JPH07177881A - 哺乳動物の人工染色体 - Google Patents
哺乳動物の人工染色体Info
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- JPH07177881A JPH07177881A JP4245206A JP24520692A JPH07177881A JP H07177881 A JPH07177881 A JP H07177881A JP 4245206 A JP4245206 A JP 4245206A JP 24520692 A JP24520692 A JP 24520692A JP H07177881 A JPH07177881 A JP H07177881A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/166—Animal cells resulting from interspecies fusion
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 哺乳動物の人工染色体を提供する。
【構成】 優性マーカー遺伝子に結合したヒトＤＮＡ配
列からなる機能的動原体を含む非ヒト細胞系を開示す
る。該動原体は、該ヒトＤＮＡ配列からなる動原体以外
の動原体をなんら有しない安定な染色体上に保持され
る。この細胞系は染色体の単離、及び哺乳動物細胞への
遺伝子の挿入に使用できる。二動原体染色体を有する細
胞系からこのような細胞系を作成する方法も開示する。
列からなる機能的動原体を含む非ヒト細胞系を開示す
る。該動原体は、該ヒトＤＮＡ配列からなる動原体以外
の動原体をなんら有しない安定な染色体上に保持され
る。この細胞系は染色体の単離、及び哺乳動物細胞への
遺伝子の挿入に使用できる。二動原体染色体を有する細
胞系からこのような細胞系を作成する方法も開示する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は哺乳動物の人工染色体に
関する。
関する。
【０００２】
【従来の技術】動原体（セントロメア：ｃｅｎｔｒｏｍ
ｅｒｅ）は真核生物染色体の特異的な領域である。これ
は細胞分裂の際に正確な染色体分離が行われるようにす
る構造であるキネトコア形成がなされる部位である。さ
らに、真核生物染色体の高度な組織化において構造的役
割を担っている可能性が示唆されている（Ｈａｄｌａｃ
ｚｋｙ（１９８５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｒｅｖ．，
９４：５７−７６）。
ｅｒｅ）は真核生物染色体の特異的な領域である。これ
は細胞分裂の際に正確な染色体分離が行われるようにす
る構造であるキネトコア形成がなされる部位である。さ
らに、真核生物染色体の高度な組織化において構造的役
割を担っている可能性が示唆されている（Ｈａｄｌａｃ
ｚｋｙ（１９８５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｒｅｖ．，
９４：５７−７６）。
【０００３】動原体を単離し、クローニングすること
は、その分子構造と機能を理解するためだけでなく、安
定な人工染色体を作るためにも不可欠である。動原体に
結合した遺伝子が存在する利点を生かして、下等真核生
物（酵母）の機能的動原体を単離することに成功してい
る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：１６３−１
９４；Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：２９−５６）。機能
的動原体と、染色体末端を安定化するテロメアとの組み
合わせにより酵母の人工染色体を作成することが可能と
なった（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｎ
ａｔｕｒｅ，３０５：１８９−１９３；Ｂｕｒｋｅ ｅ
ｔ ａｌ．（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：８
０６−８１２）。これによって染色体の機能の研究と遺
伝子操作に新しい時代が開かれた。
は、その分子構造と機能を理解するためだけでなく、安
定な人工染色体を作るためにも不可欠である。動原体に
結合した遺伝子が存在する利点を生かして、下等真核生
物（酵母）の機能的動原体を単離することに成功してい
る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：１６３−１
９４；Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：２９−５６）。機能
的動原体と、染色体末端を安定化するテロメアとの組み
合わせにより酵母の人工染色体を作成することが可能と
なった（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｎ
ａｔｕｒｅ，３０５：１８９−１９３；Ｂｕｒｋｅ ｅ
ｔ ａｌ．（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：８
０６−８１２）。これによって染色体の機能の研究と遺
伝子操作に新しい時代が開かれた。
【０００４】酵母とは対照的に、高等真核生物（哺乳動
物など）は動原体の両側で境界を形成する反復ＤＮＡ配
列を含んでいる。ある種のタンパク質、特に動物の染色
体中のタンパク質と相互作用するこの高度に反復的なＤ
ＮＡは、動原体周辺に遺伝的に不活性な領域（ヘテロク
ロマチン）を作り出す。この中心周囲のヘテロクロマチ
ンはあらゆる選択マーカー遺伝子をかなりの距離に保
ち、それ故、反復ＤＮＡは染色体の”ウォーキング（ｗ
ａｌｋｉｎｇ）”による動原体配列の単離を妨げてい
る。
物など）は動原体の両側で境界を形成する反復ＤＮＡ配
列を含んでいる。ある種のタンパク質、特に動物の染色
体中のタンパク質と相互作用するこの高度に反復的なＤ
ＮＡは、動原体周辺に遺伝的に不活性な領域（ヘテロク
ロマチン）を作り出す。この中心周囲のヘテロクロマチ
ンはあらゆる選択マーカー遺伝子をかなりの距離に保
ち、それ故、反復ＤＮＡは染色体の”ウォーキング（ｗ
ａｌｋｉｎｇ）”による動原体配列の単離を妨げてい
る。
【０００５】かくして、哺乳動物の人工染色体作成の要
求が当業界に存在する。このような染色体を使用すれ
ば、挿入変異の付随的な創出、導入されるＤＮＡの大き
さによる制限、及びプラスミドベクターの不完全な分離
などを含む、哺乳動物細胞に遺伝子を導入するための現
存の手法に固有な諸問題を克服することができる。
求が当業界に存在する。このような染色体を使用すれ
ば、挿入変異の付随的な創出、導入されるＤＮＡの大き
さによる制限、及びプラスミドベクターの不完全な分離
などを含む、哺乳動物細胞に遺伝子を導入するための現
存の手法に固有な諸問題を克服することができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、哺乳
動物の人工染色体の材料として使用できる細胞系を提供
することにある。
動物の人工染色体の材料として使用できる細胞系を提供
することにある。
【０００７】本発明の他の目的は、ヒトＤＮＡ配列を含
む機能的動原体からなる細胞系を作成する方法を提供す
ることにあり、ここで動原体は染色体上に存在し、該染
色体のすべての動原体は優性選択マーカーに結合したヒ
ト配列からなる。
む機能的動原体からなる細胞系を作成する方法を提供す
ることにあり、ここで動原体は染色体上に存在し、該染
色体のすべての動原体は優性選択マーカーに結合したヒ
ト配列からなる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】ここに記載した、またそ
の他の目的は以下に記載する１又はそれ以上の態様によ
って提供される。
の他の目的は以下に記載する１又はそれ以上の態様によ
って提供される。
【０００９】本発明の１態様においては、ヒトＤＮＡ配
列を含む機能的動原体からなる非ヒト細胞系が提供さ
れ、ここで該動原体は染色体上に存在し、かつ該染色体
のすべての動原体は優性選択マーカーに結合したヒト配
列からなる。
列を含む機能的動原体からなる非ヒト細胞系が提供さ
れ、ここで該動原体は染色体上に存在し、かつ該染色体
のすべての動原体は優性選択マーカーに結合したヒト配
列からなる。
【００１０】他の態様においては、ヒトＤＮＡを含む機
能的動原体からなる細胞系を作成する方法が提供され、
ここで動原体は染色体上に存在し、かつ該染色体のすべ
ての動原体は優性選択マーカーに結合したヒト配列から
なっており、この方法は、ヨーロピアン・コレクション
・オブ・アニマル・セル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）に
寄託番号ｎｏ．９００５１００１で寄託された細胞系の
細胞を、優性選択マーカーのための選択剤を含む培地中
で成長させ、ここで該選択剤は細胞の５０％を殺す量の
１０倍以上で培地中に存在し；該培地中で生存する細胞
を選択し；生存細胞又はその子孫から二動原体染色体を
欠いている細胞をスクリーニングする、ことからなる。
能的動原体からなる細胞系を作成する方法が提供され、
ここで動原体は染色体上に存在し、かつ該染色体のすべ
ての動原体は優性選択マーカーに結合したヒト配列から
なっており、この方法は、ヨーロピアン・コレクション
