロセル(微小核体)融合からなる群から選択される方法により得られたものである、請求項20記載の方法。
- 植物細胞がタバコ、イネ、トウモロコシ、ライ麦、小麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする請求項19から21いずれか一項に記載の方法。
- DNAフラグメントを植物細胞に導入する段階、ここでDNAフラグメントは植物細胞内の狭動原体領域内へ組み込まれる、
前記植物細胞を増殖させる段階と、
得られた植物細胞から、増幅された領域を染色体内に含む細胞を選択する段階
を含む、増幅された核酸を含む植物染色体の製造方法。 - 前記DNAフラグメントが、狭動原体領域を標的とする標的化ヌクレオチド配列を含有する、請求項1または23記載の方法。
- 前記標的化配列がrDNAを含有する、請求項24記載の方法。
- 前記増幅された領域を含む染色体が、ソーセージ染色体である、請求項23から25いずれか一項に記載の方法。
- 植物細胞がタバコ、イネ、トウモロコシ、ライ麦、小麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする、請求項23から26いずれか一項に記載の方法。
- 増幅された核酸領域が増幅された内因性染色体核酸を含む、請求項23から27いずれか一項に記載の方法。
- 前記導入されたDNAフラグメントが1つまたは複数の遺伝子をコードする、請求項1または23記載の方法。
- 前記導入されたDNAフラグメントが植物へ病気に対する耐性を付与する産物をコードするものである、請求項29記載の方法。
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