DK168302B1 - Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller - Google Patents
Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller Download PDFInfo
- Publication number
- DK168302B1 DK168302B1 DK325189A DK325189A DK168302B1 DK 168302 B1 DK168302 B1 DK 168302B1 DK 325189 A DK325189 A DK 325189A DK 325189 A DK325189 A DK 325189A DK 168302 B1 DK168302 B1 DK 168302B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- plant cells
- cells
- molecules
- plant
- watts
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 22
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 14
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 8
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)[14CH2]OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 168302 Bl i
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller.
5 Der kendes forskellige metoder til indføring af molekyler, såsom genetisk materiale, f.eks. plasmid-DNA, RNA, virus eller fragmenter deraf, i dyreceller og protoplaster.
Disse kendte metoder omfatter bl.a. kemiske metoder, elektro-10 poration og mikroinjektion. Disse kendte metoder har vist sig at være anvendelige til både transient og stabil transformation. Alle de beskrevne metoder til opnåelse af transient ekspression har også vist sig at være anvendelige til frembringelse af stabile transformationer.
15 I forbindelse med indføring af genetisk materiale er der et vigtigt lighedspunkt mellem planteprotoplaster og dyreceller, idet begge udelukkende er afgrænset fra omgivelserne af en plasmamembran. I modsætning hertil omfatter intakte plantecel-20 ler udover en plasmamembran også en for højmolekylære forbindelser ugennemtrængelig cellevæg, der består af et tæt netværk af cel 1ulosefibri1 ler, pectin og ofte også lignin.
Ligheden mellem planteprotoplaster og dyreceller underbygges 25 af, at de metoder, som kendes til indføring af genetisk materiale i planteprotoplaster, sædvanligvis også kan anvendes på dyreceller.
Sådanne metoder omfatter: 30
Calciumphosphatudfældning af plasmid-DNA under dannelse af et krystallinsk produkt. Dette produkt kan optages af dyreceller (Graham og van der Eb, Virology, 52, 456-457, 1973) og af planteprotoplaster (Hain et al., Mol. Gen.
35 Genet. 199, 161-168, 1985).
Indkapsling af plasmid-DNA med liposom med efterfølgende polyethylenglycolinduceret fusion med planteprotoplaster 2 DK 168302 B1 (Deshayes et al., EMBO 4, 2731-2737, 1985), eller med dyreceller (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987).
5 Anvendelse af polyethylenglycol (PEG). Ved denne metode sættes der til pianteprotoplaster og genetisk materiale polyethylenglycol, sædvanligvis 40% polyethylenglycol 6000 (Krens et al., Nature, 296, 72-74, 1982). På tilsvarende måde kan man anvende polyethylenimin eller poly-L-10 ornithin.
Elektroporation. Her udsættes en suspension af dyrecel ler eller planteprotoplaster for en kortvarig elektrisk impuls med høj feltstyrke i nærværelse af genetisk mate-15 riale (Neuman et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982; Fromm et al.. Nature, 319, 791-793, 1986).
Mikroinjektion. Her indføres genetisk materiale i planteprotoplaster (Crossway et al., Mol. Gen. Genet., 20, 179, 20 1986) eller i dyreceller (Cappechi, Cell, 22, 479-488, 1980) ved hjælp af en ultratynd mikropipette.
Fra W0 offentiiggørelsesskrift nr. 89/02464 er det kendt at transformere dyreceller med DNA-fragmenter ved at give cel-25 lerne en ultralydsbehandling, der er tilstrækkelig til at traumatisere cellerne uden at slå cellerne ihjel. På grund af de tidligere nævnte ligheder mellem dyreceller og planteprotoplaster, må det anses for nærliggende, at denne metode også vil kunne anvendes til indføring af DNA-fragmenter i plante-30 protoplaster. Da imidlertid ingen af de tidligere nævnte metoder har vist sig at være egnede til indførelse af plasmid-DNA i intakte planteceller, vil fagmanden, der læser W0 offentliggørelsesskriftet, drage den konklusion, at denne metode formentlig også vil kunne anvendes på protoplaster, men han vil 35 næppe komme på den tanke, at metoden vil kunne anvendes på intakte, vanskeligt gennemtrængelige planteceller. Det er således almindeligt accepteret blandt fagfolk, at plantecellers 3 DK 168302 B1 vægge generelt er uigennemtrængelige for store molekyler såsom DNA og proteiner.