・オブ・アニマル・セル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）に
寄託番号ｎｏ．９００５１００１で寄託された細胞系の
細胞を、優性選択マーカーのための選択剤を含む培地中
で成長させ、ここで該選択剤は細胞の５０％を殺す量の
１０倍以上で培地中に存在し；該培地中で生存する細胞
を選択し；生存細胞又はその子孫から二動原体染色体を
欠いている細胞をスクリーニングする、ことからなる。
【００１１】本発明のさらに他の態様においては、ヒト
ＤＮＡ配列からなる機能的動原体からなる細胞系を作成
する方法が提供され、ここで動原体は染色体上に存在
し、かつ該染色体のすべての動原体は優性選択マーカー
に結合したヒト配列からなっており、この方法は、ヨー
ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カル
チャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号ｎｏ．９００５１００
１で寄託された細胞系の細胞を、第２の哺乳動物種の細
胞と融合させて融合細胞ハイブリッドを形成し；融合細
胞ハイブリッド又はその子孫から二動原体染色体を欠い
ているはいるが、ヒトＤＮＡからなる動原体を含む細胞
をスクリーニングする、ことからなる。
ＤＮＡ配列からなる機能的動原体からなる細胞系を作成
する方法が提供され、ここで動原体は染色体上に存在
し、かつ該染色体のすべての動原体は優性選択マーカー
に結合したヒト配列からなっており、この方法は、ヨー
ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カル
チャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号ｎｏ．９００５１００
１で寄託された細胞系の細胞を、第２の哺乳動物種の細
胞と融合させて融合細胞ハイブリッドを形成し；融合細
胞ハイブリッド又はその子孫から二動原体染色体を欠い
ているはいるが、ヒトＤＮＡからなる動原体を含む細胞
をスクリーニングする、ことからなる。
【００１２】これらの態様及びその他の態様については
以下にさらに詳しく説明する。かくして本発明は哺乳動
物の人工染色体として使用し得る細胞系を当業界に提供
する。人工染色体は細胞系中で安定に維持され、所望の
遺伝的要素のためのベクターとして用いるときに単離で
きる。
以下にさらに詳しく説明する。かくして本発明は哺乳動
物の人工染色体として使用し得る細胞系を当業界に提供
する。人工染色体は細胞系中で安定に維持され、所望の
遺伝的要素のためのベクターとして用いるときに単離で
きる。
【００１３】
【詳細な説明】一方の動原体がヒトＤＮＡ断片を含有す
る二動原体の染色体を有する細胞系を処理して、他の哺
乳動物染色体から離れている染色体上にヒトＤＮＡを有
する動原体を単離することができることは、本発明にお
いて見いだされた。このことは、ヒトＤＮＡを含有する
動原体が機能的動原体である、ことを結論として示して
いる。
る二動原体の染色体を有する細胞系を処理して、他の哺
乳動物染色体から離れている染色体上にヒトＤＮＡを有
する動原体を単離することができることは、本発明にお
いて見いだされた。このことは、ヒトＤＮＡを含有する
動原体が機能的動原体である、ことを結論として示して
いる。
【００１４】ヒトＤＮＡを有する機能的動原体は、ヨー
ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カル
チャー（ＥＣＡＣＣ）、英国、ポートンダウンに、ブダ
ペスト条約に基づく条件で寄託番号９００５１００１
（またＥＣ３／７としても知られている）として寄託さ
れた細胞系から得られる。この細胞系は、一方の動原体
がヒトＤＮＡ配列を含有している二動原体染色体を有す
るマウス細胞系である。この細胞系から単離できる動原
体は優性な選択マーカーである、Ｇ４１８（シグマ社）
に対する耐性を与えるアミノグリコシドー３’−ホスホ
トランスフェラーゼーＩＩに結合されている。細胞系Ｅ
Ｃ３／７は比較的不均質であり、二動原体（８５％）又
はミニクロモソーム（１０％）の何れかを有する。二動
原体染色体の動原体及びミニクロモソームは抗動原体抗
体による免疫染色では、正常なマウス動原体と区別でき
なかった。ミニクロモソームを持つ細胞は１回の細胞ク
ローニングでは安定にクローニングできなかった。本発
明以前には、ミニクロモソームは安定な複製を行うこと
ができなかった。本発明は、クローニングされたヒトＤ
ＮＡからなる動原体のみを含有する染色体を、安定に複
製する誘導細胞系を与える。
ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カル
チャー（ＥＣＡＣＣ）、英国、ポートンダウンに、ブダ
ペスト条約に基づく条件で寄託番号９００５１００１
（またＥＣ３／７としても知られている）として寄託さ
れた細胞系から得られる。この細胞系は、一方の動原体
がヒトＤＮＡ配列を含有している二動原体染色体を有す
るマウス細胞系である。この細胞系から単離できる動原
体は優性な選択マーカーである、Ｇ４１８（シグマ社）
に対する耐性を与えるアミノグリコシドー３’−ホスホ
トランスフェラーゼーＩＩに結合されている。細胞系Ｅ
Ｃ３／７は比較的不均質であり、二動原体（８５％）又
はミニクロモソーム（１０％）の何れかを有する。二動
原体染色体の動原体及びミニクロモソームは抗動原体抗
体による免疫染色では、正常なマウス動原体と区別でき
なかった。ミニクロモソームを持つ細胞は１回の細胞ク
ローニングでは安定にクローニングできなかった。本発
明以前には、ミニクロモソームは安定な複製を行うこと
ができなかった。本発明は、クローニングされたヒトＤ
ＮＡからなる動原体のみを含有する染色体を、安定に複
製する誘導細胞系を与える。
【００１５】本発明により、２つのこのような誘導細胞
が提供される。１つの誘導細胞はＥＣ３／７とチャイニ
ーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とを融合すること
により生成されたマウス／ハムスター融合細胞である。
発明者は融合細胞系の生成の際又は後に、ヒト由来動原
体の増幅を生じることを見いだした。げっ歯類動物の染
色体のサイズであるにもかかわらず、増幅により、純粋
なげっ歯類動物のものではない染色体を有する染色体を
生じた。増幅された動原体（以下、λｎｅｏと言う）は
大部分の細胞において７倍存在した（表Ｉ）。増幅され
た動原体のうちのただ１つだけが細胞内において機能的
であると思われる。
が提供される。１つの誘導細胞はＥＣ３／７とチャイニ
ーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とを融合すること
により生成されたマウス／ハムスター融合細胞である。
発明者は融合細胞系の生成の際又は後に、ヒト由来動原
体の増幅を生じることを見いだした。げっ歯類動物の染
色体のサイズであるにもかかわらず、増幅により、純粋
なげっ歯類動物のものではない染色体を有する染色体を
生じた。増幅された動原体（以下、λｎｅｏと言う）は
大部分の細胞において７倍存在した（表Ｉ）。増幅され
た動原体のうちのただ１つだけが細胞内において機能的
であると思われる。
【００１６】第２の誘導細胞は、ＥＣ３／７から誘導さ
れたヒトＤＮＡ含有動原体からなる安定なミニクロモソ
ームを有する。ミニクロモソームは細胞系内の最も小さ
い染色体の半分以下のサイズである。安定なミニクロモ
ソームは高濃度の選択試薬中で、ＥＣ３／７のような二
動原体染色体含有細胞を生育させることにより生成でき
る。この選択試薬は結合された配列と共に選択マーカー
の増幅を誘導するものである。例えば、もしＧ４１８の
ような抗生物質の１０μｇ／ｍｌが致死量であるとすれ
ば（即ち、１０6個の細胞の３週間の生存を阻止す
る）、増幅を選択するのに４００μｇ／ｍｌの濃度を使
用できる。一般に、１０6個の細胞を殺す量の少なくと
も１０倍、好ましくは２０−４０倍が望ましい。４００
μｇ／ｍｌのＧ４１８におけるＥＣ３／７細胞の選択に
よれば、二動原体染色体よりも、むしろ安定なミニクロ
モソームを持つ細胞が生成される。二動原体染色体の損
失に関するスクリーニングは、抗動原体抗体による免疫
染色と共に、標準的な細胞遺伝学的手法によって実施で
きる。本発明によれば、細胞系の少なくとも９０％、好
ましくは９５％の細胞が染色体を保持する場合に、染色
体は安定に維持される。安定性は選択試薬の存在におい
て測定される。これらの染色体は選択試薬が存在しない
でも維持されることが好ましい。また、安定な染色体は
細胞培養の間にもその構造を維持し、染色体間及び染色
体内の転移を生じない。
れたヒトＤＮＡ含有動原体からなる安定なミニクロモソ
ームを有する。ミニクロモソームは細胞系内の最も小さ
い染色体の半分以下のサイズである。安定なミニクロモ
ソームは高濃度の選択試薬中で、ＥＣ３／７のような二
動原体染色体含有細胞を生育させることにより生成でき
る。この選択試薬は結合された配列と共に選択マーカー
の増幅を誘導するものである。例えば、もしＧ４１８の
ような抗生物質の１０μｇ／ｍｌが致死量であるとすれ
ば（即ち、１０6個の細胞の３週間の生存を阻止す
る）、増幅を選択するのに４００μｇ／ｍｌの濃度を使
用できる。一般に、１０6個の細胞を殺す量の少なくと
