CN102186968A - 从脂肪组织获得细胞群的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从少量脂肪组织有效获得大量新鲜分离的活细胞的方法，以及富集或选择在其中发现的靶细胞群的方法。在某些实施方案中，从脂肪组织获得细胞群的方法包括将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度为至少200U/ml溶液并且不超过约319U/ml溶液。在某些实施方案中，方法不含任何扩增所获细胞群的步骤。在某些情况下，方法还包括用于从脂肪组织获得靶细胞富集群的正向或反向选择步骤。本发明还提供了包含细胞、用于向患者给药的药物组合物的相关制备方法，以及在患者中治疗疾病或病症的方法。

Description

从脂肪组织获得细胞群的方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2008年10月17日提交的美国临时专利申请no.61/106353的优先权，所述临时专利申请以其全文引为参考。

发明背景

使用干细胞，通过将这些细胞给药到疾病位点并希望细胞在那里再生或修复组织以治疗疾病，是科学家和医生的目标。尽管间充质干细胞(也称为基质干细胞)表现出强大的增殖能力和产生结缔组织系(骨骼、软骨、肌腱、脂肪等)后代的能力，但收获适于临床使用的数量的这些细胞可能是困难的。

已经显示，人类脂肪组织含有具有强大增殖能力以及分化成多种细胞系能力的细胞群。这些细胞被称为脂肪组织来源的干细胞(ADSC)或脂肪基质干细胞(ASC)，通常与间充质干细胞(也称为骨髓基质细胞)相似，尽管不完全相同。Fraser等，Methods in Molec Biol 449：59-67(2008)。

尽管从脂肪组织获得细胞例如ADSC的方法在本技术领域中是已知的，但这些方法的效率仍有待优化，以便从少量脂肪组织获得最大量的活细胞。例如Fraser等，2008，同上，公开了从脂肪组织获得细胞，其中仅从组织中分离到2x 10⁴个细胞，而对于灌输到患者中用于治疗目的来说，典型需要约10⁷-10⁹个细胞(国际专利申请公开号WO 03/080801)。此外，许多这些方法出于细胞增殖和扩增的目的，包含从脂肪组织所获细胞的铺板或组织培养步骤。因为细胞表型随组织培养的时间而变，因此需要仅含少量或不含体外组织培养步骤的获得大量细胞的方法。

因此，在本技术领域中，对于从少量脂肪组织有效获得大量新鲜分离的活细胞的优化方法，存在着需求。对于从来自脂肪组织的细胞产物富集目标细胞例如CD34阳性细胞的方法，也有需求。

发明简述

本发明提供了从少量脂肪组织有效获得大量新鲜分离的活细胞的方法，以及富集或选择在其中发现的靶细胞群的方法。

在某些实施方案中，从脂肪组织获得细胞群的方法包括将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度为至少200U/ml溶液并且不超过319U/ml溶液。在某些实施方案中，方法不含任何扩增所获细胞群的步骤。在某些情况下，方法还包括用于从脂肪组织获得靶细胞富集群的正向或反向选择步骤。就此而言，本发明还提供从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法，所述方法包含从脂肪组织获得细胞群，以及将细胞群在包含第一抗体的第二种溶液中温育，所述第一抗体将细胞群分离成包含靶细胞的亚群和基本上不含靶细胞的亚群，由此获得靶细胞富集群。

本发明还提供按照本文描述的方法获得的细胞群(例如靶细胞富集群)。

本发明还提供了包含从脂肪组织获得的细胞群(例如靶细胞富集群)的药物组合物的相关制备方法、按照这些方法制备的药物组合物以及在治疗患者疾病或病症的方法中使用药物组合物的方法。

附图说明

图1显示了基于抗体的正向选择技术的示意图，其中靶细胞(或用“S”标记的所选细胞)是CD34阳性细胞，其是脂肪组织的基质血管级分(SVF)的一部分。第一抗体(抗CD34mAb)与CD34阳性细胞(用“S”标记)结合，第二抗体(SAM Ig抗体)接下来与第一抗体结合。第二抗体结合到顺磁性珠子上，并使用磁体从SVF组分中除去免疫复合物。为了释放CD34阳性细胞，向复合物加入释放肽(显示成三角形)并进行第一抗体与靶细胞上的CD34抗原的置换，以提供纯化的CD34阳性细胞群。

图2显示了如本文所述对脂肪组织进行消化后获得的细胞的多彩流式细胞分析图。显示了亮和暗的CD34ASC和MSC以及淋巴细胞、内皮细胞和造血祖细胞。碎片或死细胞也是一个门控群。

图3显示了图1所概述的选择前(左图)和选择后(右图)SVF的流式细胞分析图。显示了CD34亮/CD45-、CD34亮/CD45+、CD34暗/CD45-群。

图4显示了与图2相同的流式细胞分析数据，只是标出了群A-C。

图5显示了激光多普勒成像时间过程图。如本文中所述，数据表示成在只给药PBS、给药未选择细胞或CD34阳性选择细胞的小鼠中，缺血肢与不缺血肢中相比的灌注百分率。

发明详述

本发明提供了从脂肪组织获得细胞群的方法。方法包含将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度被优化以获得每ml脂肪组织最大数量细胞的释放而不牺牲细胞生活力。

脂肪组织

对于本发明来说，脂肪组织可以是任何体脂(或脂肪)，其是由脂肪细胞构成的松散结缔组织。在某些实施方案中，脂肪组织是骨髓脂肪组织、棕色脂肪组织、乳腺脂肪组织、机械脂肪组织或白色脂肪组织。脂肪组织可以从供体身体的任何部位获得。在某些实施方案中，脂肪组织从供体的大腿、臀部、腹部或手臂获得。在其他实施方案中，脂肪组织从供体的乳房、颈部、背部或小腿获得。在其他实施方案中，脂肪组织从心脏、肾脏、主动脉、生殖腺、眼球后或手掌脂肪垫获得。在某些情况下，脂肪组织是皮下脂肪。脂肪组织供体可以是任何宿主，包括但不限于本文中所描述的。在某些实施方案中，供体是哺乳动物。在特定实施方案中，供体是人类。

脂肪组织可以通过任何适合于获取脂肪组织的方法从供体获得。这样的方法在本技术领域中是已知的。在某些实施方案中，通过外科手术或吸脂从供体获得脂肪组织。因此，在某些实施方案中，脂肪组织是脂肪抽吸物。

对于本发明来说，与酶溶液温育的脂肪组织的量可以是任何量，例如0.01、0.1、或1g至5、10、50或100g脂肪组织。

酶溶液

对于本发明来说，本文中使用的术语“溶液”是指适合于使组织或细胞与酶接触的任何介质。溶液可以具有任何黏度或稠度，并且在某些情况下，溶液是水性溶液。在可选实施方案中，溶液在室温下是半固体介质。在某些特定情况下，溶液是本文中进一步描述的组织培养基。

溶液中包含的酶可以是任何已知用于消化组织例如结缔组织(例如在脂肪组织中发现的结缔组织)的酶。在某些情况下，酶是结缔组织消化酶。在某些实施方案中，酶从动物或非动物来源获得或衍生。在某些实施方案中，酶是蛋白水解酶、肽酶或蛋白酶。在某些特定实施方案中，酶是胶原酶、胰蛋白酶或中性蛋白酶，或其功能等价物、变体、衍生物、突变体或类似物。在某些实施方案中，酶是多种酶的混合物，例如包含胶原酶、胰蛋白酶或中性蛋白酶中的至少一种或两种的混合物。在某些实施方案中，酶是Liberase Blendzyme(Roche)。用于本文目的的适合的酶在本技术领域是已知的，并可以从多家公司商购，包括但不限于Sigma Aldrich(St.Louis，Missouri)、Worthington Biochemcial(Lakewood，New Jersey)和Roche(Indianapolis，IN)。

酶浓度

酶浓度应该高得足以实现脂肪组织的消化，以从组织释放最大量的细胞。因此，在某些实施方案中，方法包含将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度为至少约200U/ml溶液(例如至少约205U/ml溶液、至少约210U/ml溶液、至少约215U/ml溶液、至少约220U/ml溶液、至少约225U/ml溶液、至少约230U/ml溶液、至少约235U/ml溶液、至少约240U/ml溶液、至少约245U/ml溶液、至少约250U/ml溶液、至少约260U/ml溶液、至少约265U/ml溶液、至少约270U/ml溶液、至少约280U/ml溶液、至少约285U/ml溶液、至少约290U/ml溶液、至少约300U/ml溶液、至少约310U/ml溶液、至少约315U/ml溶液或更高)。

对于本发明来说，应该注意不将脂肪组织过度消化以使细胞不再存活。本技术领域的专业人员将会认识到，通过平衡消化反应中的酶量与消化反应时间(正如下文讨论的)，可以避免过度消化。因此，在某些实施方案中，将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度不超过约500U/ml溶液(例如不超过约475U/ml溶液、不超过约450U/ml溶液、不超过约425U/ml溶液、不超过约400U/ml溶液、不超过约375U/ml溶液、不超过约350U/ml溶液、不超过约325U/ml溶液、不超过约320U/ml溶液、不超过约319U/ml溶液、不超过约315U/ml溶液、不超过约310U/ml溶液、不超过约305U/ml溶液)。

在某些实施方案中，方法包含将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度在约190U/ml至319U/ml之间(例如约200U/ml至约300U/ml、约205U/ml至295U/ml、约210U/ml至290U/ml之间、约215U/ml至约285U/ml之间、约220U/ml至约280U/ml之间、约225U/ml至约275U/ml之间、约230U/ml至约270U/ml之间、约235U/ml至约265U/ml之间、约240U/ml至约260U/ml之间、约245U/ml至约255U/ml之间)。

在某些实施方案中，方法包含将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度为约245U/ml、约246U/ml、约247U/ml、约248U/ml、约249U/ml、约250U/ml、约251U/ml、约252U/ml、约253U/ml、约254U/ml或约255U/m1)。

在某些实施方案中，脂肪组织的量(例如体积)与酶量(例如酶溶液的体积)的比为约1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1、1∶4、4∶1、1∶5、5∶1。