For at løse dette problem har man derfor været nødt til først 5 at fjerne plantecellernes cellevægge, sædvanligvis ved enzymatisk hydrolyse, for derefter at kunne indføre genetisk materiale i de derved dannede protoplaster. Dette giver sædvanligvis vanskeligheder, da det normalt er endnu vanskeligere at få protoplaster regenereret til hele planter sammenlignet med 10 anvendelse af intakte planteceller. Der er således et stort behov for at finde en metode, hvormed man kan indføre genetisk materiale direkte ind i intakte planteceller, således at man undgår problemerne med fremstilling af protoplaster og problemerne med regenerering ud fra protoplaster.
15
For nyligt er der udviklet en metode til indføring af plasmid-DNA i intakte planteceller. Denne er baseret på, at små partikler beklædt med plasmid-DNA skydes med en høj hastighed ind i de intakte planteceller (Klein et al., Nature, 327, 70-73, 20 1987). Denne metode kræver dog et meget kostbart udstyr, som endvidere kræver betydelig ekspertise for at kunne anvende det på rette måde.
Der er således et behov for en mere enkel og billig metode til 25 indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller.
Det har nu vist sig, at indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte panteceller kan gennemføres ved mild ul-30 tralydbehandling ved en metode, der kun kræver forholdsvis billigt og let tilgængeligt udstyr og under opnåelse af en god effektivi tet.
Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at an-35 vise en fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller på en billig og effektiv måde.
DK 168302 B1 4
Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen der er ejendommelig ved at et medium, der indeholder plantecellerne og molekylerne, udsættes for ultralydbehandling med en frekvens fra 5 kHz til 10 MHz, en udgangseffekt på op til 300 watt i et tidsrum på op til 10.000 ms.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er et nyttigt alternativ til ® de tidligere kendte indføringsmetoder. Med fremgangsmåden er der opnået en ny metode, der kun kræver beskedne omkostninger, og som kan gennemføres på en hurtig og simpel måde. På basis af de allerede gennemførte indføringsforsøg kan man forudse, at fremgangsmåden også vil vise sin overlegenhed ved anvendel-se på mange andre biologiske materialer, hvor de kendte metoder er utilstrækkelige.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen underkastes plantecellerne en ultralydbehandling, der er betydeligt mildere end den ultralydbehandling, der benyttes til homogenisering eller lysis af celler. Det er således vigtigt at behandlingen er passende mild, således at en tilstrækkelig andel af plantecellerne bevarer levedygtigheden. For at sikre dette udsætter man plantecellesuspensionen for ultralydbølger i 20 frekvensområdet fra 5 kHz til 10 MHz, især fra 10 til 100 kHz, med en udgangseffekt (dvs. den til det lydgivende organ tilførte elektriske effekt) på op til 300 watt, såsom 5-300 watt, fortrinsvis 30-70 watt, i et tidsrum på op til 10.000 ms, såsom 100-3000 ms, fortrinsvis 400-1000 ms.
25
Som eksempler på molekyler, der kan indføres i planteceller ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan nævnes DNA, plas-mid-DNA, RNA, virus, proteiner, lipider, lægemidler, små molekyler, organeller eller fragmenter af sådanne materialer.
30
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har med fordel været anvendt til indføring af molekyler i planteceller fra sukkerroe og tobak.
35 Et fordelagtigt medium, hvori plantecellerne og molekylerne er indeholdt under ultralydbehandlingen, er en vandig saltopløsning (CPW), som er nærmere beskrevet nedenfor i forbindelse med eksemplerne, indeholdende 21-28% saccharose.
5 DK 168302 B1
Ved indføring af plasmid-DNA ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås sarligt gode resultater, hvis mediet indeholder plasmid-DNA i en koncentration på mindst 10 pg/ml.
5 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man med fordel gennemføre den milde ultralydbehandling under anvendelse af et spidst lydgivende organ, som kun neddyppes i den øvre del af mediet.
10 Ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er der påvist indføring af molekyler i tokimbladede planteceller, såsom sukkerroe og tobak. Det må dog formodes, at fremgangsmåden er lige så velegnet til indførelse af molekyler i enkimbladede planteceller.