も１０倍、好ましくは２０−４０倍が望ましい。４００
μｇ／ｍｌのＧ４１８におけるＥＣ３／７細胞の選択に
よれば、二動原体染色体よりも、むしろ安定なミニクロ
モソームを持つ細胞が生成される。二動原体染色体の損
失に関するスクリーニングは、抗動原体抗体による免疫
染色と共に、標準的な細胞遺伝学的手法によって実施で
きる。本発明によれば、細胞系の少なくとも９０％、好
ましくは９５％の細胞が染色体を保持する場合に、染色
体は安定に維持される。安定性は選択試薬の存在におい
て測定される。これらの染色体は選択試薬が存在しない
でも維持されることが好ましい。また、安定な染色体は
細胞培養の間にもその構造を維持し、染色体間及び染色
体内の転移を生じない。
【００１７】ミニクロモソームは、安定にこれを保持す
る細胞系の分裂細胞から物理的に単離される。ミニクロ
モソームは、分画遠心次いで蔗糖勾配沈殿により、部分
的に精製できる。そのような方法により、約１０−２０
％ミニクロモソームの調製物を生じる。
る細胞系の分裂細胞から物理的に単離される。ミニクロ
モソームは、分画遠心次いで蔗糖勾配沈殿により、部分
的に精製できる。そのような方法により、約１０−２０
％ミニクロモソームの調製物を生じる。
【００１８】ミニクロモソーム（又はそれらの増幅誘導
体）は染色体が媒介する遺伝子転移におけるベクターと
して使用できる。哺乳動物細胞は、リン酸カルシウム、
リポソーム、エレクトロポレーション、又は従来技術で
知られているどのような手法を用いても、ミニクロモソ
ーム又は遺伝子工学的に処理されたミニクロモソームで
形質転換できる。ミニクロモソームは卵、胚又は培養細
胞に微量注射するのにも使用できる。ミニクロモソーム
含有細胞はヒト幹細胞又は骨髄細胞と融合するのにも使
用できる。その他の応用は当業者にとって、明らかであ
ろう。
体）は染色体が媒介する遺伝子転移におけるベクターと
して使用できる。哺乳動物細胞は、リン酸カルシウム、
リポソーム、エレクトロポレーション、又は従来技術で
知られているどのような手法を用いても、ミニクロモソ
ーム又は遺伝子工学的に処理されたミニクロモソームで
形質転換できる。ミニクロモソームは卵、胚又は培養細
胞に微量注射するのにも使用できる。ミニクロモソーム
含有細胞はヒト幹細胞又は骨髄細胞と融合するのにも使
用できる。その他の応用は当業者にとって、明らかであ
ろう。
【００１９】以下の実施例は本発明を記載された具体的
態様に限定するものでなく、発明を実施できる特定の方
法を具体的に説明するために示される。
態様に限定するものでなく、発明を実施できる特定の方
法を具体的に説明するために示される。
【００２０】実施例１ この実施例ではＥＣ３／７細胞系の安定性について記載
する。
する。
【００２１】単細胞由来の４６個の独立したサブクロー
ンを単離し分析した。各々のサブクローンは二動原体染
色体を有していた。ミニクロモソーム含有細胞の割合は
サブクローンにより異なり、２％ないし３０％の間であ
った。本発明者は、専らミニクロモソーム中に付加的な
動原体を有するサブクローンを単細胞サブクローニング
によって単離することはできなかった。この結果は、ミ
ニクロモソームが不安定であり二動原体染色体の規則的
な切断による産物であることを示唆している。ＥＣ３／
７細胞系をＧ４１８の高濃度（致死量の４０倍）で３５
０世代についてサブクローニングすることによって、ミ
ニクロモソーム上にのみ特別の動原体を有する単細胞由
来の安定な二つの細胞系（ＥＣ３／７Ｃ５及びＥＣ３／
７Ｃ６）を作った。抗動原体抗体を用いた間接的な蛍光
抗体法とそれに引き続くインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーション実験によって、ミニクロモソームは二動原体染
色体に由来することが立証された。双方の細胞系におい
て、大部分のハイブリダイゼーション・シグナルはミニ
クロモソーム上に見いだされたが、ＣＭ８又はラムダ配
列の痕跡は一動原体染色体の末端において検出された。
ＥＣ３／７Ｃ５及びＥＣ３／７Ｃ６細胞系（それぞれ１
４０及び１２８個の分裂中期の細胞）において、二動原
体染色体は一つも見られなく、ミニクロモソームはそれ
ぞれ９７．２％及び９８．１％の細胞において検出され
た。そのミニクロモソームは１５０細胞世代以上にわた
って維持された。テロメアＤＮＡ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ
ＤＮＡ）の多数のコピーが、インサイチュ・ハイブリ
ダイゼーションによって二動原体染色体のマーカー動原
体領域において検出された。このことはマウスのテロメ
ア配列が外来のＤＮＡ配列で共働増幅（ｃｏａｍｐｌｉ
ｆｙ）されたことを示唆している。これらの安定なミニ
クロモソーム保持細胞系は、ヒトの配列を含有する特別
な動原体が機能しており、そのミニクロモソームを維持
する能力があるという直接的な証拠を提供する。
ンを単離し分析した。各々のサブクローンは二動原体染
色体を有していた。ミニクロモソーム含有細胞の割合は
サブクローンにより異なり、２％ないし３０％の間であ
った。本発明者は、専らミニクロモソーム中に付加的な
動原体を有するサブクローンを単細胞サブクローニング
によって単離することはできなかった。この結果は、ミ
ニクロモソームが不安定であり二動原体染色体の規則的
な切断による産物であることを示唆している。ＥＣ３／
７細胞系をＧ４１８の高濃度（致死量の４０倍）で３５
０世代についてサブクローニングすることによって、ミ
ニクロモソーム上にのみ特別の動原体を有する単細胞由
来の安定な二つの細胞系（ＥＣ３／７Ｃ５及びＥＣ３／
７Ｃ６）を作った。抗動原体抗体を用いた間接的な蛍光
抗体法とそれに引き続くインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーション実験によって、ミニクロモソームは二動原体染
色体に由来することが立証された。双方の細胞系におい
て、大部分のハイブリダイゼーション・シグナルはミニ
クロモソーム上に見いだされたが、ＣＭ８又はラムダ配
列の痕跡は一動原体染色体の末端において検出された。
ＥＣ３／７Ｃ５及びＥＣ３／７Ｃ６細胞系（それぞれ１
４０及び１２８個の分裂中期の細胞）において、二動原
体染色体は一つも見られなく、ミニクロモソームはそれ
ぞれ９７．２％及び９８．１％の細胞において検出され
た。そのミニクロモソームは１５０細胞世代以上にわた
って維持された。テロメアＤＮＡ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ
ＤＮＡ）の多数のコピーが、インサイチュ・ハイブリ
ダイゼーションによって二動原体染色体のマーカー動原
体領域において検出された。このことはマウスのテロメ
ア配列が外来のＤＮＡ配列で共働増幅（ｃｏａｍｐｌｉ
ｆｙ）されたことを示唆している。これらの安定なミニ
クロモソーム保持細胞系は、ヒトの配列を含有する特別
な動原体が機能しており、そのミニクロモソームを維持
する能力があるという直接的な証拠を提供する。
【００２２】非選択的培地で４６日間培養されたＥＣ３
／７細胞（１０３個の分裂中期の細胞）の免疫染色（ｉ
ｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）による予備的分析によっ
て、８０．６％の細胞が二動原体染色体（６０．２％）
又はミニクロモソーム（２０．４％）のいずれかを含有
することが示された。続いてビオチン標識プローブを用
いて行ったインサイチュ・ハイブリダイゼーションによ
って、付加された動原体中に“外来の”ＤＮＡが存在す
ることが立証された。これらの結果は、非選択的条件下
でこの培養期間において、付加された動原体の重大な欠
失も不活性化も起こらなかったことを示唆している。
／７細胞（１０３個の分裂中期の細胞）の免疫染色（ｉ
ｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）による予備的分析によっ
て、８０．６％の細胞が二動原体染色体（６０．２％）
又はミニクロモソーム（２０．４％）のいずれかを含有
することが示された。続いてビオチン標識プローブを用
いて行ったインサイチュ・ハイブリダイゼーションによ
って、付加された動原体中に“外来の”ＤＮＡが存在す
ることが立証された。これらの結果は、非選択的条件下
でこの培養期間において、付加された動原体の重大な欠
失も不活性化も起こらなかったことを示唆している。
【００２３】実施例２ この実施例ではＥＣ３／７マウス細胞の種間（ｉｎｔｅ
ｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）融合とヒトの配列を有する安定
な染色体の形成を立証する。
ｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）融合とヒトの配列を有する安定
な染色体の形成を立証する。
【００２４】１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び４００μ
ｇのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＳＩＧＭＡ社）を
加えたＦ１２培地中でＥＣ３／７マウス繊維芽細胞（ｆ
ｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞系を単層として培養した。チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ Ｋ−２０）を