消化时间

在某些实施方案中，脂肪组织与含有酶的溶液的温育进行约5分钟至5小时或以上的时间。在某些特定实施方案中，脂肪组织与酶溶液的温育进行约15分钟至约1.5小时之间、约25分钟至约1.25小时之间或约30分钟至约60分钟之间的时间。在某些情况下，将脂肪组织与酶溶液温育约45至55分钟之间的时间。就此而言，在某些实施方案中，将脂肪组织在酶溶液中温育约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54或约55分钟。

同样，本技术领域的专业人员将会认识到，通过平衡消化反应中的酶量(如上所讨论的)与消化反应时间，避免过度消化。

其他消化条件和步骤

在某些实施方案中，将脂肪组织在酶溶液中温育的温度是任何允许消化进行(即不使酶失活)的适合温度。在某些实施方案中，温度在约20℃至50℃之间(例如约25℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃)。

在某些实施方案中，脂肪组织与酶溶液的温育在容纳脂肪组织和酶溶液的容器存在振摇、振动、旋转或其他运动或机械搅拌的情况下进行。在其他实施方案中，温育维持在不存在任何上述条件的情况下。

在某些实施方案中，方法包含其他步骤，例如本技术领域中描述的任何组织收获、组织处理和组织清洗步骤。参见例如WO 03/080801和Fraser等，2008，同上。在某些实施方案中，方法包含使酶失活的失活步骤。在某些实施方案中，使用含有高浓度胎牛血清的溶液使酶失活。在某些实施方案中，方法包含分离被消化和未消化的脂肪组织级分。在某些实施方案中，方法包含离心和/或过滤和/或清洗和/或重悬浮细胞沉淀。

这些附加的考虑因素和其他步骤在本技术领域中已知，或其确定在普通专业人员的技术范围内。参见例如美国专利6,777,231；国际专利申请出版号WO 03/080801；Fraser等，2008，同上；Bunnell等，Methods 45：115-120(2008)；Gimble等，Cytotherapy 5：362：369(2003)；Locke等，ANZ Journal of Surgery 79：235-244(2009)；以及Boquest等，Methods in Molec Biol 325：35-46(2006)。

在某些实施方案中，本文描述的方法从脂肪组织获得大量活细胞，不必为了细胞增殖或扩增而对所获细胞进行培养。就此而言，在某些实施方案中，方法不包含任何扩增从脂肪组织获得的细胞群的步骤。在其他实施方案中，组织培养的时间有限并最小。在某些实施方案中，细胞被培养或铺板不超过8小时、不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时或不超过48小时。

从消化的脂肪组织获得细胞群

对本发明的方法进行了优化，以便在脂肪组织的酶消化后获得最大数量的活细胞。在某些实施方案中，每ml脂肪组织获得的活细胞数量为至少约10⁵、约2x 10⁵、约3x 10⁵、约4x 10⁵、约5x 10⁵、约6x10⁵、7x 10⁵，约8x 10⁵、约9x 10⁵、约10⁶、约10⁷或以上。

在某些实施方案中，从脂肪组织获得的细胞群是异源细胞群。在某些实施方案中，从脂肪组织获得的细胞群包含脂肪基质干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、前脂肪细胞、内皮细胞或其前体、成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞或其组合。在某些实施方案中，细胞群基本上不含或极少含脂肪细胞和血红细胞。在某些实施方案中，细胞群是脂肪组织的基质血管组分。脂肪来源的干细胞进一步描述在美国专利6,777,231中。人类CD34+干细胞描述在美国专利5,130,144、5,035,994、4,965,204中。在某些实施方案中，获得的细胞群包含黏附细胞和/或非黏附细胞。

从脂肪组织获得的细胞群可以通过细胞表面标志物表型进行表征。在某些实施方案中，群包含对例如本文所描述的任何细胞标志物的表达阳性的细胞。在某些实施方案中，群包含对CD34阳性的细胞。关于所获细胞的进一步说明描述在本文中。

从脂肪组织获得的细胞群的选择/富集

在本发明的某些实施方案中，方法还包含选择、分离、富集或纯化所需或靶细胞的亚群。就此而言，本发明还提供了从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法。纯化、细胞分拣和富集靶细胞的方法在本技术领域中是已知的，并包括例如荧光活化细胞分拣、离心和基于抗体的捕获技术。

在某些实施方案中，从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法包含按照本文公开的方法从脂肪组织获得细胞群，例如将脂肪组织与包含消化酶的溶液温育，并将细胞群与第一抗体温育，所述第一抗体将细胞群分成包含靶细胞的亚群和基本上不含靶细胞的亚群，由此获得靶细胞富集群。

当在本文中使用时，术语“基本上不含”意味着在某种程度上缺乏。应该认识到，“基本上不含”是相对性术语，不是必然被解释成绝对或完全不存在。因此，在某些情况下，基本上不含靶细胞的亚群包含靶细胞，但是仅有约15％以下的亚群是靶细胞。在某些情况下，基本上不含靶细胞的亚群中不超过约10％是靶细胞。在某些情况下，基本上不含靶细胞的亚群中不超过约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％是靶细胞。

反向选择

也可以将消化过的组织与针对与终产物关系不密切或无关的细胞的抗体进行温育。在某些实施方案中，当靶细胞是CD34阳性细胞时，可以将针对非靶细胞的抗体，与脂肪组织消化后或与用针对细胞特异性抗体的抗体包被的顺磁性珠子温育后所获得的细胞进行温育。通过上面描述的过程，这种不想要的(非靶)细胞然后被任选从消化物中分离并从其中除去。得到的消化物现在含有较低浓度或不含不想要的细胞，并因此含有较高浓度的所需细胞例如CD34+细胞。这种细胞移除的实例包括减少脂肪消化物中表达CD45、血型糖蛋白-a和/或CD31的细胞。

根据上述，在某些实施方案中，通过使用第一抗体富集、选择或纯化靶细胞亚群，所述第一抗体是特异性针对靶细胞不表达或以低水平表达的细胞标志物的抗体。在某些特定实施方案中，第一抗体是特异性针对选自下列的细胞标志物的抗体：CD45、血型糖蛋白-A和CD31。

正向选择

在某些实施方案中，通过使用第一抗体富集、选择或纯化靶细胞亚群，所述第一抗体是特异性针对靶细胞所表达的细胞标志物的抗体。在某些实施方案中，靶细胞所表达的细胞标志物是CD34。在某些实施方案中，靶细胞是CD34阳性细胞。在特定实施方案中，第一抗体是特异性结合CD34的抗体。CD34特异性抗体在本技术领域中是已知的，并可商购。参见例如美国专利4,965,204。在某些实施方案中，CD34特异性抗体时在Isolex 300i试剂盒(Baxter，Deerfield，IL)中提供的抗体。

在某些情况下，从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法包含反向和正向两种选择步骤。

在某些实施方案中，第一抗体以每10⁶个靶细胞约0.01μg至每10⁶个靶细胞约10μg、每10⁶个靶细胞约0.1μg至每10⁶个靶细胞约5μg或每10⁶个靶细胞约1μg至每10⁶个靶细胞约3μg的终浓度与细胞群共存。在某些实施方案中，第一抗体的终浓度为每10⁶个靶细胞约2.5μg。

珠子

在某些实施方案中，将细胞群分成亚群的第一抗体被“捕获”在固相支持物例如珠子、膜上。在某些实施方案中，固相支持物是珠子，并且将珠子与从脂肪组织获得的细胞群(例如从脂肪组织的消化所获得的细胞群)进行温育。在某些情况下，与珠子的温育在这些细胞与第一抗体温育之前或之后进行。在某些实施方案中，将珠子与第一抗体同时与从脂肪组织获得的细胞群进行温育。在细胞群与珠子和第一抗体两者温育后，形成包含珠子、第一抗体和靶细胞或非靶细胞的复合物。

在某些实施方案中，珠子包含与第一抗体结合的蛋白。在特定实施方案中，蛋白是与第一抗体，例如第一抗体的Fc区特异性结合的第二抗体。在某些实施方案中，蛋白是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L(例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L)。

在某些实施方案中，珠子与细胞群温育时珠子数与靶细胞数的比在约1∶1至5∶1之间。在某些实施方案中，比例是约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1或约5∶1。

在某些情况下，获得靶细胞富集群的方法包含通过从含有细胞、珠子和第一抗体的细胞群中除去包含珠子和第一抗体以及靶细胞或非靶细胞的复合物，将细胞群分成包含靶细胞的亚群和基本上不含不限于的亚群。除去珠子的方法在本技术领域中是已知的。在某些实施方案中，珠子是顺磁性珠子，并且珠子用磁体除去。在某些实施方案中，珠子通过离心分离。

在某些实施方案中，包含珠子和第一抗体的复合物还包含靶细胞或非靶细胞。在其中复合物包含非靶细胞的实施方案中，靶细胞包含在珠子被移除后的溶液中。在某些实施方案中，不采取其他步骤富集或纯化靶细胞。

释放肽

在其中复合物包含靶细胞的某些实施方案中，方法包含从复合物释放靶细胞的其他方法。为此，在某些情况下，方法包含将复合物与释放肽进行温育。当在本文中使用时，术语“释放肽”是包含通过肽键相连的至少两个氨基酸、从靶细胞上置换第一抗体的任何分子。

在某些实施方案中，释放肽包含表位，其是CD34的表位或第一抗体的表位，例如第一抗体的CDR。在某些情况下，释放肽是可溶性CD34(例如CD34的可溶性片段)，或PR34肽，其描述在美国专利5,968,753和6,017,719中。在某些实施方案中，释放肽是这些专利中描述的任何释放肽。在某些实施方案中，释放肽是作为Isolex 300i试剂盒(Baxter，Deerfield，IL)的一部分提供的释放肽。

在某些实施方案中，释放肽以约0.01mg/ml至10mg/ml之间、约0.1mg/ml至约5mg/ml之间或约1mg/ml至约2mg/ml之间的终浓度与复合物共存。在某些实施方案中，释放肽的终浓度为约2mg/ml。

在某些实施方案中，在释放肽与复合物温育时进行旋转、振摇或移动。在某些实施方案中，释放肽温育时不移动。

在特定实施方案中，将复合物捣碎以增加释放肽介导的从靶细胞上置换第一抗体的效率。在某些实施方案中，使用注射器、移液管或具有相对小的可以使细胞通过并便于将复合物形成后形成的细胞团打破的孔的类似工具来实现捣碎。在某些情况下，方法包含捣碎至少约30秒、至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟、至少约90分钟、至少约120分钟、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时。在某些情况下，方法包含捣碎不超过约10小时(例如不超过约5小时)。

