CN105254717B - 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与CD34分子特异性结合的多肽及其应用，所述多肽选自17号多肽、19号多肽中的至少一种，所述17号多肽、19号多肽的氨基酸序列分别如序列表中序列1、序列2所示。本发明提供的多肽能与CD34分子特异性结合，可以用人工合成或基因工程的方法生产。与抗体比较，本发明提供的多肽具有易于制备，分子量小，不易产生免疫排斥反应等特点；且毒副作用小，与CD34+细胞的结合，对目标细胞没有明显的杀伤和抑制增殖的效果。本发明提供的多肽可用于作为CD34阳性表达细胞的标记物，也可作为免疫荧光CD34抗体的代替物等。

Description

与CD34分子特异性结合的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及能与CD34分子特异性结合的多肽及其应用。
背景技术
CD34分子是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，分子量在105～120kD，结构上具有独特性，特异性的表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞(hemopoietic stem/progenitor cell，HSC/HPC)表面，并随着造血细胞逐渐成熟，CD34的表达量逐渐减少，直至消失。其次，CD34分子还表达于正常及肿瘤的微血管内皮细胞中，其在血管内皮中的作用机制尚不明确。
已有的研究结果表明CD34分子在介导细胞间黏附作用中发挥着重要作用，参与HSC/HPC造血干细胞的运输、定位和归巢CD34单克隆抗体与CD34分子的胞外域结合后可上调细胞CD34分子与骨髓间质层的结合。在HSC/HPC归巢中，细胞表面的CD34分子首先和内皮细胞及骨髓基质的L选择素结合启动黏附，然后穿越内皮细胞层，定位于骨髓血管外基质，增殖分化，完成归巢过程。CD34介导的黏附信号通过酪氨酸蛋白激酶信号通路调节CXCR4等G蛋白偶联受体表达，促使细胞发生趋化、黏附和迁移。酪氨酸蛋白激酶抑制剂和CXCR4阻断剂可抑制细胞黏附，动员HSC/HPC到外周血循环。
HSC/HPC黏附作用的调节药物已经被广泛应用于骨髓抑制的修复。在HSC/HPC移植治疗过程中，首先应用HSC/HPC动员药物，抑制细胞黏附作用，使HSC/HPC易于穿过髓血屏障,进入外周血循环，以便于HSC/HPC的富集和采取；在移植后，应用HSC/HPC黏附促进药物，提高CD34黏附作用,增强CD34分子与骨髓基质细胞表面分子的结合,促进HSC/HPC的定植,归巢和造血及免疫功能的恢复重建。
临床上还利用HSC/HPC动员药物等抑制细胞黏附作用，使HSC/HPC进入外周血循环，修复治疗组织损伤如心脑梗塞等。
在临床应用中，CD34分子的检测可用于HSC/HPC的确认、计数、富集和纯化，在HSC移植以及肿瘤生物治疗中具有重要意义。利用CD34纯化HSC/HPC可减少异基因造血干细胞移植时移植物中的T细胞，从而有效减少由于T细胞引起的急慢性移植物抗宿主疾病(graft-vs-host disease，GVHD)的发生；CD34分子可以用于白血病的诊断及分型，CD34分子特异性的表达于某些未分化或低分化的白血病细胞，并且在急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia，AML)细胞上的表达差异与临床化疗疗效、预后有一定的相关性；CD34分子被认为是最敏感的血管内皮标记物，可用于计数微血管，判定肿瘤血管生成状况以及肿瘤血管生成抑制剂的疗效。
CD34还参与炎症反应以及淋巴细胞的归巢，CD34抗体是深入研究CD34分子在造血、炎症反应和血管新生中的作用机制，以及HSP/HPC分离纯化和急性髓系白血病的诊断不可缺少的分子探针。至今仅美、英、法、丹麦等极少数国家研制出10余株鼠源性抗人CD34抗体，均采用经典的杂交瘤技术。这些CD34抗体均特异性的结合CD34分子，并能识别HSC/HPC、血管内皮细胞及某些白血病细胞。但CD34抗体在制备和临床应用中仍面临着一些问题：首先，由于CD34分子免疫原性很弱,不易刺激机体产生分泌特异抗体的B细胞，致使CD34抗体的制备工作量大且成功率低，具有成本高，生产周期长的缺点；其次，在造血干细胞移植的过程中，这些鼠源性抗体将不可避免地伴随着造血干细胞进入人体，从而引起人抗鼠抗体免疫应答(human anti-mouse antibodyresponse，HAMA)，遗留医疗安全隐患。