15
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan med fordel gennemføres ved anvendelse af et apparat, der omfatter et lydgivende organ, der i et medium kan udsende ultralyd i et tidsrum på op til 10.000 ms. Et sådant apparat kan med fordel være udformet 20 til at udsende ultralydbølger med en frekvens i området fra 10 til 100 kHz.
Til løsning af forskelligartede opgaver kan apparatet være udformet således, at den til det lydgivende 25 organ tilførte effekt kan indstilles på en hvilken som helst værdi i området fra 5 til 300 watt og således, at lydbehandlingens varighed er indstillelig i området fra 100 ms til 10.000 ms.
30 Apparatets lydkilde er med fordel udformet således, at den kan neddyppes i et medium, der er placeret i en passende beholder, såsom et Eppendorfrør. En sådan udformning, hvor det lydafgivende organ sidder for enden af en tynd stav, er kendt fra konventionelle ultralydapparater beregnet til nedbrydning el-35 ler lysis af cellemateriale.
Det har ved forsøg vist sig at sådanne konventionelle ultralydapparater kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfinde!- 6 DK 168302 B1 sen. Den foreliggende opfindelse er udviklet under anvendelse af et i handelen tilgængeligt apparat med betegnelsen Sonifier B 15, der leveres af Branson, Eagle Road, Danbury, Connecticut, USA, beregnet til lysis af celler. Apparatet kan udsen-5 de ultralyd med en frekvens på 20 kHz. De i nærværende beskri velse og krav angivne effekter i watt er udgangseffekten, sådan som den aflæses på udgangskontrolskalaen (output control). Ved forsøgene var det ultralydgivende organ neddyppet ca. 2-3 mm fra overfladen. Ved orienterende forsøg under anvendelse af 10 et kalorimeter har det vist sig, at der ved den benyttede for søgsopstilling opnås en afsat effekt til væsken, som er på ca.
5 til 10% af den angivne udgangseffekt. Ved anvendelse af andre apparater vil fagmanden på samme måde som beskrevet i de efterfølgende eksempler kunne bestemme en passende indstil-15 ling, som giver en mild ultralydbehandling med effektiv indføring af molekyler, under opretholdelse af en tilstrækkelig levedygtighed, det vil sige en indstilling, som giver en ultralydbehandlingseffekt svarende til den, der er anvendt i de ifølge eksemplerne foretagne forsøg. Det kan til sammenligning 20 oplyses, at når det nævnte apparat Sonifier B 15 anvendes til lysis eller homogenisering af celler under i øvrigt samme betingelser, indstiller man det sædvanligvis på en udgangseffekt på 80-100 watt og en behandlingstid på 30.000 til 250.000 ns ved behandling af intakte celler.
25
Som tidligere nævnt kendes der flere metoder til indføring af genetisk materiale i planteceller, hvor disse først omdannes til planteprotoplaster, idet der opnås en højere grad af indføring af det genetiske materiale i protoplasterne, da disse 30 ikke har den spærrende cellevæg. Til gengæld er det for proto-plaster af en række plantearter, især enkimbladede planter, vanskeligt at regenerere protoplaster til intakte planter. Selv om der er opnået gunstige resultater med protoplaster af visse plantearter er der andre plantearter, hvor det vil være 35 mere fordelatigt at benytte intakte planteceller, plantekim eller andet morforgent materiale i stedet for protoplaster. Det er ved forsøg påvist, at direkte indføring af genetisk 7 DK 168302 B1 materiale i intakte celler ved mild ultralydbehandling ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er mulig og attraktiv, da der her er tale om en mindre kompliceret metode, der giver mulighed for en drastisk forøgelse af det antal af plantear-5 ter, hvor der med succes kan gennemføres genetisk manipulation.
Som genetisk materiale kommer navnlig DNA eller fragmenter deraf, såsom plasmid-DNA, på tale. Det må imidlertid antages, 10 at fremgangsmåden også er velegnet til indføring af RNA eller fragmenter deraf samt til indføring af virus, f.eks. til patologiske undersøgelser. Ligeledes vil fremgangsmåden ifølge opfindelsen formentlig også kunne anvendes til indføring af proteiner, lipider, lægemidler, små molekyler samt organeller 15 og viruspartikler i celler.
Som medium kan der anvendes et hvilket som helst passende konventionelt medium for celler eller protoplaster.