在某些实施方案中，捣碎在释放肽存在下进行。在其他实施方案中，捣碎在不存在释放肽的情况下进行，例如捣碎在释放肽加入之前进行。在某些实施方案中，捣碎在加入释放肽之前进行，并且捣碎和加入释放肽彼此在约30秒内、约60秒内、约1.5分钟内、约2分钟内、约5分钟内、约10分钟内、约15分钟内、约30分钟内、约45分钟内、约60分钟内进行。

实例性实施方案

在特定实施方案中，在用胶原酶或类似的酶消化脂肪组织后，然后将消化过的组织与抗CD34阳性抗体或针对包含在CD34+细胞上或其中的其他表位/酶/蛋白选择的抗体温育。然后将抗体/消化物混合物与用针对CD34阳性抗体的抗体包被的顺磁性珠子温育。珠子-抗体与CD34+细胞-抗体复合物复合，形成细胞-抗体-珠子复合物。然后使用磁体将该与珠子结合的复合物与脂肪组织消化物的其余部分分开。然后从结合的材料上洗掉非磁性结合的材料，然后将得到的结合的材料与竞争抗CD34阳性抗体的肽进行温育。这种肽对抗CD34阳性抗体具有竞争性或更高亲和性，因此使细胞从珠子、抗体和磁体上释放。通过轻柔的机械搅拌(捣碎)打散细胞复合物的团集，以允许肽除去抗体和珠子从而释放细胞，该过程得以改进。然后可以通过使用磁体除去肽-抗体-珠子复合物。

抗体选择技术(Isolex 300i，Baxter Healthcare Corp.，Deerfield，IL)被用于从患者的血液或骨髓分离、纯化和收获人类CD34+干细胞(美国专利5,536,475、6,251,295、5,968,753、6,017,719)。在某些情况下，富集步骤使用Isolex系统例如Isolex 300i系统或其修改系统(Baxter，Deerfield，IL)进行。

在某些实施方案中可以考虑其他因素和其他方法。本发明的情况包括本文所述步骤的组合。尽管某些实施方案涵盖作为CD34阳性细胞的靶细胞，但类似的方法可用于选择其他细胞，例如CD271、CD117、CD133或CD31阳性细胞。这种类似方法包括使用抗体，例如抗CD271、抗CD117、抗CD133和抗CD31抗体。本发明考虑到了单独使用任何这些选择方法，或将其与一种或多种其他方法组合使用，以便最终得到的改进的脂肪组织消化物富集有这些细胞中的一种或其混合物，包括但不限于含有高浓度的所有上面引用细胞的改进的组织。

在某些实施方案中，本文描述的方法从脂肪组织获得靶细胞群，而不必出于细胞增殖或扩增的目的对细胞进行培养。就此而言，在某些实施方案中，方法不含任何扩增所获靶细胞群的步骤。在其他实施方案中，组织培养的时间有限并最小。在某些实施方案中，靶细胞培养或铺板不超过8小时、不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时或不超过48小时。

在某些情况下，在从脂肪组织获得的细胞群中选择或纯化后，对靶细胞进行进一步修饰。在一种可选方案中，对细胞进行体外培养以扩增靶细胞群、将基因投送到靶细胞中、使靶细胞分化或将化合物例如治疗药剂或诊断药剂与靶细胞偶联。执行这些其他步骤的方法在本技术领域中是公知的。参见例如Sambrook等《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Ogawa等，Blood 81：2844-2853(1993)；美国专利7,144,731；Li等，FASEB J 15：586(2001)；Norol等，Experimental Hematology 35(4)：653-661(2007)；Verhoeyen和Cosset《基因转移：DNA和RNA的递送和表达》(Gene Transfer：Delivery and Expression of DNA and RNA)，Friedmann和Rossi主编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2007。

细胞群

本发明的方法提供了来自于脂肪组织的细胞群。因此，本发明还提供了来自于脂肪组织的细胞群。在某些实施方案中，本发明的细胞群是(i)从脂肪组织获得或来源的原初细胞群，其出于细胞扩增的目的进行组织培养的时间很少至没有进行组织培养，(ii)包含黏附和非黏附细胞，(iii)包含CD34阳性细胞，(iv)或(i)到(iv)的组合。在其中本发明的细胞群包含CD34阳性细胞的某些实施方案中，细胞群的至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)是CD34阳性细胞。在其中细胞群是从脂肪组织获得或来源的原初细胞群并且出于细胞扩增的目的进行组织培养的时间很少至没有进行组织培养的某些实施方案中，细胞在组织培养中的时间有限并最小。在某些实施方案中，细胞被培养或铺板不超过8小时、不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时或不超过48小时。在某些实施方案中，细胞从未进行培养或铺板。

在某些实施方案中，细胞群是按照本文描述的任何方法消化脂肪组织后获得的进行或未进行选择步骤的群。

在某些实施方案中，本发明的细胞群是基本上分离的。当在本文中使用时，术语“分离的”是指已经从其天然环境中取出。因为细胞群已从脂肪组织获得并取出，因此在大多数实施方案中细胞被当做“分离的”细胞。

在某些实施方案中，本发明的细胞群是基本上纯化或富集或选择的。当在本文中使用时，术语“纯化的”、“富集的”和“选择的”意味着作为与原始组合物的其他组分分离的结果而纯度增加。应该认识到，“纯净”或“富集”或“选择”是相对性术语，不必然被解释为绝对纯净或绝对富集或绝对选择。在某些情况下，纯度为至少约50％，大于60％、70％、80％或90％，约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或约为100％。在某些实施方案中，富集或选择是与原始组合物相比1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、1000倍的富集或选择。在某些实施方案中，富集群中靶细胞的百分率是选择或纯化前细胞群中靶细胞的百分率的约1.5至约5倍。在某些实施方案中，富集群中靶细胞的百分率是基于抗体的选择之前但用酶溶液消化后细胞群中靶细胞的百分率的约1.5至约5倍。

在某些实施方案中，本发明的细胞群基本上从脂肪细胞、白细胞和/或红细胞中纯化出来，即从脂肪组织获得的细胞群基本上不含脂肪细胞、白细胞和/或红细胞。在某些情况下，本发明的细胞群基本上从碎片或死细胞中纯化出来。

在某些实施方案中，细胞群是已经历过正向选择步骤的细胞群。在某些实施方案中，细胞群是已经历过反向选择步骤的细胞群。在某些实施方案中，细胞群是已经历过正向和反向选择步骤的细胞群。在某些情况下，本发明的细胞群是靶细胞富集群。在某些实施方案中，本发明的细胞群是按照本文描述的任何方法从脂肪组织获得的靶细胞富集群。

在某些实施方案中，细胞群(例如靶细胞富集群)是基本上均质的细胞群。在某些情况下，细胞群(例如靶细胞富集群)是靶细胞的克隆群，其中群的每个细胞与群中的其他细胞在遗传上没有区别。

在某些实施方案中，细胞群(例如靶细胞富集群)是非均质的细胞群。在某些实施方案中，非均质的细胞群只包含靶细胞，但群不是克隆群，例如彼此不是遗传上一致的。在某些实施方案中，细胞群的显著部分表达一种或多种共同的细胞标志物例如CD34，但是在群的细胞之间其他细胞标志物的表达水平是不同的。在某些情况下，靶细胞是CD34+细胞，并且CD34+细胞是脂肪细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、间充质干细胞。

在某些实施方案中，非均质的群包含其他细胞类型、靶细胞之外的其他细胞。在某些情况下，非均质的细胞群除了靶细胞之外，还包含白细胞(髓样谱系或淋巴样谱系的白细胞)、红细胞、内皮细胞、循环内皮前体细胞、上皮细胞、肾细胞、肺细胞、骨细胞、髓细胞、神经元、平滑肌细胞。

在某些特定情况下，群包含多种细胞类型，并且群的显著部分包含共同的表型、生物功能或成熟或分化状态。在特定情况下，群中至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞是干细胞(例如脂肪基质干细胞、间充质干细胞、造血干细胞)。在特定情况下，群中至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞是内皮细胞。

在某些实施方案中，细胞群包含黏附细胞或非黏附细胞。在某些实施方案中，从脂肪组织获得的细胞群包含黏附和非黏附细胞两者。

分离、纯化、选择、富集具有特定表型的细胞的适合方法在本技术领域中是已知的，并包括例如使用光学流式分拣器(例如荧光活化细胞分拣(FACS))的方法和使用非光学流式分拣器(例如磁活化细胞分拣)的方法和本文描述的方法。

细胞标志物

在某些实施方案中，从脂肪组织获得的细胞群(包括靶细胞富集群)是非均质的细胞群，其中群中至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞具有特定表型(例如对于细胞标志物的表达来说阳性和/或对于细胞标志物的表达来说阴性)。在本发明的某些实施方案中，从脂肪组织获得的群中至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞是CD34阳性细胞。在本发明的某些实施方案中，群中至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞是CD45阴性细胞。在本发明的某些实施方案中，至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞对于表达任何下列细胞标志物来说是阳性的：CD140b、CD90、CD31、CD105、CD73、CD144、CD105、CD106、CD44、CD146。在本发明的某些实施方案中，至少25％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞对于表达任何下述细胞标志物来说是阴性的：CD140b、CD90、CD31、CD105、CD73、CD144、CD105、CD106、CD44、CD146。

制备药物组合物的方法

从脂肪组织获得的细胞群、包括靶细胞富集群，据信具有治疗价值。就此而言，本发明还提供了用于向患者给药的包含细胞的药物组合物的制备方法，所述方法包含将按照本文描述的方法获得的细胞群(例如靶细胞富集群)与可药用载体进行配制。

在某些情况下，脂肪组织的供体与患者相同。就此而言，细胞(例如靶细胞)被认为对患者是“自体的”。在某些实施方案中，细胞的供体(例如靶细胞)与患者不同，但是供体与患者是相同物种。就此而言，细胞(例如靶细胞)被认为是“同种异体的”。

在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)从脂肪组织新鲜获得。在特定情况下，细胞仅进行有限程度的培养或铺板，例如不超过4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时。在其他情况下，细胞在与可药用载体配制之前从未进行培养或铺板。

