CN106337036A - 一种提高脂肪组织中cd34阳性血管基质成分提取率的方法 - Google Patents

一种提高脂肪组织中cd34阳性血管基质成分提取率的方法 Download PDF

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戴玲华
王金福
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Abstract

本发明公开了一种提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分(SVF)提取率的方法，所述方法为：将脂肪组织用生理盐水混悬，离心去除油层后，将沉淀重复离心，取最后一次离心获得的沉淀破碎，获得破碎组织，然后向破碎组织中加入胶原酶水溶液，37℃振荡消化，消化结束后，离心，取沉淀即为CD34阳性血管基质成分。本发明所述方法能够用低浓度的胶原酶消化，从脂肪组织中获取含高比率CD34阳性干/祖细胞的SVF。CD34阳性干/祖细胞比率：在SVF中占比大于24％，每毫升脂肪组织可获得大于6.0×105个CD34阳性细胞。

Description

一种提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法
(一)技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从脂肪组织中高效制备SVF的方法。
(二)背景技术
目前研究发现脂肪组织是多向分化潜能细胞的来源之一，而这部分多能细胞就存在于脂肪组织的血管基质成分(Stromal vascular fraction，SVF)中。SVF是脂肪组织除去成熟脂肪细胞后得到的一组异质性细胞群体，CD34阳性干/祖细胞是其中最为重要的功能细胞群。研究表明，脂肪来源SVF不仅具有向成骨、软骨、脂肪、血管和神经元样细胞分化的多向潜能，也可分泌VEGF、bFGF、HGF、血管生长因子、血管生成素1等多种因子，这一异质性特点使其在参与组织损伤修复和促进再生方面独具优势。目前，SVF已在多种组织再生修复和疾病治疗动物模型中已展现出良好的应用效果，主要包括辅助脂肪移植并促进脂肪存活和再生，在大鼠心梗模型中促进血管新生和损伤修复，降低实验性自身免疫性脑炎中炎症因子水平，促进糖尿病足溃疡部位成纤维细胞增殖和修复以及应用于皮肤烧伤和创面愈合治疗等。目前所用单一机械法或酶法分离SVF普遍存在其中干/祖细胞得率低的问题。因此，研究和开发高效的SVF分离技术，尤其是从脂肪组织中获取高比率的CD34阳性干/祖细胞，具有重要意义。
(三)发明内容
本发明要目的是提供一种从脂肪组织中高效分离SVF的方法，利用机械法和胶原酶消化法相结合的方法，获取含高比率CD34阳性干/祖细胞的SVF。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法，所述方法为：将脂肪组织用生理盐水混悬，离心去除油层后，将沉淀重复离心，取最后一次离心获得的沉淀破碎，获得破碎组织，然后向破碎组织中加入胶原酶水溶液，37℃振荡消化，消化结束后，离心，取沉淀即为CD34阳性血管基质成分。
进一步，所述胶原酶水溶液浓度为120-180U/ml，市购获得。胶原酶的实际用法和用量如下：将胶原酶溶于适量生理盐水中，使得每毫升体积酶活为120-180个单位。0.22μm滤网过滤后所得溶液即为胶原酶溶液。
进一步，胶原酶水溶液与破碎组织体积比为(1-3):1。
进一步，所述最后一次离心获得的沉淀采用无菌剪刀剪碎或20ml注射器抽吸至乳糜状，获得破碎组织。
进一步，所述方法按如下步骤进行：将脂肪组织用生理盐水混悬，4500rpm离心30s去除油层后，将沉淀重复离心2次，取最后一次离心获得的沉淀使用无菌剪刀剪碎或20ml注射器抽吸至乳糜状，获得破碎组织，然后向破碎组织中加入等体积120-180U/ml胶原酶水溶液，37℃振荡消化30min，消化结束后，130g离心10min，重复2次，取沉淀即为CD34阳性血管基质成分。
本发明CD34阳性干/祖细胞比率通过流式细胞术检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述方法能够用低浓度的胶原酶消化，从脂肪组织中获取含高比率CD34阳性干/祖细胞的SVF。CD34阳性干/祖细胞比率：在SVF中占比大于24％，每毫升脂肪组织可获得大于6.0×105个CD34阳性细胞，是现有技术得率的5倍以上。
(四)附图说明
图1本发明制备的SVF中CD34阳性细胞流式检测图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：胶原酶溶液制备
根据胶原酶(购自sigma公司)的酶活单位，加入适量生理盐水(购自生工生物公司)使其每毫升生理盐水达到120-180个单位，0.22μm滤网过滤后所得溶液即为胶原酶溶液。
实施例2：从脂肪组织中分离SVF
将经抽脂获得的10ml人脂肪组织放入50ml离心管中，加入适量生理盐水，混匀，4500rpm离心30s，油层去除后，将组织取出移至新的离心管中，重复两次。将清洗后的组织放入离心管中，使用无菌剪刀剪碎或20ml注射器抽吸至乳糜状。将组织放入50ml离心管中，加入等体积实施例1制备的胶原酶溶液，37℃，振荡消化30min。消化结束后，130g离心10min，取沉淀。重复2次，所取沉淀即为SVF。加入1ml生理盐水悬浮细胞后，取样流式检测CD34阳性细胞比例。结果见表1和图1。
表1脂肪SVF中活细胞数、CD34阳性细胞比例和数量
