DE3537261A1

DE3537261A1 - Verfahren und medium zum feldinduzierten einschleusen von makromolekuelen in lebende zellen

Info

Publication number: DE3537261A1
Application number: DE19853537261
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: GCA Corp
Current assignee: B Braun Melsungen AG
Priority date: 1985-10-19
Filing date: 1985-10-19
Publication date: 1987-04-30
Also published as: JPS63501613A; WO1987002383A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum feld induzierten Einschleusen von Makromolekülen, wie z. B. genetischen Informationsträgern, insbesondere DNA und in der Größe vergleichbaren Molekülen, wie z. B. Proteinen, in lebende Zellen, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Enzymatische Vorbehandlung der Zellen;
b) Suspendieren der Zellen in einem wässrigen, isotonischen Medium;
c) Temperieren der Zellsuspension auf eine Tempe ratur zwischen 0° C und 25° C;
d) Anwendung elektrischer Feldpulse zur Schaffung von ausheilbaren Membrandurchbrüchen;
e) Erwärmen der Zellsuspension zum Ausheilen der Membrandurchbrüche nach dem Applizieren der Feldpulse auf eine Temperatur oberhalb der Raumtemperatur.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Medium zur Durchführung dieses Verfahrens.

Aus der DE-PS 24 05 119 ist ein Verfahren zum Ein schleusen von chemischen Substanzen in Zellen be kannt, bei dem die Zellen in einer physiologischen Elektrolytlösung suspendiert und bei einer Tempe ratur zwischen 0° C und 25° C einem elektrischen Feld mit der Feldstärke von 10³ bis 10⁵ V/cm aus gesetzt werden, so daß Membrandurchbrüche entstehen, durch die chemische Substanzen aus der die Zelle umgebenden Flüssigkeit in das Zellinnere gelangen können. Zum Ausheilen der Membrandurchbrüche wird die Zellsuspension erwärmt, um die Ausheilvorgänge der Zellmembranen zu beschleunigen.

Ebenfalls bekannt ist, dem Verfahren der DE-PS 24 05 119 einen Vorbehandlungsschritt vorzuschalten, in dem die Zellen einer enzymatischen Behandlung unterworfen werden, um die Zellmembranen gegenüber elektrischen Feldern stabiler zu machen.

In anderen Verfahren zum Einschleusen von chemischen Substanzen in Zellen wurden neben den oben erwähnten isotonischen, reinen Elektrolyt-Lösungen auch isotonische reine Nichtelektrolyt-Lösungen von Inosit oder Saccharose verwendet.

In allen Fällen war jedoch die Ausbeute des Ein schleusens von größeren Biomolekülen, wie z. B. DNA, in lebende Zellen relativ klein, selbst wenn in dem die Zellen umgebenden Medium größere Konzentrationen der einzuschleusenden Substanzen vorlagen. Sehr häufig waren die Membrandurchbrüche auf relativ kleine Gebiete der Zellmembran beschränkt, was die Fähigkeit zur Ausheilung der Membran stark herab setzt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in lebende Zellen derart zu verbessern, daß deutlich verbesserte Aus beuten beim Einschleusen von Makromolekülen erhalten werden, und daß gleichzeitig geringere Konzentra tionen der einzuschleusenden Substanzen notwendig werden.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die enzymatische Vorbehandlung mit protolytischen Enzymen erfolgt, daß das isotonische wässrige Medium mit einem Elektrolyt- und einem Nichtelektrolyt- Anteil zum Suspendieren der Zellen für die eigent liche Einschleusung der Makromoleküle verwendet wird, daß die Suspension auf eine Temperatur zwischen 0° C und 10° C abgekühlt wird, und daß ein oder mehrere elektrische Feldpulse mit superkritischer Feldstärke appliziert werden.

Das Einschleusen von Makromolekülen in Zellen macht es erforderlich, größere Durchbrüche in den Zell membranen zu schaffen, welche zusätzlich noch eine relativ lange Lebensdauer aufweisen müssen, damit eine merkliche Aufnahme der Makromoleküle in das Zellinnere erfolgt. Die Schaffung von größeren Durchbrüchen in der Zellmembran kann nur mit elek trischen Feldpulsen erzielt werden, deren Feldstärke oberhalb der kritischen Feldstärke liegt, wobei die kritische Feldstärke die niedrigste Feldstärke ist, bei der gerade an Stellen der Zellmembran, die senkrecht von den elektrischen Feldlinien durchsetzt werden, erste Durchbrüche der Membran entstehen. Die vorgenannten Verfahrensmerkmale der Erfindung wirken nun in der Weise zusammen, daß die größeren Durchbrüche, die durch die superkritischen Felder in der Zellmembran entstehen, nahezu symmetrisch über die Zellmembranoberfläche verteilt sind, d. h. die Durchbrüche sind nicht nur auf wenige Stellen der Zellmembran konzentriert.