药物组合物

因此，本发明提供了药物组合物，其包含与可用于载体配制在一起的通过本文描述的任何方法获得的细胞群(例如靶细胞富集群)。就此而言，本发明提供了包含细胞(例如靶细胞)和可药用载体的药物组合物。载体是任何常规使用的载体，并仅受化学-物理考虑因素例如溶解性和与活性化合物缺乏反应性以及给药途径的限制。本文中描述的可药用载体例如介质、佐剂、赋形剂和稀释剂，对于本技术领域的专业人员来说是公知的并易于公开获得。在一种情况下，可药用载体是对细胞例如靶细胞化学惰性的载体，以及在使用条件下没有不利副作用或毒性的载体。载体的选择部分由药物组合物的细胞的具体类型以及用于给药药物组合物的具体途径所决定。因此，本发明的药物组合物存在各种适合的剂型。

给药途径

在某些实施方案中，包含细胞(例如靶细胞)的药物组合物被配制成用于肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药、鞘内给药或腹膜内给药。在其他实施方案中，药物组合物通过鼻、喷雾、口、气溶胶、直肠或阴道给药来进行给药。

给药细胞(例如靶细胞)的方法在本技术领域中是已知的。参见例如下列任何美国专利：5423778、5550050、5662895、5800828、5800829、5811407、5833979、5834001、5834029、5853717、5855619、5906827、6008035、6012450、6049026、6083523、6206914、6303136、6306424、6322804、6352555、6368612、6479283、6514522、6534052、6541024、6551338、6551618、6569147、6579313、6599274、6607501、6630457、6648849、6659950、6692738、6699471、6736799、6752834、6758828、6787357、6790455、6805860、6852534、6863900、6875441、6881226、6884427、6884428、6886568、6918869、6933281、6933286、6949590、6960351、7011828、7031775、7033345、7033603、7049348、7070582、7074239、7097832、7097833、7135172、7145055、7157080、7166280、7176256、7244242、7452532、7470425和7494644。

肠胃外

在某些实施方案中，本文描述的药物组合物被配制成用于肠胃外给药。出于本发明的目的，肠胃外给药包括但不限于静脉内、动脉内、肌肉内、脑内、脑室内、心内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内、和海绵体内注射或灌注。

适合用于肠胃外给药的剂型包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受体的血液等渗的溶质，以及水性和非水性的无菌悬液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在各种情况下，药物组合物通过药物载体中的生理可接受稀释剂进行给药，例如无菌液体或液体混合物，所述液体包括水、盐水、葡萄糖水和相关糖溶液、二醇例如丙二醇或聚乙二醇、甘油、醚类、聚乙二醇400、油类、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，并添加或不添加可药用表面活性剂例如皂或去污剂，悬浮剂例如果胶、丙烯酸聚合物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其他药物佐剂。

可任选使用在肠胃外剂型中的油类包括石油、动物、植物或合成的油类。油类的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、石油和矿物油。适合用于肠胃外剂型中的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。

在某些实施方案中，肠胃外剂型包含防腐剂或缓冲剂。为了最小化或消除在注射位点处的刺激，这样的组合物任选包含一种或多种具有约12至约17的亲水-亲脂平衡(HLB)的非离子型表面活性剂。这种剂型中表面活性剂的量典型地在以重量计约5％至约15％的范围内。适合的表面活性剂包括聚乙二醇失水山梨糖醇脂肪酸酯例如失水山梨糖醇单油酸酯，以及通过氧化丙烯与丙二醇的缩合形成的氧化乙烯与疏水性碱的高分子量加成物。在各种实施方案中，肠胃外剂型以单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小管的形式存在，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在临使用前加入无菌液体赋形剂例如注射用水。在某些情况下，即用注射溶液和悬液从以前所描述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。

注射剂型适合于本发明。用于可注射组合物的有效药物载体的要求对于本技术领域的专业人员来说是公知的(参见例如《制药学与药学实践》(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers主编，238-250页(1982)，以及《ASHP注射药物手册》(ASHP Handbook on Injectable Drugs)，Toissel，第四版，622-630页(1986))。

细胞递送基质

在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)通过细胞递送基质给药。在某些实施方案中，细胞递送基质包含含有胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGEL、聚乙二醇、葡聚糖包括可化学交联或可光交联的葡聚糖等的任一种或多种聚合物和水凝胶。在某些实施方案中，细胞递送基质包含下列一种或多种：胶原蛋白、包括收缩或未收缩胶原蛋白凝胶，水凝胶，其包含例如但不限于纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、明胶、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖包括适合于化学交联、光交联或两者的葡聚糖、白蛋白、聚丙烯酰胺、聚羟基乙酸、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚(正乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、亲水性聚氨基甲酸酯、丙烯酸衍生物、普卢诺尼克例如聚氧丙烯和聚氧乙烯共聚物、35/65聚ε-己内酯(PCL)/聚羟基乙酸(PGA)、Panacryl生物可吸附结构、Vicryl

polyglactin 910和自组装肽，以及不可吸收材料例如含氟聚合物(例如Teflon

含氟聚合物)、塑料和金属。

在某些情况下，基质包含不可降解材料，例如但不限于泡沫聚四氟乙烯(ePTFE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅酮等，或选择性可降解材料，例如聚(乳酸-乙醇酸共交酯；PLGA)、PLA或PGA。(参见例如Middleton等，Biomaterials 21：2335 2346，2000；Middleton等，Medical Plastics and Biomaterials，March/April 1998，30-37；《生物可降解聚合物手册》(Handbook of Biodegradable Polymers)，Domb、Kost和Domb主编，1997，Harwood Academic Publishers，Australia；Rogalla，Minim.Invasive Surg.Nurs.11：6769，1997；Klein，Facial Plast.Surg.Clin.North Amer.9：205 18，2001；Klein等，J.Dermatol.Surg.Oncol.1 1：337 39，1985；Frey等，J.Urol.154：81215，1995；Peters等，J.Biomed.Mater.Res.43：422 27，1998；以及Kuijpers等，J.Biomed.Mater.Res.51：13645，2000)。

在某些实施方案中，基质包括生物相容性支架、格栅、自组装结构等，无论是否可生物吸收、是液体、凝胶还是固体。这样的基质在治疗性细胞疗法、外科手术修复、组织工程和伤口愈合技术领域中是已知的。在某些情况下，将基质用细胞(例如靶细胞)预处理。在其他实施方案中，基质填充有与基质或其空间紧密缔合的细胞(例如靶细胞)。细胞(例如靶细胞)可以黏附于基质，或可以捕集或包含在基质空间中。在某些情况下，在基质-细胞(例如靶细胞)复合物中与基质紧密缔合的细胞正在生长，并且当用于治疗时，所述复合物刺激并支持患者自身肾脏细胞的生长、修复和/或再生，并同样刺激或支持适合的血管形成。基质-细胞组合物可以本技术领域已知的任何方式导入到患者体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、与其他组织一起移植等。在某些实施方案中，基质在体内或甚至更优选在原位形成，例如可原位聚合的凝胶可用于本发明。这种凝胶的实例在本技术领域等中是已知的。

在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)被接种在三维构架或基质例如支架、泡沫或水凝胶上，并经此给药。在某些情况下，构架被构造成各种形状，例如基本上平面、基本上圆柱状或管状或可以是完全自由的形式，正如所考虑的矫正结构可能要求或需要的。在某些情况下，当需要时，两个或多个基本上平的构架被放置在另一个顶上并固定在一起，以产生多层构架。

可用于本发明的情况的基质例如支架，包括垫子(纺织的，编织的，以及更优选为无纺的)、多孔或半多孔泡沫、自组装肽等。无纺垫子可以例如使用包含天然或合成聚合物的纤维来形成。在某些实施方案中，在商品名VICRYL

(Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)下销售的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(PGA/PLA)，被用于形成垫子。如在美国专利No.6,355,699中讨论的通过例如冷冻干燥或冻干方法形成的例如由聚ε-己内酯/聚羟基乙酸(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫，也可以用作支架。凝胶也形成本文中使用的适合基质。实例包括可原位聚合凝胶和例如由自组装肽构成的水凝胶。在某些情况下，这些材料被用作组织生长的支持物。原位成型的可降解网络也适合用于本发明(参见例如Anseth，K.S.等，2002，J.Controlled Release 78：199-209；Wang，D.等，2003，Biomaterials 24：3969-3980；He等的美国专利公开2002/0022676)。在某些情况下，这些材料被配制成适于注射的流体，然后可以通过各种手段(例如温度、pH变化，暴露于光)进行诱导，以原位或在体内形成可降解水凝胶。

在某些实施方案中，构架是毡，其包含由生物可吸收材料例如PGA、PLA、PCL共聚物或混合物或透明质酸制成的多纤维纱线。在某些情况下，使用由卷曲、切割、梳理和缝纫组成的标准织物加工技术将纱线制成毡。在某些情况下，将细胞(例如靶细胞)接种在泡沫支架上，所述支架可以是复合材料结构。此外，在某些情况下，三维构架被模制成有用的形状，例如待修复、替换或扩张的肾脏中或周围的特定结构。

在某些情况下，在接种细胞(例如靶细胞)之前对构架进行处理以增强细胞附着。例如，在接种细胞(例如靶细胞)之前，将尼龙基质用0.1摩尔乙酸处理，并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中温育以包被尼龙。在某些情况下，使用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。

在其他实施方案中，对三维构架的外表面进行改性以增强细胞的附着或生长和组织分化，例如通过构架的等离子体涂层，或加入一种或多种蛋白(例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸酯、软骨素-6-硫酸酯、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、细胞基质和/或其他材料，例如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。

在某些实施方案中，支架包含使其不形成血栓的材料。在某些实施方案中，这些材料促进并维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料的实例包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白、合成材料例如ePTFE和分段聚氨基甲酸酯脲硅酮例如PURSPAN

(The Polymer Technology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。这些材料可以被进一步处理以使支架不形成血栓。这样的处理包括抗血栓药剂例如肝素，以及改变材料的表面电荷的处理例如等离子体涂层。