１０％ＦＣＳ加Ｆ１２培地中で培養した。ポリエチレン
グリコールを用いて１．８×１０7のＣＨＯ細胞と２．
３×１０6のＥＣ３／７細胞を融合させた（Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎ，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．
２，ｐｐ．１６５−１７６（１９７６））．１０％ＦＣ
Ｓ及び４００μｇのＧ４１８を含むＦ１２ＨＡＴ培地
（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｎ．Ｃ．Ｉ．Ｍｏｎｏｇｒ．，
ｖｏｌ．７，ｐｐ．７５−８９（１９８２））中でハイ
ブリッドが選択された。
ｇのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＳＩＧＭＡ社）を
加えたＦ１２培地中でＥＣ３／７マウス繊維芽細胞（ｆ
ｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞系を単層として培養した。チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ Ｋ−２０）を
１０％ＦＣＳ加Ｆ１２培地中で培養した。ポリエチレン
グリコールを用いて１．８×１０7のＣＨＯ細胞と２．
３×１０6のＥＣ３／７細胞を融合させた（Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎ，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．
２，ｐｐ．１６５−１７６（１９７６））．１０％ＦＣ
Ｓ及び４００μｇのＧ４１８を含むＦ１２ＨＡＴ培地
（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｎ．Ｃ．Ｉ．Ｍｏｎｏｇｒ．，
ｖｏｌ．７，ｐｐ．７５−８９（１９８２））中でハイ
ブリッドが選択された。
【００２５】ＬＭＴＫ ＥＣ３／７マウス細胞とＣＨＯ
Ｋ−２０ハムスター細胞との融合によって幾つかのハ
イブリッド細胞系が得られた。ＥＣ３／７細胞は、大多
数の細胞において二動原体染色体又は頻度はより少ない
（１０％）がミニクロモソーム上で優性な選択可能遺伝
子（ｎｅｏ）と結合している機能的なマーカー動原体を
有していた。ハイブリッドは４００μｇのＧ４１８（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＳＩＧＭＡ社）を含むＨＡＴ培地上
で選択され維持された。独立したハイブリッド系の細胞
学的分析の間に、上述したヒトの抗動原体血清（ＬＵ８
５１）を用いた間接的な蛍光抗体法とそれに続くビオチ
ン標識ラムダＤＮＡプローブを用いたインサイチュ・ハ
イブリダイゼーションによって、ｎｅｏ結合マーカーを
モニターした。９個のハイブリッドクローンが特別のマ
ーカー動原体を有する二動原体染色体を保持していた。
一つのハイブリッド系（ＫＥ１ ２／４）においては、
１０7細胞期（融合の６５日後）に、マーカー動原体が
二動原体染色体から離脱して新たな染色体が形成され
た。その染色体は平均的なマウス染色体の大きさを有し
ていた（１図）。ビオチン標識ラムダＤＮＡプローブを
用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーションは、新た
に形成された（λｎｅｏ）染色体上に極度のハイブリダ
イゼーション・シグナルを示した（１Ｂ図）。λｎｅｏ
染色体上のインサイチュ・ハイブリダイゼーションの結
果は、この染色体が二動原体染色体のマーカー動原体領
域（ｎｅｏ配列を保持している領域）から得られたもの
であることを明確に表している。
Ｋ−２０ハムスター細胞との融合によって幾つかのハ
イブリッド細胞系が得られた。ＥＣ３／７細胞は、大多
数の細胞において二動原体染色体又は頻度はより少ない
（１０％）がミニクロモソーム上で優性な選択可能遺伝
子（ｎｅｏ）と結合している機能的なマーカー動原体を
有していた。ハイブリッドは４００μｇのＧ４１８（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＳＩＧＭＡ社）を含むＨＡＴ培地上
で選択され維持された。独立したハイブリッド系の細胞
学的分析の間に、上述したヒトの抗動原体血清（ＬＵ８
５１）を用いた間接的な蛍光抗体法とそれに続くビオチ
ン標識ラムダＤＮＡプローブを用いたインサイチュ・ハ
イブリダイゼーションによって、ｎｅｏ結合マーカーを
モニターした。９個のハイブリッドクローンが特別のマ
ーカー動原体を有する二動原体染色体を保持していた。
一つのハイブリッド系（ＫＥ１ ２／４）においては、
１０7細胞期（融合の６５日後）に、マーカー動原体が
二動原体染色体から離脱して新たな染色体が形成され
た。その染色体は平均的なマウス染色体の大きさを有し
ていた（１図）。ビオチン標識ラムダＤＮＡプローブを
用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーションは、新た
に形成された（λｎｅｏ）染色体上に極度のハイブリダ
イゼーション・シグナルを示した（１Ｂ図）。λｎｅｏ
染色体上のインサイチュ・ハイブリダイゼーションの結
果は、この染色体が二動原体染色体のマーカー動原体領
域（ｎｅｏ配列を保持している領域）から得られたもの
であることを明確に表している。
【００２６】λｎｅｏ染色体はこの細胞系において全く
安定であることが見いだされた。培養後６５日たって
（１０7細胞期）、分析された９６個の分裂中期の細胞
のうち９２個がλｎｅｏ染色体の存在を示した。三つの
分裂中期の細胞はλｎｅｏ染色体セグメントの転移（ｔ
ｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を示し、一の分裂中期の細
胞においてはこの染色体は全く検出されなかった。培養
後１１０日たつと、９８％を越える細胞（１６７個の分
裂中期の細胞を分析）がλｎｅｏ染色体を保持してい
た。ＫＥ１ ２／４細胞を更に４３日間（＞５０世代）
非選択的な条件下（ＨＡＴ-，Ｇ４１８-）で培養したと
ころ、８４．４％の細胞（９６個の分裂中期の細胞を分
析）がλｎｅｏ染色体を持ち続けた。
安定であることが見いだされた。培養後６５日たって
（１０7細胞期）、分析された９６個の分裂中期の細胞
のうち９２個がλｎｅｏ染色体の存在を示した。三つの
分裂中期の細胞はλｎｅｏ染色体セグメントの転移（ｔ
ｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を示し、一の分裂中期の細
胞においてはこの染色体は全く検出されなかった。培養
後１１０日たつと、９８％を越える細胞（１６７個の分
裂中期の細胞を分析）がλｎｅｏ染色体を保持してい
た。ＫＥ１ ２／４細胞を更に４３日間（＞５０世代）
非選択的な条件下（ＨＡＴ-，Ｇ４１８-）で培養したと
ころ、８４．４％の細胞（９６個の分裂中期の細胞を分
析）がλｎｅｏ染色体を持ち続けた。
【００２７】実施例３ 本実施例は、λｎｅｏ染色体の特徴について記述する。
【００２８】グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．４５６−４６７，１９７
３）により記載されたとおりに、ビオチン標識プローブ
を用いてインサイチュ・ハイブリダイゼーションを実施
した。二重インサイチュ・ハイブリダイゼーションを以
下のとおりに実施した。第一のハイブリダイゼーション
後、分裂中期の写真を撮り、カバースリップをはずして
スライドをＰＢＳで洗浄した。ぬれたスライドを７０％
ホルムアミド（ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ）／２×ＳＳＣ中
で７２℃において５分間変成し、二次ビオチン標識プロ
ーブを用いて標準的ハイブリダイゼーション法（グラハ
ム（Ｇｒａｈａｍ）、上記）を行った。インサイチュ・
ハイブリダイゼーション実験は、散在したｎｅｏの存在
（図１Ｂ）およびヒト（図１Ｈ）ＤＮＡ配列を示す。こ
の発見は、λｎｅｏ染色体が広範囲な増幅工程により形
成されたことを示唆する。慣用的な細胞学においても、
インサイチュ・ハイブリダイゼーションにおいても、Ｋ
Ｅ１ ２／４細胞系における染色体外構造は検出されな
かった。
ｏｇｙ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．４５６−４６７，１９７
３）により記載されたとおりに、ビオチン標識プローブ
を用いてインサイチュ・ハイブリダイゼーションを実施
した。二重インサイチュ・ハイブリダイゼーションを以
下のとおりに実施した。第一のハイブリダイゼーション
後、分裂中期の写真を撮り、カバースリップをはずして
スライドをＰＢＳで洗浄した。ぬれたスライドを７０％
ホルムアミド（ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ）／２×ＳＳＣ中
で７２℃において５分間変成し、二次ビオチン標識プロ
ーブを用いて標準的ハイブリダイゼーション法（グラハ
ム（Ｇｒａｈａｍ）、上記）を行った。インサイチュ・
ハイブリダイゼーション実験は、散在したｎｅｏの存在
（図１Ｂ）およびヒト（図１Ｈ）ＤＮＡ配列を示す。こ
