KR20190092472A - 나노입자 제제 - Google Patents

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KR20190092472A
KR20190092472A KR1020197018935A KR20197018935A KR20190092472A KR 20190092472 A KR20190092472 A KR 20190092472A KR 1020197018935 A KR1020197018935 A KR 1020197018935A KR 20197018935 A KR20197018935 A KR 20197018935A KR 20190092472 A KR20190092472 A KR 20190092472A
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ser
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leu
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KR1020197018935A
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요세프 레파엘리
브라이언 커티스 터너
그레고리 앨런 버드
Original Assignee
타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 MYC 단백질의 생물학적 활성 나노입자 제제를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 나노입자 제제를 제조하는 방법 및 치료를 위해 상기 나노입자 제제를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

나노입자 제제
우선권
본원은 내용이 전체로서 참고로 도입되는, 2016년 12월 2일에 출원된 미국 가출원 제62/429,466호에 대한 우선권을 주장한다.
폴리펩타이드의 사차 구조는 그의 물리화학적 및 생물학적 특성에 크게 영향을 미칠 수 있다. 단백질 응집 또는 비천연 응집은 단백질 분자들이 2개 이상의 단백질들로 구성된 안정한 복합체로 조립되는 과정을 지칭하고, 이 때 개별 단백질은 단량체로서 표기된다. 응집체는 종종 강한 비공유 접촉에 의해 함께 묶여 있고, 단량체들 사이에 강한 접촉을 형성하는 핵심 아미노산 스트레치를 제공하기 위해 어느 정도의 입체구조적 뒤틀림(언폴딩 또는 미스폴딩)을 요구한다. 응집은 단백질의 안정성을 증가시키는 경향을 나타내지만, 종종 단백질의 생물학적 활성을 대가로 이와 같은 경향을 나타내고, 조성물의 균일성을 감소시키고 일부 경우 단백질의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 이 성질들은 이러한 단백질을 치료용 생물제제로서 사용하는 능력에 불리하게 영향을 미친다.
본 기술은 규정된 크기 범위의 생물학적 활성 입자의 집단으로의 MYC 함유 폴리펩타이드의 조절된 조립에 관한 것이다. 본원은 생물학적 활성을 보유하는 MYC 함유 나노입자의 안정한 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 세포를 치료하는 시험관내 방법 및 생체내 방법을 포함하는, 치료를 위해 생물학적 활성 입자를 사용하는 방법도 제공한다.
본원은 생물학적 활성 안정한 나노입자로서 제제화된 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 (i) 단백질 도입 도메인; 및 (ii) MYC 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 펩타이드를 포함하고, 이 때 나노입자는 MYC의 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 융합 펩타이드는 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 펩타이드는 서열번호 10을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성 나노입자의 수 평균 직경은 약 80 nm 내지 약 150 nm이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 pH 6.0 이상 약 pH 8 이하이다. 일부 실시양태에서, T 세포 증식에 적합한 조건 하에서 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포를 MYC 함유 폴리펩타이드 나노입자 조성물과 접촉시키는 것은 MYC 폴리펩타이드 함유 조성물과 접촉되지 않은 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포에 비해 T 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증강시킨다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 아세틸화된다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 MYC 폴리펩타이드에 연결된 단백질 도입 도메인을 포함하는 MYC 융합 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드는 단백질 도입 도메인과 MYC 폴리펩타이드를 연결하는 하나 이상의 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 하기 일반 구조를 갖는 MYC 융합 펩타이드를 포함한다: 단백질 도입 도메인-X-MYC 서열, 이 때 -X-는 단백질 도입 도메인과 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인 서열은 TAT 단백질 도입 도메인 서열이다. 일부 실시양태에서, TAT 단백질 도입 도메인 서열은 TAT[48-57] 및 TAT[57-48]로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 서열번호 1을 포함하는 MYC 융합 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 서열번호 10을 포함하는 MYC 융합 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 100 nm 내지 약 110 nm의 수 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소 투여, 경구 투여, 비경구 투여, 비내 투여, 협측 투여, 직장 투여 또는 경피 투여용으로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 본원은 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 포함하는, 치료 유효량의 본원에서 제공된 조성물을 투여함으로써, 하나 이상의 면역 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상의 증가 또는 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 면역 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증가시키거나 면역 반응을 증가시키는 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 세포는 하나 이상의 아네르기 면역 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 미감작 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 활성화된 T 세포, 아네르기 T 세포, 관용성 T 세포, 키메라 B 세포 및 항원 특이적 T 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 세포는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, B 세포는 미감작 B 세포, 형질 B 세포, 활성화된 B 세포, 기억 B 세포, 아네르기 B 세포, 관용성 B 세포, 키메라 B 세포 및 항원 특이적 B 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원은 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 후 생착을 향상시키기 위해 조혈 줄기 세포를 프라이밍하는 방법으로서, 조혈 줄기 세포의 이식 전에 시험관내에서 하나 이상의 조혈 줄기 세포를, 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 포함하는, 본원에서 제공된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (a) 소정의 농도의 변성제를 포함하는 가용화 용액에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 가용화하여, 가용화된 MYC 함유 폴리펩타이드를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 변성제 농도의 약 0.35 내지 약 0.65 및 약 100 mM 내지 약 1 M의 알칼리 금속 염 및/또는 알칼리성 금속 염을 포함하는 제1 리폴드 완충제를 사용하여 상기 가용화된 MYC 함유 폴리펩타이드에 대한 제1 리폴딩 단계를 적어도 약 30분 내지 180분 동안 수행하여 제1 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계; (c) 단계 (b)의 변성제 농도의 약 0.10 내지 약 0.30 및 약 100 mM 내지 1 M의 알칼리 금속 염 및/또는 알칼리성 금속 염을 포함하는 제2 리폴드 완충제를 사용하여 제1 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제2 리폴딩 단계를 적어도 약 30분 내지 180분 동안 수행하여 제2 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계; (e) 약 100 mM 내지 1 M의 알칼리 금속 염 및/또는 알칼리성 금속 염을 포함하는 제3 리폴드 완충제를 사용하여 제2 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제3 리폴딩 단계를 적어도 약 30분 내지 180분 동안 수행하는 단계; 및 (f) 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는 생물학적 활성 나노입자를 생성하기에 충분한 시간 동안 제3 리폴드 완충제에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 유지하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 제조하는 방법으로서, T 세포 증식에 적합한 조건 하에서 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포를 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉시키는 것이 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉되지 않은 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포에 비해 T 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증강시키는 것인 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴딩 단계, 제2 리폴딩 단계 및/또는 제3 리폴딩 단계는 완충제 교환에 의해 단계를 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제 교환은 접선 유동 여과를 이용함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 알칼리 금속 염은 나트륨 염, 리튬 염 및 칼륨 염 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알칼리 금속 염은 염화나트륨(NaCl), 브롬화나트륨, 황산수소나트륨, 황산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 염화리튬, 브롬화리튬, 황산수소리튬, 황산리툼, 탄산수소리튬, 탄산리튬, 염화칼륨, 브롬화칼륨, 황산수소칼륨, 황산칼륨, 탄산수소칼륨 및 탄산칼륨 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알칼리성 염은 마그네슘 염 및 칼슘 염 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알칼리성 금속 염은 염화마그네슘, 브롬화마그네슘, 황산수소마그네슘, 황산마그네슘, 탄산수소마그네슘, 탄산마그네슘, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 황산수소칼슘, 황산칼슘, 탄산수소칼슘 및 탄산칼슘 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알칼리 금속 염은 염화나트륨(NaCl)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제는 약 500 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 변성제의 농도는 약 1 M 내지 약 10 M이다. 일부 실시양태에서, 변성제는 구아니딘, 구아니딘 염산염, 염화구아니딘, 티오시안산구아니딘, 우레아, 티오우레아, 과염소산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 베타인, 사르코신, 카바모일 사르코신, 타우린, 디메틸설폭사이드(DMSO); 알코올, 예컨대, 프로판올, 부탄올 및 에탄올; 세제, 예컨대, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), N-라우로일 사르코신, 쯔비터전트(Zwittergent), 비-세제 설포베타인(NDSB), TRITON X-100, NONIDET™ P-40, TWEEN™ 시리즈 및 BRIJ™ 시리즈; 수산화물, 예컨대, 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제는 각각 독립적으로 완충 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충 물질은 TRIS(트리스[하이드록시메틸]아미노메탄), HEPPS(N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[3-프로판-설폰산]), CAP SO(3-[사이클로헥실아미노]-2-하이드록시-1-프로판설폰산), AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), CAPS(3-[사이클로헥실아미노]-1-프로판설폰산), CHES(2-[N-사이클로헥실아미노]에탄설폰산), 아르기닌, 라이신 및 붕산나트륨 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충 물질은 약 1 mM 내지 약 1 M의 농도로 독립적으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제는 각각 독립적으로 산화제 및 환원제를 포함하고, 이 때 산화제 대 환원제의 몰비는 약 2:1 내지 약 20:1이다. 일부 실시양태에서, 산화제는 시스테인, 글루타티온 디설파이드("산화된 글루타티온") 또는 이들 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 산화제는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 포함된다. 일부 실시양태에서, 환원제는 베타-머캡토에탄올(BME), 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 시스틴, 시스테아민, 티오글리콜레이트, 글루타티온 및 수소화붕소나트륨 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환원제는 약 0.02 mM 내지 약 2 mM의 농도로 포함된다. 일부 실시양태에서, 변성제는 우레아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성제는 6 내지 8 M 우레아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제는 글루타티온 및/또는 산화된 글루타티온을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제는 5 mM의 글루타티온 및/또는 1 mM의 산화된 글루타티온을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제는 글리세롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)는 적어도 5시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)는 적어도 10시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)는 10시간 내지 12시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)는 1000 rpm 미만에서 제3 리폴드 완충제 중에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 교반하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 미생물 숙주 세포로부터 재조합 MYC 함유 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)이다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포로부터 재조합 MYC 함유 폴리펩타이드를 단리하는 단계는 유도성 프로모터로부터 MYC 함유 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포로부터 재조합 MYC 함유 폴리펩타이드를 단리하는 단계는 친화성 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 MYC 함유 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 아세틸화된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 나노입자 조성물 및 이의 제조 방법의 MYC 함유 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 나노입자 조성물의 MYC 함유 폴리펩타이드는 MYC 폴리펩타이드에 연결된 단백질 도입 도메인을 포함하는 MYC 융합 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드는 단백질 도입 도메인과 MYC 폴리펩타이드를 연결하는 하나 이상의 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 하기 일반 구조를 갖는 MYC 융합 펩타이드를 포함한다: 단백질 도입 도메인-X-MYC 서열, 이 때 -X-는 단백질 도입 도메인과 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인 서열은 TAT 단백질 도입 도메인 서열이다. 일부 실시양태에서, TAT 단백질 도입 도메인 서열은 TAT[48-57] 및 TAT[57-48]로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 서열번호 1을 포함하는 MYC 융합 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 폴리펩타이드는 서열번호 10을 포함하는 MYC 융합 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 100 nm 내지 약 110 nm의 수 평균 직경을 갖는다.
예시적 실시양태에서, 본원은 (a) 6 내지 8 M 우레아를 포함하는 완충된 가용화 용액에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 변성시켜 변성된 MYC 함유 폴리펩타이드를 제공하는 단계; (b) 약 3 M의 우레아 및 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 제1 리폴드 완충제를 사용하여 상기 변성된 MYC 함유 폴리펩타이드에 대한 제1 리폴딩 단계를 적어도 약 120분 동안 수행하여 제1 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계; (c) 약 1.5 M의 우레아 및 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 제2 리폴드 완충제로 완충제를 교환함으로써 제1 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제2 리폴딩 단계를 적어도 약 120분 동안 수행하여 제2 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계; (d) 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 제3 리폴드 완충제로 완충제를 교환함으로써 제2 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제3 리폴딩 단계를 적어도 약 120분 동안 수행하는 단계; 및 (f) 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는 생물학적 활성 나노입자를 생성하기에 충분한 시간 동안 제3 리폴드 완충제에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 유지하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 제조하는 방법으로서, T 세포 증식에 적합한 조건 하에서 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포를 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉시키는 것이 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉되지 않은 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포에 비해 T 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증강시키는 것인 방법을 제공한다.
도 1a 및 도 1b는 유세포분석 기법을 이용하여 항-CD3 및 항-CD28 활성화된 T 세포의 증식에 대한 MYC 함유 나노입자 제제 C2A의 효과를 보여준다. 도 1a는 완충제 대조군 샘플에서의 T 세포의 증식을 보여준다. 도 1b는 24시간 동안 MYC 함유 나노입자 제제 C2A와 함께 인큐베이션된 T 세포의 증식을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 비대칭 유동 장-유동 분획화(AF4) 및 다각도 레이저 광 산란(MALLS)에 의해 분석된, 선택된 MYC 함유 나노입자 제제의 크로마토그램을 보여준다. 도 2a 및 2b는 각각 제제 F01 및 제제 F02의 분석으로부터 수득된 크로마토그램을 보여준다. 기록선 t1 및 t2는 25℃에서 저장된 샘플로부터 수득되었다. 기록선 t2* 및 t4*는 5℃에서 저장된 샘플로부터 수득되었다. 시간(t)는 주 단위로 측정되었고 t 다음의 수치 값(즉, t1 = 1주, t2 = 2주 등)으로 표시되어 있다.
도 3은 Sepax SRT-C 2000 및 300 컬럼을 직렬로 사용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 및 생물학적 불활성 MYC 함유 나노입자 제제를 분획화함으로써 유도된 크로마토그램의 비교를 보여준다. 생물학적 활성 나노입자 제제 C12 및 C13, 및 생물학적 불활성 제제 R147의 분획화를 보여주는 기록선이 표시되어 있다.
도 4a 및 4b는 다각도 광 산란 분석을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS)를 이용한 MYC 함유 나노입자 제제 C2A의 분석을 보여준다. 도 4a는 굴절률(좌측 세로좌표, RV x RI) 또는 분자 크기(우측 세로좌표, RV x MW)의 함수로서 체류 부피(㎖)를 보여준다. 도 4b는 생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 및 생물학적 불활성 제제의 분획화를 보여주는 크로마토그램을 보여준다.
도 5a 내지 5d는 동적 광 산란(DLS) 기법에 의해 분석된, 선택된 제제에서의 MYC 함유 나노입자의 크기 분포를 보여준다. 도 5a는 DLS에 의한 MYC 함유 나노입자 제제 C2A의 크기 분포를 보여준다. 도 5b는 0.5 mg/㎖의 농도로 테스트된 비생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 R149의 크기 분포를 보여준다. 도 5c는 0.5 mg/㎖의 농도로 테스트된 생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 C12의 나노입자 크기 분포를 보여준다. 도 5d는 0.5 mg/㎖의 농도로 테스트된 생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 C13의 나노입자 크기 분포를 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 나노입자 추적 분석(NTA) 기법을 이용한 MYC 함유 나노입자 제제 C2A의 분석을 보여준다. 도 6a는 나노입자 제제 C2A의 삼중반복 측정으로부터 관찰된 기록선을 보여준다. 도 6b는 도 6a에 표시된 C2A 나노입자 제제의 분석으로부터 유도된 삼중반복 측정의 컨센서스 기록선을 보여준다.
도 7은 전자 현미경관찰 기법을 이용한 MYC 함유 나노입자 제제 C2B의 분석을 보여준다.
도 8은 펩타이드 맵핑 분석 기법에 의한 생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 및 생물학적 불활성 MYC 함유 나노입자 제제의 Asp-N 엔도프로테이나제 분해물의 비교를 보여준다. 생물학적 활성 MYC 함유 나노입자 제제 C2B, C6 및 C7("기능성")을 생물학적 불활성 MYC 함유 나노입자 제제 C4, 147 및 149("비기능성")와 비교하였다.
도 9는 확인된 개별 펩타이드 피크를 가진, MYC 함유 나노입자 제제 C13에 대한 대표적인 펩타이드 맵을 보여준다.
도 10a 내지 10c는 나노입자 제제 C13에 대한 RP-HPLC 크로마토그램을 보여준다. 도 10a는 전체 크로마토그램을 보여준다. 도 10b 및 도 10c는 도 10a의 전체 크로마토그램의 2개 상이한 확대도를 보여준다.
도 11은 평균 잔기 몰 타원율(데시몰당 deg cm2)로서 표시된 나노입자 제제 C13의 원 UV CD 분광법 분석에 대한 결과를 파장(nm)의 함수로서 보여준다.
도 12는 평균 잔기 몰 타원율(데시몰당 deg cm2)로서 표시된 나노입자 제제 C13의 근 UV CD 분광법 분석에 대한 결과를 파장(nm)의 함수로서 보여준다.
도 13은 나노입자 제제 C14의 4개 별개의 샘플들에 대한 정규화된 2차 미분 푸리에 변환 적외선 스펙트럼(FTIR)을 소 혈청 알부민(BSA)의 2개 대조군 샘플과 비교하여 보여준다.
도 14는 나노입자 제제 C13에 대한 분석적 한외원심분리(AUC) 데이터를 보여준다.
도 15a 및 도 15b는 나노입자 제제 C13에 대한 각각 비환원된(NR) 및 환원된(R) 변성 SEC 크로마토그램을 보여준다. 각각의 크로마토그램에서 위에 가로놓인 기록선은 2℃ 내지 8℃에서 저장된 샘플에 대해 대략 1개월 간격으로 수행된 테스트를 표시한다.