在某些实施方案中，包含细胞(例如靶细胞)的药物组合物包含细胞递送基质的任何组分，包括任何上面描述的组分。

在某些实施方案中，药物组合物包含干细胞。向患有缺血性损伤的动物给药干细胞，描述在US 5,980,887中。

在本发明的情况下，靶细胞是源自脂肪的CD34+细胞。然后可以将不含所有或不含基本上所有处理反应物的强化的CD34+细胞混合物，置于适合于向患者治疗性注射的介质中。这样的介质对于本技术领域的专业人员来说是公知的，并可以包括但不限于灌洗溶液、细胞培养溶液等。在某些情况下，通过几种手段中的一种向患者递送CD34+细胞。在某些实施方案中，CD34+细胞被递送到肌肉内、腹膜内、颅内、血管内、静脉内、组织组分例如折断或破裂的骨骼或软骨之间。

靶的可能递送选项包括但不限于：直接注射(针和注射器)；注射导管(较深部组织)；表面喷洒；植入与生物支架缔合的预制纤维蛋白(皮下或组织床内较深处)。在本发明的情况下，用于递送的靶身体位点可以是心脏、四肢、眼、脑、肾、神经、肝、肾、心、肺、眼、胃肠道器官、皮肤和脑。

剂量

出于本文的目的，给药的药物组合物的量或剂量足以在合理的时间框架内在对象或动物中实现例如治疗或预防性响应。例如，药物组合物的剂量足以在从给药时间起约12小时、约18小时、约1至4天或以上、例如5天、6天、1周、10天、2周、16至20天或更长时间内，治疗或预防疾病或病症。在某些实施方案中，时间段甚至更长。剂量由特定药物组合物的效能和动物(例如人类)的状态以及待治疗动物(例如人类)的体重所决定。

许多用于确定给药剂量的测定方法在本技术领域中是已知的。在某些实施方案中，使用测定方法来确定向哺乳动物给药的起始剂量，所述测定方法包含在一组各给药不同剂量细胞(例如靶细胞)的哺乳动物中，在向哺乳动物给药给定剂量的这些细胞(例如靶细胞)后比较细胞(例如靶细胞)定位于受伤位点的程度。在给药一定剂量后细胞(例如靶细胞)定位于受伤位点的程度，可以通过本技术领域中已知的方法来测定。

此外，使用测定方法来确定向哺乳动物给药的起始剂量，所述测定方法包含在一组各给药不同剂量细胞(例如靶细胞)的哺乳动物中，在向哺乳动物给药给定剂量的这些细胞(例如靶细胞)后比较细胞(靶细胞)引起受伤后肢重灌注的程度。在给药一定剂量后细胞(例如靶细胞)引起受伤后肢重灌注的程度，可以通过本技术领域中已知的方法来测定，并在本文中描述。

药物组合物的剂量也将由可能伴随着特定药物组合物的给药的任何不利副作用的存在、性质和程度来决定。典型情况下，主治医师将考虑各种因素例如年龄、体重、总体健康、饮食、性别、待给药的药物组合物的治疗药剂(例如细胞(例如靶细胞))、给药途径和待治疗病症的严重性，来决定用于治疗每个个体患者的药物组合物的剂量。例如并且不打算限制本发明，药物组合物的剂量可以是至少约0.5x 10⁶(例如至少约1x 10⁶、至少约1.5x 10⁶、至少约2x 10⁶、至少约2.5x 10⁶、至少约3.0x 10⁶、至少约5.0x 10⁶、至少约10⁷、至少约10⁸)个细胞(例如靶细胞)被给药于患者。

给药的时间安排

在本发明的某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)的给药是延迟的；即细胞(例如靶细胞)不在受伤后立即给药(例如不在约30分钟以前、不在受伤后约1小时以前、约2小时以前、约3小时以前、约4小时以前、约5小时以前、约6小时以前、约7小时以前、约8小时以前、约9小时以前、约10小时以前、约11小时以前或约12小时以前)。

在本发明的某些情况下，细胞(例如靶细胞)在受伤的修复阶段开始时给药于患者。在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)在受伤后至少约12小时(例如至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时、至少约48小时、至少约50小时、至少约52小时、至少约54小时、至少约56小时、至少约58小时、至少约60小时、至少约62小时、至少约64小时、至少约66小时、至少约68小时、至少约70小时、至少约72小时)给药。

在其他实施方案中，细胞(例如靶细胞)在受伤后的上述时间点和约14天以前(例如约13天以前、约12天以前、约11天以前、约10天以前、约9天以前、约8天以前、约7天以前、约6天以前、约5天以前、约4天以前、约3天以前)给药于患者。在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)在受伤后约24小时时，或有时在其之后但在受伤后约14天以前给药于患者。

在某些情况下，细胞(例如靶细胞)在受伤后X时间之后并且在受伤后Y时间之前给药，其中X选自约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约40小时、约48小时、约52小时、约58小时、约64小时、约72小时、约3.5天、约4天、约5天、约6天、约1周、约8天、约9天、约10天，其中Y选自约16天、约15天、约14天、约13天、约12天、约11天、约10天、约9天、约8天、约1周，并且其中X小于Y。在本发明的某些情况下，细胞(例如靶细胞)在受伤后约20、约21、约22、约23、约24小时给药。

在本发明的某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)给药于患者一次以上。细胞(例如靶细胞)可以每日一次、每日两次、每日三、四次、每周一次、每2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13或14天一次或每月一次给药。在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)在受伤后约24小时后(例如在24小时时)给药，并在受伤后约48小时后(例如在48小时时)再次给药。

受控释放剂型

在某些情况下，药物组合物被改性成储库形式，以便使药物组合物释放到它所给药的身体中的方式，在时间和身体中的位置方面受到控制(参见例如美国专利No.4,450,150)。在各种情况下，储库形式是包含细胞(例如靶细胞)和多孔或无孔材料例如聚合物的可植入组合物，其中细胞(例如靶细胞)被材料包胶或扩散在整个材料中和/或降解无孔材料。然后将储库植入到身体的所需位置中，并且细胞(例如靶细胞)以预定速率从植入物释放。

因此，在某些情况下，药物组合物被改性成具有任何类型的体内释放情况。在本发明的某些情况下，药物组合物是立即释放、受控释放、持续释放、延长释放、延迟释放或双相释放剂型。

偶联物

在本发明的某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)附着或连接到第二种部分例如治疗药剂或诊断药剂上。这些实施方案的细胞(例如靶细胞)用作定向剂，因为细胞(例如靶细胞)能够特异性定位受伤的肾脏组织。因此，在一种情况下，本发明提供了包含连接到治疗药剂或诊断药剂上的细胞(例如靶细胞)的组合物。适合用于本文目的的治疗药剂和诊断药剂在本技术领域中是已知的，并且包括但不限于任何本文提到的药剂。

组合

在某些实施方案中，本文描述的药物组合物、包括偶联物自身给药。在其他实施方案中，药物组合物、包括偶联物与其他治疗或诊断药剂组合给药。在某些实施方案中，药物组合物与另一种已知治疗肾病或肾脏病症的治疗药剂一起给药，所述治疗药剂包括例如细胞因子或生长因子、抗炎性剂、TLR2抑制剂、ATF3基因或基因产物、和盐皮质激素受体阻断剂(例如螺甾内酯)、溶血磷脂酸、2-甲基氨基色满(例如U83836E)、21-氨基甾类(例如lazoroid(U74389F))、三甲氧苄嗪、血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张肽受体阻断剂(ARB)和苏拉明。

在某些实施方案中，细胞(例如靶细胞)与其他附加治疗药剂一起给药，包括但不限于抗血栓形成剂、抗凋亡剂、抗炎性剂、免疫抑制剂(例如环孢素、雷帕霉素)、抗氧化剂，以及在本技术领域中常用于治疗肾脏损伤或疾病的其他药剂例如伊罗地塞和雷公藤甲素、HMG-CoA还原酶抑制剂(例如辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀和阿伐他汀)、细胞裂解物、可溶性细胞级份、膜富集细胞级份、细胞培养基(例如条件培养基)或细胞外基质营养因子(例如肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、转化生长因子β(TGF-β)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

在某些实施方案中，将靶细胞亚群与其他干细胞组合，所述干细胞选自全能干细胞、多能干细胞、造血干细胞和任何其他干细胞。在某些实施方案中，将靶细胞与非造血干细胞例如但不限于间充质细胞组合。在某些实施方案中，将靶细胞与支架例如但不限于纤维蛋白、胶原蛋白或聚乙二醇(PEG)组合。

在某些实施方案中，将所选细胞与各种生长因子或其他生物活性剂协同使用。它们可以使用基因治疗进行修改，以用作上调物或下调物。

应用

据信，本文描述的药物组合物可用于许多疾病和病症的治疗性治疗。因此，方法还提供了治疗疾病或病症的方法，所述方法包含向患者给药任何本文描述的药物组合物，其量能够有效治疗疾病或病症。当在本文中使用时，术语“治疗”以及从其衍生的词，不必定意味着目标病症的100％或完全改善。相反，本技术领域的普通专业人员认为有益的疗效具有不同程度。就此而言，本文描述的方法为肾脏损伤提供了任何量或任何水平的治疗益处，因此“治疗”了损伤。

在某些情况下，疾病或病症是慢性心肌缺血、重症下肢缺血、急性心肌梗塞、心血管疾病、糖尿病、自体免疫疾病、中风、脑和/或脊髓损伤、烧伤、骨缺损、肾缺血和黄斑变性。在某些实施方案中，药物组合物用于治疗由缺血、血流减少、撕裂伤、极端温度、外伤或代谢或遗传疾病引起的缺血。

在其中药物组合物包含脂肪来源的干细胞的某些情况下，方法包含提供疗效，例如但不限于：促血管生成效应以对抗缺血，产生细胞、组织和/或器官再生，伤口愈合，分化，血液供应的重建，减少凋亡，旁分泌信号传导和免疫调节。在其中使用针对CD34和CD271的抗体的正向选择步骤来选择细胞的某些情况下，方法治疗炎症。在其中药物组合物包含CD34+细胞的情况下，方法提供抗凋亡效果。

已经显示，脂肪组织中的细胞具有分化潜能，因此能够用于修复和再生多种组织并用于多种损伤类型。这些细胞在美容外科领域也是有帮助的。由于吸脂术的操作容易性和相对非侵入的性质，这些细胞可以对它们修复组织的能力进行选择，或与伤口愈合剂联合使用以加速恢复。

肾脏损伤

在本发明的各种情况下，所提供的方法打算用于在患者中治疗肾脏损伤，所述肾脏损伤是由下列任一种或多种引起的肾脏损伤：缺血、暴露于毒素、使用血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂、输血反应、肌肉损伤或创伤、外科手术、休克、低血压、或ARF或慢性肾病的任何病因，正如本文进一步描述的。

