KR20100063693A - 발기 기능의 회복방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 음경 조직내에서 산화질소 생산을 증가시킬 수 있는 세포의 집단을 주입하고, 당해 세포를 생체내에서 유지시켜 산화질소의 국소 조직 농도를 증가시킴으로써, 해면체내 압력이 자극시 증진될 수 있도록 하여, 대상체에서 발기부전(ED)을 완화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

발기 기능의 회복방법{Methods of restoration of erectile function}

본 발명은 발기부전 치료용 조성물 및 방법, 및 보다 특히 환자의 음경내로 내피 전구세포(EPC)를 투여하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

600,000명 이상의 중년 미국 남성은 매년 어느 정도의 발기부전(ED) 또는 발기불능을 경험하여, 생애동안 일부 시점에서 ED를 갖는 대략 2 내지 3천만명의 미국 남성이 발생한다. 의사들은, ED의 85% 이하가 당뇨병, 고혈압, 혈관병, 전립선 및 비뇨생식기 부위에 대한 수술, 척추 손상, 다발경화증, 내분비 장애 또는 약물과 같은 의학적 또는 신체적 문제에 의해 유발되는 것으로 추정하고 있다. 예를 들어, 진성 당뇨병인 남성의 대략 35 내지 75%가 ED를 겪고 있으며, 이는 미국에서 ED 경우의 대략 30%에 해당한다.

ED의 치료를 위해 최근 사용된 방법은 외부 장치, 성 치료요법, 내부 보철물의 외과적 삽입, 음경내로 직접적인 약물의 주입, 경구 투약(예를 들면, 실데나필, 페노탈라민, 알프로스타딜) 및 국소 적용된 의약을 포함하였다. 이들 시도 중 어는 것도 전적으로 효과적이지 않으며 두통, 설사, 홍조, 저혈압, 색각 파괴, 통증 또는 당황을 포함하는 각종의 부작용을 갖는다. 또한, 이러한 치료의 사용은 투여 동시에 일시적인 발기를 유발함으로써, 단지 ED의 일시적인 경감을 제공한다. 또한, ED에 대해 현재 이용가능한 경구 의약의 사용은, 당해 약물이 혈압에 영향을 미칠 수 있기 때문에 심혈관병을 가진 남성에게는 위험할 수 있다. 미국 심장 협회에 따르면, 제2형 당뇨병을 가진 남성에서의 ED는 심장병의 초기 경고 신호일 수 있다. 따라서, ED를 겪는 많은 남성은 또한 심장병을 지닐 수 있으며 경구 의약 섭취의 위험을 알고 있지 않을 수 있다.

따라서, ED를 완화시키기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 특히, 부작용이 최소인 ED의 장기간의 치료가 요구되고 있다.

[발명의 개요]

본 발명은 내피 전구 세포를 사용하여 발기부전을 완화시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 해면체내 압력을 유지시키고 당뇨병에 의해 유발된 발기부전을 완화시키는 방법이 기술되어 있다.

기능장애 내피 세포는 음경 조직내로의 동맥 혈류의 감소를 초래하는 산화질소 방출에 있어서의 감소에 관여한다. 본 발명은, 말초 혈액으로부터 수득한 내피 전구 세포(EPC)가 질병이 있는 음경내로 주입되는 경우 치료학적 내피 세포를 수득하는데 사용될 수 있으며, 이러한 세포는 당뇨병 모델에서 정상적인 발기 기능을 회복할 수 있음을 입증한다. 이러한 세포-기반 기술은 발기부전을 가진 당뇨병 환자에 대한 치료 양식으로서 사용될 수 있다.

하나의 측면에서, 본 발명은, 내피 세포를 분리하는 단계, 내피 세포를 음경 조직내로 주입하는 단계 및 세포가 조직내로 통합하여 산화질소의 국소 조직 농도를 증가시키도록 하는 단계, 및 생체내에서 세포를 유지시켜 자극시 해면체내 압력을 증진시키는 단계를 포함하여, 발기부전(ED)을 완화시킬 필요가 있는 대상체에서 발기부전을 완화시키는 방법을 기술하고 있다. EPC는 말초 혈액 또는 골수로부터 분리할 수 있다. 세포는 동종이다. 일부 바람직한 양태에서, 세포는 자가 세포이다. 내피 전구 세포는 생체외에서 분화되어 내피 세포를 생산할 수 있다. 내피 세포는 배양물 속에서 분리하여 증식시킬 수 있다. 증식된 세포는 해면체내로 직접 주입할 수 있다. 주입당 대략 0.1 내지 약 천만개 세포를 이식시킬 수 있다. 사용된 세포의 농도는 대상체내에 존재하는 ED의 정도에 따라 변할 수 있다. 주입은 필요에 따라 반복할 수 있다.

당해 방법은 진성 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 가진 대상체에서 사용할 수 있다. 세포 치료요법으로부터 최대 이점을 유지시키기 위하여, 대상체와 또한 상담하여 글루코즈의 혈액 수준을 조절할 수 있다. 이상적으로, 혈액 글루코즈 수준은 대상체에 대해 정상 범위내에서 유지된다.