도 16a 및 16b는 TAT-MYC 나노입자 제제 및 TAT-3AMYC 나노입자 제제에 대한 변성 SEC 크로마토그램을 보여준다. 도 16b는 TAT-MYC에 대한 크로마토그램을 보여준다. TAT-MYC 단백질 복합체는 6분과 7분 사이에서 용출된다. 보다 더 작은 단백질 다량체 및 부형제는 8분과 15분 사이에서 용출된다. 도 16b는 기능성 TAT-MYC 단백질 제제와 비교된 TAT-3AMYC에 대한 크로마토그램을 보여준다. 비기능성 TAT-3AMYC 단백질 제제의 대부분은 8분과 17분 사이에서 용출되는 것으로 확인될 수 있는 보다 더 작은 단백질 다량체 및 복합체로 구성된다.
도 17은 T 세포 효능 어세이의 결과를 보여준다. TAT-MYC는 처리 부재(NT)에 비해 생존 집단 T 세포 집단의 3배 증가를 보여주었다. TAT-3MYC는 처리 부재(NT)에 비해 생존 T 세포 집단의 증가가 없음을 보여주었다.
도 18은 동적 광 산란(DLS) 기법에 의해 분석된 녹색 원숭이 TAT-MYC의 선택된 제제에서의 MYC 함유 나노입자의 크기 분포를 보여준다.
도 19는 인간 TAT-MYC와 비교된 녹색 원숭이 TAT-MYC에 대한 RP-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 20은 인간 TAT-MYC와 비교된 녹색 원숭이 TAT-MYC에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 21은 인간 TAT-MYC와 비교된 녹색 원숭이 TAT-MYC에 대한 T 세포 효능 어세이의 결과를 보여준다.
본 개시는 본 개시의 개별 양태들을 단독으로 예시하기 위한 것인, 본원에 기재된 특정 실시양태의 관점에서 한정되어서는 안 된다. 본 개시의 모든 다양한 실시양태들은 본원에 기재되지 않을 것이다. 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 바와 같이, 본 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 개시의 많은 변형물들 및 변경물들을 만들 수 있다. 본원에서 나열된 방법 및 장치 이외에 본 개시의 범위 내에 있는 기능적으로 균등한 방법 및 장치는 상기 설명으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위 내에 속한다. 본 개시는 이러한 청구범위에 의해 자격이 부여된 균등물의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구범위의 관점에 의해서만 한정되어야 한다.
본 개시는 당연히 변경될 수 있는 특정 용도, 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다.
또한, 본 개시의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 군의 관점으로 기재되어 있는 경우, 당분야에서 숙련된 자는 본 개시가 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위권의 관점에서도 기재된다는 것을 인식할 것이다.
당분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 바와 같이, 특히 작성된 설명을 제공한다는 관점에서 임의의 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위들은 임의의 모든 가능한 하위범위들 및 이들의 하위범위들의 조합도 포괄한다. 임의의 나열된 범위는 그 범위를 충분히 기술하고 적어도 동등한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나눌 수 있는 것으로서 용이하게 인식될 수 있다. 비한정적 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 하부 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상부 3분의 1 등으로 용이하게 나누어질 수 있다. 마찬가지로 당분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 바와 같이, 모든 표현들, 예컨대, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등은 언급된 숫자를 포함하고 상기 논의된 바와 같이 나중에 하위범위로 나누어질 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 1개 내지 3개의 세포를 갖는 군은 1개, 2개 또는 3개의 세포를 갖는 군을 지칭한다. 유사하게, 1개 내지 5개의 세포를 갖는 군은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 세포를 갖는 군을 지칭한다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시가 속하는 분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
I. 정의
본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 본 개시를 한정하기 위한 것이 아니다. 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 복수 형태를 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 값이 +/- 20%, +/- 15%, +/- 10% 또는 +/- 5%만큼 변경될 수 있고 본 개시의 범위 내에서 유지될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, "약 200 IU/㎖의 농도"는 160 IU/㎖ 내지 240 IU/㎖의 농도를 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 물질을 대상체에게 "투여"한다는 표현은 물질의 의도된 기능을 수행하기 위해 상기 물질을 대상체에 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다.
용어 "아미노산"은 천연 생성 아미노산 및 비천연 생성 아미노산뿐만 아니라, 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방물질도 지칭한다. 천연 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산들(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 및 피롤라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조, 즉 수소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 물질, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖되, 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드를 형성하는 아미노산은 D 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드를 형성하는 아미노산은 L 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드를 형성하는 복수의 제1 아미노산들은 D 형태로 존재하고 복수의 제2 아미노산들은 L 형태로 존재한다.
아미노산은 본원에서 그의 통상적으로 공지된 3-문자 부호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에 의해 권장된 1-문자 부호로 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 그의 통상적으로 허용되는 1-문자 코드로 지칭된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 상기 용어들은 천연 생성 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 생성 아미노산, 예를 들면, 아미노산 유사체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 상기 용어들은 전체 길이 단백질을 포함하는, 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포괄하고, 이 때 아미노산 잔기들은 공유 펩타이드 결합에 의해 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대조군"은 비교 목적으로 실험에서 사용되는 대안적 샘플이다. 대조군은 "양성" 또는 "음성" 대조군일 수 있다. 예를 들면, 실험의 목적이 특정 유형의 질환을 치료하기 위한 치료제의 효능의 상관관계를 확인하는 것인 경우, 양성 대조군(원하는 치료 효과를 나타내는 것으로 공지되어 있는 조성물) 및 음성 대조군(요법을 제공받지 않거나 플라세보를 제공받는 대상체 또는 샘플)이 전형적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 물질의 양을 지칭한다. 치료적 적용의 경우, 대상체에게 투여되는 치료 펩타이드의 양은 감염의 유형 및 중증도, 및 개체의 특성, 예컨대, 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 의해 좌우될 수 있다. 상기 양은 질환의 정도, 중증도 및 유형에 의해서도 좌우될 수 있다. 숙련된 당업자는 이 요인들 및 다른 요인들에 따라 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 나중에 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 한 양태에서, 한 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 대조군 또는 기준 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다. 또 다른 양태에서, 한 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 본원에 개시된 조성물의 투여 후 동일한 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다. 용어 "발현"은 하기 사건들 중 하나 이상을 지칭하기도 한다: (1) 세포 내에서 (예를 들면, 전사에 의한) DNA 서열로부터의 RNA 주형의 생성; (2) 세포 내에서 (예를 들면, 스플라이싱, 에디팅, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 형성에 의한) RNA 전사체의 프로세싱; (3) 세포 내에서 폴리펩타이드 또는 단백질로의 RNA 서열의 번역; (4) 세포 내에서 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후 변형; (5) 세포 표면 상에서의 폴리펩타이드 또는 단백질의 제시; 및 (6) 세포로부터 폴리펩타이드 또는 단백질의 분비 또는 제시 또는 방출.
용어 "링커"는 2개의 서열들을 접속하거나 연결하는, 예를 들면, 2개의 폴리펩타이드 도메인들을 연결하는 합성 서열(예를 들면, 아미노산 서열)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 서열을 함유한다.
본원에서 사용된 용어 "동결건조된", "동결건조" 등은 건조될 물질(예를 들면, 나노입자)을 먼저 냉동시킨 후 얼음 또는 냉동된 용매를 진공 환경에서 승화로 제거하는 과정을 지칭한다. 부형제는 저장 시 동결건조된 생성물의 안정성을 향상시키기 위해 예비동결건조된 제제에 포함될 수 있다. 동결건조된 샘플은 추가 부형제를 더 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 면역 세포는 면역 반응에서 역할을 하는 임의의 세포를 지칭한다. 면역 세포는 조혈 유래의 세포이고, 림프구, 예컨대, B 세포 및 T 세포; 천연 킬러 세포; 골수 세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 호산구, 호중구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구를 포함한다.
용어 "림프구"는 조직 특이적 변이체 및 전문화된 변이체를 포함하는, 모든 미성숙 백혈 림프구 집단들, 성숙 백혈 림프구 집단들, 미분화된 백혈 림프구 집단들 및 분화된 백혈 림프구 집단들을 지칭한다. 비한정적 예로써, 상기 용어는 B 세포, T 세포, NKT 세포 및 NK 세포를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 림프구는 전구-B 세포, 전구체 B 세포, 초기 전구-B 세포, 후기 전구-B 세포, 전구-B 대세포, 전구-B 소세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 형질 B 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포 및 아네르기 AN1/T3 세포 집단을 포함하는 모든 B 세포 계통들을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 T 세포는 미감작 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 활성화된 T 세포, 아네르기 T 세포, 관용성 T 세포, 키메라 B 세포 및 항원 특이적 T 세포를 포함한다.
용어 "B 세포" 또는 "B 세포들"은 비한정적 예로써 전구-B 세포, 전구체 B 세포, 초기 전구-B 세포, 후기 전구-B 세포, 전구-B 대세포, 전구-B 소세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 미감작 B 세포, 형질 B 세포, 활성화된 B 세포, 아네르기 B 세포, 관용성 B 세포, 키메라 B 세포, 항원 특이적 B 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포 및 아네르기 AN1/T3 세포 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 B 세포는 그의 세포 표면 상에서 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 B 세포는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하고 분비하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 B 세포는 그의 세포 표면 상에서 항원에 결합하는 세포를 포함한다. 본원에 개시된 일부 실시양태에서, B 세포 또는 AN1/T3 세포는 기재된 과정에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 예를 들면, 조혈 줄기 세포, 미감작 B 세포, B 세포, 전구 B 세포, 전구체 B 세포, 초기 전구-B 세포, 후기 전구-B 세포, 전구 B 대세포, 전구 B 소세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 형질 B 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 아네르기 B 세포 또는 아네르기 AN1/T3 세포를 포함하는, 항체를 발현하기에 적합하거나, 항체를 발현할 수 있거나(예를 들면, 유도성 발현), 항체를 발현하기에 적합한 세포로 분화될 수 있는 임의의 동물 세포로 임의적으로 치환된다.
용어 "MYC" 및 "MYC 유전자"는 동의어이다. 이들은 MYC 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. MYC 유전자는 NCBI 수탁번호 NM_002467.5의 서열과 적어도 60% 내지 100% 동일한 또는 상동한, 예를 들면, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 70%와 약 100% 사이의 임의의 다른 퍼센트만큼 동일한, 적어도 120개 뉴클레오타이드들의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 유전자는 원발암유전자이다. 일부 경우, MYC 유전자는 8번 염색체의 8q24.21에서 발견된다. 일부 경우, MYC 유전자는 pter로부터 128,816,862 bp에서 시작되고 pter로부터 128,822,856 bp에서 종결된다. 일부 경우, MYC 유전자는 약 6 kb이다. 일부 경우, MYC 유전자는 적어도 8개의 별개의 mRNA 서열들 - 5개의 선택적으로 스플라이싱된 변이체들 및 3개의 스플라이싱되지 않은 변이체들을 코딩한다.
용어 "MYC 단백질", "MYC 폴리펩타이드" 및 "MYC 서열"은 동의어이고, (하기 제공된) NCBI 수탁번호 NP_002458.2 또는 UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1로 개시된, 인간 myc 이소폼 2인 아미노산 잔기 중합체, 및 이의 기능성 상동체, 변이체, 유사체 또는 단편을 지칭한다. 이 서열은 하기 표시되어 있다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 완전한 MYC 폴리펩타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 부분적 MYC 폴리펩타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 c-MYC이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드 서열은 하기 표시된 서열을 포함한다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드 서열은 하기 표시된 서열을 포함한다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드 서열은 비인간 종으로부터의 MYC 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비인간 종은 유인원, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소 및 말 종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드 서열은 클로로세부스 사배우스(Chlorocebus sabaeus)(녹색 원숭이)로부터 유래한 하기 표시된 서열(XP_007999715.1)을 포함한다:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드 서열은 하기 표시된 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 NCBI 수탁번호 NP002458.2의 서열(서열번호 2)과 적어도 40% 내지 100% 동일한, 예를 들면, 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 40%와 약 100% 사이의 임의의 다른 퍼센트만큼 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 NP002458.2(서열번호 2)의 420개, 421개, 422개, 423개, 424개, 425개, 426개, 427개, 428개, 429개, 430개, 431개, 432개, 433개, 434개, 435개, 436개, 437개, 438개, 439개, 440개, 441개, 442개, 443개, 444개, 445개, 446개, 447개, 448개, 449개, 450개, 451개, 452개, 453개 또는 454개 연속 아미노산들의 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 임의의 번역 후 변형을 겪지 않은 NP002458.2(서열번호 2)의 435개 아미노산들의 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 번역 후 변형을 겪은 NP002458.2(서열번호 2)의 435개 아미노산들의 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 48,804 kDa이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 염기성 나선-루프-나선 류신 지퍼(bHLH/LZ) 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, bHLH/LZ 도메인은 ELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(서열번호 5)의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 전사 인자(예를 들면, 전사 인자 64)이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 E-박스 DNA 결합 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 CACGTG를 포함하는 서열에 결합한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 세포 생존 및/또는 증식 중 하나 이상을 촉진한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 앞에서 기재된 것들 중 하나 이상을 포함하고, 하나 이상의 번역 후 변형(예를 들면, 아세틸화)을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 펩타이드에 결합된다.
본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 단백질은 본원에 기재된 임의의 단백질의 아미노산 서열에 비해 1개 내지 15개의 아미노산 변화, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 단백질을 포함하는 기능성 변이체도 포함한다. 다른 실시양태에서, 변경된 아미노산 서열은 본원에 기재된 임의의 단백질 억제제의 아미노산 서열과 적어도 75%, 예를 들면, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 변경된 아미노산 서열이 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 작용할 정도로 충분한 생물학적 활성을 보유하는 한, 이러한 서열 변이체 단백질은 본원에 기재된 방법에 적합하다. 아미노산 치환이 만들어지는 경우, 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 통상의 천연 생성 아미노산들 중에서, 예를 들면, "보존적 아미노산 치환"은 각각의 하기 군 내에 속하는 아미노산들 사이의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 쓰레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘. BLOSUM62 표는 500개 초과의 관련된 단백질 군들의 고도로 보존된 영역을 대표하는 단백질 서열 분절들의 약 2,000개 국소 다중 정렬로부터 유도된 아미노산 치환 매트릭스이다(Henikoff et al., (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:10915-10919). 따라서, 일부 실시양태에서, BLOSUM62 치환 빈도는 본원에 기재되어 있거나 개시되어 있는 아미노산 서열 내로 도입되는 보존적 아미노산 치환을 정의하는 데 사용된다. (상기 논의된 바와 같이) 화학적 성질만을 기반으로 아미노산 치환을 디자인하는 것이 가능할지라도, 표현 "보존적 아미노산 치환"은 바람직하게는 -1 초과의 BLOSUM62 값으로 표시된 치환을 지칭한다. 예를 들면, 치환이 0, 1, 2 또는 3의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 경우, 아미노산 치환은 보존적이다. 이 시스템에 따르면, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 적어도 1(예를 들면, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하지만, 보다 더 바람직한 보존적 아미노산 치환은 적어도 2(예를 들면, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다.
어구 "E-박스 서열" 및 "인핸서 박스 서열"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고 뉴클레오타이드 서열 CANNTG를 의미하고, 이 때 N은 임의의 뉴클레오타이드이다. 일부 경우, E-박스 서열은 CACGTG를 포함한다. 일부 경우, MYC에 의해 코딩된 전사 인자의 염기성 나선-루프-나선 도메인은 E-박스 서열에 결합한다. 일부 경우, E-박스 서열은 유전자(예를 들면, p21, Bc1-2 또는 오르니틴 데카복실라제)의 업스트림에 위치한다. 일부 경우, MYC 폴리펩타이드는 E-박스 DNA 결합 도메인을 함유한다. 일부 경우, E-박스 DNA 결합 도메인은 KRRTHNVLERQRRN의 서열(서열번호 6)을 포함한다. 일부 경우, MYC에 의해 코딩된 전사 인자와 E-박스 서열의 결합은 RNA 중합효소가 E-박스 서열의 업스트림에서 유전자를 전사할 수 있게 한다.
용어 "MYC 활성" 또는 "MYC 생물학적 활성" 또는 "생물학적 활성 MYC"는 세포 생존, 세포 증식 및/또는 항체 생성의 향상 또는 유도 중 하나 이상을 포함한다. 한정이 아닌 예로써, MYC 활성은 항-CD3 및 항-CD28 활성화된 T 세포의 증폭의 향상 및/또는 장기간 자가-재생 조혈 줄기 세포의 증가된 증식을 포함한다. MYC 활성은 세포 핵 내로의 도입, 핵산 서열에의 결합(예를 들면, E-박스 서열에의 결합) 및/또는 MYC 표적 유전자의 발현 유도도 포함한다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 동물, 전형적으로 포유동물을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 포유동물이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
용어 "단백질 도입 도메인(PTD)" 또는 "수송자 펩타이드 서열"(세포 투과성 단백질(CPP) 또는 막 전위 서열(MTS)로서도 공지되어 있음)은 전형적인 세포내이입과 독립적으로 훨씬 더 큰 분자를 세포 내로 운반할 수 있는 작은 펩타이드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포 핵 내로의 분자의 전위를 더 매개하는 핵 국재화 신호가 단백질 도입 도메인 내에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대, 인간에서의 질환의 치료를 커버하고, (i) 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발생을 정지시키는 것; (ii) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것; (iii) 질환의 진행을 늦추는 것; 및/또는 (iv) 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 억제하거나, 완화시키거나 늦추는 것을 포함한다.