目标肾损伤包括在肾脏中发现的任何组织的损伤，包括但不限于髓质、皮质、肾锥体、叶间动脉、肾动脉、肾静脉、肾门、肾盂、输尿管、肾小盏、肾被膜、内部肾被膜、上部肾被膜、叶间静脉、肾小体、肾大盏、肾乳头、肾小球、肾小球囊和肾柱的组织，所述组织受到足够损伤导致功能的部分或完全丧失。受损的肾脏组织包含任一种或多种在肾脏中出现的不同细胞类型，包括但不限于肾小球壁细胞、肾小球足状突细胞、肾小球内血管系膜细胞、肾小球的内皮细胞、肾近球小管刷状缘细胞、髓袢细段细胞、升支粗段细胞、肾远端小管细胞、肾集合管细胞和间质组织肾细胞。在本发明的某些实施方案中，肾脏损伤包含肾小管周围微血管的损伤。在某些情况下，肾脏损伤包含肾小管周围毛细血管的损伤。在某些实施方案中，肾脏损伤包含肾小管上皮细胞的损伤。

肾病和肾脏病症的预防

尽管肾脏具有巨大的自身修复或自身再生能力，但肾脏损伤经常导致肾病或肾脏病症易感性的增加。理论上说，本文提供的在患者中治疗肾脏损伤的方法允许肾脏成功修复和再生，使得患者对肾病或肾脏病症的易感性不增加。因此，本发明还提供了在包含肾脏损伤的患者中预防肾病或肾脏病症的方法。方法包含向患者给药细胞(例如靶细胞)，其量能够有效阻止肾病或肾脏病症。在某些实施方案中，量能够有效治疗肾脏损伤，例如能够有效恢复肾功能、再生肾小管周围微血管的量。

当在本文中使用时，术语“预防”或从其派生的词不必定表示100％或完全预防。相反，本技术领域的普通专业人员认为具有潜在益处的预防具有不同程度。就此而言，本文描述的预防方法为肾病或肾脏病症提供了任何量或任何水平的预防。在各种情况下，预防方法是延迟、减缓、减轻或减弱肾病或肾脏病症或其症状或状态的发作、发展、出现或进展的方法。

在某些实施方案中，被预防的肾病或肾脏病症是急性肾衰竭、慢性肾病、肾间质纤维化、糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾盂积水、间质性肾炎、肾结石(肾石病)、肾脏肿瘤(例如肾胚胎性瘤、肾细胞癌)、狼疮肾炎、肾微小病变疾病、肾病综合征、肾盂肾炎、肾衰竭(例如急性肾衰竭和慢性肾病之外)。

急性肾衰竭

本文中使用的术语“急性肾衰竭”与“急性肾脏损伤”或“ARF”同义，是指由于肾脏的损伤造成的肾功能快速丧失。ARF是一种复杂的综合征，其特征为正常由肾脏排泄的含氮(例如血清肌酸和/或尿液排出物)和不含氮废物产物的水平突然变化。ARF的症状和诊断在本技术领域中是已知的。参见例如“急性肾脏损伤”(Acute Kidney Injury)，《对肾病学的贡献》(Contributions to Nephrology)，Vol.156，Ronco等主编，Karger Publishers，Basel，Switzerland，2007，和Bellomo等，Crit Care 8(4)：R204-R212，2004。

在各种情况下，取决于病因，ARF是肾前性ARF、肾实质性ARF或肾后性ARF。就此而言，肾前性ARF可以由下列一种或多种引起：血容量减少(例如由于休克、脱水、体液丧失或利尿剂过量使用)、肝肾综合征、血管问题(例如粥样栓塞性疾病、肾静脉栓塞、与肾病综合症相关)、感染(例如脓毒症)、严重烧伤、死骨形成(例如由于心包炎、胰腺炎)和低血压(例如由于抗高血压、血管舒张剂的使用)。

肾实质性ARF可以由下列一种或多种引起：毒素或药物(例如NSAID、氨基糖苷类抗生素、碘化造影剂、锂)、磷酸盐肾脏障碍(例如与使用磷酸钠的结肠镜检查肠制备物相关)、横纹肌瘤(例如由损伤(例如挤压伤或严重挫伤)、抑制素、刺激剂的使用引起)、溶血、多发性骨髓瘤、急性肾小球肾炎。

肾后性ARF可以由下列一种或多种引起：药物(例如抗胆碱能药物)、良性前列腺肥大或前列腺癌、肾结石、腹部恶性肿瘤(例如卵巢癌、结肠直肠癌)、导尿管阻塞以及引起结晶尿或肌球蛋白尿或膀胱炎的药物。

ARF可以由患者中的缺血、毒素、使用血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂、输血反应、肌肉损伤或创伤、外科手术、休克和低血压引起。引起ARF的毒素可以是抗真菌剂或射线照相术的染料。此外，在某些实施方案中，ARF包含急性肾小管坏死或肾缺血再灌注损伤。

慢性肾病

在本发明的预防肾病或肾脏病症的方法的某些实施方案中，肾病是慢性肾病(CKD)。当在本文中使用时，“慢性肾脏疾病”，也称为“慢性肾病”，是指在数月或数年的时间内肾功能的渐进性丧失。待治疗的CKD处于任何级，例如1级、2级、3级、4级或5级(也称为已确定的CKD、末期肾病(ESRD)、慢性肾脏衰竭(CKF)或慢性肾衰竭(CR))。

CKD可以由多种因素中的任一种引起，包括但不限于急性肾脏损伤、急性肾脏损伤的病因、导致糖尿病肾病的1型和2型糖尿病、高血压、肾小球肾炎(肾脏过滤系统的炎症和损伤)、多囊性肾病、导致止痛药肾病的止痛药(例如对乙酰氨基酚、布洛芬)的使用(例如定期或过长持续时间)、导致缺血性肾病的动脉粥样硬化、尿液流动被结石阻塞、前列腺肥大、狭窄(变窄)、HIV感染、镰状细胞病、海洛因滥用、淀粉样变性、肾结石、慢性肾脏感染和某些癌症。

非肾脏疾病和非肾脏病症的预防

慢性肾脏疾病已被鉴定为心血管疾病和心血管死亡的独立主导风险因子。理论上说，给药本文描述的细胞(例如靶细胞)对于预防肾脏疾病和肾脏病症之外的其他疾病或病症也是有用的。因此，本文中还提供了在包含肾脏损伤的患者中预防由肾脏疾病或肾脏病症引起或与其相关的非肾脏疾病或非肾脏病症的方法。方法包含向患者给药细胞(例如靶细胞)，其量能够有效预防非肾脏疾病或非肾脏病症。在某些实施方案中，非肾脏疾病或非肾脏病症是心血管疾病。

在某些实施方案中，由本文提供的方法治疗的疾病或病症是自体免疫疾病。出于本文的目的，“自体免疫疾病”是指其中身体对其自身组织的某些组成成分产生免疫原性(即免疫系统)应答的疾病。换句话说，免疫系统失去了其将体内某些组织或系统识别为自身的能力，并靶向和攻击所述组织或系统，如同它是外来的。自体免疫疾病可以分类成主要一个器官受影响的疾病(例如溶血性贫血和自身免疫性甲状腺炎)和自体免疫疾病过程扩散到许多组织的疾病(例如系统性红斑狼疮)。例如，多发性硬化被认为由T细胞攻击脑和脊髓神经纤维周围的鞘所引起。这引起协调性丧失、虚弱和视觉模糊。自体免疫疾病在本技术领域中是已知的，并包括例如桥本甲状腺炎、甲状腺机能亢进、狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎、溶血性贫血、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩病、结肠炎、糖尿病、硬皮病、牛皮癣等。

在某些实施方案中，疾病是癌症。在具体实施方案中，癌症选自：急性淋巴细胞癌、急性粒细胞白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆道癌、关节癌、颈部、胆囊或胸膜癌、鼻、鼻腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、结肠癌、食道癌、宫颈癌、胃肠类癌肿瘤、霍奇金淋巴瘤、咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和膀胱癌。

患者类型

对于本文描述的本发明的方法来说，患者是任何宿主。在某些实施方案中，宿主是哺乳动物。当在本文中使用时，术语“哺乳动物”是指任何哺乳纲的脊椎动物，包括但不限于单孔类、有袋类和胎盘类动物。在某些实施方案中，哺乳动物是啮齿目哺乳动物例如小鼠和仓鼠和兔形目哺乳动物例如家兔之一。在某些实施方案中，哺乳动物来自食肉目包括猫科(猫)和犬科(狗)。在某些实施方案中，哺乳动物来自偶蹄目牛科(奶牛)和猪科(猪)，或奇蹄目包括马科(马)。在某些情况下，哺乳动物是灵长目Ceboids或Simoids(猴)或类人猿(人类和猿类)。在特定实施方案中，哺乳动物是人。

给出下列实施例仅仅是为了说明本发明，而不以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

消化步骤的优化

在酶浓度和消化时间方面，对用于消化脂肪组织以从组织释放细胞的标准方案进行优化。对这两个参数和整体消化技术进行优化，以获得从每ml脂肪组织释放的最大量细胞，同时维持细胞存活力。

测试了191U/ml、250U/ml和319U/ml的胶原酶浓度。以与脂肪组织(脂肪抽吸物)的体积相比1∶1体积比的胶原酶溶液，包含下列组分：I型胶原酶(Worthington Biochemical)；DMEM/F12 50∶50(Gibco)；w/L-谷氨酰胺；10％FBS(Hyclone)和10mM Hepes。

与胶原酶溶液的温育时间在15至60分钟之间变化。消化在37℃下使用恒速振摇进行。在这些实验中还使用包含DMEM(Gibco)和10％FBS(Hyclone)的清洗缓冲液来失活酶，以促进所释放细胞的总体健康和存活力。

除了从脂肪组织释放的细胞总数之外，还测量了所释放细胞的存活力。细胞存活力使用只有当细胞膜受损时才能透过细胞的染料(7AAD)来测定。然后使用流式细胞术对染料以及因此细胞存活力进行定量。