일부 양태에서, 평활근 세포를 사용하여 평활근 기능을 회복시킬 수 있다. 다른 양태에서, EPC 및 전구 근육 세포(MPC)를 합하여 음경 조직내로 주입하여 음경 조직 기능을 향상시킬 수 있다. EPC 및 MPC는 둘다 말초 혈액으로부터 분리될 수 있다. 세포는 체세포 또는 줄기세포로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 대상체내로 주입하기 위한 바람직한 세포 집단은 세포의 바람직한 집단의 적어도 하나의 물리적 특성 또는 적어도 하나의 세포 특이적인 친화성 잔기를 사용하여, 말초 혈액과 같은 체액으로부터 분리할 수 있다. 물리적 특성은 크기 여과 또는 형광 또는 자성 표지에 의한 활성 세포 분류를 포함할 수 있다. 목적한 세포 집단을 부착시키는데 유용한 친화성 잔기는 예를 들면, 항체, 단백질 리간드, 핵산 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포 특이적인 친화성 잔기는 세포 특이적인 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 전구 세포는 본 발명의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 친화성 잔기는 CD133, CD31, CD34, sca-1, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor: vWF) 또는 c-kit와 같은 특이적인 전구 세포 표면 마커에 대해 실질적인 친화성을 가지도록 선택할 수 있다. 이는 대상체에 투여하기 전 증식 및/또는 분화를 위한 말초 전구 세포의 대량 정제를 가능하도록 한다. 세포 분리 기술에 있어 추가의 세부사항은 본원에 전문이 참조로 인용된 "Methods Of Isolating And Purifying Cells For Therapy"라는 명칭으로 2008년 1월 18일자 출원된, 공동-소유의, 공동-계류중인 미국 임시 특허원 제61/022,028호에서 찾을 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 음경 조직에 투여될 세포의 집단을 봉입시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 봉입은 세포로부터 분비된 혈관형성 조절제 단백질이 주변 조직내로 확산되는 동안, 영양물이 면역보호된 세포에 이르도록 하는 미세구의 형태, 예를 들면, 알기네이트-폴리-L-라이신 캅셀의 형태일 수 있다. 미세구는 숙주 면역 환경으로부터 피복된 세포를 보호한다. 또한, 위에 나타낸 바와 같이, 세포는 또한 산화질소 생산을 추가로 향상시키고/시키거나 혈액 글루코즈 수준을 조절하는 인자를 생산하도록 조작될 수 있다. 세포 분리 기술에 있어서의 추가의 세부사항은 또한 본원에 전문이 참조로 인용된, "Enhancement Of Angiogenesis To Grafts Using Cells Engineereed To Produce Growthfactors"라는 명칭으로 2004년 1월 28일자 출원된 공동-소유의, 공동-계류중인 미국 특허원 제10/766,642호(공보 번호 제US2005-0002915호)에서 찾을 수 있다.

도 1은 정상 발기 기능의 생리학을 나타내는 도식이다.
도 2는 전구 세포 기원한 내피세포 치료요법이 발기부전을 치료하는데 사용될 수 있음을 입증하는 실시예에 기술된 전체적인 연구 설계를 나타내는 도식이다.
도 3은 당뇨병 그룹과 세포 치료요법 그룹 사이의 비교를 나타내는 시간에 따른 혈액 글루코즈 그래프이다.
도 4A는 정상 랫트에서 해면체내 압력을 나타내는 해면체내압측정술로부터의 결과의 그래프이다.
도 4B는 당뇨병 랫트에서 해면체내 압력을 나타내는 해면체내압측정술로부터의 결과의 그래프이다.
도 4C는 내피 전구 세포를 사용한 세포 치료요법 후 12개월 째에 당뇨병 랫트내 해면체내 압력을 나타내는 해면체내압측정술로부터의 결과의 그래프이다.
도 5는 당뇨병 유도 후 4주 째에, 당뇨병 그룹(DB), 내피 세포를 사용한 세포 치료요법을 받은 당뇨병 그룹(CT), 인슐린 치료를 받은 당뇨병 그룹(인슐린) 및 내피 전구 세포 및 인슐린 치료를 사용한 세포 치료요법을 받은 당뇨병 그룹(CT + 인슐린)의 해면체내 압력 결과를 비교하는 시간에 따른 ICP(해면체내 압력)/MAP(평균 동맥압)의 비의 그래프이다.
도 6은 당뇨병 유도 후 8주째에 당뇨병 및 정상 그룹의 해면체내 결과를 비교하는 신경자극에 대한 MAP(평균 동맥압)/ICP(해면체내 압력)의 비의 그래프이다.
도 7은 당뇨병 유도 후 8주째에 당뇨병 그룹(DB) 및 내피 전구 세포를 사용한 세포 치료요법을 받은 당뇨병 그룹(DB + CT)을 비교하는 시간에 따른 MAP(평균 동맥압)/ICP(해면체내 압력)의 비의 그래프이다.
도 8은 정상 랫트, 당뇨병 랫트(DM), 및 내피 전구 세포를 사용한 세포 치료요법 후 12주째에 당뇨병 랫트(DM + CT)에 대한 결과를 비교하는 ICP(해면체내 압력)/MAP(평균 동맥압)의 비의 그래프이다.

본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 특정의 용어를 우선 정의한다:

본원에 사용된 용어 "분리하는" 또는 "분리된"은, 세포 성분이 수득될 수 있는 하위집단내로 분획화된 세포 또는 세포를 분획화하는 과정을 말한다. 이는 또한 세포 배양의 당해 분야의 숙련가에 의해 사용된 세포 분리를 위한 표준 기술을 사용하여 달성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "분화" 또는 "분화된"은 이것이 기원하는 전구 세포보다 더 성숙한 세포 또는 전구 세포의 성숙을 말한다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 면역 반응이 유발되는 살아있는 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 대상체는 포유동물이다. 대상체의 예는 사람, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 소, 말, 돼지, 염소 및 양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

I. 발기부전(ED)

ED는 성 수행에 충분한 발기를 획득하거나 유지하는데 있어서 지속적인 불능이다. 휴식 상태에서, 발기체의 내부 및 외부의 혈류 사이에는 균형이 맞추어져 있다. 정상적인 발기 기능은 역동적인 신경 및 혈관 상호작용의 복잡한 세트를 필요로 한다. 음경 발기는 다중 메카니즘(예를 들면, 중추 정신적 및 반사인성)에 의해 유발될 수 있다. 이러한 메카니즘은 정상적인 성 활성동안 상호작용한다. 정신적 자극은 청각, 시각, 후각 또는 영상 자극을 포함하고, 반사인성 자극은 체세포 및 부교감 신경 작용을 유발하는 음경상의 감각 수용체를 포함한다.