20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen benytter en teknik, hvor der antageligt sker en midlertidig, moderat svækkelse af såvel cellemembran som cellevæg, hvilket i de efterfølgende eksempler er påvist hos intakte planteceller. Således påvises det i eksemplerne, at plasmid-DNA kan trænge ind i ultralydbehand-25 lede planteceller.
Omfanget af opfindelsens anvendelighed vil fremgå af den efterfølgende detaljerede beskrivelse.
30 « 35 8 DK 168302 B1
Eksempler
Generelle forsøgsbetingelser: 5 Cellesuspensionskultur
En cellesuspensionskultur af sukkerroe (Beta vulgaris L.) af genotypen Ml (fra DANISCO A/S, København, Danmark) fremstilles ud fra callus opnået fra kim (embryo). Cellesuspensionen dyr-10 kes i mørke ved 25eC på et roterende rysteapparat. Cellerne opretholdes ved subdyrkning i et medium ifølge Murashige og Skoog (Physiol. Plant. 15, 473-497, 1962) suppleret med 5,7 μΜ indoleddikesyre og 4,4 μΜ benzyladenin.
15 CPW
CPW er en vandig opløsning af en blanding af uorganiske salte omfattende blandt andet ca. 10 mM Ca++ beskrevet af Frearson et al., (Dev. Biol. 33, 130-137, 1973).
20
Ultralvdbehandlino
En cellesuspension til ultralydbehandling fremstilles ved at udtage cellerne 3-4 dage efter subdyrkning og vaske to gange i 25 CPW 13S (dvs. CPW indeholdende 13% sorbitol) og suspendering til sidst i CPW 13S i forholdet 1 rumfang celler til 4 rumfang CPW 13S. Til denne suspension i 0,35 ml CPW indeholdende 21% saccharose og indeholdende planteceller (500.000/ml) i et Ep-pendorfrør sættes plasmid DNA til en siutkoncentration på 45 30 μg/ml. Som plasmid DNA anvendes et plasmid, der koder for markør-enzymet chloramphenicol-acetyl transferase (CAT). Det anvendte plasmid er plasmidet pCaMVCN, der med kodebetegnelsen 27-4909 leveres af Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige.
Efter hurtig omrystning neddyppes mikrotippen af en Sonifier B 15 (leveret af Branson, Eagle Road, Danbury, Connecticut, USA) 35 DK 168302 Bl 9 i den øvre halvdel af cellesuspensionen (dvs. 2-3 mm fra overfladen). Der tilføres en ultralydimpuls med en frekvens på 20 kHz. Den effekt, der angives i forsøgene bestemmes ud fra udgangskontrolskalaen (output control), hvor en enhed svarer til 5 15 watt elektrisk effekt. Den effektive akustiske effekt er blevet målt til 0,22 watt/cm2 ved 10 watt elektrisk effekt. Behandlingens varighed indstilles ved hjælp af skalaen for procent driftscyklus (procent duty circle), hvor man ved en indstilling på 10% opnår, at en ultralydimpuls varer i 110 ms.
10
Derefter overføres de ultralydbehandlede celler til petriskåle med et MS-medium (Murashige og Skoog, se ovenfor) og der inkuberes ved 23°C i 2 dage. Derefter påvises tilstedeværelsen af CAT-aktivitet i en ekstrakt udvundet fra de behandlede celler 15 ved tilsætning af l4C-mærket chloramphenicol og opvarmning i 6 minutter til 60eC. Efter afkøling tilsættes acetyl-coenzym A til prøven, således at siutkoncentrationen af acetyl-coenzym A bliver 0,71 mM. Indføringen af plasmidet bedømmes ved måling af den procentuelle omdannelse af chloramphenicol (CA). Den 20 anvendte metode er en modifikation af den metode, der er beskrevet af Gorman et al. (Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051, 1982).
Eksempel 1 25 Nærværende eksempel belyser indføring af plasmid-DNA i intakte celler af sukkerroe af genotypen Ml.
Suspensionskulturer af sukkerroeceller opretholdes ved sub-30 dyrkning som beskrevet ovenfor og ultralydbehandies, dyrkes og analyseres på den beskrevne måde. Resultaterne fra den målte CAT-aktivitet fremgår af tabel 1.