기재된 의학적 질환 및 상태의 다양한 치료 또는 예방 방식들은 완전한 치료 또는 예방뿐만 아니라 부분적 치료 또는 예방도 포함하는 "실질적인"을 의미하기 위한 것이고, 이 때 일부 생물학적 또는 의학적 관련 결과가 달성된다는 것도 인식해야 한다. 치료는 만성 질환에 대한 연속적인 연장된 치료일 수 있거나, 급성 상태의 치료를 위한 일회 또는 수회 투여일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 억제, 관해 또는 박멸에 의해 수득된다.
II. 나노미립자 MYC 펩타이드를 포함하는 조성물
본원은 생물학적 활성 안정한 나노입자로서 제제화된 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 MYC 폴리펩타이드와 단백질 도입 도메인, 예를 들면, HIV TAT의 융합체이다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 태그 서열도 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 폴리펩타이드는 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 폴리펩타이드는 서열번호 10을 포함한다.
아래에 보다 더 상세히 논의되어 있고 실시예에 예시되어 있는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 기술의 생물학적 활성 MYC 함유 폴리펩타이드 조성물은 약 104 내지 106 달톤의 분자 질량을 갖는 약 90 nm 내지 140 nm의 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 입자는 MYC 함유 폴리펩타이드의 약 200개 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 활성 나노미립자 조성물은 번역 후 변형된 MYC 단백질을 포함한다. 한정이 아닌 예로써, 일부 실시양태에서, 단백질은 적어도 하나의 아세틸 기를 포함한다.
A. MYC 함유 폴리펩타이드의 발현 및 정제
본원은 제공된 나노입자 조성물에서 사용하기 위한 MYC 함유 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 미생물 발효에 의해 재조합적으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 미생물 발효는 약 1 내지 약 10,000 리터의 발효 부피, 예를 들면, 약 10 내지 약 1000 리터의 발효 부피로 수행된다. 발효는 임의의 적합한 미생물 숙주 세포 및 배양 배지를 사용할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 이. 콜라이는 미생물 숙주 세포로서 사용된다. 대안적 실시양태에서, 다른 미생물, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 피키아 파스토리스(P. pastoris), 락토바실러스(Lactobacillus), 바실러스(Bacillus) 및 아스퍼길러스(Aspergillus)가 사용될 수 있다. 예시적 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 BL-21 Star™ 이. 콜라이 균주(Invitrogen)이다. 예시적 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 BLR DE3 이. 콜라이 균주이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 숙주 미생물 세포 코돈 편향을 극복하여 발현된 단백질의 번역을 개선하는 데 사용되는, 희귀 코돈에 대한 tRNA를 제공하도록 변형된다. 예시적 실시양태에서, 숙주 세포(예를 들면, 이. 콜라이)는 플라스미드, 예컨대, AGG, AGA, AUA, CUA, CCC 및 GGA 코돈에 대한 tRNA를 발현하는 pRARE(CamR)에 의해 형질전환된다. 특정 코돈에 대한 tRNA를 제공하기에 적합한 플라스미드 또는 구축물은 당분야에서 공지되어 있고 제공된 방법에서 사용될 수 있다.
삽입 또는 자가-복제 벡터는 MYC 함유 폴리펩타이드 발현 카세트를 선택된 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 발현 카세트에서, MYC 함유 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열은 프로모터, 예컨대, 유도성 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들면, 영양분의 존재 또는 부재, 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 조절 하에 있는 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 시작하는 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 박테리아 발현을 위해 코돈 최적화된다.
다양한 잠재적 숙주 세포들에 의해 인식되는 예시적 프로모터들은 잘 공지되어 있다. 이 프로모터들은 존재하는 경우 제한효소 분해로 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 벡터 내에 삽입함으로써 MYC 함유 폴리펩타이드 코딩 DNA에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 미생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템(Chang et al., (1978) Nature, 275:617-624; Goeddel et al., (1979) Nature, 281: 544), 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057; EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 프로모터(deBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 선택된 숙주 세포에 의한 발현에 적합한 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 적합한 뉴클레오타이드 서열은 공개되어 있으므로, 숙련된 당업자는 임의의 요구된 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어댑터를 사용하여 상기 서열을, MYC 함유 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA에 작동 가능하게 라이게이션시킬 수 있다(예를 들면, 문헌(Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) 참조). 예시적 실시양태에서, 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 결합된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)(S.D.) 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당분야에서 잘 공지되어 있는 바와 같이, 유도성 프로모터는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 유도되는 lacZ 프로모터이다. 프로모터 및 발현 카세트는 관심 있는 DNA 서열을 합성하는 잘 공지되어 있는 기법을 이용함으로써 드 노보 합성될 수도 있다. 예시적 실시양태에서, 본원에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 발현 벡터는 pET101/D-Topo(Invitrogen)이다.
MYC 함유 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, MYC 함유 폴리펩타이드를 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 미생물 숙주는 전형적으로 발효 반응기에서 고밀도로 생장된다. 일부 실시양태에서, 반응기는 글루코스를 위한 조절된 공급원료를 갖는다. 일부 실시양태에서, 발효기 접종물을 항생제로 보충된 배지에서 먼저 배양한다(예를 들면, 하룻밤 동안 배양). 그 다음, 발효기 접종물을 사용하여 단백질의 발현을 위한 발효기 배양물을 접종한다. 발효기 배양물의 적어도 약 15, 통상적으로 적어도 약 20, 적어도 25, 적어도 약 30 이상의 OD600에서, 재조합 단백질의 발현이 유도된다. 예시적 실시양태에서, 유도성 프로모터가 lacZ 프로모터인 경우, IPTG를 발효 배지에 첨가하여 MYC 함유 폴리펩타이드의 발현을 유도한다. 일반적으로, IPTG는 대수 생장기를 표시하는 OD600에서 발효기 배양물에 첨가된다.
제공된 방법의 일부 실시양태에서, 유도된 단백질 발현은 유도 후 약 2시간 내지 약 5시간 동안 유지되고, 유도 후 약 2시간 내지 약 3시간 동안 유지될 수 있다. 보다 더 긴 유도 시간은 재조합 단백질의 분해로 인해 바람직하지 않을 수 있다. 유도 동안 반응 혼합물의 온도는 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 37℃, 통상적으로 약 30℃ 내지 약 37℃이다. 특정 실시양태에서, 유도는 약 30℃에서 수행된다.
MYC 함유 폴리펩타이드는 전형적으로 미생물 세포에서 세포질 봉입체로서 발현된다. 봉입체를 수거하기 위해, 유도 후 발효 배양물의 원심분리로 세포 펠렛을 모으고 -70℃ 이하에서 냉동시키고 해동시키고 파괴 완충제에 재현탁한다. 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 초음파처리, 균질화 등으로 용해시킨다. 그 다음, 통상적으로 단백질을 가용화하기에 효과적인 농도, 예를 들면, 약 5 M, 6 M, 7 M, 8 M 또는 9 M 이상의 우레아의 존재 하에서 용해물을 가용화 완충제에 재현탁한다. 재현탁은 펠렛을 기계적으로 부수고 교반하여 균질성을 달성할 것을 요구할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 펠렛을 우레아 완충제에 직접적으로 재현탁하고 균질할 때까지 혼합한다. 일부 실시양태에서, 재현탁/가용화 완충제는 8 M 우레아 및 50 mM 포스페이트 용액(pH 7.5)이고, 현탁액은 균질화기를 통과한다.
일부 실시양태에서, 균질화된 현탁액은 설포닐화된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 균질화된 현탁액은 200 mM 아황산나트륨 및 10 mM 테트라티온산나트륨을 포함하도록 조절된다. 그 다음, 상기 용액을 균질할 때까지 실온에서 혼합한다. 그 다음, 혼합된 용해물을 추가 시간 동안(예를 들면, 12시간 이상 동안 2℃ 내지 8℃에서) 혼합하여 설포닐화를 완료한다. 그 다음, 설포닐화된 용해물을 1시간 동안 원심분리하였다. 그 후, 설포닐화된 MYC 함유 폴리펩타이드를 함유하는 상청액을 원심분리로 모으고, 세포 펠렛을 버렸다. 그 다음, 상청액을 필터, 예를 들면, 0.22 ㎛ 막 필터에 통과시켜 용해물을 정화한다.
그 다음, 가용화된 단백질을 정제한다. 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피가 이용된다. 예를 들면, 편리한 정제를 위해 에피토프 태그 또는 히스티딘 6 태그를 단백질에 제공한다. 본 방법에서, 예시적 myc 함유 폴리펩타이드는 Ni-수지를 사용한 Ni 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제를 위해 히스티딘 6 태그를 포함한다.
예시적 실시양태에서, 우레아를 함유하는 완충제에서 Ni-수지 컬럼을 평형화시킨다. 일부 실시양태에서, 평형화 완충제는 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl 및 10% 글리세롤 용액이다. 그 다음, MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는, 설포닐화되고 정화된 상청액을 Ni-수지 컬럼 상에 로딩한다. 그 다음, 상기 컬럼을 세척 완충제, 예를 들면, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤 및 500 mM NaCl 용액(pH 7.5)으로 세척한다. 그 다음, 감소하는 염 농도를 갖는 순차적 세척 완충제로 상기 컬럼을 세척하였다. 예를 들면, 예시적 후속 세척은 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤 및 2 M NaCl(pH 7.5)에 이은, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤, 50 mM NaCl 및 30 mM 이미다졸(pH 7.5)의 또 다른 세척을 포함할 수 있다.
세척 완충제의 순차적 적용 후, 100 내지 300 mM 이미다졸의 구배를 갖는 용출 완충제, 예를 들면, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤 및 50 mM NaCl 용액(pH 7.5)을 첨가하고 분획을 모음으로써 MYC 함유 폴리펩타이드를 컬럼으로부터 용출한다. 그 후, 0.22 ㎛ 막을 통해 풀링될 단백질 함유 분획을 여과한다. 임의의 적합한 방법, 예를 들면, UV 파장 280에서의 분광광도측정법으로 단백질 수율의 추정치를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 정제 방법을 이용하여 단리된 MYC 함유 폴리펩타이드를 더 정제할 수 있다. 예시적 실시양태에서, Ni-세파로스 크로마토그래피 단계로부터의 풀링된 분획을 Q-세파로스 수지를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피로 더 정제한다. 일부 실시양태에서, 제2 세척 완충제(예를 들면, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤, 2 M NaCl, pH 7.5)를 사용하여 샘플을 Q-세파로스 완충제의 전도성(17.52 +/-1 mS/cm)까지 희석함으로써 Q-세파로스 컬럼 상에 로딩할 풀을 Ni-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 준비한다. 그 다음, 희석된 풀을 Q-세파로스 컬럼 상에 로딩한 후, 단백질이 컬럼으로부터 용출되었다는 것을 시사하는, UV 기록선이 기준에 도달할 때까지 추적 완충제를 추가로 순차적으로 적용함으로써 추적 완충제(예를 들면, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl 및 10% 글리세롤)를 사용한 2개의 추적 단계들을 수행한다.
B. 나노입자로의 MYC 함유 폴리펩타이드의 리폴딩
본 기술의 조성물은 단리된 MYC 함유 폴리펩타이드로부터 하기 방법에 따라 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드는 리폴딩되어 생물학적 활성 나노입자를 생성한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 접선 유동 여과(TFF) 또는 교차 유동 여과를 포함한다. TFF는 펌프를 이용하여 다층 구조물(카세트)에 수용된 막의 표면을 가로질러(즉, 막 표면에 "접선으로") 샘플을 순환시키는 과정이다. 적용된 막횡단 압력은 막을 통해 용질 및 소분자를 수송하는 구동력으로서 작용한다. 막 표면 상에서의 액체의 교차 유동은 표면으로부터 보유 분자를 쓸어버려, 이들을 순환 스트림에서 유지한다.
일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드를 변성제, 예컨대, 우레아로 변성시킨다. 그 다음, 한외여과/정용여과(UFDF) 막을 가로지르는 다수의 TFF 단계들 및 감소하는 농도의 변성제, 예를 들면, 우레아를 갖는 리폴드 완충제의 순차적 첨가를 이용하여 MYC 함유 폴리펩타이드를 리폴딩한다. 일부 실시양태에서, 순차적 리폴드 완충제의 우레아 농도는 약 3 M 우레아부터 <0.001 M 또는 우레아 부재까지 감소한다. 일부 실시양태에서, 순차적 리폴드 완충제는 포스페이트, NaCl, 글리세롤, GSH(환원된 글루타티온) 및 GSSG(산화된 글루타티온)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 50 mM의 포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 알칼리 토금속 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알칼리 토금속 염은 나트륨(Na), 리튬(Li) 또는 칼륨(K)의 염이다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 나트륨 염, 예컨대, NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 100 mM 내지 2 M 농도의 알칼리 토금속 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 200 mM 내지 1 M 농도의 알칼리 토금속 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 500 mM 내지 1 M 농도의 알칼리 토금속 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 100 mM 내지 2 M 농도의 NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 200 mM 내지 1 M 농도의 NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 200 mM 내지 800 mM 농도의 NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 200 내지 500 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 500 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 300 mOsm 내지 1000 mOsm의 오스몰농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 1% 내지 20%의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 10%의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 0.1 내지 50 mM GSH(환원된 글루타티온)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 5 mM GSH(환원된 글루타티온)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 0.1 내지 50 mM GSSG(산화된 글루타티온)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 1 mM GSSG(산화된 글루타티온)를 포함한다. 예시적 실시양태에서, 리폴드 완충제는 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온) 및 1 mM GSSG(산화된 글루타티온)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 약 5.0 내지 8.0의 pH 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 리폴드 완충제는 7.5의 pH 값을 갖는다.
예시적 실시양태에서, 한외여과/정용여과(UFDF) 막을 가로지르는 3개의 TTF 단계들을 이용함으로써 MYC 함유 폴리펩타이드를 리폴딩한다. 예시적 실시양태에서, 제1 리폴드 단계는 약 120분의 과정에 걸친 리폴드 완충제 1(예를 들면, 3 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))의 교환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 리폴드 단계는 대략 120분의 과정에 걸친 리폴드 완충제 2(1.5 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))의 교환에 이은 약 120분의 재순환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 리폴드 단계는 대략 120분의 과정에 걸친 리폴드 완충제 3(50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))의 교환에 이은 12시간의 재순환을 포함한다.
최종 리폴딩 단계가 완료된 후, 0.2 ㎛ 막을 통해 최종 리폴드 용액을 여과할 수 있고 단백질 농도를 조절할 수 있다.
리폴딩 후, 나노입자 제제는 광범위한 크기 및 안정성을 갖는 나노입자를 함유한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제3 리폴드 단계 후 인큐베이션 단계 또는 평형화 단계를 수행한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는 생물학적 활성 나노입자를 생성하기에 충분한 시간 동안 리폴딩된 MYC 함유 폴리펩타이드를 제3 리폴드 완충제에서 유지한다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 평형화 단계는 나노입자 제제가 보다 더 좁은 크기 범위 및 보다 더 높은 안정성을 갖는 안정한 나노입자로 평형화될 수 있게 한다고 생각된다. 일부 실시양태에서, 이 안정한 나노입자의 수 평균 직경은 약 80 nm 내지 약 150 nm이다. 일부 실시양태에서, 평형화 단계는 적어도 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간 또는 12시간 이상의 시간 동안 수행된다. 예시적 실시양태에서, 평형화 단계는 적어도 또는 약 10시간 내지 12시간 동안 수행된다. 예시적 실시양태에서, 평형화 단계는 리폴딩된 MYC 함유 폴리펩타이드의 나노입자 제제를 제3 리폴드 완충제에서 약하게 교반시키는 단계를 포함한다. 예시적 실시양태에서, 평형화 단계는 1000 rpm 미만에서 MYC 함유 폴리펩타이드의 제제를 제3 리폴드 완충제에서 교반하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 최종 리폴드 완충제 3의 추가 교환을 수행하여, 리폴드 완충제를 투여에 적합한 제제 완충제, 예컨대, 주사에 적합한 완충제로 교환한다. 예시적 실시양태에서, 리폴드 완충제 3 중의 리폴딩된 TAT-MYC를 적합한 제제 완충제에 대해 투석한다. 예시적 실시양태에서, 한외여과/정용여과(UFDF) 막을 가로지르는 TFF를 이용하여 리폴드 완충제 3 중의 리폴딩된 TAT-MYC를 투석한다. 예시적 실시양태에서, 제제 완충제는 완충 물질을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 완충 물질은 인산나트륨, 인산칼륨, 히스티딘 및 시트레이트로부터 선택된다.
예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 5.5 내지 8.0의 pH 값을 갖는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 6.0 내지 8.0의 pH 값을 갖는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5 또는 약 8.0의 pH 값을 갖는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 약 pH 7.5의 pH 값을 갖는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 약 pH 7.5+/- pH 0.3의 제제에서 안정하다.
예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 300 mOsm 초과의 오스몰농도를 갖는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 400 mOsm 초과의 오스몰농도를 갖는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 300 mOsm 내지 1000 mOsm, 예컨대, 400 mOsm 내지 800 mOsm의 오스몰농도를 갖는 제제에서 안정하다.
예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 100 mM 초과의 NaCl을 포함하는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 150 mM 초과의 NaCl을 포함하는 제제에서 안정하다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC 제제의 NaCl 농도는 약 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 또는 550 mM NaCl이다. 예시적 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC 제제의 NaCl 농도는 약 500 mM +/- 50 mM NaCl이다.