흥분시, 부교감 활성은 산화질소의 방출로 시작하여 세포내 매개인자 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)의 증가된 수준으로 종결되는 일련의 현상을 개시한다. cGMP에서의 증가는 음경 혈관 및 육주 평활근 완화를 유발하며, 이는 해면체내로 증가된 혈류를 초래한다. 해면체 공간의 신속한 충진은 세정맥을 압박하여 감소된 정맥 유출(예를 들면, 음경 정맥-폐색 메카니즘)을 초래한다. 증가된 유입 및 감소된 유출의 조합은 해면체내 압력을 신속히 증가시켜 점진적인 음경 강직 및 완전한 발기를 초래한다. 정상적인 발기 기능의 개략도는 도 1에 나타낸다.

ED가 심인성 또는 기관 원인일 수 있다고 해도, 대부분의 경우는 혈관성, 신경성 및 호르몬성 원인과 같은 적어도 일부의 기관 원인을 갖는다. 진성 당뇨병에 걸린 남성의 대략 35 내지 75%는 ED로 고통받고 있으며, 이는 미국에서 ED 경우의 대략 30%에 해당한다. 당뇨병에 걸린 남성에서 ED는 다인자병인을 가지며 내피세포 기능장애, 신경병, 혈관병, 내분비 장애, 당뇨병 제어 및 의약과 관련되어 있다. 특정 메카니즘 및 관련 손상은 예를 들면, 탄성 섬유의 당화 및 해면체의 완화의 실패를 가져올 수 있는 고혈당증, 산화질소 방출에 있어서의 감소 및 손상된 혈관확장을 초래할 수 있는 동모양 내피 세포(sinosoidal endothelial cell)의 내피 기능장애, 및 감소된 동맥 및 세동맥 유입을 초래할 수 있는 말초 혈관병을 포함한다.

본 발명의 하나의 측면에서, 세포 치료요법을 사용하여 ED를 완화시키는 방법이 기술되어 있다. 음경 조직내로 주입된 내피 전구 세포(EPC)는 ED를 개선시키는데 있어 장기간의 효과를 가진 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법은 국소 산화질소 농도를 증가시키는데 사용될 수 있다. EPC는 바람직하게는 치료될 환자로부터의 말초 혈액으로부터 수득될 수 있다. 다른 양태에서, 중간엽 줄기세포가 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상이한 세포 유형의 조합을 음경 조직내로 주입할 수 있다. 예를 들면, EPC 및 평활근 세포를 후술된 바와 같이 사용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 전환 성장 인자-알파 및 -베타(TGF), 및 혈소판 기원 성장 인자(PDGF)와 같은 성장 인자와 합해질 수 있다.

본 발명의 방법은 ED인 남성에 대한 장기간의 치료요법을 제공한다. 예를 들어, 개선이 세포 치료요법 후 12주까지 관측되었다. 당뇨병 환자에서, 본 발명의 세포 치료요법 방법은, 혈액 글루코즈가 예를 들면, 인슐린, 식이 및 운동과 같은 의약의 사용을 통해 조절되는 경우, 보다 긴 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.

주입되는 세포의 양은 질병의 정도, 및 치료될 대상체의 상태 및 체중에 따라 변할 것이다. 예를 들면, 주입당 약 0.3 내지 약 천만 세포가 해면체내로 주입될 수 있다. 필요에 따라, 주입을 반복할 수 있다.

II. 세포 배양

내피 세포는 동일한 종으로부터 기원한 동종 세포 집단 또는 대상체 자신의 조직으로부터 기원한 자가 세포 집단으로부터 기원할 수 있다. 세포는 또한 이종일 수 있으며, 여기서, 세포 집단은 대상체와는 상이한 포유동물 종으로부터 기원한다. 예를 들면, 조직 세포는 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 소, 말, 돼지, 염소 및 양과 같은 포유동물로부터 기원할 수 있다.

분리된 세포는 바람직하게는 대상체 자신의 조직으로부터의 말초 혈액 샘플 또는 생검으로부터 수득한 세포이다. 생검은 과정을 신속하고 단순하게 하는 국소 마취하에 생검 바늘을 사용함으로써 수득할 수 있다. 이후에 작은 생검을 배양물 속에서 분화시키고 증식시켜 조직 세포를 수득한다. 동일한 종의 친척 또는 다른 공여자로부터의 세포를 또한 적절한 면역제어와 함께 사용할 수 있다.

세포를 분리 및 배양하는 방법은 문헌(참조: Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126)에 기술되어 있다. 세포를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 조직을 절편으로 절단하여, 기계적으로 분해하고/하거나 분해 효소 및/또는 이웃하는 세포 사이의 연결을 약화시켜 조직을 적절한 세포 파괴없이 개개의 세포의 현탁액으로 분산시키는 것이 가능하도록 하는 킬레이트제로 처리할 수 있다. 필요에 따라, 효소적 분해는 조직을 썰고 썰어진 조직을 특정한 다수의 분해 효소 단독 또는 조합으로 처리하여 달성할 수 있다. 이들은 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 및/또는 하이알루로니다제, DNase, 프로나제 및 디스파제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기계적 분해는 또한 조직 표면의 긁음, 분쇄기, 배합기, 체, 균질화기, 가압 세포 또는 초음파기 등의 사용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

세포 유형은 사람 내피 세포, 말초 혈액 또는 상이한 세포, 줄기세포, 수임 줄기세포로 분화되도록 유도시킬 수 있는 골수로부터 분리된 전구 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않고/않거나 분화된 세포가 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 내피 전구 세포는 말초 혈액으로부터 자가 기원한다.

