CN100506978C

CN100506978C - 一种新的造血干/祖细胞的富集方法及其体外定向诱导分化

Info

Publication number: CN100506978C
Application number: CNB011418664A
Authority: CN
Inventors: 裴雪涛; 冯凯; 南雪; 白慈贤; 张锐
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Beijing Jia Chen Hong Biological Technologies Company Limited
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2021-09-21
Also published as: CN1357620A

Abstract

本发明包括利用脐带血中含有细胞成分的不同的理化性质，利用B淋巴细胞与尼龙棉吸附及单核/巨噬细胞与塑料制品吸附的特点，采用两步法负性富集的方法获得富集的人造血干/祖细胞，既克服了传统的免疫磁珠分离体系价格昂贵及含有磁珠的缺点，又保留了细胞成分中的晚期祖细胞及对造血有支持作用的细胞成分，为今后临床体外诱导分化的细胞用于造血损伤修复提供了可行的方法。体外定向诱导分化实验表明此细胞可高效向红系及粒系细胞定向诱导分化。

Description

一种新的造血干/祖细胞的富集方法及其体外定向诱导分化

本发明涉及一种利用血细胞理化性质，两步法负性富集造血干/祖细胞的方法及在这种条件下富集的细胞体外定向诱导分化及其在造血损伤修复中的用途。

造血干细胞(HSC)凭借其强大的自我更新和多系分化的能力而维持机体造血处与一相对恒定的状态，并持续一生。因此，HSC被认为是进行造血组织移植后重建长期造血和免疫功能的关键成分，而且在某些疾病的基因治疗中是最理想的靶细胞。因而，如何有效地分离造血干细胞始终是血液学研究领域的热点，这使得造血干细胞表型的研究显得尤为重要。近年来，造血细胞分选技术、造血生长因子的发现与克隆、各种ex vivo操作技术的建立与完善，使得造血细胞在数量、性能和功能方面的改造更易于操作与应用，从而产生了一个新兴的研究与应用领域，即造血细胞工程。造血细胞工程是利用造血干/祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，通过细胞工程的技术，在体外模拟或部分模拟体内的造血环境或过程，对分离纯化的造血干/祖细胞进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等，从而在短时间内大量扩增早期的造血祖细胞及各阶段的造血前体细胞，以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞、NK细胞、T/B淋巴细胞等功能细胞和免疫活性细胞，并可对部分细胞的功能进行激活和调控，对缺陷性基因进行靶向性转染，最终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域。造血细胞工程的应用有两个基础，一是前体细胞的分离(因为成熟细胞的代谢产物在体外培养过程中会对细胞的生长产生非常不利的影响)，二是体外培养体系的应用。

细胞治疗是近些年来飞速发展起来的一种高科技生物治疗手段，它是生物免疫治疗和基因治疗的重要组成部分。血细胞由于具有运输氧、修复损伤内皮、控制感染、参与机体免疫等多种复杂的功能，因此它又是细胞治疗最主要的细胞来源。

人们利用不同的细胞因子组合，使造血干/祖细胞按照我们的要求向不同的方向分化，从而生产出我们所需的用于临床治疗的细胞产品。这就是所谓的第三代细胞治疗方案(第一代疗法为全血细胞输注，第二代为以骨髓移植为代表的造血干细胞移植)，该方法首先是分离纯化少量的CD34⁺或其亚群造血干/祖细胞(CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、CD34⁺HLA—DR⁺、CD34⁺HLA—DR^-等)，利用其高度增殖能力和多向分化的潜能，在体外进行扩增和定向诱导分化，从而在短时间内产生大量的早期祖细胞及各阶段的血细胞，以及定向扩增大量的中性粒细胞、红细胞、血小板、树突状细胞、NK细胞等免疫活性细胞，最终将广泛应用于造血干细胞移植、肿瘤生物免疫治疗、造血支持治疗及基因治疗等领域(Scheding S，et al.Exp Hematol，2000；28：460.Hino M，et al.Br J Haematol.2000；109：314.)。