일부 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 약 1.2 mg/㎖의 농도까지 저장될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 저장 조건과 관련하여 "안정성"은 리폴딩된 TAT-MYC가 저장 전 리폴딩된 TAT-MYC의 MYC 생물학적 활성에 비해 저장 후 그의 MYC 생물학적 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상을 보유하는 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 2년 동안 -80℃에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 1개월 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 예시적 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 2개월 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 예시적 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 3개월 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 예시적 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 4개월 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 예시적 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 5개월 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 예시적 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 6개월 이상 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 예시적 실시양태에서, 일단 해동되면, 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 100일 이상 동안 4℃에서 저장될 때 안정하다. 따라서, 본원에서 제공된 리폴딩된 TAT-MYC의 안정성은 대략 34분의 반감기를 갖는 야생형 MYC 폴리펩타이드의 안정성(Kaptein et al. (1996) JBC 271, 18875-18884)에 비해 상당히 증가된다.
C. 나노입자 크기
본 기술의 나노입자의 크기 및 질량은 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 한정이 아닌 예로써, 이러한 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 동적 광 산란, 나노입자 추적 분석 및 전자 현미경관찰을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 70 nm 내지 약 140 nm, 예컨대, 70 nm 내지 140 nm이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 80 nm 내지 약 120 nm, 예컨대, 80 nm 내지 120 nm이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 80 nm 내지 약 110 nm, 예컨대, 80 nm 내지 110 nm이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 80 nm 내지 약 90 nm, 예컨대, 80 nm 내지 90 nm이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 84 nm 또는 84 nm이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 100 nm 내지 약 120 nm, 예컨대, 100 nm 내지 120 nm이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 나노입자의 평균 입자 크기는 약 111 nm 또는 111 nm이다.
일부 실시양태에서, 제제 중의 입자의 평균 분자량은 약 103 내지 107 달톤, 예컨대, 103 내지 107 달톤이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 입자의 평균 분자량은 약 104 내지 107 달톤, 예컨대, 104 내지 107 달톤이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 입자의 평균 분자량은 약 105 내지 107 달톤, 예컨대, 105 내지 107 달톤이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 입자의 평균 분자량은 약 106 내지 107 달톤, 예컨대, 106 내지 107 달톤이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 입자의 평균 분자량은 약 2 X 106 또는 2 X 106 달톤이다.
일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.01% 미만 또는 0.01% 미만의 나노입자는 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과 또는 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.001% 미만의 나노입자는 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과 또는 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.01% 미만 또는 0.01% 미만의 나노입자는 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.001% 미만 또는 0.001% 미만의 나노입자는 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제제 내에서 약 0.01% 미만 또는 0.01% 미만의 나노입자는 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.001% 미만 또는 0.001% 미만의 나노입자는 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.01% 미만 또는 0.01% 미만의 나노입자는 50 nm 미만의 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내에서 약 0.001% 미만 또는 0.001% 미만의 나노입자는 50 nm 미만의 입자 크기를 갖는다.
D. MYC 융합 단백질
일부 실시양태에서, MYC 함유 폴리펩타이드의 생물학적 활성 나노미립자 조성물은 MYC 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 단백질은 단백질 도입 도메인, 세포 생존 또는 증식 중 하나 이상을 촉진하는 MYC 폴리펩타이드, 및 임의적으로 단백질 태그 도메인, 예를 들면, 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 폴리펩타이드(예를 들면, 본 기술의 나노미립자 제제)와 접촉된 세포는 (예를 들면, MYC와 접촉되지 않은 동일한 유형의 동일한 또는 유사한 세포에 비해) 증가된 생존 시간, 및/또는 (예를 들면, MYC와 접촉되지 않은 동일한 유형의 동일한 또는 유사한 세포에 비해) 증가된 증식을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 (a) 단백질 도입 도메인; 및 (b) MYC 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 펩타이드는 식 (I)의 펩타이드이다:
[식 (I)]
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) 단백질 도입 도메인; (b) MYC 폴리펩타이드 서열; 및 (c) 단백질 도입 도메인과 MYC 폴리펩타이드 서열을 연결하는 하나 이상의 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 펩타이드는 식 (II)의 펩타이드이다:
[식 (II)]
단백질 도입 도메인-X-MYC 폴리펩타이드 서열,
상기 식에서, -X-는 단백질 도입 도메인과 MYC 폴리펩타이드 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시양태에서, -X-는 적어도 하나의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) 단백질 도입 도메인; (b) MYC 폴리펩타이드 서열; (c) 적어도 2개의 단백질 태그; 및 (d) 임의적으로 링커(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 펩타이드는 식 (III) 내지 (VI)의 펩타이드이다:
단백질 도입 도메인-X-MYC 폴리펩타이드 서열-X-단백질 태그 1-X-단백질 태그 2(식 (III)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-X-단백질 태그 1-X-단백질 태그 2(식 (IV)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-단백질 태그 1-X-단백질 태그 2(식 (V)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-단백질 태그 1-단백질 태그 2(식 (VI)),
상기 식에서, -X-는 링커이다. 일부 실시양태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) 단백질 도입 도메인; (b) MYC 폴리펩타이드 서열; (c) 6-히스티딘 태그; (d) V5 에피토프 태그; 및 (e) 임의적으로 링커(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 펩타이드는 식 (VII) 내지 (XIV)의 펩타이드이다:
단백질 도입 도메인-X-MYC 폴리펩타이드 서열-X-6-히스티딘 태그-X-V5 에피토프 태그(식 (VII)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-X-6-히스티딘 태그-X-V5 에피토프 태그(식 (VIII)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-6-히스티딘 태그-X-V5 에피토프 태그(식 (IX)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-6-히스티딘 태그-V5 에피토프 태그(식 (X)),
단백질 도입 도메인-X-MYC 폴리펩타이드 서열-X-V5 에피토프 태그-X-6-히스티딘 태그(식 (XI)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-X-V5 에피토프 태그-X-6-히스티딘 태그(식 (XII)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-V5 에피토프 태그-X-6-히스티딘 태그(식 (XIII)), 또는
단백질 도입 도메인-MYC 폴리펩타이드 서열-V5 에피토프 태그-6-히스티딘 태그(식 (XIV)),
상기 식에서, -X-는 링커이다. 일부 실시양태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, MYC 융합 단백질은 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열은 융합 단백질의 단백질 도입 도메인, MYC 폴리펩타이드 서열, V5 에피토프 태그 및/또는 6-히스티딘 태그를 결합시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커의 아미노산 서열은 KGELNSKLE(서열번호 11)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 RTG의 아미노산 서열을 포함한다.
1. 단백질 도입 도메인(PTD)
일부 실시양태에서, MYC 융합 단백질은 단백질 도입 도메인을 포함한다. 펩타이드 수송은 세포 막을 가로질러 소분자, 단백질 또는 핵산을 세포의 세포내 구획으로 전달하는 대안을 제공한다. 한 비한정적 예 및 잘 특징규명된 단백질 도입 도메인(PTD)은 TAT 유래의 펩타이드이다. 프랭켈과 그의 동료들(Frankel et al.)(예를 들면, 미국 특허 제5,804,604호, 미국 특허 제5,747,641호, 미국 특허 제5,674,980호, 미국 특허 제5,670,617호 및 미국 특허 제5,652,122호 참조)은 TAT의 아미노산 48-57을 함유하는 펩타이드를 카고(cargo) 단백질에 접합시킴으로써 카고 단백질(β-갈락토시다제 또는 호스라디쉬 퍼록시다제)을 세포 내로 수송한다는 것을 입증하였다. 일부 실시양태에서, TAT 단백질 도입 도메인은 MRKKRRQRRR의 아미노산 서열(서열번호 7)을 포함한다.
PTD의 또 다른 비한정적 예는 페네트라틴(penetratin)이다. 페네트라틴은 세포 막을 가로질러 친수성 거대분자를 수송할 수 있다(전체로서 본원에 참고로 도입되는 문헌(Derossi et al., Trends Cell Biol., 8:84-87 (1998))). 페네트라틴은 배양물 중의 세포에 의해 내재화되는 초파리 전사 인자인 안테나페디아(Antennapedia)의 호메오도메인의 아미노산 43-58에 상응하는 16개 아미노산 펩타이드이다.
PTD의 또 다른 비한정적 예는 VP22이다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형(HSV-1)으로부터의 외피 단백질인 VP22는 세포 막을 가로질러 단백질 및 핵산을 수송하는 능력을 갖는다(전체로서 본원에 참고로 도입되는 문헌(Elliot et al., Cell 88:223-233, 1997)). VP22의 잔기 267-300은 필요하나, 수송을 위해 충분하지 않을 수 있다. 수송 기능을 담당하는 영역이 확인되지 않았기 때문에, 전체 VP22 단백질이 세포 막을 가로질러 카고 단백질 및 핵산을 수송하는 데 통상적으로 사용된다(Schwarze et al., Trends Pharmacol Sci, 21:45-48, 2000).
일부 실시양태에서, MYC 융합 폴리펩타이드는 단백질 도입 도메인을 포함한다. 한정이 아닌 예로써, 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT, 페네트라틴, VP22, vpr, EPTD, R9, R15, VP16 및 안테나페디아 중 하나 이상의 단백질의 단백질 도입 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT, 페네트라틴, VP22, vpr 및 EPTD 중 하나 이상의 단백질의 단백질 도입 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT, 페네트라틴, VP22, vpr, EPTD, R9, R15, VP16 및 안테나페디아 중 하나 이상의 단백질의 단백질 도입 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 합성 단백질 도입 도메인(예를 들면, 폴리아르기닌 또는 PTD-5)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT 단백질 도입 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 MYC 폴리펩타이드에 공유결합된다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 펩타이드 결합을 통해 MYC 폴리펩타이드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 링커 서열을 통해 MYC 폴리펩타이드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 짧은 아미노산 서열을 포함한다. 한정이 아닌 예로써, 일부 실시양태에서, 링커 서열은 길이가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산이다.
본 기술의 MYC 융합 단백질은 임의의 원하는 순서로 정렬될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, MYC 융합 단백질은 a) MYC 폴리펩타이드에 인 프레임(in frame)으로 결합된 단백질 도입 도메인, b) V5 도메인에 인 프레임으로 결합된 MYC 폴리펩타이드, 및 c) 6-히스티딘 에피토프 태그에 인 프레임으로 결합된 V5 도메인의 순서로 정렬될 수 있다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 단백질은 a) 단백질 도입 도메인에 인 프레임으로 결합된 MYC 폴리펩타이드, b) V5 도메인에 인 프레임으로 결합된 단백질 도입 도메인, 및 c) 6-히스티딘 에피토프 태그에 인 프레임으로 결합된 V5 도메인의 성분 순서를 갖는다. 일부 실시양태에서, 추가 아미노산 서열이 각각의 서열들 사이에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드 서열의 시작 및/또는 말단에서 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT 단백질 도입 도메인이다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT[48-57]이다. 일부 실시양태에서, 단백질 도입 도메인은 TAT[57-48]이다.
2. 단백질 태그 도메인
일부 실시양태에서, MYC 융합 단백질은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 태그 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 태그 도메인은 폴리히스티딘 태그 및 에피토프 태그 중 하나 이상을 포함한다. 한정이 아닌 예로써, 예시적 태그는 V5, 히스티딘-태그(예를 들면, 6-히스티딘 태그), HA(헤마글루티닌) 태그, FLAG 태그, CBP(칼모둘린 결합 펩타이드), CYD(공유결합되어 있지만 해리 가능한 NorpD 펩타이드), Strepll 또는 HPC(단백질 C의 중쇄) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 태그 도메인은 길이에서 약 10개 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 태그 도메인은 길이에서 2개 내지 40개의 아미노산, 예를 들면, 길이에서 6개 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 나열된 태그들 중 2개의 태그들(예를 들면, V5 및 his-태그)은 단백질 태그 도메인을 형성하는 데 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 히스티딘 태그는 6-히스티딘 태그이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘 태그는 서열 HHHHHH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 V5 에피토프 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, V5 태그는 GKPIPNPLLGLDST의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, V5 태그는 IPNPLLGLD의 아미노산 서열을 포함한다.
단백질 태그는 임의의 적합한 방법에 의해 본원에 개시된 융합 단백질에 추가될 수 있다. 한정이 아닌 예로써, 일부 실시양태에서, TAT-MYC 폴리펩타이드 서열은 하나 이상의 단백질 태그, 예를 들면, 폴리His-태그 및/또는 V5 태그를 코딩하는 발현 벡터 내로 클로닝된다. 일부 실시양태에서, 폴리히스티딘 태그 및/또는 V5 태그는 PCR에 의해 추가된다(즉, PCR 프라이머는 폴리히스티딘 서열 및/또는 V5 서열을 포함한다).
C. MYC 융합 펩타이드의 구축
본원에 개시된 MYC 융합 펩타이드(예를 들면, TAT-MYC 융합 펩타이드)는 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법에 의해 구축될 수 있다. 한정이 아닌 예로써, TAT-MYC 융합 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 PCR에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 MYC 서열에 대한 정방향 프라이머는 TAT 단백질 도입 도메인의 인 프레임 N-말단 9-아미노산 서열(예를 들면, RKKRRQRRR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 MYC 서열에 대한 역방향 프라이머는 정지 코돈을 제거하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, PCR 생성물은 임의의 적합한 발현 벡터 내로 클로닝된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 폴리히스티딘 태그 및 V5 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) TAT 및 (b) c-MYC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) TAT[48-57] 및 (b) c-MYC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) TAT[57-48] 및 (b) c-MYC를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) TAT, (b) c-MYC, (c) 링커(들), (d) V5 태그 및 (e) 6-히스티딘 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) TAT[48-57], (b) c-MYC, (c) 링커(들), (d) V5 태그 및 (e) 6-히스티딘 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는 (a) TAT[57-48], (b) c-MYC, (c) 링커(들), (d) V5 태그 및 (e) 6-히스티딘 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드의 MYC 부분은 본원에 기재된 임의의 MYC 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드의 MYC 부분은 하기 표시된 서열을 포함하는 MYC 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00006
일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드는 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC-융합 펩타이드는 서열번호 1이다.
Figure pct00007
일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드의 MYC 부분은 하기 표시된 서열을 포함하는 MYC 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00008
일부 실시양태에서, MYC 융합 펩타이드는 서열번호 10을 포함하고; 일부 실시양태에서, MYC-융합 펩타이드는 서열번호 10이다.
Figure pct00009
융합 단백질은 하나 이상의 작용기를 포함하도록 합성 동안 또는 합성 후 변형될 수 있다. 한정이 아닌 예로써, 상기 단백질은 아세틸, 포스페이트, 아세테이트, 아미드, 알킬 및/또는 메틸 기 중 하나 이상을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 목록은 배제하기 위한 것이 아니고 예시적인 것일 뿐이다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 적어도 하나의 아세틸 기를 포함한다.
III. 본 기술의 제제를 사용하는 방법
본 기술의 조성물(예를 들면, 생물학적 활성 안정한 나노입자로서 제제화된 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물)은 MYC 활성을 제공하므로, 생체내에서(예를 들면, 보조제, 면역 시스템 증강제 등으로서) 및 시험관내에서(예를 들면, 줄기 세포, 예컨대, 조혈 줄기 세포(HSC)의 생장 및 증식을 자극하고/하거나, 조혈 줄기 세포 이식 후 향상된 생착을 위해 HSC를 컨디셔닝하고/하거나, 면역 세포의 활성화, 생장, 증식, 생존력 또는 생존을 유도하거나 향상시키고/시키거나 배양물 중의 면역 세포에 의한 항체 생성을 향상시키는 데) 유용하다.
한정이 아닌 단지 예로써, 본 기술의 MYC 함유 나노미립자 조성물은 예를 들면, 중증 복합 면역결핍증과 같은, 그러나 이것으로 한정되지 않는, 면역 관련 질환 또는 장애를 갖는 환자에게 이식하기 위한 기증자 HSC(예를 들면, 환자의 단리된 HSC 또는 제3의 기증자의 HSC)를 프라이밍하는 데 사용될 수 있다.
중증 복합 면역결핍증(SCID)은 T 세포 및 B 세포의 양 및 기능을 손상시키는 결함에 의해 야기되는 생명 위협 원발성 면역결핍 질환이다. SCID를 갖는 유아는 통상적으로 3개월 내지 6개월의 연령까지 진단으로 이어지는 반복된 생명 위협 감염을 앓는다. 치료되지 않은 상태로 방치되면, 소아는 중증 생명 위협 감염을 계속 경험하고 2세까지 사망한다. SCID를 갖는 소아는 현재 정상 면역 시스템을 재구성하도록 디자인된 HSCT를 이용함으로써 치료된다. 이 이식의 결과는 중증 감염을 앓기 전에 이식받은 가장 어린 유아들(이 유아들 중 대다수는 계보발단자의 형제자매이거나 신생아 스크리닝 프로그램에 의해 확인됨), 및 인간 백혈구 항원(HLA)-일치된 가족 기증자를 갖는 환자의 경우 가장 우수하다. 대조적으로, 연령이 더 높은 유아에 대해 수행된 이식의 결과 및 대안적 기증자로부터의 세포를 사용함으로써 수행된 이식의 결과는 덜 유리하다.
일부 실시양태에서, 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC)를 포함하는, T 세포 및 B 세포 고갈된 기증자 조혈 세포를 본 기술의 MYC 함유 나노미립자 조성물과 함께 소정의 시간 동안 생체외에서 인큐베이션한다("프라이밍된다"). 인큐베이션 후, 프라이밍된 세포를 세척하고 환자 내로 이식한다. 기증자 세포와 본 기술의 조성물의 인큐베이션은 이식 후 장기간 자가-재생 조혈 줄기 세포의 증식을 증가시켰다.