또한, 제조되는 조직 또는 기관의 유형에 따라서, 특정 유형의 수임 줄기세포가 사용될 수 있다. 예를 들면, 근육모 세포를 사용하여 각종 근육 구조를 제작할 수 있다. 다른 유형의 수임 줄기세포를 사용하여 심장, 신장, 간, 췌장, 비장, 방광, 요관 및 요도와 같은 기관 또는 기관-유사 조직을 제조할 수 있다. 다른 세포는 내피 세포, 근육 세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 골모세포, 근모세포, 신경모세포, 섬유아세포, 아교모세포; 배아 세포, 간세포, 연골세포, 각질세포, 심근 세포, 연결 조직 세포, 상피 세포, 내피 세포, 호르몬-분비 세포, 면역계의 세포, 신경, 심장, 신장, 간, 췌장, 비장, 방광, 요관 및 요도로부터의 세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 사용될 줄기세포의 유형을 미리 선택하는 것은 불필요한데, 이는 많은 유형의 줄기세포가 일단 제공된 기관으로 전달되면 기관 특이적인 패턴으로 분화하도록 유도될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 간으로 전달된 줄기세포는 간세포를 간의 생화학적 환경내에 위치시킴에 의해 단순히 줄기세포로 되도록 유도시킬 수 있기 때문이다.

예로써 또한 유전자 조작된 세포, 형질전환된 세포 및 무한증식 세포를 포함한다. 본 발명에 유용한 유전자 조작된 세포의 하나의 예는 하나 이상의 바람직한 분자를 제조하고 분비하는 유전자 조작된 세포이다. 유전자 조작된 세포가 유기체내로 이식되는 경우, 생산된 분자는 국소 효과 또는 전신계 효과를 생산할 수 있으며, 가능한 물질로서 위에서 정의된 분자를 포함할 수 있다.

세포는 염증을 억제하고 자극하며; 치유를 촉진하고; 면역거부를 저지하며; 호르몬 대체를 제공하고; 신경전달인자를 대체하며; 암 세포를 억제하거나 파괴하고; 세포 성장을 촉진하며; 혈관의 형성을 억제하거나 자극하고; 조직을 증강시키며; 다음 조직, 신경, 피부, 윤활액, 힘줄, 연골, 인대, 골, 근육, 기관, 경질막, 혈관, 골수 및 세포외 기질을 보충하거나 대체하는 물질을 생산할 수 있다. 다른 인자 및 분화 유도인자를 배양물에 가하여 특이적인 유형의 세포 성장을 촉진할 수 있다.

조직이 개개 세포의 현탁액으로 전환되면, 현탁액을 세포 성분이 수득될 수 있는 하위집단으로 분획화할 수 있다. 이는 또한 특이적인 세포 유형의 클로닝 및 선택, 원치않은 세포의 선택적인 파괴(음성 선택), 혼합된 집단에서 분화된 세포 응집성을 기초로 한 분리, 동결-해동 과정, 혼합된 집단에서 세포의 차등적인 부착 특성, 여과, 통상의 및 띠 원심분리, 원심분리 정화(역류 원심분리), 단위 중력 분리, 역류 분포, 전기영동 및 형광-활성화된 세포 분류를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포 분리용 표준 기술을 사용하여 달성할 수 있다[참조: Freshney, (1987) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, Ch. 11 and 12, pp. 137-168]. 예를 들면, 타액 세포는 형광-활성화된 세포 분류로 풍부하게 할 수 있다. 자성 분류 또한 사용할 수 있다.

예를 들어, 공여자가 암 또는 종양과 같은 질병을 갖는 경우, 세포 분획화가 또한 바람직할 수 있다. 세포 집단은 정상적인 비암 세포로부터 암 또는 종양 세포를 분리하기 위해 분류할 수 있다. 이후에, 하나 이상의 분류 기술로 분리한, 정상의 비암성 세포를 조직 재구성에 사용할 수 있다.

성장 인자 및 조절 인자를 배지에 가하여 분리된 세포 배양물 속에서 증식 및 세포 성숙 및 분화를 향상시키거나, 변경시키거나 조절할 수 있다. 배양물 중 세포의 성장 및 활성은 성장 호르몬, 성장호르몬촉진인자, 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 상피 성장 인자, 간 적혈구생성 인자(헤파토포이에틴) 등과 같은 각종의 성장 인자에 의해 영향받을 수 있다. 증식 및/또는 분화를 조절하는 다른 인자는 프로스타글란딘, 인터루킨 및 천연적으로 존재하는 칼론(chalone)을 포함한다.

분화된 세포는 시험관내에서 배양하여 주입에 유용한 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 증식되어진 분화된 세포는 또한 추가의 분리 단계에 의해 하나 이상의 세포 집단을 수득할 수 있다. 세포의 이식 후 면역학적 반응을 예방하기 위하여, 대상체를 사이클로스포린 또는 FK506과 같은 면역제어제로 처리할 수 있다.