发明内容
本发明为弥补现有技术的不足，提供一种能与CD34分子特异性结合的多肽，其具有易于制备，分子量小，不易产生免疫排斥反应等特点。
本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：提供与CD34分子特异性结合的多肽，所述多肽选自17号多肽、19号多肽中的至少一种，所述17号多肽、19号多肽的氨基酸序列分别如序列表中序列1、序列2所示。
本发明提供的多肽能与CD34分子特异性结合，可以用人工合成或基因工程的方法生产。该多肽亦可称之为一种非抗体结合蛋白(non-antibody binding protein)，非抗体结合蛋白是相对于抗体/抗原特异性结合的特征而言，又称之为支架结合蛋白(scaffoldsbinding protein)。这类蛋白在三维结构上通过其表面氨基酸形成的支架能结合特定的分子，与抗体比较，具有分子量小，渗透力强，耐热，稳定性好，容易操作和适合大规模生产等特点。
本发明提供的多肽能与CD34+造血干细胞、血管内皮细胞和白血病细胞(具体如K562白血病细胞)结合，不与CD34-的MNNG/HOS骨肉瘤细胞结合。
本发明提供的多肽与CD34+细胞结合后不影响细胞的增殖速率。
本发明提供的多肽可作为CD34阳性表达细胞的标记物使用，具体如作为导管上皮细胞、血管内皮细胞标记物。
本发明提供的多肽还可在干细胞，特别是HSC/HPC细胞的鉴定、富集、筛选或纯化中应用。
本发明提供的多肽还可在制备用于白血病诊断或分型的试剂中应用。
本发明提供的多肽还可用于制备CD34靶点药物，该药物其活性成分包括上文所述的多肽。
本发明提供的多肽可用于调节CD34阳性细胞的黏附和归巢作用，例如可用于制备具有抑制CD34阳性细胞的黏附和归巢作用的药物制剂。
本发明提供的多肽还可用于制备吸附和富集CD34阳性细胞的制剂，例如用于组织再生区域可吸附造血干细胞，促进组织的再生和愈合；用于白血病患者癌细胞的初筛。
上述利用本发明的多肽制备药物或制剂时，还可以包括药学上可接受的载体、辅料等。这些载体或辅料本领域技术人员可根据所需制备的药物剂型等要求而具体选择，例如载体可以为稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或多种；辅料例如可以包括有香味剂、甜味剂等。药物剂型例如可以是胶囊、软胶囊、片剂、口服液、分散片、冻干粉针、注射液或滴丸等。
本发明提供的多肽还可作为药物靶向分子使用，其可在制备药物靶向制剂中应用，例如靶向CD34+细胞的药物靶向制剂。
本发明提供的多肽可在分离或检测CD34阳性细胞的方法中进行应用，从而替代现有技术中使用CD34抗体来分离或检测CD34阳性细胞。
本发明提供的多肽，能够满足以下医学应用和医学研究的要求：
1)可以用于检测、富集和纯化HSC/HPC；
2)可以用于作为血管内皮标记物；
3)可以用于白血病诊断、分型；
4)可以作为药物靶向分子；
5)可以用于作为免疫荧光CD34抗体的代替物；
6)可以用于抑制CD34阳性细胞的黏附作用；
7)可以用于吸附干细胞，促进组织再生和修复。
另外，本发明提供的多肽还具有以下优点：
1)该多肽结合效率高，可以特异的结合CD34+干细胞、造血干细胞、血管内皮细胞和K562白血病细胞；
2)该多肽毒副作用小，与CD34+细胞的结合，对目标细胞没有明显的杀伤和抑制增殖的效果；
3)该多肽分子量小，具有通透性好、不易变性、免疫原性低等特点；
4)该多肽制备方便，成本低，可用人工合成方法直接合成，也可以通过基因工程的方法制备，避免了如抗体动物生产的异种蛋白隐患，增进了干细胞分离制备的医疗安全，有利于减少干细胞移植并发症。
附图说明
图1：为噬菌体展示技术筛选到的能与CD34分子结合的17、19和24号单克隆噬菌体的PCR结果。除第一组条带为Mark外，从左到右依次为17,19和24号噬菌体的PCR条带。
图2a-图2b：为将K562白血病细胞的CD34分子通过CD34抗体免疫共沉淀，然后与CD34结合多肽结合，最后将CD34抗体沉淀后并结合有CD34荧光多肽的CD34分子通过荧光分光光度计检测荧光强度的结果；其中图2a为17号多肽与CD34分子结合的检测结果；图2b为19号多肽与CD34分子结合的检测结果。