일부 실시양태에서, 기증자 조혈 세포를 환자로부터 단리한다. 일부 실시양태에서, 기증자 조혈 세포를 본 기술의 나노미립자 MYC 함유 조성물과 함께 30분, 60분, 90분 또는 120분 동안 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 기증자 조혈 세포를 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 90 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 본 기술의 나노미립자 MYC 함유 조성물과 함께 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 세포를 50 ㎍/㎖의 나노미립자 MYC 함유 조성물과 함께 60분 동안 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물의 나노입자는 약 80 내지 150 nm, 약 90 내지 140 nm, 약 100 내지 120 nm, 또는 약 100 내지 110 nm의 평균 입자 크기를 갖고, 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물의 나노입자는 약 80 내지 150 nm, 약 90 내지 140 nm, 약 100 내지 120 nm, 또는 약 100 내지 110 nm의 평균 입자 크기를 갖고, 서열번호 10을 포함한다.
생체내 사용을 위해, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 나노미립자 MYC 함유 단백질 및 임의적으로 하나 이상의 추가 치료 화합물 및 임의적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 제제는 다수의 투여 경로들, 예컨대, 비한정적 예로써, 경구, 비경구(예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 비내, 협측, 국소, 직장 또는 경피 투여 경로 중 하나 이상을 포함하는 임의의 방식으로 개체에게 투여된다. 본원에 기재된 약학 제제는 수성 액체 분산액, 자가-유화 분산액, 고체 용액, 리포좀 분산액, 에어로졸, 고체 제형, 분말, 즉시 방출 제제, 조절 방출 제제, 급속 용융 제제, 정제, 캡슐, 환제, 지연 방출 제제, 연장 방출 제제, 박동 방출 제제, 다중미립자 제제, 및 혼합된 즉시 및 조절 방출 제제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 약학 제제의 요약은 예를 들면, 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)); 문헌(Hoover, John E., Remington is Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975); 문헌(Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980); 및 문헌(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999))에서 확인된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 나노입자 제제는 적합한 완충제를 포함한다. 예시적 완충제는 트리스, 인산나트륨, 인산칼륨, 히스티딘 또는 시트레이트 기제 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 마그네슘을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 하나 이상의 계면활성제를 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 교반 및 전단과 같은 기계적 응력으로부터 단백질 제제를 포함하는 데 사용되는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 계면활성제의 예로는 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르(Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(Poloxamer, Pluronic) 및 나트륨 도데실 설페이트(SDS)가 있다. 적합한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르, 예컨대, 폴리소르베이트 20(상표명 Tween 20® 하에 시판됨) 및 폴리소르베이트 80(상표명 Tween 80® 하에 시판됨)을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체는 상표명 Pluronic® F68 또는 Poloxamer 188® 하에 시판되는 공중합체이다. 적합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 상표명 Brij® 하에 시판되는 에테르이다. 적합한 알킬페놀폴리옥시에틸렌 에테르는 상표명 Triton-X 하에 시판된다. 폴리소르베이트 20(Tween 20®) 및 폴리소르베이트 80(Tween 80®)이 사용될 때, 이들은 일반적으로 약 0.001% 내지 약 1%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 및 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v(중량/부피)의 농도 범위 내에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 나노입자 제제는 안정화제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정화제"는 제조, 저장 및 적용 동안 화학적 및/또는 물리적 분해로부터 활성 약학 성분 및/또는 제제를 보호하는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 단백질 약물의 화학적 및 물리적 분해 경로는 문헌(Cleland et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 70(4):307-77 (1993)); 문헌(Wang, Int. J. Pharm., 7S5(2): 129-88 (1999)); 문헌(Wang, Int. J. Pharm., 203(1-2): 1-60 (2000)); 및 문헌(Chi et al, Pharm. Res., 20(9): 1325-36 (2003))에 검토되어 있다. 안정화제는 이하에서 정의된 바와 같이 당, 아미노산, 폴리올, 사이클로덱스트린, 예를 들면, 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 설포부틸에틸-베타-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 예를 들면, PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, 알부민, 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 염, 예를 들면, 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 킬레이터, 예를 들면, EDTA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 앞에서 언급된 바와 같이, 안정화제는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 양, 약 10 mM 내지 약 300 mM의 양, 또는 약 100 mM 내지 약 300 mM의 양으로 제제에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 펩타이드 나노입자를 포함하는 조성물에 대한 1일 용량은 체중당 약 0.001 내지 1000.0 mg/kg, 예컨대, 체중당 약 0.01 내지 100.0 mg/kg, 예컨대, 체중당 약 0.1 내지 10.0 mg/kg이다. 개별 치료 섭생법에 대한 변수의 수가 크고 이 권장된 값으로부터의 상당한 이탈이 드물지 않기 때문에, 상기 범위는 제안적인 범위일 뿐이다. 일부 실시양태에서, 이러한 용량은 사용된 본원에 기재된 물질 또는 조성물의 활성, 치료될 장애 또는 상태, 투여 방식, 개별 대상체의 요구, 치료되는 장애 또는 상태의 중증도, 및 의사의 판단으로 한정되지 않는 다수의 변수에 따라 임의적으로 변경된다.
LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)의 측정을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 이러한 치료 섭생법의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 임의적으로 측정된다. 독성 효과와 치료적 효과 사이의 용량 비는 LD50과 ED50 사이의 비로서 표현되는 치료 지수이다. 높은 치료 지수를 나타내는, 본원에 기재된 물질 또는 조성물이 바람직하다. 세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량의 범위를 공식화하는 데 임의적으로 사용된다. 본원에 기재된 이러한 물질 또는 조성물의 용량은 바람직하게는 최소한의 독성으로 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 용량은 사용된 제형 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 임의적으로 변경된다.
VII. 실시예
하기 실시예는 예시하기 위한 것일 뿐이고 비한정적 실시양태이다. 상기 교시에 비추어 볼 때, 본 개시의 많은 변형물들, 균등물들 및 변경물들이 가능하므로, 첨부된 청구범위 내에서 본 개시는 구체적으로 기재된 방식과 다른 방식으로 실시될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 본 기술의 TAT-MYC 융합 펩타이드의 구축
HIV-1의 TAT 단백질 도입 도메인의 인-프레임 N-말단 10-아미노산 서열(MRKKRRQRRR(서열번호 7))을 함유하는 정방향 프라이머, 및 정지 코돈을 제거하는 역방향 프라이머를 사용하여 인간 MYC에 대한 코딩 영역의 PCR 증폭으로 플라스미드 pTAT-MYC-V5-6xHis를 제조하였다. C-말단 V5 에피토프 태그 및 6-히스티딘 단백질 태그를 포함하는 pET101/D-Topo(Invitrogen) 벡터 내로 PCR 생성물을 클로닝하였다.
A. 단백질 발현을 위해 사용된 박테리아 균주
AGG, AGA, AUA, CUA, CCC 및 GGA 코돈에 대한 tRNA를 발현하는, BL21 로세타(Rosetta) 세포(Novagen)로부터 단리된 pRARE(CamR)로 BL-21 Star™ 이. 콜라이 균주(Invitrogen)를 형질전환시킴으로써 BL-21 RARE 세포를 생성하였다.
B. 단백질 유도 및 정제
발효기 접종물을 준비하기 위해, TAT-MYC 마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank)(MCB)의 바이알을 해동시켰고, 선택을 위해 항생제(40 ㎍/㎖ 카나마이신)로 보충된 LB 배지를 함유하는 진탕기 플라스크를 접종하는 데 사용하였다. 세포를 14시간 내지 16시간 동안 궤도 진탕기/인큐베이터에서 증폭시켰다. 그 다음, 증폭된 배양물을 사용하여 발효기 배양물을 접종하였다. 세포가 대수 생장기(약 4.0의 OD)에 있을 때 IPTG(약 0.5 내지 1 mM)를 배양물에 첨가함으로써 37℃에서 발효를 유도하였다. DO(용해된 산소) 스파이크(spike)가 대략 3시간 내지 6시간에서 관찰될 때까지 세포를 유도하였다. 유도 후, 세포 페이스트를 원심분리로 수거하고 추가 프로세싱까지 -70℃ 이하에서 저장하였다. 봉입체에 함유된 단백질의 대부분은 TAT-MYC이다.
세포 페이스트를 8 M 우레아 및 50 mM 포스페이트 용액(pH 7.5)에 재현탁하였다. 현탁액을 균질할 때까지 실온에서 혼합하였다. 그 다음, 현탁액을 균질화기에 통과시켰다. 그 다음, 200 mM 아황산나트륨 및 10 mM 테트라티온산나트륨을 포함하도록 균질화된 현탁액을 조절하였다. 용액을 균질할 때까지 실온에서 혼합하였다. 설포닐화된 용해물을 12시간 이상 동안 2℃ 내지 8℃에서 혼합하였다. 그 후, 설포닐화된 용해물을 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 모았고 펠렛을 버렸다. 상청액을 0.22 ㎛ 막 필터에 통과시켰다.
Ni-수지를 사용하여 Ni 친화성 크로마토그래피로 설포닐화된 TAT-MYC 용액을 정제하였다. 컬럼을 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl 및 10% 글리세롤 용액에서 평형화시켰다. 그 다음, 설포닐화되고 정화된 TAT-MYC를 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤 및 500 mM NaCl 용액(pH 7.5)으로 세척하였다. 그 다음, 컬럼을 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤 및 2 M NaCl 용액(pH 7.5)으로 세척한 후, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤, 50 mM NaCl 및 30 mM 이미다졸 용액(pH 7.5)으로 또다시 세척하였다. 100 내지 300 mM 이미다졸의 구배를 가진, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤 및 50 mM NaCl(pH 7.5)을 함유하는 용출 완충제를 러닝시키고 분획을 모음으로써 컬럼으로부터 생성물을 용출하였다. 0.22 ㎛ 막을 통해 풀링될 단백질 함유 분획을 여과하였고, UV280을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다.
Ni-세파로스 크로마토그래피 단계로부터의 풀링된 분획을, Q-세파로스 수지를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피로 더 정제하였다. 제2 세척 완충제(6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 10% 글리세롤, 2 M NaCl, pH 7.5)를 사용하여 Q-세파로스 완충제의 전도성(17.52 +/-1 mS/cm)까지 희석함으로써 컬럼에 로딩할 풀을 Ni-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 준비하였다. 그 다음, 희석된 풀을 컬럼에 로딩한 후, 6 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl 및 10% 글리세롤 용액을 사용하여 2개의 추적 단계들을 수행하였고 UV 기록선이 기준에 도달할 때까지 추가 추적 단계를 수행하였다.
실시예 2. 나노미립자 TAT-MYC 조성물의 제조
UFDF(한외여과/정용여과) 막을 사용한 접선 유동 여과 기반 리폴딩 방법을 이용하여 실시예 1로부터의 Q-세파로스 관류 풀에서의 TAT-MYC 단백질의 리폴딩을 달성하였다. 리폴딩 과정은 일련의 3개의 리폴딩 단계들을 포함하였다. 제1 리폴딩 단계는 약 120분의 과정에 걸친 리폴드 완충제 1(3 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))의 교환을 포함하였다. 제2 리폴드 단계는 대략 120분의 과정에 걸친 리폴드 완충제 2(1.5 M 우레아, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))의 교환에 이은 약 120분의 재순환을 포함하였다. 제3 리폴드 단계는 대략 120분의 과정에 걸친 리폴드 완충제 3(50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))의 교환에 이은 12시간의 재순환으로 구성되었다. 제3 리폴딩 단계가 완료된 후, 0.2 ㎛ 막을 통해 리폴드 3 용액을 여과하였고, 단백질 농도를 조절하였다.
서열번호 1의 TAT-MYC 융합체의 단백질 농도를 소 혈청 알부민의 표준 곡선과 비교하여 브래드포드(Bradford) 단백질 어세이(Sigma)로 측정하였다.
리폴딩된 TAT-MYC의 여러 로트들을 기재된 방법에 따라 제조하였다. 이 실시예를 위해, 제공된 로트는 "F01", "C2A", C2B", "C6", "C7", "C12", "C13" 및 "C14"로서 명명된다. 아르기닌을 추가로 함유하는 C2A 제제를 제외한 각각의 테스트된 로트는 리폴드 완충제 3을 사용한 제3 리폴드 단계 후 수득되었을 때 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온) 및 1 mM GSSG(산화된 글루타티온)를 함유하였다.
리폴딩된 TAT-MYC는 pH에 민감하고 pH 7.5 +/- pH 0.3의 제제에서 안정하였다. 리폴딩된 TAT-MYC는 NaCl 농도에도 민감하고 약 500 mM +/- 50 mM NaCl에서 안정하였다. 리폴딩된 TAT-MYC는 1.2 mg/㎖의 농도까지도 안정하였다. 리폴딩된 TAT-MYC는 최대 또는 약 2년 동안 -80℃에서 안정하다. 일단 해동되면, 이 물질은 최대 또는 약 1개월 동안 4℃에서 저장될 때 활성 상태로 유지된다.
실시예 3. 나노미립자 TAT-MYC 조성물의 기능 분석
TAT-MYC 조성물을 다음과 같이 활성에 대해 테스트하였다.
비장을 C57BL/6j(Jackson) 마우스로부터 채취하고 와이어 메쉬를 통해 기계적으로 해리하였다. 적혈구 세포를 제거하였고, 상업적으로 입수 가능한 단리 과정(Dynabead)을 이용하여 CD4 양성 T 세포를 단리하였고, T 세포를 1 ㎍/㎖ 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화시켰다. 세포를 웰당 1 ㎖ 배지 중의 1.5X106개 세포의 밀도로 48웰 클러스터 디쉬 내에 플레이팅하였다. 24시간 후, TAT-MYC 제제를 세포에 첨가하고(웰당 총 12 ㎍) 24시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질을 첨가한 지 24시간 후, 배지를 교체하였고, 세포를 48시간 동안 인큐베이션하였다. 초기 활성화 후 96시간에서 유세포분석(정방향 x 측면 산란)을 통해 생존력에 대해 세포를 평가하였다. (실시예 2에 따라 제조된) C2A에 대한 결과는 도 1에 표시되어 있다.
도 1a(좌측에 있는 도표)는 처리되지 않은 활성화된 T 세포의 증식을 보여준다(12.8). 도 1b(우측에 있는 도표)는 24시간 동안 6 ㎍의 TAT-MYC 제제 C2A로 처리된 활성화된 T 세포의 증식을 보여준다. 표시된 바와 같이, T 세포의 증식은 C2A 처리에 의해 2배 이상 증가된다.
이 실시예를 위해, TAT-MYC의 활성 제제, 조성물, 제제 또는 분획은 대조군 T 세포에 비해 적어도 2배의 T 세포 증식 증가를 제공하는 TAT-MYC의 활성 제제, 조성물, 제제 또는 분획이다.
Figure pct00010
실시예 4: 나노입자 제제의 특징규명
여러 다양한 기법들을 이용하여, 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었고 실시예 3에 기재된 바와 같이 생물학적 활성에 대해 테스트된 나노미립자 TAT-MYC 단백질의 조성물을 특징규명하여, (a) 본 기술의 방법에 의해 제조된 TAT-MYC 단백질이 놀랍게도 예상외로 적당한 크기 범위를 갖는 나노입자를 형성하고; (b) 이 범위 내의 나노입자의 하위분획만이 생물학적 활성, 예를 들면, MYC 활성을 갖고; (c) 활성이 입자 크기 및 하나 이상의 번역 후 변형 둘 다와 연관되어 있다는 것을 입증하였다.
A. 기능성 제제의 안정성
F01 및 F02로서 명명된 2개의 상이한 TAT-MYC 단백질 제제들을 두 상이한 온도에서 비대칭 유동 장-유동 분획화(AF4) 및 다각도 레이저 광 산란(MALLS)으로 평가하여, 샘플 중의 모든 성분들의 질량 및 크기 분포에 대한 정보를 제공하였다. FO1을 실시예 2에 따라 리폴딩하였다. FO2를 하기 논의된 바와 같이 제조하였다. AF4-MALLS 분석은 FO1이 주로 적당한 크기 범위를 갖는 입자의 단일 집단을 포함하고 입자 크기가 시간의 경과에 따라 다양한 온도에서 안정하다는 것을 보여주었다.
상기 인지된 바와 같이, F01은 실시예 2의 방법에 따라 제조되었다. FO2는 실시예 1B에 기재된 바와 같이 제조되었다. 리폴드 후, FO2는 FO1 제제, 즉 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온) 및 1 mM GSSG(산화된 글루타티온) 제제(pH 7.5)를 위해 50 mM 포스페이트, 250 mM NaCl 및 10% 글리세롤의 최종 제제(pH 7.0)로 바뀌었다.
도 2a는 FO1에 대한 결과를 보여준다. 4개의 상이한 샘플들이 도 2a에 표시되어 있다: 25℃에서 러닝된 2개의 FO1 샘플들 및 5℃에서 러닝된 2개의 FO1 샘플들이 제시되어 있다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 두 온도에서 모든 샘플들에 대해 거의 동일한 상대적 스케일의 단일 일차 피크가 약 24분 내지 약 32분에서 확인된다. 이것은 적당한 크기의 입자의 안정한 집단을 포함하는 조성물을 시사한다.
도 2b는 FO2에 대한 결과를 제공한다. 다시, 4개의 상이한 샘플들이 표시되어 있다: 25℃에서 러닝된 2개의 FO2 샘플들 및 5℃에서 러닝된 2개의 FO2 샘플들. FO1 결과와 대조적으로, 상대적 스케일에서 모두 상이한 여러 피크들이 다양한 시점들에서 확인되었다. 10분과 20분 사이에서 나타나는 피크의 경우, 상부 기록선 및 제3 기록선은 25℃에서 러닝된 샘플로부터의 결과를 표시하고; 제2 기록선 및 제4 기록선은 5℃에서 러닝된 샘플을 표시한다. 24분과 32분 사이에서 나타나는 피크의 경우, 상부 3개의 기록선들은 2개의 5℃ 샘플들 및 1개의 25℃ 샘플을 포함하는 반면, 이 시간 프레임에서 최저 기록선은 25℃에서 러닝된 제2 샘플을 표시한다. 40분 시점에서의 피크는 최저 기록선으로서 5℃ 샘플들 중 하나를 보여주고, 이 때 남은 3개의 샘플 기록선들은 위에 있다.
FO1은 실시예 3에 기재된 T 세포 어세이에서 기능을 보여주었지만, F02는 보여주지 못하였다.
따라서, 본 기술의 제제는 적당한 크기의 안정한 TAT-MYC 입자를 포함하고 생물학적 기능을 갖는다.
B. 본 기술의 제제의 생물학적 활성은 입자 크기와 연관되어 있다.
1. 크기 배제 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피는 적당한 입자 크기가 생물학적 활성 TAT-MYC 제제에 존재한다는 것을 입증한다.
TAT-MYC 단백질의 기능이 적당한 크기의 나노입자와 연관되어 있다는 것을 입증하기 위해, 3개의 상이한 TAT-MYC 제제들을 평가하였다. 다음과 같이 크기 배제 크로마토그래피에 이은 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 2개의 기능성 제제들("C12" 및 "C13"으로서 명명됨) 및 1개의 비기능성 제제("R147")를 특징규명하였다.
실시예 2에 요약된 절차에 따라 기능성 C12 및 C13을 제조하였다. 실시예 1B에 상세히 기재된 바와 같이 120분, 120분 및 14시간이 소요되는 리폴드 단계를 가질 필요성을 조사하기 위해 TFF 리폴드 단계가 가속화된 러닝 동안 R147을 생성하였다. 대신에, 전체 리폴드는 60분 이내에 달성되었다.
TAT-MYC를 분석하기 위한 SEC-HPLC 절차를 Agilent 1100 시리즈 상에서 수행하였다. 3개의 컬럼들을 직렬로 배열하였다. 설정은 다음과 같았다: 가드 컬럼-2000 A-500 A-300 A. 이동상은 1.0 ㎖/분의 유속을 갖는 50 mM 인산나트륨 및 500 mM NaCl 용액(pH 7.0)이었고, 각각의 실행 시간은 40분이었고, 단백질은 100 ㎕ 주입 부피로 컬럼에 도입되었다.
3개의 샘플들의 기록선은 도 3에 표시되어 있다. SEC-HPLC는 입자 크기 분포의 고해상을 가능하게 하고 약 13분 및 16분에서 2개의 상이한 피크들을 보여준다. 13분에서의 피크는 활성 입자를 갖는 반면, 24분에서의 피크는 활성 입자를 포함한다. 22분과 24분 사이에서 관찰된 피크는 리폴드 완충제 중의 부형제의 결과라는 것을 주목한다.
2. 입자 크기를 측정하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 및 다각도 정적 광 산란 분석
컬럼과의 임의의 예상되지 않은 분자 상호작용을 조절하고 제거하기 위해 SEC-다각도 정적 광 산란(MALS)도 이용하여 동일한 3개의 샘플들을 분석함으로써 입자 크기(분자량)를 확인하였다.
결과는 도 4a 및 4b에 표시되어 있다. 도 4a는 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온) 및 250 mM 아르기닌 용액(pH 7.5)에서 제제화된 샘플 C2A의 굴절률(음영선) 및 분자량(직선)을 보여주는 그래프이다. 도 4b는 글루타티온을 갖되 아르기닌을 갖지 않는 C2A 리폴드 완충제(활성 샘플 1) 및 아르기닌을 갖되 글루타티온을 갖지 않는 리폴드 완충제(활성 샘플 2)의 상대적 신호를 보여주는 C2A의 SEC 기록선이다.
도 4a 및 4b에 표시된 결과는 활성 입자들의 대부분이 약 107 내지 109 달톤의 분자 질량을 갖는다는 것을 확인시켜준다(약 12.5 ㎖의 체류 부피에서의 분획 참조).
3. 입자 크기를 입증하기 위한 동적 광 산란 분석
입자 크기를 측정하기 위해 생물학적 활성 제제 C2A 및 3개의 추가 제제들인 C12, C13(둘 다 활성) 및 R149(불활성)를 어세이하였다. 실시예 2에 요약된 절차에 따라 기능성 C12 및 C13을 제조하였다. R149를 C12 및 C13과 유사하게 러닝 동안 생성하였고, 6시간에 걸쳐 수행된 투석으로 TFF 리폴드 단계를 대체하였다. 앞에서 요약된 절차에 따라 기능성 C2A를 제조하였으나, 최종 제제 완충제는 250 mM 아르기닌을 포함하였다.
현탁액 중의 소립자 또는 용액 중의 중합체의 크기 분포 프로파일을 확인하는 데 이용될 수 있는 기법인 동적 광 산란(DLS)을 이용하여 샘플을 평가하였다. DLS는 브라운(Brownian) 운동 하에서 이동하는 입자의 확산을 측정하고 스토크-아인슈타인(Stokes-Einstein) 관계를 이용하여 확산 계수를 수력학적 직경으로 전환시킨다:
Figure pct00011
상기 식에서,
D h = 수력학적 직경, kB = 볼츠만 상수, η = 동적 점도, D = 병진 확산 계수, 및 T = 열역학적 온도.
말번 제타사이저 나노(Malvern Zetasizer Nano)(s) 상에서 샘플 및 표준물을 분석하였다. 분석 전에 테스트 샘플 및 대조군을 0.5 mg/㎖의 농도까지 제제 완충제로 희석하였다. 샘플을 분석하였고 사이징을 강도, 수 카운트 및 부피 분포로 평가하였다. 분석을 위해 보고된 값은 강도 Z-Ave(d.nm) 값으로부터 수득되었다.
결과는 도 5a 내지 5d에 표시되어 있다. 도 5a는 C2A에 대한 DLS 기록선을 보여주고; 평균 입자 크기(직경)는 106.2 nm이었다.
도 5b 내지 5d는 각각 제제 R149(불활성), C12(활성) 및 C13(활성)에 대한 DLS 기록선 데이터를 보여준다. 불활성 제제는 63 nm의 평균 입자 크기를 갖는 반면, 제제 C12 및 C13은 각각 106 및 103 nm의 평균 입자 크기를 갖는다.
4. 용액 중의 생물학적 활성 TAT-MYC 입자의 크기 분포를 입증하기 위한 나노입자 추적 분석
나노입자 추적 분석(NTA)은 브라운 운동의 속도와 입자 크기를 관련시키는, 액체 중의 입자를 가시화하고 분석하는 방법이다. 운동 속도는 액체의 점도 및 온도와만 관련되어 있고; 입자 밀도 또는 굴절률에 의해 영향을 받지 않는다. NTA는 액체 현탁액에서 대략 10 내지 1000 나노미터(nm)의 직경을 갖는 소립자의 크기 분포 프로파일을 확인할 수 있게 한다.
488 nm 레이저 및 NTA 2.3 소프트웨어를 갖춘 NS300 기계(Malvern, 영국 워스터 소재)를 이용한 나노입자 추적 분석(NTA)으로 나노입자 크기 및 농도를 측정하였다. 데이터 획득 전, 샘플을 400 ㎕의 최종 부피로 1:200 내지 1:400으로 희석하고 유동 셀 내에 로딩하였다. 비디오를 60초 동안 실온에서 포착하였다. 크기 검출 하한은 상기 소프트웨어에 의해 자동적으로 설정되었다.
결과는 도 6a 및 6b에 표시되어 있다. 활성 C2A 제제를 사용하여 NTA 분석을 삼중으로 반복 수행하였다. 도 6a는 샘플 중의 입자들의 대부분의 크기가 약 100 nm라는 것을 표시한다. 도 6b는 평균 농도 및 크기를 보여준다. 샘플에서 입자 크기의 통계학적 분해는 하기 표에서 제공되어 있다.
Figure pct00012
5. 생물학적 활성 나노미립자 TAT-MYC의 균일성 및 크기를 시각적으로 입증하기 위한 전자 현미경관찰
상기 생화학적 결과를 전자 현미경관찰로 더 확인하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었고 "C2B"로서 명명된 TAT-MYC 제제를 실시예 3의 T 세포 어세이에서 테스트하여 생물학적 활성을 입증하였다. 다음과 같이 전자 현미경관찰을 통해 C2B를 가시화하였다.
TAT-MYC 나노입자 제제의 50 마이크로리터 소적을 파라필름 상에 점찍은 후, 글로-방전되고 탄소 및 포름바르(formvar)로 코팅된 구리 투과 전자 현미경관찰(TEM) 격자(G400 구리; EM Science)에 흡착시켰다. 격자를 킴와이프(Kimwipe)(Kimberly-Clark)에 건조된 상태로 블롯팅한 후, 우라닐 아세테이트(2%[wt/vol]를 사용한 염색을 수행하였고 80 kV에서 TEM(Philips CM10)을 수행하였다. 입자를 4,800배 배율로 관찰하였다.
결과는 도 7에 표시되어 있다. 도 7은 100 nm 크기 범위 내의 적당한 입자를 보여준다(어두운 공). 상기 입자는 모양이 균일하고, 약간의 크기 변경이 현미경사진에서 인지되었지만, 구획 B 내지 E의 데이터는 활성 입자의 크기 범위가 현미경사진에서 표시된 크기 범위와 일치한다는 것을 확인시켜준다.
C. 본 기술의 TAT-MYC 제제의 생물학적 기능
활성 TAT-MYC 제제와 불활성 TAT-MYC 제제를 더 구별하기 위해, 펩타이드 맵핑을 수행하였다. 펩타이드 핑거프린팅으로서도 공지되어 있는 펩타이드 맵핑은 단백질의 부분적 가수분해에 이은 전기영동 및 크로마토그래피로 (종이 또는 겔 상에서) 펩타이드의 2차원적 패턴을 형성하는 기법이다. 생성된 펩타이드 패턴(또는 핑거프린트)은 특정 단백질에 대해 특징적이고 상기 기법은 펩타이드들의 혼합물을 분리하는 데 이용될 수 있다.
6개의 상이한 TAT-MYC 제제들을 엔도프로테아제 AspN으로 분해하였다. 3개의 샘플 C2B, C6 및 C7은 실시예 2에 따라 제조되었고 실시예 3의 T 세포 어세이에서 생물학적 활성을 보였다. 3개의 샘플 C4, 147 및 149는 다음과 같이 제조되었다. R149를 C12 및 C13과 유사하게 러닝 동안 생성하였으나, 6시간에 걸쳐 수행된 투석으로 TFF 리폴드 단계를 대체하였다. 실시예 2에 상세히 기재된 바와 같이 120분, 120분 및 14시간이 소요되는 리폴드 단계를 가질 필요성을 조사하기 위해 TFF 리폴드 단계가 가속화된 러닝 동안 R147을 생성하였다. 대신에, 전체 리폴드는 60분 이내에 달성되었다. C4를 실시예 1B에 요약된 절차에 따라 제조하였으나, 관류를 위해 Q 로드의 염 및 전도성을 조절하기 보다는 오히려, 이 Q 컬럼을 결합제로서 러닝시킨 후 염 구배 상에서 용출하였다. 이 샘플들 중 어느 샘플도 실시예 3의 T 세포 어세이에서 생물학적 활성을 보이지 않았다.
펩타이드 분해를 다음과 같이 수행하였다. TAT-MYC를 구아니딘 염산염으로 변성시키고, TCEP(트리스 2-카복시에틸 포스핀)으로 환원시키고, 요오도아세트아미드로 알킬화하고, 아스파르트산 잔기의 N-말단에서 절단하는 엔도프로테이나제 Asp-N으로 분해하였다. 수득된 펩타이드를 역상 HPLC로 분리하고 215 nm 흡광도로 모니터링하였다. 피크 용출 프로파일에서의 펩타이드 정체성을 질량 분광측정으로 확립하였다. 상용적인 단백질 분석을 위해, 샘플의 UV-크로마토그램에서의 피크 프로파일을 기준 샘플과 시각적으로 비교함으로써 정체성을 확립할 수 있다.
단백질 단편을 HPLC로 분석하였다. 결과는 도 8에 표시되어 있다. 도 8의 상부 3개 기록선들은 생물학적 활성 샘플들을 표시한다. 하부 3개 기록선들은 불활성 샘플들을 표시한다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 12분 시점과 12.5분 시점 사이의 피크, 즉 A1로 표지된 피크의 바로 우측에 있는 A1-2는 모든 3개의 활성 샘플들에 존재하였으나, 불활성 샘플에는 부재하였거나 최소한으로 보였다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 활성 샘플에서 하나 이상의 아스파르트산 잔기가 아세틸화될 가능성이 높다.
실시예 5: MYC 함유 나노입자 제제의 구조적 특징규명
표준 기법을 이용하여 하기 표에 요약된 바와 같이 생화학적, 생물리학적 및 기능적 특징규명 기법의 어레이를 이용하여 MYC 함유 나노입자 제제의 일차 구조, 이차 구조, 삼차 구조 및 사차 구조를 평가하였다.
MYC 함유 나노입자 구조 및 기능을 밝히는 방법의 요약
Figure pct00013
이 실시예에서 제시된 특징규명 분석들의 대부분을 위해 나노입자 제제 C13을 사용하였다. 일부 경우, 대안적 나노입자 제제(C2B 또는 C14)로부터의 데이터가 본원에 제시되어 있다. 나노입자 제제 C14도 나노입자 제제 C13을 위해 이용된 과정과 본질적으로 동일한 과정에 따라 유사한 제조 규모로 생성되었다.
A. 액체 크로마토그래피-질량 분광측정(LC/MS)에 의한 펩타이드 맵핑
비행 시간(TOF) 분석기와 함께 전자분무 이온화(ESI)를 이용한 질량 분광측정을 추가하여 상기 차트에 기재된 바와 같이 myc 함유 나노입자 제제를 분석하였다. MS 러닝 동안 UV 검출이 없었기 때문에, MS 총 이온 크로마토그램(TIC) 및 UV 크로마토그램의 시각적 정렬을 수행하여 관찰된 질량을 각각의 UV 피크에 배정하였다.
질량 분광측정 분석은 예상된 펩타이드 서열을 기반으로 펩타이드의 100% 적용범위를 확인시켜주었다. 도 9는 확인된 펩타이드 피크를 가진, MYC 펩타이드에 대한 대표적인 펩타이드 맵을 보여준다. 각각의 피크에 대한 펩타이드의 배정은 하기 표에서 제공되어 있다.
이론상 TAT-MYC Asp-N 펩타이드
Figure pct00014
B. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)
번역 후 변형물 및 생성물 관련 불순물의 정량을 위해 역상 HPLC(RP-HPLC)를 이용하였다. 테스트 샘플을 변성 완충제(7.5 M 구아니딘 HCl, 0.0625 M TrisHCl pH 7.3)로 희석하였고, Agilent AdvanceBio RP-mAb C4 컬럼(2.1 x 150 mm, 고체 코어 비드 3.5 ㎛, 450 Å)을 이용하여 분리하였다. 상기 컬럼을 50℃의 온도에서 평형화시켰다. 하기 표에 표시된 바와 같이 0.5 ㎖/분의 유속, 및 100% H20 중의 0.1%(w/v) TFA(용출제 A) 및 100% ACN 중의 0.1%(w/v) TFA(용출제 B)의 선형 구배를 적용하여 용출을 달성하였다. 검출을 280 nm에서 수행하였다.
RP-HPLC 구배 프로파일
Figure pct00015
나노입자 제제 C13의 분석은 도 10에 표시된 바와 같이 주 피크 및 몇몇 소수 피크들의 존재를 표시하였다. 이 특정 실시예에서 불순물 피크의 확인은 수행되지 않았다.
C. 원편광 이색성 분광법
"원-UV" 스펙트럼 영역(190-250 nm) 및 "근-UV" 스펙트럼 영역(250-350 nm) 둘 다에서 원편광 이색성 분광법(CD)을 이용하여 나노입자 제제 C13의 구조를 평가하였다. 원-UV 영역에서, 발색단은 펩타이드 결합이고, 이것이 통상의 폴딩된 환경에 위치할 때 신호가 생성된다. 근-UV 영역은 삼차 구조의 일부 양태에 민감할 수 있다. 이 파장들에서, 발색단은 방향족 아미노산 및 디설파이드 결합이고, 이것에 의해 생성된 CD 신호는 단백질의 전체 삼차 구조에 민감하다.
나노입자 제제 C13을 근-UV의 경우 280 nm에서 0.75 AU의 흡광도까지 희석하였고 원-UV의 경우 195 nm에서 1.1 AU의 흡광도까지 희석하였다. 글루타티온은 UV에서 샘플 흡광도의 상당한 영향을 갖는다. 따라서, 단백질로부터의 신호 기여를 증가시키기 위해, 샘플을 환원된 글루타티온 완충제 및 글루타티온 무함유 완충제로 완충제 교환하였다. 샘플에 대한 테스트 파라미터는 하기 표에 표시되어 있다.
CD 분광법에 의한 나노입자 제제의 특징규명을 위한 테스트 파라미터
Figure pct00016
원-UV 및 근-UV CD 분광법 둘 다를 위해, 평균 스펙트럼을 완충제 차감하였고 평균 잔기 몰 타원율(MRME)로 정규화하였다. 가중된 스펙트럼 차이(WSD) 알고리즘을 이용하여 스펙트럼 유사성의 정량적 분석을 수행하였다. 도 11에서 제공된, 수득된 원-UV 스펙트럼은 단백질 이차 구조가 주로 β-시트로 구성된다는 것을 암시한다. α-나선 구조가 존재한다는 증거는 거의 없었다. 도 12에서 제공된 근-UV 스펙트럼은 약한 트립토판, 높은 티로신 및 매우 높은 디설파이드 특징을 시사하였다. 하기 표에 표시된 바와 같이, 이 결과는 분자의 트립토판, 티로신 및 디설파이드 잔기의 수와 일치한다.
MYC 함유 나노입자 제제에서의 트립토판, 티로신 및 디설파이드
Figure pct00017
D. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)
파수 1700-1500 cm-1로부터의 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼을 이용하여 단백질의 구조적 성질을 확인할 수 있다. 이 스펙트럼 영역에서의 분석은 통상적으로 각각 아미드 I 및 아미드 II로서 지칭되고 파수 1700-1600 cm-1와 1600-1500 cm-1 사이에 놓인 2개의 흡수 밴드를 야기한다. 아미드 I 밴드는 이차 구조(α-나선, β-시트 등)에 의해 조절되는, 펩타이드 결합의 C=O 신축 진동에 기인한다. 이차 구조 함량은 측정된 스펙트럼을, 공지된 이차 구조를 갖는 단백질에 대해 수득된 스펙트럼과 비교함으로써 수득될 수 있다. MCT 검출기 및 BioATR Cell II를 갖춘 브루커 옵틱스 버텍스(Bruker Optics Vertex) 70을 이용하여 나노입자 제제 C14에 대한 FTIR 분광법을 수행하였다. 샘플은 분석 전 준비를 요구하지 않았다. 분석을 위한 테스트 파라미터는 하기 표에 표시되어 있다.
FTIR 테스트 파라미터
Figure pct00018
수득된 FTIR 스펙트럼을 완충제 차감하고 1600 내지 1700 cm-1에 걸쳐 최소-최대 정규화하였다. 9-점 평활화(smoothing)를 적용하여, 이차 미분의 측정을 위해 백색 노이즈를 최소화하였다. 가중된 스펙트럼 차이(WSD) 알고리즘을 이용하여 스펙트럼 유사성의 정량적 분석을 수행하였다.
나노입자 제제 C14는 시트 및 회전 둘 다에서 상당한 베타 구조를 보였다. 1649 내지 1655 주변의 피크는 랜덤 코일이다. 이 스펙트럼 특징들은 원-UV CD 데이터의 정성적 분석과 일치한다: 즉, 주로 베타 구조 및 랜덤 코일이 존재하고 α-나선은 거의 존재하지 않거나 전혀 존재하지 않는다.
E. 분석적 한외원심분리
침강 속도 분석적 한외원심분리(SV-AUC)로 용액에서의 단백질의 침강 거동을 기반으로 나노입자 제제 C13의 고차 구조를 조사하였다. SV-AUC는 분자가 원심력에 반응하여 침강하는 속도를 측정한다. 이 침강 속도는 샘플에 존재하는 분자의 분자량에 대한 정보를 제공한다.
흡광도 광학을 이용한 벡크만-코울터(Beckman-Coulter) XLI를 이용하여 SV-AUC를 수행하였다. 샘플은 분석 전 추가 준비를 요구하지 않았다. 테스트 파라미터는 하기 표에 표시되어 있다. 하기 표에 표시된 파라미터를 이용한 SEDFIT 15.01b를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. AUC 데이터는 도 14에 제시되어 있다.
AUC 테스트 파라미터
Figure pct00019
AUC 데이터 분석 파라미터
Figure pct00020
나노입자 제제 C13은 큰 분자량 분포를 나타내었다. 공지된 완충제 성질을 이용하여 대략적인 분자량을 측정하였다. 분포는 약 4 MDa(20.6S)에서 날카롭게 시작되고 약 10 MDa(40S)에서 정점을 갖는다. 주 집단 분포는 약 120 MDa(185S)까지 확장하였다. 소량의 보다 더 큰 종들이 400S를 넘어 확장하였으나, 이 종들은 방법의 정량 한계 미만이고 정확히 정량될 수 없다.
F. 변성 크기 배제 크로마토그래피-HPLC
나노입자 제제 C13을 변성 크기 배제 크로마토그래피-HPLC(dSEC-HPLC)로 분석하였다. 샘플 내에서 크기를 기준으로 보다 더 큰 분자량 종으로부터 단량체를 분리하는 것을 달성하기 위해 사용되는 TSKgel G3000SWxl; 5 ㎛; 스테인레스 강철 7.8 mm x 30 cm 컬럼을 사용하여 환원 조건 및 비환원 조건 둘 다에서 샘플을 변성 조건 하에서 러닝시켰다.
비환원 조건 하에서 샘플을 분석하기 위해, 등용매 배열로 7.5 M Gdn HCl 및 0.01 M 아세트산나트륨(pH 4.7)을 이동상으로서 사용하여 용출을 달성하였다. 샘플을 이동상으로 1/10로 희석하였고 10초 동안 볼텍싱하여 혼합하였다. 그 다음, 샘플을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 4℃에서 오토샘플러 내에 놓아두었다.
환원 조건 하에서 샘플을 분석하기 위해, 등용매 배열로 7.5 M Gdn HCl 및 0.0625 M TrisHCl(pH 7.3)을 이동상으로서 사용하여 용출을 달성하였다. 샘플을 이동상으로 1/10로 희석하였고 1 ㎖의 TCEP를 첨가한 후 10초 동안 볼텍싱하여 혼합하였다. 그 다음, 샘플을 15분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 4℃에서 오토샘플러 내에 놓아두었다.
피크의 정량을 위해 형광을 이용하여 환원 조건 및 비환원 조건 둘 다에 대한 검출을 수행하였다. 다각도 레이저 광 산란(MALLS)을 이용하여 피크 전체에 걸친 크기 분포의 평가를 달성하였다.
나노입자 제제 C13의 SEC-HPLC 분석에 대한 수득된 크로마토그램은 도 15에 표시되어 있다. 각각의 크로마토그램에서 위에 가로놓인 기록선은 2℃ 내지 8℃에서 저장된 샘플에 대해 대략 1개월 간격으로 수행된 시험을 표시하고, 이것은 가속화된 온도에서 저장할 때 변화를 골라내는 상기 방법의 능력을 입증한다.
G. 전자 현미경관찰
나노입자 제제 C2B의 3차원적 구조의 영상을 수집하기 위해 전자 현미경관찰을 수행하였다. 나노입자 제제(100 ㎍/㎖)의 50 마이크로리터 소적을 파라필름 상에 점찍은 후, 글로-방전되고 탄소 및 포름바르로 코팅된 구리 투과 전자 현미경관찰(TEM) 격자(G400 구리; EM Science)에 흡착시켰다. 격자를 킴와이프(Kimberly-Clark)에 건조된 상태로 블롯팅한 후, 우라닐 아세테이트(2%[wt/vol])를 사용한 염색을 수행하였고 80 kV에서 TEM(Philips CM10)을 수행하였다. 다수의 100 nm 입자들을 4,800배 배율로 영상화하였다. 도 7에 표시된 바와 같이, 수득된 영상은 자가-조립 구의 고차 복합체를 확인시켜준다.
실시예 6: 돌연변이체 TAT-MYC 펩타이드 제제의 특징규명
이 실시예에서, MYC 기능에 있어서 역할을 하는 부위에 있는 MYC의 점 돌연변이가 TAT-MYC 나노입자 제제의 안정성에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 상기 돌연변이를 조사하였다. 전술한 바와 같이, 서열번호 1로 기재된 서열을 갖는 TAT-MYC 융합 단백질은 2종의 태그들, 즉 V5 및 6xHis가 뒤따르는 야생형 인간 MYC 단백질(c-MYC)에 인 프레임으로 융합된 HIV-1 TAT의 단백질 도입 도메인(PTD)을 겸비하는 융합 단백질이다. TAT-3AMYC는 3개의 아미노산 치환, 즉 T358A, S373A 및 T400A를 함유한다는 점을 제외하고 TAT-MYC와 동일하다. 3개의 잔기들 모두에서의 인산화가 최대 결합을 차단하거나 DNA에의 결합을 직접적으로 방해하여 MYC와 DNA의 회합을 억제함으로써 MYC 기능을 감소시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 돌연변이를 위해 이들 3개의 아미노산들을 먼저 선택하였다(Huang et al. Mol Cell Biol. 24(4): 1582-1594 (2004)). 아래에 상세히 기재된 바와 같이, TAT-3AMYC의 점 돌연변이는 형성된 복합체를 불안정화시키고 융합 단백질 제제가 기능을 갖지 않게 만드는 것으로 보인다.
TAT-MYC 융합 단백질 및 TAT-3AMYC 융합 단백질의 제조
상기 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 TAT-MYC 단백질 및 TAT-3AMYC 단백질을 제조하였다. 융합 단백질을 변성 조건 하에서 가용화한 후, 염, 글리세롤 및 환원제를 함유하는 최종 제제(즉, 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM GSH(환원된 글루타티온), 1 mM GSSG(산화된 글루타티온))로 리폴딩하였다.
크기 배제 크로마토그래피 HPLC(SEC-HPLC)
그 다음, 크기 배제 크로마토그래피 HPLC(SEC-HPLC)를 이용하여, TAT-MYC 및 TAT-3AMYC를 포함하는 나노입자 제제들의 분자량 프로파일을 분석하였다. 크기 배제 컬럼 상에서 크기 변이체를 등용매 이동상(4 M GdnHCl, 10 mM NaOAc, pH 4.65)으로 분리하였고 280 nm에서 자외선(UV) 검출을 이용하는 다이오드 어레이 검출기 상에서 모니터링하였다. 사용된 파라미터는 다음과 같았다: 유속 0.75 ㎖/분; 최대 압력 한계: 70.0 bar; 러닝 시간: 30분; 주입 부피: 20 ㎕).
도 16a는 TAT-MYC 단백질 제제의 크로마토그램을 보여준다. 단백질 복합체는 6분과 7분 사이에서 용출된다. 8분과 15분 사이에서 용출되는 보다 더 작은 단백질 다량체 및 부형제 피크를 확인할 수 있다. 도 16b는 TAT-MYC 단백질 제제와 비교된 TAT-3MYC의 크로마토그램을 보여준다. TAT-3AMYC는 6분과 7분 사이에서 용출되는 유의미하게 더 적은 단백질 복합체를 갖는다. 단백질 제제의 대부분은 8분과 17분 사이에서 용출되는 것으로 확인될 수 있는 보다 더 작은 단백질 다량체 및 부형제 피크로 구성되었다. 이것은 알라닌으로의 T358, S373 및 T400의 돌연변이가 SEC 컬럼 상에서 6분과 7분 사이에 용출되는 나노입자 복합체의 형성을 파괴하기에 충분하다는 것을 시사한다.
효능 어세이
활성화된 CD4+ T 세포를 아폽토시스로부터 구조하고 블라스팅 표현형을 보유하고 항원성 자극 후 계속 증식하는 TAT-MYC 융합 단백질 및 TAT-3AMYC 융합 단백질의 능력을 시험함으로써 이들을 효능에 대해서도 평가하였다. 마우스로부터 비장 및 림프절을 채취함으로써 어세이를 위한 T 세포를 수득하였다. 메쉬 스크린을 통해 비장 및 림프절을 분쇄하여, C10 배양 배지 중의 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 상기 세포를 원뿔 튜브로 옮기고 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상기 세포를 5 ㎖ 멸균 TAC 완충제(135 mM NH4Cl, 17 mM 트리스 pH 7.65)에 재현탁하고 1분 내지 2분 동안 TAC 완충제에서 방치하여 적혈구 세포를 용해시켰다. 세포를 5분 동안 1200 RPM에서 원심분리하고 10 ㎖의 C10 배지로 세척하고 4 ㎖의 C10 배지에 재현탁하였다.
제조자의 설명서(Invitrogen Cat # 11445D)에 따라 항-CD4 다이나비드(Dynabead)를 사용하여 재현탁된 RBC-고갈된 세포 혼합물로부터 T 세포를 단리하였다. 요약하면, 4 ㎖의 재현탁된 세포 펠렛을, 50 ㎕의 세척된 다이나비드(x4)를 갖는 스냅 캡 튜브에 첨가하였고 4℃의 360o 뉴테이터(Nutator)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 튜브를 다이날(Dynal) 자석 위에 2분 동안 놓아두어, 비드와 세포가 튜브의 측면에서 모아지게 하였다.
상청액(CD4 음성 세포)을 제거하였다. 비드 및 결합된 세포를 4 ㎖의 C10 배지에 재현탁하고 자석 위에 다시 놓아두어 분리되게 하였다. 이 세척을 반복하였다. 세척 후, 비드 및 결합된 세포를 4 ㎖의 C10에 재현탁하였고, 50 ㎕의 CD4 디태차비드(detachabead)(Invitrogen Cat # 12406D)를 각각의 튜브에 첨가하고 22℃의 360o 뉴테이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 튜브를 다이날 자석 위에 2분 동안 놓아두어, 비드가 튜브의 측면에서 모아지게 하였다. CD4+ 세포를 함유하는 상청액을 50 ㎖ 원뿔 튜브에 모았다. 남은 비드를 10 ㎖의 C10 배지에 재현탁하고 다이날 자석 위에서 분리하고 모았다. 그 다음, 이 단계를 반복하였고, 상청액을 풀링하였다. 풀링된 단리된 CD4+ 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였고, 세포를 대략 1.5X106개 세포/㎖로 20 ㎖(5 ㎖/마우스)에 재현탁하였다. 1 ㎕/㎖의 20 ㎕ 상업용 항-CD3(eBiosciences Cat # 16-0031-86) 및 20 ㎕ 항-CD28 항체(클론 37N1)를 튜브에 첨가하여 T 세포를 활성화시켰고, 세포를 웰당 1 ㎖의 배지로 24웰 디쉬의 20웰에 시딩하였고 36℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
항-CD3 및 항-CD28로 활성화시킨 지 72시간 후, 각각의 웰의 바닥으로부터 세포를 세척하기 위해 배지를 사용하여 24웰 디쉬의 각각의 웰로부터 세포를 제거하였다. 세포를 5분 동안 1200 rpm에서 펠렛화하고 5 ㎖의 C10 배지에 재현탁하고 15 ㎖ 원뿔 튜브로 옮겼다. 5 ㎖의 Ficoll-Paque를 세포의 아래에 깔았고, 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 회전시켰다. 4 ㎖ 유리 피펫을 이용하여 버피 코트를 제거하고 새로운 15 ㎖ 원뿔 튜브로 옮겼다. 10 ㎖의 C10 배지를 첨가하여 세포를 세척하였다. 세포를 5분 동안 1200 rpm에서 펠렛화하고 1X106개 세포/㎖로 재현탁하고 24웰 플레이트의 웰당 1 ㎖씩 시딩하였다. 그 다음, 세포를 TAT-MYC 또는 TAT-3AMYC 융합 단백질로 처리하였다. 융합 단백질로 처리한 후 48시간까지 유세포분석을 이용하여 생존력을 측정하였다.
도 17은 사이토카인 회수 후 아폽토시스로부터 활성화된 T 세포를 구조하는 TAT-MYC 및 TAT-3AMYC의 능력을 평가하는 활성화된 T 세포 효능 어세이의 그래프 표시를 보여준다. TAT-MYC는 처리 부재(NT)에 비해 사이토카인 회수 후 생존 T 세포 집단의 3배 증가를 보였다. 그러나, TAT-3AMYC는 처리 부재(NT)에 비해 생존 집단 T 세포 집단의 증가가 없음을 보였다. 이 결과는 TAT-3AMYC의 대부분이 도 16b에 표시된 바와 같이 TAT-MYC처럼 복합체를 형성하지 않는다는 것을 보여준 크로마토그래피 데이터와 일치하였다.
요약하면, TAT-MYC는 SEC-HPLC에 의해 측정될 수 있고 6분과 7분 사이에서 용출되는 나노입자 복합체를 형성한다. TAT-3AMYC는 TAT-MYC와 동일한 나노입자 복합체를 형성하지 않는다. 알라닌으로의 T358, S373 및 T400의 돌연변이는 SEC 컬럼 상에서 6분과 7분 사이에서 용출되는 복합체의 형성을 파괴하기에 충분하였다. 또한, T 세포 효능 어세이에서 관찰된 TAT-MYC의 기능은 이 복합체의 형성과 상관관계를 갖는 것으로 보인다.