在与含有不同浓度胶原酶的介质温育后从脂肪组织释放的细胞总数以及存活细胞的百分数，显示在表1中。

表1

浓度(U/ml)	释放的总细胞	标准偏差	存活性％
				191(n＝12)	4.41E+05	2.81E+05	79.86
250(n＝6)	8.10E+05	8.63E+04	85.87
				319(n＝6)	4.15E+05	3.64E+04	76.09

释放的总细胞表示每mL脂肪组织释放的细胞总数。

这些数据表明，与含有浓度为250U/mL的胶原酶的介质在搅拌、振摇或混合下在约37℃温育45分钟的时间，对于本应用是最适的。在这些条件下，在250U/ml时每ml加工组织释放的细胞数最高，并且细胞的存活力没有大程度的牺牲。

选择步骤的优化

使用基于抗体的捕获方法从胶原酶消化后从脂肪组织释放的细胞中富集或选择靶细胞群。对在图1中概述的选择步骤进行优化，以获得最高的纯度和回收百分率，并在同时维持细胞存活力。

通过选择脂肪组织释放的细胞群中包含的CD34阳性细胞，对抗体浓度、珠子与靶细胞比例、释放肽浓度和捣碎技术进行分析。被选择和未选择细胞的CD34表达和定量，使用干细胞试剂盒CD34计数测定法(Stem Kit CD34 Enumeration Assay)进行测定，所述测定法使用荧光团计算给定样品中CD34阳性细胞的总数。此外还测定了CD45表达和细胞存活力(通过7AAD)。

用于这些实验的溶液包括选择缓冲液和反应试剂盒(Baxter)的组分。选择缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Baxter)、137mM NaCl、2.68mM KC1、3.21mM Na2HPO4x12 H2O(pH 7.2)、41％柠檬酸钠(Baxter)和1％人类血清白蛋白(Baxter)。反应试剂盒(Baxter)包含抗CD34抗体(Clone9C5)、Dynal抗小鼠抗体顺磁性珠子(SAM)和PR34释放肽。

使用的抗体浓度(每百万份靶细胞的抗体量)模拟Isolex试剂盒的浓度，并据信是过量的。使用每百万个靶细胞1μg抗体并优化对所使用的特定细胞类型进行优化，确定了抗CD34抗体的浓度。具体来说，测试了每百万个靶细胞约1至2.5μg之间的抗体浓度。将含有被释放细胞和抗体的介质在旋转器上温育30分钟。通过以600g离心来清洗细胞。

珠子与细胞的比是选择方法的关键特点，并可以随着待处理细胞/组织的类型而变。对于该包含以比外周血来源的细胞更高的频率表达CD34抗原的粘附细胞的测定来说，测试了1∶1、2∶1、4∶1、5∶1、7.5∶1和10∶1的珠子与靶细胞的比。靶细胞约占未选择的释放细胞总群的50％。将珠子与细胞在旋转器上温育约45分钟。将混合物暴露于磁体三次以捕获免疫复合物。确定了1∶1至5∶1(珠子与靶细胞比)的目标范围是最适的。该范围可能只对脂肪组织是最适的。

尽管其他珠子与靶细胞的比似乎是有用的，能够允许极高的捕获效率，据信过高的珠子与靶细胞的比不利于释放效率。

通过将PR34肽的量改变为1mg/ml或2mg/ml，确定了最适释放肽浓度。将含有细胞CD34抗体、珠子和释放肽的介质在旋转器上温育45至60分钟。

CD34阳性靶细胞的黏附性质需要分散细胞团块以及为释放肽的结合产生空间的方法。在释放步骤中使用捣碎来打破团块并释放细胞。具体来说，通过在释放步骤过程中将介质抽取到注射器小孔中并缓慢排空注射器，如此三次，将团块捣碎。测试的捣碎时间包括0、15、30和45分钟。

从这些实验，发现使用释放肽PR34并伴随捣碎，产生最佳结果。这种类型的捣碎技术对于脂肪组织来说是特异性和新颖的。使用这种技术观察到的近似释放百分率超过20％。

将所选择的CD34阳性细胞的存活力和纯度与未选择细胞进行比较。如表2中所示，基于抗体的选择步骤实现了约2倍的纯度增加(从40％到75％)，总回收百分率为23％。在另一组实验中，选择步骤实现CD34阳性细胞纯度从36％到73％的增加(数据未显示)。值得注意的是，选择步骤不显著损害细胞存活力。

表2

对于本实验来说，n＝3。纯度是CD34阳性细胞的总数除以总细胞(排除碎片)的计算值。回收％是被选择群中CD34阳性细胞的总数除以未选择群中CD34阳性细胞的总数。

被选择细胞的表型被确定为与未选择细胞不同。例如，在CD34选择细胞中CD45的表达(7.54％)与未选择细胞(15.82％)相比降低。此外，在选择后淋巴细胞也减少了。此外，在被选择群中与未选择群相比，亮的CD34细胞(以较高程度表达CD34的细胞)的量降低。可以对选择步骤进行定制以捕获亮的CD34细胞。CD140b阳性细胞的数量在选择后增加，而ASC和CD144阴性细胞的数量在选择后维持。

实施例2

将来自吸脂术过程的人类脂肪组织，使用如实施例1中所确定的最适酶消化步骤进行消化。具体来说，将含有250U/ml介质的溶液添加到等体积脂肪组织中。将混合物在37℃和连续振摇下温育。使用高浓度胎牛血清(FBS)溶液将酶失活。将失活的酶混合物以300g离心5分钟，并将细胞沉淀重悬浮在新溶液中。将细胞悬液进行一系列过滤步骤。然后将过滤后的溶液以300g离心5分钟。将细胞沉淀重悬浮在新溶液中。该细胞产物被称为基质血管级份(SVF)。

将SVF样品在FACSCalibur和FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上进行分析。使用多彩流式细胞术图来定量确定SVF的细胞组成(图2)。确定了亮CD34阳性细胞(脂肪基质细胞；ASC)、淋巴细胞、暗CD34阳性细胞(间充质基质细胞；MSC)、内皮细胞和碎片(死细胞)的存在并对其进行定量(图3)。

SVF中CD34阳性细胞的定向选择使用CD34抗体和顺磁性珠子来进行。在与展示针对CD34特异性抗体的第二抗体的顺磁性珠子温育后，细胞形成玫瑰花形。通过释放步骤使CD34阳性细胞从抗体-珠子复合物中释放。由此通过该选择程序获得了纯化的CD34阳性细胞。

使用流式细胞术确定CD34阳性细胞的表型。通过这种方式测定了细胞标志物包括CD10、CD13、CD34、CD45、CD140b、CD90、CD31、CD105、CD73、CD144等的表达。CD34是干细胞标志物，其存在于许多细胞类型上，包括任何细胞来源的干细胞、胚细胞和骨髓与脐带中的各种细胞。CD140b(也称为PDGFR2)已被报道是MSC标志物。CD90也被称为Thy-1胸腺细胞抗原，并存在于许多细胞类型上，包括但不限于MSC、HSC、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞。CD31也被称为PECAM-1(血小板内皮细胞黏附分子)，并存在于内皮细胞上。CD105(也称为Endoglin，TGF-β受体-细胞复合物的调控组分)介导针对TGF-β的细胞应答。CD105存在于许多细胞上，因为它帮助调节增殖和凋亡途径。CD73是胞外5′-核苷酸酶(5′-NT)并存在于白细胞上，但是已被报道作为ASC标志物。CD45是白细胞共有抗原，并存在于除了红细胞之外所有的造血细胞上。CD144也称为VE-钙粘着蛋白，是细胞间连接处的钙依赖性黏附分子，并主要发现在血管内皮上。最近的研究表明，CD 144也可以存在于某些白细胞上。

在未选择群的CD34阳性选择细胞群中，似乎存在至少三种不同的亚群：群A占总数的20+/-6％，并具有34亮/45-/90+/140b+/31-/73+/44+/105-/146-的表达分布情况；群B占总数的8+/-4％，并具有34亮/45-/90+/140b-/105+/146+/144+/31+/44+的表达分布情况；群C占总数的31+/-16％，并具有34暗/45-/90+/105+/146+/31+/44暗的表达分布情况。群A和B的约96％是CD34阳性的，并且这些群的约78％是CD140b表达阳性的。这些群的约92％是CD45表达阴性的。

选择方法的修改导致这些细胞群的保留或消除。

群A似乎是多能性质的脂肪基质细胞。这些细胞展示干细胞标志物和45-/105+/31-的分布情况，表明细胞具有基质性质。该群的基质性质可以允许这些细胞具有组织工程化特性。这些细胞还表达PDGFR2抗原，表明更多的间充质性质。这些标志物的组合可以允许这些细胞分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、上皮细胞、神经元等。

群B具有内皮细胞分布情况(31+/144+/146+)，但是也展示干细胞标志物和endoglin标志物CD105，后者是TGFB受体的一部分。这些细胞可以促进血管形成和血管发生，并有助于组织修复。

群C展示34+/31+/146+/105暗/90+/45-的表达情况，其已被发表是造血祖细胞的分布情况，能够形成髓样和淋巴样细胞。其他标志物表明这些细胞可能也具有内皮细胞性质。

SVF是富有治疗潜力的细胞级份。每个群包含在其表面标志物分布情况中所反映的特定特征。可以设计用于每种这些群的选择方法，以分离没有其他群污染的一种群。这些特定细胞产品将具有多种特定的治疗用途，并且可以专门满足个体患者的需要。

实施例3

从人类脂肪抽吸物制备新鲜ASC。在胶原酶处理并通过100微米滤器过滤后，将样品分拆：3/4用于基本如实施例1和2中所述使用Dynabead(Invitrogen)选自CD34阳性级份，1/4通过标准过滤方法进行处理。CD34选择获得了CD34阳性细胞约3倍的富集，CD34阳性细胞的纯度从13％增加到36％。

在裸鼠中产生了后肢缺血模型。手术后一天，将动物分派到三个组中的一个：PBS对照；未选择(总群)；和CD34选择群。通过直接肌肉内注射到缺血肢的腓肠肌和股四头肌中来实施治疗(PBS、未选择细胞或CD34选择细胞)。

在第1、5、10、15和20天时执行激光多普勒灌注成像(LDI)以评估缺血肢的再灌注。在第1天具有最低相对灌注的大部分对照处理的小鼠，到第5天时发生严重坏死(影响超过一半的缺血足)，并不得不安乐死。因此，对照组的平均值朝向较高相对灌注方向偏斜。没有根据第1天相对灌注值超出范围(即＞20％)排除动物，因为这将需要移除剩余5只对照小鼠中的3只。