结果表明，利用本方法制备的SVF中CD34阳性细胞比例大于24％，每毫升脂肪组织可获得大于6.0×105个CD34阳性细胞，是现有技术得率的5倍以上。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法，其特征在于所述方法为：将脂肪组织用生理盐水混悬，离心去除油层后，将沉淀重复离心，取最后一次离心获得的沉淀破碎，获得破碎组织，然后向破碎组织中加入胶原酶水溶液，37℃振荡消化，消化结束后，离心，取沉淀即为CD34阳性血管基质成分。
2.如权利要求1所述提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法，其特征在于所述胶原酶水溶液浓度为120-180U/ml。
3.如权利要求1所述提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法，其特征在于胶原酶水溶液与破碎组织体积比为1-3∶1。
4.如权利要求1所述提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法，其特征在于所述最后一次离心获得的沉淀采用无菌剪刀剪碎或20ml注射器抽吸至乳糜状，获得破碎组织。
5.如权利要求1所述提高脂肪组织中CD34阳性血管基质成分提取率的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：将脂肪组织用生理盐水混悬，4500rpm离心30s去除油层后，将沉淀重复离心2次，取最后一次离心获得的沉淀使用无菌剪刀剪碎或20ml注射器抽吸至乳糜状，获得破碎组织，然后向破碎组织中加入等体积120-180U/ml胶原酶水溶液，37℃振荡消化30min，消化结束后，130g离心10min，重复2次，取沉淀即为CD34阳性血管基质成分。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652367A (zh) * 2019-01-04 2019-04-19 吉林省拓华生物科技有限公司 一种制备临床级脂肪干细胞的方法
CN110129260A (zh) * 2019-04-08 2019-08-16 奥尔文（深圳）生物科技有限公司 一种脂肪组织中的血管基质成分的提取方法及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1592781A (zh) * 2001-09-10 2005-03-09 加利福尼亚大学董事会 脂肪衍生的干细胞和网格体
CN101490246A (zh) * 2006-05-17 2009-07-22 同源治疗公司 自吸脂后脂肪吸取物分离及纯化造血干细胞
CN102002478A (zh) * 2010-12-01 2011-04-06 四川大学 一种脂肪干细胞的分离培养方法
CN102186968A (zh) * 2008-10-17 2011-09-14 巴克斯特国际公司 从脂肪组织获得细胞群的方法
CN103443272A (zh) * 2010-12-27 2013-12-11 智能细胞生物科学有限公司 从脂肪组织获得的源自超声空化的基质或间充质血管提取物和源自其的细胞以及其用途
CN104357387A (zh) * 2014-12-08 2015-02-18 深圳市赛欧细胞生物科技有限公司 一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法
CN105254717A (zh) * 2015-08-18 2016-01-20 广州一代医药科技有限公司 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1592781A (zh) * 2001-09-10 2005-03-09 加利福尼亚大学董事会 脂肪衍生的干细胞和网格体
CN101490246A (zh) * 2006-05-17 2009-07-22 同源治疗公司 自吸脂后脂肪吸取物分离及纯化造血干细胞
CN102186968A (zh) * 2008-10-17 2011-09-14 巴克斯特国际公司 从脂肪组织获得细胞群的方法
CN102002478A (zh) * 2010-12-01 2011-04-06 四川大学 一种脂肪干细胞的分离培养方法
CN103443272A (zh) * 2010-12-27 2013-12-11 智能细胞生物科学有限公司 从脂肪组织获得的源自超声空化的基质或间充质血管提取物和源自其的细胞以及其用途
CN104357387A (zh) * 2014-12-08 2015-02-18 深圳市赛欧细胞生物科技有限公司 一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法
CN105254717A (zh) * 2015-08-18 2016-01-20 广州一代医药科技有限公司 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652367A (zh) * 2019-01-04 2019-04-19 吉林省拓华生物科技有限公司 一种制备临床级脂肪干细胞的方法
CN109652367B (zh) * 2019-01-04 2022-06-14 吉林省拓华生物科技有限公司 一种制备临床级脂肪干细胞的方法
CN110129260A (zh) * 2019-04-08 2019-08-16 奥尔文（深圳）生物科技有限公司 一种脂肪组织中的血管基质成分的提取方法及应用

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