실시예 7: 클로로세부스 사배우스(녹색 원숭이) MYC 단백질로부터 유래한 TAT-MYC 융합 펩타이드의 구축 및 특징규명
녹색 원숭이 TAT-MYC의 구축 및 정제
클로로세부스 사배우스(녹색 원숭이) MYC에 대한 코딩 영역을 PCR로 증폭하고 실시예 1의 인간 TAT-MYC 벡터에서 인간 MYC 서열을 코딩하는 핵산을, 2개의 아미노산에 의해 인간 MYC 서열과 상이한 서열번호 8을 코딩하는 녹색 원숭이 MYC 서열의 부분으로 대체함으로써 플라스미드 pTAT-MYC(녹색 원숭이)-V5-6xHis를 제조하였다. 단백질 생성 및 정제를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 나노미립자 TAT-MYC 조성물의 제조를 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
입자 크기를 입증하기 위한 동적 광 산란(DLS)
실시예 4(B)(3)에 기재된 바와 같이 동적 광 산란(DLS) 기법으로 리폴딩된 나노미립자 조성물을 나노입자 크기 분포에 대해 평가하였다. 결과는 녹색 원숭이 TAT-MYC 나노미립자 조성물에 대한 DLS 기록선을 보여주는 도 18에 표시되어 있다. 녹색 원숭이 TAT-MYC에 대한 평균 입자 크기(직경)는 약 80 nm이었다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)
녹색 원숭이 TAT-MYC 나노미립자 조성물에서 번역 후 변형물 및 생성물 관련 불순물을 정량하기 위해 역상 HPLC(RP-HPLC)를 이용하였다. 테스트 샘플을 변성 완충제(7.5 M 구아니딘 HCl, 0.0625 M TrisHCl pH 7.3)로 1 mg/㎖까지 희석하였다. 2 ㎕의 0.5 M TCEP((트리스(2-카복시에틸)포스핀)를 샘플에 첨가하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 2℃ 내지 8℃까지 냉각시켰다. 샘플을 분석 전에 최대 5일 동안 2℃ 내지 8℃에서 저장하였다. Agilent AdvanceBio RP-mAb C4 컬럼(2.1 x 150 mm, 고체 코어 비드 3.5 ㎛, 450 Å)을 이용하여 샘플(50 ㎕(약 5 ㎍))을 분리하였다. 상기 컬럼을 50℃의 온도에서 평형화시켰다. 하기 표에 표시된 바와 같이 0.5 ㎖/분의 유속, 및 100% H20 중의 0.1%(w/v) TFA(용출제 A) 및 100% ACN 중의 0.1%(w/v) TFA(용출제 B)의 선형 구배를 적용하여 용출을 달성하였다. 검출을 215 nm에서 수행하였다. 기준 인간 TAT-MYC 나노미립자 조성물과 비교된 녹색 원숭이 TAT-MYC 나노미립자 조성물에 대한 결과는 도 19에 표시되어 있다.
크기 배제 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)
크기 배제 크로마토그래피에 이은 고성능 액체 크로마토그래피를 통해서도 녹색 원숭이 TAT-MYC 나노미립자 조성물을 특징규명하였다. 샘플 내에서 크기를 기준으로 보다 더 큰 분자량 종으로부터 단량체를 분리하는 것을 달성하기 위해 TSKgel G3000SWxl; 5 ㎛; 스테인레스 강철 7.8 mm x 30 cm 컬럼을 이용하여 변성 비환원 조건 하에서 샘플을 러닝시켰다. 등용매 배열로 4 M Gdn HCl 및 0.1 M 아세트산나트륨(pH 4.65)을 이동상으로서 사용하여 용출을 달성하였다. 샘플을 이동상으로 1/10로 희석하고 10초 동안 볼텍싱하여 혼합하였다. 그 다음, 샘플을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 4℃에서 오토샘플러 내에 놓아두었다.
기준 인간 TAT-MYC 나노미립자 조성물과 비교된 녹색 원숭이 TAT-MYC 나노미립자 조성물의 SEC-HPLC 분석에 대한 수득된 크로마토그램은 도 20에 표시되어 있다.
효능 어세이
활성화된 CD4+ T 세포를 아폽토시스로부터 구조하고 블라스팅 표현형을 보유하고 항원성 자극 후 계속 증식하는 녹색 원숭이 TAT-MYC 나노미립자 조성물 및 기준 인간 TAT-MYC 나노미립자 조성물의 능력을 시험함으로써 이들을 효능에 대해서도 평가하였다. 실시예 6에 기재된 효능 어세이에 따라 상기 조성물들을 생물학적 활성에 대해 어세이하였다.
도 21은 다양한 용량에서 처리 부재 대조군에 비해 블라스팅 표현형을 갖는 활성화된 T 세포의 양을 증가시키는 녹색 원숭이 TAT-MYC 및 인간 TAT-MYC의 능력을 평가하는 활성화된 T 세포 효능 어세이의 그래프 표시를 보여준다.
본 개시의 바람직한 실시양태들이 본원에 제시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시양태들이 예로써만 제공된다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 개시를 벗어나지 않으면서 많은 변경, 변화 및 치환이 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 것이다. 본원에 기재된 본 개시의 실시양태들에 대한 다양한 대안들이 본 개시를 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 개시의 범위를 정의하고 이 청구범위 내의 방법 및 구조, 및 이들의 균등물은 이 청구범위에 의해 커버된다.
모든 도면들 및 표들을 포함하는, 본원에서 참조되거나 인용된 모든 특허들, 특허출원들, 가출원들 및 공개문헌들은 본 명세서의 명확한 교시와 불일치하지 않는 정도까지 전체로서 참고로 도입된다.
다른 실시양태들은 하기 청구범위에 기재되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> TAIGA BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> NANOPARTICLE FORMULATIONS <130> 106417-0285 <140> PCT/US2017/064206 <141> 2017-12-01 <150> 62/429,466 <151> 2016-12-02 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Leu Asn Val Ser Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe 20 25 30 Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu 35 40 45 Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu 50 55 60 Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser 65 70 75 80 Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp Gln Leu Glu Met Val Thr 100 105 110 Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro 115 120 125 Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met 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Asp Ser Gly Ser 145 150 155 160 Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 165 170 175 Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val 180 185 190 Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 195 200 205 Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 210 215 220 Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 225 230 235 240 Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 245 250 255 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 260 265 270 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 275 280 285 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 290 295 300 Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 305 310 315 320 Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 325 330 335 Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 340 345 350 Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 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Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro 115 120 125 Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp 130 135 140 Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser 145 150 155 160 Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly 165 170 175 His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala 180 185 190 Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu 195 200 205 Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala 210 215 220 Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro 225 230 235 240 Gln Ala Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His Glu Glu Thr Pro Pro Thr 245 250 255 Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp 260 265 270 Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser 275 280 285 Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys Pro Pro His Ser Pro Leu 290 295 300 Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His Gln His Asn Tyr Ala Ala 305 310 315 320 Pro 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Met Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Leu Asn Val Ser Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Asn Tyr Asp 20 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Tyr Asp Leu Asp 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Leu Asp Tyr Asp 1 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Tyr Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp 1 5 10 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu 1 5 10 15 Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp 20 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Asp Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser 1 5 10 15 Pro Ser Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr 20 25 30 Pro Phe Ser Leu Arg Gly Asp 35 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gly Asp Asn Asp 1 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ala Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gly Asp Met Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp 1 5 10 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His 1 5 10 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 41 His His His His His His 1 5 <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 44 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5

Claims (60)

  1. 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 포함하는 조성물로서,
    a. 상기 생물학적 활성 나노입자의 평균 직경이 약 80 nm 내지 약 150 nm이고;
    b. 제제의 pH가 약 pH 6.0 이상 약 pH 8 이하이고;
    c. T 세포 증식에 적합한 조건 하에서 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포를 상기 MYC 함유 폴리펩타이드 나노입자 조성물과 접촉시키는 것이 상기 MYC 폴리펩타이드 함유 조성물과 접촉되지 않은 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포에 비해 T 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증강시키는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, MYC 폴리펩타이드가 아세틸화된 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 MYC 폴리펩타이드에 연결된 단백질 도입 도메인을 포함하는 MYC 융합 펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, MYC 융합 펩타이드가 단백질 도입 도메인과 MYC 폴리펩타이드를 연결하는 하나 이상의 분자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 하기 일반 구조를 갖는 MYC 융합 펩타이드를 포함하는 것인 조성물:
    단백질 도입 도메인-X-MYC 서열
    상기 구조에서, -X-는 단백질 도입 도메인과 MYC 서열을 연결하는 분자이다.
  6. 제3항 또는 제5항에 있어서, 단백질 도입 도메인 서열이 TAT 단백질 도입 도메인 서열인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, TAT 단백질 도입 도메인 서열이 TAT[48-57] 및 TAT[57-48]로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, MYC 폴리펩타이드가 서열번호 1 또는 10을 포함하는 MYC 융합 펩타이드인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 나노입자가 약 100 nm 내지 약 110 nm의 평균 직경을 갖는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 투여, 경구 투여, 비경구 투여, 비내 투여, 협측 투여, 직장 투여 또는 경피 투여용으로 제제화된 조성물.
  12. 치료 유효량의 제1항의 제제를 투여함으로써, 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 면역 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증가시키거나 면역 반응을 증가시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 면역 세포가 하나 이상의 아네르기 면역 세포를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 면역 세포가 T 세포인 방법.
  15. 제14항에 있어서, T 세포가 미감작 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 활성화된 T 세포, 아네르기 T 세포, 관용성 T 세포, 키메라 B 세포 및 항원 특이적 T 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 면역 세포가 B 세포인 방법.
  17. 제16항에 있어서, B 세포가 미감작 B 세포, 형질 B 세포, 활성화된 B 세포, 기억 B 세포, 아네르기 B 세포, 관용성 B 세포, 키메라 B 세포 및 항원 특이적 B 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 후 생착을 향상시키기 위해 조혈 줄기 세포를 프라이밍하는 방법으로서, 조혈 줄기 세포의 이식 전에 시험관내에서 하나 이상의 조혈 줄기 세포를 제1항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  19. (a) 소정의 농도의 변성제를 포함하는 가용화 용액에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 가용화하여, 가용화된 MYC 함유 폴리펩타이드를 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 변성제 농도의 약 0.35 내지 약 0.65 및 약 100 mM 내지 약 1 M의 알칼리 금속 염 및/또는 알칼리성 금속 염을 포함하는 제1 리폴드 완충제를 사용하여 상기 가용화된 MYC 함유 폴리펩타이드에 대한 제1 리폴딩 단계를 적어도 약 30분 내지 180분 동안 수행하여 제1 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 변성제 농도의 약 0.10 내지 약 0.30 및 약 100 mM 내지 1 M의 알칼리 금속 염 및/또는 알칼리성 금속 염을 포함하는 제2 리폴드 완충제를 사용하여 제1 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제2 리폴딩 단계를 적어도 약 30분 내지 180분 동안 수행하여 제2 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계;
    (e) 약 100 mM 내지 1 M의 알칼리 금속 염 및/또는 알칼리성 금속 염을 포함하는 제3 리폴드 완충제를 사용하여 제2 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제3 리폴딩 단계를 적어도 약 30분 내지 180분 동안 수행하는 단계; 및
    (f) 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는 생물학적 활성 나노입자를 생성하기에 충분한 시간 동안 제3 리폴드 완충제에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 유지하는 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 제조하는 방법으로서, T 세포 증식에 적합한 조건 하에서 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포를 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉시키는 것이 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉되지 않은 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포에 비해 T 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증강시키는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제1 리폴딩 단계, 제2 리폴딩 단계 및/또는 제3 리폴딩 단계가 완충제 교환에 의해 단계를 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 접선 유동 여과를 이용하여 완충제 교환을 수행하는 것인 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리 금속 염이 나트륨 염, 리튬 염 및 칼륨 염 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리 금속 염이 염화나트륨(NaCl), 브롬화나트륨, 황산수소나트륨, 황산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 염화리튬, 브롬화리튬, 황산수소리튬, 황산리툼, 탄산수소리튬, 탄산리튬, 염화칼륨, 브롬화칼륨, 황산수소칼륨, 황산칼륨, 탄산수소칼륨 및 탄산칼륨 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리성 염이 마그네슘 염 및 칼슘 염 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리성 금속 염이 염화마그네슘, 브롬화마그네슘, 황산수소마그네슘, 황산마그네슘, 탄산수소마그네슘, 탄산마그네슘, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 황산수소칼슘, 황산칼슘, 탄산수소칼슘 및 탄산칼슘 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리 금속 염이 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것인 방법.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제가 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 것인 방법.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 변성제의 농도가 약 1 M 내지 약 10 M인 방법.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제가 구아니딘, 구아니딘 염산염, 염화구아니딘, 티오시안산구아니딘, 우레아, 티오우레아, 과염소산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 베타인, 사르코신, 카바모일 사르코신, 타우린, 디메틸설폭사이드(DMSO); 알코올, 예컨대, 프로판올, 부탄올 및 에탄올; 세제, 예컨대, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), N-라우로일 사르코신, 쯔비터전트(Zwittergent), 비-세제 설포베타인(NDSB), TRITON X-100, NONIDET™ P-40, TWEEN™ 시리즈 및 BRIJ™ 시리즈; 수산화물, 예컨대, 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제가 각각 독립적으로 완충 물질을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 완충 물질이 TRIS(트리스[하이드록시메틸]아미노메탄), HEPPS(N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[3-프로판-설폰산]), CAP SO(3-[사이클로헥실아미노]-2-하이드록시-1-프로판설폰산), AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), CAPS(3-[사이클로헥실아미노]-1-프로판설폰산), CHES(2-[N-사이클로헥실아미노]에탄설폰산), 아르기닌, 라이신 및 붕산나트륨 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 각각의 완충 물질이 독립적으로 약 1 mM 내지 약 1 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제가 각각 독립적으로 산화제 및 환원제를 포함하고, 이 때 산화제 대 환원제의 몰비가 약 2:1 내지 약 20:1인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 산화제가 시스테인, 글루타티온 디설파이드("산화된 글루타티온"), 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 산화제를 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 포함시키는 것인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 베타-머캡토에탄올(BME), 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 시스틴, 시스테아민, 티오글리콜레이트, 글루타티온 및 수소화붕소나트륨 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 환원제를 약 0.02 mM 내지 약 2 mM의 농도로 포함시키는 것인 방법.
  38. 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제가 우레아를 포함하는 것인 방법.
  39. 제19항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제가 6 내지 8 M 우레아를 포함하는 것인 방법.
  40. 제19항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제가 글루타티온 및/또는 산화된 글루타티온을 포함하는 것인 방법.
  41. 제19항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제가 5 mM의 글루타티온 및/또는 1 mM의 산화된 글루타티온을 포함하는 것인 방법.
  42. 제19항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리폴드 완충제, 제2 리폴드 완충제 및/또는 제3 리폴드 완충제가 글리세롤을 포함하는 것인 방법.
  43. 제19항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)를 적어도 5시간 동안 수행하는 것인 방법.
  44. 제19항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)를 적어도 10시간 동안 수행하는 것인 방법.
  45. 제19항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)를 10시간 내지 12시간 동안 수행하는 것인 방법.
  46. 제19항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)가 1000 rpm 미만에서 제3 리폴드 완충제 중에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 교반하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  47. 제19항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 재조합 폴리펩타이드인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 미생물 숙주 세포로부터 재조합 MYC 함유 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 미생물 숙주 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 미생물 숙주 세포로부터 재조합 MYC 함유 폴리펩타이드를 단리하는 단계가 유도성 프로모터로부터 MYC 함유 폴리펩타이드를 발현시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 숙주 세포로부터 재조합 MYC 함유 폴리펩타이드를 단리하는 단계가 친화성 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 MYC 함유 폴리펩타이드를 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.
  52. 제19항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 아세틸화된 것인 방법.
  53. 제19항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 MYC 폴리펩타이드에 연결된 단백질 도입 도메인을 포함하는 MYC 융합 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, MYC 융합 펩타이드가 단백질 도입 도메인과 MYC 폴리펩타이드를 연결하는 하나 이상의 분자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  55. 제19항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 하기 일반 구조를 갖는 MYC 융합 펩타이드를 포함하는 것인 방법:
    단백질 도입 도메인-X-MYC 서열
    상기 구조에서, -X-는 단백질 도입 도메인과 MYC 서열을 연결하는 분자이다.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 도입 도메인 서열이 TAT 단백질 도입 도메인 서열인 방법.
  57. 제56항에 있어서, TAT 단백질 도입 도메인 서열이 TAT[48-57] 및 TAT[57-48]로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제19항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, MYC 함유 폴리펩타이드가 서열번호 1 또는 10을 포함하는 MYC 융합 펩타이드인 방법.
  59. 제19항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 약 100 nm 내지 약 110 nm의 평균 직경을 갖는 것인 조성물.
  60. (a) 6 내지 8 M 우레아를 포함하는 완충된 가용화 용액에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 변성시켜 변성된 MYC 함유 폴리펩타이드를 제공하는 단계;
    (b) 약 3 M의 우레아 및 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 제1 리폴드 완충제를 사용하여 변성된 MYC 함유 폴리펩타이드에 대한 제1 리폴딩 단계를 적어도 약 120분 동안 수행하여 제1 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계;
    (c) 약 1.5 M의 우레아 및 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 제2 리폴드 완충제로 완충제를 교환함으로써 제1 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제2 리폴딩 단계를 적어도 약 120분 동안 수행하여 제2 폴리펩타이드 혼합물을 제공하는 단계;
    (d) 약 500 mM의 NaCl을 포함하는 제3 리폴드 완충제로 완충제를 교환함으로써 제2 폴리펩타이드 혼합물에 대한 제3 리폴딩 단계를 적어도 약 120분 동안 수행하는 단계; 및
    (f) 약 80 nm 내지 약 150 nm의 수 평균 직경을 갖는 생물학적 활성 나노입자를 생성하기에 충분한 시간 동안 제3 리폴드 완충제에서 MYC 함유 폴리펩타이드를 유지하는 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 MYC 함유 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 나노입자의 집단을 제조하는 방법으로서, T 세포 증식에 적합한 조건 하에서 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포를 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉시키는 것이 상기 생물학적 활성 나노입자와 접촉되지 않은 항-CD3 또는 항-CD28 활성화된 T 세포에 비해 T 세포의 활성화, 생존 또는 증식 중 하나 이상을 증강시키는 것인 방법.
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