の発見は、λｎｅｏ染色体が広範囲な増幅工程により形
成されたことを示唆する。慣用的な細胞学においても、
インサイチュ・ハイブリダイゼーションにおいても、Ｋ
Ｅ１ ２／４細胞系における染色体外構造は検出されな
かった。
【００２９】テロメアは染色体の安定性に必要であると
考えられるので、テロメア配列がλｎｅｏ染色体内に存
在するのか否かという疑問が持ち上がった。この疑問に
答えるために、テロメア反復配列（ＴＴＡＧＧＧ）nを
用いてインサイチュ・ハイブリダイゼーションが実施さ
れたが、該反復配列は脊椎動物において共通である（メ
イネ（Ｍｅｙｎｅ）ら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，ｖｏ
ｌ．９９，ｐｐ．３−１０，１９９０）。テロメア配列
とハイブリダイズする配列が、λｎｅｏ染色体全体を通
して散在することが見いだされた（図１Ｄ）。さらに、
ＴＴＡＧＧＧ反復配列に富んだ幾つかのハムスター染色
体の中心周囲領域にわたって強いラベリングが検出され
た（メイネ（Ｍｅｙｎｅ）ら、上記）。”親の”ＥＣ３
／７分裂中期におけるハイブリダイゼーションにより、
ＴＴＡＧＧＧ反復配列の起点（ｏｒｉｇｉｎ）が明らか
にされた。マーカー動原体が位置する、二動原体染色体
の完全に末端の動原体領域が、ビオチン標識テロメアプ
ローブとの強いハイブリダイゼーションシグナルを示し
た（図１Ｅ）。このことは、二動原体染色体のマーカー
動原体領域が形成されたときの第一の増幅の間、ヒト
（λＣＭ８）とｎｅｏ配列（λｇｔＷＥＳｎｅｏ）でテ
ロメア配列が共に増幅することを示唆している。
考えられるので、テロメア配列がλｎｅｏ染色体内に存
在するのか否かという疑問が持ち上がった。この疑問に
答えるために、テロメア反復配列（ＴＴＡＧＧＧ）nを
用いてインサイチュ・ハイブリダイゼーションが実施さ
れたが、該反復配列は脊椎動物において共通である（メ
イネ（Ｍｅｙｎｅ）ら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，ｖｏ
ｌ．９９，ｐｐ．３−１０，１９９０）。テロメア配列
とハイブリダイズする配列が、λｎｅｏ染色体全体を通
して散在することが見いだされた（図１Ｄ）。さらに、
ＴＴＡＧＧＧ反復配列に富んだ幾つかのハムスター染色
体の中心周囲領域にわたって強いラベリングが検出され
た（メイネ（Ｍｅｙｎｅ）ら、上記）。”親の”ＥＣ３
／７分裂中期におけるハイブリダイゼーションにより、
ＴＴＡＧＧＧ反復配列の起点（ｏｒｉｇｉｎ）が明らか
にされた。マーカー動原体が位置する、二動原体染色体
の完全に末端の動原体領域が、ビオチン標識テロメアプ
ローブとの強いハイブリダイゼーションシグナルを示し
た（図１Ｅ）。このことは、二動原体染色体のマーカー
動原体領域が形成されたときの第一の増幅の間、ヒト
（λＣＭ８）とｎｅｏ配列（λｇｔＷＥＳｎｅｏ）でテ
ロメア配列が共に増幅することを示唆している。
【００３０】他の反復配列がλｎｅｏ染色体の形成に関
与しているか否かを試験するために、ビオチン標識され
た全マウスＤＮＡプローブおよび全ハムスターＤＮＡプ
ローブをインサイチュ・ハイブリダイゼーションに使用
した。全ハムスターＤＮＡプローブを用いた場合、λｎ
ｅｏ染色体上にシグナルは見いだされなかった。マウス
プローブを用いると、マウス染色体の中心周囲領域が強
いハイブリダイゼーションを示し、そして明確なハイブ
リダイゼーションパターンがλｎｅｏ染色体上で検出さ
れた。一定の細いバンドがλｎｅｏ染色体に沿って観察
された（図１Ｆ）。これらの結果が示すことは、二動原
体染色体からマーカー動原体を分離する分断が、隣接す
るマウス動原体の中心周囲領域において生じたことであ
る。λｎｅｏ染色体の形成に通じる増幅工程の間、この
反復マウスＤＮＡは大きいアンプリコン（増幅されたユ
ニット）（＞１０Ｍｂ）と近似した。
与しているか否かを試験するために、ビオチン標識され
た全マウスＤＮＡプローブおよび全ハムスターＤＮＡプ
ローブをインサイチュ・ハイブリダイゼーションに使用
した。全ハムスターＤＮＡプローブを用いた場合、λｎ
ｅｏ染色体上にシグナルは見いだされなかった。マウス
プローブを用いると、マウス染色体の中心周囲領域が強
いハイブリダイゼーションを示し、そして明確なハイブ
リダイゼーションパターンがλｎｅｏ染色体上で検出さ
れた。一定の細いバンドがλｎｅｏ染色体に沿って観察
された（図１Ｆ）。これらの結果が示すことは、二動原
体染色体からマーカー動原体を分離する分断が、隣接す
るマウス動原体の中心周囲領域において生じたことであ
る。λｎｅｏ染色体の形成に通じる増幅工程の間、この
反復マウスＤＮＡは大きいアンプリコン（増幅されたユ
ニット）（＞１０Ｍｂ）と近似した。
【００３１】マウス線維芽細胞をＤＮＡ結合性染色剤ヘ
キスト ３３２５８の存在下に培養すると、分裂中期染
色体の中心周囲のヘテロクロマチンの目立った不完全凝
縮（ｕｎｄｅｒｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）が生じる
（ヒルウイグ（Ｈｉｌｗｉｇ）ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８１，ｐｐ．４７４−４７７（１９
７３））。この技術をＫＥ１ ２／４細胞系に使用する
ことにより、我々はλｎｅｏ染色体の縦の分割を観察す
ることを期待した。これが、不完全凝縮した染色体にお
いて生じたインサイチュ・ハイブリダイゼーションによ
り明らかにされたよりもさらに詳細な染色体構造を提供
するものであることを、我々は期待した（図１Ｆ）。
キスト ３３２５８の存在下に培養すると、分裂中期染
色体の中心周囲のヘテロクロマチンの目立った不完全凝
縮（ｕｎｄｅｒｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）が生じる
（ヒルウイグ（Ｈｉｌｗｉｇ）ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８１，ｐｐ．４７４−４７７（１９
７３））。この技術をＫＥ１ ２／４細胞系に使用する
ことにより、我々はλｎｅｏ染色体の縦の分割を観察す
ることを期待した。これが、不完全凝縮した染色体にお
いて生じたインサイチュ・ハイブリダイゼーションによ
り明らかにされたよりもさらに詳細な染色体構造を提供
するものであることを、我々は期待した（図１Ｆ）。
【００３２】ヘキスト染色剤３３２５８を処理されたλ
ｎｅｏ染色体は、マウス反復配列中のハイブリダイズす
るバンドに対応した領域の一定の不完全凝縮を示したが
（図１Ｇ）、このことは、これらが中心周囲の起点（ｏ
ｒｉｇｉｎ）を有することを示唆する。マウス中心周囲
のヘテロクロマチンの主要ＤＮＡ成分が主要なサテライ
トＤＮＡであることは前に報告されている（ワング（Ｗ
ｏｎｇ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，ｖｏ
ｌ．１６，ｐｐ．１１６４５−１１６６１（１９８
８））。ビオチン標識マウス主要サテライトプローブ
（ドクター、ラトナー（Ｊ．Ｂ．Ｒａｔｔｎｅｒ）によ
り供与された）を用いたインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーションパターンは、全マウスＤＮＡプローブにより検
出されたパターンと区別のつかないものであり（図１
Ｆ）、このことはアンプリコンのへりがマウス主要サテ
ライトＤＮＡに富んでおり、マウス中心周囲ヘテロクロ
マチンとしてふるまうことを示している。
ｎｅｏ染色体は、マウス反復配列中のハイブリダイズす
るバンドに対応した領域の一定の不完全凝縮を示したが
（図１Ｇ）、このことは、これらが中心周囲の起点（ｏ
ｒｉｇｉｎ）を有することを示唆する。マウス中心周囲
のヘテロクロマチンの主要ＤＮＡ成分が主要なサテライ
トＤＮＡであることは前に報告されている（ワング（Ｗ
ｏｎｇ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，ｖｏ
ｌ．１６，ｐｐ．１１６４５−１１６６１（１９８
８））。ビオチン標識マウス主要サテライトプローブ
（ドクター、ラトナー（Ｊ．Ｂ．Ｒａｔｔｎｅｒ）によ
り供与された）を用いたインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーションパターンは、全マウスＤＮＡプローブにより検
出されたパターンと区別のつかないものであり（図１
Ｆ）、このことはアンプリコンのへりがマウス主要サテ
ライトＤＮＡに富んでおり、マウス中心周囲ヘテロクロ
マチンとしてふるまうことを示している。
【００３３】ヘキスト染色剤３３２５８により誘導され
たλｎｅｏ染色体のある領域の不完全凝縮によって、こ
の染色体の詳細な構造上の特徴を明らかにすることもま
た可能となった。
たλｎｅｏ染色体のある領域の不完全凝縮によって、こ
の染色体の詳細な構造上の特徴を明らかにすることもま
た可能となった。
【００３４】１．最初に細胞の増殖段階が１０7（６５
日培養）の時に検出されたアンプリコン数は、ある程度
の一致性を示していた。６５．６％の細胞において、ア
ンプリコン数は７であった。アンプリコン数におけるこ
の一致性は、１１０日培養後にわずかに増加しており
（分析した細胞分裂中期の細胞１５００個のうち７３．
２％）、非選択培養条件下において維持された（４３日
間）。２５４日培養後においては、アンプリコン数が７