图3a-图3b：为K562白血病细胞中CD34分子与CD34抗体(红色荧光)和CD34结合多肽(绿色荧光)结合的免疫荧光照片。其中图3a为17号多肽与K562细胞中CD34分子结合的免疫荧光照片(1000×)；图3b为19号多肽与K562细胞中CD34分子结合的免疫荧光照片(1000×)。
图4：CD34结合多肽对CD34阳性细胞黏附作用的实验结果。
图5：为磁性分离示意图。
图6a：为CD34结合多肽与人颌下腺组织切片中导管上皮和血管内皮细胞结合的荧光显微镜照片，图中绿色荧光为多肽结合部位，蓝色荧光为DAPI核染色；
图6b：为CD34结合多肽的阴性对照，蓝色荧光为DAPI核染色；
图6c：为人颌下腺组织切片中CD34表达的免疫荧光照片，红色荧光为CD34表达，蓝色荧光为DAPI核染色；
图6d：为人颌下腺组织切片的H&E染色结果。
图7a为MNNG/HOS在明场下的显微镜照片；图7b为该区域细胞与19号多肽结合的荧光显微镜照片。
图8a为MNNG/HOS在明场下的显微镜照片；图8b为该区域细胞与17号多肽结合的荧光显微镜照片。
图9：为在K562细胞的低血清培养液中，分别添加CD34结合多肽17号和19号后，K562细胞的增殖曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明：
文中的百分比若未特别说明，均为质量百分比；文中使用的试剂若未特别说明，均为可从市面购买获得。
实施例1CD34结合噬菌体的筛选
1)以CD34为靶分子富集结合CD34的噬菌体
用5μg/mL的CD34分子(购自PeproTech公司)包被96孔板，利用T7人cDNA文库(Novagen)中展示随机多肽的T7噬菌体裂解液与3％的脱脂奶粉按质量比1:1混合后，同CD34分子包被的96孔板孵育30分钟。然后用冲洗液洗脱去除非特异性结合噬菌体，富集与CD34结合的T7噬菌体，经过反复筛选，直到噬菌体文库回收率不再增加。没有包被CD34分子的培养皿作为对照组。
在第一轮筛选中投入的噬菌体滴度为6.4×1010cfu，回收的噬菌体滴度为5.4×105cfu，将回收后的噬菌体进行扩增，扩增后滴度达到4.2×109cfu，继续投入进行第二轮的筛选，第二轮回收的噬菌体滴度为5.8×102cfu，同样的将筛选后的噬菌体扩增达到8.53×109cfu，投入继续第三轮筛选，回收到1.62×104cfu，经过计算从第一轮开始筛选回收率不再增加(表1所示)。将筛选后的噬菌体文库保种备用。
表1.噬菌体筛选结果
2)与CD34结合单克隆噬菌体的筛选
在富集的噬菌体文库中随机挑选80个单克隆噬菌体，经扩增后，与CD34包被的96孔板结合，洗脱去除非特异性结合的单克隆噬菌体，通过分光光度计检测每个单克隆噬菌体的结合效率。共筛选出3个与CD34分子结合率高的单克隆噬菌体，按挑选单克隆顺序分别命名为17、19、24号单克隆噬菌体。将3个单克隆噬菌体做菌液PCR，经检测其结果如图1所示，17、19和24号噬菌体的菌液PCR条带均为单一条带，证明为单克隆噬菌体。
3)序列测序和多肽合成
将三个单克隆噬菌体送广州艾基生物技术有限公司，测序与CD34分子结合的阳性单克隆噬菌体中插入的cDNA序列，分析得到与CD34分子特异性结合的氨基酸序列。17和19号噬菌体展示的氨基酸序列分别如序列表中序列1、序列2所示，24号噬菌体展示的氨基酸序列还在科学论证中，因而在此不予展示。
人工合成17和19号噬菌体展示的多肽(上海强耀生物科技有限公司合成)，分别命名为17号多肽、19号多肽，其氨基酸序列分别如序列表中序列1、序列2所示，并在N末端添加FITC(绿色荧光)标签，纯度＞95％。
实施例2CD34结合多肽免疫共沉淀
(1)提取总蛋白：用预冷的PBS缓冲液洗涤K562细胞一次，弃去PBS，于培养皿中加入500μL含蛋白酶抑制剂的非变性蛋白裂解液，将细胞收集到1.5mL的离心管中，超声波破碎4次，每次4秒，冰上放置30分钟，8000rpm 4℃离心20分钟，将上清液转移到新离心管中，即得细胞总蛋白产物；
(2)细胞总蛋白产物预处理：在细胞总蛋白产物中加入50μL正常山羊血清封闭液，在冰上孵育1小时，然后加入100μL蛋白G微球悬液(Calbiochem)，在4℃孵育20分钟，离心去除蛋白G微球；
(3)免疫共沉淀：向经步骤(2)预处理后的总蛋白中加入CD34抗体(AR)为实验组，对照组则加入等量的PBS抗体稀释液，4℃孵育8小时；
(4)多肽共结合及蛋白G抗体纯化：分别将17号和19号多肽加入各自的实验组和对照组，同时加入蛋白G微球悬液，4℃孵育4小时；