Eine besondere Rolle für die Überlebensrate der Zellen spielt die enzymatische Vorbehandlung mit protolytischen Enzymen, durch die die Zellmembran stabiler gegenüber hochenergetischen elektrischen Feldern wird. Wesentlich ist weiterhin ein gewisser Elektrolytanteil in dem isotonischen wässrigen Medium, durch den die Symmetrie der Verteilung der Durchbrüche in der Zellmembran in gewissen Grenzen gesteuert werden kann. Das Abkühlen der Zellsuspen sion auf eine Temperatur zwischen 0° C und 10° C dient zur Verlängerung der Lebensdauer der Membran durchbrüche, so daß die Aufnahmequote von Makro molekülen in das Zellinnere praktikable Werte an nimmt, selbst wenn die Makromoleküle nur in ver gleichsweise geringen Konzentrationen in dem Ein schleusungsmedium vorliegen. Zur Erhaltung der Lebensfähigkeit, d. h. der Teilungsfähigkeit der Zelle ist es zum Abschluß des Einschleusungsver fahrens notwendig, die Temperatur zu erhöhen, um nach der Aufnahme der Makromoleküle in das Zell innere den Ausheilprozeß der Membrandurchbrüche zu beschleunigen.

Als besonders günstig hat sich der Einsatz von Dispase oder auch Pronase als protolytische Enzyme erwiesen, wobei beim Einsatz der Pronase Vorkehrungen getroffen werden müssen, daß dieses protolytische Enzym während dem Einschleusungsvorgang möglichst nicht mehr in dem die Zellen umgebenden Medium vorhanden ist, da die Pronase-Aktivität innerhalb der Zelle zum Absterben derselben führt.

Wenn die Zellsuspension während dem Einschleusen auf ungefähr 4° C gehalten wird, hat man für eine große Auswahl von Zellsystemen optimale Verhältnisse der Geschwindigkeitskonstanten der Ausheilung der Membrandurchbrüche, der Austauschgeschwindigkeit selbst und anderen Austauschvorgängen, die negativ auf die Überlebensrate der Zelle wirken.

Beste Ergebnisse werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt, wenn die superkritische Feld stärke ungefähr das Zwei- bis Dreifache der oben definierten kritischen Feldstärke beträgt.

Der Ausheilvorgang der Membrandurchbrüche geschieht vorzugsweise durch eine Temperaturerhöhung auf unge fähr 37° C, nachdem der Einschleusungsvorgang be endet ist.

Bei besonders empfindlichen Zelltypen ist es teil weise angebracht, die Zellen nach dem Einschleusungs vorgang in ein spezielles Ausheilmedium zu über führen, in dem dann der Ausheilprozeß ebenfalls bei erhöhter Temperatur durchgeführt wird.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Medium zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen.

Diese Aufgabe wird bei einem gattungsgemäßen Medium dadurch gelöst, daß der Elektrolytanteil 25 mMol bis 60 mMol beträgt und daß der Nichtelektrolytan teil eine Konzentration aufweist, durch die die Osmolarität des Mediums so weit erhöht wird, daß das Medium isotonisch ist. Das Medium enthält gleich zeitig auch die einzuschleusenden Makromoleküle.

Wie zuvor schon erwähnt, ist es mit Hilfe des Elek trolytanteils in dem wässrigen isotonischen Medium möglich, die Verteilung der Durchbrüche auf der Membranoberfläche der Zelle zu steuern.

Ein besonders symmetrisches Durchbruchsmuster erhält man bei einem Elektrolytanteil von ungefähr 30 mMol. Hierbei liegen die Durchbrüche bei einer ange nommenen kugelförmigen Gestalt der Zelle beinahe symmetrisch verteilt auf beiden "Polkappen" der Zelle, so daß zum einen eine maximale Aufnahmequote für die Makromoleküle erreicht wird und zum anderen keine zu große Konzentration von großen Membran durchbrüchen auf einer relativ kleinen Oberfläche der Zelle erfolgt, wodurch die Überlebensfähigkeit der Zelle wesentlich begünstigt wird.

Zweckmäßigerweise setzt sich der Elektrolytanteil aus ein- oder zweiwertigen Kationen und ein- oder zweiwertigen Anionen zusammen. An die Kationen und Anionen selbst werden keine weiteren Forderungen gestellt, als daß sie in der üblichen Weise zell verträglich sein müssen.

Der Nichtelektrolytanteil des Mediums wird vorzugs weise aus einem oder mehreren der Nichtelektrolyte Zucker, Zuckeralkohol, Aminozucker und damit ver wandte Verbindungen, wie z. B. Inosit, gebildet.

Nicht zwingend notwendig, jedoch bei empfindlicheren Zellsystemen zu empfehlen, ist die zusätzliche Pufferung des Mediums mit einem Phosphatpuffer, der beispielsweise in einer Konzentration von 1 mMol dem Medium zugegeben wird. Zu beachten ist, daß der Phosphatpufferanteil als Teil des Elektrolytanteils zu berücksichtigen ist.

Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden im folgenden anhand eines Beispiels noch näher er läutert:
Einschleusen von E. coli-Plasmiden in Maus-Lymphozyten zellen

Maus-Lymphozytenzellen wurden in einem RPMI 1640- Medium (erhältlich von Boehringer, Mannheim), das mit 5 % FCS (fetal calf serum) versetzt war, ver mehrt.

Für das Einschleusungsexperiment wurde das RPMI- Medium dekantiert und durch eine isotonische Lösung mit niedriger Ionenstärke (280 mMol Inosit und 1,1 mMol Phosphatpuffer) ersetzt. Danach wurden die Zellen mit ca. 140 g zentrifugiert. Die abzentri fugierten Zellen wurden in einer Lösung von niedriger Ionenstärke suspendiert, zu der 0,1 mg/ml Dispase zugegeben wurde (6 Einheiten/mg, Qualitätsstufe 1, Boehringer, Mannheim). Nach dieser Behandlung mit protolytischem Enzym wurden die Zellen mit dem eigentlichen Einschleusungsmedium gewaschen und in diesem suspendiert. Die Zusammensetzung des Mediums war wie folgt:

Die Feldpulse wurden auf die auf 4° C abgekühlte Zellsuspension angewendet, wobei die Dichte der Zellen 2 × 10⁵ bis 2,3 × 10⁶ Zellen/ml betrug. Die einzuschleusende DNA wurde vor dem Applizieren der Feldpulse dem Medium in einer Konzentration von 1 µg/ml zugegeben.

Als DNA wurde die zirkulare Form eines Plasmids pSV 2-neo, das ein Neomycin-resistentes Gen umfaßt, verwendet. Die teilweise linearisiert eingesetzte Plasmid-DNA wurde durch ein dreistündiges Einwirken bei 37°C von 3 × 50 Einheiten von Eco R 1 auf 50 µg Plasmid-DNA hergestellt, wobei jeweils 50 Einheiten von Eco R 1 nach 0,1 und 2 Stunden zugegeben wurden. Daran schließen sich zwei Zyklen einer Phenol/Chloroform-Extraktion an, aus der die DNA mit 2 Volumenteilen Ethanol ausgefällt wird. Das Plasmid selbst wurde aus E. coli isoliert.

Die Einschleusung mittels elektrisch induzierten Durchbrüchen in den Zellmembranen wurde analog den Vorschriften von Zimmermann et al durchgeführt (U. Zimmermann, G. Pilwat und F. Riemann, Biophys. J. 14, 881 (1974). Die Pulsdauer wurde auf 5 µs eingestellt. Die Suspension wurde nach dem Appli zieren der Pulse für eine bis zwei Minuten bei 4° C gehalten, danach wurde die Suspension mittels einer Mikropipette aus der Kammer entfernt und in ein Volumen von 15 ml eines Ausheil-Mediums, das auf 37° C vorgeheizt wurde, überführt. Die Zusammen setzung des Ausheilungs-Mediums war wie folgt:

Die Zellen wurden in dem Ausheilungs-Medium während etwa 20 Minuten bei 37° C gehalten.

Nach der vollständigen Ausheilung der Zellmembranen wurden die Zellen abzentrifugiert und in ein Nähr medium (RPMI 1640) mit 5 % FCS überführt und 48 Stunden lang inkubiert. Nach der Behandlung mit einem Selektionsmedium wurde die Ausbeute an ge klonten Zellen durch das Zählen der gebildeten Kolonien (innerhalb von 12 bis 18 Tagen nach der Zugabe des Selektionsmediums) festgestellt. Die Ergebnisse der Experimente sind in den Tabellen 1 und 2 festgehalten.

Bei den Experimenten wurde die Feldstärke der Feld pulse variiert. Eine Feldstärke von 8 kV/cm war für gute Ausbeuten von Klonen ausreichend, obwohl 10 kV/cm in den meisten Experimenten bessere und besser reproduzierbare Ergebnisse erbrachten. Eine weitere Erhöhung der Feldstärke bis zu 20 kV/cm oder mehrfache Anwendung von Pulsen (z. B. 3 Pulse in einem Intervall von 20 sec bei 10 kV/cm) er bringen keine entsprechend vergrößerte Ausbeute von stabilen Klonen.

Tabelle 1

Ausbeute an stabilen, d. h. lebensfähigen Klonen unter verschiedenen Feldbedingungen und unter Ver wendung von zirkularer Plasmid-DNA. Falls nicht anders vermerkt, beträgt die DNA-Konzentration 1 µg/ml. Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Zahl der Klone bei 1 µg DNA/ml. Die Zahl der Zellen schwankte zwischen 6 × 10⁵ und 7 × 10⁶ in den Experimenten. Kontrollexperimente , in denen die Zellen gleichen experimentellen Bedingungen ausge setzt wurden, jedoch ohne die Anwendung von elek trischen Feldpulsen, produzierten keine oder nur einzelne Klone.

Tabelle 1

Tabelle 2

Vergleich der Ausbeuten von stabilen Klonen, die mit zirkularer und linearer Plasmid-DNA erhalten wurden. Die Ergebnisse wurden in parallelen Experimenten erhalten, wobei 1 g/ml DNA und 1,3 bzw. 2,4 × 10⁶ Zellen/ml für die zirkulare und die lineare Form von DNA verwendet wurden.

Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zum feldinduzierten Einschleusen von Makromolekülen, wie z. B. von genetischen Infor mationsträgern, insbesondere DNA, und in der Größe vergleichbaren Biomolekülen, wie z. B. Proteinen, in lebende Zellen, das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:

a) enzymatische Vorbehandlung der Zellen;
b) Suspendieren der Zellen in einem wässrigen; isotonischen Medium;
c) Temperieren der Zellsuspension auf eine Temperatur zwischen 0° C und 25° C;
d) Anwendung elektrischer Feldpulse zur Schaffung von ausheilbaren Membrandurchbrüchen;
e) Erwärmen der Zellsuspension zum Ausheilen der Membrandurchbrüche nach dem Applizieren der Feldpulse auf eine Temperatur oberhalb der Raumtemperatur,

wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß

f) die enzymatische Vorbehandlung mit proto lytischen Enzymen erfolgt, daß
g) das isotonische wässrige Medium mit einem Elektrolyt- und einem Nichtelektrolyt-Anteil zum Suspendieren der Zellen für die eigent liche Einschleusung der Makromoleküle ver wendet wird, daß
h) die Suspension auf eine Temperatur zwischen 0° C und 10° C abgekühlt wird, und daß
i) ein oder mehrere elektrische Feldpulse mit superkritischer Feldstärke appliziert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als protolytische Enzyme Dispase oder Pronase verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zellsuspension auf ungefähr 4° C abgekühlt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die superkritische Feldstärke das Zwei- bis Dreifache der kritischen Feldstärke beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Applizieren des Feldpulses oder der Feldpulse auf ungefähr 37°C erwärmt wird.

6. Medium zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß der Elektrolytanteil 25 mMol bis 60 mMol beträgt und daß der Nichtelektrolytanteil eine Konzentration aufweist, durch die die Osmolarität des Mediums so weit erhöht wird, daß das Medium isotonisch ist.

7. Medium nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektrolytanteil ungefähr 30 mMol beträgt.

8. Medium nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn zeichnet, daß der Elektrolytanteil ein- oder zweiwertige Kationen und ein- oder zweiwertige Anionen umfaßt.

9. Medium nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Nichtelektrolytanteil einen oder mehrere aus der Reihe der Nichtelek trolyte der Zucker, Zuckeralkohole, Aminozucker und dazu verwandte Verbindungen, wie z. B. Inosit, umfaßt.

10. Medium nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektrolytanteil einen Phosphatpuffer umfaßt.