であるλｎｅｏ染色体の数は８０％に達した（表１）。
日培養）の時に検出されたアンプリコン数は、ある程度
の一致性を示していた。６５．６％の細胞において、ア
ンプリコン数は７であった。アンプリコン数におけるこ
の一致性は、１１０日培養後にわずかに増加しており
（分析した細胞分裂中期の細胞１５００個のうち７３．
２％）、非選択培養条件下において維持された（４３日
間）。２５４日培養後においては、アンプリコン数が７
であるλｎｅｏ染色体の数は８０％に達した（表１）。
【００３５】２．ある特定のλｎｅｏ染色体のアンプリ
コンは、種々の大きさであったが、それぞれの細胞にお
いてはある特定のアンプリコンの大きさは一定に保たれ
ていた。この知見はλｎｅｏ染色体の「マッピング」を
可能にした。すなわち、２つの同様の大きさのブロック
（ａ及びｂ）と２つの大きなユニット（ｃ及びｄ）、及
び３つの小さなアンプリコン（ｅ、ｆ及びｇ）によって
染色体が完成する（図２Ａ）。
コンは、種々の大きさであったが、それぞれの細胞にお
いてはある特定のアンプリコンの大きさは一定に保たれ
ていた。この知見はλｎｅｏ染色体の「マッピング」を
可能にした。すなわち、２つの同様の大きさのブロック
（ａ及びｂ）と２つの大きなユニット（ｃ及びｄ）、及
び３つの小さなアンプリコン（ｅ、ｆ及びｇ）によって
染色体が完成する（図２Ａ）。
【００３６】３．アンプリコン中の少量のマウス大（ｍ
ａｊｏｒ）サテライト配列は、「２次圧縮（ｓｃ：ｓｅ
ｃｏｎｄａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ）」を生
成することができ、従って、よく広がり引き伸ばされた
染色体のより詳細な構造を可視化することができる。２
次圧縮によって、ｃ及びｄユニットは分割して同等でな
い部分となり、これらのアンプリコンは鏡像対称であっ
た（図２Ａ）。このことはアンプリコンｃがアンプリコ
ンｄに対して逆方向になっていることを示唆した。
ａｊｏｒ）サテライト配列は、「２次圧縮（ｓｃ：ｓｅ
ｃｏｎｄａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ）」を生
成することができ、従って、よく広がり引き伸ばされた
染色体のより詳細な構造を可視化することができる。２
次圧縮によって、ｃ及びｄユニットは分割して同等でな
い部分となり、これらのアンプリコンは鏡像対称であっ
た（図２Ａ）。このことはアンプリコンｃがアンプリコ
ンｄに対して逆方向になっていることを示唆した。
【００３７】４．抗動原体血清を用いた間接免疫蛍光法
によって、機能的動原体はアンプリコンａに存在するこ
とが示された。
によって、機能的動原体はアンプリコンａに存在するこ
とが示された。
【００３８】
【表１】 ２５４日培養後のλｎｅｏ染色体のアンプリコン数アンプリコン数 細胞数 ％ ３ １ ０.２７ ４ ２ ０.５３ ５ ９ ２.４０ ６ ７ ７.２０ ７ ３００ ８０.００ ８ １０ ２.６６ ９ ３ ０.８０ １０ ２ ０.５３ １１ １ ０.２７ １２ ０ ０.００ １３ １ ０.２７ 転移 １９ ５.０７ 合計 ３７５ １００.００ ヘキスト３３２５８で染色処理したＫＥＩ２／４の細胞
分裂中期の細胞を、カルボルフクシンで染色し、光学顕
微鏡で分析した。「転移（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏ
ｎ）」とは、λｎｅｏ染色体の全体又はその断片がマウ
ス又はチャイニーズハムスターの染色体に転移している
ことを示す。３９１個の細胞分裂中期の細胞中１６個に
おいて、λｎｅｏ染色体が見い出されなかった。
分裂中期の細胞を、カルボルフクシンで染色し、光学顕
微鏡で分析した。「転移（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏ
ｎ）」とは、λｎｅｏ染色体の全体又はその断片がマウ
ス又はチャイニーズハムスターの染色体に転移している
ことを示す。３９１個の細胞分裂中期の細胞中１６個に
おいて、λｎｅｏ染色体が見い出されなかった。
【００３９】５．ヘキスト染色処理及びカルボルフクシ
ン染色した細胞分裂中期の細胞数千個中、７個より少な
いか又は多いアンプリコンを有するλｎｅｏ染色体が多
く見いだされた。これらの染色体のほとんどが末端アン
プリコンｅ、ｆ及びｇを含んでいた（図２Ｂ）。免疫染
色およびヘキスト３３２５８処理した細胞分裂中期の細
胞を数百個分析したところ、動原体が末端以外に位置し
ているλｎｅｏ染色体は１つも見い出されなかった。こ
れらの観察は、λｎｅｏ染色体の伸長が染色体の腕にお
いて生じており、染色体の末端において生じるのではな
いことを示唆している。
ン染色した細胞分裂中期の細胞数千個中、７個より少な
いか又は多いアンプリコンを有するλｎｅｏ染色体が多
く見いだされた。これらの染色体のほとんどが末端アン
プリコンｅ、ｆ及びｇを含んでいた（図２Ｂ）。免疫染
色およびヘキスト３３２５８処理した細胞分裂中期の細
胞を数百個分析したところ、動原体が末端以外に位置し
ているλｎｅｏ染色体は１つも見い出されなかった。こ
れらの観察は、λｎｅｏ染色体の伸長が染色体の腕にお
いて生じており、染色体の末端において生じるのではな
いことを示唆している。
【００４０】６．約７５００個のλｎｅｏ染色体のうち
８個が姉妹染色分体間で異なるアンプリコン数を示して
いた（図２Ｃ）。しかし、すべての場合において両方の
染色分体に末端アンプリコンが存在していた。
８個が姉妹染色分体間で異なるアンプリコン数を示して
いた（図２Ｃ）。しかし、すべての場合において両方の
染色分体に末端アンプリコンが存在していた。
【００４１】７．ヘキスト染色処理したλｎｅｏ染色体
を、ヒト（ＣＭ８）ＤＮＡをプローブとしてインサイチ
ュ・ハイブリダイゼーションしたところ、不完全凝縮領
域は標識されないことが示された（図１Ｈ）。
を、ヒト（ＣＭ８）ＤＮＡをプローブとしてインサイチ
ュ・ハイブリダイゼーションしたところ、不完全凝縮領
域は標識されないことが示された（図１Ｈ）。
【００４２】近年、ワン（Ｗｏｎｇ）とラトナー（Ｒａ
ｔｔｎｅｒ）はマウスの小（ｍｉｎｏｒ）サテライトＤ
ＮＡがすべてのマウス染色体の動原体に特異的に位置し
ていることを示した（Ｗｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ｓ
ｕｐｒａ）。同じＤＮＡプローブを用いたところ、ＥＣ
３／７細胞の染色体の、マーカー動原体を除くすべての
動原体がハイブリダイズした。ＫＥＩ２／４細胞におい
ても同様の結果が見られた。マウス動原体をプローブと
したところ、動原体に強いハイブリダイゼーションが検
出されたが、λｎｅｏ染色体の動原体はハイブリダイズ
しなかった（図３Ｂ）。λｎｅｏ染色体を同定するため
に、二重インサイチュ・ハイブリダイゼーションを行っ
た。同じ染色体調製物についてλＤＮＡプローブを用い
て再びハイブリダイゼーションを行った（図３Ｃ）。
ｔｔｎｅｒ）はマウスの小（ｍｉｎｏｒ）サテライトＤ
ＮＡがすべてのマウス染色体の動原体に特異的に位置し
ていることを示した（Ｗｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ｓ
ｕｐｒａ）。同じＤＮＡプローブを用いたところ、ＥＣ
３／７細胞の染色体の、マーカー動原体を除くすべての
動原体がハイブリダイズした。ＫＥＩ２／４細胞におい
ても同様の結果が見られた。マウス動原体をプローブと
したところ、動原体に強いハイブリダイゼーションが検
出されたが、λｎｅｏ染色体の動原体はハイブリダイズ
しなかった（図３Ｂ）。λｎｅｏ染色体を同定するため
に、二重インサイチュ・ハイブリダイゼーションを行っ
た。同じ染色体調製物についてλＤＮＡプローブを用い
て再びハイブリダイゼーションを行った（図３Ｃ）。
【００４３】小サテライトＤＮＡプローブを５倍量
（２．８μｇ／ｍｌ）用いたところ、λｎｅｏ染色体に
おいてハイブリダイゼーションのバンドが見られ（図３
Ｅ、Ｆ）、これはマウス大サテライト配列の位置に対応
していた（比較のために図１Ｆを参照のこと）。この弱
いハイブリダイゼーションは、マウス小サテライトプロ
ーブと大サテライト配列のクロスハイブリダイゼーショ
ンに起因したものであり得る。これらの配列はある領域
で有意な相同性を示すからである（Ｗｏｎｇ， ｅｔ．
ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。
（２．８μｇ／ｍｌ）用いたところ、λｎｅｏ染色体に
おいてハイブリダイゼーションのバンドが見られ（図３
Ｅ、Ｆ）、これはマウス大サテライト配列の位置に対応
していた（比較のために図１Ｆを参照のこと）。この弱
いハイブリダイゼーションは、マウス小サテライトプロ
ーブと大サテライト配列のクロスハイブリダイゼーショ
ンに起因したものであり得る。これらの配列はある領域
で有意な相同性を示すからである（Ｗｏｎｇ， ｅｔ．
ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。
【図１】抗動原体抗体によるＫＥ１ ２／４細胞の免疫
染色及びビオチン標識ＤＮＡプローブによるＫＥ１ ２
／４及びＥＣ３／７細胞のインサイチュ・ハイブリダイ
ゼーションを示す。染色体はヨウ化プロピジウムで対比
染色した。 パネルＡ：抗動原体血清（ＬＵ８５１）によるＫＥ１
２／４分裂中期の細胞染色体の間接的免疫蛍光染色。 パネルＢ：続いて行ったビオチン化ラムダＤＮＡプロー