분화된 세포는 핵산 서열로 형질감염시킬 수 있다. 유용한 핵산 서열은 예를 들면, 숙주내에서 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 유전 물질일 수 있다. 예를 들면, 제I 부류 및 제II 부류 조직적합성 항원과 같은 세포 표면 항원의 발현을 제어할 수 있다. 또한, 형질감염이 또한 유전자 전달에 사용될 수 있다. 세포는 생적합성 치환물상에 씨딩하기 전에 특정 유전자로 형질감염시킬 수 있다. 따라서, 배양된 세포를 조작하여 특정 질환을 완화시키는데 도움을 주는 바람직한 단백질을 생산하는 유전자 생성물을 발현시킬 수 있다.

세포 성장을 유전자 조작하여 이식에 유리한 유전자 생성물, 예를 들면, 항-염증 인자, 예를 들면, 항-GM-CSF, 항-TNF, 항-IL-1 및 항-IL-2를 생산할 수 있다. 달리는, 내피 세포를 유전자 조작하여 염증을 촉진하는 천연의 유전자 생성물, 예를 들면, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2의 발현을 "녹아웃(knock out)"시키거나 거부 위험을 감소시키기 위하여 MHC의 발현을 "녹아웃"시킬 수 있다.

예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 방법을 사용하여 세포를 유전자 조작시키는 방법을 사용할 수 있다. 이는 세포내에서 핵산 분자를 수송하고 발현하는 발현 벡터를 사용함을 포함한다[참조: Geoddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)].

벡터 DNA를 통상의 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포내로 도입시킨다. 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌[참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)], 및 기타 실험 교재에서 찾을 수 있다.

본 발명의 세포는 각종의 적용에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 내피 세포를 대상체내로 이식시켜 존재하는 조직을 대체하거나 증강시킬 수 있다. 대상체는 내피 세포의 이식 후, 질병의 완화에 대해 모니터될 수 있다.

세포를 시험관내에서 사용하여 약제, 화학제, 성장/조절 인자의 효능 및 세포독성에 대해 광범위한 화합물을 스크리닝할 수 있다. 배양물을 시험관내에서 유시키고 시험할 화합물에 노출시킬 수 있다. 세포독성 화합물의 활성은 배양물 속에서 세포를 손상시키거나 사멸시키는 이의 능력으로 측정할 수 있다. 이는 생 염색 기술로 용이하게 측정할 수 있다. 성장/조절 인자의 효과는 주입 후 세포 함량을 분석함에 의해, 예를 들면, 총 세포 수 및 분화 세포 수에 의해 평가할 수 있다. 이는 유형-특이적인 세포 항원을 정의하는 항체를 사용하는 면역세포화학 기술의 사용을 포함하는 표준 세포학적 및/또는 조직학적 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 인공 조직에서 배양된 정상 세포상의 각종 약물의 효과를 평가할 수 있다.

본 발명의 다른 양태 및 용도는 명세서 및 본원에 기술된 본 발명의 실시에 대한 고려로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 어떠한 이유로도 본원에서 언급한 모든 미국 특허 및 기타 참조문헌은 참조로 상세히 인용된다. 명세서 및 실시예는 청구의 범위에 의해 나타낸 본 발명의 실제 범위 및 취지와 함께 단지 예시적인 것으로 고려되어야 한다.

[실시예]

실시예 1: 재료

달리 나타내지 않는 한, 모든 화학물질은 시그마(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. ECL 완충액 및 125I-나트륨은 퍼킨엘머(PerkinElmer) NEN(미국 매사추세츠주 보스톤 소재)로부터 구입하였다. 콜라게나제 제II형(1mg/ml)은 베링거 만하임(Boehringer Mannheim, 독일 만하임 소재)로부터 구입하였다. 내피 세포 배지(EBM-2)는 캄브렉스 바이오 사이언스(Cambrex Bio Science, 메릴랜드주 워커스빌 소재)로부터 구입하였다. PCR 시약 및 프라이머, M199 배지, 태아 소 혈청(FBS) 및 페니실린은 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies, 메릴랜드주 게이터스부르그 소재)로부터 구입하였다. 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)는 주디쓰 아브라함(Judith Abraham, 캘리포니아주 시오스 노바 소재)로부터 기증받았다. FITC-표지된 모노클로날 항 사람 CD31 항체는 산타 크루즈(Santa Cruz, 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터 구입하였다. 토끼 폴리클로날 항 폰빌레브란트 인자(vWF), 항 평활근 액틴 항체, 및 FITC 표지된 항-토끼 IgG 항체는 다코(DAKO, 덴마크 글로스트룹 소재)로부터 구입하였다. 모노클로날 항 사람 CD31, 염소 폴리클로날 항-VE 카데린(VE-Cad), 염소 항-vWF 및 토끼 폴리클로날 항 Flk-1 항체는 산타 크루즈(캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터 구입하였다. FITC 및 비오틴-표지된 Ulex 유로피우스(europeaus) I 렉틴은 시그마(메릴랜드주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 비오틴-표지된 염소 항-마우스 IgG 및 비오틴-표지된 마우스 항-염소 IgG는 산타 크루즈(캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터 구입하였다. 항-CD105 항체는 비디 파밍겐(BD Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 구입하였다. FITC-접합된 아비딘은 벡터 레보러토리즈(Vector Laboratories, 캘리포니아주 부를링게임 소재)로부터 구입하였다.

실시예 2: 발기부전을 완화시키기 위한 내피 전구 세포의 주입

당해 연구는, 말초 혈액으로부터 수득한 EPC가 성숙한 내피 세포를 달성하는데 사용할 수 있음을 입증한다. 질병이 있는 음경내로 주입된 내피 세포는 당뇨병 랫트 모델에서 정상적인 발기 기능을 회복할 수 있다. 이러한 세포-기반 기술은 발기부전을 지닌 당뇨병 환자에 대한 생활가능한 치료 양식일 수 있다.

