JP2010529895A - 勃起機能の回復方法 - Google Patents
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Abstract
Description
EDは、性行為に十分な勃起を達成または維持することが持続的に不可能であることである。安静状態において、拡張体の内外の血流間でバランスが存在する。正常な勃起機能は、一連の複雑な動的神経および血管の相互作用が必要である。陰茎の勃起は、多重機構(例えば、主要な心因性および反射発生機構)によって誘発する。これらの機構は、正常の性的行為時に相互作用する。心因性刺激には、聴覚、視覚、嗅覚または想像上の刺激を含み、また、反射発生刺激には、身体および副交感神経の導出作用を引き起こすペニスでの感覚受容体を含む。
内皮細胞を、同種由来の同種異系細胞集団または、対象自身の組織に由来する自己生産細胞集団から単離することができる。細胞はまた、異種でもよく、その場合細胞集団は、対象と異なる哺乳動物種に由来するものとする。例えば、組織細胞は、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジのような哺乳動物に由来することができる。
特に言及しない限り、全ての化学物質をシグマ社(St. Louis, MO)から購入した。ECL緩衝液および125Iナトリウムを、パーキンエルマーNEN社(Boston, MA)から購入した。II型コラゲナーゼ(1mg/ml)を、ベーリンガーマンハイム社(Mannheim, Germary)から購入した。内皮培地(EBM−2)を、カムブレックスバイオサイエンス社(Walkersville, MD)から購入した。PCR試薬およびプライマー、M199培地、ウシ胎仔血清(FBS)およびペニシリンを、ライフテクノロジー社(Gaithersburg, MD)から購入した。基本的な繊維芽細胞成長因子(bFGF)は、Judith Abraham(Scios Nova, CA)からの贈与であった。FITC−標識モノクローナル抗ヒトCD31抗体を、サンタクルス社(Santa Cruz, CA)から購入した。ウサギポリクローナル抗フォンヴィレブランド因子(vWF)、抗平滑筋アクチン抗体およびFITC標識抗ウサギIgG抗体を、DAKO社(Glostrup, Denmark)から購入した。モノクローナル抗ヒトCD31、ヤギポリクロ―ナル抗VEカドヘリン(VE−Cad)、ヤギ抗vWFおよびウサギポリクロ―ナル抗Flk−1抗体を、サンタクルス社(Santa Cruz, CA)から購入した。FITCおよびビオチン標識Ulex europeaus Iレクチンを、シグマ社(St. Louis, MO)から購入した。ビオチン標識ヤギ抗マウスIgGおよびビオチン標識マウス抗ヤギIgGを、サンタクルス社(Santa Cruz, CA)から購入した。抗CD105抗体を、BDファーミンゲン社(San Diego, CA)から購入した。FITC−複合アビジンを、ベクターラボラトリー社(Burlingame, CA)から購入した。
本研究は、末梢血液から得たEPCが成熟内皮細胞を達成するために用いることができることを証明する。病気の体内に注入した内皮細胞は、糖尿病のラットモデルにおける正常な勃起機能を回復させることができる。この細胞に基づく技術は、機能不全の糖尿病対象に対して実行可能な治療であることができる。
約200〜250g程度の84匹のオスのルイスラットを、ウェイクフォレスト大学で飼育した。動物は、食物および水を自由に摂取し、糖尿病の動物には特別な処理を施した。すべての実験手順は、ウェイクフォレスト大学の動物処理および使用委員会(IACUC)によって審査および承認され、動物保護法および実験動物の処理および使用に関するガイドに従って行った。動物を、12時間の短いサイクルでウェイクフォレスト大学の動物の施設に収容した。
群I:糖尿病ルイスラット(n=20)
群II:細胞療法を施した糖尿病ルイスラット(n=20)
群III:インスリン治療を施した糖尿病ルイスラット(n=20)
群IV:インスリン治療および細胞療法を施した糖尿病ルイスラット(n=20)
単核細胞を、同系のドナールイスラットの末梢血液10mLから、ヒストパク1077(シグマ社)を用いた密度勾配遠心分離機によって単離した。単離した後すぐに、単核細胞を、ヒトフィブロネクチン(シグマ社)で被覆した6ウェルの培養皿上にそれぞれ5×106細胞濃度で固定し、2%のウシ胎仔血清、ヒトVEGF−1、ヒト繊維芽細胞成長因子2(FGF−2)、ヒト上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF−1)およびアスコルビン酸を含むEGM SingleQuotsで付加した内皮基礎培地(EBM,CellSystems)内で保持し、2日間37°Cで5%CO2、95%以上の湿度で培養した。2日後、非接着の細胞を採取し、フィブロネクチンコートの24ウェル培養皿上に1×106細胞濃度で培養し、さらに3日間、内皮コロニーを形成させるために培養した。
細胞の特徴を、細胞表面マーカーCD31,CD34,vWFおよびCD133の発現試験を1:20の希釈で行った。免疫標識を、アビジン−ビオチン検出キット(Vactastain elite ABC, Vector Laboratories Inc, Bulingame, CA)を用いて、第二抗体に対して1:200の希釈で免疫蛍光によって行った。