ブによるインサイチュ・ハイブリダイゼーション後の同
じ分裂中期の細胞。 パネルＣ：ｎｅｏによるインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーション。 パネルＤ：テロメアプローブ、矢印はλｎｅｏ染色体を
示す。 パネルＥ：テロメアプローブによるＥＣ３／７分裂中期
の細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。矢印
は二動原体染色体を示す。 パネルＦ：全マウスＤＮＡプローブによるＫＥ１ ２／
４染色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーションであ
って、マウス染色体の中心周囲領域の強いラベルと、λ
ｎｅｏ染色体上のバンド状のパターンを示す。 パネルＧ：ヘキスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１
２／４染色体のカルボルフクシン染色による分裂中期
の細胞。 パネルＨ：ビオチン標識ヒト（ＣＭ８）ＤＮＡによるヘ
キスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１ ２／４分裂
中期の細胞プレートのインサイチュ・ハイブリダイゼー
ション。矢印はλｎｅｏ染色体を示す。
染色及びビオチン標識ＤＮＡプローブによるＫＥ１ ２
／４及びＥＣ３／７細胞のインサイチュ・ハイブリダイ
ゼーションを示す。染色体はヨウ化プロピジウムで対比
染色した。 パネルＡ：抗動原体血清（ＬＵ８５１）によるＫＥ１
２／４分裂中期の細胞染色体の間接的免疫蛍光染色。 パネルＢ：続いて行ったビオチン化ラムダＤＮＡプロー
ブによるインサイチュ・ハイブリダイゼーション後の同
じ分裂中期の細胞。 パネルＣ：ｎｅｏによるインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーション。 パネルＤ：テロメアプローブ、矢印はλｎｅｏ染色体を
示す。 パネルＥ：テロメアプローブによるＥＣ３／７分裂中期
の細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。矢印
は二動原体染色体を示す。 パネルＦ：全マウスＤＮＡプローブによるＫＥ１ ２／
４染色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーションであ
って、マウス染色体の中心周囲領域の強いラベルと、λ
ｎｅｏ染色体上のバンド状のパターンを示す。 パネルＧ：ヘキスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１
２／４染色体のカルボルフクシン染色による分裂中期
の細胞。 パネルＨ：ビオチン標識ヒト（ＣＭ８）ＤＮＡによるヘ
キスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１ ２／４分裂
中期の細胞プレートのインサイチュ・ハイブリダイゼー
ション。矢印はλｎｅｏ染色体を示す。
【図２】ヘキスト染色剤３３２５８で処理したλｎｅｏ
染色体の構造を示す。ａからｇは個々のアンプリコンを
示す。 パネルＡ：４個の異なる分裂中期の細胞からのλｎｅｏ
染色体の”アンプリコンマップ”。模式図では動原体の
位置はｃｃで示され、ｃ及びｄの”２次圧縮”はｓｃの
記号で示す。 パネルＢ：種々のアンプリコン数によるλｎｅｏ染色体
であって、末端アンプリコンの存在を示す。 パネルＣ：姉妹染色分体間で異なるアンプリコン数を示
すλｎｅｏ染色体。矢印は対にならないアンプリコンを
示す。
染色体の構造を示す。ａからｇは個々のアンプリコンを
示す。 パネルＡ：４個の異なる分裂中期の細胞からのλｎｅｏ
染色体の”アンプリコンマップ”。模式図では動原体の
位置はｃｃで示され、ｃ及びｄの”２次圧縮”はｓｃの
記号で示す。 パネルＢ：種々のアンプリコン数によるλｎｅｏ染色体
であって、末端アンプリコンの存在を示す。 パネルＣ：姉妹染色分体間で異なるアンプリコン数を示
すλｎｅｏ染色体。矢印は対にならないアンプリコンを
示す。
【図３】免疫染色及び二重インサイチュ・ハイブリダイ
ゼーションによるＫＥ１ ２／４染色体の動原体の検出
を示す。染色体はヨウ化プロピジウムで対比染色した。 パネルＡ：抗動原体血清によるヘキスト染色剤３３２５
８で処理したＫＥ１２／４染色体の免疫染色。矢印は末
端動原体を有するλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＢ：同じ分裂中期の細胞のＤＮＡ染色。 パネルＣ：マウスの小サテライトＤＮＡプローブ、及び
次いでラムダＤＮＡプローブで行ったＫＥ１ ２／４染
色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。 パネルＤ：矢印はλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＥ：パネルＣと同じであるが、５倍のマウス小サ
テライトＤＮＡプローブを用いた。λｎｅｏ染色体の弱
いバンド状ハイブリダイゼーションパターンに注意（矢
印）。 パネルＦ：次いで同じ分裂中期の細胞をラムダＤＮＡプ
ローブで行ったハイブリダイゼーション。
ゼーションによるＫＥ１ ２／４染色体の動原体の検出
を示す。染色体はヨウ化プロピジウムで対比染色した。 パネルＡ：抗動原体血清によるヘキスト染色剤３３２５
８で処理したＫＥ１２／４染色体の免疫染色。矢印は末
端動原体を有するλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＢ：同じ分裂中期の細胞のＤＮＡ染色。 パネルＣ：マウスの小サテライトＤＮＡプローブ、及び
次いでラムダＤＮＡプローブで行ったＫＥ１ ２／４染
色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。 パネルＤ：矢印はλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＥ：パネルＣと同じであるが、５倍のマウス小サ
テライトＤＮＡプローブを用いた。λｎｅｏ染色体の弱
いバンド状ハイブリダイゼーションパターンに注意（矢
印）。 パネルＦ：次いで同じ分裂中期の細胞をラムダＤＮＡプ
ローブで行ったハイブリダイゼーション。
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗動原体抗体によるＫＥ１ ２／４細
胞の免疫染色及びビオチン標識ＤＮＡプローブによるＫ
Ｅ１ ２／４及びＥＣ３／７細胞のインサイチュ・ハイ
ブリダイゼーションを示す生物の形態写真である。染色
体はヨウ化プロピジウムで対比染色した。 パネルＡ：抗動原体血清（ＬＵ８５１）によるＫＥ１
２／４分裂中期の細胞染色体の間接的免疫蛍光染色。 パネルＢ：続いて行ったビオチン化ラムダＤＮＡプロー
ブによるインサイチュ・ハイブリダイゼーション後の同
じ分裂中期の細胞。 パネルＣ：ｎｅｏによるインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーション。 パネルＤ：テロメアプローブ、矢印はλｎｅｏ染色体を
示す。 パネルＥ：テロメアプローブによるＥＣ３／７分裂中期
の細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。矢印
は二動原体染色体を示す。 パネルＦ：全マウスＤＮＡプローブによるＫＥ１ ２／
４染色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーションであ
って、マウス染色体の中心周囲領域の強いラベルと、λ
ｎｅｏ染色体上のバンド状のパターンを示す。 パネルＧ：ヘキスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１
２／４染色体のカルボルフクシン染色による分裂中期
の細胞。 パネルＨ：ビオチン標識ヒト（ＣＭ８）ＤＮＡによるヘ
キスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１ ２／４分裂
中期の細胞プレートのインサイチュ・ハイブリダイゼー
ション。矢印はλｎｅｏ染色体を示す。
胞の免疫染色及びビオチン標識ＤＮＡプローブによるＫ
Ｅ１ ２／４及びＥＣ３／７細胞のインサイチュ・ハイ
ブリダイゼーションを示す生物の形態写真である。染色
体はヨウ化プロピジウムで対比染色した。 パネルＡ：抗動原体血清（ＬＵ８５１）によるＫＥ１
２／４分裂中期の細胞染色体の間接的免疫蛍光染色。 パネルＢ：続いて行ったビオチン化ラムダＤＮＡプロー
ブによるインサイチュ・ハイブリダイゼーション後の同
じ分裂中期の細胞。 パネルＣ：ｎｅｏによるインサイチュ・ハイブリダイゼ
ーション。 パネルＤ：テロメアプローブ、矢印はλｎｅｏ染色体を
示す。 パネルＥ：テロメアプローブによるＥＣ３／７分裂中期
の細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。矢印
は二動原体染色体を示す。 パネルＦ：全マウスＤＮＡプローブによるＫＥ１ ２／
４染色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーションであ
って、マウス染色体の中心周囲領域の強いラベルと、λ