당뇨병의 모델은 스트렙토조토신(50 mg/Kg)의 복강내 주입에 의해 생성되었다. 300 mg/dl 이상인 혈액 글루코즈 수준의 동물을 당뇨병으로 고려하여 당해 연구에 사용하였다. EPC는 공여자 랫트의 말초 혈액으로부터 분리하였다. 세포를 성장시켜, 증식시키고 내피 세포 계통으로 유도하였다. 세포를 세포-특이적인 마커(CD31, CD34, vWF, CD133)를 사용하여 특성화하였다. 배양물 증식된 내피 세포를 적색 형광 염료(PKH26)로 표지하고 기능장애 음경내로 직접 주입하며, 동물을 12시간까지 두었다. 발기 기능은 해면체내 압력으로 평가하고 음경 조직은 조직- 및 면역조직화학 분석을 위해 회수하였다. 도 2는 전체 연구 설계의 개략도를 나타낸다.

(i) 당뇨병 유도, 치료 및 마취

체중이 약 200 내지 250g인 84 마리의 수컷 루이스 랫트를 웨이크 포리스트 대학(Wake Forest University)에서 사육 및 성장시켰다. 동물을 사료와 물에 자유로이 접근할 수 있도록 하고 당뇨병 동물에 대해 특별 관리를 하였다. 모든 실험 과정은 웨이크 포리스트 대학 학회 동물 보호 및 사용 위원회(Wake Forest University Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에서 관측하고 증명하며 동물 복지 법(Animal Welfare Act) 및 실험 동물의 보호 및 사용에 관한 지침(guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 부합하도록 수행하였다. 동물을 웨이크 포리스트 대학의 동물 시설에서 12시간의 광 주기로 우리에 두었다.

인산나트륨 0.2M 및 시트르산 0.1M의 멸균 완충액 속에 용해된 50 mg/Kg의 복강내 스트렙토조토신(STZ)에 의해 당뇨병을 유도하였다.

주입 전에, 꼬리 혈액 글루코즈를 측정하여 기본값을 수득하였다. 주입 후, 꼬리 혈액 글루코즈를 연속 3일 동안 측정하여 고혈당증을 확인하였다. 랫트가 처음 STZ 주입 후 당뇨병으로 되지 않은 경우, 당해 랫트에게 연속된 주내에 두번째 STZ를 주입하였다. 300 mg/dL 이상의 혈액 글루코즈 수준을 갖는 동물을 당뇨병으로 고려하고 후속적인 실험에 사용하였다. 혈액 글루코즈 수준 및 체중을 8 내지 11주 동안 매 주마다 글루코즈 시험 키트를 사용하여 모니터하고 이들 당뇨병 랫트를 4개의 그룹으로 나누었다:

그룹 I: 당뇨병 루이스 랫트(n=20).

그룹 II: 세포 치료요법을 받는 당뇨병 루이스 랫트(n=20).

그룹 III: 인슐린 치료를 받는 당뇨병 루이스 랫트(n=20).

그룹 IV: 인슐린 치료 및 세포 치료요법을 받는 당뇨병 루이스 랫트(n=20).

추가로, 10마리의 나이를 맞춘 루이스 랫트를 정상 대조군으로서 사용하였다. 모든 동물에게 다른 12주 동안 각각의 그룹에 대해 확립된 치료를 제공하였다. 도 3은 당뇨병 그룹 및 세포 치료를 받은 당뇨병 그룹에 대해 시간에 걸친 혈액 글루코즈의 그래프를 나타내는 당뇨병 표준화 곡선을 나타낸다.

(ii) EPC의 분리

단핵 세포를 히스토파크(histopaque) 1077(제조원: 시그마)를 사용한 밀도-구배 원심분리에 의해 동계의 공여자 루이스 랫트의 말초 혈액 10mL로부터 분리하였다. 분리 즉시, 단핵 세포를 사람 피브로넥틴(제조원: 시그마)이 각각의 하나에 5 x 10⁶ 세포 농도로 피복된 6-웰 배양 디쉬 상에 플레이팅하고, 2% 태아 소 혈청, 사람 VEGF-1, 사람 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2), 사람 상피 성장 인자(EGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 아스코르브산을 함유하는 EGM 싱글쿼트(EGM SingleQuots)가 보충된 내피 기본 배지[EBM, 제조원: 셀시스템스(CellSystems)] 속에서 유지시키고 37℃, 5% CO₂와 ≥ 95% 습도에서 2일 동안 항온배양하였다.

2일 후, 비-부착 세포를 수거하고 피브로넥틴-피복된 24-웰 디쉬 상에서 1 x 10⁶ 세포 농도로 배양하고 추가로 3일 동안 항온배양하여 내피 콜로니가 형성되도록 하였다.

당해 생체외 증식된 세포의 대부분은 내피 계통의 것이었으며, 그 자체로서, 이들은 생체외 증식된 EPC-풍부한 분획을 구성하였다.

세포를 분리하고, 성장시키고, 분화시키며 충분한 수의 세포가 이식을 위해 수득될 때까지(8주) 증식시켰다. 이식된 세포는 7, 8 및 9번째 계대배양 중의 것이었다.

(iii) 시험관내 실험

세포 특성화를 1:20의 희석에서 세포-표면 마커 CD31, CD34, vWF 및 CD133의 발현 실험으로 수행하였다. 면역표지를 아비딘-비오틴 검출 키트[Vectastain elite ABC, 제조원: 벡터 래보러토리즈 인코포레이티드(Vector Laboratories Inc.), 캘리포니아주 불링갬 소재]를 사용하고 제2 항체를 위해 1:200의 희석에서 면역형광에 의해 수행하였다.

(iv) PKH26을 사용한 표지

EC를 세포 링커 키트(PKH26, 제조원: 시그마, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 사용하여 제조업자의 안내에 따라 적색 형광 PKH26-레드로 표지하였다. 요약하면, PBS 중의 세포를 10 μM 염료 용액에 가하고 서서히 혼합하였다. 25℃에서 5분 동안 항온처리 기간 후 FBS를 가하여 염색 반응을 중지시켰다. 염색 용액을 PBS를 사용한 반복적인 세척으로 제거하였다. 현미경에 의해 형광을 확인한 후 세포를 주입할 때까지 빙상에 두었다.

(v) EPC의 이식

랫트를 마취 상태[베트이큅, 인코포레이티드(VetEquip, Inc.) 캘리포니아주 플레아산톤 소재]를 사용하여 1-2%의 흡입된 이소플루란(제조원: 애보트)와 혼합된 3 L/분 O₂로 마취시켰다. 랫트를 열조절된 외과 테이블 상에 앙와위로 두었다. 복벽 벽 및 회음부를 전기 면도기로 면도하고 베타딘으로 세정하였다. 멸균 기술을 사용함으로써, 회음부내에서 중선으로 절개하였다. 해면체를 비절개박리(blunt dissection)하여 노출시켰다. 마이크로리터 주사기에 부착된 30-게이지 바늘을 사용함으로써, 20㎕의 EGM-2 속에 희석된 1-2 x 10⁶ 세포를 해면체내로 주입하였다. 당뇨병 대조군 그룹(그룹 1)으로부터의 랫트에는 단지 0.2 mL의 EGM-2를 비히클로서 제공하였다.

(vi) 인슐린을 사용한 치료

글루코즈 혈액 수준을 정상 범위로 유지시키기 위한 목적으로, 그룹 III 및 IV로부터의 당뇨병 랫트에게 5-10 UI의 인슐린[제조원: 일라이 릴리(Eli Lilly), 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재]을 매일 피하 주입하는 치료를 제공하였다.

(vii) 결과

정상 및 당뇨병 랫트의 해면체내 압력

해면체내 압력을 평가하기 위한 외과적 기술을 위해, 치료 후 4, 8 및 12주째에, 각각의 그룹의 5마리 랫트를 나트륨 펜토바르비탈을 복강내 주입(35 mg/kg)하여 마취시켰다. 마취를 필요에 따라 펜토바르비탈(5-10 mg/kg)을 매 45 내지 60분마다 연속 주입함으로써 필요에 따라 실험 과정(2 내지 3시간) 동안 유지하였다. 경부, 복벽 및 회음부를 전기 면도기로 면도하고 베타딘으로 세정하였다.

목 동맥을 앞-중선 목 절개를 통해 노출시키고 생리학적 염수 용액으로 충전된 폴리에틸렌 카테터 19 fr로 삽관시키고 압력 변환기에 연결시켜 평균 동맥압(MAP)을 연속적으로 모니터하였다.

압력 변환기를 각각의 실험 전에 cmH₂O로 조정하였다. 보다 낮은 중선 절개를 하부 복부, 및 확인된 방광 및 전립선을 통해 수행하였다. 하하복신경총(즉, 골반총 또는 주요 골반신경절), 골반 신경 및 해면체 신경을 양쪽 측면에서 전립선에 대해 후측방으로 확인하고, 스테인레스-강 이극성 전선 전극을 전기 자극을 위해 당해 구조주변에 두었다. 랫트 "발기"의 측정을 해면체 압력의 측정을 통해 수행하였다. 사람 및 동물에서 압력은 초기에 매우 낮으며(대략 5-10 mmHg), 발기 동안 이는 전신계 혈압의 60-90%(종 및 바늘 위치에 따라)로 상승한다.

이후에, 음경의 피부를 벗기고; 양쪽의 음경(해면체)를 덮고 있는 좌골해면체골 근육의 일부를 제거하여 노출시켰다. ICP를 모니터하기 위하여, 20-G 캐뉼라를 폴리에틸렌-50 튜빙[제조원: 인트라메딕(Intramedic), 미국 캘리포니아주 벡톤 디킨슨 소재]에 연결된 250U/mL의 헤파린 용액으로 충전시키고 우측 해면체내로 삽입시켰다. 압력 변환기를 각각의 실험 전에 cmH₂O로 조정하였다.

양쪽 압력 라인을 압력 변환기에 연결한 후, 변환기 증폭기(ETH 401)를 통해 데이터 획득 보드에 연결하여 실시간 디스플레이 및 ICP의 기록(PowerLab. Chart 5, ADInstruments)을 수득한다.

해면체 신경을 다중-결합된 클램프에 부착된 정밀한 스테인레스-강 이극성 후크 전극을 사용하여 앞서 기술한 바와 같이 직접 전기자극시켰다. 각각의 프로브는, 직경이 0.2mm이었으며; 2개의 극은 1mm 떨어져 있었다. 단일상 직각 펄스를 시그날 생성기(주문 생산되고 적분 상수-전류 증폭기 장착)[Grass, 제조원: 아스트로 메드, 인코포레이티드(Astro Med, Inc). 미국 로드아일랜드주 더블유, 와르빅 소재]로 전달하였다. 자극 매개변수는 20 Hz, 펄스 폭 0.22 ms, 및 1분 경과; 1, 2, 4 및 6 mA의 증가하는 전류를 사용하였다. 자극 간격은 10분이었다. 이들 매개변수를 다원기록기상에서 기록하고, 데이터 획득 및 기원한 매개변수의 계산을 소프트웨어 컴퓨터 시스템[참조: 도 4A-C 상단: 평균 동맥 압력(MAP), 하단: 해면체내 압력(ICP)]을 사용하여 수행하였다.