EC’sを、赤色蛍光PKH26−redで、製造ガイドラインに従って細胞リンカーキット(PKH26, Sigma, Saint Louis, MI)を用いて標識化した。簡潔には、PBS内の細胞を10uMの染色溶液に加え、静かに混合した。5分間25°Cで培養後、FBSを加えて、染色反応を停止させた。染色溶液を、PBSで繰り返し洗浄することによって除去した。顕微鏡によって蛍光を確認後、細胞を注射するまで氷上に置いた。
ラットを、麻酔工程(VetEquip, Inc. Pleasanton, CA)を用いて、3L/分のO2と混合した1〜2%の吸入イソフルレン(Abbott)で麻酔した。ラットを、体温調節された手術台上で仰臥位に配置した。前面腹壁および会陰部を、電気かみそりで剃り、ベタジンで洗浄した。滅菌技術を用いることによって、会陰部内の正中切開を行った。海綿体を、ありのままの解剖によって切開し、露出した。マイクロリットルシリンジに付けた30ゲージの針を用いることによって、20μlのEGM−2内に希釈した1〜2×106個の細胞を海綿体に注射した。糖尿病のコントロール群(群I)のラットは、賦形剤として0.2mLのEGM−2のみを注射した。
群IIIおよびIVの糖尿病ラットを、5〜10Ulのインスリン(Eli Lilly, Indianapolis, IN, U.S.A)を、グルコース血中濃度を正常範囲内に維持するために、皮下に毎日注射した治療を施した。
正常および糖尿病のラットにおける海綿体内圧
海綿体内圧を評価する手術法に関して、治療後4,8および12週間で、各群の5匹のラットを、ペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射(35mg/kg)して麻酔した。麻酔を、必要に応じて45〜60分毎にペントバルビタールをその後注射(5〜10mg/kg)して、必要があれば実験計画の間(2〜3時間)維持した。頚部、腹壁および海綿体を、電気かみそりで剃り、ベタジンで洗浄した。
空洞切開後、ペニスを根元で切除し、陰茎亀頭および骨幹の周りの結合組織を、組織構造を検討するために除去した。回収した組織サンプルを、Tissue−Tek(登録商標)O.C.T.Compound4583(Sakura(登録商標))に配置し、液体窒素内で凍結した。凍結ブロックを、低温恒温槽(Model CM 1850, Leica Microsystems, Bannockburn, IL)を用いて6μm切片に解体した。切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で固定および染色した。
Claims (22)
- 対象における勃起障害(ED)を改善する方法であって、
身体組織内に一酸化窒素生成を増加させることができる細胞集団を注射し、
一酸化窒素の局所的組織濃度を増加させる細胞を生体内で維持することで、
海綿体内圧を刺激下で改善する方法。 - 前記細胞集団は内皮細胞を有する請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団はさらに平滑筋細胞を有する請求項2に記載の方法。
- 前記細胞集団は内皮前駆細胞を有する請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団はさらに平滑筋前駆細胞を有する請求項4に記載の方法。
- 前記細胞を前記身体組織に組み込むことをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記細胞をサンプルから単離する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を末梢血液のサンプルから単離する工程をさらに含む請求項7に記載の方法。
- 前記細胞が自己移植である請求項1に記載の方法。
- 前駆細胞を単離する工程をさらに有する請求項7に記載の方法。
- 内皮前駆細胞を単離する工程をさらに有する請求項7に記載の方法。
- 平滑筋前駆細胞を単離する工程をさらに有する請求項7に記載の方法。
- 注射前に生体外で前記単離した細胞を増殖する工程をさらに有する請求項7に記載の方法。
- 前記単離した細胞を分化する工程をさらに有する請求項7に記載の方法。
- 前記単離した細胞を内皮細胞内に分化する工程をさらに有する請求項14に記載の方法。
- 前記単離した細胞を平滑筋細胞内に分化する工程をさらに有する請求項14に記載の方法。
- 注射前に生体外で前記分化した細胞を増殖する工程をさらに有する請求項14に記載の方法。
- 細胞を海綿体内に注射する工程をさらに有する請求項1に記載の方法。
- 一注射当たり約30〜約1000万の細胞数の範囲で細胞を注射する工程をさらに有する請求項1に記載の方法。
- 対象が糖尿病である請求項1に記載の方法。
- 前記対象の血中グルコース濃度を管理する工程をさらに有する請求項1に記載の方法。
- 効果的な量のインスリンを投与する工程をさらに有する請求項1に記載の方法。
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