35 10 DK 168302 B1
Tabel 1 Sukkerroe
Effekt Tid Omdannelse af CA
(watt) (ms) (%) 500 0,03 60 800 0,06 75 800 0,21 90 800 0,17 105 800 0,07 10
Eksempel 2 Nærværende eksempel belyser indføring af plasmid-DNA i intakte celler af tobak.
15
En cellesuspensionskultur af tobak opretholdes ved subdyrkning på samme måde som beskrevet ovenfor for subdyrkning af celle-suspensionerne af sukkerroe, idet dog dyrkningsmediet består af et medium ifølge Murashige og Skoog (Physiol. Plant. 15, 20 473-497, 1962) suppleret med 0,2 mg/1 2,4-dichlorphenoxy- eddikesyre, 0,1 mg/1 kinetin, 0,9 mg/1 thiaminhydrochlorid og 0,2 g/1 KH2PO4, pH 6,0.
Cellerne udtages 3-4 dage efter subdyrkning og vaskes to gange 25 i CPW13S (dvs. CPW indeholdende 13% sorbitol) og suspenderes til sidst i CPW13S i forholdet 1 rumfang celler til 4 rumfang CPW13S. Herfra udtages prøver på 0,35 ml, som hver tilsættes plasmidet pCaMVCN til en siutkoncentration på 100 pg/ml. Derefter underkastes cellerne ultralydbehandling under de i tabel 30 2 angivne betingelser. Efter dyrkning i 2 dage i det oven nævnte medium ekstraheres cellerne, og CAT-aktiviteten måles. Resultaterne ses i tabel 2.
35
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller, kendetegnet 25 ved, at et medium, der indeholder plantecellerne og molekylerne, udsættes for ultralydbehandling med en frekvens fra 5 kHz til 10 MHz, en udgangseffekt på op til 300 watt i et tidsrum på op til 10.000 ms.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ultralydbehandlingen foretages med en udgangseffekt på 5-300 watt i et tidsrum på 100-3000 ms.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 35 at ultralydbehandlingen foretages med en udgangseffekt på SOTO watt i et tidsrum på 400-1000 ms, og at frekvensen for lydbølgerne ligger i området fra 10 til 100 kHz. DK 168302 B1
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at molekylerne er valgt blandt DNA, plasmid-DNA, RNA, virus, proteiner, lipider, lægemidler, små molekyler, organeller eller fragmenter af sådanne materialer. 5
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet har en plasmid-DNA-koncentration på mindst 10 pg/ml.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at ultralydbehandlingen foretages med et spidst lydgivende organ, som kun neddyppes i den øvre del af mediet.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plantecellerne er fra en enkimbladet plante. 15
8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plantecellerne er fra en tokimbladet plante.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved 20 at plantecellerne er celler fra sukkerroe eller tobak. 25 30 35
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK325189A DK168302B1 (da) | 1989-06-29 | 1989-06-29 | Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller |
| PCT/DK1990/000166 WO1991000358A1 (en) | 1989-06-29 | 1990-06-28 | A method for introducing molecules, particularly genetic material, into plant cells |
| JP2510265A JPH05500304A (ja) | 1989-06-29 | 1990-06-28 | 植物細胞に分子、特に遺伝物質を導入する方法 |
| AU60432/90A AU645260B2 (en) | 1989-06-29 | 1990-06-28 | A method for introducing molecules, particularly genetic material, into plant cells |
| EP19900910596 EP0480971A1 (en) | 1989-06-29 | 1990-06-28 | A method for introducing molecules, particularly genetic material, into plant cells |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK325189A DK168302B1 (da) | 1989-06-29 | 1989-06-29 | Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller |
| DK325189 | 1989-06-29 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK325189D0 DK325189D0 (da) | 1989-06-29 |
| DK325189A DK325189A (da) | 1990-12-30 |
| DK168302B1 true DK168302B1 (da) | 1994-03-07 |
Family
ID=8120791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK325189A DK168302B1 (da) | 1989-06-29 | 1989-06-29 | Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0480971A1 (da) |
| JP (1) | JPH05500304A (da) |