如图5中所示，在第5和第10天观察到高的相对灌注值。该观察可以通过排除了较高数量的对照组小鼠来解释。

当直接注射到具有缺血后肢的小鼠的受影响肌肉组织中时，富集3倍的CD34+ASC比未选择细胞更有效力。

本文引证的所有参考文献、包括出版物、专利申请和专利，在此引为参考，其程度如同每个参考文献被单独并具体指明以其全文在此引为参考。

在描述本发明的文本中(特别是在后面权利要求书的文本中)，无具体数量指称的术语和类似指称的使用，应该被解释为涵盖了单数和复数两者，除非在本文中另有指明或通过上下文明确否认。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应该被解释为开放术语(即意味着“包括，但不限于”)，除非另有注明。除非在本文中另有指明，否则本文中值的范围的陈述仅仅打算用作对处于该范围内的每个独立值进行个别指称的简要方法，并且每个独立值被引入说明书中，如同其在本文中被个别陈述。本文描述的所有方法可以以任何适合的次序执行，除非在本文中另有指明或通过上下文明确否认。除非另有指明，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)，仅仅是为了更好地说明本发明，而不是为本发明的范围设限。说明书中的所有措辞都不应被解释为表明任何未宣称的要素对本发明的实践来说是必需的。

在本文中描述了本发明的某些实施方案，以及本发明人所知的用于执行发明的最佳方式。对于本技术领域的普通专业人员来说，在阅读了上面的描述后，那些优选实施方案的变化形式可能变得明显。本发明人预计专业技术人员能够适合地使用这些变化形式，并且本发明人意图使本发明能够以本文所具体描述的方式之外的方式实践。因此，本发明包括在本文随附的权利要求书中所叙述的主题内容的在适用法允许下的所有修改形式和等价物。此外，上述要素在其所有可能变化形式下的任何组合都被本发明所涵盖，除非在本文中另有指明或通过上下文明确否认。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种从脂肪组织获得细胞群的方法，所述方法包含将脂肪组织在包含浓度为至少约200U/ml溶液并且不超过约319U/ml溶液的酶的溶液中温育约30至60分钟之间的时间段，由此从脂肪组织获得细胞群。

2.权利要求1的方法，其中酶浓度在约200至约300U/ml溶液之间。

3.权利要求2的方法，其中酶浓度在约225至约275U/ml溶液之间。

4.权利要求3的方法，其中酶浓度在约245至255U/ml溶液之间。

5.权利要求1到4任一项的方法，其中时间段在约45至约55分钟之间。

6.前述权利要求任一项的方法，其中酶是胶原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或包含至少一种上述的酶的混合物。

7.前述权利要求任一项的方法，其中脂肪组织体积与酶溶液体积的比为约1∶1。

8.前述权利要求任一项的方法，其中从每ml脂肪组织获得至少6.0x 10⁵个细胞。

9.权利要求8的方法，其中从每ml脂肪组织获得至少8.0x 10⁵个细胞。

10.一种从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法，所述方法包含：

a.根据权利要求1到9任一项的方法从脂肪组织获得细胞群；以及

b.将细胞群在包含第一抗体的第二种溶液中温育，所述第一抗体将细胞群分成包含靶细胞的亚群和基本上不含靶细胞的亚群，由此获得靶细胞富集群。

11.权利要求10的方法，其中第一抗体是特异性针对靶细胞不表达的细胞标志物的抗体。

12.权利要求11的方法，其中第一抗体是特异性针对选自下列的细胞标志物的抗体：CD45、血型糖蛋白-A和CD31。

13.权利要求10的方法，其中第一抗体是特异性针对靶细胞所表达的细胞标志物的抗体。

14.权利要求13的方法，其中细胞标志物是CD34。

15.权利要求14的方法，其中靶细胞是CD34阳性细胞。

16.权利要求10到15的方法，其包含将细胞群与珠子温育，由此形成包含珠子和第一抗体的复合物。

17.权利要求16的方法，其中珠子包含与第一抗体结合的蛋白。

18.权利要求17的方法，其中蛋白选自：(i)与第一抗体特异性结合的第二抗体，或其抗原结合片段，(ii)蛋白A，(iii)蛋白G和(iv)它们的组合。

19.权利要求16到18任一项的方法，其中珠子以1∶1至5∶1之间的珠子与靶细胞比存在。

20.权利要求19的方法，其中珠子与靶细胞的比为约4∶1。

21.权利要求16至20任一项的方法，其包含从第二种溶液中除去复合物。

22.权利要求21的方法，其中珠子是顺磁性珠子，并且使用磁体从溶液中除去复合物。

23.权利要求13到22任一项的方法，其包含将复合物与释放肽温育。

24.权利要求23的方法，其中释放肽包含表位，所述表位是CD34的表位或第一抗体的表位。

25.权利要求23或24的方法，其中释放肽是可溶性CD34或PR34释放肽。

26.权利要求23到25任一项的方法，其包含用注射器捣碎复合物。

27.权利要求1到26任一项的方法，其中获得的群被培养或铺板少于一天。

28.权利要求1到26任一项的方法，其不含任何扩增所获群的步骤。

29.根据权利要求10到28任一项的方法从脂肪组织获得的靶细胞富集群。

30.权利要求29的富集群，其中富集群中靶细胞的百分率是(a)的细胞群中靶细胞的百分率的约1.5倍至约5倍。

31.权利要求29或30的富集群，其中靶细胞是CD34阳性细胞。

32.一种用于向患者给药的包含细胞的药物组合物的制备方法，所述方法包含将权利要求29到31任一项的靶细胞富集群与可药用载体配制在一起。

33.权利要求32的方法，其中细胞对于患者来说是自体的。

34.权利要求32或33的方法，其中细胞被培养或铺板不超过一天。

35.权利要求32到34任一项的方法，其中药物组合物中至少50％的细胞是CD34阳性的。

36.根据权利要求32到35任一项的方法制备的药物组合物。

37.一种在患者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包含向患者给药权利要求36的药物组合物，所述药物组合物的量能够有效治疗疾病或病症。

Claims (37)

1.一种从脂肪组织获得细胞群的方法，所述方法包含将脂肪组织在包含浓度为至少约200U/ml溶液并且不超过约319U/ml溶液的酶的溶液中温育约30至60分钟之间的时间段，由此从脂肪组织获得细胞群。

2.权利要求1的方法，其中酶浓度在约200至约300U/ml溶液之间。

3.权利要求2的方法，其中酶浓度在约225至约275U/ml溶液之间。

4.权利要求3的方法，其中酶浓度在约245至255U/ml溶液之间。

5.权利要求1到4任一项的方法，其中时间段在约45至约55分钟之间。

6.前述权利要求任一项的方法，其中酶是胶原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或包含至少一种上述的酶的混合物。

7.前述权利要求任一项的方法，其中脂肪组织体积与酶溶液体积的比为约1∶1。

8.前述权利要求任一项的方法，其中从每ml脂肪组织获得至少6.0x 10⁵个细胞。

9.权利要求8的方法，其中从每ml脂肪组织获得至少8.0x 10⁵个细胞。

10.一种从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法，所述方法包含：

a.根据权利要求1到9任一项的方法从脂肪组织获得细胞群；以及

b.将细胞群与第一抗体温育，所述第一抗体将细胞群分成包含靶细胞的亚群和基本上不含靶细胞的亚群，由此获得靶细胞富集群。

11.权利要求10的方法，其中第一抗体是特异性针对靶细胞不表达的细胞标志物的抗体。

12.权利要求11的方法，其中第一抗体是特异性针对选自下列的细胞标志物的抗体：CD45、血型糖蛋白-A和CD31。

13.权利要求10的方法，其中第一抗体是特异性针对靶细胞所表达的细胞标志物的抗体。

14.权利要求13的方法，其中细胞标志物是CD34。

15.权利要求14的方法，其中靶细胞是CD34阳性细胞。

16.权利要求10到15的方法，其包含将细胞群与珠子温育，由此形成包含珠子和第一抗体的复合物。

17.权利要求16的方法，其中珠子包含与第一抗体结合的蛋白。

18.权利要求17的方法，其中蛋白选自：(i)与第一抗体特异性结合的第二抗体，或其抗原结合片段，(ii)蛋白A，(iii)蛋白G和(iv)它们的组合。

19.权利要求16到18任一项的方法，其中珠子以1∶1至5∶1之间的珠子与靶细胞的比存在。

20.权利要求19的方法，其中珠子与靶细胞的比为约4∶1。

21.权利要求16至20任一项的方法，其包含从细胞群中除去复合物。

22.权利要求21的方法，其中珠子是顺磁性珠子，并且使用磁体从细胞群中除去复合物。

23.权利要求16到22任一项的方法，其包含将复合物与释放肽温育。

24.权利要求23的方法，其中释放肽包含CD34的表位或第一抗体的表位。

25.权利要求23或24的方法，其中释放肽是CD34的可溶性片段或PR34释放肽。

26.权利要求23到25任一项的方法，其还包含捣碎复合物。

27.权利要求1到26任一项的方法，其中获得的群被培养或铺板少于一天。

28.权利要求1到26任一项的方法，其不含任何扩增所获群的步骤。

29.根据权利要求10到28任一项的方法从脂肪组织获得的靶细胞富集群。

30.权利要求29的富集群，其中富集群中靶细胞的百分率是从步骤(a)获得的细胞群中靶细胞的百分率的约1.5倍至约5倍。

31.权利要求29或30的富集群，其中靶细胞是CD34阳性细胞。

32.一种用于向患者给药的包含细胞的药物组合物的制备方法，所述方法包含将权利要求29到31任一项的靶细胞富集群与可药用载体配制在一起。

33.权利要求32的方法，其中细胞对于患者来说是自体的。

34.权利要求32或33的方法，其中细胞被培养或铺板不超过一天。

35.权利要求32到34任一项的方法，其中药物组合物中至少50％的细胞是CD34阳性的。

36.根据权利要求32到35任一项的方法制备的药物组合物。

37.一种在患者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包含向患者给药权利要求36的药物组合物，所述药物组合物的量能够有效治疗疾病或病症。

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