以往用于分离造血干/祖细胞的方法多是利用免疫磁珠进行纯化，虽然获得的细胞较纯，但一方面增加了费用，另一方面由于采用正性分离的方法，所获得的细胞表面均带有磁珠，这是临床应用所不允许的，而更重要的一点是，纯化后的细胞往往去除了许多已定向分化的祖细胞以及对细胞体外培养有益的细胞成分，这对于临床应用是不适合的，我们的发明在于探索一种可应用于临床的分离造血干/祖细胞的方法并使其体外诱导分化为临床所需的细胞成分，从而应用于造血损伤的修复。

本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的分离方法。

本发明的目的是提供一种富集造血干/祖细胞的方法，以使得体外能高效诱导分化出有功能的成熟细胞以应用于基础及临床。

本发明的用于细胞富集的材料组合为尼龙棉柱及塑料培养板。

通过对脐带血单个核细胞的分离、及利用该方法分离的细胞的体外定向诱导分化、流式细胞仪分析的研究表明，本发明所分离出的细胞可在体外高效诱导分化出红系及粒系细胞。富集后的细胞中CD34+细胞的含量可达30％以上(单个核细胞中只含不到1％)。

下面用实施例对本发明进行进一步详细说明。

实施例1.脐带血单个核细胞的分离

一方法

1.肝素抗凝的脐血(来自永定路医院)按1:1的比例与PBS混匀，再按4:1与0.5％甲基纤维素混匀，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明。

2.吸出上清，置于50ml离心管中，20℃、1500rpm离心5分钟。

3.弃上清，加5ml PBS重悬细胞。

4.先在10ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，再缓慢沿管壁加入5ml细胞悬液，20℃、1500rpm离心20分钟，分离出单个核细胞。

5.收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。

6.用PBS悬浮细胞计数，备用。

注：以上操作均严格按照无菌操作规程

二.结果

经上述方法可从脐带血中分离出(8.465±4.04)×10⁷个单个核细胞。

实施例2.利用尼龙面柱去除细胞中的B淋巴细胞

一、方法

(一)尼龙棉柱的制备：

1 去尼龙棉约10克，用手细细将其撕为细丝(越细越好)；之后用1％稀盐酸浸泡2小时。

2 收集尼龙棉，用蒸馏水洗净晾干。

3 将尼龙棉加入到10ml的注射器针筒中，高压蒸汽灭菌备用。

(二)细胞分离：

1 取出尼龙棉柱，悬置于架子上，下接三接头活塞，先用PBS洗涤3次。

2 关闭活塞，加入用培养液悬浮的单个核细胞，均匀的加入到尼龙棉柱中，使细胞悬液的液面低于尼龙棉的界面。

3 将尼龙棉柱放置于37℃，孵育1小时。

4 取出尼龙棉柱，置于超净台内。柱下端置一灭菌的小瓶用于收集细胞，移取柱上的盖子，从柱端加入缓冲液(含5％ FBS的PBS)，使其以重力将未黏附于尼龙柱上的细胞冲下。

5 持续加入缓冲液，直到收集到3倍柱体积的液体。

6 将细胞离心，收集的细胞即为去除了B淋巴细胞的细胞悬液。

注：以上操作均严格按照无菌操作规程

二结果

通过上述方法从脐带血中分离出的Lin-细胞占单个核细胞的比率为(60.6±10.31)％；细胞绝对数为：(4.95±2.42)×10⁷。

实施例3.单核/巨噬细胞的去除

一.方法

1 将上述方法收获的细胞加到IMDM培养液中，接种至一次性塑料培养瓶中，37℃孵育2小时。

2 收集未贴壁的细胞。

二.结果

富集的造血干/祖细胞占单个核细胞的比率为：29.05±8.16％，细胞绝对数为：(8.42±4.53)×10⁶。

实施例4.富集的造血干/祖细胞的CD34+细胞含量分析

一.方法

细胞直接用计数板计数，PBS洗涤细胞后，用FITC-CD34单克隆抗体加入PBS悬浮的细胞悬液中，冰上孵育30分钟，洗涤细胞，流式细胞仪检测(Coulter)。同时设FITC-IgG1标记的阴性对照抗体。

二.结果

CB34+细胞的含量随每一步的进行其含量逐渐增高，最终为329％。

实施例5.富集的造血干/祖细胞向红系及粒系细胞定向诱导分化

一.方法

1.细胞培养

IMDM(Gibco公司)培养基中含SCF 100ng/ml，TPO 4U/ml，IL-6100ng/ml，IL-3 100ng/ml，EPO 2U/ml(向粒系定向诱导分化将EPO改为G-CSF100ng/ml)。富集的造血干/祖细胞接种浓度为5×10⁵/ml，在37℃、5％ CO₂条件下培养，每周半量换液，每3天补充上述物质一次。第7天及第14天收集部分细胞用于细胞计数及细胞表型分析。