| AU (1) | AU645260B2 (da) |
| DK (1) | DK168302B1 (da) |
| WO (1) | WO1991000358A1 (da) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2042093C (en) * | 1990-05-09 | 2002-12-24 | Gyula Hadlaczky | Cell line carrying an excess of mammalian centromeres |
| ATE242809T1 (de) | 1995-09-08 | 2003-06-15 | Genentech Inc | Vegf-verwandtes protein |
| US6030945A (en) * | 1996-01-09 | 2000-02-29 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
| US6998116B1 (en) | 1996-01-09 | 2006-02-14 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
| US5693512A (en) * | 1996-03-01 | 1997-12-02 | The Ohio State Research Foundation | Method for transforming plant tissue by sonication |
| EP0904366A1 (en) | 1996-04-01 | 1999-03-31 | Genentech, Inc. | Apo-2li and apo-3 apoptosis polypeptides |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6077697A (en) | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
| US6159462A (en) * | 1996-08-16 | 2000-12-12 | Genentech, Inc. | Uses of Wnt polypeptides |
| US6462176B1 (en) | 1996-09-23 | 2002-10-08 | Genentech, Inc. | Apo-3 polypeptide |
| US5990281A (en) | 1996-09-30 | 1999-11-23 | Genentech, Inc. | Vertebrate smoothened proteins |
| US6342369B1 (en) | 1997-05-15 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Apo-2-receptor |
| CA2293724C (en) | 1997-06-05 | 2010-02-02 | Xiaodong Wang | Apaf-1, the ced-4 human homolog, an activator of caspase-3 |
| CA2293740A1 (en) | 1997-06-18 | 1998-12-23 | Genentech, Inc. | Apo-2dcr, a tnf-related receptor |
| US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
| ATE411385T1 (de) | 1998-01-15 | 2008-10-15 | Genentech Inc | Apo-2 ligand |
| US6114603A (en) * | 1998-03-27 | 2000-09-05 | John Innes Center | Genetic engineering of sugarbeet plants |
| DE19834612A1 (de) * | 1998-07-31 | 2000-02-24 | Dornier Medtech Holding Int Gmbh | Verfahren zum intrazellulären Transfer von Oligonukleotiden und Vorrichtung zur Durchführung desselben |
| US6195936B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-03-06 | University Of Iowa Research Foundation | Method for uptake of a substance into a seed |
| ES2392392T3 (es) | 1999-06-28 | 2012-12-10 | Genentech, Inc. | Métodos para producir ligando Apo-2 utilizando iones metálicos divalentes |
| DE19962904A1 (de) * | 1999-12-23 | 2001-08-09 | Dornier Medizintechnik | Verfahren zum Transfer von Molekülen in Zellen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| JP5062606B2 (ja) | 2000-02-16 | 2012-10-31 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｔｎｆ関連分子の活性を調節するためのアゴニスト及びアンタゴニストの使用 |
| EP2390256A1 (en) | 2001-05-30 | 2011-11-30 | Agrisoma, Inc. | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
| KR100942880B1 (ko) | 2001-08-29 | 2010-02-17 | 제넨테크, 인크. | 유사분열촉진 활성을 가진 Ｂｖ８ 핵산 및 폴리펩티드 |
| CA2461292A1 (en) | 2001-10-02 | 2003-04-10 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand variants and uses thereof |
| DE60237841D1 (de) | 2001-11-13 | 2010-11-11 | Genentech Inc | Zusammensetzungen basierend auf APO2-Ligand/ TRAIL und ihre Verwendung |
| DE10223196B4 (de) | 2002-05-24 | 2004-05-13 | Dornier Medtech Systems Gmbh | Verfahren und Einrichtung zum Transferieren von Molekülen in Zellen |
| JP4574350B2 (ja) | 2002-06-24 | 2010-11-04 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ａｐｏ−２リガンド／ｔｒａｉｌ変異体とその使用法 |
| MXPA05009743A (es) | 2003-03-12 | 2006-03-09 | Genentech Inc | Composiciones con actividad hematopoyetica e inmune. |
| AU2004256042A1 (en) | 2003-06-05 | 2005-01-20 | Genentech, Inc. | BlyS antagonists and uses thereof |
| DE602005019367D1 (de) | 2004-12-15 | 2010-04-01 | Dornier Medtech Systems Gmbh | Verbesserte Zelltherapie und Gewebsregeneration mittels Stosswellen bei Patienten mit kardiovaskulären and neurologischen Krankheiten |
| GB2452543B (en) * | 2007-09-07 | 2012-07-25 | Wei Huang | Nucleic acid transfer techniques |