도 5는 4개 그룹의 당뇨병 그룹(DB), 당뇨병 유도 후 4주 동안 내피 세포를 사용한 세포 치료요법을 받은 당뇨병 그룹(CT), 인슐린 치료를 받은 당뇨병 그룹(인슐린) 및 내피 전구 세포를 사용한 세포 치료요법과 인슐린 치료를 받은 당뇨병 그룹(CT + 인슐린)의 모든 4개 그룹의 시간에 따른 해면체내 압력을 비교하여 시간에 대한 ICP(해면체내 압력)/MAP(평균 동맥 압력)의 비의 그래프이다.

도 6은 당뇨병 유도 후 8주 째에 당뇨병 및 정상 그룹의 해면체내압측정술 결과를 비교하는 신경자극에 대한 MAP(평균 동맥 압력)/ICP(해면체내 압력)의 비의 그래프이다.

도 7은 당뇨병 유도 후 8주 째에 당뇨병 그룹(DB) 및 내피 전구 세포를 사용한 세포 치료요법을 받은 당뇨병 그룹(DB + CP)의 해면체내압측정술 결과를 비교하는 시간에 따른 MAP/ICP의 그래프를 나타낸다. 세포 치료요법 그룹에서 MAP/ICP는 주입 후 12주까지 지속적으로 증가하였으며, 이는 치료요법의 장기간의 효과를 나타낸다.

연구의 말기(EPC 주입 후 12주 째)에, 상이한 양의 신경자극을 사용한 ICP/MAP 비를 정상의 당뇨병(DM) 및 세포 치료요법을 받은 당뇨병 그룹(DM + CT)에 대해 도 8에 나타낸 바와 같이 비교하였다(결과는 평균값 ± sem으로 나타내었다. ^*정상 그룹에 대해 p<0.05). 세포 치료요법 후 12주 째에 DM + CT는 정상 그룹의 결과와 거의 유사하였다. 당해 결과는 내피 전구 세포 치료요법의 장기간의 효과를 나타낸다.

조직학 및 면역형광

해면체압측정 후, 음경을 이의 기저 및 귀두에서 절개하여 음경을 둘러싸고 있는 연결 조직을 조직학적 연구를 위해 제거하였다. 회수된 조직 샘플을 Tissue-Tek^® O.C.T. 화합물 4583 (Sakura^®) 속에 두고 액체 질소 속에서 동결시켰다. 동결된 블록을 냉동미세절단기[모델 CM 1850, 제조원: 레이카 마이크로시스템스(Leica Microsystems), 일리노이주 반녹크부른 소재]를 사용하여 6㎛ 절편으로 절단한다. 당해 절편을 고정시키고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다.

PKH26 표지된 세포를 550 nm의 여기 파장을 사용하여 형광 현미경으로 확인하였다. 디지털 영상을 다양한 배율로 촬영하였다[Zeiss Axio Imager M1 Microscope, 제조원: 카를 짜이즈(Carl Zeiss), 뉴욕주 토른우드 소재]. PKH26으로 표지된 이식시킨 세포는 4, 8 및 12주 후 음경 조직내에서 검출될 수 있었으며 이는 세포의 장기간 생존을 나타낸다.

EPC-기원한 내피 세포를 성공적으로 분리하고, 성장시키고 증식시켰다. 전구 내피 세포 표현형 및 분화된 내피 세포 표현형을 세포 특이적인 항체를 사용하여 면역조직화학으로 확인하였다. 세포를 주입한 동물은 해면체내 압력에 있어서 실질적인 증진을 나타내었으며 이들의 발기 기능은 정상 수준으로 회복되었다. 조직학적으로, 형광 염료 추적자 PKH26으로 표지된 이식된 세포는 생존하였으며 주입된 영역내 음경 조직내로 통합되었다.

Claims (22)

1. 음경 조직내에서 산화질소 생산을 증가시킬 수 있는 세포의 집단을 주입하고,
   상기 세포를 생체내에서 유지시켜 산화질소의 국소 조직 농도를 증가시킴으로써,
   자극시 해면체내 압력이 증진될 수 있도록 함을 포함하여,
   대상체에서 발기부전(ED)을 완화시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 세포 집단이 내피 세포를 포함하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 세포 집단이 평활근 세포를 추가로 포함하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 세포 집단이 내피 전구 세포를 포함하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 세포 집단이 평활근 전구 세포를 추가로 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 세포가 음경 조직내로 통합되도록 함을 추가로 포함하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 샘플로부터 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 말초 혈액 샘플로부터 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 세포가 자가 세포인 방법.
10. 제7항에 있어서, 전구 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 내피 전구 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
12. 제7항에 있어서, 평활근 전구 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
13. 제7항에 있어서, 분리된 세포를 주입 전에 생체외에서 증식시킴을 추가로 포함하는 방법.
14. 제7항에 있어서, 분리된 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 분리된 세포를 내피 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
16. 제14항에 있어서, 분리된 세포를 평활근 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제14항에 있어서, 분화된 세포를 주입 전에 생체외에서 증식시킴을 추가로 포함하는 방법.
18. 제1항에 있어서, 주입 방법이 세포를 해면체내로 주입함을 추가로 포함하는 방법.
19. 제1항에 있어서, 주입 단계가 주입당 약 0.3 내지 약 1000만 세포의 범위의 세포를 주입함을 추가로 포함하는 방법.
20. 제1항에 있어서, 대상체가 당뇨병에 걸린 방법.
21. 제1항에 있어서, 대상체에서 글루코즈의 혈액 수준을 조절함을 추가로 포함하는 방법.
22. 제1항에 있어서, 유효량의 인슐린을 투여함을 추가로 포함하는 방법.

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