(5)清洗和洗脱，4℃离心去除上清，用洗液清洗3次，离心去上清，加入与蛋白G微球体积等量的2×SDS缓冲液，在50℃处理10分钟，离心去除微球，转移上清到新的EP管，加入DTT(二硫苏糖醇)到终浓度为100mM；
(5)微量荧光分光光度计(NanoDrop3300)检测实验组和对照组中的荧光强度。
如图2a、2b所示(图2a显示的是17号多肽的荧光光度计检测结果，图2b显示的是19号多肽荧光光度计的检测结果)，由图2a、2b可知，通过CD34抗体免疫共沉淀的蛋白可与17号和19号多肽特异性结合，而且19号多肽结合的特异性优于17号多肽。
实施例3CD34结合多肽与CD34阳性细胞的CD34分子的结合
(1)准备细胞：将K562细胞悬液置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％时，离心弃去培养液，PBS缓冲液清洗一次，离心，取细胞悬液，滴加在用多聚赖氨酸包被的载玻片上，干燥后用冷丙酮固定10分钟。
(2)PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟。然后用5％BSA封闭液室温封闭1小时。
(3)一抗孵育：CD34抗体(AR)的一抗稀释液，滴加到玻片上，4℃孵育过夜。PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟。
(4)二抗孵育及多肽结合：分别将17号和19号多肽加入稀释后的Alexa Fluor 561标记的抗兔抗体中混合，然后滴加到盖玻片上，室温避光孵育1小时。PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟。
(5)1μg/mL的DAPI室温避光染色5分钟，PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟。
(6)用防荧光淬灭剂封片后，激光共聚焦显微镜观察拍照。
结果如图3a-3b所示，图中红色荧光为CD34抗体标记的位置，绿色荧光为CD34结合多肽(图3a为17号多肽，图3b为19号多肽)标记的位置，蓝色为DAPI细胞核染色，红色与绿色荧光相互重叠，证明了17号、19号多肽与CD34分子结合。
由本实施例的实验结果可知，17号多肽、19号多肽可替代CD34抗体在分离或检测CD34阳性细胞中应用，如在干细胞分离、白血病诊断或分型中应用。同样也可用于开发吸附CD34阳性细胞的试剂或材料。
本实施例的实验结果也体现了17号和19号多肽的用于替代抗体的优势，通过标记荧光的多肽直接与细胞表面分子结合，反应时间短，方便临床应用。
实施例4CD34结合多肽对CD34阳性细胞黏附作用的影响
如图4所示，将K562细胞分别放入FN,Collagen I和Mareigel的96孔板中培养，设实验组和对照组，分别将17号和19号多肽加入培养孔中作为各自的实验组(多肽终浓度为2μg/mL)，对照组(图4中NC对应于对照组的结果)为向培养孔中加入等量的多肽稀释液；6小时后去除上清及悬浮的细胞，计数贴壁的黏附细胞，结果显示含有17号多肽、19号多肽的培养液显著抑制K562细胞的黏附功能，而且19号多肽培养液的抑制效果尤为显著，结果可参见图4。
由本实施例的实验结果可知，17号多肽、19号多肽可用于开发抑制CD34阳性肿瘤细胞黏附作用的抗肿瘤转移药物。同样，也可用于开发抑制CD34阳性造血干细胞/祖细胞黏附作用的造血干细胞动员药物。
实施例5CD34结合多肽对CD34阳性细胞的磁性分离
分别将黏附于纳米磁珠表面的17号和19号多肽与K562细胞和外周血细胞混合孵育1小时，通过磁性分选仪器分选，结果发现K562细胞分选效率达到95％以上，而17号和19号多肽因不结合CD34阴性细胞，所以其它血细胞未能被磁性分离。本实施例的示意图可参见图5。本实施例进行磁性分离的具体操作可参照本技术领域常规的磁性分离技术进行。
由本实施例的实验结果可知，17号多肽、19号多肽可用于分选CD34阳性细胞，并去除CD34阴性的细胞。
实施例6CD34结合多肽与颌下腺血管内皮细胞和导管上皮细胞的结合
本实施例通过免疫荧光检测多肽与颌下腺导管上皮细胞和血管内皮细胞的结合。
将人的颌下腺组织用OCT包埋，在-20℃下切成6μm厚的薄片，用丙酮固定15分钟，用PBS洗3遍，每次5分钟，与2μg/mL的CD34结合多肽(17号多肽)室温孵育1小时，用PBS洗3遍，每次10分钟，滴加20μL防荧光淬灭剂封片，放入4℃避光保存，荧光显微镜观察并拍照。