| JP2011500715A (ja) | 2007-10-16 | 2011-01-06 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | 自己免疫疾患の治療のためのＢＬｙＳ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の組合せ |
| US8669085B2 (en) | 2009-02-05 | 2014-03-11 | Ut-Battelle, Llc | Transformation of gram positive bacteria by sonoporation |
| BR112012002974B1 (pt) | 2009-08-11 | 2022-06-07 | Genentech, Inc | Processo para produzir um anticorpo em uma célula hospedeira de célula ovário de hamster chinês (cho) expressando o referido polipeptídeo |
| WO2012151317A1 (en) | 2011-05-03 | 2012-11-08 | Genentech, Inc. | Vascular disruption agents and uses thereof |
| KR101791563B1 (ko) * | 2015-05-11 | 2017-11-02 | 대한민국 | 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3537261A1 (de) * | 1985-10-19 | 1987-04-30 | Gca Corp | Verfahren und medium zum feldinduzierten einschleusen von makromolekuelen in lebende zellen |
| PT87394B (pt) * | 1987-05-05 | 1992-09-30 | Sandoz Sa | Processo para a transformacao de tecidos vegetais |
| GB8721015D0 (en) * | 1987-09-07 | 1987-10-14 | Amersham Int Plc | Modifying living cells |
-
1989
- 1989-06-29 DK DK325189A patent/DK168302B1/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-06-28 EP EP19900910596 patent/EP0480971A1/en not_active Ceased
- 1990-06-28 JP JP2510265A patent/JPH05500304A/ja active Pending
- 1990-06-28 AU AU60432/90A patent/AU645260B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-28 WO PCT/DK1990/000166 patent/WO1991000358A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6043290A (en) | 1991-01-17 |
| EP0480971A1 (en) | 1992-04-22 |
| DK325189D0 (da) | 1989-06-29 |
| WO1991000358A1 (en) | 1991-01-10 |
| AU645260B2 (en) | 1994-01-13 |
| JPH05500304A (ja) | 1993-01-28 |
| DK325189A (da) | 1990-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK168302B1 (da) | Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller | |
| CN106047877B (zh) | 一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用 | |
| Schlesier et al. | A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions | |
| Parkinson et al. | Graft formation in cultured, explanted internodes | |
| Kilby et al. | Repeated harvest of vacuole-located secondary product from in vitro grown plant cells using 1.02 MHz ultrasound | |
| CN116024321B (zh) | 一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用 | |
| JPH02501264A (ja) | 生存細胞の修飾法 | |
| CN114807043A (zh) | 人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法 | |
| Augustine et al. | Targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum ADF gene using shockwave‐mediated ribonucleoprotein delivery increases osmotic stress tolerance | |
| Zachrisson et al. | Electromanipulation of plant protoplasts | |
| Matthys-Rochon et al. | Isolation and microinjection of active sperm nuclei into egg cells and central cells of isolated maize embryo sacs | |
| Dugas et al. | Lateral diffusion in the plasma membrane of maize protoplasts with implications for cell culture | |
| Alvarez et al. | A histochemical study of embryo development in Vanda (Orchidaceae) | |
| van Iterson et al. | BASAL BODIES OF BACTERIAL FLAGELLA IN PROTEUS MIRABILIS: I. Electron Microscopy of Sectioned Material | |
| CN108070567A (zh) | 一种永生化的尿液来源细胞株及其构建方法 | |
| US20030165483A1 (en) | Method for the modification of biological cells | |
| WO2024048670A1 (ja) | 導入装置及びデリバリー方法 | |
| JP2010022227A (ja) | 目的細胞の取得方法および解析方法 | |
| CN117050937A (zh) | 东方蝾螈肢端芽基原代细胞提取方法 | |
| Rakotondrafara et al. | Preparation and electroporation of oat protoplasts from cell suspension culture | |
| Terzaghi et al. | Plant cell transfection by electroporation | |
| WO2004076671A1 (fr) | Procede permettant de construire des algues economiques transgeniques | |
| Cocking | Plant protoplasts as genetic systems | |
| US20210032644A1 (en) | Method for introducing substance into plant cell | |
| Lucas et al. | Nuclear transplantation with mammalian cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |