JPS62501537A - リンパ球細胞を電気的に不滅化するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

リンパ球細胞を電気的に不滅化するための方法発明の背景 この発明は、クローン化された細胞性の腫瘍遺伝子を高電圧の電場によって導入 することにより不滅化されたリンパ球細胞を調製するための方法、ならびにこの 方法により調製された不滅化されたリンパ球細胞に関するものである。 大半の動物細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養された場合はとんど成長しないか、 あるいは全く成長しない。通常、このような細胞培養は密度依存性成長、すなわ ち細胞密度が高くなるにつれて細胞生産が制限されるという現象を示す。さらに 、大半のヒトの細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養では約５０世代後に成長する能 力を送出する。のみならず、抗体産生を有するヒトリンパ系Ｂ細胞のような細胞 は、通常は、一時的にのみ、かつ、ある種の外因性の刺激に応答してのみ多量の 抗体を産生する。このような細胞は、＋ｎ　ｖＨｒｏで培養された場合所望の蛋 白質を生産する能力を失いがちである。 他方、不滅化された細胞は、ｉｎ　ＶｉｔｒＯで不定に成長づる能力を有する。 しばしば、これらの不滅化された細胞は、免疫グロブリンのような特別の蛋白質 を生産づ−る能力を保持している。単一の不滅化された抗体産生細胞からの培養 成長は、モノクローナル抗体を生じる。ヒトリンパ球細胞は、＠歯頚動物および 他のモデルで成功してきた多くの技術による不滅化に驚くべきほど不応性を示す ことがわかった。 培養においてモノクローナル抗体を生産するＩ、：めにリンパ球系細胞を不滅化 づるいくつかの技術が現在用いられている。多分、大半の広範に用いられている 技術は、ジー・＝１ラーおよびシー・ミルスタイン（Ｇ　、　Ｋ　ｏｈｌｅｒお よびＣ１八４ｉ１Ｓｔｅｉ［１）　、Ｎａｔｕｒｅ　５２６　：　４９５−４９ ７　（１９７５）および［１：ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｐｌ＋ ａｒｍａｅｏｌｏ　ｇｙ　Ｇ　二　５１１−５１９（１９７６）に記載されてい るように、形質転換された細胞系でリンパ系を交雑づるものである。これらの先 行技術は、骨髄腫細胞またはウィルスで形質転換された細胞系をリンパ系Ｂ細胞 群で融合する技術を説明しでいる。この形質転換され！ζ系は、このＭ秤に対し 、て不滅性（づなわら培養に（１，９いて成長するＯＬ力）を与える。このリン パ系Ｂ細胞は、雑種に対し−（、所望の抗体の小さな鎖および人さ・な鎮を作る 能力を与える。一般的には、このような細胞融合は、メヂエータとしてポリエチ レングリコールまたは硫酸デキスｌ〜ランを用いることにより行なわれ（さた。 得られる雑種くづ−なわｆ５ハイブリドーマ）は、分離され、かつモノクローナ ル抗体を独立に生産フる独立の培地内で成長ｊる。 最近になって用いられてさ・た他の細胞融合技術は、電気的な細胞融合である。 電気的融合では、２秤の親細胞が、非導電性の同浸透圧性環境のもとに配置され る。これらの細胞を融合ブーるように電気的に配列させるために、交流が用いら れる。短いａｉ雷電圧直流パルスにこれらのＳ胞＠晒すと、細胞膜が圧縮され、 細胞融合が生じる。たとえば、ニー・ライマーマンおよびジエー・グレインジ＜ ｕ、ｚｉ＋ａｍｅｒｍａｒ＋＃３よびＪ　、　Ｑ　ｒｅｙｓｏｎ）の［Ｅ　１ｅ ｃｔｒｉｃ　Ｆ　１ｃｌｄ　−１ｎｄｕｃｃｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏｎ　”　 ３ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　３ｅｐｔｃｍｂｃｒ／Ｑｃｔｏｂｅｒ　１９８ ３　：　１１８−１２２　Ｊを参照されたい。 これらの融合技術には大きな制約がある。第１に、抗体産生ｓ１胞を不滅化づ° ると多聞の遺伝情報を導入ブーることになるが、そのごく一部のみが成長および 不滅化に必要なものである。すなわら、わずか１個の、あるいは多くともいくつ かの遺伝子が、得られたハイブリドーマの不滅性についての役割を担うものであ るが、不滅性の親のはとｌνどすべての遺伝情報がこの雑種に移転されることに なる。この融合技術の他の欠点は、融合が選択的なものではなく、２個の親のい ずれかの間で、ならびに２を越える細胞間で非産生のＩＩ胞融合が生じることで ある。 ヒトのリンパ球細胞を不滅化するための他の方法は、Ｅ−８ウイルス（ＥＢＶ） の形質転換ならびにＲＮＡ肝癌ウィルスの形質転換である。たとえば、エヌ・ブ ラウンおよびジー・ミラー（Ｎ、３ｒｏｗｎおよびＧ、　ＭＮＩｃｒ　）「”　 ｌＩｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　Ｈｕｍａｎ　Ｂ− Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｃｓ　Ｃ１ｏｎａｌｌｙ　ｌ−ｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ 　ｌ：ｐｓｔｅｉｎ　３ａｒｒ■１ｒＵｓ”、　Ｊ　、Ｉ　＋＋ｌＩＩｌｕｎｏ ｌｏｇｙ　１２８　：　２４−２９　（１９８２）　Ｊを参照されたい。この方 法では、ヒトリンパ球細胞はＢ　ＩＩＩ胞に特異的なウィルスにより感染される 。このウィルス性の形質転換は、細胞の不滅化および成長を導く。この方法の欠 点は、ウィルス自身ならびにウィルス性生産物を）５染づる合成の可能性がある ことであり、これはほとんど抗体を合成しない。また、現在のデータは、ＥＢＶ 感染による長期間の成長は、わずかな聞のウィルス性ゲノムのみを生じることを 示している。最近では、抗体産生細胞のＥＢＶ感染に引続き先のヒト８１１１１ １ｄとマウスのｆＪＩｌ）ＩＥＩｊ融合により作られた交雑系を用いてこの細胞 を連続的に融合することにより、上記したウィルス性のＤＮＡ汚染物が除去され ている。 このようにして得られる交雑細胞は、ＥＢＶ　ＤＮＡを含んでおらず、かつマウ スのゲノムをほとんど含んでいないが、特定８のヒト抗体を生産づる。 前述した各方法は、抗体を生産する長寿命の交雑細胞系を生産し得ることは明ら かであるが、これらの技術のジベてが、所望の不滅化されたｍ胞系を実現プるた めに極めて過量の遺伝情報を利用している。この過剰の遺伝子付加は、この細胞 系に不安定性をもたらし得る。 Ｉｌｌ胞内に遺伝子を導入づ゛るための他の方法が現在用いられている。大半の 円通の方法は、Ｃａ　ＰＯ４トランスフェクションであり、この方法では所望の 遺伝子を細胞表面に沈降させ、次に該遺伝子を食させ、あるいは他の方法で細胞 内に一体化させる。ヒトリンパ系Ｂ細胞およびリンパ芽球が、このＣａ　ＰＯ， トランスフェクション方法には不適切なものであることがわかった。このため、 他の方法が用いられてきている。たとえば、人工の脂質バッグ（リボソ−ム〉に 問題の遺伝子を封入し、続いてポリエチレングリコールによ、り融合し、または 電気的に融合覆る方法が挙げられる。使用されている他の技術は、顕微鏡および 微小マニビコレータを利用して細胞内に遺伝子を直接注入するものである。これ らの方法は作業が煩雑であり、うまくいく場合はかなり制限される。 ｌＱｍに、トランスフェクション技術あるいは注入技術に関する改良方法は、問 題の遺伝子を保有しているが、それ自身を再生産し４ｇないように遺伝子操作さ れたＲ　ＮΔ肝腸瘍ウィルスようなレトロウィルス・ベクターを構成づることで ある。使用されるウィルスは、感染づることができ、かつヒＩ−８リンパ芽球ゲ ノムに安定に一体化し得る。この方法は、上述した方法を人さく改善づ−るもの であるが、この方法を使用づることは、いくつかの理由により批判されている。 訝１１に、細胞の連続的４Ｔ増殖ならびに連続的な再感染を多分引起こすヘルパ ーウィルスの存在下に、これらのウィルスが生産される。さらに、その由来およ び発病力が知られていない潜伏性の複製覆ることができないウィルスを細胞が含 むかもしれない。この感染力を有づるウィルスからのＲＮＡウィルスゲノムが存 在するど、多分、これらの潜伏性のすなわち複製することができないウィルスを 修正し、あるいは活性化させることになるであろう。最後に、レトロウィルス・ ベクターの構成は、がなりの専門的能力を有する非常にｉＩ′Ｉｉ度な技術であ る。 よって、この発明の目的の１つは、ウィルス複製の危険性なしに不滅性を与える 細胞内に遺伝子を導入することである。 この発明の伯の目的は、不滅化に必要なりＮＡのみを用いてリンパ系Ｂ細胞を不 滅化する技術を提供づるごとにある。この発明のさらに他の目的は、発癌遺伝子 で不滅化さｉ、、　／、、：、安定な七ツク［］−ノル抗体産生細胞系を１ｉｌ 供づることにある。 この発明の他の目的、特徴および効果は、下記の発明の説明から明らかとなるで あろう。 １」匹１眠乞距乱 前述した目的に従って、この発明１４１、不滅化作用べりるＤＮＡをターゲット の細胞内に電気的に挿入づるＪどよりリンパ球細胞を不滅化する方法を提供りる 。この方法トｔ、２個の電極間にリンパ球細胞を配買し、該細胞に腫瘍遺伝子を 含むデオキシリポ核酸セグメン１〜を加え、該ディ１ジリボ核酸を少なくともい くつかの細胞内に導入するために、約０．１ツノ秒〜約１０ミリ秒のパルスで電 極に電位を印加して約１〜約４０ＫＶ／ｃｍの電＠を作ることにより少なくとも いくつかの細胞を不滅化する、各ステップを備える。 通常は、約５〜約５０μｓの良さを有し、かつ約２〜約１０ＫＶ／ｅｍの電位を 右する２個から７四のパルス、好ましくは３個〜５個のパルスが用いられる。 （ヒト由来の）ｃｍｙｃ３３Ｉ伝子は、プラスミドでまたは遊間のＤＮＡ鎖のい ずれかとしてヒトリンパ系細胞に導入されると、多聞のこれらの細胞に安定に合 体しかつこれらを不滅化し得る。この技術分野の研究省達は、Ｉ［Ｉ＠遺伝子が ある棒の不滅化された細胞の形質転換にＪ３いて何らかの役割を果たＶことを長 い間認識していたが、里−の外因性の細胞性腫ＩＡ遺伝子がこのようにリンパ系 Ｂ細胞を形質転換し得ることはこれまで認識してＪ３らず、また説明されてもい なかっ１．：、シたがって、この発明は、この単一の遺伝子が現実にリンパ系Ｂ 細胞を形質転換し１ワるという発見、ならびにこれらの遺伝子を導入するための 単純化された効率的な方法の発見によるものである。 この発明のさらに他の局面では、前述した方法により生産された不滅化された細 胞が提供される。また、この発明は、ヒトリンパ系細胞を不滅化するためにその ゲノムに合体凸れた外因性の細胞性Ｂ瘍逍伝子（好ましくはヒトＣ−ｍｙｃ　） を有するヒトリンパ系細胞を含む。これらの不滅化された細胞は、好ましくは、 モノクローナル抗体を産生し得る独立の細胞系の形態にある。 ぬ支旦亘太上Ｊ１．．ｌＬ！じすを匪 この明細内および請求の範囲で用いられているように：用ｉ！ｎｒＤＮ△１また はｆ’ＤＮＡポリマー」はデオキシリボ核酸のポリマーを意味覆るものである。 用３ｎ「裸のＤＮＡ（ｎａｋｅｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）　Ｊ　ハ、細胞、ウィルスま たは小胞のような組織プなわち構造に含まれていないＤＮＡを意味づる。裸のＤ ＮＡは、通常、溶液中または懸濁液中に浮遊しているＤＮＡである。 細胞に関して用いられている用語「Ａ囚性ＤＮＡ」は、その細胞またはその幹細 胞外の源からのＤＮＡを意味する。 「腫瘍遺伝子」を修飾づるために用いられる場合、用語「細胞性」　（または略 ｉｉ５１“ＣＪ）は、（ウィルス性源に対するての）Ｉｌｌ胞性源からの８瘍遺 伝子を意味ザる。 細胞を説明づるのに用いられている場合、用語［不滅性の］または「不滅化され たＪは、外因性の成長要素なしにｉｎ　ｖｉｔｒｏで不定に成長する能力を獲得 した細胞を意味づる。 不滅化は、少なくとも数か月の期間にわたり安定に成長することを要求する。培 養による成熟核ｍ胞の集落の単なる生成は、不滅化を表わづものではない。この ような不滅性の細胞は、通常ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいで懸濁液中で成長づる。 この発明に４３いて用いられる腫瘍遺伝子は、哺乳動物の細胞、好ましくはヒト の細胞から分離される。この発明の技術を用いてリンパ球細胞のゲノムに合体さ れた場合に該リンパ球細胞を不滅化する特定の腫瘍遺伝子の能力は、標準的な技 術を用いて該遺伝子をクローニングし、本明細書で述べられている電気的な技術 を用いてリンパ球細胞内にクローン化された遺伝子を挿入し、そのように！８理 されたリンパ球細胞を培放し、安定成長および蛋白質生産について得られた細胞 系を試験することにより、容易に決定づ゛ることができる。 この発明において用いるのに好ましい不滅性を与える腫瘍遺伝子は、ｃ−ｍｙｃ 腫瘍遺伝子である。ヒｌ−ｅ−ｍｙｃ肝瘍遺伝子の分離についての手順は、次の 文献に述べられでイル（［）ａｌｌａ−１”ａｖｅｒａ、Ｒ，Ｅｔａｌ、、（Ｎ ａｔｕｒｅ２９９　：６ｌ−６３（１０８２）　；Ｑａｌｌａ−「ａｖｅｒａ、 Ｒ，、ｐｒｏｃ、Ｎａじ１Δｃａｄ、３ｃｉ、　Ｕ、　３．Δ、　７９：　Ｇ４ ９７−６５０１　（１９８２）　；Ｔａｕｂ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、ｐｒｏｃ　Ｎａ ｔ’　１．６１ｃａｄ、３ｃｉ、　ＬＪ。 Ｓ、Δ、　７９：　７８３７−７８４１．ｕ！Ｊ８２）　：　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ 、　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　１Δｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Δ 、　８０　：　７５８１−７５８５ヒトｃ−ｎ＋ｙｃｌ仏子は、マウスのものに 比べられる染色体＃８Ｊ３よび制限酵素断片に地図化され、［Ｄａｌｌａ　Ｆａ ｖＯｒａ、Ｒ，ａｔ　ａｌ　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　１　Ａｃａｄ、Ｕ、Ｓ、Δ。 ７９　：　７８２４−７８２７　（１９８２）　］　’Ｊらびに核酸配列順序１ １３よび制限酵素の消化物および断片分析は、［ＷａｔＳＯｎ、Ｄ、　Ｋ。 ｅｔ　ａｔ、ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、３ｃｔ、　ｊｌ、　Ｓ、Δ、 ８０：３６４２−３６４５　（１９８３）　］において説明されており、かつＣ −ＩｌｙＣおよびｖ−ａｔｙｃをイｉするちのに比較されている。 ヒトｃ−ｍｙｃ３ｊｌ伝子の分ｍｌ　８３よび分析のための探ｔａは、［Ｌ　ａ ｕｔｅｎｂａｒｇｅｒ、Ｊ　、　Ａ、　ｅｔ　ａｔ　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　Ｉ　 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７８：　１５１８−１５２２（１９８１）　；　 Ｄａｌｌａ　−Ｆａｖｅｒａ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　２０９　：６ｌ −６３（１９８２）　；Ｄａｌｌａ−）”ａｖｅｒａ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ　ｐｒｏ ｃ　Ｎａｔ’　１八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、７９：　７８２４−７ ８２７（１９８２）　：　Ｔａｕｂ、Ｒ。 Ｃｔ　ａｉ、　ｐｒｏｃ　Ｎａじ　１　△ｅａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、△、　７ ９ニアＢ５７−７８４１（１９８２）　；Ｗｉｎｍａｎ、　ｌ（、Ｑ、　ａｔ　 ａｌ、　ｐｒｏｃＮａｔ’１　Δｃａｃｌ、　３ｃｉ、（Ｊ、３．　Δ、８１　 ：　６７８９−６８０２　（１９８４）］ニＨａ載されでおり、あルイはｐｎ＋ ｙｃ、１−ＴＭ　（Ｏｎｃｏｒ、　Ｐ、Ｑ、　ＢＯＸ　８７０．　Ｑａｉｔｈｅ ｒｓｂｕｒｇ、ｌｙｌ［）、２０８７７）　）として商業的に入手可能である。 弁部された＋１！Ｔ！瘍）責伝了をクローン化するのに用いる特定の技術は制限 的なものではない。ヒｈＣ−Ｊ’Ｃ遺伝子は、（１−ｅｖｉｓ、　Ｒ，ａｒｉｄ 　３．　ｐｅｎｍＬ！ｎ　Ｊ、　Ｍｏｌ（ＩＣ，３ｉｏ１．１２１：２１９−２ ３９　（１９７８）　：　Ｗａｈｌ、Ｇ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、Ｐｒｏｃ　Ｎａ １′１Δｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Δ、　７６　：　３６８３−、、３６１ ３７　（１９７９）に記載されズいるように）細胞を溶解し、プロプイナー１に で消化し、フェノールで抽出しかつエタノールで沈澱ざけることにより調製され た高分子量のヒ１−逍伝子性ＤＮへが、消化されて制限酵素ＥＣ０ＲＩおよびｔ ｌｉｎｄｌｌｌを結合づることにより完成されると、（Ｗａｔｓｏｎ、Ｄ、　Ｋ 、　ｅｔ　ａｌ、ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　１△ｃａｄ、３ｃｉ、　（Ｊ、３、△、 　８０：　３６４２−３６４５　（１９Ｂ３）に記載され１いるように）蛋白ｉ に究極的に翻訳された核酸配列順序を含む３個の核酸セグメントを有する完全ｃ 　−ｍｙｃ逍伝子を含む８．２Ｋｂ断片を！ｊえる。 この遺伝子は、好ましくは、ヒト前骨髄細胞性白血病系から分離され（Ｃｏｌｌ ｉｎｓ、　Ｓ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｉ、Ｎａｔｕｒｃ　２７０　：３４７−３４９ 　（１９７７）　）、ｃ−ＩｌｙＣの１６〜３２１１Ｆａの複写を含んでいるが ［Ｄａｌｌａ−１：ａｖｅｒａ、Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ　２９９　：６１−６３　（ １’１８２）　１　、正常の完全ｃ−ｍｙｃ遺伝子を含むヒトの静脈および組織 からも分離され得る（すなわち、Ｔａｕｂ。 Ｒ，、ｅＬ　ａｌ、ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　１Δｃａｄ、３ｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　 Ａ。 ７９　：　７８３７−７８１Ｎ　１９８２）。 ８．２Ｋｂ　ＥＣ０Ｒ１／Ｈｉｎｄ　ｍ断片は、標準的な分子クローニング技術 ［Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： 　Ａ　−１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ ｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　３ｐｒｉｎｇ　）−１ａｒｂｏｒ 、Ｎ０Ｗｙｏｒｋ　（１９８２）　１を適用することにより大半のＤＮＡから分 離され、かつ大腸菌Ｄ　Ｈ、を用いるｐＵＣ８またはＩ）ＢＲ３２２プラスミド にクローン化される。この制限酵素の消化物は、低融点のアガロースゲル電気泳 動により分離される。８．２Ｋｂｆｒｌ域は、切断され、アガロースを溶解する ために６５℃の温度まで加熱され、かつＱＮＡＲ１１’ｉ片がフェノールにより 抽出されさらにニチノール沈降により回収される。 ＥＣＯＲ１／Ｈｉｎｄ　ｍＫ片は、酸による前処］！Ｉ！［Ｗａｈｌ。 Ｑ、　Ｍ、　ａｔ　ａｔ、ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、３ｃｉ、　ＩＪ 、　３゜△、　７６　：　３６８３−３６８７　（１９７９）　］および切断− 翻訳された［ＲｉｄｂＬ　Ｐ、　Ｗ、Ｊ、　Ｍｏ１．３ｉｏ１，１１３：　２３ ７−２５１（１９７７）　］　ＩｌｙＣ−Ｍ転子探針（Ｑ　ｎｃｏｒ、　Ｑ　ａ ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。 Ｍ、Ｄ、）への交雑を用いて、分離およびサザン・プロット転位［３ｏｕｔｈｅ ｒｎ　Ｅ、　Ｍ、Ｊ、　Ｍｏｌ　３ｉｏ１．９８　：　５０３−５１７　（１９ ７５）　］のための従来の０．８％アガロースゲル司気気泳動用いることにより 同定される。Ｅ　ｃｏＲ１／　ｌ−１ｉｎｄ　ｌ［の８．２Ｋｂ断片領域に対す るとの探針の反応についての１５適のストリンジェント条件〈交１１２度および ホルムアミド濃度）は、製造する者の考えに従って発展される。 親プラスミドベクターを［ｃｏＲ１／および）（ｉｎｄ［制限酵素で切断し、過 剰の８．２Ｋｂ断片（′！ｊ′なわち１０μ９／２μのプラスミド）により結繋 反応を施し、大ｙｌＡ菌ＤＨ１を形質転換しくＨａｎａｈａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　 Ｍｏｌ、　［３ｉｏ１．１６６：５５７−５８０　（１９８３）　）　、アンピ シリン（ａｍｐｉｃＮｌｉｎ）抵抗を選択することにより、この８．２Ｋｂ　Ｅ Ｃ０Ｒ１／Ｈｉｎｄｌｌ）制限断片は、プラスミドｐＵ　Ｃ８または［）Ｂ　Ｒ ３２２に結繋される。このＤ１１１宿主

【よ、２００Ｉ＋のプレートあたり１０ ０，０００セルの密度に配置され、活性を有する集落は、結紙に移され［Ｑｅｒ ｇｃｎ、Ｊ、　Ｐ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７　：　 ２１１５−２１３５　（１９７０）　］　、ａ＋ｙｅ遺伝子の探針に交雑される 。この陽性領域は、肉汁培地に擦りつけられ、スペースを与えるためのプレート を右するアンビシン上で再培長される。このクローンは、配列され、ｍｙｃ遺伝 子の探針に対して再度スクリーニングされ、かつ単一の集落が分離される。代わ りに、軟らかいアガロース電気泳動ゲルのＥ　ＣＯＲ１／　ｉｔ　１ｒｉｄ　ｍ 領域からの８．２Ｋｂ断片、を、大腸菌ファージ　ラムダ　カロン　ベクター２ ８　（Ｒ１ｆｆｉｎ。 Ｄ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｔ、ＧｅｎＱ　１２二３０１−　３０９（１９５０）　） を用いてプラスミドを栴成するに先立ち、クローン化してもよい。 挿入すした８、　２Ｋｂ　ｃ−ｍｙｃ遺伝子を含むプラスミドを右する適当な集 落は、Ｅ　ＣＯＲ１／　Ｈｉｎｄ　■で消化されたプラスミドの微小片のゲル７ Ｇ気泳動された試料のＬＩｌｙｃ遺伝子の探針に対してサザンプロット分析法に より同定される。 このｃ−ｍｙｃ逼仏子の同定は、診断療法的な制限断片分析法　（Ｗ　ａｔｓｏ ｎ、　Ｄ、　Ｋ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　１　Δ　ｃａｄ、　３　ｃｉ　、Ｕ　 。 Ｓ、Δ、　８０：　３６４２−６３４５　（１９８３）　）　：　Ｄａｌｌａ　 −Ｆａｖｃｒａ。 Ｒ，ｐｒｏｃＮａじ１△ｅａｄ、３ｃｉ、　（Ｊ、　３．△、　７９　：　６４ ９７−６５０１　（１９８２）　）により確立されている。 この電気泳動法において用いられるべき遺伝子または遺伝子断片を含むプラスミ ドＤＮＡは、肉汁を含むアンピシリン中で適切なり　）−１１染色体を人聞培養 することにより、ならびにこの培地をクロラムフェニコールにより拡大づること 、ｌ１ｌＩ胞をリゾブーム−トリトンＸ−１００で溶解すること［１（ａｔｚ、 Ｌ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、　［３ａｃｒｅｒｉｏｌ、　１１４　：５７７− ５９１　（１９７３）　］および］塩化セシウムー央化エブージウム′！ｌなわ ちホミディウム）平衡遠心分前［ＲａｄｉｏＨ，Ｒ。 Ｗ、　Ｃｔ　ａｌ、ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、３ｅｉ、　Ｕ、　Ｓ、 　Ａ。 ５７　：　１５１４−１５２１　（１９６７）　］により調製される。 所望の腫瘍遺伝子を含む分離された裸のＤＮＡは、プラスミドベクター〇状態で リンパ球細胞に挿入されても、よい。 しかしながら、この腫瘍遺伝子を裸のＤＮＡの線状セグメントとして押入した場 合に、形質転換および不滅化がより効果的である。このクローン化された遺伝子 を直線状にしかつプラスミドから分離するために１適切む制限酵素を用いてもよ い。ｃ−ｍｙｅ３ｆｉ伝子は、ＨｉｎｄＴＭおよびＥＣ０ＲＩを用いＴ８．２Ｋ ｂセグメンｌ−Ｌ、Ｃ’１ｌｌＢＲ３２２がら分離され１りる。 この発明の技術を用い１不滅化され（１する細胞はリンパ球細胞、好ましく１． ｔヒ１へ由来のリンパ球細胞を含む。好ましい細胞は、所望の蛋白質またはポリ パブ１ドを生じるピトリンバ系１３梢胞である。このＪ：うな蛋白質Ｊ３よびボ リペプチドは、特定の抗原に対する抗体、■細胞成長因子およびＢ細胞成長因子 を含む。 この発明の方法では、所望のリンパ球細胞を含むｍ胞懸渇液が調製される。約０ ．３モルのマンニトール、ソルビトール、グル」−ス、サクロースまたはヒスデ シンのような比較的非導電性の懸濁物が好ましい、肺癌遺伝子を含む裸のＤＮＡ ［グメントは、この懸濁液に加えられ、かつ該懸濁液が２本の電極間に配置され る。この電極を０．３〜１．０ＣＩＩｌｌｌｉｌｉｔ、て配置したときに良ＩＥ な結果が得られる。アメリカ合衆国サンジエゴのマックスウェル・マニコフ？ク ヂャリング・カンパニーによりｒｌＪ造された電気的融合用ブーヤンバのような 、このような電極を含む標準的な電気的融合用チャンバを用いることができる。 リンパ球細胞中へのＤＮＡの挿入は、裸の腫瘍遺伝子を含む細胞懸濁液に少なく とも１個、好ましくは２個ないし７個の電気的パルスを与えることより達成され る。、３個〜５個のパルスを用いることが好ましい。パルスの長さは、約Ｑ、１ ｎｓから約１０１１１５であってよい。通常は、このパルス長は約５〜約５０μ ｓである。 Ｎ極に約１〜約４０ＫＶ／ｃｍの電位を与え得る何らかの適ｌ、７Ｊな電源を用 いることができる。通常は、約２〜約１０ＫＶ／（Ｊの電位を用いる。このパル スは、パルス変換器および／またはコンデンサの放電を利用したような従来の技 術により発生させることができる。サンジエゴ市のマックスウェル・マニュファ クヂャリング・コーポレーションにより開発されたような標準的な電気的細胞融 合装四におけるいくつかの商業的に入手可能なパルスジェネレータが、適当な電 気パルスを与え得る。他の適切なパルスジェネレータは、ヒユーレットバラカー ド社のモデル２１４Ｂである。 細胞に電気的パルスを与えると細胞膜が一時的に透過性を右づ゛るようになると いう仮説が立てられている。ｚ　ｉｍｍｅｒｍａｎＪｊよびＱ　ｒｅｙｓｏｎ、 “Ｅ　Ｉｅｃｔｒｉｃ　Ｆ　１ｅｌｄ　−１ｎｄｕｃｅｄ　ＱＣｌｌ　［ｕｓｉ ｏｎ　”　、　３ｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３ｐｅｔｅｍｂｅｒ／Ｑｃｔｏ ｂｃｒ　１９８３　：　１１８．を参照さレタイ。 電気的パルスの処理に続いて、細胞の懸濁液を低温、たとえば４℃または室温に て約１０分ないし１５分間放置させる。′Ｆｉ気泳肋され！、：細胞膜を正常な 状態に復帰させるのにこの静置′！￥Ｊ間が必要であり、この時間の間に、細Ｉ ｌ＆膜が裸の外因性ＤＮＡに対する透過性を相持すると考えられる。 細胞のａｍ液は、次に希釈され、適切な培地に埋め込まれる。３７℃で幾日かイ ンキュベーションした後、不滅化されたＩＩＩＩ胞の成長を１１５２寮する。次 に、単一集落の分離体を得て、所望の蛋白質を生産づる特定の細胞を同定し、か つ標準的な技術を用いて培養づることができる。 この技術は、ヒト由来のモノクローナル抗体産生細胞系を得るのに特に重要であ る。倫理的な束縛により、比較的多数のリンパ球細胞がその内部で所望の抗体を 産生ずる動物から細胞試料を得る従来の技術は、ヒトの細胞を１！７るのに用い ることはできない。したがって、ヒトの細胞Ｗ３濁液中における所望の細胞のぬ 度が極めて低いので、高い形質転換効率を示づ゛技術は特に１ｉｌｌｉｖ！１の あるものである。 従来作られていた細胞と異なり、この発明により生み出された細胞は、該細胞を 不滅性にす゛る、そのゲノムに一体化された外因性の細胞性Ｈｍ遺伝子を有する 。このようも不滅化されたヒ１−のリンパ球細胞は、この発明の一部をなづ゛も のと考えられる。 この発明から得られる抗体産生細胞は、従来法により得られるものとは異なる。 公知の形質転換ウィルスまたはウィルス性ゲノムは何ら導入されていない。腫瘍 遺伝子は、細胞の分化および成熟の間用いられる天然功信号を与、えるものと考 えられる。通常、これらの表現は、染色体中の正常なコントロール領域すなわち 信号に対する位置または近接度によりコントロールされる。この発明の形質転換 された細胞では、表現が正常な細胞制御機構により阻害されない位置に肝’ＤＡ Ｍ伝子が単純に合体されていると考えられる。 染色体の負荷は変化せず、′ｇなわち付加的４ｒ染色体は導入されない。 宋ＪｉＪＬ 新鮮な扁桃腺をガーリック・プレスを通過させることによりｉｌ１ｗａ懸濁液に 分散させた。用いるまで、この得られた扁桃腺由来の細胞懸濁液のバンクの干渉 塩溶液を４℃の温瓜で保存した。 前骨髄細胞性白血病細胞系１−Ｉ　Ｌ　−６０から分離したヒトＣ−ｆｆ１ｙＣ 遺伝子を含む再結合性ｐＢＲ３２２プラスミドを、［Ｄ、　ｐａｖｅｒａ、　ａ ｔ　ａｌ。　“Ｑ　ｎｃ　Ｑ　ｅｎｃΔ１ｌｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎ　ｐｒ ｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｅ　ｌ−ｅｕｋｅｍｉａ　Ｃｅ１ｌ　ｉｎ　＋−！Ｌ−Ｇ ｏ　ａｎｄｐ　ｒｔｌｌａｒｙｌ−ＱＵｋａｅｍｔＣＣｅ１ｌＳ　ｏｆ　ｔｈｅ 　３ａｍｃ　ｐ　ａｔｉｅｎｔ”、　Ｎａｔｕｒｅ　２０９　：　Ｇ１−６３　 （１９８２）およびＤ　、　Ｆ　ａｖｃｒａ、　ｅｔａｌ、、“Ｃｌｏｎｉｎｇ 　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　［）　１Ｈｅｒｅｎｔ　 Ｈｕｍａｎ　３ｅｑｕｅｎｅｅｓ　Ｒｅ１ａｔｃｄ　ｔｏ　ｔｈＯＱｎｃ　Ｇｅ ｎｃ（ｃ−ｍｙｃ）ｏｆ　Δｖｉａｎ　Ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ　Ｖ ｉｒｕｓ（ＭＯ２９＞　”　、　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ’　１△ｅａｄ、３ｅｉ、　 Ｕ、　Ｓ、　Ａ。 ７９　：　６４９７−６５０１　（１９８２）　］に記載されているようにして 得た。 このプラスミドはトランスフェクションされ、かつ標準的な方法によって大胆菌 内でアンピリジンにより拡大される。たとえばＦ、　３ｏ１ｉｖａｒ、　ａｔ　 ａｌ、、　Ｑｅｎｅ　２　：　９５−１１３（１９７７）　：　ＭｏｒｒＯＷ、 Ｏｔ　ａｔ、、　ｐ　ｒＱＣ，Ｎａｔ’　１１　、△Ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＪ、 Ｓ、△。　７１　：　１７４３−１７４７　（１９７４）　ＨＱ　ｒｕｎｓｔｅ ｉｎ　＆　１ｌＬｌｊｌｒｅｓ３．　ｐ　ｒＯｃ、ｌ’Ｊａｔ’　１’　、Δｃ ａｄ、　３Ｃｉ［Ｊ、３．Δ、　７２　：　３９６１−３９６５　（１９７５） 　：　Ｊ３．ｌ：びＢｅｒｎａｒｄ＆　ｌ−１ｅｌｉｎｓｋｉ、Ｑｅｎｅ目ｃ　 Ｆｎｇｉｎｃｅｒｉｎｇ　ｐ　ｒｉｎｅｉｐｌａｓ　ａｎｄ　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ 　２　（１９Ｊ１０）　Ｙｉ　光照（きれたい。 このようにＬ）（゛得られた１ラスミドを、精製し、そのまま用いるか、あるい は続イーＣＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｅ　ＣＯＲ１消化ａ３ヨびさらに精製を行’３　 ｍ’ｌ　Ｔ　Ｃ−ｍｙｃ　遺伝子（８，２Ｋｂ挿入体）としで用いｒ、：　。 上述のようにし・てｒＪ、’ｌ製された扁桃腺の細胞（約５０９６のリンパ系１ ３１ｔｆｌ　ｆｌａ　）を、５００　ｘＧ　ｒ　５分間５〈ｊ心分幼しｆ、：、 。 吸引によりバンクＴ渉液を除去し・、さらに細胞ベレッ１−を・、冷ｌζい滅菌 １ノ１：、：０．３ｆルの７−二１・−ノド。ｐｌ−１７′、２内にｍ度墾濁さ １！：てｎル８細胞密度を２−１；ロベＮＯ’細胞数、、、、／　ｔｎ　ｌとし た９、（約１１０１ｉＩ＋７）ｔ〜リスートｉ　（／　Ｉ、０　、５　ｍｈｉの ［ＤＴ　Ａす！−リウムｊＭ、ｐｆ１７．４中ｋＺ１ｍｇ／ｍｌの）この遺伝子 を含むＣ・−ｍｙｃ遺伝子、に１．、：はプラスミ１：を細胞懸濁液に加えた。 一般的「は、１０μｍを加え、これＧｔｌｌｌｌｌあたり１０１３〜１０′８個 の遺伝子を表わ寸。この懸濁液を緩かに混合し、サンジエゴのマクスウェルツー ボレーシコンにより作られた多用の予め冷却されたステンレススチール製の電気 的融合用チトンバに移した。４ＫＶ／ｃｍ〜７に■／ａｍの弾痕の電場を電極間 に形成ｌる４個の電気的なパルスにより、このリンパ球細胞を、ｃ−ｉｙｃｌ伝 了またはプラスミドに対して透過性とした。このパルス長は５〜５０μ秒であっ た。この１１液をパルス間に１０〜２０秒の間緩かに混合した。パルスを加えら れた細胞懸濁液を、約１５分間約４℃で氷上に載置させた。次に、１０％のウシ の胎児の血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭＩ−１６４０Ｗ体で１：１０〜１：１５に この懸濁液を希釈した。＋４７られた希釈された懸濁液を注意深く遠心分離し、 がっＲＰＭＩ−１０％　Ｆ　Ｃ３ｋＴ　５　Ｘ　１０　’　１ＸＫｂ’　シ１０ ’　ＩＭＩＩ１１１ａ／ｌＩト’＞ルＪ：うに再度懸濁させた。この１１の単位 を、２４ウエルの培養皿の各ウェルに植え付けた。成長が見られるまで、約７な いし１０日経過するまで、５％ＣＯ２雰囲気のもζにこの培養皿を３７℃でイン キュベートした。培地を展開し免疫グロブリンの存在についてメディア試験を行 ない、かつ永久保存を一７０℃で凍結することにより確立した。単一集落の分離 体を、標準的な軟らかい寒天を用い１ζ技術または制限希釈クローニング技術に より得た。このクローンを拡張し、成長特性、抗体産生および抗体形式ならびに 制限断片パターンに関して特徴づけた。 抗体産生リンパ系Ｂｌ！ｌ胞の成長がｃ　−＋ｍｙｃ遺伝子の挿入に依存するこ とが、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を、含まないプラスミドを用いた同様の実験、ｃ−ｍｙ ｃに関連しない遺伝子を用いた同様の実験、ならびに核酸の外因性源が存在しな い状態で電気的パルスに晒されたリンパ球帽胞を用いた同様の実験においＩＳ成 長を観察しｉｆｆ　？ｔか−）だごどにより央づけられた。 不滅化されｔ：　１ニック１−】−プル抗体産生細胞系番よ、４か月以上にわた り安定な成長おＪ、び抗体産生を示しており、かつごのような成長Ｊ３よび抗体 産生を示ヅ−ことは継続り、でいる。 この発明し１、好ましい実施例に対し・でシ（明し・できたが、この発明の範囲 は、次の請求の範囲ｊ３　、、Ｌ：び妥当なイの均等物によりて規定されるべき ものであることがわかるであろ囚際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトリンパ球細胞を２本の電極間に配置し、前記細胞に細胞性腫瘍遺伝子を 含む裸のＤＮＡポリマーセグメントを加え、かつ 前記電極に電位を印加して前記腫瘍遺伝子を少なくともいくつかの前記細胞に導 入することにより少なくともいくつかの前記細胞を不減化する各ステップを備え る、ヒトリンパ球細胞を不滅化するための方法。
2. ２．前記リンパ球細胞は、予め決定した抗原に対する抗体を産生するリンパ系Ｂ 細胞であり、かつ前記電位が少なくとも１個の高電圧の電気パルスの形態で印加 されるように、前記細胞は、前記細胞懸濁液の形態で前記電極間に配置されてい る、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記電位を印加するステップは、約０．１ナノ秒ないし１０ミリ秒のパルス 幅を有するパルスで約１〜約４０ＫＶ／ｃｍの電場を形成することを含む、請求 の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. ４．２個から７個のパルスが、前記細胞に与えられ、前記パルスは約５〜５０μ ｓのパルス幅と、約２〜１０ＫＶ／ｃｍの電位を有する、請求の範囲第３項記載 の方法。
5. ５．前記腫瘍遺伝子がｃ−ｍｙｃ遺伝子である、請求の範囲第１項〜第４項のい ずれかに記載の方法。
6. ６．前記腫瘍遺伝子がヒト腫瘍遺伝子である、請求の範囲第１項〜第５項のいず れかに記載の方法。
7. ７．前記ＤＮＡポリマーセグメントがブラスミドである、請求の範囲第１項〜第 ６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．前記ＤＮＡポリマーセグメントが線状である、請求の範囲第１項〜第６項の いずれかに記載の方法。
9. ９．不滅化された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、かつ前記抗原に対するモノ クローナル抗体を産生する独立の細胞系を分離する各ステップをさらに備える、 請求の範囲第２項記載の方法。
10. １０．請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載された方法により調製された 不減化されたヒトリンパ系Ｂ細胞。
11. １１．その細胞内に組込まれた外因性の細胞性腫瘍遺伝子を有し、不滅化されて いる、ヒトリンパ球細胞。
12. １２．前記腫瘍遺伝子がｃ−ｍｙｃである、請求の範囲第１４項記載の細胞。
13. １３．前記腫瘍遺伝子がヒトｃ−ｍｙｃであり、前記細胞がリンパ系Ｂ細胞であ る、請求の範囲第１４項記載の細胞。
14. １４．モノクローナル抗体を産生し得る培養体の形態にある、請求の範囲第１４ 項記載の細胞。