2.细胞计数及细胞表面标志分析

细胞直接用计数板计数，PBS洗涤细胞后，用PE-CD11b，PE-GlycophorinA单克隆抗体加入PBS悬浮的细胞悬液中，冰上孵育30分钟，洗涤细胞，流式细胞仪检测(Coulter)。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性对照抗体。

三.结果

富集的造血干/祖细胞在上述细胞培养条件下，细胞总数在培养的第7天可扩增35±2.75倍，14天细胞总数可扩增94.5±12.96倍，21天可扩增456±34.26倍。流式细胞仪检测结果表明CD11b+(粒细胞的表面标志)及Glycophorin A+细胞(红系细胞表面标志)比例可达60％以上(见附图)。

说明书附图1所示为：细胞富集过程中CD34+细胞表达量的变化

a阴性对照 b从脐带血分离的单个核细胞

c去除B细胞后 d去除单核/巨噬细胞后

说明书附图2所示为：向红系定向诱导分化后红系表面标志的表达

说明书附图3所示为：向粒系定向诱导分化后粒系表面标志的表达

Claims

1.一种富集人造血干/祖细胞的方法，其特征在于它按下述步骤进行：

(1)单个核细胞的分离；按1:1的比例将抗凝血与PBS混匀，再向其中加入1/4体积的0.5％甲基纤维素，混匀后室温静置，待红细胞自然沉降至界限分明，吸出上清，置于离心管中，室温下1500rpm离心5分钟，小心弃上清，加PBS重悬细胞，然后在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，再缓慢沿管壁加入5ml细胞悬液，20℃、1500rpm离心20分钟，分离收集界面单个核细胞，PBS洗涤一次，再以PBS重悬细胞，计数备用；

(2)制备尼龙棉柱：取10克尼龙棉，撕成细丝后用1％盐酸浸泡2小时，再用蒸馏水洗净，晾干后将其加入到10ml的注射器针筒中，高压蒸汽灭菌备用；

(3)去除B淋巴细胞：将尼龙棉柱底部接三接头活塞，悬置于架子上，用PBS洗涤3次，关闭活塞，均匀加入悬浮的单个核细胞到尼龙棉柱中，使细胞悬液的液面低于尼龙棉的界面，置37℃孵育1小时后将尼龙棉柱移至超净台内，柱下端置一灭菌的小瓶用于收集细胞，移取柱上的盖子，从柱端加入含5％FBS的PBS缓冲液，使其以重力将未黏附于尼龙柱上的细胞冲下，持续加入缓冲液，直到收集到3倍柱体积的液体，将细胞离心，收集的细胞即为去除了B淋巴细胞的细胞；

(4)单核/巨噬细胞的去除：用IMDM培养基重悬去除了B淋巴细胞的细胞，将其接种至一次性塑料培养瓶中，37℃孵育2小时后收集未贴壁的细胞；

(5)此未贴壁的细胞即为富集的人造血干/祖细胞。

2.一种体外诱导造血干/祖细胞定向分化为红系细胞的方法，其特征在于利用含有细胞因子SCF100ng/ml、TPO 4U/ml、IL-6 100ng/ml、IL-3 100ng/ml、EPO2U/ml的培养基，将权利要求1富集得到的造血干/祖细胞接种后在体外进行定向诱导分化，得到可用于造血损伤修复的红系细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述细胞因子加入Gibco公司的IMDM培养基中。

4.一种体外诱导造血干/祖细胞定向分化为粒系细胞的方法，其特征在于利用含有细胞因子SCF 100ng/ml、TPO 4U/ml、IL-6 100ng/ml、IL-3 100ng/ml、G-CSF100ng/ml的培养基，将权利要求1富集得到的造血干/祖细胞接种后在体外进行定向诱导分化，得到可用于造血损伤修复的粒系细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述细胞因子加入Gibco公司的IMDM培养基。

6.权利要求2所述方法获得的红系细胞或权利要求4所述方法获得的粒系细胞在配制用于造血损伤修复治疗的药剂中的应用。