如图6a所示，在图中自带绿色荧光的CD34结合多肽结合于颌下腺组织中的导管上皮细胞和血管内皮细胞上，围绕管腔分布。我们还利用了CD34抗体(RA)对颌下腺组织切片中的CD34表达做了免疫荧光检测，结果如图6c所示，证明在颌下腺组织中的导管上皮细胞和血管内皮细胞有CD34的表达，表达区域与CD34结合多肽(17号多肽)相同。颌下腺组织冷冻切片的H&E染色图片，如图6d所示，图中伊红着色较深的为导管细胞。
另外，也对19号多肽进行了同样的实验，其结果和17号多肽基本相同，在此不再赘述。
由本实施例的实验结果可知，17号多肽、19号多肽可作为导管上皮细胞和血管内皮细胞标记物应用。
实施例7CD34结合多肽与人骨肉瘤细胞系MNNG/HOS的结合性检测
在两皿生长状态良好，密度达到80％的MNNG/HOS细胞中，按2μg/mL的比例分别加入17和19号多肽，在37℃培养箱中孵育2小时，弃去培养液，加入1mL PBS洗3遍，然后加入5mL培养液，在荧光显微镜下观察多肽与MNNG/HOS细胞的结合情况。
如图7a-7b所示，图7a为19号多肽结合后明场下的MNNG/HOS细胞，图7b为用同一视野在荧光显微镜下拍摄的照片。在照片中没有观察到荧光多肽与MNNG/HOS细胞的结合。
如图8a-8b所示，图8a为17号多肽结合后明场下的MNNG/HOS细胞，图8b为用同一视野在荧光显微镜下拍摄的照片。在照片中没有观察到荧光多肽与MNNG/HOS细胞的结合。
骨肉瘤细胞系MNNG/HOS不表达CD34分子，本实验结果显示了17号多肽、19号多肽与CD34分子结合的特异性。
由本实验可知，17号多肽、19号多肽与人骨肉瘤细胞系MNNG/HOS不结合，显示了CD34分子结合的特异性。类似实验结果也在鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤和乳腺癌等细胞系中证实，在此不予一一展示。
实施例8CD34结合多肽对K562细胞增殖的影响
1)取生长状态良好的K562细胞，以6000个/mL/孔的细胞浓度接种于24孔板中，设两个实验组，该两个实验组分别为向培养液中加入17号多肽、19号多肽(多肽浓度为2μg/mL)，设对照组，对照组为向培养液中加入和多肽等量的多肽稀释液。
2)每隔24小时计数一次，每隔48小时补加一次CD34结合多肽(多肽的浓度为2μg/mL)连续计数6天，该实验重复3次；
3)以每天细胞密度均值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。
结果如图9所示，对照组(对应于图中NC的结果)中K562白血病细胞的增殖速率，与分别添加CD34结合多肽17号多肽和19号多肽的K562白血病细胞的增殖速率无显著性差异，证明了本发明的CD34结合多肽毒副作用小，不影响K562细胞正常增殖的特点。
以上实施例中涉及的实验操作若未特别说明，均可参照本技术领域常规操作进行，在此不再一一赘述。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.与CD34分子特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽选自17号多肽、19号多肽中的至少一种，所述17号多肽、19号多肽的氨基酸序列分别如序列表中序列1、序列2所示。
2.一种CD34阳性表达细胞的标记物，其特征在于，包括如权利要求1所述的多肽。
3.一种CD34靶点药物，其特征在于，所述药物其活性成分包括如权利要求1所述的多肽。
4.根据权利要求3所述的CD34靶点药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
5.权利要求1所述的多肽在制备具有抑制CD34阳性细胞黏附、归巢作用的制剂中的应用。
6.权利要求1所述的多肽在制备用于组织再生中吸附CD34阳性细胞的制剂中的应用。
7.权利要求1所述的多肽在干细胞的鉴定、富集、筛选或纯化中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述干细胞为造血干/祖细胞。
9.权利要求1所述的多肽在制备用于白血病诊断或分型的试剂中的应用。
10.权利要求1所述的多肽在制备药物靶向制剂中的应用。
11.权利要求1所述的多肽在分离CD34阳性细胞中的应用。
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