ｎｅｏ染色体上のバンド状のパターンを示す。 パネルＧ：ヘキスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１
２／４染色体のカルボルフクシン染色による分裂中期
の細胞。 パネルＨ：ビオチン標識ヒト（ＣＭ８）ＤＮＡによるヘ
キスト染色剤３３２５８で処理したＫＥ１ ２／４分裂
中期の細胞プレートのインサイチュ・ハイブリダイゼー
ション。矢印はλｎｅｏ染色体を示す。
【図２】図２は、ヘキスト染色剤３３２５８で処理した
λｎｅｏ染色体の構造を示す生物の形態写真である。ａ
からｇは個々のアンプリコンを示す。 パネルＡ：４個の異なる分裂中期の細胞からのλｎｅｏ
染色体の”アンプリコンマップ”。模式図では動原体の
位置はｃｃで示され、ｃ及びｄの”２次圧縮”はｓｃの
記号で示す。 パネルＢ：種々のアンプリコン数によるλｎｅｏ染色体
であって、末端アンプリコンの存在を示す。 パネルＣ：姉妹染色分体間で異なるアンプリコン数を示
すλｎｅｏ染色体。矢印は対にならないアンプリコンを
示す。
λｎｅｏ染色体の構造を示す生物の形態写真である。ａ
からｇは個々のアンプリコンを示す。 パネルＡ：４個の異なる分裂中期の細胞からのλｎｅｏ
染色体の”アンプリコンマップ”。模式図では動原体の
位置はｃｃで示され、ｃ及びｄの”２次圧縮”はｓｃの
記号で示す。 パネルＢ：種々のアンプリコン数によるλｎｅｏ染色体
であって、末端アンプリコンの存在を示す。 パネルＣ：姉妹染色分体間で異なるアンプリコン数を示
すλｎｅｏ染色体。矢印は対にならないアンプリコンを
示す。
【図３】図３は、免疫染色及び二重インサイチュ・ハイ
ブリダイゼーションによるＫＥ１ ２／４染色体の動原
体の検出を示す生物の形態写真である。染色体はヨウ化
プロピジウムで対比染色した。 パネルＡ：抗動原体血清によるヘキスト染色剤３３２５
８で処理したＫＥ１２／４染色体の免疫染色。矢印は末
端動原体を有するλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＢ：同じ分裂中期の細胞のＤＮＡ染色。 パネルＣ：マウスの小サテライトＤＮＡプローブ、及び
次いでラムダＤＮＡプローブで行ったＫＥ１ ２／４染
色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。 パネルＤ：矢印はλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＥ：パネルＣと同じであるが、５倍のマウス小サ
テライトＤＮＡプローブを用いた。λｎｅｏ染色体の弱
いバンド状ハイブリダイゼーションパターンに注意（矢
印）。 パネルＦ：次いで同じ分裂中期の細胞をラムダＤＮＡプ
ローブで行ったハイブリダイゼーション。
ブリダイゼーションによるＫＥ１ ２／４染色体の動原
体の検出を示す生物の形態写真である。染色体はヨウ化
プロピジウムで対比染色した。 パネルＡ：抗動原体血清によるヘキスト染色剤３３２５
８で処理したＫＥ１２／４染色体の免疫染色。矢印は末
端動原体を有するλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＢ：同じ分裂中期の細胞のＤＮＡ染色。 パネルＣ：マウスの小サテライトＤＮＡプローブ、及び
次いでラムダＤＮＡプローブで行ったＫＥ１ ２／４染
色体のインサイチュ・ハイブリダイゼーション。 パネルＤ：矢印はλｎｅｏ染色体を示す。 パネルＥ：パネルＣと同じであるが、５倍のマウス小サ
テライトＤＮＡプローブを用いた。λｎｅｏ染色体の弱
いバンド状ハイブリダイゼーションパターンに注意（矢
印）。 パネルＦ：次いで同じ分裂中期の細胞をラムダＤＮＡプ
ローブで行ったハイブリダイゼーション。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ (72)発明者 ジューラ・ハドラツキー ハンガリー人民共和国エイチ−6723 セゲ ド，セモス ウーツカ・１／エイ アイエ ックス・36
Claims (13)
- 【請求項１】 動原体が染色体上に存在し、かつ該染
色体のすべての動原体がクローン化ヒト配列からなる、
ヒトＤＮＡ配列を含む機能的動原体からなる非ヒト細胞
系。 - 【請求項２】 該動原体がＥＣ３／７としても知られ
る、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セ
ル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号ｎｏ．９００
５１００１で寄託された細胞系から由来する請求項１に
記載の細胞系。 - 【請求項３】 細胞系がマウスーハムスターハイブリ
ッド細胞系である請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項４】 動原体が、齧歯類の全長染色体の大き
さである染色体上に存在する請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項５】 動原体が、細胞系中の最小の染色体の
半分の長さよりも短いミニクロモソーム上に存在する請
求項１に記載の細胞系。 - 【請求項６】 動原体が安定に維持された染色体上に
存在する請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項７】 染色体が選択剤の非存在下に安定に維
持される請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項８】 染色体が細胞系中の細胞の少なくとも
９０％中に保持される請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項９】 染色体が細胞系中の細胞の少なくとも
９５％中に保持される請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項１０】 ヒトＤＮＡを含む機能的動原体からな
る細胞系を作成する方法であって、ここで動原体は染色
体上に存在し、かつ該染色体のすべての動原体はヒト配
列からなっており、この方法は、 ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・
カルチャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号ｎｏ．９００５１
００１で寄託された細胞系の細胞を、優性選択マーカー
のための選択剤を含む培地中で成長させ、ここで該選択
剤は細胞の５０％を殺す量の１０倍以上の量で培地中に
存在し；該培地中で生存する細胞を選択し；生存細胞又
はその子孫から二動原体染色体を欠いている細胞をスク
リーニングする、ことを特徴とする。 - 【請求項１１】 ヒトＤＮＡ配列を含む機能的動原体か
らなる細胞系を作成する方法であって、ここで動原体は
染色体上に存在し、かつ該染色体のすべての動原体はヒ
ト配列からなっており、この方法は、 ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・
カルチャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号ｎｏ．９００５１
００１で寄託された細胞系の細胞を、第２の哺乳動物種
の細胞と融合させて融合細胞ハイブリッドを形成し；融
合細胞ハイブリッド又はその子孫から二動原体染色体を
欠いてはいるが、ヒトＤＮＡからなる動原体を含む細胞
をスクリーニングする、ことを特徴とする。 - 【請求項１２】 請求項１０の方法によって作成された
細胞系。 - 【請求項１３】 請求項１１の方法によって作成された
細胞系。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/759,558 US5288625A (en) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | Mammalian artificial chromosomes |
| US759558 | 1991-09-13 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07177881A true JPH07177881A (ja) | 1995-07-18 |
| JP3456715B2 JP3456715B2 (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=25056105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24520692A Expired - Fee Related JP3456715B2 (ja) | 1991-09-13 | 1992-09-14 | 哺乳動物の人工染色体 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5288625A (ja) |
| EP (1) | EP0532050B1 (ja) |
| JP (1) | JP3456715B2 (ja) |
| AT (1) | ATE201450T1 (ja) |
| CA (1) | CA2078189C (ja) |
| DE (1) | DE69231835T2 (ja) |
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